JP2013205159A - Method for producing substance immobilizing carrier having hydrophilic polymer layer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫アッセイでの利用に適した物質固定化用担体に関する。 The present invention relates to a substance immobilization carrier suitable for use in an immunoassay.
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸光、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高いと言われているが、実際には固相担体へのタンパク質の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に非特異的に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおける非特異シグナルの原因の１つとなっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的である。そこで、タンパク質の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）の利用が検討されている。 Enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter referred to as ELISA), which is a kind of immunoassay, is used in a wide range of fields including drug discovery, diagnosis, environmental measurement, and food. A typical ELISA includes (1) antibody or antigen immobilization (solid phase), (2) binding of a target substance, (3) binding of an enzyme-labeled antibody, (4) enzymatic reaction, (5) optical detection. It consists of five steps (absorption, fluorescence, luminescence). Horseradish peroxidase or alkaline phosphatase is used as the labeling enzyme. ELISA is said to be particularly sensitive among many immunoassays, but in reality, the expected sensitivity is often not obtained due to nonspecific adsorption of proteins to a solid support. In particular, a complex such as an enzyme-labeled antibody is easily adsorbed non-specifically to a solid phase carrier, which is one of the causes of non-specific signals in ELISA. In order to prevent such nonspecific adsorption, a blocking treatment with bovine serum albumin (BSA) is attempted, but the effect is limited. Therefore, the use of polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG) that effectively prevents non-specific adsorption of proteins has been studied.
特許文献１には、ＰＥＧ鎖を介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に非イオン性官能基を導入し、ここにヘテロ二官能性ＰＥＧの片末端を連結し、別の末端にタンパク質を結合させる。これによって表面プラズモン共鳴法におけるバックグラウンドノイズが有意に低減されることが記載されている。
特許文献２には、ＰＥＧ鎖を介しタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧ鎖を有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧ鎖の末端にタンパク質を結合させる。これによってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
しかしながら、従来のＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体は、タンパク質の固定化効率が低いという課題があった。高濃度（１ｍｇ／ｍｌ以上）のタンパク質を用いることによってある程度改善されるが、貴重なタンパク質では現実的な方法とは言えない。 However, conventional carriers for immobilizing substances containing PEG chains have a problem of low protein immobilization efficiency. Although it is improved to some extent by using a protein with a high concentration (1 mg / ml or more), it is not a realistic method with a valuable protein.
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、低濃度のタンパク質でも高い密度で固定化することのできるＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of such a situation, and it aims at providing the support | carrier for substance immobilization containing the PEG chain | strand which can be fix | immobilized by high density even if it is a low concentration protein.
本発明者は、物質固定化用担体に含まれるＰＥＧ鎖の数平均分子量が数平均分子量が１７６以上１０３２以下という範囲にある場合に、低濃度のタンパク質でも高密度に固定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含む物質固定化用担体であって、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖と、
被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
（２）支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
被固定化物質と
を少なくとも含む物質固定化担体であって、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と前記被固定化物質とが、共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
（３）（２）の物質固定化担体の製造方法であって、
（１）の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、物質固定化工程
を含む方法。
（４）前記溶液が、イオン強度が０．１００以下である水溶液に、前記被固定化物質を溶解して調製された溶液である、（３）の方法。
（５）前記物質固定化工程後に、前記物質固定化担体と、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と共有結合を形成可能な官能基および更なる親水性基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、（３）又は（４）の方法。
（６）免疫アッセイにより標的物質を測定する方法であって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、（２）の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程
を含む、前記方法。
（７）免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基が、標的物質と結合する抗原又は抗体と共有結合を形成可能な官能基である、あるいは標的物質と共有結合を形成可能な官能基である、（１）の物質固定化用担体
を含む、前記キット。
（８）免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、（２）の物質固定化担体
を含む、前記キット。
The present inventor has found that when the number average molecular weight of the PEG chain contained in the substance immobilization carrier is in the range of 176 to 1032, even a low concentration protein can be immobilized at a high density. The invention has been completed. The present invention includes the following group of inventions.
(1) a support;
A substance immobilization carrier comprising at least a hydrophilic polymer layer disposed on a surface of the support,
The hydrophilic polymer layer is
A polyethylene glycol chain having a number average molecular weight of 176 or more and 1032 or less;
A substance immobilization carrier comprising a functional group linked to the polyethylene glycol chain capable of forming a covalent bond with a substance to be immobilized.
(2) a support;
A hydrophilic polymer layer disposed on the surface of the support;
A substance-immobilized carrier containing at least a substance to be immobilized,
The hydrophilic polymer layer includes a polyethylene glycol chain having a number average molecular weight of 176 or more and 1032 or less,
A substance-immobilized carrier in which the polyethylene glycol chain and the substance to be immobilized are linked via a covalent bond.
(3) A method for producing a substance-immobilized carrier according to (2),
A method comprising a substance immobilization step, wherein the substance immobilization support of (1) is brought into contact with a solution in which the substance to be immobilized is dissolved.
(4) The method according to (3), wherein the solution is a solution prepared by dissolving the substance to be immobilized in an aqueous solution having an ionic strength of 0.100 or less.
(5) After the substance immobilization step, the substance immobilization carrier is contacted with a low molecular weight compound having a functional group capable of forming a covalent bond with a functional group linked to the polyethylene glycol chain and a further hydrophilic group. The method of (3) or (4) further including the process to make.
(6) A method for measuring a target substance by immunoassay,
The method comprising measuring the target substance using the substance-immobilized carrier of (2), wherein the substance to be immobilized is an antigen or an antibody that binds to the target substance, or is a target substance.
(7) A kit for measuring a target substance by immunoassay,
The functional group linked to the polyethylene glycol chain is a functional group capable of forming a covalent bond with an antigen or antibody that binds to a target substance, or a functional group capable of forming a covalent bond with a target substance. (1) The kit comprising a substance immobilizing carrier.
(8) A kit for measuring a target substance by immunoassay,
The kit comprising the substance-immobilized carrier of (2), wherein the substance to be immobilized is an antigen or an antibody that binds to a target substance, or is a target substance.
低濃度のタンパク質であっても高密度に固定化できるＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体を提供できる。 It is possible to provide a substance immobilization carrier containing a PEG chain that can be immobilized at a high density even with a low concentration of protein.
（支持体）
本発明における支持体の材料及び形状は、免疫アッセイにおける固相の支持体として利用可能な材料及び形状であれば特に限定されない。支持体の材料としてはプラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄における問題が小さいことから免疫アッセイ用担体の支持体の材料として特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性ポリマー層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。予め支持体表面にプラズマ処理やコロナ処理などの親水化処理が施されていてもよい。支持体は、免疫アッセイにおける固相として利用可能な表面を有している支持体であればよく、全体の形状は特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
(Support)
The material and shape of the support in the present invention are not particularly limited as long as the material and shape can be used as a solid phase support in an immunoassay. Examples of the material for the support include plastic, glass, quartz, silicon, and metal. Plastic is particularly preferred as a support material for an immunoassay carrier because it is easy to mold and has few problems in transportation and disposal. That is, the support preferably used in the present invention contains plastic in all or at least a part thereof. The surface of the support on the side on which the hydrophilic polymer layer described later is formed preferably contains plastic, and more preferably the surface is made of plastic. Specific examples of the plastic include polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, cyclic polyolefin, acrylic resin, and polyethylene terephthalate. The support surface may be subjected to a hydrophilic treatment such as plasma treatment or corona treatment in advance. The support may be any support that has a surface that can be used as a solid phase in an immunoassay, and the overall shape is not particularly limited. For example, a support in the form of a microwell plate (a plate-like body having a plurality of recesses), particles, slides, tubes, capillaries, microchannels, or the like can be used. In particular, supports in the form of microwell plates, in particular polystyrene microwell plates, are useful.
（親水性ポリマー層）
支持体の表面には、親水性ポリマー層が配置される。親水性ポリマー層はポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を少なくとも含む。「ポリエチレングリコール鎖（又はＰＥＧ鎖）」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。驚くべきことに、親水性ポリマー層におけるＰＥＧ鎖の数平均分子量が免疫アッセイの感度に影響を与える。十分に高感度の免疫アッセイを行うためにはＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６以上（ｍが４以上）であることが好ましく、より好ましくは３６２以上である。ＰＥＧ鎖の数平均分子量が上記の下限よりも小さい場合には実施例で確認されている通り十分な感度が達成できない場合がある。ＰＥＧ鎖の数平均分子量は１０３２以下であることが好ましく、６１２以下であることがより好ましい。ＰＥＧの数平均分子量が上記の上限を上回る場合には、実施例で確認されている通り十分な固定化密度を達成できない場合がある。ここで、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す正の整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
(Hydrophilic polymer layer)
A hydrophilic polymer layer is disposed on the surface of the support. The hydrophilic polymer layer includes at least a polyethylene glycol chain (PEG chain). “Polyethylene glycol chain (or PEG chain)” is represented by the following formula:
- (CH 2 -CH 2 -O) m -
(M is an integer indicating the degree of polymerization)
Refers to the structure represented by Surprisingly, the number average molecular weight of the PEG chains in the hydrophilic polymer layer affects the sensitivity of the immunoassay. In order to perform a sufficiently sensitive immunoassay, the number average molecular weight of the PEG chain is preferably 176 or more (m is 4 or more), more preferably 362 or more. When the number average molecular weight of the PEG chain is smaller than the lower limit, sufficient sensitivity may not be achieved as confirmed in Examples. The number average molecular weight of the PEG chain is preferably 1032 or less, and more preferably 612 or less. When the number average molecular weight of PEG exceeds the above upper limit, a sufficient immobilization density may not be achieved as confirmed in Examples. Here, the number average molecular weight of the PEG chain is PEG used as a raw material or PEG dissociated from a carrier:
HO— (CH 2 —CH 2 —O) m —H
(M is a positive integer indicating the degree of polymerization)
The molecular weight of H 2 O (18.015) can be subtracted from the number average molecular weight of The PEG number average molecular weight is determined by the vapor pressure osmotic pressure method or the membrane osmotic pressure method. The vapor pressure osmotic pressure method can be used when the number average molecular weight of PEG is less than 100,000. The membrane osmotic pressure method can be used when the number average molecular weight of PEG is 10,000 to 1,000,000.
固定化前の物質固定化用担体におけるＰＥＧ鎖の一端には、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていることが好ましい。このような官能基としては、被固定化物質と共有結合を形成することが可能な、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質との反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。 At least one functional group capable of forming a covalent bond with the substance to be immobilized is directly or indirectly linked to one end of the PEG chain in the substance immobilization carrier before immobilization. Is preferred. As such a functional group, (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group, succinimidyloxycarbonyl group, epoxy group, aldehyde group, amino group capable of forming a covalent bond with the substance to be immobilized Group, thiol group, carboxyl group, azide group, cyano group, active ester group (1H-benzotriazol-1-yloxycarbonyl group, pentafluorophenyloxycarbonyl group, paranitrophenyloxycarbonyl group, etc.), halogenated carbonyl group (Carbonyl chloride group, carbonyl fluoride group, carbonyl bromide group, carbonyl iodide group) and the like. These functional groups may be directly linked to the PEG chain as a substituent that replaces the hydrogen of the hydroxyl group at the end of the PEG chain, or may be a functional group bonded to a linker structure bonded to the end of the PEG chain. As such, it may be indirectly linked to the PEG chain. In consideration of the balance between the reactivity with the substance to be immobilized and the storage stability, a (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group and a succinimidyloxycarbonyl group are preferred. These functional groups can react with a functional group such as an amino group of the substance to be immobilized to form a covalent bond.
親水性ポリマー層には官能基が付加されていないＰＥＧ鎖や、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。 The hydrophilic polymer layer may further contain a PEG chain to which no functional group is added or another hydrophilic compound.
（親水性ポリマー層の形成方法）
支持体の、免疫アッセイにおける固相として利用される位置の表面に親水性ポリマー層が形成される。親水性ポリマー層は、支持体表面に化学的又は物理的に固定された官能基との共有結合により支持体に固定化される。
(Method for forming hydrophilic polymer layer)
A hydrophilic polymer layer is formed on the surface of the support at a position used as a solid phase in an immunoassay. The hydrophilic polymer layer is immobilized on the support by a covalent bond with a functional group chemically or physically immobilized on the surface of the support.
本発明の物質固定化担体は、図１１に概略を示すとおり、プライマー層又はカップリング剤を用いて支持体の表面に官能基を導入する工程Ｓ１１０１と、前記官能基にＰＥＧ鎖を連結させる工程Ｓ１１０２と、ＰＥＧ鎖末端へ官能基を連結する工程Ｓ１１０３とを含む方法により製造することができる。 The substance-immobilized carrier of the present invention includes a step S1101 for introducing a functional group on the surface of a support using a primer layer or a coupling agent, and a step for linking a PEG chain to the functional group, as schematically shown in FIG. It can be produced by a method including S1102 and step S1103 of linking a functional group to the PEG chain end.
（プライマー層による官能基の導入）
支持体が表面にプラスチックを含む支持体である場合、該表面にはプライマー層が形成され、該プライマー層の表面に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。このとき、プライマー層のポリシロキサンの側鎖上の官能基が、ＰＥＧ鎖末端と共有結合を形成する。この場合の、本発明の物質固定化用担体の実施形態の概要を、図１２を参照して説明する。
(Introduction of functional group by primer layer)
When the support is a support containing a plastic on the surface, a primer layer is preferably formed on the surface, and a hydrophilic polymer layer is preferably formed on the surface of the primer layer. At this time, the functional group on the side chain of the polysiloxane of the primer layer forms a covalent bond with the PEG chain end. An outline of an embodiment of the substance immobilizing carrier of the present invention in this case will be described with reference to FIG.
物質固定化用担体１２０は、表面Ｓにプラスチックを含む支持体１２１と、表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層１２２と、プライマー層１２２上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層１２３とを備える。
The
親水性ポリマー層１２３のＰＥＧ鎖−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−はプライマー層１２２を構成するポリシロキサンの側鎖Ａと共有結合を介して連結されている。ここで側鎖Ａは、後述する式１のシラノール化合物が有する、Ｒ１に由来する基であり、Ｒ１上の官能基又は該官能基から誘導された官能基がＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基と共有結合を形成して形成された二価の基を指す。ケイ素原子に結合する基Ｘは式１のシラノール化合物のＲ１（ｐ＝２の場合）、Ｒ２（ｐ＋ｑ＝３の場合）、又はヒドロキシル基（ｑ＝３の場合）に由来する基である。プライマー層１２２中のポリシロキサンは直鎖状であってもよいし、分岐鎖状又は網目状の構造を有していてもよいが、好ましくは分岐鎖状又は網目状の構造を有する。ポリシロキサンが分岐鎖状又は網目状の構造を有するとき、Ｘは、他の繰り返し単位（図示していない）のケイ素原子と結合する架橋基である。架橋基としてのＸとしては、式１のシラノール化合物のヒドロキシル基に由来するエーテル基（−Ｏ−）が挙げられる。ポリシロキサンが直鎖状の構造を有するとき、Ｘは、式１に定義するＲ１又はＲ２、未反応のヒドロキシル基、加水分解されずに残存した式２に定義する基Ｙ等の一価の基である。ＰＥＧ鎖の両端のうち、ポリシロキサンと連結されていない側の端部には、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基Ｒ３が、直接的に、或いは必要に応じてリンカーを介して間接的に連結されていることが好ましい。図１２においてＱは結合、又はリンカーを示す。
The PEG chain — (CH 2 —CH 2 —O) m — in the
図１２に示す本実施形態において、支持体１２１は、少なくとも表面Ｓにプラスチックを含む。ポリシロキサンを含むプライマー層１２２は支持体１２１の表面Ｓに物理吸着により結合することができる。物理吸着はファンデルワールス力または疎水性相互作用により生じると考えられる。プライマー層１２２と支持体１２１の表面Ｓとの間には共有結合等の化学結合が形成される必要はないため、表面Ｓがポリスチレン等の、反応性官能基を含まないプラスチックからなる場合であっても、プライマー層１２２を結合させることができる。
In the present embodiment shown in FIG. 12, the
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。支持体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と支持体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物及び形成されたポリシロキサンは支持体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。この点は、ガラスを支持体とする場合とは大きく異なる。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。 The primer layer can be formed of a layer containing at least polysiloxane. Here, polysiloxane is a polymer composed of repeating units of siloxane bonds (Si—O—Si) and can be obtained by condensation polymerization of silanol compounds. The condensation of the silanol compound is a reaction that occurs between the molecules of the silanol compound. When the plastic molecule on the support surface does not have a reactive functional group, no reaction occurs between the silanol compound and the plastic molecule on the support surface. That is, the silanol compound and the formed polysiloxane are not physically reacted with the plastic molecules on the support surface, but are merely physically adsorbed. This point is greatly different from the case of using glass as a support. The physical adsorption power of such a silanol compound to the plastic surface is extremely weak with a monomer, but becomes stronger when condensation proceeds to some extent and becomes a polymer (polysiloxane). A primer layer containing polysiloxane is formed on the plastic surface by appropriately condensing the silanol compound.
（シラノール化合物）
本発明で用いられるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は典型的には式１で表される構造を有する：
The silanol compound used in the present invention has an organic group containing a carbon atom directly connected to a silicon atom and having a functional group, in addition to a silanol group (Si—OH). This organic group becomes the side chain of the polysiloxane. Silanol compounds typically have a structure represented by Formula 1:
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。 (P is 1 or 2, q is 2 or 3, p + q is 3 or 4, and R 1 is an organic group containing a carbon atom directly connected to a silicon atom and having a functional group. R 2 is an organic group containing a carbon atom directly connected to a silicon atom). It is preferable that p = 1 and q = 2 or 3, and it is more preferable that p = 1 and q = 3. When p + q = 4, R 2 is not present.
Ｒ１は、好ましくは、水素原子が、１つ以上（好ましくは１つ）の官能基により、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換されている、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６の炭化水素基である（ただし、前記炭化水素基の全部又は一部がビニル基である場合のように、前記炭化水素基自体が官能基である場合は官能基により置換されている必要はない）。前記炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖或いは環構造を有する、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（アルキル基、炭素数２以上のアルケニル基、又は炭素数２以上のアルキニル基）であってもよいし、単環又は多環の炭素数６以上の芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記脂肪族炭化水素基によって置換された前記芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記芳香族炭化水素基によって置換され前記脂肪族炭化水素基であってもよい。前記炭化水素基では、炭素−炭素結合が、１又は２個の、酸素、窒素及び硫黄から選択される同一又は異なる原子により中断されていてもよい。炭化水素基の例としては好ましくはプロピル基、エチル基が挙げられる。 R 1 preferably has 1 to 20 carbon atoms, in which a hydrogen atom is substituted with one or more (preferably one) functional group, if necessary, through an appropriate linker structure. Is a hydrocarbon group of 1 to 15, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 6 (provided that all or part of the hydrocarbon group is a vinyl group, as in the case of the hydrocarbon group If it is a functional group, it need not be substituted with a functional group). The hydrocarbon group is a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group (an alkyl group, an alkenyl group having 2 or more carbon atoms, or an alkynyl group having 2 or more carbon atoms) having a linear or branched chain or ring structure. It may be a monocyclic or polycyclic aromatic hydrocarbon group having 6 or more carbon atoms, or the aromatic hydrocarbon group substituted by one or more aliphatic hydrocarbon groups. The aliphatic hydrocarbon group may be substituted with one or more aromatic hydrocarbon groups. In the hydrocarbon group, the carbon-carbon bond may be interrupted by 1 or 2 identical or different atoms selected from oxygen, nitrogen and sulfur. Preferred examples of the hydrocarbon group include a propyl group and an ethyl group.
Ｒ１における、前記炭化水素基の１つ以上の水素を、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換する官能基としては、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換可能な官能基であれば特に限定されないが、典型的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。グリシジル基又はエポキシ基は、それ自体がＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成可能であるが、特開２００９−１５６８６４号公報に記載されている方法に従って、グリシジル基又はエポキシ基をアルデヒド基に変換し、形成されたアルデヒド基と、ＰＥＧが有するヒドロキシル基とを反応させてもよい。これらの官能基は、前記炭化水素基の水素原子を直接置換してもよいし、適切なリンカー構造を介して置換してもよい。リンカー構造としては、例えば炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられ、例えば、炭化水素基が左側に、官能基が右側にそれぞれ結合するとしたとき、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−、−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−（Ｎ＝Ｃ＝Ｎ）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）−で表される構造が挙げられる。 As a functional group for substituting one or more hydrogens of the hydrocarbon group in R 1 through an appropriate linker structure as necessary, it can react with a hydroxyl group of PEG to form a covalent bond. Although it will not specifically limit if it is a functional group which can be converted into the functional group which can react with the hydroxyl group of PEG, or the functional group which can form a covalent bond, Typically, (1H- imidazol-1-yl ) Carbonyl group, succinimidyloxycarbonyl group, glycidyl group, epoxy group, aldehyde group, amino group, thiol group, carboxyl group, azide group, cyano group, active ester group (1H-benzotriazol-1-yloxycarbonyl) Group, pentafluorophenyloxycarbonyl group, paranitrophenyloxycarbonyl group, etc.), halogenated carbonyl group Isocyanate group, a maleimide group, and the like. Among them, a glycidyl group or an epoxy group is preferable. The glycidyl group or epoxy group itself can react with the hydroxyl group of PEG to form a covalent bond. According to the method described in JP2009-156864A, the glycidyl group or epoxy group is converted into an aldehyde group. The aldehyde group thus formed may be reacted with the hydroxyl group of PEG. These functional groups may be substituted directly on the hydrogen atom of the hydrocarbon group or may be substituted via an appropriate linker structure. Examples of the linker structure include a divalent group having 0 to 3 carbon atoms and 0 to 3 identical or different heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur. When the group is bonded to the left side and the functional group is bonded to the right side, -O-, -S-, -NH-,-(C = O) O-, -O (C = O)-, -NH (C = O)-,-(C = O) NH-,-(C = O) S-, -S (C = O)-, -NH (C = S)-,-(C = S) NH-, Structures represented by-(N = C = N)-, -CH = N-, -N = CH-, -O-O-, -S-S-,-(O = S = O)-are mentioned. It is done.
Ｒ１の特に好ましい態様としては３−グリシドキシプロピル基、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。 Particularly preferred embodiments of R 1 include a 3-glycidoxypropyl group and a 2- (3,4-epoxycyclohexyl) ethyl group.
Ｒ２は、好ましくは、置換基により置換されていないという点を除いてＲ１について上述したものと同様の（ただしＲ１とは独立して選択される）炭化水素基であり、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。 R 2 is preferably a hydrocarbon group similar to that described above for R 1 except that it is not substituted by a substituent (but selected independently of R 1 ), A linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and a methyl group or an ethyl group is particularly preferable.
（加水分解によりシラノール化合物を生成するケイ素化合物）
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を生成可能な基を有するケイ素化合物を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は式２で表される構造を有する：
The silanol compound can be produced by hydrolyzing a silicon compound having a group capable of producing a silanol group (Si—OH) by hydrolysis. Such silicon compounds have a structure represented by Formula 2:
Ｙとしては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基等が好ましい。Ｙとしては特に、炭素数１〜６のアルコキシ基（特にメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、塩素原子が好ましい。 Y is preferably an alkoxy group, a halogen atom, an aryloxy group, an alkoxy group substituted by an alkoxy group or an aryloxy group, an aryloxy group substituted by an alkoxy group or an aryloxy group, an alkylcarbonyloxy group, or the like. Y is particularly an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms (particularly a methoxy group, ethoxy group, isopropoxy group, tert-butoxy group), an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms substituted by an alkoxy group (for example, methoxyethoxy group). Group), an alkylcarbonyloxy group having 1 to 6 carbon atoms (for example, an acetoxy group), and a chlorine atom are preferable.
式２のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。
As the silicon compound of
（プライマー層の形成方法）
ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体の表面上において式１のシラノール化合物を重合させる工程（プライマー層形成工程）を含む方法により形成可能である。該工程は、好ましくは、式２のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式１のシラノール化合物を生成する工程と、生成したシラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程とを含む。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、式２のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式１のシラノール化合物が生成する。
(Method for forming primer layer)
The primer layer containing polysiloxane can be formed by a method including a step (primer layer forming step) of polymerizing the silanol compound of
次いでシラノール化合物を支持体表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサンを形成する。式１のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を支持体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。プライマー層の被覆密度は、シラノールや塩基の濃度、あるいはシラノール溶液をプラスチック表面に接触させる時間によって制御可能である。プライマー層の被覆密度が高ければ高いほど、次の工程で共有結合させるＰＥＧ鎖の結合密度も高くなる。
A silanol compound is then applied to the support surface and a polysiloxane is formed by condensation polymerization. The silanol compound of
形成されたポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を誘導体化して他の官能基に変換する場合には、プライマー層形成後に引き続き、ポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換する誘導体化工程を行う。 When the functional group from the silanol compound on the side chain of the formed polysiloxane is derivatized and converted to another functional group, the functional group from the silanol compound on the side chain of the polysiloxane is subsequently formed after the primer layer is formed. A derivatization step is performed in which is converted to a functional group capable of reacting with the hydroxyl group of PEG to form a covalent bond.
（シランカップリング剤による官能基の導入）
支持体が表面にガラス、石英またはシリコンを含む支持体である場合、該表面に、シランカップリング剤の加水分解により生成される、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を結合させることにより、或いは、更に、必要に応じて該官能基をＰＥＧと共有結合を形成することができる他の官能基に変換する誘導体化により、支持体表面にＰＥＧと共有結合を形成することができる官能基を導入することができる。該官能基とＰＥＧの一端との反応によりシランカップリング剤と親水性ポリマー層のＰＥＧ鎖とを共有結合により連結することができる。
(Introduction of functional group by silane coupling agent)
When the support is a support containing glass, quartz or silicon on the surface, an organic group containing a carbon atom directly bonded to a silicon atom and having a functional group formed on the surface by hydrolysis of a silane coupling agent It is shared with PEG on the surface of the support by linking a silanol compound having a functional group or, if necessary, by derivatization that converts the functional group into another functional group capable of forming a covalent bond with PEG. Functional groups capable of forming bonds can be introduced. The silane coupling agent and the PEG chain of the hydrophilic polymer layer can be linked by a covalent bond by a reaction between the functional group and one end of PEG.
シラノール化合物としては、プライマー層に関して上述した式１のシラノール化合物と同様のものを使用することができる。
As a silanol compound, the thing similar to the silanol compound of
シランカップリング剤としては、プライマー層に関して上述した式２のケイ素化合物と同様のものを使用することができる。
As the silane coupling agent, those similar to the silicon compound of
この実施形態では、支持体表面に導入された、シラノール化合物又はシランカップリング剤に由来する有機基上の官能基又は該官能基から誘導された他の官能基がＰＥＧ末端のヒドロキシル基と共有結合を形成するために用いられる。 In this embodiment, a functional group on an organic group derived from a silanol compound or a silane coupling agent or other functional group derived from the functional group introduced on the support surface is covalently bonded to a hydroxyl group at the PEG end. Is used to form
（親水性ポリマー層の形成）
プライマー層、シランカップリング剤等により官能基が導入された支持体表面に、ＰＥＧを反応させてＰＥＧ鎖を形成する（Ｓ１１０２）。このとき触媒量の濃硫酸を含むＰＥＧを接触させる。ここで、数平均分子量が１０００を超えるＰＥＧはあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜９０℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は３０〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＰＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＰＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
(Formation of hydrophilic polymer layer)
PEG is reacted to form a PEG chain on the surface of the support into which a functional group has been introduced by a primer layer, a silane coupling agent or the like (S1102). At this time, a PEG containing a catalytic amount of concentrated sulfuric acid is brought into contact. Here, PEG having a number average molecular weight exceeding 1000 is previously heated and melted. If necessary, PEG may be diluted with tert-butyl alcohol or the like. The PEG solution is brought into contact with the plastic surface and heated. The heating temperature can be set in the range of 60 to 90 ° C, but is preferably around 80 ° C (75 ° C to 85 ° C) considering the heat resistance of the plastic. The heating time can be set in the range of 10 minutes to 24 hours, but when the heating temperature is around 80 ° C., 30 to 60 minutes is preferable. Through the above operation, the PEG chain is covalently bonded to the primer layer. At this time, the binding density of the PEG chain depends on the coating density of the primer layer.
最後に、ＰＥＧ鎖の一端に、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる（Ｓ１１０３）。官能基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層、シランカップリング剤等を介して支持体表面に固定されたＰＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。 Finally, at least one functional group capable of forming a covalent bond with the substance to be immobilized is directly or indirectly linked to one end of the PEG chain (S1103). The method for introducing the functional group is not particularly limited. A preferred embodiment of the method for introducing a (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group and a succinimidyloxycarbonyl group as a substituent for substituting the hydrogen of the hydroxyl group at the end of the PEG chain is as follows. 1,1′-carbonyldiimidazole (hereinafter referred to as CDI) or dicarbonate (N-succinimidyl) (hereinafter referred to as DSC) is attached to the other end of the PEG chain, one end of which is fixed to the support surface via a primer layer, a silane coupling agent, ) Is reacted as follows.
上記の反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、支持体がプラスチックを含む場合には、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは２０分間〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、官能基が共有結合されたＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が形成される。 The above reaction needs to be carried out in an organic solvent containing little water. Since plastics generally have low resistance to organic solvents, when the support contains plastics, it is preferable to use acetonitrile, dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent obtained by mixing these organic solvents in an appropriate ratio. The water content of these organic solvents is desirably 0.1% or less. The final concentration of CDI or DSC can be set in the range of 0.01 to 1M. However, when the reaction is performed at room temperature or lower, it is preferably 0.1M or higher. When the support contains plastic, it is desirable to set the reaction temperature in the range of 4 to 25 ° C. in order to avoid damage to the plastic. The reaction time is preferably set in the range of 10 minutes to 24 hours, and preferably 20 minutes to 60 minutes when the CDI concentration is around 0.5 M (0.4 to 0.6 M). By the above operation, a hydrophilic polymer layer containing a PEG chain having a functional group covalently bonded thereto is formed.
（被固定化物質）
本発明の物質固定化用担体には、目的に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体および物質固定化担体では、「被固定化物質」が、「標的物質と結合する抗原又は抗体」又は「標的物質」であることが好ましい。
(Immobilized substance)
An antigen or antibody that binds to a target substance or a target substance is immobilized on the substance immobilization carrier of the present invention depending on the purpose. In the present invention, these target substances for immobilization are called “substances to be immobilized”. In the substance immobilization carrier and substance immobilization carrier of the present invention for use in an immunoassay, the “immobilized substance” is preferably “an antigen or antibody that binds to a target substance” or “target substance”.
後述するサンドイッチ法又は直接競合法による免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体では、被固定化物質として「標的物質と結合する抗原又は抗体」が固定化される。この実施形態において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。 In the substance immobilization carrier of the present invention for use in an immunoassay by the sandwich method or direct competition method described later, “an antigen or antibody that binds to a target substance” is immobilized as the substance to be immobilized. In this embodiment, the combination of the substance to be immobilized and the target substance is not particularly limited as long as it is a combination capable of specific binding based on the antigen-antibody reaction. For example, when the target substance is an antigen (including a hapten), the immobilized substance can be an antibody (including an antibody fragment), and when the target substance is an antibody (including an antibody fragment) The immobilized substance can be an antigen (including a hapten).
後述する間接競合法による免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体では、被固定化物質として「標的物質」が固定化される。この実施形態において固定化される標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。 In the substance immobilization carrier of the present invention for use in an immunoassay by the indirect competitive method described later, the “target substance” is immobilized as the substance to be immobilized. In this embodiment, the target substance to be immobilized is an antigen (including a hapten) or an antibody (including an antibody fragment).
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（DNA、RNA）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。 The antigen as the substance to be immobilized and / or the target substance is not particularly limited as long as it is a substance exhibiting specific antigen-antibody reactivity with an antibody. Typical antigens include natural antigens such as proteins, peptides, saccharides, nucleic acids (DNA, RNA), lipids, coenzymes, cells, viruses, bacteria, and complexes of these, derivatives of natural antigens, and artificial synthesis. Hapten, artificial antigen and the like.
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。 An antibody as an immobilized substance and / or a target substance refers to an immunoglobulin exhibiting specific antigen-antibody reactivity to a certain antigen and a fragment thereof, and may be subjected to chemical modification or the like as necessary. .
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。 The substance to be immobilized is not particularly limited as long as it has a functional group capable of reacting with a functional group of the PEG chain to form a covalent bond. Such functional groups typically include amino groups, but also include thiol groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, alkoxides, secondary amines, tertiary amines, azide groups, cyano groups, and the like. Even if the substance to be immobilized has no functional group capable of forming a covalent bond by reaction with a functional group linked to the PEG chain, such as an amino group, the amino group is not present in these substances. Etc. can be used for immobilization by artificially introducing the above.
（被固定化物質の固定化）
被固定化物質は例えば以下のように固定化される。まず、被固定化物質を適宜ｐＨ調整された水溶液に溶解する。このとき、アミノ基成分を含まない水溶液を用いることが好ましい。ｐＨ調整された水溶液としては緩衝液が好ましい。緩衝液の具体例としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などが挙げられる。これらは被固定化物質の種類によって適宜撰択される。被固定化物質を溶解する前の状態での水溶液のイオン強度は０．１００以下であることが望ましい。イオン強度が０．１００を超える場合、詳細なメカニズムは不明であるが、タンパク質の固相化が阻害される場合がある。被固定化物質を溶解するための水溶液の、より好ましいイオン強度は、被固定化物質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、被固定化物質が抗体である場合には、被固定化物質を溶解するための水溶液のイオン強度は０．０６０以下であることが好ましく、０．０５０以下であることが特に好ましい。被固定化物質が抗体以外のタンパク質である場合には、被固定化物質を溶解するための水溶液のイオン強度は０．１００以下であることが好ましく、０．０７０以下であることがより好ましく、０．０２０以下であることが特に好ましい。
(Immobilization of substances to be immobilized)
The substance to be immobilized is immobilized as follows, for example. First, the substance to be immobilized is dissolved in an aqueous solution whose pH is adjusted appropriately. At this time, it is preferable to use an aqueous solution containing no amino group component. A buffer solution is preferable as the pH-adjusted aqueous solution. Specific examples of the buffer include an acetate buffer, a citrate buffer, a phosphate buffer, and a carbonate-bicarbonate buffer. These are appropriately selected depending on the kind of the substance to be immobilized. It is desirable that the ionic strength of the aqueous solution in a state before dissolving the substance to be immobilized is 0.100 or less. When the ionic strength exceeds 0.100, the detailed mechanism is unknown, but the protein immobilization may be inhibited. More preferable ionic strength of the aqueous solution for dissolving the substance to be immobilized can be appropriately determined according to the kind of the substance to be immobilized. For example, when the substance to be immobilized is an antibody, the ionic strength of the aqueous solution for dissolving the substance to be immobilized is preferably 0.060 or less, and particularly preferably 0.050 or less. When the substance to be immobilized is a protein other than an antibody, the ionic strength of the aqueous solution for dissolving the substance to be immobilized is preferably 0.100 or less, more preferably 0.070 or less, It is especially preferable that it is 0.020 or less.
ここで、イオン強度は次式：
で求められる物理量である。例えば、０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液の場合は、主要イオン種がＮａ＋とＣｌ−となるため、
It is a physical quantity calculated by For example, in the case of a 0.1 M sodium chloride aqueous solution, the main ionic species are Na + and Cl − ,
被固定化物質を溶解するための水溶液は、典型的には、水溶性塩等の水溶性成分が水中に溶解された溶液である。当該水溶液としては、多くの場合、水溶性成分の濃度が１０ｍＭ前後の水溶液であれば問題なく用いることができる。適切な水溶液（好ましくは、適切なｐＨに調整された緩衝液）であれば、従来の１００分の１から１０００分の１の濃度でタンパク質を高密度に固定化することができる。例えば、被固定化物質がタンパク質である場合、前記イオン強度を有する水溶液に１ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度となるように前記タンパク質を溶解させた液を、本発明の物質固定化用担体に接触させることにより、十分な密度で前記タンパク質を固定化することが可能である。 The aqueous solution for dissolving the substance to be immobilized is typically a solution in which a water-soluble component such as a water-soluble salt is dissolved in water. In many cases, the aqueous solution can be used without any problem as long as the concentration of the water-soluble component is about 10 mM. With an appropriate aqueous solution (preferably, a buffer adjusted to an appropriate pH), the protein can be immobilized at a high density at a conventional concentration of 1/100 to 1/1000. For example, when the substance to be immobilized is protein, the protein is dissolved in the aqueous solution having ionic strength so that the concentration is less than 1 mg / ml, preferably 1 to 100 μg / ml, more preferably 1 to 10 μg / ml. The protein can be immobilized at a sufficient density by bringing the liquid thus brought into contact with the substance immobilization carrier of the present invention.
水溶液中にトレハロースやスクロースなどの糖類、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０などの非イオン性界面活性剤が含まれていてもよく、これらの添加剤は被固定化物質の固定化を阻害しない。反応温度は４〜３７℃、接触時間は１分〜２４時間の範囲で適宜選択される。適切な条件下であれば、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合、ウレタン結合等の共有結合が形成される。
The aqueous solution may contain saccharides such as trehalose and sucrose, and nonionic surfactants such as Triton (registered trademark) X-100 and
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、該未反応の官能基と共有結合を形成可能な官能基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい。これによって、免疫アッセイに関与する物質が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。前記低分子化合物が有する官能基としては、典型的にはアミノ基が挙げられる。この操作は、ＰＥＧ鎖に連結された官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためには、前記低分子化合物として、ＰＥＧ鎖に連結された官能基と結合を形成する官能基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。更なる親水性基としては水酸基が挙げられる。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。これらの低分子化合物を水溶液として調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、所望の被固定化物質を固定化した基材と接触させる。低分子化合物の濃度は１〜１０００ｍＭ、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化するとよい。 After the desired substance to be immobilized is bound to the PEG chain, the unreacted functional group linked to the PEG chain is converted to a low molecular compound having a functional group capable of forming a covalent bond with the unreacted functional group. By bonding, the functional group may be converted to a functional group having a lower reactivity. This can prevent the substance involved in the immunoassay from being improperly immobilized on the surface of the carrier. The functional group of the low molecular compound typically includes an amino group. This operation is particularly necessary when the reactivity of the functional group linked to the PEG chain is high. However, the surface of the carrier after reacting the functional group with the low molecular weight compound is desirably hydrophilic. This is because a hydrophilic surface generally has an effect of suppressing nonspecific adsorption of a biological substance. For this purpose, it is preferable to use a low molecular compound further having a hydrophilic group in addition to the functional group that forms a bond with the functional group linked to the PEG chain. Further hydrophilic groups include hydroxyl groups. Examples of such low molecular weight compounds include 2-aminoethanol and 2- (2-aminoethoxy) ethanol, and 2- (2-aminoethoxy) ethanol is particularly preferable. These low molecular weight compounds are prepared as an aqueous solution, and after adjusting the pH as necessary, they are brought into contact with a substrate on which a desired substance to be immobilized is immobilized. The concentration of the low molecular weight compound is preferably optimized within a range of 1 to 1000 mM, a contact time of 1 minute to 24 hours, and a temperature of 4 to 37 ° C.
（免疫アッセイ）
本発明はまた、本発明の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む免疫アッセイに関する。本発明において「標的物質を測定する」とは、測定対象試料中の標的物質の存在の有無、及び／又は、測定対象試料中の標的物質の量を測定することを指す。免疫アッセイは、具体的には、本発明の物質固定化担体と、測定対象試料とを、該担体上の被固定化物質に、該測定対象試料中の標的物質の量に相関した量の抗原又は抗体（ここで該抗原又は抗体とは、測定対象試料中の標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能抗原又は検出可能抗体等を指す）が抗原抗体反応により結合する条件において接触させる工程と、前記工程において被固定化物質に結合した抗原又は抗体を検出する工程とを含む。
(Immunoassay)
The present invention also relates to an immunoassay comprising a step of measuring a target substance using the substance-immobilized carrier of the present invention. In the present invention, “measuring a target substance” refers to measuring the presence or absence of the target substance in the measurement target sample and / or the amount of the target substance in the measurement target sample. Specifically, the immunoassay comprises the substance-immobilized carrier of the present invention and the sample to be measured on the substance to be immobilized on the carrier, and an amount of antigen correlated with the amount of the target substance in the sample to be measured. Or an antibody (wherein the antigen or antibody is a target substance in a sample to be measured, a detectable target substance added to the antigen-antibody reaction system as necessary, or a detection added to the antigen-antibody reaction system as needed) And a step of detecting the antigen or antibody bound to the substance to be immobilized in the step.
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイは公知の方法で実施することができ、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。 The immunoassay using the substance-immobilized carrier of the present invention can be performed by a known method, and can be in any mode such as a sandwich system, a direct competition system, and an indirect competition system.
サンドイッチ方式の免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、該被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。 In a sandwich type immunoassay, a substance-immobilized carrier in which an antigen or antibody that binds to a target substance is immobilized as a substance to be immobilized, and a target substance that binds to the target substance in a non-competitive manner are directly used. At least a detectable antigen or detectable antibody that is a detectable or indirectly detectable antigen or antibody is used.
サンドイッチ方式の免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質との抗原抗体反応を行う、一次反応工程と、
一次反応工程の後に、前記物質固定化担体と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体とを接触させ、被固定化物質に結合した標的物質と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体との抗原抗体反応を行う、二次反応工程と、
二次反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
Sandwich-type immunoassays are typically
A primary reaction step in which a sample to be measured is brought into contact with the substance-immobilized carrier, and an antigen-antibody reaction between the target substance and the substance to be immobilized in the sample to be measured is performed;
After the primary reaction step, the substance-immobilized carrier is brought into contact with the detectable antigen or antibody, and the antigen-antibody reaction between the target substance bound to the substance to be immobilized and the detectable antigen or detectable antibody Performing a secondary reaction step;
After the secondary reaction step, at least a detection step of detecting the detectable antigen or the detectable antibody bound to the substance-immobilized carrier is included.
一次反応工程及び二次反応工程では、抗原抗体反応後に、担体に固定化されていない成分を洗浄除去する洗浄工程を適宜含む。 The primary reaction step and the secondary reaction step appropriately include a washing step for washing and removing components not immobilized on the carrier after the antigen-antibody reaction.
二次反応工程に用いられる「検出可能抗原又は検出可能抗体」は、被固定化物質と競合しない位置において標的物質と結合する。検出可能抗原又は検出可能抗体は、検出可能な標識物質と連結された標識抗原又は標識抗体（直接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよいし、検出可能な標識物質と、更なる反応によって連結されて標識されうる抗原又は抗体（間接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよい。後者の例としては、検出可能な標識物質と連結された二次抗体と結合可能な抗原又は抗体や、ビオチン−アビジン（又はビオチン−ストレプトアビジン）結合対の一方と連結された標識物質と結合可能な、前記結合対の他方と連結された抗原又は抗体等が挙げられる。 The “detectable antigen or detectable antibody” used in the secondary reaction step binds to the target substance at a position that does not compete with the immobilized substance. The detectable antigen or detectable antibody may be a labeled antigen or labeled antibody (directly detectable antigen or antibody) linked to a detectable labeling substance, or a detectable labeling substance, and It may be an antigen or antibody (an indirectly detectable antigen or antibody) that can be linked and labeled by reaction. Examples of the latter include an antigen or antibody capable of binding to a secondary antibody linked to a detectable labeling substance, or a labeling substance linked to one of a biotin-avidin (or biotin-streptavidin) binding pair. Examples thereof include an antigen or an antibody linked to the other of the binding pair.
直接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質とが少なくとも用いられる。 In an immunoassay based on a direct competition method, a substance-immobilized carrier in which an antigen or antibody that binds to a target substance is immobilized as an immobilized substance, and the immobilized substance competitively with the target substance in the sample to be measured. At least a detectable target substance, which is a directly or indirectly detectable target substance that binds to is used.
直接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能標的物質と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応と、検出可能標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、直接競合反応工程と、
直接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した検出可能標的物質を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
Immunoassays using a direct competition format typically
A sample to be measured, a detectable target substance, and the substance-immobilized carrier are brought into contact with each other, an antigen-antibody reaction between the target substance in the sample to be measured and the immobilized substance, a detectable target substance and the target substance A direct competitive reaction step for competitively performing an antigen-antibody reaction with an immobilized substance;
It includes at least a detection step of detecting a detectable target substance bound to the substance-immobilized support after the direct competitive reaction step.
直接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能標的物質とを洗浄除去する工程が適宜含まれる。 The direct competitive reaction step appropriately includes a step of washing and removing the target substance not bound to the carrier and the detectable target substance after the antigen-antibody reaction.
直接競合方式による免疫アッセイにおいて、標的物質は抗原又は抗体であり、検出可能標的物質は対応する検出可能抗原又は検出可能抗体である。検出可能標的物質としては、測定対象試料中の標的物質とは独立して検出することができるものである限り、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体において、抗原又は抗体として標的物質が用いられたものが使用可能である。 In an immunoassay based on a direct competition system, the target substance is an antigen or an antibody, and the detectable target substance is a corresponding detectable antigen or antibody. As long as the detectable target substance can be detected independently of the target substance in the sample to be measured, in the detectable antigen or detectable antibody described above with respect to the sandwich method, the target substance is the antigen or antibody. The used one can be used.
間接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。 In an indirect competitive immunoassay, a substance-immobilized carrier in which a target substance is immobilized as an immobilized substance is usually directly coupled to a target substance in the measurement target sample and the immobilized substance. Alternatively, at least a detectable antigen or antibody that is an indirectly detectable antigen or antibody is used.
間接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能抗原又は検出可能抗体と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応と、前記被固定化物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、間接競合反応工程と、
間接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
Immunoassays using an indirect competitive format typically
A sample to be measured, a detectable antigen or a detectable antibody, and the substance-immobilized carrier are contacted, and an antigen-antibody reaction between the target substance in the sample to be measured and the detectable antigen or the detectable antibody, An indirect competitive reaction step of competitively performing an antigen-antibody reaction between the immobilized substance and the detectable antigen or the detectable antibody;
After the indirect competitive reaction step, at least a detection step of detecting the detectable antigen or the detectable antibody bound to the substance-immobilized carrier is included.
間接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能抗原又は検出可能抗体とを洗浄除去する工程が適宜含まれる。 The indirect competitive reaction step appropriately includes a step of washing and removing the target substance not bound to the carrier and the detectable antigen or detectable antibody after the antigen-antibody reaction.
検出可能抗原又は検出可能抗体としては、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体と同様のものが使用できる。 As the detectable antigen or detectable antibody, those similar to the detectable antigen or detectable antibody described above with respect to the sandwich method can be used.
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイにおいて抗原又は抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的又は間接的に標識された抗原又は抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノＰＣＲ）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。本発明の免疫アッセイは、安全性及び簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。標識物質として用いることができる酵素は特に限定されないが、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼが挙げられる。酵素活性による検出の方法としては、酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等を用いた検出方法が挙げられ、なかでも化学発光基質を用いた検出方法が好ましい。一般に、化学発光基質を用いた検出は発色基質を用いた検出よりも感度が高いため、酵素反応に要する時間を短縮することができる。特に、フェムトグラムのレベルの微量な標的物質の検出に使用される高感度な化学発光基質を用いれば、感度の点で相乗効果を得ることができる。このような化学発光基質としてはＥＣＬＴＭＡｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア）、ＥＣＬＴＭＰｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）、イムノスター（登録商標）ＬＤ（和光純薬）、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＣＳＰＤ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられ、そのための酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。化学発光を検出するための検出器としては、発光プレートリーダーやＣＣＤイメージャーを用いることができる。これらの検出器はダイナミックレンジが広いという点でも都合がよい。すなわち、本発明の物質固定化担体と化学発光基質とを組み合わせれば、迅速かつ高感度でダイナミックレンジの広いＥＬＩＳＡを達成できる。 The means for detecting the antigen or antibody in the immunoassay using the substance-immobilized carrier of the present invention is not particularly limited, and an antigen or antibody labeled directly or indirectly with any labeling substance can be used. As a labeling substance, an amplified detection signal such as an enzyme (ELISA method), a nucleic acid (immunoPCR), an electrochemiluminescent substance (electrochemiluminescent method), a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a radioactive substance, etc. can be generated. Possible labeling substances are mentioned. In view of safety and simplicity, the immunoassay of the present invention is preferably an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that uses an enzyme as a labeling substance and performs detection based on enzyme activity. The enzyme that can be used as the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include peroxidase such as horseradish peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, and glucose oxidase. Examples of detection methods using enzyme activity include detection methods using chemiluminescent substrates that chemiluminescent by enzyme activity, chromogenic substrates that generate color by enzyme activity, chemiluminescent substrates that emit chemical fluorescence by enzyme activity, etc. A detection method using a luminescent substrate is preferred. In general, since detection using a chemiluminescent substrate is more sensitive than detection using a chromogenic substrate, the time required for the enzyme reaction can be shortened. In particular, if a highly sensitive chemiluminescent substrate used for detection of a trace amount of target substance at the femtogram level is used, a synergistic effect can be obtained in terms of sensitivity. Examples of such chemiluminescent substrates include ECL ™ Advance (GE Healthcare), ECL ™ Plus (GE Healthcare), Immunostar (registered trademark) LD (Wako Pure Chemical Industries), CDP-STAR (registered trademark) (Roche Diagnostics ). Nostics), CSPD (registered trademark) (Roche Diagnostics), SuperSignal West Femto Maxum Sensitive Substrate, and enzymes for that include peroxidase such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase Is mentioned. As a detector for detecting chemiluminescence, a luminescence plate reader or a CCD imager can be used. These detectors are also advantageous in that they have a wide dynamic range. That is, when the substance-immobilized carrier of the present invention and the chemiluminescent substrate are combined, an ELISA having a wide dynamic range can be achieved quickly, with high sensitivity.
（免疫アッセイ用キット）
本発明の物質固定化用担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分としては、免疫アッセイの種類に応じて、被固定化物質に抗原抗体反応により結合した標的物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体や、被固定化物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体（直接的又は間接的に検出可能な標的物質を含む）が例示できる。更に、免疫アッセイに必要な成分としては、間接的な検出に用いるための、前記間接的に検出可能な抗原又は抗体と結合可能な標識物質や、検出用試薬（例えば標識物質が酵素である場合には酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等）が挙げられる。「直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体」及び「直接的又は間接的に検出可能な標的物質」は上記「免疫アッセイ」の欄にて説明したのと同様のものが使用できる。該キットは更に、被固定化物質（標的物質と結合する抗原又は抗体、或いは、標的物質であることができる）や、被固定化物質を物質固定化用担体に固定化するために用いられる試薬（例えば被固定化物質を溶解するための緩衝液等の水溶液や、当該水溶液を作成するための水溶性成分）を含んでもよい。
(Immunoassay kit)
The substance immobilization carrier of the present invention can constitute a kit for measuring a target substance by immunoassay. The kit can further comprise components necessary for the immunoassay. As a component necessary for an immunoassay, a directly or indirectly detectable antigen or antibody that binds to a target substance bound to an immobilized substance by an antigen-antibody reaction, depending on the type of immunoassay, by the antigen-antibody reaction Further, examples include directly or indirectly detectable antigens or antibodies (including directly or indirectly detectable target substances) that bind to an immobilized substance by an antigen-antibody reaction. Furthermore, components necessary for the immunoassay include a labeling substance capable of binding to the indirectly detectable antigen or antibody for use in indirect detection, and a detection reagent (for example, when the labeling substance is an enzyme). Include a chemiluminescent substrate that chemiluminescents by enzyme activity, a chromogenic substrate that develops color by enzyme activity, a chemiluminescent substrate that emits chemical fluorescence by enzyme activity, and the like. “Directly or indirectly detectable antigen or antibody” and “directly or indirectly detectable target substance” can be the same as those described in the above “Immunoassay” column. The kit further includes a substance to be immobilized (an antigen or an antibody that binds to the target substance, or a target substance) or a reagent used to immobilize the substance to be immobilized on a substance immobilization carrier. (For example, an aqueous solution such as a buffer solution for dissolving the substance to be immobilized, or a water-soluble component for preparing the aqueous solution) may be included.
本発明の物質固定化担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分の具体例は上記の通りである。 The substance-immobilized carrier of the present invention can constitute a kit for measuring a target substance by immunoassay. The kit can further comprise components necessary for the immunoassay. Specific examples of components necessary for the immunoassay are as described above.
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。 The present invention will be described below with reference to the drawings and specific examples.
［実施例１］
図１は物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を表す。ポリスチレン製９６穴マイクロプレート１１の表面にポリシロキサンを含むプライマー層１２が形成されている。プライマー層１２の側鎖にはＰＥＧ鎖１３の片末端が共有結合を介して連結されている。ＰＥＧ鎖１３の別の末端には（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基１４が連結されている。ＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６〜１０３２の範囲にある。
[Example 1]
FIG. 1 shows an embodiment of the present invention relating to a substance immobilizing carrier. A primer layer 12 containing polysiloxane is formed on the surface of a 96-well polystyrene microplate 11. One end of the PEG chain 13 is linked to the side chain of the primer layer 12 through a covalent bond. A (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group 14 is linked to the other end of the PEG chain 13. The number average molecular weight of the PEG chain is in the range of 176-1032.
［実施例２］
図２は実施例１の担体の製造方法を表す。まず、１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加し、続けて０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。この溶液をポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、室温で１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ（関東化学）を各ウェルに１００μｌずつ分注し、８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製した。この溶液を各ウェルに４０μｌずつ分注し、室温で３０分間放置した。最後に、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。
[Example 2]
FIG. 2 shows a method for producing the carrier of Example 1. First, silanol was prepared by adding 0.35 ml of dilute hydrochloric acid (pH 2.4) to 1.65 ml of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS, Momentive Performance Materials). This was added to 100 ml of 2-propanol (Pure Chemical), followed by 0.5 ml of triethylamine (Wako Pure Chemical Industries). 100 μl of this solution was dispensed into each well of a polystyrene 96-well microplate (Becton Dickinson) and left at room temperature for 135 minutes. Thereafter, the inside of the well was washed with pure water and dried by nitrogen blowing. Next, 100 μl of PEG (Kanto Chemical) containing a catalytic amount of concentrated sulfuric acid was dispensed into each well and heated at 80 ° C. for 45 minutes. Thereafter, the inside of the well was washed with pure water and dried by nitrogen blowing. Next, a CDI (Tokyo Kasei) solution having a final concentration of 0.5 M was prepared using an equal weight mixed solvent of dehydrated acetonitrile (Kanto Chemical) and dehydrated dimethyl sulfoxide (Kanto Chemical). 40 μl of this solution was dispensed into each well and left at room temperature for 30 minutes. Finally, the inside of the well was washed with pure water and dried by nitrogen blowing.
［実施例３］
担体に含まれるＰＥＧ鎖の数平均分子量とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、表１に示す数平均分子量を有する各種ＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を実施例２にしたがって作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液にＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を溶解し、５μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗体溶液を調製した。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した。その後、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を分注し、室温で１０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１０３２以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（表１）。
[Example 3]
The relationship between the number average molecular weight of the PEG chain contained in the carrier and the immobilized amount of IgG antibody was determined as follows. First, a substance-immobilizing support (96-well microplate) containing various PEG chains having the number average molecular weight shown in Table 1 was prepared according to Example 2. Next, IgG antibody (Rockland) was dissolved in 10 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution to prepare a 5 μg / ml IgG antibody solution. This was dispensed onto the carrier and left at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 1 μg / ml of HRP-labeled anti-IgG antibody (Rockland) was dispensed and left at room temperature for 10 minutes. The carrier was washed three times with PBS containing 0.05
［実施例４］
ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、様々な濃度（１．６〜２００ｍＭ）のリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）にＩｇＧ抗体を溶解し、５μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗体溶液を調製した。リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度とイオン強度の関係は表２に示した通りである。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０５０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（図３）。
[Example 4]
The relationship between the ionic strength of the IgG antibody solution and the immobilized amount of IgG antibody was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, IgG antibody was dissolved in various concentrations (1.6 to 200 mM) of sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 4.4) to prepare a 5 μg / ml IgG antibody solution. The relationship between the concentration of sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and ionic strength is as shown in Table 2. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 3. As a result, when the ionic strength of the IgG antibody solution was 0.050 or less, it was found that even a low concentration (5 μg / ml) IgG antibody could be immobilized at a high density (FIG. 3).
［実施例５］
ＩｇＧ抗体溶液の塩濃度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）に塩化ナトリウムを添加し、様々な塩濃度（０〜２００ｍＭ）の水溶液を調製した。これらにＩｇＧ抗体を溶解し、イオン強度の異なる様々なＩｇＧ抗体溶液（５μｇ／ｍｌ）を調製した。塩濃度とイオン強度の関係は表３に示した通りである。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０６０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（図４）。
[Example 5]
The relationship between the salt concentration of the IgG antibody solution and the immobilized amount of IgG antibody was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, sodium chloride was added to a 10 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 4.4) to prepare aqueous solutions having various salt concentrations (0 to 200 mM). IgG antibodies were dissolved in these to prepare various IgG antibody solutions (5 μg / ml) having different ionic strengths. The relationship between salt concentration and ionic strength is as shown in Table 3. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 3. As a result, when the ionic strength of the IgG antibody solution was 0.060 or less, it was found that even a low concentration (5 μg / ml) IgG antibody could be immobilized at a high density (FIG. 4).
［実施例６］
ＩｇＧ抗体の濃度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）にＩｇＧ抗体を溶解し、様々な濃度（０．８〜１００μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体溶液を調製した。表３によれば、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度は０.０１０である。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０１０の場合は、約２０μｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ抗体の固定化密度が最大になることがわかった（図５）。
[Example 6]
The relationship between the concentration of IgG antibody and the amount of immobilized IgG antibody was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, IgG antibody was dissolved in 10 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 4.4) to prepare IgG antibody solutions having various concentrations (0.8 to 100 μg / ml). According to Table 3, the ionic strength of the IgG antibody solution is 0.010. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 3. As a result, it was found that when the ionic strength of the IgG antibody solution was 0.010, the IgG antibody immobilization density was maximized at a concentration of about 20 μg / ml (FIG. 5).
［実施例７］
リゾチーム溶液のイオン強度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、様々な濃度（１．６〜２００ｍＭ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチーム（和光純薬）を溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。リン酸緩衝液の濃度とイオン強度の関係は表４に示した通りである。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、室温で１０分間放置した。その後、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で１０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.１００以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のリゾチームであっても高密度に固定化できることがわかった（図６）。
[Example 7]
The relationship between the ionic strength of the lysozyme solution and the amount of lysozyme immobilized was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, egg white lysozyme (Wako Pure Chemical Industries) was dissolved in various concentrations (1.6 to 200 mM) of phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 5 μg / ml lysozyme solution. The relationship between the phosphate buffer concentration and ionic strength is as shown in Table 4. This was dispensed onto the carrier and left at room temperature for 10 minutes. Next, 1 μg / ml of anti-lysozyme antibody (Nordic Immunological Laboratories) was dispensed and left at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 1 μg / ml of HRP-labeled anti-IgG antibody was dispensed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The carrier was washed three times with PBS containing 0.05
［実施例８］
リゾチーム溶液の塩濃度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に塩化ナトリウムを添加し、様々な塩濃度（０〜２００ｍＭ）の水溶液を調製した。これらにリゾチームを溶解し、イオン強度の異なる様々なリゾチーム溶液（５μｇ／ｍｌ）を調製した。塩濃度とイオン強度の関係は表５に示した通りである。その後の操作は実施例７と同様に行なった。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.０７０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のリゾチームであっても高密度に固定化できることがわかった（図７）。
[Example 8]
The relationship between the salt concentration of the lysozyme solution and the amount of lysozyme immobilized was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, sodium chloride was added to 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to prepare aqueous solutions having various salt concentrations (0 to 200 mM). Lysozyme was dissolved in these to prepare various lysozyme solutions (5 μg / ml) having different ionic strengths. The relationship between salt concentration and ionic strength is as shown in Table 5. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 7. As a result, it was found that even when the lysozyme solution had an ionic strength of 0.070 or less, even a low concentration (5 μg / ml) of lysozyme could be immobilized at a high density (FIG. 7).
［実施例９］
リゾチームの濃度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にリゾチームを溶解し、様々な濃度のリゾチーム溶液（０．８〜１００μｇ／ｍｌ）を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０.０２０である。その後の操作は実施例７と同様に行なった。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.０２０以下の場合は、１μｇ／ｍｌの濃度でリゾチームの固定化密度が最大になることがわかった（図８）。
[Example 9]
The relationship between the concentration of lysozyme and the amount of lysozyme immobilized was determined as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, lysozyme was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to prepare lysozyme solutions (0.8 to 100 μg / ml) having various concentrations. According to Table 5, the ionic strength of the lysozyme solution is 0.020. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 7. As a result, it was found that when the ionic strength of the lysozyme solution was 0.020 or less, the immobilization density of lysozyme was maximized at a concentration of 1 μg / ml (FIG. 8).
［実施例１０］
本発明の物質固定化用担体を用いて抗リゾチーム抗体の検出感度を以下のように求めた（間接ＥＬＩＳＡ）。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０．０２０である。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した（固相化）。次に、１Ｍの２−（２−アミノエトキシ）エタノール水溶液（ｐＨ９．６）を分注し、室温で１０分間放置した。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体を分注し、室温で６０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、抗リゾチーム抗体（Ａｎｔｉ−Ｌｙｚ）の検出感度は０．０６ｎｇ／ｍｌであった（図９）。
[Example 10]
Using the substance immobilization carrier of the present invention, the detection sensitivity of the anti-lysozyme antibody was determined as follows (indirect ELISA). First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, egg white lysozyme was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 5 μg / ml lysozyme solution. According to Table 5, the ionic strength of the lysozyme solution is 0.020. This was dispensed onto the carrier and allowed to stand at room temperature for 10 minutes (solid phase). Next, 1M 2- (2-aminoethoxy) ethanol aqueous solution (pH 9.6) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 0 to 500 ng / ml of anti-lysozyme antibody was dispensed and left at room temperature for 60 minutes. Next, 1 μg / ml of HRP-labeled anti-IgG antibody was dispensed and left at room temperature for 30 minutes. After washing the carrier three times with PBS containing 0.05% Triton (registered trademark) X-100, a phosphate buffer solution containing chromogenic substrate SAT-3 and hydrogen peroxide was dispensed, and color was allowed to develop for 15 minutes at room temperature. It was. Finally, the color development reaction was stopped with 1 M sulfuric acid, and the absorbance (474 nm) was measured using an absorbance plate reader. As a result, the detection sensitivity of the anti-lysozyme antibody (Anti-Lyz) was 0.06 ng / ml (FIG. 9).
（比較例１）
実施例１０の比較例として、市販されているＥＬＩＳＡ用プレートを用いて抗リゾチーム抗体の検出感度を次のように求めた。まず、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。これを上記プレートに分注し、３７℃で３０分間放置した（固相化）。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを分注し、室温で３０分間放置した（ブロッキング）。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体を分注し、室温で６０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、抗リゾチーム抗体の検出感度は３．９ｎｇ／ｍｌであった（図９）。すなわち、本発明の物質固定化用担体は市販品の約６５倍の検出感度を示した。
(Comparative Example 1)
As a comparative example of Example 10, the detection sensitivity of the anti-lysozyme antibody was determined as follows using a commercially available ELISA plate. First, egg white lysozyme was dissolved in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) to prepare a 5 μg / ml lysozyme solution. This was dispensed onto the plate and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes (solid phase). Next, PBS containing 1% BSA was dispensed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes (blocking). Thereafter, 0 to 500 ng / ml of anti-lysozyme antibody was dispensed and left at room temperature for 60 minutes. Next, 1 μg / ml of HRP-labeled anti-IgG antibody was dispensed and left at room temperature for 30 minutes. The plate was washed three times with PBS containing 0.05
［実施例１１］
本発明におけるアミノ基を有する低分子化合物の効果を以下のように検証した。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）に抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を溶解し、５μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。表３によれば、抗体溶液のイオン強度は０．０１０である。これを上記担体に分注し、室温で３０分間放置した（固相化）。次に、１Ｍの２−（２−アミノエトキシ）エタノール水溶液（ｐＨ９．６）を分注し、室温で１０分間放置した。一方で、このような低分子化合物と接触させていない担体も用意した。その後、０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を分注し、室温で６０分間放置した。次に、２μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＩＬ−１β抗体を分注し、室温で３０分間放置した。続いて、０．２５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、２−（２−アミノエトキシ）エタノールと接触させたときのＩＬ−１βの検出感度は０．１５ｐｇ／ｍｌ、接触させなかったときの検出感度は１９．５ｐｇ／ｍｌであった（図１０）。すなわち、本発明の物質固定化担体は、２−（２−アミノエトキシ）エタノールと接触させることによって検出感度が著しく改善されることがわかった。
[Example 11]
The effect of the low molecular weight compound having an amino group in the present invention was verified as follows. First, a substance-immobilizing carrier (96-well microplate) containing a PEG chain (raw material PEG400) was prepared according to Example 2. Next, an anti-IL-1β antibody (Biolegend) was dissolved in a 10 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 4.4) to prepare an antibody solution of 5 μg / ml. According to Table 3, the ionic strength of the antibody solution is 0.010. This was dispensed onto the carrier and allowed to stand at room temperature for 30 minutes (solid phase). Next, 1M 2- (2-aminoethoxy) ethanol aqueous solution (pH 9.6) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. On the other hand, a carrier not contacted with such a low molecular compound was also prepared. Thereafter, 0 to 2500 pg / ml of IL-1β (Wako Pure Chemical Industries) was dispensed and left at room temperature for 60 minutes. Next, 2 μg / ml of biotin-labeled anti-IL-1β antibody was dispensed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 0.25 μg / ml of HRP-labeled streptavidin (Prozyme) was dispensed and left at room temperature for 30 minutes. After the carrier was washed three times with PBS containing 0.05% Triton (registered trademark) X-100, a buffer containing chromogenic substrate SAT-3 and hydrogen peroxide was dispensed, and color was allowed to develop for 15 minutes at room temperature. Finally, the color development reaction was stopped with 1 M sulfuric acid, and the absorbance (474 nm) was measured using an absorbance plate reader. As a result, the detection sensitivity of IL-1β when contacted with 2- (2-aminoethoxy) ethanol was 0.15 pg / ml, and the detection sensitivity when not contacted was 19.5 pg / ml (FIG. 10). That is, it has been found that the detection sensitivity of the substance-immobilized carrier of the present invention is remarkably improved by bringing it into contact with 2- (2-aminoethoxy) ethanol.
［実施例１２］
ＰＥＧ鎖の数平均分子量と抗リゾチーム抗体の検出感度の関係を以下のように求めた。なお、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１０３２を超えるものについてはＩｇＧ抗体を十分な密度で固定化できなかったので検討から除外した。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を７種類作製した。ＰＥＧ鎖の原料および数平均分子量は表６に示した通りである。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０．０２０である。その後の操作は実施例１０と同様に行なった。その結果、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６以上１０３２以下のときに高い検出感度（０．０３μｇ／ｍｌ）を示すことがわかった（表６）。
[Example 12]
The relationship between the number average molecular weight of the PEG chain and the detection sensitivity of the anti-lysozyme antibody was determined as follows. In addition, since the IgG antibody could not be immobilized at a sufficient density, the number average molecular weight of the PEG chain exceeded 1032 was excluded from the examination. First, according to Example 2, seven types of substance-immobilizing carriers (96-well microplates) containing PEG chains were prepared. The raw material and number average molecular weight of the PEG chain are as shown in Table 6. Next, egg white lysozyme was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 5 μg / ml lysozyme solution. According to Table 5, the ionic strength of the lysozyme solution is 0.020. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 10. As a result, it was found that high detection sensitivity (0.03 μg / ml) was exhibited when the number average molecular weight of the PEG chain was 176 or more and 1032 or less (Table 6).
１０ ＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体
１１ ポリスチレンからなる支持体
１２ ポリシロキサンを含むプライマー層
１３ 数平均分子量１７６〜１０３２のＰＥＧ鎖
１４ (１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基
１２０ 物質固定化用担体
１２１ 表面Ｓにプラスチックを含む支持体
１２２ 表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層
１２３ プライマー層上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層
DESCRIPTION OF
Claims (8)
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含む物質固定化用担体であって、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖と、
被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。 A support;
A substance immobilization carrier comprising at least a hydrophilic polymer layer disposed on a surface of the support,
The hydrophilic polymer layer is
A polyethylene glycol chain having a number average molecular weight of 176 or more and 1032 or less;
A substance immobilization carrier comprising a functional group linked to the polyethylene glycol chain capable of forming a covalent bond with a substance to be immobilized.
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
被固定化物質と
を少なくとも含む物質固定化担体であって、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と前記被固定化物質とが、共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。 A support;
A hydrophilic polymer layer disposed on the surface of the support;
A substance-immobilized carrier containing at least a substance to be immobilized,
The hydrophilic polymer layer includes a polyethylene glycol chain having a number average molecular weight of 176 or more and 1032 or less,
A substance-immobilized carrier in which the polyethylene glycol chain and the substance to be immobilized are linked via a covalent bond.
請求項１の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、物質固定化工程
を含む方法。 A method for producing a substance-immobilized carrier according to claim 2,
A method comprising a substance immobilization step, wherein the substance immobilization support according to claim 1 is brought into contact with a solution in which the substance to be immobilized is dissolved.
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、請求項２の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程
を含む、前記方法。 A method for measuring a target substance by an immunoassay, comprising:
The method comprising measuring a target substance using the substance-immobilized carrier according to claim 2, wherein the substance to be immobilized is an antigen or an antibody that binds to the target substance, or is a target substance.
前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基が、標的物質と結合する抗原又は抗体と共有結合を形成可能な官能基である、あるいは標的物質と共有結合を形成可能な官能基である、請求項１の物質固定化用担体
を含む、前記キット。 A kit for measuring a target substance by an immunoassay,
The functional group linked to the polyethylene glycol chain is a functional group capable of forming a covalent bond with an antigen or antibody that binds to a target substance, or a functional group capable of forming a covalent bond with a target substance. The kit comprising a substance immobilizing carrier.
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、請求項２の物質固定化担体
を含む、前記キット。 A kit for measuring a target substance by an immunoassay,
The kit comprising the substance-immobilized carrier according to claim 2, wherein the substance to be immobilized is an antigen or an antibody that binds to a target substance, or is a target substance.
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