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JP2013542711A - がんの治療および診断の標的遺伝子としてのＣ６ｏｒｆ１６７ - Google Patents

がんの治療および診断の標的遺伝子としてのＣ６ｏｒｆ１６７ Download PDF

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Abstract

がん、特に肺癌、またはがんを発症する素因を診断することを目的とする方法を、本明細書に記載する。本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルをがんの指標として利用する診断法を提供する。本発明は、がん、例えば肺癌の治療において有用な治療用物質をスクリーニングする方法をさらに提供する。本発明は、がん細胞増殖を阻害する方法、ならびにがんの治療および予防のいずれかまたは両方のための方法をさらに提供する。本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子およびＮＦＫＢＩＬ２の阻害性ポリペプチド、ならびにそれらをコードするベクターおよびそれらを含有する組成物も特徴とする。

Description

本発明は、がんを検出および診断する方法、ならびにがんを治療および予防する方法に関する。
優先権
本出願は２０１０年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／４０１，９２７号、および２０１０年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／３７５，１８４の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
肺癌は最もよく見られるがんであり、１年当たりのがんの新規症例１，０９０万例のうち１３５万例を占める。肺癌はがん関連疾患による死亡原因の第１位でもあり、世界的に見てがん関連死６７０万例のうち１１８万例を占める（非特許文献１）。この１０年の間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む新たに開発された細胞傷害剤が出現して、進行性ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）患者に複数の治療選択肢が提供されるようになった。しかしながら、新たな投与レジメンはそれぞれ、シスプラチンに基づく治療法と比較してわずかな延命効果しかもたらすことができない（非特許文献２）。
最近になって、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体または抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）またはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、およびゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）などのＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤を含む分子標的剤が、臨床使用について調査されかつ／または承認された（非特許文献３、４）。これらの剤は再発性ＮＳＣＬＣに対してある程度は活性を示すものの、延命効果を受け得る患者の数にはまだ限界がある。ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）患者はファーストラインの多剤併用化学療法に好ましく反応する一方、短期間のうちに再発する場合が多い。限局期疾患（ＬＤ）患者の２０％しか集学的治療で治癒することができず、また進展期疾患（ＥＤ）患者の５％未満しか初期診断後の５年生存を達成することができない（非特許文献５）。従って肺癌に対して、より選択的でかつ効果的な分子標的剤の開発などの新たな治療戦略が待ち望まれている。
ヒトのがんを診断、治療、および予防するための新規分子標的をスクリーニングする過程において、本発明者らは、レーザーマイクロダイセクションと共に、２７，６４８個の遺伝子または発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１０１症例の肺癌の網羅的ゲノム発現プロファイリングを行い、肺癌治療のためのいくつかの候補分子標的およびバイオマーカーを見出した（特許文献１〜２、非特許文献６〜９）。
WO2004/031413 WO2007/013665
Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. CA Cancer J Clin. 2008;58:71-96. Schiller JH, Harrington D, Belani CP, et al. Eastern Cooperative Oncology Group. N Engl J Med 2002;346:92-8. Dowell J, Minna JD, Kirkpatrick P. Nat Rev Drug Discov 2005;4:13-4. Pal SK, Pegram M. Anticancer Drugs 2005;16:483-94. Chute JP, Chen T, Feigal E, Simon R, Johnson BE: J Clin Oncol 1999;17:1794-801. Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53. Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205. Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, Yano S, Sone S, Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003;1:485-99. Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.
本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子が臨床肺癌組織において過剰発現するという、マイクロアレイ解析およびＲＴ−ＰＣＲによる発見に関する。本明細書において実証されるように、がん細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内因性Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の機能的ノックダウンは、がん細胞増殖の劇的な抑制をもたらし、このことから、がん細胞の生存能の維持におけるその必須の役割が示唆される。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子は、成体正常器官ではほとんど発現しないため、副作用が最小である治療アプローチのための特に有用な分子標的である。さらに本明細書に開示される結果は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在ががん細胞増殖に重要であり、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドがＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を担っていることを実証する。
従って、対象由来の生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定することによる、対象におけるがん、特に肺癌、またはがんを発症する素因の検出または診断の方法を提供することが、本発明の目的である。正常対照レベルと比較したＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの増加は、対象が、がん、特に肺癌に罹患しているか、またはがんを発症するリスクを有することを示す。本発明の方法において、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡが適切なプローブもしくはプライマーセットによって検出されることができ、あるいはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質が抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体によって検出されることができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡまたはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬を含むキットを提供することが、本発明のさらなる目的である。好ましくは、試薬は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含み得る。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む、がんの診断または検出のための試薬を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブもしくはプライマー、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の、がんの診断または検出のための試薬の製造のための使用を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。
がん細胞増殖を阻害する候補物質をスクリーニングする方法を提供することが本発明のなおさらなる目的であり、そのような物質は、肺癌のようながんの治療および／または予防において利用可能である。本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実施され得、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとの結合活性、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベル、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域下で制御されたレポーター遺伝子の発現レベルもしくはレポーター遺伝子の活性、またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を、指標として使用する。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと結合する物質、あるいはＣ６ｏｒｆ１６７の発現もしくは活性、レポーター遺伝子の発現もしくは活性、またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を抑制する物質を、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質として同定することができる。検出されるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性は、好ましくは、細胞増殖促進活性またはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性である。試験物質の非存在下での対照レベルと比較してＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性が減少する場合、その試験物質を、がんの症状の低下またはがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のために使用し得ることを示す。
互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成される二本鎖分子を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、標的配列に相補的な配列を含む。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合に、二本鎖分子は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する。
ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、かつＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いているポリペプチドを提供することが、本発明のなおさらなる目的である。欠けているＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能であり得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列またはその機能的等価物を含む。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および／またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能を阻害する剤を投与することによる、Ｃ６ｏｒｆ１６７を過剰発現しているがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはＣ６ｏｒｆ１６７を過剰発現しているがん細胞の増殖の阻害のための方法を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。好ましくは、剤は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはその二本鎖分子をコードするベクターである。遺伝子の発現は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の二本鎖分子の標的細胞への導入によって阻害され得る。従って、本発明の特に好ましい態様において、方法は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそのような分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能を阻害する剤は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能を欠いているポリペプチドであり得る。従って、本発明の好ましい態様において、方法は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含みかつＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能を欠いている薬学的有効量のポリペプチドを対象に投与する段階を含む。
薬学的に許容される担体と、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する１種もしくは複数種の二本鎖分子、またはそのような分子をコードするベクター、またはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含みかつＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能を欠いているポリペプチドを含む活性剤とを含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７関連がんの治療および予防のいずれかまたは両方に適する薬学的組成物を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。本発明の文脈において、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対する二本鎖分子は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害することができ、かつ細胞増殖を阻害することもできる。
本発明の方法および材料は、がんを、その明らかな臨床症状の検出前に同定することができ、副作用のないがん治療との関連において使用され得る。
より具体的には、本発明は、以下の［１］〜［４０］を提供する：
［１］対象由来の生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんまたはがんを発症する素因の検出または診断の方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した前記レベルの増加が、対象におけるがんの存在、または対象ががんに罹患しているかもしくはがんを発症するリスクを有することを示し、発現レベルが、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか一つによって測定される、方法。
［２］前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、［１］記載の方法。
［３］対象由来の生物学的試料が生検試料である、［１］または［２］記載の方法。
［４］がんが肺癌である、［１］〜［３］のいずれか一項記載の方法。
［５］（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を少なくとも１種含む、がんの検出または診断のためのキット。
［６］試薬が、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む、［５］記載のキット。
［７］Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む、がんの検出または診断のための試薬。
［８］がんが肺癌である、［５］もしくは［６］記載のキット、または［７］記載の試薬。
［９］がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたは機能的等価物と試験物質との間の結合活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）該ポリペプチドまたは機能的等価物に結合する試験物質を、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質として選択する段階
を含む、方法。
［１０］がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出されるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルと比較して、段階（ｂ）において検出される発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階
を含む、方法。
［１１］がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、段階（ｂ）において検出されるポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階
を含む、方法。
［１２］生物学的活性が、細胞増殖促進活性、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性、または核局在活性である、［１１］記載の方法。
［１３］がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）におけるレポーター遺伝子の発現および／または活性のレベルを測定する段階；ならびに
（ｃ）試験物質の非存在下での発現および／または活性のレベルと比較して、段階（ｂ）において検出されるレポーター遺伝子の発現および／または活性のレベルを低下させる試験物質を選択する段階
を含む、方法。
［１４］がんの治療および予防のいずれかまたは両方のため、がん細胞増殖またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験物質の存在下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する段階；および
（ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験物質を選択する段階
を含む、方法。
［１５］Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドのＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインを含む、［１４］記載の方法。
［１６］Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０の１〜４１４のアミノ酸配列を含む、［１５］記載の方法。
［１７］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含む、［１４］〜［１６］のいずれか一項記載の方法。
［１８］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９３２〜１３７８のアミノ酸配列を含む、［１７］記載の方法。
［１９］がんが肺癌である、［９］〜［１８］のいずれか一項記載の方法。
［２０］センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞に導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子であって、センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９のヌクレオチド配列からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、それらの鎖が標的配列において互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、二本鎖分子。
［２１］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［２０］記載の二本鎖分子。
［２２］センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に１個または２個の３'オーバーハングを有する、［２０］または［２１］記載の二本鎖分子。
［２３］一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドである、［２０］〜［２２］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
［２４］ポリヌクレオチドが、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９のヌクレオチド配列からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］が約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］が標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、［２３］記載の二本鎖分子。
［２５］［２０］〜［２４］のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
［２６］Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法。
［２７］二本鎖分子が［２０］〜［２４］のいずれか一項記載のものである、［２６］記載の方法。
［２８］ベクターが［２５］記載のものである、［２６］記載の方法。
［２９］Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物。
［３０］二本鎖分子が［２０］〜［２４］のいずれか一項記載のものである、［２９］記載の組成物。
［３１］ベクターが［２５］記載のものである、［２９］記載の組成物。
［３２］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含むポリペプチドであって、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠く、ポリペプチド。
［３３］（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、［３２］記載のポリペプチド。
［３４］細胞膜透過性物質により修飾されている、［３２］または［３３］記載のポリペプチド。
［３５］［３２］または［３３］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［３６］［３２］または［３３］記載のポリペプチドをコードするベクター。
［３７］［３２］〜［３４］のいずれか一項記載のポリペプチドまたは［３６］記載のベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法。
［３８］［３２］〜［３４］のいずれか一項記載のポリペプチドまたは［３６］記載のベクターの薬学的有効量を含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物。
［３９］治療されるがんが肺癌である、［２６］、［２７］、［２８］、または［３７］記載の方法、ならびに
［４０］治療されるがんが肺癌である、［２９］、［３０］、［３１］、または［３８］記載の組成物。
本発明の一つまたは複数の局面がある種の目的を満たすことができ、他の一つまたは複数の局面が他のある種の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されるであろう。各目的は、本発明の全ての局面に、全ての点で、同等に当てはまるわけではない。そのため、先の目的は、本発明のいずれか一つの局面に関して、代替的に考慮され得る。
本発明の上記の概要および以下の詳細な説明はいずれも、例示的な態様のものであって、本発明または本発明の他の別の態様を制限するものではないことも理解されるであろう。以下の詳細な説明を添付の図面および実施例と併せて参照することにより、本発明の他の目的および特徴が、より完全に明白になるであろう。特に、本発明は、多数の具体的な態様に関して本明細書に記載されるが、この記載は、本発明を例示するものであって、本発明を制限するものと解釈されてはならないことが認識されるであろう。添付の特許請求の範囲に記載される本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、様々な修飾および適用が、当業者に想到され得る。同様に、本発明の他の目的、特徴、恩恵、および利点は、この概要および下記のある種の態様から明らかになり、当業者に容易に明らかになるであろう。そのような目的、特徴、恩恵、および利点は、単独で、または本明細書に組み入れられた参照の考慮と共に、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから得られる全ての合理的な推測と併せて、上記から明らかになるであろう。
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明の考慮により、当業者に明らかになるであろう。
図１は肺腫瘍および食道腫瘍ならびに正常組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を示す。パートＡは、正常肺組織と比較した、肺癌組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現を実証する半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。パートＢは、肺癌細胞株におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を実証する半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。パートＣは、肺癌細胞株および食道癌細胞株におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の発現を実証するウエスタンブロット解析の結果を示す。パートＤは、様々な正常ヒト組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７転写物のノーザンブロット解析の結果を示す。 図２はＣ６ｏｒｆ１６７の増殖促進効果を示す。パートＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７に特異的なオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ（ｓｉ−＃１およびｓｉ−＃２）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＣＮＴ）に応答した、Ａ５４９肺癌細胞およびＬＣ３１９肺癌細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７発現に対するノックダウン効果を確認する半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析およびウエスタンブロット解析の結果を示す。パートＢは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびＬＣ３１９細胞のＭＴＴアッセイの結果を示す。アッセイは全て、３連のウェルで独立して３回実施した。パートＣは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞およびＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイの結果を示す。 パートＤは、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ２９３細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の発現および増強された増殖促進活性を確認するウエスタンブロット解析およびＭＴＴアッセイの結果を示す。 図３はＮＦＫＢＩＬ２が培養細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在を制御することを示す。パートＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７相互作用タンパク質の同定のためのＩＰ−ＭＳ解析の結果を示す。外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を、Ｆｌａｇアガロースを使用して免疫沈降させ、ＷＢおよびコロイドＣＢＢ染色により検出した。パートＢは、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質がＮＦＫＢＩＬ２タンパク質と相互作用することを確認するＦｌａｇアガロースおよび／またはＨＡアガロースを使用したＩＰ−ＷＢ解析の結果を示す。 パートＣは、ＨｅＬａ細胞における内因性のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の細胞内局在を示す。細胞をウサギポリクローナル抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体；マウスポリクローナル抗ＮＦＫＢＩＬ２により染色し、核をＤＡＰＩにより染色した。パートＤは、ＣＯＳ−７細胞における外因性のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の細胞内局在を示す。細胞に、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクター（上パネル）をトランスフェクトするか、またはＣ６ｏｒｆ１６７発現ベクターおよびＮＦＫＢＩＬ２発現ベクター（下パネル）をコトランスフェクトし、４８時間後に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質をモノクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体により染色し；ＮＦＫＢＩＬ２をマウスモノクローナル抗ＨＡにより染色し、核をＤＡＰＩにより染色した。 パートＥは、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターおよびＮＦＫＢＩＬ２発現ベクターをコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞質画分および核画分におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の局在を示す。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質を、抗マウスＦｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体および／またはモノクローナル抗ラットＨＡ（３Ｆ１０）抗体を使用して検出した。パートＦは、ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７オリゴヌクレオチドまたはｓｉ−ＮＦＫＢＩＬ２オリゴヌクレオチドによる、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の発現のノックダウンを示す。内因性のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の発現を、抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体および抗ＮＦＫＢＩＬ２抗体を使用したウエスタンブロッティングにより検出した。 図４は肺癌細胞株におけるＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質のドミナントネガティブ効果を示す。パートＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の部分タンパク質の設計を示す。パートＢは、各部分タンパク質と共に、全長のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質および／またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質をコトランスフェクトした細胞におけるＩＰ−ＷＢ解析の結果を示す。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質とＮＦＫＢＩＬ２タンパク質との間の結合領域を、Ｆｌａｇ／ＨＡアガロースを使用して同定した。 パートＣは、ＣＯＳ−７細胞における全長外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質および各部分ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の細胞内局在を示す。細胞に、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターおよび部分ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクターをコトランスフェクトし、４８時間後に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を、モノクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体により染色し；ＮＦＫＢＩＬ２を、マウスモノクローナル抗ＨＡにより染色し、核をＤＡＰＩにより染色した。 パートＤは、部分ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における内因性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の局在を示す。内因性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を、ウサギポリクローナル抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体を使用して検出した。ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を、モノクローナル抗ラットＨＡ（３Ｆ１０）抗体により検出した。 パートＥは、Ｃ６ｏｒｆ１６７を高発現しているＨｅＬａ細胞およびＬＣ３１９細胞に対するＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質のドミナントネガティブ効果を示す。ドミナントネガティブ効果は、トランスフェクション後７日目に、ＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイによる定量化によって、ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質をトランスフェクトしＣ６ｏｒｆ１６７を高発現しているＨｅＬａ細胞およびＬＣ３１９細胞において検出された。 図５はがん細胞に対するＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質のドミナントネガティブ増殖抑制効果を示す。パートＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターと、全長ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクター／３種の部分ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクター（Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３）とをコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を示す。免疫沈降アッセイを、Ｆｌａｇ−Ｍ２アガロースを使用して実施した。パートＢは、ＨｅＬａ細胞株、ＬＣ３１９細胞株、およびＣＣＤｌｕ−１９細胞株におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の発現を示す。パートＣは、トランスフェクション後７日目にＭＴＴアッセイにより定量化された、モックプラスミドまたは３種の部分ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクター（Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３）のいずれかをトランスフェクトしたＣ６ｏｒｆ１６７陽性のＨｅＬａ細胞およびＬＣ３１９細胞ならびにＣ６ｏｒｆ１６７陰性ＣＣＤｌｕ−１９細胞を使用したＭＴＴアッセイを示す。 図６はＮＦＫＢ経路の上流分子としてのＣ６ｏｒｆ１６７の関与を示す。パートＡは、内因性のＣ６ｏｒｆ１６７およびＲｅｌＡ／ｐ６５に対する抗体、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７についてのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞およびＬＣ３１９細胞を使用したウエスタンブロッティングの結果を示す。これらの細胞株を、１５分間、５０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαにより刺激した。核画分および細胞質画分を、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して単離した。パートＢは、内因性のＣ６ｏｒｆ１６７、ＲｅｌＡ／ｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＴＲＡＦ１に対する抗体、ならびにｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７またはｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を使用したウエスタンブロッティングの結果を示す。これらの細胞株を、１５、３０、６０、または１２０分間、５０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαにより処理した。Ｎ．Ｔ．は、ＴＮＦαにより処理されていないことを示す。 パートＣは、内因性のＣ６ｏｒｆ１６７、ＲｅｌＡ／ｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＡＴＭ、ＣＳＢ、ｐ５３に対する抗体、ならびにｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７オリゴヌクレオチドまたはｓｉ−ＬＵＣオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、その後、シスプラチン（ＣＤＤＰ；５０または１００μｇ／ｍＬ）で処理したＨｅＬａ細胞を使用したウエスタンブロッティングの結果を示す。パートＤは、Ｃ６ｏｒｆ１６７経路の模式図を示す。 図７はがん試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７ならびにその相互作用タンパク質ＮＦＫＢＩＬ２および下流タンパク質の発現を示す。パートＡは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出された、肺および食道のがん組織（Ｔ）ならびに肺および食道の隣接する正常組織（Ｎ）におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を示す。パートＢは、Ｃ６ｏｒｆ１６７、ＮＦＫＢＩＬ２、ＲｅｌＡ／ｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＴＲＡＦ１に対する抗体を使用したウエスタンブロッティングにより検出された、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびその相互作用タンパク質／下流タンパク質の発現パターンを示す。 図８は培養細胞においてＮＦＫＢＩＬ２がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質を安定化することを示す。ｓｉ−ＬＵＣオリゴヌクレオチド（対照）またはｓｉ−ＮＦＫＢＩＬ２オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞を使用した免疫細胞化学的解析。細胞を、抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体、抗ＮＦＫＢＩＬ２、およびＤＡＰＩにより染色した。 図９はＮＦＫＢＩＬ２に対するｓｉＲＮＡを使用した、がん細胞の増殖および／または生存の抑制を示す。パートＡは、ウエスタンブロッティングにより確認された、ＮＦＫＢＩＬ２に特異的なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉ−＃１およびｓｉ−＃２）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰおよびｓｉ−ＬＵＣ）による、肺癌細胞株ＬＣ３１９およびＡ５４９におけるＮＦＫＢＩＬ２発現のノックダウンを示す。パートＢは、ｓｉＲＮＡに応答した、ＭＴＴアッセイにより評価されたＬＣ３１９細胞およびＡ５４９細胞の生存能を示す。アッセイは全て、３連のウェルで独立して３回実施した。パートＣは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞およびＡ５４９細胞を使用したコロニー形成アッセイを示す。 図１０はＮＦＫＩＬ２タンパク質のＣ末端部分が、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質との結合にとって重要であることを示す。パートＡは、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を発現するベクターの設計を示す。 パートＢは、ＦｌａｇアガロースまたはＨＡアガロース、ならびに全長／部分Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ｆｌａｇタンパク質および全長／部分ＮＦＫＢＩＬ２−ＨＡタンパク質をコトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を使用して検出される、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質とＮＦＫＢＩＬ２タンパク質との間の結合を示す。パートＣは、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質および３種のＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質の細胞内局在を示す。ＣＯＳ−７細胞に、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターおよび部分ＮＦＫＢＩＬ２発現ベクター（Ｎ１〜Ｎ３）をコトランスフェクトした。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体により染色し；ＮＦＫＢＩＬ２を抗ＨＡ抗体により染色し、核をＤＡＰＩにより染色した。 図１１は外因性のＣ６ｏｒｆ１６７および／またはＮＦＫＢＩＬ２を発現しているがん細胞における、内因性ＲｅｌＡ／ｐ６５タンパク質の上昇した発現を示す。Ｆｌａｇタグ付きＣ６ｏｒｆ１６７発現ベクターおよび／またはＨＡタグ付きＮＦＫＩＢＬ２発現ベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を使用して、ウエスタンブロッティングを実施した。外因性のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質を、抗Ｆａｇ−Ｍ２抗体および／または抗ＨＡ（３Ｆ１０）抗体を使用して検出した。ＲｅｌＡ／ｐ６５の内因性ＮＦＫＢサブユニットを、抗ＲｅｌＡ／ｐ６５抗体（Ｆ−６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−８００８）を使用して検出した。 図１２はＴＮＦα刺激下での細胞の核におけるＲｅｌＡ／ｐ６５タンパク質の増加したレベルを示す。ＨｅＬａ細胞を、１５分間、５０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαにより処理した。細胞を、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、細胞質画分および核画分に分割した。Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＲｅｌＡ／ｐ６５に対する抗体を使用して、ウエスタンブロッティングを実施した。 図１３はＤＮＡ傷害条件下でｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７をトランスフェクトしたがん細胞の増加したサブＧ１集団を示す。パートＡは、ｓｉ−Ｃｏｒｆ１６７をトランスフェクトし、ＤＮＡ傷害剤によって処理したＨｅＬａ細胞の細胞周期分布を示す。ＨｅＬａ細胞におけるｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７によるＣ６ｏｒｆ１６７発現のノックダウンの後、細胞を、４８時間、シスプラチン（ＣＤＤＰ；５０μｇ／ｍＬ）または５−ＦＵ（５０μｇ／ｍＬ）により処理し、フローサイトメトリー解析のため採集した。Ｎ．Ｔ．は、ＣＤＤＰまたは５−ＦＵにより処理されていないことを示す。 パートＢは、ｓｉ−Ｃｏｒｆ１６７をトランスフェクトし、ＤＮＡ傷害剤によって処理したＨｅＬａ細胞の細胞周期分布を示す。ＨｅＬａ細胞におけるｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７によるＣ６ｏｒｆ１６７発現のノックダウンの後、細胞を、４８時間、シスプラチン（ＣＤＤＰ；５０μｇ／ｍＬ）または５−ＦＵ（５０μｇ／ｍＬ）により処理し、フローサイトメトリー解析のため採集した。Ｎ．Ｔ．は、ＣＤＤＰまたは５−ＦＵにより処理されていないことを示す。
態様の説明
本明細書に記載の方法および材料と類似したまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いることができるが、典型的な方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載される特定のサイズ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
定義：
本明細書で用いられる「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その」という単語は、特に他に具体的に指示がない限り「少なくとも一つ」を意味する。
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関連して本明細書で用いられる「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中に他に含まれ得る少なくとも一つの物質を実質的に含まないということを示す。従って、単離されたまたは精製されたポリペプチドとは、そのポリペプチドの由来元である細胞もしくは組織源に由来する、炭水化物、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、または化学合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドがそこから単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から該ポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。従って、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）を有するポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、ポリペプチドは同様に好ましくは培養液を実質的に含まず、培養液がタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満であるポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、ポリペプチドは好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質がタンパク質調製物の体積の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満であるポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそのゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示すことができる。好ましい態様において、本発明において用いられるポリペプチドおよび本発明のポリペプチドは、単離されているかまたは精製されている。
「単離された」または「精製された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子および二本鎖分子（例えばｓｉRNA）は、組換え技法によって作製された場合には、他の細胞材料もしくは培養液を実質的に含まなくてよく、または化学合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、一つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾された天然アミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、類似した機能を有する、化学物質を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、公知の３文字表記または１文字表記により言及されてもよい。
本明細書で用いられる「生物学的試料」という語句は、生物全体、または、その組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」という語句はさらに、生物全体からまたはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、あるいはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」という語句は、細胞成分、例えばタンパク質またはポリヌクレオチドを含む、生物が増殖した培地、例えば栄養ブイヨンまたはゲルを指す。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特に他に具体的に指示がない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードにより参照される。アミノ酸と同様に、それらは天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。
特記しない限り、「がん」という用語は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現するがんを指す。Ｃ６ｏｒｆ１６７を過剰発現するがんの例には、ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを含む肺癌が含まれるが、これに限定されない。ＮＳＣＬＣには、腺癌（ＡＤＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「二本鎖分子」という用語は、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、および短鎖干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指す。本明細書において、「二本鎖分子」は、「二本鎖核酸」、「二本鎖核酸分子」、「二本鎖ポリヌクレオチド」、および「二本鎖ポリヌクレオチド分子」とも称される。
本発明の文脈において「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために用いられる。修飾語「薬学的」に関して（「薬学的組成物」のように）用いられる場合、そのような用語は、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、一つもしくは複数の成分の解離から、または一つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を含む生成物を包含することが意図される。従って、本発明との関連において、「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の生成物を指す。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、有効成分をある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、組成物中の物質を指す。特に、薬学的な組成物という文脈において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に用いるための薬学的な組成物の場合、組成物中の有効成分は、がん細胞および／または組織に対して直接的または間接的に、少なくとも一つの生物学的作用または生理的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低下または阻害、がん細胞および／または組織の損傷または殺傷などが含まれ得る。製剤化される前には、この「有効成分」は「バルク」、「原薬」、または「原体」とも称され得る。
遺伝子およびポリペプチド：
本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７をコードする遺伝子が、非がん性組織と比較してがんにおいて過剰発現されているという発見に一部基づく。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリヌクレオチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのアミノ酸配列は当業者に公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）のようなウェブサイト上の遺伝子データベースから得られる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリヌクレオチドの例示的なヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７および１９に示され、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８および２０に示される。配列データは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８４６８またはＮＰ＿９４０８７０を介しても入手可能である。ＮＦＫＢＩＬ２ポリヌクレオチドの例示的なヌクレオチド配列も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示され、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される。配列データは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１３４３２またはＮＰ＿０３８４６０を介しても入手可能である。Ｃ６ｏｒｆ１６７配列またはＮＦＫＢＩＬ２配列が、これらの配列に限定される必要はなく、変種（例えば、機能的等価物および対立遺伝子変種）を、下記のように本発明において使用することができることを当業者は認識するであろう。
本発明の一つの局面によれば、機能的同等物もまた「Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド」または「ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチド」と見なされる。本明細書において、タンパク質（例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチド」）の「機能的同等物」とは、そのタンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いてもよい。そのような機能的同等物には、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の天然アミノ酸配列に対して一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、ポリペプチドは、各タンパク質の配列と少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称される）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、多くの場合には約９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成され得る。
本発明で用いるポリペプチドには、その産生に用いた細胞もしくは宿主または利用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、ヒトＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質と同等の機能を有する限り、これは、本発明の範囲内である。
他の態様において、ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＮＦＫＢＩＬ２遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下では異なり得る。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によって達成させてもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、以下が挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、あるいは５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、加えて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおいて５０℃で洗浄。
本発明の文脈において、ヒトＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。例えば「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてプレハイブリダイゼーションを６８℃で３０分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加して、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行うことができる。例示的な低ストリンジェント条件としては、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。しばしば高ストリンジェント条件が好ましく用いられる。例示的な高ストリンジェント条件としては、室温で２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行った後に、３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を３回行い、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける２０分間の洗浄を２回行うことが挙げられる。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
一般的に、タンパク質中の１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、そのタンパク質の機能に影響しない。実際に、変異タンパク質または改変タンパク質（すなわち、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元の生物学的活性を保持することが知られている(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。従って当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質が生じる「保存的改変」であると見なされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。従って、一つの態様において、本発明のペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７配列またはＮＦＫＢＩＬ２配列において１個、２個、またはさらにはそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されているアミノ酸配列を有し得る。
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されるわけではない。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。従って、典型的な態様において、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般的には３０アミノ酸またはそれ未満、好ましくは２０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは１０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは５もしくは６アミノ酸またはそれ未満、さらにより好ましくは３もしくは４アミノ酸またはそれ未満である。
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が挙げられる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の８群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
そのような保存的改変ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質に含まれる。しかしながら本発明はこれらに限定されず、該Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質は、該Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の少なくとも一つの生物学的活性が保持されている限り、非保存的改変物を含む。さらに、改変タンパク質は、多型バリアント、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＮＦＫＢＩＬ２遺伝子は、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。該Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはＮＦＫＢＩＬ２タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加えて、これらのタンパク質をコードするＤＮＡの配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いる、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。それぞれヒトＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＮＦＫＢＩＬ２遺伝子およびタンパク質と機能的に同等であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％またはそれ以上、好ましくは６０％またはそれ以上、より好ましくは８０％またはそれ以上、さらにより好ましくは９０％〜９５％またはそれ以上、さらにより好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」におけるアルゴリズムに従うことによって決定することができる。
がんを診断する方法：
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現は、肺癌において特異的に上昇することが見出された（図１Ａ〜Ｃ、図７）。ノーザンブロット解析により、Ｃ６ｏｒｆ１６７は精巣を除き正常組織では発現しないことが示された（図１Ｄ）。従って、本明細書において同定されたＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子ならびにその転写産物および翻訳産物は、対象由来の生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現を測定することにより、肺癌などのがんのマーカーとして診断上有用である。対象由来の試料と正常試料との間でＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを比較することにより、がんを診断または検出することができる。より詳細には、本発明は、対象におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定することにより、がん、より詳細にはＣ６ｏｒｆ１６７関連がん、例えば肺癌の存在、またはそのようながんを発症する素因を検出、診断、および／または判定する方法を提供する。
従って本発明は、対象におけるがんを検出または診断する方法を提供し、該方法は、対象由来の生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが上昇していることにより、該試料中にがん細胞が存在することまたはその疑いがあることが示され、次いで該対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクがあることが示唆される。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルは、任意の公知の方法によって測定することができ、その例には、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出する段階；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する段階；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する段階
が含まれる。
典型的な態様において、本発明の方法によって診断されるがんは、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺癌である。ＮＳＣＬＣには、肺腺癌（ＡＤＣ）および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）が含まれるがこれに限定されない。
本発明に従って、対象の状態を調べるための中間的な結果が提供され得る。そのような中間的な結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する上で、医師、看護師、または他の関係者を補助することができる。従って本発明は、がんの診断マーカーとしてのＣ６ｏｒｆ１６７の使用を意図する。
あるいは、本発明は、対象由来の組織中のがん性細胞を検出または同定するために用いることができ、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることを特徴とするそのような細胞によって、該組織中にがん細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。Ｃ６ｏｒｆ１６７発現の結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する上で、医師、看護師、または他の医療関係者を補助することができる。言い換えれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば、本発明に従って、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関して疑いがある場合には、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、血中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮して、臨床決定に至ることができる。例えば、血中のいくつかの周知の診断的肺腫瘍マーカーは、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡである。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
以下の方法［１］〜［１１］が、本発明にとって特に関心対象となる：
［１］対象由来の生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんまたはがんを発症する素因を検出または診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが上昇していることにより、該対象におけるがんの存在、該対象ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクがあることが示される、方法。
［２］前記上昇が正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、［１］記載の方法。
［３］発現レベルが、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること、および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
の中より選択される方法によって検出される、［１］または［２］記載の方法。
［４］発現レベルが、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって測定される、［３］記載の方法。
［５］発現レベルが、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することによって測定される、［３］記載の方法。
［６］がんが肺癌である、［１］〜［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］生物学的試料が生検試料、痰、または血液を含む、［１］〜［６］のいずれか１項記載の方法。
［８］対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］〜［７］のいずれか１項記載の方法。
［９］対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法。
［１０］対象由来の生物学的試料ががん性上皮細胞を含む、［１］〜［９］のいずれか１項記載の方法、および
［１１］対象由来の生物学的試料が肺の組織または肺の細胞を含む、［１］〜[１０]のいずれか１項記載の方法。
本発明のがんを診断する方法を以下に、より詳細に説明する。
本発明の方法によって診断を受ける対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
診断を受ける対象から生物学的試料を採取して、診断を行うことが好ましい。Ｃ６ｏｒｆ１６７の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生物学的材料を測定のための生物学的試料として用いることができる。生物学的試料には、がんを診断することが望まれるかまたはがんに罹患していることが疑われる身体組織、ならびに生検試料、血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがん性である疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要に応じて、採取された身体組織または体液から細胞を精製し、その後これを生物学的試料として用いてもよい。典型的な態様において、生物学的試料は、診断を受ける対象から採取された肺細胞または肺組織を含み得る。
本発明に従って、対象由来の生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写産物（ｍＲＮＡ）レベルで測定することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば、様々ながん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７のｃＤＮＡをプローブとして用いてもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。例えば、「実施例」で用いられるプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３〜６）を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出に使用してもよいが、本発明はそれらに限定されない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェント、中程度にストリンジェント、または低ストリンジェントな条件下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いられる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なると考えられる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては、温度が少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物（タンパク質）を検出することもできる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質（Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質）の量を測定してもよい。翻訳産物として該タンパク質の量を測定する方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製し得る。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強力な染色の観察により、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の存在の増加、およびそれと同時にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の高発現レベルが示される。
さらに、診断の精度を向上させるために、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルに加えて、その他のがん関連遺伝子、例えばがんにおいて差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルを測定してもよい。
生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、それが、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルから例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇していると見なされ得る。
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が判明している一名／複数名の対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、試験生物学的試料と同時に測定してもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象由来の試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の予め測定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。さらに、本発明の一つの局面に従って、生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較してもよい。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得てもよい。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を基準値として用い得る。
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出される試験遺伝子の発現レベルを意味し、正常対照レベルおよびがん対照レベルの両方を包含する。「正常対照レベル」という語句は、正常な健常個体またはがんに罹患していないことが公知である個体集団において検出される遺伝子の発現レベルを意味する。正常な個体とは、肺癌の臨床症状が無い個体である。正常対照レベルは、非がん組織から得られた正常細胞を用いて測定することができる。「正常対照レベル」はまた、肺癌に罹患していないことが分かっている個体または集団の正常な健常組織または健常細胞において検出される試験遺伝子の発現レベルであってもよい。一方、「がん対照レベル」という語句は、肺癌に罹患している個体または集団のがん組織またはがん細胞において検出される試験遺伝子の発現レベルを意味する。
正常対照レベルと比較した、対象由来の試料において検出されるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの増加は、（その試料が得られた）対象が肺癌に罹患しているかまたは肺癌を発症するリスクを有することを示す。本発明の文脈において対象由来の試料は、被験対象、例えばがんを有すると推測される患者から得られた任意の組織であり得る。例えば組織は上皮細胞を含み得る。より具体的には組織は、がん性と推測される領域から収集された上皮細胞であり得る。
あるいは対象由来の生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを、（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のがん対照レベルと比較することができる。対象由来の生物学的試料の発現レベルとがん対照レベルとの間の類似性は、（その試料が得られた）対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す。がんに関係のあるその他の遺伝子の発現レベルも測定され比較される場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示す。
本明細書において、遺伝子発現が、対照レベルと比較して、例えば、１０％、２５％、もしくは５０％、または少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、またはそれ以上、変化するかまたは増加する場合、その遺伝子発現レベルは「変更」または「増加」していると見なされる。従って、生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の正常対照レベルから、例えば、１０％以上、２５％以上、もしくは５０％以上増加するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増加する場合、増加していると見なすことができる。標的遺伝子の発現レベルは、検出することによって測定され得、例えば試料中の遺伝子転写物との核酸プローブのハイブリダイゼーション強度により測定され得る。
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７が有用な診断マーカーであるばかりでなく、がん治療に適した標的であることも明らかにされる。従ってＣ６ｏｒｆ１６７を標的とするがん治療が、本発明によって達成され得る。本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７を標的とするがん治療とは、がん細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７の活性および／または発現の抑制または阻害を指す。Ｃ６ｏｒｆ１６７を標的とするがん治療に、任意の抗Ｃ６ｏｒｆ１６７剤を用いることができる。本発明において、抗Ｃ６ｏｒｆ１６７剤は以下の物質または有効成分を含む：
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｃ）それをコードするベクター。
従って典型的な態様において、本発明は、（ｉ）対象が抗Ｃ６ｏｒｆ１６７剤で治療すべきがんを有するかどうかを診断し、かつ／または（ｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７を標的とするがん治療のために対象を選択する方法を提供し、該方法は、
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階；
ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
あるいは、そのような方法は、
ａ）治療すべきがんを有する疑いのある対象から採取されたがん細胞または組織中のＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルを測定する段階；
ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現レベルががん性対照レベルと類似するかまたは同等である場合に、該対象が治療すべきがんを有すると診断する段階；および
ｄ）段階ｃ）において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階
を含む。
がんを診断するためのキット：
本発明はまた、がんを診断するためのキットを提供し、このキットはまた、がん治療の有効性を評価および／またはモニターするのにも有用であり得る。本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクターで治療され得るがんに罹患している対象を判定するためのキットを提供し、このキットはまた、そのようながん治療の有効性を評価および／またはモニターするのにも有用であり得る。好ましくは、本発明のキットによって診断されるがんは、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺癌である。より好ましくは、本キットは、対象由来の生物学的試料中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを検出するための少なくとも一つの試薬を含み、該試薬は、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡ（Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡ）を検出するのに適した試薬には、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドのような、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、または該ｍＲＮＡを同定する核酸が含まれる。このようなオリゴヌクレオチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズし、このハイブリダイゼーションレベルはＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡの量と相関する。このような種類のオリゴヌクレオチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡに特異的であるプライマーおよびプローブによって例証される。このような種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製し得る。必要に応じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化してもよい。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めてもよい。
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的にはＣ６ｏｒｆ１６７配列を含む核酸の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列、もしくはＣ６ｏｒｆ１６７配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはこれらの配列の天然に存在する変異体の少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。具体的には、例えば好ましい態様において、５〜５０ｂｐの長さを有するオリゴヌクレオチドが、検出される遺伝子の増幅のためのプライマーとして使用され得る。より好ましくは、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、１５〜３０ｂｐの長さを有するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーにより検出され得る。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５ｂｐから選択され得る。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用することによる遺伝子の検出のためのアッセイ法、装置、または試薬は、周知である（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーは、タグ配列またはリンカー配列を含んでいてもよい。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能標識または捕捉されるアフィニティリガンドにより修飾されていてもよい。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく検出法においては、数百（例えば、約１００〜２００）塩基〜数キロ（例えば、約１０００〜２０００）塩基の長さを有するポリヌクレオチドも、プローブのために使用され得る（例えば、ノーザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。
一方、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するのに適した試薬には、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることもできる。タンパク質を検出するためのこのような種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの同等物を調製し得る。さらに、直接連結または間接標識技法により、抗体をシグナル発生分子で標識してもよい。標識、および抗体を標識し、それらの標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明に使用してもよい。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めてもよい。
さらに、例えば、生物学的試料中の発現したＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質による細胞増殖活性を測定することにより、生物学的活性を測定することができる。例えば、対象由来の生物学的試料の存在下で細胞を培養し、次に増殖の速度を検出することにより、または細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することにより、生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。必要に応じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体基質上に固定化してもよい。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物学的活性を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めてもよい。
本キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。さらに、本キットは、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対するプローブまたはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を結合させるための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含み得る。例えば、がんに罹患しているかまたは罹患していない対象から採取された組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。これらの試薬等は、ラベルを貼った容器中に提供され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
本発明の一つの態様として、試薬がＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体基質上に固定化して、少なくとも一つの検出部位を形成させてもよい。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。検査ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、検査ストリップとは別のストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含み得る、すなわち、第１検出部位ではより大量の固定化核酸を、および以降の部位ではより少量の固定化核酸を含み得る。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出可能な任意の形状で構成してもよく、典型的には、検査ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性および／もしくは陰性対照試料、ならびに／またはＣ６ｏｒｆ１６７標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、Ｃ６ｏｒｆ１６７陽性のがん組織試料を回収することによって調製し得る。そのようなＣ６ｏｒｆ１６７陽性試料は、例えば、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、Ａ５４９、ＬＣ３１９等の肺腺癌細胞（ＡＤＣ）株；ＮＣＩ−Ｈ２６、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ２１７０等の肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）細胞株；およびＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、Ｈ１９６、Ｈ４４６等のＳＣＬＣ細胞株を含む、樹立された肺癌細胞株から得てもよい。あるいは、Ｃ６ｏｒｆ１６７陽性試料は、肺線癌組織、肺扁平上皮癌組織、およびＳＣＬＣ組織を含む臨床肺癌組織から得てもよい。あるいは、陽性対照試料は、カットオフ値を決定し、そのカットオフ値よりも多くのＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を含む試料を調製することにより、調製してもよい。本明細書において、「カットオフ値」という語句は、正常範囲とがん性範囲を分割する値を指す。例えば、当業者は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてカットオフ値を決定し得る。本発明のキットは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡまたはポリペプチドのカットオフ値量を含むＣ６ｏｒｆ１６７標準試料を含み得る。反対に、陰性対照試料は、非がん性細胞株もしくは正常肺組織などの非がん性組織から調製してもよく、またはカットオフ値未満のＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡもしくはタンパク質を含む試料を調製することにより、調製してもよい。
あるいは、本発明は、がんを診断するための診断試薬を調製するための試薬の使用を提供する。ある態様において、試薬は、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
具体的には、そのような試薬は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に結合する抗体を含む。さらに本発明は、がんを検出または診断するための試薬もまた提供する。典型的な態様においてこのような試薬は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の ｍＲＮＡにハイブリダイズするかオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む。
抗がん物質のスクリーニング：
本発明を通じて、Ｃ６ｏｒｆ１６７ががん細胞の増殖に関与することが実証された。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルおよび／またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性を抑制する物質は、がんを治療および予防することのいずれかまたは両方のために有用である。そのような物質は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド、または該遺伝子の転写調節領域を用いてスクリーニングすることができる。従って本発明はまた、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、がんを治療および予防することのいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明において、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドがＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと相互作用することがさらに実証されている。本明細書において実証されるように、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在はがん細胞増殖において重要であり、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドがそのような核局在に関与している。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の相互作用を阻害する物質も、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のために有用である。そのような物質は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する物質を同定することによってスクリーニングすることができる。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する物質を同定することによって、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。
本発明の文脈において、本発明のスクリーニング法により同定される物質は、任意の化合物またはいくつかの化合物を含む組成物であってよい。さらに、本発明のスクリーニング法に従って細胞またはタンパク質に曝露させる試験物質は、単一の物質であっても、または物質の組み合わせであってもよい。本方法において物質の組み合わせを用いる場合には、物質を連続して接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
本発明のスクリーニング法によってスクリーニングされる物質は、がんを治療および／もしくは予防する、ならびに／またはがん細胞の増殖を阻害するのに適した候補物質であり得る。本発明において、がんは好ましくは、Ｃ６ｏｒｆ１６７過剰発現との関連によって特徴づけられる。従って、スクリーニングされる物質は好ましくは、Ｃ６ｏｒｆ１６７過剰発現と相関または関連するがんに適用され得る。典型的な態様において、Ｃ６ｏｒｆ１６７過剰発現と相関または関連するがんは、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む肺癌である。ＮＳＣＬＣには、肺腺癌（ＡＤＣ）および肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等の核酸構築物を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験物質は、（１）生物学的ライブラリー法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリー法または溶液相ライブラリー法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは物質のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または化合物の低分子ライブラリーにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリーを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリーは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
本発明のスクリーニング法のいずれか一つによってスクリーニングされた物質の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって得られる物質に含まれる。
さらに、本発明のスクリーニング法によって得られた候補物質がタンパク質である場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られたタンパク質の部分アミノ酸配列を解析して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられるオリゴＤＮＡプローブを調製してもよい。次いで、得られたＤＮＡが候補物質をコードしていることを確認するために試験されてもよい。
本明細書に記載されるスクリーニングにおいて用いられる試験物質はまた、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質またはインビボで元のタンパク質の生物学的活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であってもよい。
試験物質ライブラリーの構築は当技術分野で周知であるが、本スクリーニング法のための試験物質の同定およびそのような物質のライブラリー調製に関するさらなる指針を、本明細書において以下に提供する。
（ｉ）分子モデリング：
試験物質ライブラリーの構築は、求められる特性を有することが既知である物質の分子構造、および／またはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験物質を予備スクリーニングするための一つのアプローチは、試験物質とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングを利用することである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな物質の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな物質が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該物質および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異性を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−物質間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）コンピュータが必要である。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動解析が可能になる。
多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングに関して発表しており、例えばRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90を含む。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターすなわち「試験物質」のライブラリーを、がんが肺癌である、がんを治療および／もしくは予防する、ならびに／またはがんの術後再発を予防するのに適した、試験物質を同定するための本発明の方法を用いて、スクリーニングしてもよい。
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験物質のコンビナトリアルライブラリーは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリーを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリーを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリーを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリーである。そのようなペプチドライブラリーは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリーは、線形コンビナトリアル化学ライブラリーと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかによって作成することができる。コンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。化学的多様性ライブラリーを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報 ＷＯ９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報 ＷＯ９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（ｒａｎｄｏｍ ｂｉｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば国際公開公報 ＷＯ９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリー（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリー（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ，３９０ ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照されたい）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体で市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等を参照されたい）。
（ｉｉｉ）その他の候補：
別のアプローチは、ライブラリーを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリーを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
アプタマーは、特定の分子標的に強く結合する核酸からなる巨大分子である。TuerkおよびGold(Science. 249: 505-510 (1990））は、アプタマー選択のためのＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリー｛例えば、１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
Ｉ．タンパク質に基づくスクリーニング法
本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを用いて、がんの治療および予防のいずれか又は両方のために適用可能な候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング法との関連において、用いられるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってよい。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然由来のタンパク質、またはその部分ペプチドであってよい。
天然に存在するＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに加えて、該ポリペプチドの機能的等価物が、この修飾されたペプチドが元のポリペプチドの少なくとも１種の生物学的活性を保持する限り、本発明のスクリーニングのために使用されるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに含まれ得る。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性の例には、細胞増殖活性、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性が含まれるが、これらに限定されない。そのような機能的等価物の典型的な例は、上記の「遺伝子およびポリペプチド」という表題のセクションに記載されている。例えば、そのような機能的等価物の好ましい例には、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドのＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインを含有するポリペプチドが含まれる。ＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインを含有するそのようなポリペプチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０の１〜４１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質は、インビトロ翻訳系によってインビトロで作製され得る。
本発明のスクリーニング法において使用されるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、例えば、精製されたポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
本発明の方法に用いられるポリペプチドまたは断片は、従来の精製法により天然タンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学合成を通して得てもよい。例えば、この合成に採用できる従来のペプチド合成法には、以下のものが含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成，丸善，１９７５；
４）ペプチド合成の基礎と実験，丸善，１９８５；
５）医薬品の開発（続 第１４巻）ペプチド合成，広川書店，１９９１；
６）国際公開公報 ＷＯ９９／６７２８８号；および
７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
あるいは、関心対象のポリペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適応して、前記タンパク質を得てもよい（例えば、Morrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、所望のタンパク質を発現可能な形態で（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換し、次に該宿主細胞を培養して、該タンパク質を産生させる。より具体的には、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８などの、外来遺伝子を発現させるためのベクターに、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞で発現させる。発現用に、プロモーターを用いることができる。例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ最初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等を含む、一般的に用いられている任意のプロモーターを使用することができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の従来の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17；Sussman et al., Mol Cell Biol 1985, 4:1641-3）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37；Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30；Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）等に従って行うことができる。
ポリペプチドおよび断片が少なくとも１種の生物学的活性を保持する限り、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは他の物質とさらに連結されていてもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然ポリマーおよび合成ポリマー等が含まれる。そのような修飾は、付加的な機能を付与するかまたはポリペプチドおよび断片を安定化するために使用され得る。
例えば、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体のエピトープを、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として、ポリペプチドを発現させてもよい。例えば、市販されているエピトープ−抗体系が使用され得る（Experimental Medicine 13:85-90(1995)）。マルチクローニング部位の使用により、例えば、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。
融合により元のポリペプチドの特性が変化しないよう、数個〜１２個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製された融合タンパク質も、本明細書において提供される。ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ赤血球凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のようなエピトープ、およびそれらを認識する抗体が、ポリペプチド間の結合活性を検出するためのエピトープ−抗体系として使用され得る（Experimental Medicine 13:85-90(1995)）。
（ｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７結合物質のスクリーニング：
本発明の文脈において、正常器官ではＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子は発現しないが、肺癌においてＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現が検出された（図１）。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質を用いて、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。Ｃ６ｏｒｆ１６７はがんにおいて発現するため、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する物質はがん細胞の増殖を抑制するために用いることができ、そのためがんを治療および予防することのいずれかまたは両方のために有用であり得る。従って本発明はまた、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを用いて、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。特に、このスクリーニング方法の一つの態様は、
（ａ）試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたはその機能的等価物と該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドまたはその機能的等価物に結合する試験物質を選択する段階
を含む。
あるいは、本発明に従って、がんを治療および予防することのいずれかまたは両方のための試験物質の潜在的治療効果を評価または推定することもできる。ある態様において、本発明は、がんを治療および予防することのいずれかまたは両方のための、ならびに／またはＣ６ｏｒｆ１６７の過剰発現と関連するがんを阻害するための試験物質の治療効果を評価または推定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたはその機能的等価物と該試験物質との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）物質が該ポリペプチドまたはその機能的等価物に結合する場合に示される潜在的治療効果と該試験物質を相関させる段階
を含む。
本発明の文脈において、治療効果は試験物質とＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド（またはその機能的等価物）の結合レベルと相関し得る。例えば、試験物質がＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する場合には、該試験物質を、必要な治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質がＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合しない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さないと特徴づけることができる。
本発明の方法を以下に、より詳細に説明する。
スクリーニングに用いられるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然由来のタンパク質、またはその部分ペプチドであってよい。試験物質と接触させるポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってよい。
典型的な態様において、本発明によって用いられる試験物質は、抗体などのタンパク質または合成化合物であってよい。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いてもよい。そのようなスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって行うことができる。
免疫沈降法を用いる場合には、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは抗体認識部位を含むことが好ましい。本発明のスクリーニング法に用いられるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、上記のように調製することができる。あるいは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、上記のように融合タンパク質として発現させることができる。
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもでき、該抗体は上述のように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する段階、細胞中のタンパク質を標識する段階、該タンパク質を検出する段階によって、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを用いて該ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、ウエスト−ウエスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90(1991)）を用いることができる。詳細には、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を使用して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予測される培養細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させ、発現したタンパク質をフィルター上に固定し、精製されかつ標識されたＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを上記のフィルターと反応させ、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識に従って検出することにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、あるいはＣ６ｏｒｆ１６７またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに融合させた、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、ＧＳＴ）に特異的に結合する抗体を利用することによって標識し得る。放射性同位体または蛍光等を使用する方法もまた用いてもよい。
あるいは本発明のスクリーニング法の別の態様では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを用いてもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステム」、「哺乳動物ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドアッセイキット」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲワンハイブリッドシステム」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰツーハイブリッドベクターシステム」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。
ツーハイブリッドシステムでは、本発明のポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させ、酵母細胞で発現させる。本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると予測される細胞から、ライブラリーが発現した際にＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。次にこのｃＤＮＡライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリーに由来するｃＤＮＡを単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞で発現された場合、この２つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる）。ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、上記のようにして単離されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、該タンパク質を発現させることによって調製することができる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子のほかに、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する物質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてスクリーニングしてもよい。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化し、試験物質を含む組成物をカラムに供し得る。本明細書における組成物は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物、抗体ライブラリー等であってよい。試験物質を負荷した後にカラムを洗浄し、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合した物質を回収することができる。試験物質がタンパク質である場合には、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析して、その配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、そのオリゴＤＮＡをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを取得する。
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを、結合した物質を検出または定量するための手段として本発明において用いてもよい。このようなバイオセンサーを使用すると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと試験物質との間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。そのため、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを用いて、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと試験物質との間の結合を評価することが可能である。
固定化されたＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを、合成化学物質、または天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに曝露した際に結合する分子をスクリーニングする方法、およびＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質に結合するタンパク質のみならず化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、コンビナトリアルケミストリー技法に基づくハイスループットを用いたスクリーニング方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996);Verdine, Nature 384: 11-13 (1996);Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)）は、当業者に周知である。
（ｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７の生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング：
本発明の文脈において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、がん細胞の細胞増殖を促進する活性を有することを特徴とする（図２）。本発明の文脈において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドに結合する活性を有することも特徴とする（図３）。これらの生物学的活性を指標として使用して、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法、ならびにがん、特に肺癌のようなＣ６ｏｒｆ１６７関連がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための物質をスクリーニングする方法を提供する。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを使用して、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は以下のような段階を含む：
（ａ）試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、ポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階。
本発明によると、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド（またはその機能的等価物）の生物学的活性（例えば、細胞増殖活性）の抑制における試験物質の治療効果、またはがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための候補物質の治療効果が評価され得る。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を使用して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性を抑制する候補物質、またはがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の生物学的活性を試験物質の治療効果と相関させる段階。
あるいはいくつかの態様において、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現に関連したがんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現に関連したがんの増殖の阻害における試験物質の治療効果の評価または推定の方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）ある物質が該ポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を抑制する場合に、該試験物質の非存在下で検出されるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性と比較して示される潜在的治療効果と、該試験物質とを相関させる段階。
従って、本発明のスクリーニング法において同定された候補物質は、がんの治療または予防において使用することができる。そのようながんには肺癌が含まれる。
本発明の文脈において、治療効果は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性と相関させてもよい。例えば、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を抑制するかまたは阻害する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択され得る。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を抑制または阻害しない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有しない物質として同定され得る。
本発明の方法を、より詳細に以下に記載する。
Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性を保持する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングのために使用することができる。そのような生物学的活性の例には、細胞増殖促進活性、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性、および核局在活性が含まれるが、これらに限定されない。例えば、天然に存在するヒトＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を使用することができ、これらのポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドも使用することができる（「遺伝子およびポリペプチド」を参照のこと）。そのようなポリペプチドは、細胞によって内因的にまたは外因的に発現され得る。そのようなポリペプチドを調製する方法は上に記載されている。
別の局面において、本発明は、上記「スクリーニング」セクションに記載された方法によるスクリーニング法も提供し、このような方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドまたは機能的等価物と試験物質との間の結合を検出する段階；
（ｃ）該ポリペプチドまたは機能的等価物に結合する試験物質を選択する段階；
（ｄ）段階（ｃ）において選択された試験物質をＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたは機能的等価物と接触させる段階；
（ｅ）段階（ｄ）において検出されるポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を、試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較する段階；および
（ｆ）該ポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を、肺癌の治療または予防のための候補物質として選択する段階。
このスクリーニングにより単離された物質は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってそのポリペプチドの機能を阻害する分子を指す。この用語は、Ｃ６ｏｒｆ１６７をコードする遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する分子も指す。さらに、このスクリーニングにより単離された物質は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドと（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）分子とのインビボ相互作用を阻害する物質の候補である。
本発明の方法において検出される生物学的活性が細胞増殖である場合、それは例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験物質の存在下で細胞を培養して、細胞の増殖スピードの測定、細胞周期の測定等によって検出することができるし、例えば図２に示される、生存細胞またはコロニー形成活性の測定によって検出することもできる。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞の増殖スピードを低下させる物質が、がんの治療または予防のための候補物質として選択される。
より具体的には、方法は、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する段階；および
（ｃ）試験物質の非存在下での細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験物質を選択する段階
を含む。
好ましい態様において、本発明の方法は、
（ｄ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を全くまたはほとんど発現していない細胞に対しては効果を有しない試験物質を選択する段階
をさらに含んでいてもよい。
「生物学的活性を抑制する」という語句は、本明細書において定義されるように、物質の非存在下との比較における、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、最も好ましくは９０％の抑制である。
典型的な態様において、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現しない対照細胞が使用される。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を使用して、細胞増殖を阻害する候補物質、またはＣ６ｏｒｆ１６７関連疾患の治療および予防のいずれかもしくは両方のための候補物質をスクリーニングする方法も提供し、以下のような段階を含む：
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞、およびＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現しない対照細胞を、試験物質の存在下で培養する段階；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを発現する細胞および対照細胞の生物学的活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）対照細胞において検出される増殖および試験物質の非存在下で検出される増殖と比較して、タンパク質を発現する細胞における生物学的活性を阻害する試験物質を選択する段階。
本発明のスクリーニング法において検出される生物学的活性が、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性である場合、それは、例えば試験物質の存在下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を検出することにより検出することができる。詳細は以下の項目「（ｉｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７とＮＦＫＢＩＬ２との間の結合を阻害する物質のスクリーニング」に記載する。
本発明のスクリーニング法において検出される生物学的活性が、核局在活性である場合、それは例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞を調製し、試験物質の存在下で細胞を培養し、核に局在するＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物のレベルを測定することによって検出することができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物の核局在レベルは、当技術分野において周知の方法によって測定され得る。例えば核局在は、実施例に記載されるように、免疫細胞化学的解析、または細胞分画後のＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに対する抗体を使用したウエスタンブロッティング解析により検出することができる。
本明細書において明らかにされるように、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性の抑制は、細胞増殖を低下させる。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性を阻害する候補物質をスクリーニングすることにより、がんの治療および／または予防のために使用することができる候補物質を同定することができる。がんの治療または予防のためのこれらの候補物質の可能性は、がんのための治療用物質を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングにより評価され得る。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質が、がんの活性も阻害する場合、そのような物質はＣ６ｏｒｆ１６７特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
（ｉｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７とＮＦＫＢＩＬ２との間の結合を阻害する物質のスクリーニング：
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドがＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドと相互作用することが確認された（図３）。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する物質は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合を指標として使用して同定され得る。その観点から、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することが、本発明の目的である。さらに、実施例において実証されるように、ＮＦＫＢＩＬ３ポリペプチドは、がん細胞増殖にとって重要であるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在に関与している。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する物質は、がん治療剤のために有用である。従って本発明は、がん細胞の増殖を阻害するかまたは低下させる候補物質、およびがん、例えば肺癌の治療または予防のための候補物質をスクリーニングする方法も提供する。
従って、本発明は、以下の［１］〜［７］記載の方法を提供する：
［１］（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）におけるポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出される結合レベルを、試験物質の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）ポリペプチド間の結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験物質を選択する段階：
を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害するかまたは低下させる物質をスクリーニングする方法。
［２］（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）におけるポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出される結合レベルを、試験物質の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）ポリペプチド間の結合レベルを低下させるかまたは阻害する試験物質を選択する段階：
を含む、がんの治療および／もしくは予防またはがん細胞増殖の阻害のために適当な候補物質をスクリーニングする方法。
［３］Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドのＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインのアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載の方法。
［４］Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０の１〜４１４のアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載の方法。
［５］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインのアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載の方法。
［６］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９３２〜１３７８のアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載の方法、ならびに
［７］がんが肺癌である、［２］〜［６］のいずれか一項記載の方法。
本発明によると、細胞増殖の阻害における候補物質の治療効果、またはがんの治療および／もしくは予防に関する候補物質の治療効果が評価され得る。従って本発明は、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、ならびにがんの治療および／または予防に適合した候補物質をスクリーニングする方法も提供する。
そのような方法の例示的な例は、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）におけるポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出される結合レベルを、試験物質の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを試験物質の治療効果と相関させる段階：
を含む。
あるいは、他の態様において、本発明は、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と、試験物質の存在下で接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）におけるポリペプチド間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）において検出される結合レベルを、試験物質の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）試験物質が結合レベルを低下させる場合に示される潜在的治療効果と試験物質とを相関させる段階：
を含み、がんの治療および予防のいずれかもしくは両方、またはがんの阻害に関する試験物質の治療効果の評価または推定の方法を提供し得る。
本発明の文脈において、治療効果は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合レベルと相関させられ得る。例えば試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合レベルを低下させる場合、その試験物質は、所望の治療効果を有する候補物質として同定または選択され得る。あるいは試験物質が、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合レベルを低下させない場合、その試験物質は有意な治療効果を有しない物質として同定され得る。
本発明の文脈において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドと等価な生物学的活性を有するであろう（「遺伝子およびポリペプチド」を参照のこと）。典型的な態様において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドのＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインを含む。そのような機能的等価物の例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０の１〜４１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。同様に典型的な態様において、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含む。そのような機能的等価物の例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９３２〜１３７８のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。
Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害するかまたは低下させる物質のスクリーニングの文脈において、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。そのようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降、ウエストウエスタンブロッティング解析（Skolnik et al.,Cell 65:83-90(1991)）、細胞を利用したツーハイブリッド系（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参照「Dalton and Treisman,Cell 68:597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz,Trends Genet 10:286-92(1994)」）、アフィニティークロマトグラフィー、および表面プラズモン共鳴現象を使用したバイオセンサーを介して実施することができる。それらの方法は、上記「（ｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７結合物質のスクリーニング」の項目に記載された方法に類似した様式で実施することができる。
いくつかの態様において、本発明のスクリーニング法は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの両方を発現する細胞を使用した、細胞に基づくアッセイにおいて実施され得る。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドを発現する細胞には、例えば、がん、例えば肺癌から確立された細胞株が含まれる。あるいは細胞は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる形質転換を通して調製され得る。そのような形質転換は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの両方をコードする発現ベクター、またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドもしくはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのいずれかをコードする発現ベクターを使用して実施され得る。本発明のスクリーニング法は、試験物質の存在下でそのような細胞をインキュベートすることにより実施され得る。ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとの間の結合は、抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体または抗ＮＦＫＢＩＬ２抗体を使用した免疫沈降アッセイにより検出され得る。
免疫沈降法が使用される場合、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよびＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドは抗体認識部位を含有することが好ましい。例えばＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよび／またはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドは、そのポリペプチドと市販されているエピトープとを含む融合タンパク質として調製され得る。そのような融合タンパク質を調製する方法は、上に記載されている。
免疫沈降においては、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよび／またはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドに融合したエピトープに対する抗体を、適切な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物へ添加することにより、免疫複合体が形成され得る。免疫複合体は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドと抗体とからなる。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体の使用に加えて、上記のように調製することができるＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドおよび／またはＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドに対する抗体を使用して実施することもできる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって、免疫複合体を沈降させることができる。
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合の抑制が、がん細胞の増殖の抑制をもたらすことが明らかにされる。従って、物質がＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する場合、その阻害は、対象における潜在的治療効果を示す。本発明において、潜在的治療効果とは、合理的に予想される臨床的有効性を指す。本発明において、そのような臨床的有効性には、
（ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合の低下、
（ｂ）対象におけるがんのサイズ、蔓延、もしくは転移能の減少、
（ｃ）さらなるがん形成の予防、または
（ｄ）がんの臨床症状の予防もしくは軽減
が含まれ得る。
ＩＩ．Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現を変更する物質のスクリーニング：
本明細書に示したように、ｓｉＲＮＡによるＣ６ｏｒｆ１６７の発現の減少は、がん細胞の増殖の阻害を引き起こす（図２Ａ〜Ｃ）。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現を阻害する物質は、がん細胞の増殖を抑制し、よってがん、特に肺癌などのＣ６ｏｒｆ１６７関連がんを治療または予防するのに有用である。従って本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；および
（ｂ）段階（ａ）の細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを検出する段階；
（ｃ）試験物質の非存在下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）（ｂ）の発現レベルを該試験物質の治療効果と相関させる段階。
本発明の文脈において、治療効果はＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルと相関し得る。例えば、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択し得る。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定し得る。
本発明の方法を以下に、より詳細に説明する。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞には、例えば肺癌から樹立された細胞株、またはＣ６ｏｒｆ１６７発現ベクターをトランスフェクトした細胞株が含まれる；そのような細胞のいずれかを、本発明のスクリーニング法に用いることができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって評価することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」という語句は、物質の非存在下における発現レベルと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは少なくとも９５％のレベル低下である。本明細書における物質には、化合物、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は以下に記載する。本スクリーニング方法において、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを低下させる物質を、がんの治療または予防に用いられる候補物質として選択することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含み得る：
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）このレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）このレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる試験物質を選択する段階。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が含まれるが、これらに限定されず、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域は、転写開始部位から少なくとも５００ ｂｐ上流、好ましくは１０００ ｂｐ、より好ましくは５０００または１００００ ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法、およびアッセイプロトコールもまた周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
このようなレポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に導入し、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現レベルまたは活性を低下させる」とは、試験物質の非存在下と比較して、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは少なくとも９５％の低下である。
あるいは、ある態様において、本発明はまた、がんの治療もしくは予防、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現と関連したがんの阻害に及ぼす試験物質の治療効果を評価または推定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）このレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験物質が該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合に示される潜在的治療効果と該試験物質とを相関させる段階
を含む。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に及ぼす試験物質の治療効果、またはＣ６ｏｒｆ１６関連疾患、例えばがんを治療もしくは予防するための候補物質の治療効果を評価し得る。従って本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補物質をスクリーニングする方法、およびＣ６ｏｒｆ１６７関連疾患を治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法を提供する。
別の局面に従って、本発明は以下の段階を含む方法を提供する：
（ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子から構成されるベクターを導入した細胞と接触させる段階；
（ｂ）このレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する段階；ならびに
（ｃ）（ｂ）の発現レベルまたは活性を該試験物質の治療効果と相関させる段階。
本発明において、治療効果は前記レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と相関し得る。例えば、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる場合には、該試験物質を、治療効果を有する候補物質として同定または選択し得る。あるいは、試験物質が、該試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させない場合には、該試験物質を、有意な治療効果を有さない物質として同定し得る。
（ｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する；（ｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞増殖活性、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドに対する結合活性、核局在活性）、を抑制する／低下させる；（ｉｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを低下させる候補物質をスクリーニングする、または（ｉｖ）Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害または低下させることにより、がん（例えば、肺癌）を治療または予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質の治療可能性は、がんのための治療物質を同定するための二次および／またはさらなるスクリーニングによって評価し得る。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する物質ががんの上記の活性を阻害する場合には、そのような物質はＣ６ｏｒｆ１６７特異的治療効果を有すると結論付けられ得る。
二本鎖分子：
本明細書で用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
本明細書で用いられる「標的配列」は、遺伝子を発現する細胞に該配列を標的とする本発明の二本鎖核酸分子が導入された場合に、標的遺伝子のｍＲＮＡ全体の翻訳の抑制をもたらす、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列である。標的配列に相当する配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、標的遺伝子を発現する細胞において該遺伝子の発現を阻害する場合に、遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は標的配列であると判定され得る。遺伝子発現を抑制する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的配列および２〜５ヌクレオチド長の３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）からなってよい。
標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、標的配列を規定するために、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖配列、すなわちｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列に変換された配列が用いられる。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖、および該標的配列に対する相補配列を有するアンチセンス鎖からなり、アンチセンス鎖はセンス鎖と相補配列においてハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。
本明細書において、「〜に相当する」という語句は、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて標的配列を変換することを意味する。例えば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合には、該ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は塩基「ｕ」に置き換えられる。一方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合には、該ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は塩基「ｔ」に置き換えられる。本発明の文脈において、標的配列は主にＤＮＡで示される。
同様に、二本鎖分子のアンチセンス鎖に関して、標的配列に対する相補配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類に応じて規定され得る。
二本鎖分子は、標的配列に相当する配列およびそれに対する相補配列に加えて、２〜５ヌクレオチド長を有する１つもしくは２つの３'オーバーハング（例えば、ｕｕ）、および／または、センス鎖とアンチセンス鎖とを連結してヘアピン構造を形成するループ配列を有してよい。
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとする技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡには、Ｃ６ｏｒｆ１６７センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、Ｃ６ｏｒｆ１６７アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列で構成され、かつ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングする、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含んでよい。
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および指向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有できるものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡには、Ｃ６ｏｒｆ１６７センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、Ｃ６ｏｒｆ１６７アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が含まれる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、かつ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングする、２つの分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる（キメラ分子）か、あるいは代替的に、分子の一方がＲＮＡからなり、もう一方がＤＮＡからなる（ハイブリッド二本鎖）。
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および指向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によってループが生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で用いられる「単離された核酸」とは、その元の環境（例えば、天然のものであれば自然環境）から取り出され、従ってその天然状態から人工的に変更された核酸である。本発明の文脈において、単離された核酸の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体が含まれる。典型的な態様において、本発明の二本鎖分子が単離される。
標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子は、通常は該遺伝子の一本鎖ｍＲＮＡ転写物と結合し、それによってＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の翻訳を妨げ、従って該タンパク質の発現を阻害することにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の産生を低減または阻害する。本明細書で記述したように、いくつかのがん細胞株におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現が、ｄｓＲＮＡによって阻害された（図２）。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害し得る単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下に言及されるものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムにより設計することができる。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に関する標的配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６などの核酸配列を含む。
言い換えれば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に関する標的配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２；あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９などの核酸配列を含む。
本発明において特に興味深いのは、以下の二本鎖分子［１］〜［２０］である：
［１］細胞に導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、単離された二本鎖分子。
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の二本鎖分子。
［３］標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有するセンス鎖と、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するアンチセンス鎖とから構成される二本鎖分子であって、該鎖が標的配列において互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞に導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、二本鎖分子；
［４］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［３］記載の二本鎖分子。
［５］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３４４４〜３４６２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３６７１〜３６８９の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［３］記載の二本鎖分子。
［６］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［５］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
［７］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載の二本鎖分子。
［８］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載の二本鎖分子。
［９］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［８］記載の二本鎖分子。
［１０］センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［９］記載の二本鎖分子。
［１１］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［１０］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
［１２］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］が該標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１１］記載の二本鎖分子。
［１３］ＲＮＡから構成される、［１］〜［１２］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
［１４］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］〜［１２］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
［１５］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１４］記載の二本鎖分子。
［１６］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１５］記載の二本鎖分子。
［１７］ＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１４］記載の二本鎖分子。
［１８］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１７］記載の二本鎖分子。
［１９］隣接する領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１８］記載の二本鎖分子、ならびに
［２０］１つまたは２つの３'オーバーハングを含む、［１］〜［１９］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
本発明の二本鎖分子について、以下でより詳細に説明する。
細胞における標的遺伝子発現の阻害能を有する二本鎖分子を設計するための方法は公知である。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい。）例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から利用可能である。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択：
１．転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡおよび３'側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域は、調節タンパク質結合部位がより多い可能性があること、ならびにＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げ得ることから、これらに対するｓｉＲＮＡの設計を推奨していない。
２．潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較し、他のコード配列と有意な相同性を有する全ての標的配列を検討から外す。基本的には、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上で得られるＢＬＡＳＴを使用する（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402）。
３．合成に適格である標的配列を選択する。遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することが一般的である。
上記プロトコールを使用して、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の標的配列を、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９
のヌクレオチド配列として設計した。
上記標的配列は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６のヌクレオチド配列である。
標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について、上記標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ調査した。従って本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３４４４〜３４６２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３６７１〜３６８９の配列を標的とする二本鎖分子を提供する。あるいは、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の配列を標的とする二本鎖分子を提供する。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の上記の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、該標的配列の核酸配列および／または該標的配に対する相補配列を含有する単離されたポリヌクレオチドを含む。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５もしくは１６の配列、および／またはこれらのヌクレオチドに対する相補配列を含有するものが含まれる；しかしながら、本発明はこの例に限定されず、改変分子がＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限り、前述の核酸配列における軽微な改変は許容される。本明細書において、核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する核酸の１個、２個、または数個の置換、欠失、付加、または挿入を示す。
一つの態様において、二本鎖分子は２つのポリヌクレオチドからなり、一方のポリヌクレオチドは標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖を有し、もう一方のポリペプチドは該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
別の態様において、二本鎖分子は、標的配列に相当する配列、すなわちセンス鎖と、該標的配列に対する相補配列、すなわちアンチセンス鎖の両方を有するポリヌクレオチドからなる。一般的に、センス鎖とアンチセンス鎖は介在鎖によって連結され、互いにハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。そのような二本鎖分子の例には、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが含まれる。
言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチド、および該標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドから構成され、両ポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。該ポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部がＲＮＡであってもよく、標的配列がＤＮＡ配列で規定される場合には、該標的配列およびそれに対する相補配列内のヌクレオチド「ｔ」は「ｕ」に置き換えられる。
本発明の一つの態様において、本発明のそのような二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるステムループ構造を含む。センス鎖とアンチセンス鎖は、ループによって結合され得る。従って本発明はまた、介在一本鎖によって連結されたかまたは介在一本鎖が隣接するセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドから構成される二本鎖分子も提供する。
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を標的とする二本鎖分子は、標的配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６より選択される配列を有し得る。従って、本発明の二本鎖分子の好ましい例には、ポリヌクレオチドおよびそれに対する相補配列、ならびに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６に相当する配列およびそれに対する相補配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加、および／または挿入に適用される場合の用語「数個」とは、３〜７個、好ましくは３〜５個、より好ましくは３〜４個、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味し得る。
本発明に従って、本発明の二本鎖分子を、実施例において利用される方法を用いてその能力について試験することができる。本明細書に後述する実施例では、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従って、がん細胞株におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子産物の産生を低減させる能力についてインビトロで試験した。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞と比較した、該候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子産物の減少を、例えば、実施例１：「半定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の下で記載されるＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって、検出することができる。次に、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子産物の産生を低減させる配列を、細胞増殖に対する阻害効果について試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、がんを有する動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いてインビボでの能力について試験し、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子産物の産生の低減およびがん細胞増殖の低減を確認することができる。
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合できる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。一つの典型的な態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。いくつかの態様において、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に関して、ポリヌクレオチドは通常８６４３ヌクレオチド長未満である。例えばＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に関して、ポリヌクレオチドは５００ヌクレオチド長未満、２００ヌクレオチド長未満、１００ヌクレオチド長未満、７５ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子を形成するため、または、二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するために有用である。二本鎖分子を形成するためにポリヌクレオチドを使用する場合、該ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長くてよく、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長である。
従って本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列である。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
二本鎖分子は、該二本鎖分子を細胞に導入した場合にＲＩＳＣ複合体のｍＲＮＡにおける相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的ＲＮＡはダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断および分解され、これにより該二本鎖分子は最終的に、該ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるかまたは阻害する。従って、本発明の二本鎖分子は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成できる能力によって定義することができる。本明細書において、二本鎖分子から生成された一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と称される。本発明の文脈において、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列を用いてだけでなく、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列を用いても示すことができる。
本発明の二本鎖分子は、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非リン酸化ジエステル結合を含有してもよい。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報 ＷＯ０３／０７０７４４号、ＷＯ２００５／０４５０３７号）。一つの態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いてもよい。このような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
別の態様において、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端または５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２'−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（国際公開公報 ＷＯ２００４／０２９２１２号）が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報 ＷＯ２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様において、該二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端ヌクレオチド突出ヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換することができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらなる詳細については、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開文献が入手可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持する限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるかまたはその反対である構造のいずれかである。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなる構造である。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有することが好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。
キメラ型二本鎖分子の典型的な例として、二本鎖分子の上流部分領域（すなわちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５'側（５'末端）およびアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を示す。あるいは、センス鎖の５'末端および／またはアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。すなわち好ましい態様では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、または、センス鎖の５'末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５'−［−−−ＤＮＡ−−−］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（−−−ＲＮＡ−−−）−５'：アンチセンス鎖。
典型的には上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子のいくつかの例には、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５'側領域およびアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（ＵＳ２００５０００４０６４）。
本発明の文脈において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を停止するのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。従って、本発明は、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、［Ａ］は標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は該標的配列に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えばＣ６ｏｒｆ１６７に関するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６のヌクレオチド配列の中より選択され得る。あるいは標的配列は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２のヌクレオチド配列、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９のヌクレオチド配列の中より選択され得る。
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であり得る。領域［Ａ］は領域［Ａ'］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中より選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の典型的な二本鎖分子の例を以下に示す。以下の構造において、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中より選択されることができる；しかしながら、本発明はこれらに限定されない：
ＣＣＧＣＣＡＡＵＡＵＣＡＵＣＵＣＵＡＡ−［Ｂ］−ＵＵＡＧＡＧＡＵＧＡＵＡＵＵＧＧＣＧＧ
（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の場合）。
ＧＡＡＣＣＵＧＣＡＡＵＡＣＡＵＧＧＵＡ−［Ｂ］−ＵＡＣＣＡＵＧＵＡＵＵＧＣＡＧＧＵＵＣ
（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の場合）。
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、いくつかのヌクレオチドを標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に、３'オーバーハングとして付加することができる。３'オーバーハングを構成するヌクレオチドの典型的な例には「ｔ」および「ｕ」が含まれるが、これらに限定されない。付加するヌクレオチドの数は、少なくとも２個、一般的には２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加されたヌクレオチドは、二本鎖分子のアンチセンス鎖の３'末端において一本鎖を形成する。二本鎖分子が単一ポリヌクレオチドからなり、ヘアピンループ構造を形成する場合には、３'オーバーハング配列を該単一ポリヌクレオチドの３'末端に付加することができる。
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する具体例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例には、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が含まれる。
あるいは、二本鎖分子のコード配列を、適切な細胞内での該二本鎖分子の発現を支持する調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーター）を該コード配列に隣接して含むベクター内にクローニングすることによって、その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、該二本鎖分子を細胞内で転写してもよい。二本鎖分子のコード配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。二本鎖分子を産生することができるベクターについての詳細を以下に述べる。
二本鎖分子をコードするベクター：
上に示されたように、本発明は、本明細書に記載された二本鎖分子のうちの１種または複数種を含有するベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞を企図する。
本発明において特に興味深いのは、以下の［１］〜［１３］記載のベクターである。
［１］細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される二本鎖分子をコードするベクター。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するｍＲＮＡに作用する、［１］記載のベクター。
［３］標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有するセンス鎖と、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するアンチセンス鎖とから構成される二本鎖分子をコードするベクターであって、該鎖が標的配列において互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子がＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞に導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する、ベクター。
［４］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［３］記載のベクター。
［５］センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３４４４〜３４６２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３６７１〜３６８９の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［３］記載のベクター。
［６］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［５］のいずれか一項記載のベクター。
［７］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載のベクター。
［８］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載のベクター。
［９］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［８］記載のベクター。
［１０］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［９］記載のベクター。
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［１０］のいずれか一項記載のベクター。
［１２］一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有する二本鎖分子をコードし、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有するセンス鎖であり；［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり；かつ［Ａ'］が標的配列に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である、［１１］記載のベクター、ならびに
［１３］１個または２個の３'オーバーハングを含有する、［１］〜［１２］のいずれか一項記載の二本鎖分子。
本発明のベクターを、より詳細に以下に記載する。
本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書において「発現可能な形態で」という語句は、ベクターが細胞へ導入された場合に、その分子を発現するであろうことを示す。典型的な態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現のために必要な調節要素を含む。従って一つの態様において、発現ベクターは、本発明の二本鎖分子の核酸配列をコードし、かつそのような二本鎖分子の発現のために適合している。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を作製するために使用されてもよいし、またはがんを治療するための有効成分として直接使用されてもよい。
本発明のベクターは、例えば、本発明の二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式でそのような配列に機能的に連結されるように発現ベクターにクローニングすることによって、作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードしてもよい。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためのものを包含してもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報 ＷＯ９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに仲介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子仲介性（「遺伝子銃」）または圧力仲介性の送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
本発明のベクターには、例えばウイルス性または細菌性のベクターが含まれる。発現ベクターの例には、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例にはカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）が含まれる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例には、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が含まれる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
ＮＦＫＢＩＬ２の阻害性ポリペプチド：
本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力を欠く阻害性ポリペプチドにも関する。実施例において実証されるように、ＮＦＫＢＩＬ２のＣ末端の部分ポリペプチドの発現は、おそらくドミナントネガティブ効果によってＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在を低下させ、がん細胞増殖を抑制する。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間のタンパク質間相互作用の阻害は、抗がん薬の開発のための有用な戦略として使用され得る。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する阻害性ポリペプチドも提供する。さらに本発明は、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびベクターも提供する。
本発明において特に興味深いのは、以下の［１］〜［５］記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターである。
［１］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチド。
［２］（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）１個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、［１］記載のポリペプチド。
［３］細胞膜透過性物質により修飾されている、［１］または［２］記載のポリペプチド。
［４］［１］または［２］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［５］［１］または［２］記載のポリペプチドをコードするベクター。
本発明のポリペプチドを、より詳細に以下に記載する。
本発明の阻害性ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力を欠く、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含有する。本発明の文脈において、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドが欠いている機能は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを核に局在させる能力である。典型的な態様において、本発明のポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含む。
さらにいくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相同な（すなわち配列同一性を共有する）ポリペプチドを含み得る。本発明においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに相同なポリペプチドとは、１個または数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換、および挿入より選択される任意の変異を含有し、かつ機能的に等価なものである。本明細書において「機能的に等価」という語句は、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドに結合する機能を有するが、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドを核に局在させる機能を有しておらず、結果的にがん細胞増殖を阻害することを指す。従って本発明の阻害性ポリペプチドは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列に１個または数個のアミノ酸変異を有する。いくつかの態様において「数個」とは、概して３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、より好ましくは５個または６個以下、なおさらに好ましくは３個または４個以下である。あるいは本発明の阻害性ポリペプチドは、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、またはより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％もしくは９９％以上のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列との相同性を有するアミノ酸配列から構成され得る。アミノ酸配列相同性は、当技術分野において周知のアルゴリズム、例えばデフォルト設定にセットされたＢＬＡＳＴまたはＡＬＩＧＮを使用して、決定することができる。
他の態様において、本発明の阻害性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。そのようなポリペプチドは、「遺伝子およびポリペプチド」に記載された方法と同様に単離することができる。
本発明のポリペプチドは、上記のように化学合成することができる（「抗がん物質のスクリーニング Ｉ．タンパク質に基づくスクリーニング法」を参照のこと）。
本発明のポリペプチドは、公知の遺伝子工学的技法によっても合成することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、形質転換細胞を調製するために適切な宿主細胞へ導入する。この形質転換細胞によって産生されたポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。典型的な態様において、ポリペプチドをコードするポリペプチドは、ポリペプチドをコードするベクターであり得る。そのようなポリヌクレオチドおよびベクターは、従来の方法によって調製され得る（「抗がん物質のスクリーニング Ｉ．タンパク質に基づくスクリーニング法」を参照のこと）。あるいは、タンパク質合成に必要な要素がインビトロで再構成されたインビトロ翻訳系によって、本発明のポリペプチドを合成することもできる。
遺伝子工学的技法が使用される場合、異なるアミノ酸配列を有するペプチドとの融合タンパク質として、本発明のポリペプチドを発現させることができる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一のリーディングフレームにあるように連結し、次いで得られたヌクレオチドを発現ベクターへ導入することによって、所望の融合タンパク質を発現するベクターを得ることができる。融合タンパク質は、適切な宿主を得られたベクターにより形質転換することによって発現される。融合タンパク質の形成において使用される異なるペプチドには、以下のペプチドが含まれる：ＦＬＡＧ（Hopp et al.,(1988)BioTechnology 6,1204-10）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＶ−ＧＰ断片、ｐ１８ ＨＩＶ断片、Ｔ７タグ、ＨＳＶタグ、Ｅタグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、αチューブリン断片、Ｂタグ、プロテインＣ断片、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ赤血球凝集素）、免疫グロブリン定常領域、βガラクトシダーゼ、およびＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）。
このように作製された融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって処理し、次いで所望のポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドを精製するため、融合タンパク質と結合するアフィニティークロマトグラフィーで融合タンパク質を予め捕捉し、次いで捕捉された融合タンパク質をプロテアーゼによって処理することができる。プロテアーゼ処理によって所望のポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーから分離され、高い純度を有する所望のポリペプチドが回収される。
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドには修飾されたポリペプチドが含まれ得る。本発明において「修飾された」という用語は、例えば他の物質との結合を指す。従って本発明において、本発明のポリペプチドは細胞膜透過性物質のような他の物質をさらに含んでいてもよい。他の物質には、ペプチド、脂質、糖類、および様々な天然に存在するポリマーまたは合成ポリマーのような有機化合物が含まれる。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドが阻害性の機能を保持する限り任意の修飾を有していてよい。いくつかの態様において、本発明の阻害性ポリペプチドは、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとの結合についてＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドと直接競合することができる。修飾は、本発明のポリペプチドに相加的な機能も付与することができる。相加的な機能の例には、標的可能性、送達可能性、および安定化が含まれる。
本発明における修飾の典型的な例には、例えば細胞膜透過性物質の導入が含まれる。一般的に、細胞内構造は細胞膜によって外部から隔離されている。従って細胞外物質を細胞へ効率的に導入することは困難である。細胞膜透過性物質によってポリペプチドを修飾することにより、本発明のポリペプチドに細胞膜透過性を付与することができる。結果として、本発明のポリペプチドを細胞と接触させることにより、ポリペプチドを作用させるために細胞へ送達することができる。
「細胞膜透過性物質」とは、哺乳動物細胞膜を貫通して細胞質に進入することができる物質を指す。例えばある種のリポソームは、細胞膜と融合して細胞内へ内容物を放出する。一方ある種の型のポリペプチドは、哺乳動物細胞の細胞膜を貫通して細胞の内部に進入する。本発明のポリペプチドに細胞進入活性を付与するためには、そのような型のポリペプチドが細胞膜透過性物質として好ましい。具体的には、本発明は以下の一般式を有するポリペプチドを含む：
［Ｒ］−［Ｄ］；
式中、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し、［Ｄ］は本発明の阻害性ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。上記一般式において［Ｒ］および［Ｄ］は、直接連結することができ、またはリンカーによって間接的に連結することができる。ペプチド、複数の官能基を有する化合物等を、リンカーとして使用することができる。具体的には、−ＧＧＧ−を含有するアミノ酸配列をリンカーとして使用することができる。あるいは、細胞膜透過性物質および選択された配列を含有するポリペプチドを、微粒子の表面に結合させることができる。［Ｒ］を、［Ｄ］の任意の位置に連結することができる。具体的には、［Ｒ］を、［Ｄ］のＮ末端もしくはＣ末端に連結することができ、または［Ｄ］を構成するアミノ酸の側鎖に連結することができる。さらに、複数個の［Ｒ］分子を、１個の［Ｄ］分子に連結することができる。［Ｒ］分子を、［Ｄ］分子上の異なる位置に導入することができる。あるいは、［Ｄ］を、共に連結された多数の［Ｒ］によって修飾することができる。
例えば、細胞膜透過性を有する、多様な天然に存在するポリペプチドまたは人工的に合成されたポリペプチドが報告されている（Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96）。これらの公知の細胞膜透過性物質は全て、本発明においてポリペプチドを修飾するために使用され得る。本発明において、例えば以下の群より選択される任意の物質が、上記の細胞膜透過性物質として使用され得る：
ポリアルギニン；Matsushita et al.,(2003)J.Neurosci.;21,6000-7
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ Frankel et al.,(1988)Cell 55,1189-93
Green & Loewenstein(1988)Cell 55,1179-88
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
Derossi et al.,(1994)J.Biol.Chem.269,10444-50
ブフォリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ
Park et al.,(2000)Proc.Natl Acad.Sci.USA 97,8245-50
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ
Pooga et al.,(1998)FASEB J.12,67-77
ＭＡＰ（ｍｏｄｅｌ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ
Oehlke et al.,(1998)Biochim.Biophys.Acta.1414,127-39
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ
Lin et al.,(1995)J.Biol.Chem.270,14255-8
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ
Sawada et al.,(2003)Nature Cell Biol.5,352-7
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ
Sawada et al.,(2003)Nature Cell Biol.5,352-7
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ
Lundberg et al.,(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.299,85-90
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ
Elmquist et al.,(2001)Exp.Cell Res.269,237-44
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ
Morris et al.,(2001)Nature Biotechnol.19,1173-6
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ
Rousselle et al.,(2000)Mol.Pharmacol.57,679-86
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ
Gao et al.,(2002)Bioorg.Med.Chem.10,4057-65
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ
Hong & Clayman(2000)Cancer Res.60,6551-6。
本発明において、細胞膜透過性物質の一例として上に記載されているポリアルギニンは、任意の数のアルギニン残基により構成される。具体的には、例えば、それは連続する５〜２０個のアルギニン残基により構成される。アルギニン残基の好ましい数は１１個である。
がん細胞増殖の阻害もしくは低下またはがんの治療の方法：
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７についてのｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力に関して試験した。Ｃ６ｏｒｆ１６７についてのｄｓＲＮＡ（図２）は、数種のがん細胞株において遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、同時に細胞増殖を抑制した。さらに本発明において、ＮＦＫＢＩＬ２のＣ末端の部分ポリペプチドの発現は、おそらくドミナントネガティブ効果を通して、Ｃ６ｏｒｆ１６７の核局在を低下させ、がん細胞増殖を抑制することができた。
従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在の阻害を介して、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能障害を誘導することにより、がん細胞増殖を阻害する方法を提供する。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子発現は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を特異的に標的とする本発明の上記の二本鎖分子のいずれかによって阻害することができる。Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの核局在も、本発明の上記の阻害性ポリペプチドのいずれかによって阻害することができる。
本発明の二本鎖分子および阻害性ポリペプチドの、がん細胞の細胞増殖を阻害するそのような能力は、それらが肺癌のようながんの治療および予防のいずれかまたは両方のための方法のために使用され得ることを示す。従って本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子もしくは二本鎖分子を発現するベクター、または阻害性ポリペプチドもしくは阻害性ポリペプチドを発現するベクターを投与することによって、がんを有する対象を治療するか、または対象におけるがんを予防するための方法を提供する。正常器官においてはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の検出は最小限であるため、本発明の方法は副作用なしに実施され得る（図１Ｄ）。
本発明において特に興味深いのは、以下の方法［１］〜［２３］である：
［１］Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがん細胞の増殖の阻害、または対象におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための方法。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の方法。
［３］二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［１］記載の方法。
［４］二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３４４４〜３４６２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３６７１〜３６８９の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［１］記載の方法。
［５］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［４］のいずれか一項記載の方法。
［６］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［５］記載の方法。
［７］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載の方法。
［８］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載の方法。
［９］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［８］記載の方法。
［１０］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［９］のいずれか一項記載の方法。
［１１］二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］が標的配列に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である、方法。
［１２］二本鎖分子がＲＮＡから構成される、［１］〜［１１］のいずれか一項記載の方法。
［１３］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］〜［１１］のいずれか一項記載の方法。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１３］記載の方法。
［１５］二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１４］記載の方法。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１４］記載の方法。
［１７］二本鎖分子内のアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１６］記載の方法。
［１８］隣接する領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１７］記載の方法。
［１９］二本鎖分子が１個または２個の３'オーバーハングを含有する、［１］〜［１８］のいずれか一項記載の方法。
［２０］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含有し、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いている薬学的有効量のポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、がん細胞増殖の阻害または対象におけるがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための方法。
［２１］ポリペプチドが、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）１個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、［２０］記載の方法、および
［２２］ポリペプチドが細胞膜透過性物質により修飾されている、［２１］記載の方法、ならびに
［２３］二本鎖分子またはポリペプチドが、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物の中に含有されている、［１］〜［２２］のいずれか一項記載の方法。
本発明の方法を、より詳細に以下に記載する。
本発明のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子、阻害性ポリペプチド、またはそのような分子もしくはポリペプチドを発現するベクター、またはそれらを含有する組成物と、細胞を接触させることによって、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞の増殖を阻害し得る。細胞を、トランスフェクション剤とさらに接触させてもよい。適当なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、細胞が、分子に曝されていない細胞と比較して、より小さい速度で増殖するかまたは減少した生存能を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して測定され得る。
阻害性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの文脈において、「特異的に阻害する」という用語は、剤またはリガンドの、Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現または生物学的機能の阻害能力を指す。特異的阻害は、典型的にはＣ６ｏｒｆ１６７発現（例えば、転写もしくは翻訳）または測定された生物学的機能（例えば、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈまたはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、アポトーシスの阻害、Ｃ６ｏｒｆ１６７からの細胞内シグナル伝達）の、バックグラウンドの少なくとも約２倍の阻害、好ましくは約１０倍超、最も好ましくは１００倍超の阻害をもたらす。発現レベルおよび／または生物学的機能は、処理された細胞と未処理の細胞とを比較して測定することができ、または処理の前後の細胞集団を比較して測定することができる。いくつかの態様において、Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現または生物学的機能は完全に阻害される。典型的には、特異的な阻害は、適切な統計検定を使用したＣ６ｏｒｆ１６７発現または生物学的機能の統計的に有意な低下（例えば、ｐ＜＝０．０５）である。
細胞がＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するかまたは過剰発現している限り、任意の種類の細胞の増殖を本発明の方法によって抑制し得る。例示的な細胞には肺癌が含まれる。同様に、がんがＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するかまたは過剰発現している限り、任意の種類のがんを本発明の方法によって治療しかつ／または予防し得る。例示的ながんには肺癌が含まれる。
Ｃ６ｏｒｆ１６７に関連する疾患に罹患しているか、または該疾患を発症するリスクのある対象を、本発明の二本鎖分子もしくは阻害性のペプチドの少なくとも一つ、そのような分子もしくはペプチドを発現する少なくとも一つのベクター、またはそのような分子もしくはペプチドを含む組成物の投与により治療し得る。例えばがんの対象を本発明の方法に従って治療し得る。がんの型は、診断される腫瘍の特定の型に従って標準的な方法によって同定することができる。より好ましくは、本発明の方法によって治療を受ける対象は、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫測定法により、対象由来の生検標本中のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を検出することによって選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象由来の生検標本は、当技術分野で公知の方法、例えば免疫組織化学的解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の過剰発現について確認される。
細胞増殖を阻害し、それによってがんを治療する本発明の方法によれば、複数種類の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターもしくはこれを含む組成物）の投与の間、該分子はそれぞれ異なる構造を有してよいが、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の同一標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用し得る。あるいは、複数種類の二本鎖分子は、同一遺伝子の異なる標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用し得る。あるいは、例えば本方法は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の１つ、２つ、またはそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子と対応するｍＲＮＡ転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入してもよい。同様に、本発明の阻害性のポリペプチドを、このポリペプチドとＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとの結合を達成するための形態で、細胞内に直接導入してもよい。あるいは、二本鎖分子または阻害性のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用してもよい。
治療により、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低下などの臨床的恩恵がもたらされる場合に、該治療は「有効」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成が遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状が予防もしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の公知の方法と共同して判定される。
本発明の方法および組成物が「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の作用を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能の回復および疾患関連の合併症の低減によって、既に確立された疾患の悪影響を低下させることを目的とした活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などのいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を低下させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療の構成要素であり、かつ／または、予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定な疾患を含む。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＣ６ｏｒｆ１６７ ｍＲＮＡを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。従って、標準的ながん治療に比べて本発明は、治療効果を発揮するために、がん部位またはその近くに、有意に少ない二本鎖分子が送達される必要がある。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路などの要素；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかを考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの、がん部位またはその近傍での細胞間濃度である。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドも投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要となる正確な投与量は、当業者によって容易かつ慣行的に決定され得る。
本発明の方法を用いて、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがん；例えば、肺癌の増殖または転移を阻害することができる。具体的には、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６）の標的配列を含む二本鎖分子が、がんの治療のために特に有用である。あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有する阻害性のポリペプチドを、がんの治療のために用いることができる。
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを、これらとは別の薬学的組成物と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを、がんを治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドは、がんの治療またはがん転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
本方法において、二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子もしくは阻害性のポリペプチドとして、または該二本鎖分子もしくは阻害性のポリペプチドを発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）またはリポソームが含まれる。典型的な送達試薬はリポソームである。
リポソームは、肺腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明の文脈における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成されてもよく、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されたような様々な方法が知られており、その開示全体が参照により本明細書に引用される。
好ましくは、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを封入するリポソームは、該リポソームをがん部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に多く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾する。一つの態様では、本発明で用いられるリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
リポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。従って、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、分子量約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびに、ガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、例えばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか一つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを少なくとも一つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリジン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを発現する組換えウイルスベクターを患者のがん領域に送達する方法は当技術分野内である。
本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドは、該二本鎖分子または阻害性のポリペプチドをがん部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。同様に本発明の阻害性のポリペプチドは、好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
好適な非経口投与経路には、小胞内投与および静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）によるがん部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が含まれる。二本鎖分子、阻害性のポリペプチド、またはベクターの注射または注入は、がん部位またはその近傍で行うことが好ましい。
本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドは、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。がん部位のまたはその近傍の組織内へ、二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを直接注射することが好ましい。がん部位のまたはその近傍の組織へ、二本鎖分子を複数回注射することが特に好ましい。
当業者はまた、本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを、例えばがん部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子または阻害性のポリペプチドを７日間、１日１回、がん部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が必要とされる場合、対象に投与される二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの総量を含むことができることが理解される。
本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現するがんを、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、
（ｃ）それをコードするベクター、
（ｄ）本発明の阻害性のポリペプチド
（ｅ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｆ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも一つの有効成分によって治療することができる。
がんには肺癌が含まれるが、これに限定されない。従って、有効成分としての本発明の二本鎖分子または阻害性のポリペプチドの投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７の発現レベルが、同じ臓器の正常細胞と比較して増大しているか否かを確認することが好ましい。従って、一つの態様において、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を（過剰）発現しているがんを治療するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）治療されるがんを有する対象から入手したがん細胞または組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の該発現レベルを正常対照と比較する段階；ならびに
ｉｉｉ）正常対照と比較してＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現するがんを有する対象に対して、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、
（ｃ）それをコードするベクター、
（ｄ）本発明の阻害性のポリペプチド
（ｅ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｆ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも一つの成分を投与する段階
を含む。あるいは本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現するがんを有する対象への投与に用いるための、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、
（ｃ）それをコードするベクター
（ｄ）本発明の阻害性のポリペプチド
（ｅ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｆ）それをコードするベクター
からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含む医薬組成物も提供する。言い換えれば、本発明は、治療される対象を
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、
（ｃ）それをコードするベクター
（ｄ）本発明の阻害性のポリペプチド
（ｅ）それをコードするＤＮＡ、および
（ｆ）それをコードするベクター
を用いて同定するための方法をさらに提供し、該方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含んでよく、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増大により、該対象が、
（ａ）本発明の二本鎖分子、
（ｂ）それをコードするＤＮＡ、
（ｃ）それをコードするベクター
（ｄ）本発明の阻害性のポリペプチド
（ｅ）それをコードするＤＮＡ、または
（ｆ）それをコードするベクター
によって治療され得るがんを有することが示される。
本発明のがん治療法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これに限定されない。
本発明に従って、対象から採取したがん細胞または組織におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを、プローブを用いてハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの検出に関してはアレイの使用が好ましい。当業者は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の配列情報を利用してそのようなプローブを調製することができる。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光物質、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９）の転写産物を、プライマーを用いて増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは該遺伝子についての入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）その標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的にはストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、観察されたタンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０）の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾抗体がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質との結合能を保持する限り、該断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。該タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を測定してもよい。すなわちこの測定において、強い染色は、タンパク質の存在量／レベルの増大を示すと同時にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の高い発現レベルを示す。
がん細胞における標的遺伝子、例えばＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルは、該標的遺伝子の対照レベル（例えば、正常細胞におけるレベル）よりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上に増大していれば、増大したと判定することができる。
疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、がん細胞と同時に対照レベルを測定してもよい。さらに、治療されるがんを有する臓器の非がん性領域から採取した正常細胞を正常対照として使用してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを測定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースに由来することもできる。その上本発明の一局面によれば、生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から測定した複数の対照レベルと比較することができる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から測定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、がん性でないと判明している生物学的試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性生物学的試料から測定される場合には、これは「がん性対照レベル」と称される。
Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している／同等である場合、対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
がん細胞増殖の阻害もしくは低下またはがんの治療のための組成物：
上記に加え、本発明は、本発明の二本鎖分子、阻害性ポリペプチド、またはそのような分子もしくはポリペプチドを発現するベクターを含む、がん細胞増殖の阻害もしくは低下またはがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための薬学的組成物も提供する。
本発明において特に興味深いのは、以下の組成物［１］〜［２３］である：
［１］Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物。
［２］二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の組成物。
［３］二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［１］記載の組成物。
［４］二本鎖分子のセンス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３４４４〜３４６２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７もしくは１９の３６７１〜３６８９の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有する、［１］記載の組成物。
［５］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１００ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［１］〜［４］のいずれか一項記載の組成物。
［６］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約７５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［５］記載の組成物。
［７］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約５０ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［６］記載の組成物。
［８］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、［７］記載の組成物。
［９］センス鎖が、標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、［８］記載の組成物。
［１０］二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、［１］〜［９］のいずれか一項記載の組成物。
［１１］二本鎖分子が、一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
を有し、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］が標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するアンチセンス鎖である、［１０］記載の組成物。
［１２］二本鎖分子がＲＮＡから構成される、［１］〜［１１］のいずれか一項記載の組成物。
［１３］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、［１］〜［１１］のいずれか一項記載の組成物。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１３］記載の組成物。
［１５］二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、［１４］記載の組成物。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、［１４］記載の組成物。
［１７］二本鎖分子内のアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡである、［１６］記載の組成物。
［１８］隣接する領域が、９〜１３ヌクレオチドから構成される、［１７］記載の組成物。
［１９］二本鎖分子が１個または２個の３'オーバーハングを含有する、［１］〜［１８］のいずれか一項記載の組成物。
［２０］ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含有し、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いている薬学的有効量のポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がん細胞増殖の阻害または対象におけるがんの治療および予防のいずれかもしくは両方のための組成物。
［２１］ポリペプチドが、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）１個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、［２０］記載の組成物。
［２２］ポリペプチドが細胞膜透過性物質により修飾されている、［２１］記載の組成物、ならびに
［２３］トランスフェクション増強剤を含有する、［１］〜［２２］のいずれか一項記載の組成物。
本発明の適当な組成物を、さらに詳細に以下に説明する。
本発明の二本鎖分子または阻害性ポリペプチドは、好ましくは、当技術分野において公知の技術に従って、対象への投与前に、薬学的組成物として製剤化される。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌でありかつ発熱性物質を含まないことを特徴とする。本明細書において使用されるように、「薬学的組成物」には、ヒトにおける使用および獣医学的使用のための製剤が含まれる。従って、組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのようなその他の哺乳動物のための医薬として使用され得る。
本発明の文脈において、本発明の適当な薬学的製剤には、経口投与、直腸内投与、経鼻投与、局所投与（頬、舌下、および経皮を含む）、膣内投与、もしくは非経口投与（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）のため、または吸入もしくはガス注入による投与のために適当なものが含まれる。その他の製剤には、治療剤を放出する植え込み型装置および粘着パッチが含まれる。所望により、上記製剤は有効成分の徐放を与えるために適合していてもよい。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)に記載されているように、当技術分野の技術の範囲内にあり、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体媒体と混合された、本発明の二本鎖分子もしくは阻害性ポリペプチド、またはそのような分子もしくはポリペプチドをコードするベクター（例えば、０．１〜９０重量％）、または分子の薬学的に許容される塩を含有する。好ましい生理学的に許容される担体媒体は、水、緩衝水、普通の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
本発明によると、組成物は、複数の種類の二本鎖分子を含有していてもよく、それらの分子は、各々、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の同一の標的配列に対するものであってもよいし、または異なる標的配列に対するものであってもよい。例えば、組成物は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子を含有し得る。あるいは、例えば、組成物は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の１種、２種、またはそれ以上の標的配列に対する二本鎖分子を含有していてもよい。
さらに本発明の組成物は、１種または複数種の二本鎖分子をコードするベクターを含有していてもよい。例えば、ベクターは、１種、２種、または数種の種類の、本発明の二本鎖分子をコードしていてもよい。あるいは、本発明の組成物は、各々異なる二本鎖分子をコードする複数の種類のベクターを含有していてもよい。
さらに、本発明の二本鎖分子または阻害性ポリペプチドは、組成物中にリポソームとして含有されていてもよい。リポソームの詳細に関しては、「がん細胞増殖の阻害もしくは低下またはがんの治療の方法」という表題のセクションを参照のこと。
本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のある緩衝液（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意で、カルシウム塩もしくはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装することができ、または凍結乾燥することもできる。
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を用いることができる。
例えば、経口投与のための固体薬学的組成物は、上記の担体および賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、好ましくは２５〜７５％の本発明の二本鎖分子の一つまたは複数を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための薬学的組成物は、上記のようにリポソーム中に封入される０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の本発明の二本鎖分子の一つまたは複数、および噴霧剤を含み得る。必要に応じて、担体、例えば鼻腔内送達の場合はレシチンを含めることもできる。
上記のものに加えて、本発明の二本鎖分子または阻害性ポリペプチドのインビボ機能を阻害しない限り、本発明の組成物は他の薬学的有効成分を含有していてもよい。例えば、組成物は、がんを治療するために従来使用されている化学療法剤を含有していてもよい。薬学的組成物は、抗微生物剤、免疫抑制薬、または保存剤のような他の有効成分も含有していてもよい。さらに、上に具体的に述べられた成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の型に関して当技術分野において従来より用いられるその他の剤を含んでいてもよいことが理解されるべきである；例えば、経口投与のために適当なものには着香剤が含まれ得る。
別の態様において、本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用を提供する。例えば本発明は、互いにハイブリダイズしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対する二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがんの治療のための薬学的組成物の製造のための使用に関する。同様に本発明は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、かつＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いている、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する阻害性ポリペプチドの使用に関する。
本発明は、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現するがんの治療において使用するための本発明の二本鎖分子または阻害性ポリペプチドをさらに提供する。
あるいは本発明は、有効成分としての、互いにハイブリダイズしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対する二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含みＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現している細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための薬学的組成物を製造する方法または過程をさらに提供する。同様に本発明は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いている、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する阻害性ポリペプチドと共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための薬学的組成物を製造する方法または過程をさらに提供する。
別の態様において、本発明は、互いにハイブリダイズしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５または１６の標的配列に対する二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を過剰発現している細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子である有効成分を、薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混和する段階を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための薬学的組成物を製造する方法または過程を提供する。同様に、本発明は、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含み、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する能力である生物学的機能を欠いている、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合を阻害する阻害性ポリペプチドである有効成分を、薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混和する段階を含む、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための薬学的組成物を製造する方法または過程を提供する。
以下に、実施例を参照しながら本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および実施例は本発明の局面を説明するのみであり、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。従って、本発明の実施または試験において、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができる。
特記しない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で引用した出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1：全般的方法
細胞株および臨床サンプル
本研究に用いられた２４例のヒト肺癌細胞株には、１９例のＮＳＣＬＣ（Ａ４２７、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＮＣＩ−Ｈ１６６６、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＬＵ６１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−１、ＬＸ１、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０）ならびに４例の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ：ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、およびＳＢＣ−５）が含まれる。本研究に用いられたヒト食道癌腫細胞株は以下のとおりであった：１２例のＥＳＣＣ細胞株（ＴＥ１、ＴＥ２、ＴＥ３、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ６、ＴＥ８、ＴＥ９、ＴＥ１０、ＴＥ１２、ＴＥ１３、およびＴＥ１５）および１例の腺癌（ＡＤＣ）細胞株（ＴＥ７）。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した適切な培地中において単層で増殖させ、５％ ＣＯ２での加湿空気の大気中にて３７℃で維持した。ヒト気道上皮細胞ＳＡＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）も本研究に用いられた細胞のパネルに含まれる。原発性の肺癌および食道癌サンプルは、インフォームドコンセントを得て以前に入手していた（Kikuchi T, et al. Oncogene 2003; 22:2192-205.；Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003; 1:485-99.；Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004; 13:3029-43.；Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006; 28:799-805.；Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006; 29:567-75.；Yamabuki T, et al. Int J Oncol 2006; 28: 1375-84.）。本研究および言及される全ての臨床材料の使用は、個々の機関の倫理委員会によって承認されている。
半定量的RT-PCR
肺癌および食道癌の臨床サンプルのｍＲＮＡから調製された各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈液を調製し、定量対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）発現のレベルを測定した。増幅のためのプライマーセットは以下のとおりであった：ＡＣＴＢに対してＡＣＴＢ−Ｆ（５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびＡＣＴＢ−Ｒ（５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対してＣ６ｏｒｆ１６７−Ｆ（５'−ＧＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ｒ（５'−ＣＣＡＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＣ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。全ての反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での、９５℃５分間の初期変性、その後に９５℃３０秒間、５６℃３０秒間、および７２℃６０秒間の２２サイクル（ＡＣＴＢに対して）または３０サイクル（Ｃ６ｏｒｆ１６７に対して）を伴った。
ノーザンブロット解析
ヒト多組織ブロット（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、白血球を含む１６例の正常組織；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を３２Ｐ標識したＣ６ｏｒｆ１６７のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。Ｃ６ｏｒｆ１６７−Ｆ１（ＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＣ６ｏｒｆ１６７−Ｒ１（ＡＴＣＧＣＣＣＡＡＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃ６ｏｒｆ１６７の部分長ｃＤＮＡを調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を、供給業者の勧告に従って行った。ブロットを、−８０℃で７日間、増感スクリーンを用いたオートラジオグラフ撮影した。
抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体
ＣＬＧＱＭＧＱＤＥＭＱＲＬＥＮＤＮＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）（１２２７−１２４３）（Ｎ末にシスチン（Ｃｉｓｔｉｎｅ）を付加した）のアミノ酸配列を有する合成ペプチドをウサギに接種し、標準的方法論に従って、免疫血清をアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体を、ウエスタンブロッティングならびに免疫細胞化学的研究に用いた。Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターをトランスフェクトした細胞株からのライセート、ならびに内在的にＣ６ｏｒｆ１６７を発現しているもしくは発現していない肺癌細胞株からのものを用いたウエスタンブロットで、抗体がＣ６ｏｒｆ１６７に特異的であることを確認した。
ウエスタンブロッティング
溶解バッファー；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸−Ｎａ、０．１％ ＳＤＳ、さらにプロテアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｓｅｔ ＩＩＩ）で細胞を溶解した。本発明者らは、以前に記載されているように（Bencardino, K et al. (March 2007). Internal and Emergency Medicine 2 (1): 3-12.）、ＥＣＬウエスタンブロッティング解析システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
免疫細胞化学的解析
培養した細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１：１のアセトン：メタノール溶液中にて−２０℃で１０分間固定し、かつ透過性にした。一次抗体反応の前に、細胞をブロッキング溶液［ＰＢＳ（−）中に５％ウシ血清アルブミン］で１０分間被覆して、非特異的抗体結合をブロックした。細胞を、ヒトＣ６ｏｒｆ１６７に対するウサギポリクローナル抗体（合成ペプチドＣ６ｏｒｆ１６７に対して作製した；上記を参照されたい）またはヒトＮＦＫＢＩＬ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）とインキュベートした後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したロバ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識したロバ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えて、内在性のＣ６ｏｒｆ１６７またはＮＦＫＢＩＬ２を個別に検出した。核を４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。抗体で染色された細胞をレーザー共焦点顕微鏡（ＴＳＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ：Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で見た。
ＲＮＡ干渉アッセイ
２種の独立したＣ６ｏｒｆ１６７ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｃ６ｏｒｆ１６７配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１９８４６８）を用いて設計した。２種の独立したＮＦＫＢＩＬ２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを購入した（Ｓｉｇｍａ／ＡｌｄｒｉｃｈカタログＮｏ． ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０２＿００１２６８２、ＳＡＳＩ＿００１１２６８３）。ｓｉＲＮＡ（６００ｐＭ）を、製造業者のプロトコールに従って、３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２例のＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９およびＬＣ３１９、または子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養した。細胞数および生存率を、ギムザ染色および３連の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって測定した。用いたｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりであった：コントロール−１ （ｓｉ−ＬＵＣ：フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子）、５'−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；コントロール−２ （ＣＮＴ：４種のオリゴのプールであるＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡｓ：５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；および５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；ｓｉＲＮＡ−Ｃ６ｏｒｆ１６７−＃１ （ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７−＃１：５'−ＣＣＧＣＣＡＡＵＡＵＣＡＵＣＵＣＵＡＡＵＵ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；ｓｉＲＮＡ−Ｃ６ｏｒｆ１６７−＃２ （ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７−＃２：５'−ＧＡＡＣＣＵＧＣＡＡＵＡＣＡＵＧＧＵＡＵＵ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；ｓｉＲＮＡ−ＮＦＫＢＩＬ２−＃１（ｓｉ−ＮＦＫＢＩＬ２−＃１：５'−ＧＴＧＡＴＴＣＧＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＧ−３'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）；ｓｉＲＮＡ−ＮＦＫＢＩＬ２−＃２（ｓｉ−ＮＦＫＢＩＬ２−＃２：５'−ＡＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）。Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡによる、しかしながらコントロールによるものではない、細胞株における内在性のＣ６ｏｒｆ１６７発現の下方制御が半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析によって確認された。
細胞増殖アッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＨｅＬａおよびＬＣ３１９細胞にはモックおよびｐＣＡＧＧＳｎ−ＨＡ−Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３発現ベクターをトランスフェクトし、非常に低レベルに内在性のＣ６ｏｒｆ１６７を発現しているＣＯＳ−７またはＨＥＫ２９３細胞にはモックまたはＣ６ｏｒｆ１６７発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳｎ−３×Ｆｌａｇ−Ｃ６ｏｒｆ１６７）をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を０．８ｍｇ／ｍＬのネオマイシン（ジェネティシン，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培養培地中で７日間インキュベートした。Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現ならびに細胞の生存率およびコロニー数を、ウエスタンブロッティング、ならびに７日目におけるＭＴＴおよびコロニー形成アッセイによって評価した。
フローサイトメトリー解析
Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を、６０ｍｍディッシュあたり５×１０５の密度でプレーティングした。細胞をＰＢＳ中に回収し、氷冷７０％エタノールで３０分間固定した。１００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）での処理後、細胞をＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。Ｃｅｌｌ Ｌａｂ Ｑｕａｎｔａ ＳＣ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）でフローサイトメトリー解析を行い、ＣＸＰ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）によって解析した。少なくとも１０，０００個のゲートをかけない細胞から選択された細胞をＤＮＡ含有量について解析した。
実施例２：肺癌におけるＣ６ｏｒｆ１６７の上方制御
１０１例の肺癌症例についての網羅的ゲノム発現プロファイル解析が、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて以前に行われた（Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53.;Kikuchi T, et al. Oncogene 2003;22:2192-205.;Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75.）。肺癌において上方制御されている遺伝子の中で、Ｃ６ｏｒｆ１６７転写産物が過剰発現していることが特定され、かつ半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によって、その発現は１５例の臨床肺癌組織の全てにおいて増加しており、しかしながらそれらの隣接した正常な肺組織ではほとんど検出できないことが確認された（図１Ａ）。高レベルのＣ６ｏｒｆ１６７発現は調べた１６例の肺癌細胞株の全てにおいて特異的に観察されたが、その発現は正常な気道上皮細胞に由来するＳＡＥＣ細胞ではほとんど検出できなかった（図１Ｂ）。肺癌および食道癌細胞株における抗Ｃ６ｏｒｆ１６７抗体を用いたウエスタンブロット解析によって、高レベルの内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質がさらに確認された（図１Ｃ）。
１６例の正常な組織についてのノーザンブロット解析により、Ｃ６ｏｒｆ１６７は１５例の組織においてほとんど検出できないが、精巣においてのみ発現していることがさらに確認された（図１Ｄ）。
実施例３：Ｃ６ｏｒｆ１６７の増殖促進効果
肺癌細胞におけるその増殖促進の役割を調査するために、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡｉ技術によって、２例の肺癌細胞Ａ５４９およびＬＣ３１９において、内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７の発現をノックダウンした（図２Ａ〜２Ｃ）。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により、Ｃ６ｏｒｆ１６７ ｓｉ−＃１およびｓｉ−＃２をトランスフェクトした細胞において、Ｃ６ｏｒｆ１６７の転写およびタンパク質レベルの両方における有意なノックダウン効果が検出されたが、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣおよびｓｉ−ＣＮＴ）では検出されなかった。ノックダウン効果に合致して、コロニー形成およびＭＴＴアッセイにより、ノックダウン効果を示さなかった２種の対照ｓｉＲＮＡと比較して、２種のｓｉＲＮＡのＣ６ｏｒｆ１６７ ｓｉ−＃１およびｓｉ−＃２による肺癌細胞の増殖抑制がはっきりと明らかになった。これらの発見により、肺癌細胞の増殖におけるＣ６ｏｒｆ１６７の決定的な役割が暗示された。本発明者らの独自の遺伝子発現プロファイルのデータベースによっても、臨床的子宮頸癌においてその高レベルの発現が明らかになったため、子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにおいてもＣ６ｏｒｆ１６７の発現をｓｉＲＮＡによってノックダウンし、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡによる増殖抑制効果が観察された。
哺乳類細胞の増殖に対するＣ６ｏｒｆ１６７の効果をさらに調べるために、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７を一過性に発現するように設計されたプラスミド（ｐＣＡＧＧＳｎ−３×Ｆｌａｇ−Ｃ６ｏｒｆ１６７）またはモックプラスミドをＣＯＳ−７またはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。モックベクターと比較して、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターをトランスフェクトした細胞において増殖促進効果が有意に観察された（図２Ｄ）。
実施例４：ＮＦＫＢＩＬ２は培養細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在を制御する
がん細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の機能を解析するために、ＭＳ解析と合わせた免疫沈降アッセイを行った。ＮＦＫＢＩＬ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｋａｐｐａ（ＮＦＫＢ） ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎ Ｂ−ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅ２）は、Ｃ６ｏｒｆ１６７相互作用タンパク質として同定された（図３Ａ）。以前の報告では、不死化細胞株でのゲノム安定性およびＤＮＡ複製におけるＣ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２相互作用の役割が個別に示唆されているが(O'Donnell L, et al. Molecular Cell. 2010; 40, 619-31;Duro E, et al. Molecular Cell. 2010; 40, 632-44; Brenda C, et al. Molecular Cell. 2010; 40, 645-57;Piwko W, et al. The EMBO Journal. 2010; 29 (24) 4210-4222)、しかしながら臨床的がんにおけるＣ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２の活性化の決定的な役割について示し、かつ発がんにおけるそれらの機能的重要性を調査した研究はない。肺癌由来の細胞株、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、これら２種のタンパク質の共発現が明らかになった（図７Ｂ）。これらのタンパク質間の相互作用をＩＰ−ＷＢ解析を用いて確認した（図３Ｂ）。続いて、ＨｅＬａ細胞を用いた免疫蛍光解析を行って、内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞内局在を同定した。データにより、このタンパク質は主に核に位置し、細胞質にはわずかに位置することが示された（図３Ｃ）。しかしながら、哺乳類細胞ＣＯＳ−７またはＮＩＨ３Ｔ３を用いた外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞内局在により、このタンパク質は主に細胞質に位置し、タンパク質凝集も観察されることが示された（データ示さず）。従って、がん細胞においてＣ６ｏｒｆ１６７はＮＦＫＢＩＬ２タンパク質と相互作用し、その細胞内局在を制御し得ることが推測された。次に、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびその相互作用タンパク質であるＮＦＫＢＩＬ２を発現するベクターを共トランスフェクトした。これら２種のベクターの両方をトランスフェクトした細胞は、ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の発現なしでは、Ｃ６ｏｒｆ１６７は主に細胞質に位置することを示すことが分かった。外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７の核局在は、まずＮＦＫＢＩＬ２タンパク質を発現する細胞のみで観察された（図３Ｄ）。これらのデータにより、細胞内のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在はＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の発現によって制御されることが衝撃的な解明がなされた。さらにこれらのデータは、細胞質および核分画を検出するウエスタンブロッティング法を用いることによって確認された（図３Ｅ）。
加えて、外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質は細胞内のそれらのタンパク質レベルを安定化することも確認された。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡ（８ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７）を用いた内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７のノックダウンによって肺癌ＬＣ３１９細胞におけるＮＦＫＢＩＬ２タンパク質レベルが低下し、ｓｉ−ＮＦＫＢＩＬ２を用いたＮＦＫＢＩＬ２の低下によってＣ６ｏｒｆ１６７レベルが低下しかつがん細胞の増殖が有意に抑制された（図３Ｆ、図８、および図９）。これらのデータは、ＮＦＫＢＩＬ２の発現により、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在および安定性が促進される可能性があり、これら２種のタンパク質を含む複合体は、細胞増殖および／または生存において協調的に極めて重要な役割を果たし得ることを示唆している。
実施例５：肺癌細胞株におけるＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質のドミナントネガティブ効果
ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質が肺の発がんにおいて重要な役割を果たすかどうかを調べるために、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質をクローン化して結合領域を同定した（図４Ａ）。免疫沈降およびウエスタンブロッティングアッセイにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質のＮ末がＮＦＫＢＩＬ２タンパク質とＣ末で強く結合することが明らかになった（図４Ｂ）。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在はＮＦＫＩＬ２タンパク質の存在下で制御されるため、続いて培養細胞においてＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のどの部分がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞内局在を制御し得るかを調査した。ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を発現するプラスミドを、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７を発現するベクターとともに共トランスフェクトした。興味深いことに、Ｎ１（ＮＦＫＢＩＬ２のＮ末端の部分タンパク質）およびＮ２（ＮＦＫＢＩＬ２の中央の部分タンパク質）は核内に位置し得た。しかしながら、ＩＰ−ＷＢ解析の結果によると、これら２種のタンパク質は核内で検出されたが、しかしタンパク質凝集およびＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞質局在が観察され、これら２種の部分タンパク質はＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質と結合し得なかった。対照的に、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質と結合し得る部分タンパク質Ｎ３は、核内に位置し得なかった（図４Ｃ）。まとめると、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在ががん細胞の増殖に重要であるならば、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質が核に位置することを阻害すれば細胞増殖を低下させ得ると仮定される。外因性の部分タンパク質Ｎ３ががん細胞においてＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在を阻害し得るかどうかを調べるために、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質を高発現する細胞にモック、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３発現ベクターをトランスフェクトした。予想どおり、Ｎ３ベクターをトランスフェクトした細胞ではＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在の減少が示された（図４Ｄ）。
さらに、肺癌細胞の増殖または生存に対するＣ６ｏｒｆ１６７とＮＦＫＢＩＬ２との間の相互作用の機能的重要性を調査するために、ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質それぞれ、およびモックベクターをトランスフェクトしたＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質高発現細胞を用いて増殖アッセイを行った。データにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質と細胞質で結合する部分タンパク質であるＮ３を発現する細胞は、ＭＴＴアッセイで測定されたように細胞増殖を阻害することが示された。本発明者らの発見により、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質間の相互作用の阻害は、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在を低下させ、かつがん細胞の増殖抑制をもたらすことが示された（図４Ｅ）。
実施例６：ＮＦＫＩＬ２タンパク質のＣ末部はＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質への結合に重要である
Ｃ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質複合体が発がんに重要な役割を果たし得るかどうかを調べるために、本発明者らは、続いてＦｌａｇタグを有するＣ６ｏｒｆ１６７の部分タンパク質またはＨＡタグを有するＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を発現する種々のプラスミドを構築し、それらをＣＯＳ−７細胞内にトランスフェクトした（図１０Ａ）。ＦｌａｇタグまたはＨＡタグに対する抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロッティングアッセイにより、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質のＮ末部（Ｃ１；コドン１−４１４）がＮＦＫＢＩＬ２のＣ末領域（Ｎ３；コドン８２３−１２４４）と結合し得ることが明らかになった（図１０Ｂ）。免疫細胞化学的解析により、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在は核におけるＮＦＫＩＬ２タンパク質の存在が必要のようであることが明らかになったため（図３Ｄ）、本発明者らは、続いて培養細胞においてＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のどの部分がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の細胞内局在に必須であるかを調査した。ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を発現するプラスミドを、全長Ｃ６ｏｒｆ１６７発現ベクターとともにＣＯＳ−７細胞内に共トランスフェクトした。興味深いことに、ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のＮ末（Ｎ１；コドン１−４５０）および中央部分（Ｎ２；コドン４０３−８３６）は核内に局在し得、一方で、凝集したＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質は同じ細胞の主に細胞質に位置した（図１０Ｃ）。それは、免疫沈降解析によって示された、これら２種の部分タンパク質（Ｎ１およびＮ２）がＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質と結合し得なかったというデータと一致している。対照的に、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質およびＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質と結合し得るＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のＣ末部分（Ｎ３；コドン８２３−１２４４）は、主に細胞の細胞質に局在した（図１０Ｃ）。データは、ＮＦＫＢＩＬ２のＮ末部分（Ｎ１；１−４５０）および中央部分（Ｎ２；コドン４０３−８３６）はＮＦＫＢＩＬ２の核局在に関して、より重要であり、一方でそのＣ末部分（Ｎ３；コドン８２３−１２４４）はＣ６ｏｒｆ１６７との結合に必須であることを示している。
実施例７：Ｃ６ｏｒｆ１６７結合部位を含むＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質のドミナントネガティブな増殖抑制効果
上記のデータに従って、本発明者らは、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在ががん細胞の増殖に重要であるならば、Ｃ６ｏｒｆ１６７とＮＦＫＢＩＬ２との間の相互作用を阻害することによる核内でのＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の減少は、がん細胞の増殖を抑制し得ると仮定した。外因性のＮ３部分タンパク質の発現が、Ｃ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２相互作用および細胞増殖を阻害し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞内に全長Ｃ６ｏｒｆ１６７および全長／部分長（Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３）いずれかのＮＦＫＢＩＬ２を発現するベクターを共トランスフェクトした。免疫沈降アッセイによって実証されたように、外因性Ｃ６ｏｒｆ１６７と結合する外因性全長ＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の量が、Ｎ３部分タンパク質の導入後に有意に減少し、一方でそれはＮ１またはＮ２ベクターをトランスフェクトした細胞では変化しないことを見出した（図５Ａ）。がん細胞の増殖に対するＣ６ｏｒｆ１６７とＮＦＫＢＩＬ２との間の相互作用の機能的重要性を調査するために、ＮＦＫＢＩＬ２の部分タンパク質を発現するベクターまたはモックベクターのいずれかを、内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質の両方を高発現している２種のがん細胞株ＨｅＬａおよびＬＣ３１９、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７発現がほとんど検出できない肺線維芽細胞ＣＣＤｌｕ−１９細胞内にトランスフェクトした。予想どおり、ＮＦＫＩＬ２タンパク質のＣ末部（Ｎ３）の外因性の発現により、核内のＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質のレベルが低下し、ＭＴＴアッセイによって測定されたようにＨｅＬａおよびＬＣ３１９細胞の増殖が阻害されたが、一方で、それによってＣ６ｏｒｆ１６７陰性のＣＣＤＬｕ−１９細胞の増殖は影響を受けなかった（図４Ｄ、５Ｂ〜５Ｃ）。これらの発見により、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢＩＬ２タンパク質間の相互作用の阻害は、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の核局在を抑制し得、かつがん増殖の低下をもたらすこと、ならびに小分子によるがん細胞における相互作用の阻害は、新しいがん治療のための潜在的治療戦略になり得ることが示唆される。
実施例８：Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質はＮＦＫＢ経路の上流分子として作用する
ＮＦＫＩＬ２タンパク質は、細胞増殖の促進および抗アポトーシスにおいて必須の役割を果たすＮＦＫＢ経路に関与することが示されているため（Rayet B.et al, Oncogene. 1999; 18, 6938-47, Tergaonkar V. Int J. Biochem. Cell Biol. 2006; 38, 1647-53, Yamamoto Y.et al, J Clin Invest. 2001; 107:135-42)、本発明者らは、外因性のＣ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＩＬ２の両方を導入したＨｅＬａ細胞におけるＮＦＫＢ ｐ６５／ＲｅｌＡタンパク質の発現を調べ、ＮＦＫＩＬ２のみを導入した細胞と比較して、内在性ｐ６５／ＲｅｌＡタンパク質のレベルが上昇していることを見出した（図１１）。結果は、Ｃ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２複合体の発現がＮＦＫＢ経路を正に制御し得ることを示唆している。続いて本発明者らは、ＴＮＦ−αで処理したＨｅＬａおよびＬＣ３１９細胞の細胞質および核分画を用いて、ＮＦＫＢ経路分子に対する内在性Ｃ６ｏｒｆ１６７発現の効果を調べようと試みた。まず、ＴＮＦ−α刺激によって細胞の核においてＲｅｌＡ／ｐ６５のレベルは増加するが（ＨｅＬａ細胞の代表的データを図１２に示した）、Ｃ６ｏｒｆ１６７に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７）をトランスフェクトしたこれらの細胞では、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ）をトランスフェクトした細胞と比較して、ＴＮＦ−α処理後に内在性ＲｅｌＡ／ｐ６５タンパク質のレベルは減少することが確認された（図６Ａ）。本発明者らは次いで、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質と抗アポトーシス因子であるＢｃｌ−ＸＬおよびＴＲＡＦ１／２等のＲｅｌＡ／ｐ６５の下流分子との間の関係を調べた。ｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞をＴＮＦ−αで処理した場合、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＴＲＡＦ１はＲｅｌＡ／ｐ６５の上昇に従って増加した（図６Ｂ）。しかしながら、ｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＴＲＡＦ１の上昇は、ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７をトランスフェクトしたＴＮＦ−α刺激細胞では検出されなかった。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の発現レベルは、肺癌細胞株においてｐ６５、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＴＲＡＦ１タンパク質の発現レベルと良好な相関関係を示した（図７Ｂ）。
がん細胞におけるアポトーシス経路に対するＣ６ｏｒｆ１６７発現の効果をさらに調べるために、ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７をトランスフェクトしたがん細胞を、ＤＮＡ損傷剤（シスプラチン／ＣＤＤＰまたは５−フルオロウラシル／５−ＦＵ）を用いることによるＤＮＡ損傷条件下で培養した。ＨｅＬａ細胞におけるｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７でのＣ６ｏｒｆ１６７発現のノックダウン後、細胞をＣＤＤＰ（５０μｇ／ｍＬ）または５−ＦＵ（５０μｇ／ｍＬ）で４８時間処理し、フローサイトメトリー解析のために細胞を回収した。ＤＮＡ損傷条件下で、ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７をトランスフェクトした細胞のサブＧ１集団は、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ）をトランスフェクトしたものと比較して有意に増加した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。本発明者らがｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７またはｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトした細胞を２０Ｊの紫外線に４８時間曝露した場合、同様の結果が観察された（データ示さず）。ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７またはｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトし、続いて上述のようにＣＤＤＰで処理したＨｅＬａ細胞を用いたウエスタンブロッティングにより、ＡＴＭ、ＣＳＢ、およびｐ５３等のＤＮＡ修復分子、ならびにＲｅｌＡ／ｐ６５およびその下流の抗アポトーシス因子Ｂｃｌ−ＸＬの誘導は、ｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトした細胞と比較して、ｓｉ−Ｃ６ｏｒｆ１６７をトランスフェクトした細胞において有意に抑制されることが明らかになった（図６Ｃ）。データは、Ｃ６ｏｒｆ１６７がこれらの抗アポトーシス因子の上流分子として機能することができ、いくつかのＤＮＡ修復経路分子の誘導に影響を及ぼし得ることも示唆している（図６Ｄ）。
考察
放射線療法および化学療法等の様々な治療法と組み合わせた近年の外科技術の進歩にもかかわらず、肺癌および食道癌患者の臨床転帰は依然として不良のままである。従って、新しいタイプの抗がん薬の開発が心待ちにされている。薬の開発のための新規標的分子を同定するために、本発明者らは、肺癌および食道癌細胞において過剰発現している遺伝子についての網羅的ゲノム発現プロファイル解析を、ＲＮＡｉ技術および腫瘍組織マイクロアレイ解析による機能消失効果のハイスループットスクリーニングと組み合わせた(Kikuchi T,et al. Oncogene 2003; 22:2192-205, Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003; 1:485-99, Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004; 13:3029-43, Furukawa C, et al. Cancer Res 2005; 65:7102-10, Hayama S, et al. Cancer Res 2007; 67:4113-22, Hirata D, et al. Clin Cancer Res 2009; 15:256-66, Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004; 10:8363-70, Takano A, et al. Cancer Res 2009; 69: 6694-703, Sato N, et al. Cancer Res 2010; 70: 5326-36, Kono K, et al. Cancer Sci. 2009; 100: 1502-9, Tomita Y, et al. Cancer Sci 2011; 102 (49) 697-705)。この系統的手法を通して、本発明者らは、肺癌および食道癌の臨床サンプルにおいてＣ６ｏｒｆ１６７が高い頻度で上方制御されていることを見出し、かつこの遺伝子産物ががん細胞の増殖および／または生存において不可欠な役割を果たすことを示した。
Ｃ６ｏｒｆ１６７は推定がん遺伝子であること、ならびにその核局在および安定性はＮＦＫＢＩＬ２との結合によって増進されることが実証された。加えて、本発明者らは、がん細胞内へのＮＦＫＢＩＬ２タンパク質のＣ末部の導入が、おそらくＣ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２相互作用を遮断することによってＣ６ｏｒｆ１６７の核局在をドミナントネガティブに阻害し得、かつがん細胞の増殖／生存の抑制をもたらすことを明らかにした。さらに、がん細胞内へのＣ６ｏｒｆ１６７またはＮＦＫＢＩＬ２に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、それらの発現および細胞増殖が抑制された。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７−ＮＦＫＢＩＬ２相互作用の阻害またはＣ６ｏｒｆ１６７タンパク質の機能を抑制することは、新規がん治療の開発のための有効な手法であり得る。
現在までのところ、ＮＦＫＢ転写因子は免疫応答、炎症応答、および急性期応答の主要な調節因子であり、かつ細胞増殖およびアポトーシスの制御に関与することが知られている(Rayet B.et al, Oncogene. 1999; 18, 6938-47, Tergaonkar V. Int J. Biochem. Cell Biol. 2006; 38, 1647-53, Yamamoto Y.et al, J Clin Invest. 2001; 107:135-42, Kim, H. J.et al, Cell Death Differ. 2006; 13, 738-47)。ＮＦＫＢ活性の活性化および結果として生じるその下流遺伝子の誘導は、哺乳類細胞における腫瘍形成につながる。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質は、ＲｅｌＡ／ｐ６５の上流分子として作用し、かつ抗アポトーシス因子Ｂｃｌ−ＸＬまたはＴＲＡＦ１の誘導に不可欠であると思われる。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の調節および機能に関するさらなる研究は、Ｃ６ｏｒｆ１６７およびＮＦＫＢ経路の活性化を介した発がんの分子メカニズムの理解に寄与するであろう。
がん化学療法では、多くの種類のＤＮＡ損傷剤が用いられているところである。細胞周期を標的とする最も一般的な手法は、５−ＦＵまたはＣＤＤＰのようなＤＮＡに損傷を与える化学療法剤の効果を利用するものであって、その効果は種々のがん細胞においてアポトーシスを誘導する多様な細胞内標的によって仲介される(BJ Lee, et al. Chemotherapy. 2005; 51: 103-10)。しかしながらＤＮＡ損傷薬の毒性は、いくつかのＤＮＡ修復経路ならびに抗アポトーシス因子の活性によって低減することができる。従って、特異的なＤＮＡ修復および／または抗アポトーシス経路の阻害剤は、ＤＮＡ損傷に基づくがん治療の有効性を改善することができる新規がん治療の有望な治療戦略であり得る(BJ Lee, et al. Chemotherapy. 2005; 51: 103-10)。これらのデータにより、ＤＮＡ損傷剤に対する細胞応答におけるＣ６ｏｒｆ１６７の関与が示唆された。実際に、Ｃ６ｏｒｆ１６７発現のノックダウンも、おそらくＡＴＭ、ＣＳＢ、およびｐ５３等のＤＮＡ修復分子、ならびにＲｅｌＡ／ｐ６５およびその下流の抗アポトーシス因子Ｂｃｌ−ＸＬの誘導の阻害によって、５−ＦＵおよびＣＤＤＰを含むＤＮＡ損傷剤に曝露したがん細胞のアポトーシスを増進した。本発明者らの実験についての組み合わせたデータにより、細胞の薬物応答および発がんにおけるＣ６ｏｒｆ１６７の詳細な機能は依然として解明されていないが、Ｃ６ｏｒｆ１６７はこれらの抗アポトーシス因子およびＤＮＡ修復分子の上流分子として機能し得ること、ならびにＣ６ｏｒｆ１６７を標的とすることは抗がん治療に対するがん細胞の耐性を回避するのに重要な利点を有し得ることが示唆される。
要約すると、これらのデータは、Ｃ６ｏｒｆ１６７はがん細胞においてＮＦＫＢＩＬ２とのその相互作用を介してＮＦＫＢ経路に関与すること、およびそれは副作用のリスクが最低限である非常に特異的な抗がん薬を開発するための有望な標的候補であり得ることを示している。
本明細書において提供されたデータは、がんについての包括的理解を高め、新規診断戦略の開発を容易にし、かつ治療薬および予防剤のための分子標的を提供する。そのような情報は、腫瘍発生のより深い理解に寄与し、かつ診断、治療、および最終的にはがんの予防のための有用な戦略を開発するための指標を提供する。マイクロアレイのデータによれば、Ｃ６ｏｒｆ１６７は有望な治療標的分子として見出された。Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質は、肺癌臨床サンプルにおいて高頻度で上方制御されており、この遺伝子産物が肺癌細胞の増殖に不可欠な役割を果たすことが示された。現在までのところ、Ｃ６ｏｒｆ１６７が発がんに関与し得ることを示す研究はない。本発明において、Ｃ６ｏｒｆ１６７は肺癌において高くかつ高頻度に発現する推定がん遺伝子であることが示された。Ｃ６ｏｒｆ１６７およびその相互作用タンパク質ＮＦＫＢＩＬ２の間の相互作用の阻害は、新しいタイプの抗がん薬の開発のための有用な治療戦略である。
例えばその示差的発現を考慮すると、Ｃ６ｏｒｆ１６７は、がん、特に肺癌を同定および検出するための分子診断マーカーとして好都合に使用することができる。従って、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質は、がんの診断キットおよびアッセイに有用である。
本発明はさらに、細胞増殖がＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子またはＮＦＫＢＩＬ２のＣ末端の部分タンパク質を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制され得ることを実証している。従って、二本鎖分子およびＮＦＫＢＩＬ２のＣ末端の部分タンパク質は、抗がん医薬として有用である。さらに、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドは、抗がん医薬の開発のための有用な標的である。例えば、Ｃ６ｏｒｆ１６７タンパク質の発現を遮断またはその活性を妨げる物質は、抗がん剤、特に肺癌の治療のための抗がん剤として治療上有用である。
本明細書で引用した出版物、データベース、配列、特許、および特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を詳細にかつその特定の態様に関して説明してきたが、前述の説明は本質的に、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。従って本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。

Claims (40)

  1. 対象由来の生物学的試料におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを測定する段階を含む、対象におけるがんまたはがんを発症する素因の検出または診断の方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較した前記レベルの増加が、対象におけるがんの存在、または対象ががんに罹患しているかもしくはがんを発症するリスクを有することを示し、発現レベルが、
    （ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
    （ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること；および
    （ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出すること
    からなる群より選択される方法のいずれか一つによって測定される、方法。
  2. 前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、請求項１記載の方法。
  3. 対象由来の生物学的試料が生検試料である、請求項１または２記載の方法。
  4. がんが肺癌である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. （ａ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
    （ｂ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
    （ｃ）Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
    からなる群より選択される試薬を少なくとも１種含む、がんの検出または診断のためのキット。
  6. 試薬が、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む、請求項５記載のキット。
  7. Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む、がんの検出または診断のための試薬。
  8. がんが肺癌である、請求項５もしくは６記載のキット、または請求項７記載の試薬。
  9. がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
    （ｂ）該ポリペプチドまたは機能的等価物と試験物質との間の結合活性を検出する段階；ならびに
    （ｃ）該ポリペプチドまたは機能的等価物に結合する試験物質を、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための候補物質として選択する段階
    を含む、方法。
  10. がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
    （ｂ）段階（ａ）の細胞におけるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
    （ｃ）試験物質の非存在下で検出されるＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現レベルと比較して、段階（ｂ）において検出される発現レベルを低下させる試験物質を選択する段階
    を含む、方法。
  11. がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
    （ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する段階；および
    （ｃ）試験物質の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、段階（ｂ）において検出されるポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を選択する段階
    を含む、方法。
  12. 生物学的活性が、細胞増殖促進活性、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの結合活性、または核局在活性である、請求項１１記載の方法。
  13. がんの治療および予防のいずれかもしくは両方のため、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験物質を、Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞と接触させる段階；
    （ｂ）段階（ａ）におけるレポーター遺伝子の発現および／または活性のレベルを測定する段階；ならびに
    （ｃ）試験物質の非存在下での発現および／または活性のレベルと比較して、段階（ｂ）において検出されるレポーター遺伝子の発現および／または活性のレベルを低下させる試験物質を選択する段階
    を含む、方法。
  14. がんの治療および予防のいずれかまたは両方のため、がん細胞増殖またはＣ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドとＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドとの間の結合の阻害のための候補物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験物質の存在下で、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
    （ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する段階；および
    （ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験物質を選択する段階
    を含む、方法。
  15. Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドのＮＦＫＢＩＬ２結合ドメインを含む、請求項１４記載の方法。
  16. Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８または２０の１〜４１４のアミノ酸配列を含む、請求項１５記載の方法。
  17. ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
  18. ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの機能的等価物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の９３２〜１３７８のアミノ酸配列を含む、請求項１７記載の方法。
  19. がんが肺癌である、請求項９〜１８のいずれか一項記載の方法。
  20. センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、かつＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞に導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子であって、センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９のヌクレオチド配列からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、それらの鎖が標的配列において互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、二本鎖分子。
  21. センス鎖が標的配列においてアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する、請求項２０記載の二本鎖分子。
  22. センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端に１個または２個の３'オーバーハングを有する、請求項２０または２１記載の二本鎖分子。
  23. 一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドである、請求項２０〜２２のいずれか一項記載の二本鎖分子。
  24. ポリヌクレオチドが、一般式
    ５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'または
    ５'−［Ａ'］−［Ｂ］−［Ａ］−３'
    を有し、式中、［Ａ］がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３４４４〜３４６２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７または１９の３６７１〜３６８９のヌクレオチド配列からなる群より選択される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］が約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ'］が標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、請求項２３記載の二本鎖分子。
  25. 請求項２０〜２４のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードするベクター。
  26. Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターを対象に投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法。
  27. 二本鎖分子が請求項２０〜２４のいずれか一項記載のものである、請求項２６記載の方法。
  28. ベクターが請求項２５記載のものである、請求項２６記載の方法。
  29. Ｃ６ｏｒｆ１６７遺伝子を発現する細胞へ導入された場合にＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する薬学的有効量のＣ６ｏｒｆ１６７遺伝子に対する二本鎖分子またはそれをコードするベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物。
  30. 二本鎖分子が請求項２０〜２４のいずれか一項記載のものである、請求項２９記載の組成物。
  31. ベクターが請求項２５記載のものである、請求項２９記載の組成物。
  32. ＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドのＣ６ｏｒｆ１６７結合ドメインを含むポリペプチドであって、Ｃ６ｏｒｆ１６７ポリペプチドの細胞内局在を制御する機能であるＮＦＫＢＩＬ２ポリペプチドの生物学的機能を欠いている、ポリペプチド。
  33. （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｂ）１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド：
    からなる群より選択される、請求項３２記載のポリペプチド。
  34. 細胞膜透過性物質により修飾されている、請求項３２または３３記載のポリペプチド。
  35. 請求項３２または３３記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  36. 請求項３２または３３記載のポリペプチドをコードするベクター。
  37. 請求項３２〜３４のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項３６記載のベクターの薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法。
  38. 請求項３２〜３４のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項３６記載のベクターの薬学的有効量を含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための組成物。
  39. 治療されるがんが肺癌である、請求項２６、２７、２８、または３７記載の方法。
  40. 治療されるがんが肺癌である、請求項２９、３０、３１、または３８記載の組成物。
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