JP2012532626A

JP2012532626A - 無毒化されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ免疫原

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Publication number: JP2012532626A
Application number: JP2012520121A
Authority: JP
Inventors: ローラセリーノ，; マリアリタフォンタナ，; ダニーロゴメスモリエル，
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2012-12-20
Also published as: ZA201200833B; EP2837386B1; EP2464658B1; WO2011007257A1; US8871214B2; EP2464658A1; MX2012000734A; US20120207777A1; EP2837386A1; PT2464658E; ES2526996T3; SI2464658T1; PL2464658T3; CA2768343A1; IL217539A0; ES2670799T3; US10058600B2; HRP20141270T1; SG178035A1; CN102770443A

Abstract

病原性Ｅ．ｃｏｌｉ「ＡｃｆＤ前駆体」（ｏｒｆ３５２６）の無毒化改変体は、被験体において天然のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させることが同定されている。該無毒化改変体は、天然のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して増大した溶解度を持つようにさらに修飾され得る。例えば、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して変異を含むＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドを提供し、該変異が、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して該免疫原性ポリペプチドの毒性を低下させ、また、この免疫原性ポリペプチドは、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる。

Description

この出願は、２００９年７月１６日に出願された米国仮出願第６１／２２６，２１９号、および２００９年１２月２９日に出願された同第６１／２９０，６５４号（これらの両方の完全な内容は、全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本発明は、病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株に対する免疫化に関する。

Ｅ．ｃｏｌｉ株は、伝統的に、片利共生的または病原性のいずれかとして分類されており、そして病原性株は、その後、腸内株または腸外株として下位分類される。病原性Ｅ．ｃｏｌｉは、参考文献１（非特許文献１）の中でさらに詳細に議論されており、多数の様々な病原型（すなわち、共通する毒性因子のセットを使用して１つの共通する疾患を引き起こすＥ．ｃｏｌｉ株の１つのグループ）に該当する。株の病原型決定（ｐａｔｈｏｔｙｐｉｎｇ）は日常的に行われている技術であり、これは、遺伝子型によって行うことができ、また、表現型によって行うこともできる。１つの最近の遺伝子型に基づく病原型決定の方法［２（非特許文献２）］では、ＤＮＡマイクロアレイが使用される。

腸内株の間では、少なくとも６種類の十分に記載されている病原型が公知である：腸病原性（ＥＰＥＣ）、腸出血性（ＥＨＥＣ）、腸管凝集性（ＥＡＥＣ）、腸侵入性（ＥＩＥＣ）、腸毒性（ＥＴＥＣ）、および分散接着性（ＤＡＥＣ）。

Ｅ．ｃｏｌｉの腸外病原性株（すなわち、「ＥｘＰＥＣ」株［３（非特許文献３）、４（非特許文献４）］）には、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株、新生児髄膜炎（ＮＭＥＣ）株、および敗血症関連株（ＳＥＰＥＣ）が含まれる。ＥｘＰＥＣは、尿管感染の最も一般的な原因であり、重篤な合併症および死に至る可能性があるヒトの新生児髄膜炎および新生児敗血症の主原因の１つである。他のタイプの腸外感染としては、骨髄炎、肺、腹内、柔組織、および血管内装置が関係している感染が挙げられる。ヒト以外の別のＥｘＰＥＣ病原型は鳥病原性（ＡＰＥＣ）であり、これは、家禽において腸外感染を引き起こす。

ほとんどの以前からあるＥｘＰＥＣワクチンは、細胞溶解物または細胞構造をベースとするものである。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ（商標）には、６種類のＥｘＰＥＣ株を含む１０種類の熱によって死滅させられた細菌が含まれている。ＵＲＯ−ＶＡＸＯＭ（商標）は、１８種類の選択されたＥ．ｃｏｌｉ株の凍結乾燥させられた細菌溶解物を含む、経口用の錠剤型のワクチンである。ＢａｘｔｅｒＶａｃｃｉｎｅによっては、６種類から１０種類の異なる株に由来する繊毛をベースとするＵＴＩワクチンが開発された。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによっては、ＦｉｍＨ付着因子複合体をベースとする、ＭＥＤＩ５１６と呼ばれる製品が開発されている。対照的に、参考文献５および６（特許文献１および２）には、ＮＭＥＣ株およびＵＰＥＣ株の両方に対して、定義されているワクチンに基づいて使用することができる、ＥｘＰＥＣ株由来の特異的免疫原が開示されている。

国際公開第２００６／０８９２６４号国際公開第２００６／０９１５１７号

Ｋａｐｅｒら、ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）２（２）：１２３−４０Ａｎｊｕｍら、ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００７）７３：５６９２−７ＲｕｓｓｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ（２０００）１８１：１７５３−１７５４Ｓｍｉｔｈら、ＦｏｏｄｂｏｒｎｅＰａｔｈｏｇｅｎｓＡｎｄＤｉｓｅａｓｅ（２００７）４：１３４−６３

本発明の目的は、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する、より詳しくは、腸内病原型（例えば、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣおよびＥＴＥＣ株）ならびにＥｘＰＥＣ病原型に対する免疫化における使用のためのさらなるさらに良好な抗原を提供すること、特に、免疫化のための成分としての使用が可能になるように無毒化した抗原、または惹起される免疫応答を低減させることなく発現と精製が改善されるように（ｔｏａｓｔｏ）短くした抗原を提供することである。

発明の開示
参考文献５に開示されている多くの抗原の１つは、アクセサリー定着因子Ｄ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＤ）（「ＡｃｆＤ」）前駆体（ｏｒｆ３５２６）と注釈が付けられている（その中の配列番号７０５１および７０５２；本明細書中では配列番号１）。参考文献５には、ＮＭＥＣ株のＩＨＥ３０３４に由来する配列が開示されており、本発明は、ＥｘＰＥＣ「ＡｃｆＤ前駆体」（ｏｒｆ３５２６）の改変体（これは、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、およびＥＴＥＣ株を含むさらなる病原型においても同定されている）に基づく。参考文献５の開示とは異なり、これらの改変体は、腸内病原型の処置に特に有用であり得る。したがって、本発明により、そのような改変体が、Ｅ．ｃｏｌｉ感染に対して患者を免疫化することにおけるそれらの使用とともに提供される。加えて、本開示には、全てのＥ．ｃｏｌｉ病原型のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の断片および改変体が含まれる。ここでは、これらの断片は、全長と比較して高い溶解度を有しているが、被験体においては、全長のタンパク質によって惹起されるものと実質的に類似する免疫応答を惹起させる。さらに、本開示は、全長のタンパク質と比較して毒性は低下しているが、被験体において全長のタンパク質によって惹起されるものと実質的に類似する免疫応答を惹起させる、すべてのＥ．ｃｏｌｉ病原型のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の断片および変異体を含む。また、本開示は、被験体において全長のタンパク質によって惹起されるものと実質的に類似する免疫応答を惹起させるとともに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合、精製に関して改善された特性を持つ、すべてのＥ．ｃｏｌｉ病原型のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の断片および変異体を含む。

本発明とともに使用されるポリペプチド
本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して変異を含むＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、該変異が、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して該免疫原性ポリペプチドの毒性を低下させるものである、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチドを提供する。

Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質は、配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つものであり得る。

毒性を低下させる例示的な変異としては、ジンシン（ｚｉｎｃｉｎ）メタロプロテアーゼドメインの全体またはその一部の欠失、およびジンシンメタロプロテアーゼドメインにおける該プロテアーゼの活性を低下させる点変異が挙げられる。一部の特定の場合では、該点変異は亜鉛結合残基の変異または触媒性残基の変異である。好ましい点変異は、配列番号１とのアラインメントに基づくアミノ酸番号１３０５の置換である。

例示的な欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０個のＣ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８個のＣ末端アミノ酸の除去を含むか、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０個のＮ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０個のＮ末端アミノ酸を含まない。

本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２０〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２０〜７６のいずれか１つに対して少なくともａ％の配列同一性
を含む；または
（ｃ）１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個（もしくはそれより多い）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を持つ（これは、（ａ）もしくは（ｂ）の配列と比較して、別々の位置であってもよく、連続していてもよい）；および／または；
（ｄ）配列番号２０〜７６のいずれか１つと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（その結果、ｐ個のアミノ酸までに延ばす（ここでは、ｐ＞ｘである）アラインメントについては、ｐ−ｘ＋１個のそのようなウィンドウが存在する）は、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、そして、ｘ・ｙが整数でない場合は、これは最も近い整数になるように丸められる。ここで、該免疫原性ポリペプチドはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して変異を含み、該変異は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して該免疫原性ポリペプチドの毒性を低下させるものであり、また、該免疫原性ポリペプチドは、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［７］であり、デフォルトパラメーターが使用される（例えば、ギャップ解放ペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５とともに、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用される）。このアルゴリズムは、通常は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツール（ｎｅｅｄｌｅｔｏｏｌ）の中で実行される［８］。

これらのポリペプチドには、配列番号２０〜７６の他の無毒化改変体が含まれる。これには、対立遺伝子改変体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体などが含まれる。

ａの値は、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれを超えるものから選択され得る。

前述の免疫原性ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して、該Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して該免疫原性ポリペプチドの溶解度を増大させる欠失をさらに含むが、依然として、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させるものであってもよい。

溶解度を増大させる例示的な欠失としては、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的にすべての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方が挙げられる。該欠失が、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０個のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４個のＮ末端アミノ酸の除去である請求項８に記載の免疫原性ポリペプチド。

また、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドの免疫原性ポリペプチド断片であって、
（ａ）配列番号７７〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくともａ％の配列同一性
を含む；または
（ｃ）１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個（もしくはそれより多い）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を持つ（これは、（ａ）もしくは（ｂ）の配列と比較して、別々の位置であってもよく、連続していてもよい）；および／または；
（ｄ）配列番号７７〜９５のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（したがって、ｐ＞ｘであるｐ個のアミノ酸に拡張されるアラインメントでは、そのようなウィンドウはｐ−ｘ＋１個となる）が、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは：ｘが、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙが、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；ｘ・ｙが整数でない場合は、最も近い整数に丸めを行なう、
アミノ酸配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質よりも低い毒性を有し、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる免疫原性ポリペプチド断片を提供する。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムであり［７］、デフォルトパラメータが使用される（例えば、ギャップ解放ペナルティ＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５とともに、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用される）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツールにおいて簡便に実行される［８］。

これらのポリペプチドには、配列番号７７〜９５の他の無毒化改変体、例えば、対立遺伝子改変体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体などが含まれる。

該免疫原性ポリペプチド断片には、一部の特定の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２５個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３個のＮ末端アミノ酸が含まれていない。

該免疫原性ポリペプチド断片には、一部の特定の実施形態において（先の実施形態との組合せであってもよい）、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０個のＣ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７個のＣ末端アミノ酸が含まれていない。

さらに、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチド断片であって、該免疫原性ポリペプチドが
（ａ）配列番号２０〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２０〜７６のいずれか１つに対して少なくともａ％の配列同一性
を含む；または
（ｃ）１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個（もしくはそれより多い）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を持つ（これは、（ａ）もしくは（ｂ）の配列と比較して、別々の位置であってもよく、連続していてもよい）；および／または；
（ｄ）配列番号２０〜７６のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（したがって、ｐ＞ｘであるｐ個のアミノ酸に拡張されるアラインメントでは、そのようなウィンドウはｐ−ｘ＋１個となる）が、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは：ｘが、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙが、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；ｘ・ｙが整数でない場合は、最も近い整数に丸めを行なう、
アミノ酸配列を含み、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる免疫原性ポリペプチド断片を提供する。

これらのポリペプチドには、配列番号２０〜７６の他の改変体、例えば、対立遺伝子改変体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体などが含まれる。

例示的な断片は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０個のＣ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８個のＣ末端アミノ酸が含まれていないもの、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０個のＮ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０個のＮ末端アミノ酸が含まれていないものである。

また、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドの免疫原性ポリペプチド断片であって、
（ａ）配列番号７７〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくともａ％の配列同一性
を含む；または
（ｃ）１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個（もしくはそれより多い）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を持つ（これは、（ａ）もしくは（ｂ）の配列と比較して、別々の位置であってもよく、連続していてもよい）；および／または；
（ｄ）配列番号７７〜９５のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（したがって、ｐ＞ｘであるｐ個のアミノ酸に拡張されるアラインメントでは、そのようなウィンドウはｐ−ｘ＋１個となる）が、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは：ｘが、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙが、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；ｘ・ｙが整数でない場合は、最も近い整数に丸めを行なう、
アミノ酸配列を含み、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる免疫原性ポリペプチド断片を提供する。

これらのポリペプチドには、配列番号７７〜９５の他の改変体、例えば、対立遺伝子改変体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、変異体などが含まれる。

本発明は、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドの免疫原性ポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、該免疫原性ポリペプチド断片が、配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくともａ％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、また、該免疫原性ポリペプチド断片が、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させ、また、該免疫原性ポリペプチド断片に、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０個のＣ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７個のＣ末端アミノ酸が含まれていない免疫原性組成物を提供する。

一部の特定の実施形態の免疫原性組成物の免疫原性ポリペプチド断片には、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２５個のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３個のＮ末端アミノ酸が含まれていない。

免疫原性組成物は、一部の特定の実施形態において、１体積％〜１２体積％の代謝可能な油と０．２重量％〜２．５重量％の乳化剤を含み得るアジュバントであって、該代謝可能な油と該乳化剤とが、実質的に全部が１ミクロン未満の直径である油滴を持つ水中油型エマルジョンの形態で存在しているアジュバント；４体積％〜５体積％のスクアレン、および（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとソルビタントリオレエートとを含む約１％の乳化剤であって、該スクアレンと該乳化剤が、実質的に全部が１ミクロン未満の直径である油滴を持つ水中油型エマルジョンの形態で存在している、スクアレンと乳化剤；またはＭＦ５９（ＴＭ）をさらに含むものであってもよい。

前述の無毒化した免疫原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチド断片は、好ましくは、配列番号１〜１９の少なくとも１つのエピトープまたは免疫原性断片を保持しているものである。断片内のエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープは、経験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［９，１０］もしくは類似する方法を用いて）同定することができ、または、それらは、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｎｄｅｘ）［１１］、マトリックスに基づくアプローチ［１２］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１３］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１４、１５］、神経ネットワーク（ｎｅｕｒａｌｎｅｔｗｏｒｋ）［１６］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［１７，１８］、ＡＤＥＰＴ［１９］、Ｔｓｉｔｅｓ［２０］、親水性［２１］、抗原性指数［２２］、または参考文献２３〜２７に開示されている方法などを使用して）予測することもできる。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、それらに結合する抗原の一部分であり、「抗原性決定基」と称されることもあり得る。

前述の無毒化した免疫原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチド断片には、適当な組成物（これには、アジュバント（以下の「免疫原性組成物および医薬品」のセクションの中で列挙されるかまたは議論される任意のアジュバントが含まれるがこれに限定されない）、または該ポリペプチドにカップリングさせた適当な担体を含めてもよい）にて被験体に投与されると、それぞれ、単離された全長のポリペプチドである配列番号１〜１９（これらから免疫原性ポリペプチドが導かれる）を認識する抗体またはＴ細胞に媒介される免疫応答を誘導する免原性ポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。

前述の無毒化した免疫原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチド断片には、適当な組成物（これには、アジュバント（以下の「免疫原性組成物および医薬品」のセクションの中で列挙されるかまたは議論される任意のアジュバントが含まれるがこれに限定されない）、または該ポリペプチドにカップリングさせた適当な担体を含めてもよい）にて被験体に投与されると、それぞれ、単離された全長のポリペプチドである配列番号１〜１９（これらから免疫原性断片が導かれる）を認識する抗体またはＴ細胞に媒介される免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。

本発明の無毒化ポリペプチドは、配列番号１〜１９のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個など）のアミノ酸置換、例えば、保存的置換（すなわち、あるアミノ酸の、関連する側鎖を持つ別のアミノ酸での置換）を含むものであり得る。遺伝子にコードされたアミノ酸は、一般的に、４つのファミリー：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）電荷を持たない極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、場合によっては、まとめて芳香族アミノ酸として分類される。一般的に、これらのファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物学的活性に対して大きな影響はない。

無毒化ポリペプチドは、配列番号１〜１９のいずれか１つに関して１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個など）の単一アミノ酸欠失を含むものであり得る。同様に、ポリペプチドは、配列番号１〜１９のいずれか１つに関して１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個など）の挿入（例えば、各々、１、２、３、４または５アミノ酸）を含むものであり得る。

一般的に、本発明の無毒化ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド断片に、配列番号１〜１９のうちの１つの完全なものと同一でない配列が含まれている場合（例えば、それに対して＜１００％の配列同一性を有する配列表が含まれている場合、またはその断片が含まれている場合）、該ポリペプチドは、該配列番号の完全な配列からなるポリペプチドを認識する抗体（すなわち、前記配列番号１〜１９の１つまたは複数に結合する抗体）を誘発できるものであることが好ましい。そのような抗体は、それぞれ、配列番号１〜１９に特異的に結合し得るが、非ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質には、非特異的結合の参照標準としてのヒト血清アルブミンに対する該抗体の非特異的親和性よりも有意に高い親和性で結合しない。

本発明とともに使用されるポリペプチドは、様々な形態をとり得る（例えば、天然の形態、融合形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態、脂質化形態、非脂質化形態、リン酸化形態、非リン酸化形態、ミリストイル化形態、非ミリストイル化形態、単量体、多量体、粒子形態、変性形態など）。例えば、本発明のポリペプチドは、脂質化されたＮ末端のシステイン（例えば、配列番号１〜１９のＣｙｓ−２４）を持つものであり得る。

本発明とともに使用されるポリペプチドは、様々な手段（例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によって調製することができる。組み換えによって発現されるタンパク質が好ましい。

本発明とともに使用されるポリペプチドは、精製された形態または実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、自然界に存在しているポリペプチドを含まない）形態、特に、他のＥ．ｃｏｌｉもしくは宿主細胞のポリペプチドを含まない形態で提供されることが好ましい。本発明とともに使用されるポリペプチドには、一般的には、少なくとも約５０％純粋であり（重量で）、そして通常は、少なくとも約９０％純粋であり、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば、５％）が、他の発現されたポリペプチドで構成される。したがって、組成物中の抗原は、その分子を発現させるために用いられる生命体全体から分離される。

本発明とともに使用されるポリペプチドは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、さらに、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、およびＥＴＥＣＥ．ｃｏｌｉポリペプチドから選択され得る。

用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。ポリマーは、直鎖であっても、または分枝していてもよく、これには、修飾されたアミノ酸が含まれる場合があり、そして、これには、非アミノ酸が間に挟まれる場合もある。この用語にはまた、自然に修飾されたか、または介入（例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（例えば、標識成分との結合体化））によって修飾されたアミノ酸ポリマーも含まれる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸のアナログ（例えば、天然にはないアミノ酸などを含む）、ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖として存在することができ、また、会合した鎖として存在することもできる。

本発明により、配列−Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−を含むポリペプチドが提供される。ここでは、−Ｐ−は上記で定義されたアミノ酸配列であり、そして−Ｑ−は上記で定義された配列ではない。すなわち、本発明により、融合タンパク質が提供される。−Ｐ−のＮ末端コドンがＡＴＧではなく、このコドンがポリペプチドのＮ末端に存在しないとき、これは、Ｍｅｔではなく、そのコドンの標準的なアミノ酸として翻訳されるであろう。しかし、このコドンがポリペプチドのＮ末端にある場合には、これはＭｅｔとして翻訳されるであろう。−Ｑ−部分の例としては、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ_ｎ、ここでは、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い）、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明によってはまた、本発明のポリペプチドを含むオリゴマータンパク質も提供される。このオリゴマーは、二量体、三量体、四量体などであり得る。オリゴマーはホモオリゴマーでも、またヘテロオリゴマーでもあり得る。オリゴマーの中のポリペプチドは、共有結合されている場合も、また、非共有的に結合されている場合もある。

被験体において該ポリペプチドによって惹起される免疫応答と、全長のタンパク質によって惹起される免疫応答との比較は、当業者に利用可能な任意の手段を用いて行なわれ得る。以下の実施例で使用している簡単な方法の一例は、モデル被験体（マウスなど）の免疫化、次いで、致死量のＥ．ｃｏｌｉでの抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を伴うものである。適正な比較のため、当業者であれば、当然、同じアジュバント（フロイント完全アジュバントなど）を選択するであろう。そのような試験において、本発明の免疫原性ポリペプチド断片は、例えば、該ポリペプチドにより全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも７０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９７％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９８％、または全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９９％が提供される場合、被験体において実質的に類似する免疫応答を惹起させる（すなわち、該致死性の抗原投与に対して実質的に同じ防御をもたらす）ものである。

該免疫原性ポリペプチド断片と比較され得る（溶解度、毒性および惹起される免疫応答について）全長のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質は、任意の代表的なＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質、例えば、配列番号１〜１９であり得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質は、該免疫原性ポリペプチド断片が取得される対応する全長のタンパク質である。

本発明によってはまた、本発明のポリペプチドを生産するためのプロセスも提供される。これには、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養する工程が含まれる。その後、ポリペプチドは、例えば、培養上清から精製され得る。

本発明により、本発明のポリペプチドをコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞が提供される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の染色体にはＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のホモログが含まれる場合があり、また、そのようなホモログが含まれない場合もある。しかし、いずれの場合にも、本発明のポリペプチドはプラスミドから発現させることができる。プラスミドには、マーカーをコードする遺伝子などが含まれ得る。これらおよび適切なプラスミドについての他の詳細は以下に提供される。

本発明のポリペプチドの発現はＥ．ｃｏｌｉ株の中で行わせることができるが、本発明では、通常は、発現のために異種宿主が使用されるであろう。異種宿主は原核生物（例えば、細菌）である場合も、また真核生物である場合もある。適している宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明により、本発明のポリペプチドを生産させるためのプロセスが提供される。これには、化学的手段によってポリペプチドの少なくとも一部を合成する工程が含まれる。

上記タンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープ、および免疫原性断片のいずれかおよび全ては、以下を含む多数の形態のいずれか１つであり得るが、これらに限定されない：組み換え体、（そのようなタンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープ、および免疫原性断片と、それらの自然な状態において一緒に存在している物質から）単離されたかまたは実質的に精製された形態。

核酸
本発明によってはまた、本発明のポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドをコードする核酸が提供される。本発明によってはまた、本発明の１つもしくは複数のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。

本発明によってはまた、そのようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。配列間の同一性は、上記に記載されたようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されることが好ましい。そのような核酸には、同じアミノ酸をコードするために別のコドンを使用する核酸が含まれる。

本発明によってはまた、これらの核酸にハイブリダイズすることができる核酸が提供される。ハイブリダイゼーション反応は、様々な「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は広く知られており、当該分野で公開されている（例えば、参考文献２１１の７．５２頁）。（ストリンジェンシーを高めるための）関連する条件の例としては、以下が挙げられる：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣのバッファー濃度（ここでは、ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸バッファーである）、および他のバッファー系を使用するそれらの等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれより多い洗浄工程；１分、２分、または１５分の洗浄インキュベーション時間；および、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水である洗浄溶液。ハイブリダイゼーション技術とそれらの最適化は当該分野で周知である（例えば、参考文献２８、２９、２１１、２１３などを参照のこと）。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、低いストリンジェンシーの条件下で標的にハイブリダイズする。他の実施形態では、本発明の核酸は、中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件の例示的なセットは、５０℃と１０×ＳＳＣである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５℃と１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃と０．１×ＳＳＣである。

本発明には、（例えば、アンチセンスまたはプロ−ビングのための、あるいは、プライマーとしての使用のための）これらの配列に対して相補的な配列を含む核酸が含まれる。

本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応において（例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイ、または「遺伝子チップ」）、そして増幅反応において（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）、ならびに他の核酸技術において使用することができる。

本発明の核酸は様々な形態をとることができる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識された形態など）。本発明の核酸は、環状である場合も、または分枝されている場合もあるが、通常は直鎖であろう。特に明記されないか必要とされない場合は、核酸を利用する本発明の任意の実施形態では、二本鎖形態と、二本鎖形態を形成する２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれのいずれを利用することもできる。プライマーおよびプローブは、これらがアンチセンス核酸であるので、一般的には一本鎖である。

本発明の核酸は、精製された形態または実質的に精製された形態、すなわち、他の核酸を（特に、他のＥ．ｃｏｌｉまたは宿主細胞の核酸を）実質的に含まない形態（例えば、自然界に存在している核酸を実質的に含まない形態）で提供されることが好ましく、一般的には、少なくとも約５０％純粋（重量で）であり、通常は、少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ核酸であることが好ましい。

本発明の核酸は、多くの方法で、例えば、全体または一部が化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホルアミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用したより長い核酸の消化によって、より短い核酸もしくはヌクレオチドの（例えば、リガーゼもしくはポリメラーゼを使用する）連結によって、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーからなどで調製することができる。

本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、薄膜、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に付着させることができる。本発明の核酸は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識することができる。これは、核酸が検出技術において使用される場合、例えば、核酸がプライマーであるかまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。

用語「核酸」には、一般的な意味において、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態が含まれる。これには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログが含まれる。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。核酸にはまた、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ、例えば、修飾された骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＳ）もしくはホスホロチオエート）または修飾された塩基を含むものが含まれる。したがって、本発明には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え体である核酸、分枝された核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどが含まれる。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合には、これは５’キャップを持つ場合も、また５’キャップを持たない場合もある。

本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つまたは複数の細胞のタイプの形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部である場合もある。ベクターは、例えば、「クローニングベクター」（これは、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖、および複製のために設計される）、「発現ベクター」（これは、宿主細胞の中でのヌクレオチド配列の発現のために設計される）、「ウイルスベクター」（これは、組み換え体ウイルスもしくはウイルス様粒子の生産を生じるように設計される）、あるいは「シャトルベクター」（これには、ベクターの２種類以上のタイプの属性が含まれる）であり得る。好ましいベクターは上記のようなプラスミドである。「宿主細胞」には、個々の細胞または細胞培養物が含まれ、これらは、外因性核酸のレシピエントであり得るかまたは外因性核酸のレシピエントである。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、この子孫は、自然な、偶発的な、または意図的な変異および／または変化が原因で、最初の親細胞と（形態に関して、または全ＤＮＡ量に関して）必ずしも完全に同じではない場合がある。宿主細胞には、本発明の核酸でインビボまたはインビトロでトランスフェクションされたか、あるいは感染させられた細胞が含まれる。

核酸がＤＮＡである場合は、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」は、ＤＮＡにおいては「Ｔ」に置き換わるであろうことが理解されるであろう。同様に、核酸がＲＮＡである場合には、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」が、ＲＮＡにおいては「Ｕ」に置き換わるであろうことが理解されるであろう。

用語「相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」または「相補性」は、核酸に関して使用される場合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合をいう。したがって、Ｃの相補物はＧであり、Ｇの相補物はＣであり、Ａの相補物はＴ（またはＵ）であり、そしてＴ（またはＵ）の相補物はＡである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）に相補的なＩ（プリンであるイノシン）のような塩基を使用することも可能である。

本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドを生産するために；生物学的試料中の核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして、；核酸のさらなるコピーを生じさせるために；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生じさせるために；一本鎖のＤＮＡプライマーまたはプローブとして；あるいは、三本鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用することができる。

本発明により、本発明の核酸を生産するためのプロセスが提供される。ここでは、核酸は、一部が、または全体が、化学的手段を使用して合成される。

本発明により、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。

本発明による核酸の増幅は、定量的および／またはリアルタイムであり得る。

本発明の特定の実施形態については、核酸は、少なくとも７ヌクレオチドの長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチド、またはさらに長い）であることが好ましい。

本発明の特定の実施形態については、核酸は、最長５００ヌクレオチドの長さ（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチド、またはさらに短い）であることが好ましい。

本発明のプライマーおよびプローブ、ならびに、ハイブリダイゼーションに使用される他の核酸は、１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）であることが好ましい。

免疫原性組成物および医薬品
本発明のポリペプチドは、免疫原性組成物において有効成分（免疫原）として有用であり、そのような組成物はワクチンとして有用であり得る。本発明のワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、通常は予防的であろう。

免疫原性組成物は薬学的に許容されるであろう。これらには、通常は、抗原に加えて複数の成分が含まれるであろう。例えば、これらには、典型的には、１つまたは複数の薬学的担体（単数または複数）、賦形剤（単数または複数）、および／またはアジュバント（単数または複数）が含まれる。担体と賦形剤についての十分な議論は、参考文献２０８の中のものを利用することができる。ワクチンアジュバントについての十分な議論は、参考文献３０および３１の中のものを利用することができる。

組成物は、一般的には、水性の形態で哺乳動物に投与されるであろう。しかし、投与前は、この組成物は、非水性の形態であり得る。例えば、いくつかのワクチンは、水性形態で製造され、その後、充填され、分配され、そしてまた水性の形態で投与されるが、他のワクチンは、製造の間に凍結乾燥させられ、使用時に水性の形態になるように再構成される。したがって、本発明の組成物は、乾燥させられた、例えば、凍結乾燥させられた処方物であり得る。

組成物には、保存剤（例えば、チメロサールまたは２−フェノキシエタノール）が含まれ得る。しかし、ワクチンには、水銀性物質は実質的には含まれない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チメロサールが含まれない）ことが好ましい。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤が含まれていないワクチンが特に好ましい。

熱安定性を改善するために、組成物に、温度保護剤（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ）が含まれる場合がある。

張度を制御するためには、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、脱水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

組成物は、一般的には、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を持つであろう。さらに好ましくは、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にあるであろう。

組成物には、１種類または複数の種類のバッファーが含まれ得る。典型的なバッファーとしては、リン酸塩バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含むもの）、またはクエン酸塩バッファーが挙げられる。バッファーは、典型的には、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。

組成物のｐＨは、一般的には、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間であろう。

組成物は、好ましくは、滅菌されている。組成物は非発熱性であることが好ましい。例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な基準）が含まれ、好ましくは、１用量あたり＜０．１ＥＵが含まれる。組成物にはグルテンが含まれないことが好ましい。

組成物には、１回の免疫化のための材料が含まれる場合があり、また、複数回の免疫化のための材料が含まれる場合もある（すなわち、「複数用量の」キット）。複数用量の構成においては、保存剤が含められることが好ましい。複数用量の組成物に保存剤を含めることの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、物質を取り出すための無菌のアダプターを持つ容器の中に入れられる場合もある。

ヒト用のワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投薬体積で投与されるが、その半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が子供に投与される場合もある。

本発明の免疫原性組成物にはまた、１種類または複数の種類の免疫調節因子が含まれる場合もある。免疫調節因子の１つまたは複数に、１つまたは複数のアジュバントが含まれることが好ましい。アジュバントには、以下でさらに議論されるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれ得る。

本発明の組成物において使用することができるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．無機物を含む組成物
本発明においてアジュバントとしての使用に適している無機物を含む組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献３２の中で開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、これらの塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、無定形など）をとる。これらの塩への吸着が好ましい。無機物を含む組成物はまた、金属塩の粒子として処方される場合がある［３３］。

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は便宜上であるが、便宜のためだけに使用される。なぜなら、これは、存在する実際の化合物の正確な記載ではないからである（例えば、参考文献３０の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般的に使用されている、「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントの任意のものを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常は、少なくとも一部が結晶である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合には、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含まれる。これらは沈殿によって得ることができ、沈殿の間の反応条件と濃度が、塩の中のホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度に影響を及ぼす。

繊維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真で見られるようなもの）が、水酸化アルミニウムアジュバントについての典型である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ^＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。

リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的には、０．３〜１．２の間、好ましくは、０．８〜１．２の間、さらに好ましくは、０．９５±０．１のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、一般的には無定形であろう。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する、０．６ｍｇのＡｌ^３＋／ｍｌで含まれる無定形のヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的には粒子状であろう（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる平板様の形態）。いずれかの抗原吸着後の粒子についての典型的な直径は、０．５μｍ〜２０μｍの範囲（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ^＋＋＋あたり、０．７ｍｇ〜１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告されている。

リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度と逆の関係にあり、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件と反応物の濃度に応じて変わり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のホスフェートイオンの濃度を変えることによって（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはバッファー（例えば、ヒスチジンバッファー）を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化させられる。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的には、４．０〜７．０の間、より好ましくは、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有するであろう。

本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液には、バッファー（例えば、リン酸塩バッファー、またはヒスチジンバッファー、またはＴｒｉｓバッファー）が含まれ得るが、これは、必ずしもそうである必要はない。懸濁液は、滅菌されており、発熱物質が含まれないことが好ましい。懸濁液には、遊離の水性のホスフェートイオンが含まれる場合があり、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは、５ｍＭ〜１５ｍＭの間、そしてより好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する。懸濁液にはまた、塩化ナトリウムも含まれる場合がある。

本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多く存在し得、例えば、少なくとも２：１の重量比、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などで存在し得る。

患者に投与される組成物中でのＡｌ^＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとしての使用に適している油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９［参考文献３０の第１０章；参考文献３４もまた参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用して１ミクロン未満の粒子になるように処方された、５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５）が挙げられる。完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）もまた使用される場合がある。

様々な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらには、典型的には、少なくとも１種類の油、および少なくとも１種類の界面活性剤が含まれ、この油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）であり、かつ生体適合性である。エマルジョンの中の油滴は、一般的には、５μｍ未満の直径であり、理想的には１ミクロン未満の直径であり、これらの小さい大きさは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーを用いて得ることができる。２２０ｎｍ未満の大きさの液滴が好ましい。なぜなら、これらは、濾過滅菌を行うことができるからである。

エマルジョンには、油、例えば、動物（例えば、魚）を供給源とするものまたは植物を供給源とするものが含まれ得る。植物油についての供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６個〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油の中には自然界においては存在しないが、堅果油および種子油由来の適切な出発材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、鹸化、および他の手段についての手順は当該分野で周知である。ほとんどの魚には、容易に回収することができる代謝可能な油が含まれている。例えば、タラの肝油、サメの肝油、およびクジラの油（例えば、鯨ろう）が、本明細書中で使用することができる魚の油のいくつかの例である。多数の分枝鎖の油が、５個の炭素のイソプレン単位で生化学的に合成され、これは、一般的には、テルペノイドと呼ばれる。サメの肝油には、スクアレンとして知られている、分枝不飽和テルペノイドである、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン（これは、本明細書中では特に好ましい）が含まれる。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）もまた好ましい油である。スクアレンとスクアランを含む魚の油は、商業的な供給業者から容易に入手することができ、また、当該分野で公知の方法によって得ることもできる。他の好ましい油はトコフェロールである（下記を参照のこと）。油の混合物を使用することができる。

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、そしてより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを持つ。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない界面活性剤とともに使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎｓと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰り返し回数が様々であり得、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ならびに、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般的に知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンを含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））との組み合わせもまた適している。別の有用な組み合わせには、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステル、および／またはオクトキシノールが含まれる。

界面活性剤（重量％）の好ましい量は以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）０．０１％〜１％、特に、約０．１％；オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１％〜０．１％、特に、０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％〜２０％、好ましくは、０．１％〜１０％、および特に、０．１％〜１％、または約０．５％。

好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍの平均の液滴の大きさを持ち、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれ未満である。これらの液滴の大きさは、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって簡単に得ることができる。

本発明に有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５の１ミクロン未満のエマルジョン。このエマルジョンの組成は、体積で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量では、これらの比率は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献３８の第１０章および参考文献３９の第１２章にさらに詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として知られている［３５〜３７］。ＭＦ５９エマルジョンには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファーが含まれることが有利である。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０のエマルジョン。エマルジョンには、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれ得る。これにはまた、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含まれ得る。これらのエマルジョンは、２％〜１０％のスクアレン、２％〜１０％のトコフェロール、および０．３％〜３％のＴｗｅｅｎ８０が含まれ得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１である。なぜなら、これによってより安定なエマルジョンが提供されるからである。スクアレンとＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の体積比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解させて、２％の溶液とし、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、その後、この混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、１ミクロン未満の油滴を有し得、例えば、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有し得る。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）もまた含まれ得る。このエマルジョンには、リン酸塩バッファーが含まれる場合がある。

・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンには、これらの３種類の成分が、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）が含まれ得、そしてこれらの濃度には、抗原に由来するこれらの成分の任意の寄与が含まれるはずである。このエマルジョンにはまた、スクアレンも含まれる場合がある。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬも含まれ得る（下記を参照のこと）。水相には、リン酸塩バッファーが含まれ得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてはスレオニル−ＭＤＰとともに使用されている［４０］（０．０５％〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、「ＡＦ」アジュバントと同様に、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［４１］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または、２００ｎｍ未満の大きさを持つ油滴を少なくとも９０％（体積で）含む［４２］。このエマルジョンにはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシドの１つまたは複数が含まれ得る。そのようなエマルジョンは凍結乾燥させられ得る。

・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［４３］。アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン中でのこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃｐｏｌｙｏｌ））、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。

・０．５％〜５０％の油、０．１％〜１０％のリン脂質、および０．０５％〜５％の非イオン性界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献４４に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴の大きさが有利である。

・代謝不可能な油（例えば、軽鉱油（ｌｉｇｈｔｍｉｎｅｒａｌｏｉｌ））および少なくとも１種類の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０）の１ミクロン未満の水中油型エマルジョン。添加物，例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂質親和性結合体（例えば、参考文献４５に記載されている、グルクロン酸のカルボキシル基を介するデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって得られるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが含まれ得る。

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がへリックスミセルとして会合しているエマルジョン［４６］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［４７］。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［４７］。

いくつかの実施形態では、エマルジョンは、送達時に、即座に抗原と混合することができ、したがって、アジュバントと抗原は、使用時の最終的な処方の準備として、パッケージされたワクチンまたは分配されたワクチンの中に別々に保たれ得る。他の実施形態では、エマルジョンは、製造の際に抗原と混合され、したがって、組成物は、液体のアジュバント添加された形態でパッケージされる。抗原は、一般的には、ワクチンが２種類の液体を混合することによって最終的に調製されるように、水性の形態であろう。混合される２種類の液体の体積比は様々であり得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般的には、約１：１である。成分の濃度が特定のエマルジョンについての上記の記載の中にある場合には、これらの濃度は、典型的には、未希釈の組成物についての濃度であり、したがって、抗原溶液との混合後の濃度は下がるであろう。

組成物にトコフェロールが含まれる場合は、α、β、γ、δ、ε、またはζのいずれのトコフェロールも使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、様々な塩および／または異性体）をとることができる。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールのいずれを使用することもできる。トコフェロールは、高齢の患者（例えば、６０歳以上）に使用されるワクチンに含められることが有利である。なぜなら、ビタミンＥが、この患者のグループにおいて免疫応答に対してポジティブな影響を有することが報告されているからである［４８］。これらはまた、エマルジョンの安定化を助けることができる、抗酸化特性も持つ［４９］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協働することが明らかにされている。

Ｃ．サポニン処方物［参考文献３０の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、多種多様な植物種の樹皮、葉、茎、根、およびさらには花でも見られる、ステロールグリコシドとトリテルペノイドグリコシドの不均質なグループである。ＱｕｉｌｌａｉａｓａｐｏｎａｒｉａＭｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルヴェール（ｂｒｉｄｅｓｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐｒｏｏｔ））由来のサポニンはまた、商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに、脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を使用した特異的な精製された画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献５０に開示されている。サポニン処方物にはまた、コレステロールのようなステロールも含まれ得る［５１］。

サポニンとコレステロールの組み合わせを、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成させるために使用することができる［参考文献３０の第２３章］。ＩＳＣＯＭにはまた、典型的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含まれる。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭの中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つまたは複数が含まれる。ＩＳＣＯＭについては、参考文献５１〜５３の中でさらに記載されている。状況に応じて、ＩＳＣＯＭＳには、追加の界面活性剤は含まれない場合がある［５４］。

サポニン系のアジュバントの開発についての概要は、参考文献５５および５６の中で見ることができる。

Ｄ．ヴィロソームおよびウイルス様粒子
ヴィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においては、アジュバントとして使用することができる。これらの構造には、一般的には、状況に応じてリン脂質と組み合わされたか、またはリン脂質と一緒に処方された、ウイルスに由来する１種類または複数の種類のタンパク質が含まれる。これらは、一般的には、非病原性、非複製性であり、一般的には、天然のウイルスゲノムは全く含まれない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって生産することができ、また、完全なウイルスから単離することもできる。ヴィロソームまたはＶＬＰにおける使用に適しているこれらのウイルスタンパク質としては、以下に由来するタンパク質が挙げられる：インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、外被タンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）。ＶＬＰは、参考文献５７〜６２の中でさらに議論されている。ヴィロソームは、例えば、参考文献６３の中でさらに議論されている。

Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ−リボシル化毒素、ならびにそれらの無毒化誘導体が挙げられる。

ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄＡ）の、４、５、または６のアシル化された鎖を有するものの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」の形態は、参考文献６４に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍの膜を通して濾過滅菌するためには十分に小さい［６６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）が挙げられる［６５、６６］。

リピドＡ誘導体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献６７および６８に記載されている。

本発明においてアジュバントとしての使用に適している免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンに結合させられたホスフェートによって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡ、およびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。

ＣｐＧ’には、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチドの修飾／アナログが含まれ得、そしてこれは、二本鎖であってもまた一本鎖であってもよい。参考文献６９、７０、および７１には、可能なアナログでの置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献７２〜７７の中でさらに議論されている。

ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）に特異的であり得る［７８］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−ＡＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫応答を誘導することについて特異的である場合があり、また、ＣｐＧ−ＢＯＤＮのように、Ｂ細胞応答を誘導することについてより特異的である場合もある。ＣｐＧ−ＡＯＤＮとＣｐＧ−ＢＯＤＮは、参考文献７９〜８１で議論されている。ＣｐＧはＣｐＧ−ＡＯＤＮであることが好ましい。

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために利用しやすいように構築される。状況に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、「イムノマー」を形成させるために、それらの３’末端に結合させることができる。例えば、参考文献７８、および８２〜８４を参照のこと。

有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（ＣｏｌｅｙＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。別のものはＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を使用する代わりに、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができ［８５］、そしてこれらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ピリミジンが多く含まれる場合がある。例えば、これには、２つ以上の連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献８７に開示されているように、ＴＴＴＴ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。例えば、これには、２つ以上の連続するシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献８５に開示されているように、ＣＣＣＣ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。これらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激オリゴヌクレオチドには、典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドが含まれるであろう。これらには、１００個未満のヌクレオチドが含まれ得る。

免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として知られている［８６］。したがって、本発明とともに使用されるアジュバントには、以下の混合物が含まれ得る：（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、ジヌクレオチドを形成させるためにイノシンに連結させられたシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの間）、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（単数または複数）を含むオリゴペプチド（例えば、５アミノ酸〜２０アミノ酸の間）のようなポリカチオン性ポリマー。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号１１０）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号１１１）を含むペプチドであり得る。

細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体を、本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。無毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献８７に記載されており、そして非経口アジュバントとしての使用は参考文献８８に記載されている。毒素または類毒素は、好ましくは、ホロ毒素の形態であり、これには、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方が含まれる。Ａサブユニットには、無毒化変異が含まれることが好ましい。Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。好ましくは、アジュバントは、無毒化されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献８９〜９６の中で見ることができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［９７］。アミノ酸の置換についての数字での言及は、好ましくは、その中のアラインメントおよびアミノ酸ナンバリングの目的だけのためにその全体が引用により具体的に本明細書中に組み入れられる、参考文献９８に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。

Ｆ．ヒトの免疫調節因子
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているヒトの免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［９９］など）［１０１］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。

Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１０１］、または粘膜接着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［１０２］。

Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生体分解性であり、かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とともに形成させられるマイクロ粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、状況に応じて、負に荷電した表面を持つように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正に荷電した表面を持つように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。

Ｉ．リポソーム（参考文献３０の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適しているリポソーム処方物の例は、参考文献１０３〜１０５に記載されている。

Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルの処方物
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１０６］。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１０７］、ならびに少なくとも一種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせられたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［１０８］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

Ｋ．ホスファゼン
例えば、参考文献１０９および１１０に記載されているホスファゼン｛例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）｝を使用することができる。

Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［１１１、１１２］、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［１１３］、およびそれらのアナログ、ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献１１４〜１１８の中で見ることができる。

Ｎ．置換された尿素
アジュバントとして有用な置換された尿素としては、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」のような、参考文献１１９において定義されているような、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、あるいはそれらの塩が挙げられ：

例えば、以下である：

Ｏ．さらなるアジュバント
本発明とともに使用することができるさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられる：
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［１２０、１２１］。

・参考文献１２２の中で開示されているもののような、チオセミカルバゾン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１２２の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。

・参考文献１２３に開示されているもののような、トリプタントリン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１２３の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。

・以下のようなヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１２４〜１２６に開示されている化合物ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１２７］。

・以下を含む、参考文献１２８に開示されている化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１２９、１３０］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１３１］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［１３２］。

・ホスフェートを含む非環式骨格に対して連結させられた脂質を含む化合物（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４）［１３３、１３４］：
・ポリオキシドニウムポリマー［１３５、１３６］または他のＮ−酸化ポリエチレンピペラジン誘導体。

・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１３７］。

・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１３８］あるいはその薬学的に許容される塩または誘導体、例えば、以下の式を持つもの：

式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖である、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群より選択される。例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなど。

・ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１３９〜１４６］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。

・γイヌリン［１４７］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。

アジュバントの組み合わせ
本発明にはまた、上記で同定されたアジュバントの１つまたは複数の態様の組み合わせが含まれる場合もある。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１４８］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１４９］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（状況に応じて＋ステロール）［１５０］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［１５１］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０（商標）、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（１ミクロン未満のエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるようにボルテックスされるかのいずれか）；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種類または複数の種類の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種類または複数の種類の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。

免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献３０の第７章に開示されている。

水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、抗原は、一般的には、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムが別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントとの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとａｌｕｍ、またはレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とａｌｕｍの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを使用することができる。

本発明の組成物は、細胞に媒介される免疫応答と、体液性の免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫応答は、長期間持続する（例えば、中和）抗体、および肺炎球菌に曝されると直ちに反応することができる細胞に媒介される免疫を誘導するであろうことが好ましい。

Ｔ細胞の２つのタイプ（ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞）は、一般的には、細胞媒介性の免疫と体液性免疫を開始および／または増大させるために必要であると考えられている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般的には、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識するか、またはそれと相互作用することができる。

ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般的には、Ｔへルパー細胞と呼ばれている。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与している他の細胞を活性化させることができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、さらに、それらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なる、以下のような２種類の機能的に異なるサブセットに分類することができる：ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型。

活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬの生産の増大を含む）を増強し、したがって、細胞内感染に応答することにおいて特に有用である。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βの１つまたは複数を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させることによって、局所炎症反応を生じ得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２でＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、免疫応答を拡大させるようにも作用し得る。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。

活性化されたＴＨ２細胞は、抗体の生産を増強させ、したがって、細胞外感染に応答することにおいて有用である。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答によっては、さらなる防御のための、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産が生じ得る。

増強された免疫応答には、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つまたは複数が含まれ得る。

ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−β）の１つまたは複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増大、あるいはＩｇＧ２ａの生産の増大の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、増強されたＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２ａの生産の増大が含まれるであろう。

ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ２ａの生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ヴィロソーム、およびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）が、本発明での使用に好ましいＴＨ１アジュバントである。

ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）の１つまたは複数の増加、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産の増大の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１の生産の増大が含まれるであろう。

ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機物を含む組成物、オイルエマルジョン、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられ得る。無機物を含む組成物（例えば、アルミニウム塩）が、本発明での使用に好ましいＴＨ２アジュバントである。

本発明に、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物が含まれることが好ましい。好ましくは、そのような組成物は、増強されたＴＨ１応答と増強されたＴＨ２応答を誘発する、すなわち、アジュバントを用いない免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産とＩｇＧ２ａの生産の両方の増大を誘発する。なおより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントでの免疫化と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバントだけでの免疫化、またはＴＨ２アジュバントだけでの免疫化と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大を誘発する。

免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答により、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答の一方または両方が提供される。

増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答により、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答の一方または両方が提供される。好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答には、ＩｇＡの生産の増大が含まれる。

Ｅ．ｃｏｌｉは、多数の解剖学的部位で疾患を引き起こす可能性があり［４］、したがって、本発明の組成物は、様々な形態で調製され得る。例えば、組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射前の、液体媒体中の溶液または懸濁液に適している固体形態（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）もまた、調製することができる。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム剤、または散剤として調製される場合もある。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセル剤として、噴霧剤として、あるいはシロップ剤として（状況に応じて、香味づけされたもの）調製される場合もある。組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末を使用する吸入剤または噴霧剤として、調製される場合もある。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製される場合もある。組成物は、鼻腔内投与、耳投与、または眼投与のために、例えば、滴剤として調製され得る。組成物は、組み合わせられた組成物が患者への投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。そのようなキットには、液体形態の中にある１つまたは複数の抗原と、１つまたは複数の凍結乾燥させられた抗原とが含まれる場合がある。

組成物が、使用前に即座に調製され（例えば、１種類の成分が凍結乾燥させられた形態で存在する場合）、そしてキットとして提示される場合には、このキットには２つのバイアルが含まれるか、または、キットには、１つの既に充填された注射器と１つのバイアルが含まれ、ここで、注射器の内容物は、注射前にバイアルの内容物を再度活性化させるために使用される場合もある。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物には、免疫学的有効量の抗原（単数または複数）、ならびに、任意の他の成分が必要に応じて含まれる。「免疫学的有効量」によっては、単回用量または一連のものの一部としてのいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況についての処置を行う医師による評価、および他の関連する要因に応じて様々である。この量は、日常的に行われている試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に入るであろうと予想される。

処置方法、およびワクチンの投与
本発明によってはまた、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を惹起させるための方法が提供される。免疫応答は、好ましくは防御的であり、抗体および／または細胞媒介性の免疫が含まれることが好ましい。この方法によっては、追加免疫応答（ｂｏｏｓｔｅｒｒｅｓｐｏｎｓｅ）が惹起され得る。

本発明によってはまた、医薬品として使用される、例えば、哺乳動物において免疫応答を惹起させるために使用される、本発明のポリペプチドが提供される。

本発明によってはまた、哺乳動物において免疫応答を惹起させるための医薬品の製造における本発明のポリペプチドの使用も提供される。

本発明によってはまた、本発明の免疫原性組成物が予め充填されている送達デバイスも提供される。

これらの使用および方法によって哺乳動物の中で免疫応答を惹起させることにより、哺乳動物を、ＥｘＰＥＣ株および非ＥｘＰＥＣ株を含むＥ．ｃｏｌｉ感染に対して防御することができる。本発明は、腸内病原型（例えば、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型）を含む病原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する広範囲に及ぶ防御を提供するために特に有用である。したがって、哺乳動物は、以下を含むがこれらに限定されない疾患に対して防御され得る：腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿管感染症（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に、新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（乳児下痢、旅行者下痢（ｔｒａｖｅｌｌｅｒｓ’ ｄｉａｒｒｈｅａ）、急性下痢、持続性下痢など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿症など。

配列番号２１、３０、３５、４０、４９、５４、５９、６８および７３、ならびにそれらの他の無毒化改変体は、ＥＡＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、下痢（急性および慢性の両方）の予防に特に有用である。

配列番号２２、２８、３６、４１、４７、５５、５６、６０、６６、７４、および７５ならびにこれらの他の無毒化改変体は、ＵＰＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、ＵＴＩ（腎盂腎炎、膀胱炎（急性と再発性の両方）、腹膜炎、カテーテルに関連するＵＴＩ、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｓｉｓ）、細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）が含まれるが、これらに限定されない）の予防に特に有用である。

配列番号２３、４２、および６１ならびにこれらの他の無毒化改変体は、ＥＩＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児の）の予防に特に有用である。

配列番号２４、２７、２９、４３、４６、４８、６２、６５、および６７ならびにこれらの他の無毒化改変体は、ＥＴＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（例えば、旅行者下痢および乳児下痢）の予防に特に有用である。

配列番号２５、２６、３３、３４、４５、５３、６３、６４、および７２ならびにこれらの他の無毒化改変体は、ＥＡＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（急性と慢性の両方）の予防に特に有用である。

配列番号７９、８５、９３および９４、ならびにそれらの他の無毒化改変体は、ＵＰＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、以下を含むが、これらに限定されないＵＴＩの予防に特に有用である：腎盂腎炎，膀胱炎（急性および再発の両方）、腹膜炎、カテーテルに関連するＵＴＩ、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｓｉｓ）、および細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）。

配列番号８０およびその他の無毒化改変体は、ＥＩＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児において）の予防に、特に有用である。

配列番号８１、８４および８６、ならびにそれらの他の無毒化改変体は、ＥＴＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、下痢（旅行者下痢、および乳児下痢を含む）の予防に、特に有用である。

配列番号８２、８３および９１、ならびにそれらの他の無毒化改変体は、ＥＰＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、下痢（乳児下痢を含む）の予防に、特に有用である。

配列番号２１、３０、３５、４０、４９、５４、５９、６８、および７３ならびにこれらの他の改変体は、ＥＡＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（急性と慢性の両方）の予防に特に有用である。

配列番号２２、２８、３６、４１、４７、５５、５６、６０、６６、７４、および７５ならびにこれらの他の改変体は、ＵＰＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、ＵＴＩ（腎盂腎炎、膀胱炎（急性と再発性の両方）、腹膜炎、カテーテルに関連するＵＴＩ、前立腺炎、細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）が含まれるが、これらに限定されない）の予防に特に有用である。

配列番号２３、４２、および６１ならびにこれらの他の改変体は、ＥＩＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児の）の予防に特に有用である。

配列番号２４、２７、２９、４３、４６、４８、６２、６５、および６７ならびにこれらの他の改変体は、ＥＴＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（例えば、旅行者下痢および乳児下痢）の予防に特に有用である。

配列番号２５、２６、３３、３４、４５、５３、６３、６４、および７２ならびにこれらの他の改変体は、ＥＡＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（急性と慢性の両方）の予防に特に有用である。

配列番号７９、８５、９３、および９４ならびにこれらの他のものは、ＵＰＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、ＵＴＩ（腎盂腎炎、膀胱炎（急性と再発性の両方）、腹膜炎、カテーテルに関連するＵＴＩ、前立腺炎、細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）が含まれるが、これらに限定されない）の予防に特に有用である。

配列番号８０ならびにこの他の改変体は、ＥＩＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児の）の予防に特に有用である。

配列番号８１、８４、および８６ならびにこれらの他の改変体は、ＥＴＥＣ病原型に対する免疫化、したがって、下痢（例えば、旅行者下痢および乳児下痢）の予防に特に有用である。

配列番号８２、８３および９１、ならびにそれらの他の改変体は、ＥＰＥＣ病原型に対して免疫化するのに、したがって、下痢（乳児下痢を含む）の予防に、特に有用である。

哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコ、またはイヌでもあり得る。なぜなら、Ｅ．ｃｏｌｉ病はまた、これらの種においても問題であるからである。［４］。ワクチンが予防的用途のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、子供（例えば、幼児または乳児）であるか、あるいは十代の若者であり、ワクチンが治療的用途のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。子供用に意図されるワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与され得る。

治療的処置の効力をチェックする１つの方法には、本発明の組成物の投与後にＥ．ｃｏｌｉ感染をモニタリングすることが含まれる。予防的処置の効力をチェックする１つの方法には、組成物の投与後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的に（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの生産レベルをモニタリングする）および／または粘膜的に（例えば、ＩｇＡの生産レベルをモニタリングする）モニタリングすることが含まれる。典型的には、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後、抗原投与前に決定されるが、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後、抗原投与後に決定される。

本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために、組み換えによってタンパク質を発現させることである。タンパク質と患者の試料との間でのポジティブな反応は、その患者が、問われているタンパク質に対する免疫応答を確立させていることを示す。この方法はまた、免疫優勢抗原および／または抗原内のエピトープを同定するために使用され得る。

ワクチン組成物の効力はまた、ワクチン組成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ感染の動物モデル（例えば、モルモットまたはマウス）に抗原投与することによって、インビボで決定することもできる。ＥｘＰＥＣおよび致死性敗血症のマウスモデルが、参考文献１５２に記載されている。コットンラットモデルが、参考文献１５３に開示されている。

本発明の組成物は、一般的には、患者に直接投与されるであろう。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙腔に対して）によって、または経直腸、経口（例えば、錠剤、噴霧剤）、経膣、局所、経皮、もしくは鼻腔内、眼、経耳、肺もしくは他の粘膜投与によって行われ得る。また、該新規な直接送達形態として、食品における本明細書中に開示したポリペプチドのトランスジェニック発現（例えば、イモにおけるトランスジェニック発現）も挙げられ得る。

本発明は、全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発するために使用され得る。

好ましくは、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１免疫応答および／またはＴＨ２免疫応答において反映される。好ましくは、増強された免疫応答には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生産の増大が含まれる。

投薬は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによって行うことができる。複数回用量は、初回免疫化スケジュールにおいて、および／または追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量が、同じ経路または異なる経路（例えば、非経口での初回と粘膜からの追加、粘膜からの初回と非経口での追加など）によって投与され得る。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間の間隔をあけて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与されるであろう。

本発明のワクチンは、子供および成人の両方を処置するために使用され得る。したがって、ヒト患者は、１歳未満、１歳〜５歳、５歳〜１５歳、１５歳〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンが投与される好ましい患者は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若い（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、兵役に従事している者および軍人、妊婦、慢性疾患患者、または免疫不全患者である。ワクチンは、これらのグループについてのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に使用され得る。

本発明のワクチンは、外科手術が予想される患者、または他の入院患者に特に有用である。これらはまた、カテーテルが挿入されるであろう患者にも有用である。これらはまた、思春期の女性（例えば、１１歳〜１８歳）および慢性尿管感染の患者においても有用である。

本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ医療的診察、または医療の専門家もしくは予防接種センターを訪れた際に）、例えば、麻疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、結合型髄膜炎菌ワクチン（例えば、４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、呼吸器合胞体ウイルスワクチンなどと実質的に同時に、患者に投与され得る。

核酸での免疫化
上記に記載された免疫原性組成物には、ポリペプチド抗原が含まれる。しかし、全ての場合において、ポリペプチド抗原は、そのようなポリペプチドをコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）に置き換えることができ、核酸での免疫化に基づく組成物、方法、および使用が提供される。核酸での免疫化は、現在では、発展済みの分野である（例えば、参考文献１５４〜１６１などを参照のこと）。

免疫原をコードする核酸は、患者への送達後にインビボで発現され、その後、発現された免疫原は、免疫系を刺激する。活性成分は、典型的には、以下を含む核酸ベクターの形態をとるであろう：（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能であるように連結させられた免疫原をコードする配列；および状況に応じて、（ｉｉｉ）選択マーカー。好ましいベクターにはさらに以下が含まれ得る：（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）に対して下流に、かつ作動可能であるように連結させられた転写終結点。一般的には、（ｉ）と（ｖ）は真核生物のものであろう。そして（ｉｉｉ）と（ｉｖ）は原核生物のものであろう。

好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモーター）である。ベクターにはまた、プロモーターに加えて転写調節配列（例えば、エンハンサー）も含まれ得る。そしてこれは、プロモーターと機能的であるように相互作用する。好ましいベクターには、最初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターが含まれ、より好ましいベクターには、ＣＭＶイントロンＡも含まれる。プロモーターは、免疫原をコードする下流の配列に作動可能であるように連結される。その結果、免疫原をコードする配列の発現は、プロモーターの制御下になる。

マーカーが使用される場合は、これは、好ましくは、微生物宿主の中（例えば、原核生物の中、細菌の中、酵母の中）で機能するものであることが好ましい。マーカーは、好ましくは、原核生物の選択マーカー（例えば、原核生物のプロモーターの制御下で転写されるもの）である。便宜上、典型的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。

本発明のベクターは、好ましくは、自立複製するエピソーム性または染色体外ベクター（例えば、プラスミド）である。

本発明のベクターには、好ましくは、複製起点が含まれる。複製起点は、原核生物の中では活性であり、真核生物の中では活性ではないことが好ましい。

したがって、好ましいベクターには、ベクターを選択するための原核生物のマーカー、原核生物の複製起点、しかし、免疫原をコードする配列の転写を駆動するための真核生物のプロモーターが含まれる。したがって、ベクターは、（ａ）原核生物宿主の中では、ポリペプチドを発現させることなく増幅され、そして選択されるであろうが、（ｂ）真核生物宿主の中では、増幅されることなく発現されるであろう。この配置は、核酸免疫化ベクターについては理想的である。

本発明のベクターには、コード配列の下流に、真核生物の転写終結配列が含まれ得る。これは、転写レベルを増強することができる。コード配列がそれ自体のポリアデニル化配列を持たない場合には、本発明のベクターには、好ましくは、ポリアデニル化配列が含まれる。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化配列である。

本発明のベクターには、マルチクローニング部位が含まれ得る。

免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターには、第２の真核生物のコード配列が含まれ得る。ベクターにはまた、免疫原と同じ転写物からの第２の真核生物ポリペプチドの翻訳を可能にするために、上記第２の配列の上流にあるＩＲＥＳも含まれ得る。あるいは、免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳの下流にある場合もある。

本発明のベクターには、メチル化されていないＣｐＧモチーフ（例えば、２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンが隣接している、グアノシンと先行するシトシンを共通して持つメチル化されていないＤＮＡ配列）が含まれ得る。それらのメチル化されていない形態の中では、これらのＤＮＡモチーフは、いくつかのタイプの免疫細胞の強力な刺激因子であることが明らかにされている。

ベクターは、標的化された方法で送達され得る。受容体に媒介されるＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献１６２〜１６７に記載されている。核酸を含む治療用組成物は、遺伝子治療プロトコールにおいては、局所投与について約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、そして約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールの際に使用することができる。最終的な効力のために必要な投与量に影響を及ぼすであろう、作用方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強するかまたは阻害するための）、ならびに形質転換および発現の効率のような要因が考慮される。より広い組織領域にわたるより高い発現が所望される場合には、ポジティブな治療結果が得られるように、連続投与プロトコールで再度投与されるより多量または同じ量のベクター、あるいは異なる隣接組織部分または近い組織部分に対する数回の投与が必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験において日常的に行われる実験によって、最適な治療結果のための特異的な範囲が決定されるであろう。

ベクターは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルス起源のものであっても、また、ウイルス以外の起源のものであってもよい（一般的には、参考文献１６８〜１７１を参照のこと）。

所望される核酸の送達および所望される細胞の中での発現のためのウイルスをベースとするベクターは当該分野で周知である。例示的なウイルスをベースとする媒体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組み換え体レトロウイルス（例えば、参考文献１７２〜１８２）、アルファウイルスをベースとするベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−６７；ＡＴＣＣＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−３７３；ＡＴＣＣＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−９２３；ＡＴＣＣＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも使用され得る）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、改変ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄｖａｃｃｉｎｉａＡｎｋａｒａ）など）、アデノウイルスベクター、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１８３〜１８８を参照のこと）。死滅させられたアデノウイルスに連結させられたＤＮＡの投与［１８９］もまた使用することができる。

以下を含むが、これらに限定されない、非ウイルス送達媒体および方法もまた使用することができる：死滅させられたアデノウイルスだけに連結させられたか連結させられていないポリカチオン性縮合ＤＮＡ［例えば、１８９］、リガンドに連結させられたＤＮＡ［１９０］、真核生物の細胞送達媒体細胞［例えば、参考文献１９１〜１９５］、および核の電荷の中和または細胞膜との融合。裸のＤＮＡもまた、使用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、参考文献１９６および１９７に記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソーム（例えば、免疫リポソーム）は、参考文献１９８〜２０２に記載されている。さらに別のアプローチは、参考文献２０３および２０４に記載されている。

使用に適しているさらなる非ウイルス送達としては、参考文献２０４に記載されているアプローチのような、機械的送達システムが挙げられる。さらに、コード配列とそのような発現産物は、光重合させられたヒドロゲル材料の沈着、または電離放射線の使用によって送達することができる［例えば、参考文献２０５および２０６］。コード配列の送達に使用することができる遺伝子送達の他の従来の方法としては、例えば、携帯型遺伝子導入粒子銃（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｐａｒｔｉｃｌｅｇｕｎ）の使用［２０７］または導入された遺伝子を活性化させるための電離放射線の使用［２０５および２０６］が挙げられる。

ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）｝マイクロ粒子を使用するＤＮＡの送達が、特に好ましい方法であり、例えば、状況に応じて、負に帯電した表面を持つように処理された（例えば、ＳＤＳで処理される）または正に帯電した表面を持つように処理された（例えば、ＣＴＡＢのような陽イオン性界面活性剤で処理される）、マイクロ粒子への吸着によって行われる。

一般論
本発明の実施では、他の場所に明記されない限りは、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法が使用されるであろう。そのような技術は、文献の中で十分に説明されている。例えば、参考文献２０８〜２１５などを参照のこと。

用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」が含まれる。例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなる場合があり、また、付加的な他のものを含む場合もある（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

「ＧＩ」ナンバリングが本明細書中で使用される。ＧＩ番号、すなわち「ＧｅｎＩｎｆｏＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がそのデータベースに加えられた時に、ＮＣＢＩによって処理されたそれぞれの配列の記録に対して連続して割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号には、その配列記録の登録番号との類似性はない。配列がアップデートされると（例えば、修正のために、またはさらなる注釈もしくは情報を加えるために）、これには新しいＧＩ番号が与えられる。したがって、与えられたＧＩ番号と組み合わせられた配列は変わることはない。

２つのアミノ酸配列間での配列同一性の割合（％）の言及は、アラインメントされた場合に、２つの配列を比較して同じであるアミノ酸の割合（％）を意味する。このアラインメントと相同性または配列同一性の割合（％）は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２１６のセクション７．７．１８の中で記載されているもの）を使用して決定することができる。好ましいアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、１２のギャップ解放ペナルティー、および２のギャップ伸長ペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いるアフィンギャップ検索を使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２１７に開示されている。

当業者は、「単離された」が、その天然の状態から「人の手によって」変化させられたことを意味する。すなわち、それが自然界に存在している場合には、これは変化しているか、もしくはそのもともとの環境から取り出されているか、またはそれらの両方である。例えば、生存している生命体の中に自然界において存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような生存している生命体の中にある場合には「単離され」ていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その自然な状態において一緒に存在している物質から分離されている場合には、この用語が本開示において使用される限りは、「単離され」ている。さらに、形質転換、遺伝子操作によって、または任意の他の組み換え方法によって生命体に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような形質転換、遺伝子操作、または他の組み換え方法によって、自然界に存在している生命体と別の方法では区別することができない生命体を生じる場合を除いて、それがなおも上記生命体の中に存在する場合でも、「単離された」と理解される。この生命体は、生存している場合も、また生存していない場合もある。

図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。図２は、配列の対の間でのアミノ酸同一性を示す。図３は、ＤＴＴの非存在下で見ることができる高ＭＷのバンドを持つ、精製されたタンパク質のゲル分析を示す。図４は、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株と非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株の、抗ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）血清を使用したウェスタンブロットを示す。パネル（Ａ）は、全細胞溶解物のウェスタンブロットである。パネル（Ｂ）は、培養物に由来する上清のウェスタンブロットである。パネル（Ａ）および（Ｂ）のそれぞれのレーンは、左から右に、以下のとおりである：レーンＭ−パネル（Ａ）の左側に沿って示した各々のマーカータンパク質のｋＤａでの分子量とともに、マーカータンパク質；１−ＩＨＥ３０３４；２−ＣＦＴ０７３；３−５３６；４−ＢＬ２１；５−ＭＧ１６５５；６−Ｗ３１１０；７−ＮＩＳＳＬＥ１９１７；８−ＩＨＥ３０３４ΔＡｃｆＤ。分析から観察されるように、病原性株（ＩＨＥ３０３４、レーン１；５３６、レーン３）は、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）を発現し、分泌するが、非病原性株（ＭＧ１６５５、レーン５；Ｗ３１１０、レーン６；Ｎｉｓｓｌｅ１９１７、レーン７）は、タンパク質を発現するが、その分泌が欠失している。株ＣＦＴ０７３（レーン２）およびＩＨＥ３０３４ΔＡｃｆＤ（レーン８）は、ネガティブ対照として使用される。なぜなら、これらはＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）遺伝子を持たないからである。ＢＬ２１株（レーン４）は、ポジティブ対照として使用される研究室株である。なぜなら、これは、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）を発現し、分泌するからである。図５は、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質とこのタンパク質の様々な断片の溶解度の比較を示す。パネル（Ａ）は、上清（それぞれのタンパク質または断片について右側のレーン）に対してペレット（それぞれのタンパク質または断片について左側のレーン）を比較する、３７℃での試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４％〜１２％のＭＯＰＳバッファー）である。レーンは、左から右に、以下のとおりである：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、挿入物を含まないｐＥＴ発現ベクターで形質転換された対照の細菌、３５２６（ヒスタグ、リーダーペプチドが除去されている）の細菌での発現、Ｌ３５２６（ヒスタグ、全長）の細菌での発現、Ｌ３５２６−２ｓｔｏｐ（Ｈｉｓタグの前に終止コドンを有する全長）の細菌での発現、ΔＧ３５２６（ヒスタグ、可堯性グリシン−セリンリンカーまでのＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去）の細菌での発現、およびΔＰ３５２６（ヒスタグ＋プロリンリッチ領域全体のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端領域の除去）の細菌での発現。パネル（Ｂ）は、パネル（Ａ）のレーンと同じ順序にしたがう、２５℃での試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４％〜１２％のＭＯＰＳバッファー）である。図６は、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質およびこのタンパク質の様々な断片の発現と精製の比較を示す。パネル（Ａ）は、様々な精製段階に由来する画分（ｆａｃｔｉｏｎ）を比較している、２５℃で培養された３５２６（ヒスタグ、リーダーペプチドが除去されている）を発現する細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳバッファー）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからのフロースルー；５００ｍＭのイミダゾールバッファーを用いたＥ１、Ｅ２、およびＥ３の３つの溶離。パネル（Ｂ）は、様々な精製段階に由来する画分を比較している、２５℃で培養されたΔＧ３５２６（ヒスタグ＋可堯性グリシン−セリンリンカーまでのＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去）を発現している細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳバッファー）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからのフロースルー；５００ｍＭのイミダゾールバッファーを用いたＥ１、Ｅ２、およびＥ３の３つの溶離。パネル（Ｃ）は、様々な精製段階に由来する画分を比較している、２５℃で培養されたΔＰ３５２６（ヒスタグ、プロリンリッチ領域全体のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去）を発現している細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳバッファー）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからのフロースルー、５００ｍＭのイミダゾールバッファーを用いた、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の３つの溶離。図７は、配列のさらに別の対の間でのアミノ酸同一性を示す。１６種類の腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）が、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）遺伝子を持つとは見出されなかった（示されていない）。（示される場合）配列は、左から右に、または上から下に、以下のとおりである：１０種類の非病原性株または片利共生的株（１：片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株、２：ＤＨ１０Ｂ株、３：ＭＧ１６５５株、４：Ｗ３１１０株（配列番号１４）；５：ＨＳ株（配列番号１３）；９：別の片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株；および１０：なお別の片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株）；３種類のＮＭＥＣ株（１：ＮＭＥＣ株ＲＳ２１８；２：ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４（配列番号２）；および３：ＮＭＥＣ株Ｓ８８（配列番号１４１））；１種類のＡＰＥＣ株（１：ＡＰＥＣＯ１株）；６種類のＵＰＥＣ株（２：ＵＰＥＣ株５３６（配列番号４）；３：ＵＴＩ８９；４：ＵＰＥＣ株Ｆ１１（配列番号１０）；５：ＵＰＥＣ株ＩＡＩ３９（配列番号１３３）；および６：ＵＰＥＣ株ＵＭＮ０２６（配列番号１３７））；３種類のＥＡＥＣ株（１：ＥＡＥＣ株１０１−１（配列番号３）；２：ＥＡＥＣ株Ｏ４２（配列番号１２；および３：ＥＡＥＣ株５５９８９（配列番号１２９））；１種類のＥＩＥＣ株（１：ＥＩＥＣ株５３６３８（配列番号５））；４種類のＥＰＥＣ株（２：ＥＰＥＣ株Ｅ２２（配列番号８））；３：ＥＰＥＣ株Ｅ２３４８／６９（配列番号１６）；および４：ＥＰＥＣ株Ｅ１１００１９（配列番号７））；３種類のＥＴＥＣ株（１：ＥＴＥＣ株Ｂ７Ａ（配列番号６）；２：ＥＴＥＣ株Ｅ２４３７７Ａ（配列番号９）；および３：ＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７（配列番号１１））；ならびに１種類の抗生物質耐性株（１：抗生物質耐性株ＳＥＣＥＣ（配列番号１５））。図８は、左から右に：脂質化モチーフ；プロリンリッチ領域、ＷｘｘｘＥモチーフ、亜鉛結合モチーフ、およびＲＧＤドメインを含む、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）において同定された配列モチーフを示す。図９は、様々な亜鉛メタロプロテアーゼのファミリー間の関係を示す。ジンシンモチーフはＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）にみられるモチーフであるため、ジンシンを灰色の囲みで強調している（図８参照）。図１０は、ｏｒｆ３５２６Ｃ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％の勾配，Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）を示す。レーンの上部の表示は以下のとおり：（１）全細胞溶解物−ＩＰＴＧなし，２５℃で６時間；（２）全細胞溶解物−１ｍＭＩＰＴＧ，２５℃で３時間；（３）全細胞溶解物−１ｍＭＩＰＴＧ，２５℃で６時間；（Ｍ）マーカー（サイズは、単位：ｋＤａで、ゲルの左側に沿って表示している）；（４）超音波処理後の可溶性画分−１ｍＭＩＰＴＧ，２５℃で３時間；および（５）超音波処理後の可溶性画分−１ｍＭＩＰＴＧ，２５℃で６時間である。

本発明の実施のための態様
参考文献５に開示されている抗原の１つは、ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４由来のアクセサリー定着因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体（ｏｒｆ３５２６）（本明細書中ではアミノ酸配列番号２）と注釈が付けられている。このタンパク質は、発現させられ、精製されており、これは、敗血症の動物モデルにおいてＥｘＰＥＣ株に対する防御を付与する。

様々な他のＥ．ｃｏｌｉ株の中のオルトログについての複数の配列が得られた。ＩＨＥ３０３４の中で見られるアミノ酸配列はまた、ＡＰＥＣＯ１株およびＵＴＩ８９株の中でも見られたが、１４種類のさらに別の配列も見られた（配列番号３〜配列番号１６）。図１は、配列番号２〜配列番号１６のアラインメントを示す。３０個のＮ末端アミノ酸は１００％保存されており、これらには、天然のリポタンパク質のシグナルペプチド（ａａ１〜２３）とＮ末端システインが含まれる。

いくつかの株は、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）遺伝子の中にフレームシフト変異を有しており、これによって、ポリペプチドの発現が起こらなかった。ａｃｆＤ遺伝子は、ＣＦＴ０７３株、ＥＤＬ９３３株、Ｓａｋａｉ株、およびＢ１７１株からは完全に失われていた。

図２は、アミノ酸配列間での％同一性を示す。標識は、株の名称を使用したＭＧ１６５５、ＲＳ２１８、ＤＨ１０Ｂ、ＡＰＥＣＯ１、およびＵＴＩ８９を除き、配列番号である。最も低い同一性のレベル（図２の中で四角で囲った）は、配列番号２と配列番号４（いずれもＥｘＰＥＣ株）との間での８５．９％であった。

実施例１-全長ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）の免疫原性
ＩＨＥ３０３４株由来のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）配列をクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ宿主の中で、リーダーペプチドを持たない組み換え体Ｈｉｓタグ付きタンパク質として、プラスミドから発現させた。タンパク質を精製し、分析した。ゲル濾過は、アミノ酸配列だけに基づいて予想したよりもはるかに大きな分子量を示した。ＤＴＴの非存在下でのゲル分析は、ＤＴＴの存在下とは異なり、このタンパク質のより大きな分子量の形態を示す（図３）。したがって、このタンパク質はオリゴマーを形成するようである。

ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）に対して惹起させた血清を、全細胞溶解物（図４（Ａ））または６０％のＴＣＡで沈殿させた培養上清（図４（Ｂ））に対するウェスタンブロットにおいて使用した。この血清は、病原性株および片利共生的株の両方に由来する溶解物中の約１５０ｋＤａのタンパク質を認識した。これらは、ＣＦＴ０７３由来の溶解物、またはＩＨＥ３０３４のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ノックアウト変異体由来の溶解物の中のこのバンドとは反応しなかった。上清中のタンパク質との反応性は、このタンパク質が分泌され得ることを示している。

ＣＤ１マウス（５週齢）を、２０μｇの抗原およびフロイトのアジュバント（または以下に示す他のアジュバント）を使用して皮下に免疫化した。このマウスに、０日目、２１日目、および３５日目に接種した。３回目の接種の１４日後、マウスに、致死量（ＬＤ８０）の病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株を抗原投与した。血液を抗原投与後２４時間で尾から収集し、菌血症を評価した。死亡率を、抗原投与後４日間モニターした。防御率は、（対照グループ（免疫化なし）の中での％死亡−実験グループ（免疫化した）の中での％死亡）／対照グループの中での％死亡×１００として計算され得る。

したがって、ＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）は、ワクチンまたはワクチン成分としての使用に有効な候補である。

ワクチンまたはワクチン成分の候補としてのＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）の有用性をさらに実証するため、ＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）を、Ｅ．ｃｏｌｉの他の病原型株に対して交差防御をもたらす能力について、敗血症の動物モデルを使用し、上記に示したとおりに試験した。この試験の結果を以下の表２に示す（比較目的のため、表１の結果を含めている）。

したがって、ＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）は、該タンパク質を導いた株に対してだけでなく、関連株に対してもワクチンまたはワクチン成分としての使用に有効な候補であり、したがって有用性を増大させる。ＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）に対する応答と、以下において試験した３種類の免疫原性断片（３５２６Ａ、３５２６Ｂ、および３５２６Ｃ）に対する応答との類似性に基づき、これらの３種類の断片によっても同様に、類似する交差防御がもたらされ得ることが予測され得る。

実施例２-増大した溶解度を有するＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）の断片
予想外に、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質は、タンパク質が分泌型タンパク質であった場合にもなお、低い溶解度を示した。図５（Ｂ）に示すように、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体の、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去は、２５℃で発現させると、溶解度を有意に増大させた（ｐＫ１−ΔＧ３５２６図５（Ｂ）を参照のこと）。同様に、プロリンリッチ領域全体の、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去も、２５℃で発現させた場合には、溶解度を有意に増大させた。（ｐＫ１−ΔＰ３５２６図５（Ｂ）を参照のこと）。

両方の断片が、全長のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）と実質的に同じ免疫原性を有していることを確認するために、これらの断片を精製した。精製した断片を、フロイトの完全なアジュバントでアジュバント添加した、マウスでの３回の免疫化実験に使用した。免疫化したマウスに、その後、致死量以下の用量のＥ．ｃｏｌｉを抗原投与した。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）での免疫化は、マウスを死から１００％防御したが、免疫化しなかった対照グループにおいては、動物の９０％が死亡した。プロリンリッチ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）での免疫化によっては、マウスの９０％が死から防御されたが、免疫化しなかった対照グループにおいては、動物の９０％が死亡した。

発現および精製
ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のヒスタグ付き改変体を発現する３種類の構築物の１種類を持つ細菌を、３０ｍｌの培地の中で培養し、２５℃でＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）改変体を発現するように誘導した（リーダーペプチドを持たないＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）（３５２６）、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）（ΔＧ３５２６）、およびプロリンリッチ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）（ΔＰ３５２６））。細菌を回収し、そして超音波処理によって溶解させた。可溶性画分を単離し、そしてＩＭＡＣカラムにロードした。このカラムを２０ｍＭのイミダゾールバッファーで３回洗浄した。ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）改変体を、その後、５００ｍＭのイミダゾールバッファーで３回洗浄して溶離させた。図６に示すように、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体の、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のＮ末端の除去により、溶解度と精製されたタンパク質の収量が有意に増大した。得られた収量を、以下のようにＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって評価した：０．１８ｍｇの３５２６、および２．３４ｍｇのΔＧ３５２６。

実施例３−毒性が低下したＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）変異体
ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質において亜鉛結合モチーフが同定された（図８参照）。また、ジンシン亜鉛メタロプロテアーゼモチーフは、そのようなＥ．ｃｏｌｉの病原に関与しているＥＨＥＣによって分泌されるタンパク質であるＳｔｃＥ（ＥＨＥＣ由来のＣ１エステラーゼインヒビター分泌型プロテアーゼ）にもみられる。

このモチーフがＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のすべての改変体において保存されており、ＥＨＥＣが、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）が同定されない唯一の病原型であったことを考慮すると、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）も同様に、これが発現および分泌されるＥ．ｃｏｌｉ病原型の病原性に関与している亜鉛メタロプロテアーゼであると推測された。したがって、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）の毒性の不活化を模索した。当業者であれば、困難なく、該メタロプロテアーゼを不活化するためのＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）の修飾がなされよう。該モチーフのＧｌｕ残基が触媒活性に最も重要であることがわかっているとともに、一方、２つのＨｉｓ残基が亜鉛に配位するため、該メタロプロテアーゼ活性を不活化させる例示的な変異としてＧｌｕをＡｌａに変異させた（配列番号５８〜７６）（例えば，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，１９９８年９月，ｐ．５９７−６３５，第６２巻，３号を参照のこと）。また、２種類のさらなる無毒化改変体：Ｃ末端を欠失させたもの（配列番号２０〜３８）、およびＮ末端を欠失させたもの（配列番号３９〜５７）を設計した。

全長のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）のインビトロ毒性の試験
２種類の異なる細胞株：ヒト骨髄内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の毒性をアッセイする能力について試験した。ＨＢＭＥＣでは、漸増用量のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ）の効果を、ＴＮＦ−α（ポジティブ対照）と比較した。ＴＮＦ−α処理細胞では、平均約２２．５％の細胞死（３つの実験の平均）が示されたが、最高用量のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質で示された細胞死は平均わずか約５％（３つの実験の平均）であった（これに対して、ネガティブ対照で示された細胞死は平均わずか約２．５％（３つの実験の平均）であった）。ＣＨＯ細胞では、漸増用量のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）の効果をＴＮＦ−α（ポジティブ対照）と、ＣＨＯ細胞の細胞骨格の変化による経時的な電位差の変化を測定することにより比較した。ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質試験の最高レベルでは、４６時間後に有意な減少が検出されたが、ＴＮＦ−αに対する応答の減少は著しくより大きかった。

したがって、強いシグナルを伴う毒性についての好ましい試験は同定されなかったが、以下の同定された断片は、依然として有意な有用性を有する。上記で議論したように、これらの３種類の断片により、上記で試験した全長型と類似した程度の交差防御がもたらされるはずである。さらに、片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉは、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の発現に好ましい株である。しかしながら、図４に示されるように、片利共生的Ｅｃｏｌｉは、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の型を発現するが、該タンパク質を分泌しない。したがって、ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の断片の発現により、大きさの違いに基づいて、親和性精製タグを必要とすることなく、該断片を内因性のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質から分離することが可能になるという利点がもたらされる。

クローニングおよび発現−３５２６Ａおよび３５２６Ｂ
ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ部位特異的変異誘発系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて変異体を得た。遺伝子をｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングし、増殖のために化学的にコンピテントな（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ５α−Ｔ１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において形質転換を行なった。発現には、化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用した。すべての候補をクローニングし、シグナル配列なしで、ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現させ、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。

免疫原性−３５２６Ａおよび３５２６Ｂ
両断片と点変異が全長のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）と実質的に同じ免疫原性を有することを確認するため、該断片を精製した。この精製断片をマウスでの３つの免疫化実験に使用し、アジュバントとしてフロイント完全アジュバントを加えた。次いで、免疫化したマウスを致死量のＥ．ｃｏｌｉで抗原投与した。抗原投与の結果を以下の表３に示す。

クローニングおよび発現−ΔＧ３５２６Ｃ
さらなる確認として、溶解度が改善されるΔＧ３５２６Ｎ末端欠失と、Ｃ末端〜亜鉛モチーフの欠失を併せ持つ構築物（ΔＧ３５２６Ｃ）を設計した。例示的な構築物を配列番号７７〜９５で示す。

ΔＧ３５２６Ｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ株ＩＨＥ３０３４−配列番号７７）構築物のためのｈｉｓタグなし発現ベクターは、以下に示すプライマー（ΔＧ３５２６Ａ／Ｃ＿ＦｏｒとΔＧ３５２６Ｃ＿ＮａｔＲｅｖ）を用いたＰＣＲによって得た。増幅させたＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ−２４ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にライゲートし、増殖のために化学的にコンピテントなＤＨ５α−Ｔ１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において形質転換を行なった。発現には、化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用した。

ΔＧ３５２６Ｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ株ＩＨＥ３０３４−配列番号７７）構築物のためのｈｉｓタグ付き発現ベクターは、以下に示すプライマー（Ｉ−ＰＣＲでは、ΔＧ３５２６Ａ／Ｃ＿ＦｏｒとΔＧ３５２６Ｃ＿Ｎａｔ、およびＶ−ＰＣＲでは、ｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のｐ−ｐｅｔ１とｐｅｔ３）を使用し、ポリメラーゼ不完全プライマー伸長（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅＰｒｉｍｅｒＥｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＰＩＰＥ）を用いて得た。この発現ベクターで、増殖のために化学的にコンピテントなＤＨ５α−Ｔ１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において形質転換を行なった。発現には、化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用した。

ΔＧ３５２６Ｃのｈｉｓタグ付き型を、シグナル配列なしで発現させ（例えば、図１０参照）、ｈｉｓタグに基づいたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。

免疫原性−ΔＧ３５２６Ｃ
さらなる断片が全長のＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）と実質的に同じ免疫原性を有することを確認するため、該断片を精製した。次いで、この精製断片を以下のようにして試験した。８匹のＣＤ１マウス（４週齢）の２つの群を、ミョウバン中で製剤化した３つの用量の抗原ΔＧ３５２６Ｃ（２μｇまたは２０μｇのいずれか）で、０日目、３１日目および３５日目にｓ．ｃ．免疫化した。最後の免疫化の１４日後（マウスは１１週齢）、マウスをｉ．ｐ．で病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＩＨＥ３０３４に感染させた。２４時間後に尾部から血液を採取し、菌血症を評価した。感染後４日間、死亡率をモニタリングした。防御を４日目における生存％として計算し、フィッシャーの正確確率検定によって統計解析を行なった。抗原投与の結果を以下の表４に示す。

交差株免疫原性（Ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）−ΔＧ３５２６Ｃ
多種類の株に対して防御をもたらすことにおける該さらなる断片の有用性をさらに確認するため、該精製断片を、以下のようにしてさらに試験した。ＣＤ１マウス（４週齢）を、ミョウバン中で製剤化した３つの用量の抗原ΔＧ３５２６Ｃ（１０μｇまたは２０μｇのいずれか）で、０日目、３１日目および３５日目にｓ．ｃ．免疫化した。最後の免疫化の１４日後（マウスは１１週齢）、マウスをｉ．ｐ．で、表５に示した病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株に感染させた。２４時間後に尾部から血液を採取し、菌血症を評価した。感染後４日間、死亡率をモニタリングした。防御を４日目における生存％として計算し、フィッシャーの正確確率検定によって統計解析を行なった。抗原投与の結果を以下の表５に示す。

本発明は例として記載されているにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内に含まれるように改変が行われ得ることが理解されるであろう。

参考文献（これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）

Claims

Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して変異を含むＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドであって、前記変異が、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して前記免疫原性ポリペプチドの毒性を低下させ、そして、前記免疫原性ポリペプチドは、被験体において前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質が配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項１に記載の免疫原性ポリペプチド。
前記変異が、ジンシンメタロプロテアーゼドメインの全体またはその一部の欠失、およびジンシンメタロプロテアーゼドメインにおけるそのプロテアーゼの活性を低下させる点変異から選択される、請求項１または請求項２に記載の免疫原性ポリペプチド。
前記点変異が亜鉛結合残基の変異または触媒性残基の変異である、請求項１〜３いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
前記亜鉛結合残基が配列番号１とのアラインメントに基づくアミノ酸番号１３０５である、請求項１〜４いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０個のＣ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８個のＣ末端アミノ酸が含まれていないか、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０個のＮ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０個のＮ末端アミノ酸が含まれていない、請求項１〜５いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
免疫原性ポリペプチド断片が、以下：
（ａ）配列番号２０〜７６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２０〜７６と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化；
（ｃ）配列番号２０〜７６のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性；または
（ｄ）配列番号２０〜７６のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である
を含むアミノ酸配列を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、被験体において前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、請求項１〜６いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して前記免疫原性ポリペプチドの溶解度を増大させる欠失をさらに含む、請求項１〜７いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的にすべての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項８に記載の免疫原性ポリペプチド。
前記欠失が、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０個のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４個のＮ末端アミノ酸の除去である、請求項８に記載の免疫原性ポリペプチド。
前記免疫原性ポリペプチド断片が、単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項１〜１０いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１１いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
請求項１〜９いずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項１〜９いずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞。
請求項１１に記載の免疫原性ポリペプチドを含むワクチン成分。
請求項１５に記載のワクチン成分を含むワクチン。
アジュバントをさらに含む、請求項１６に記載のワクチン。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ抗原、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、さらなるＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択されるさらなるワクチン成分をさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載のワクチン。
免疫原性ポリペプチド断片であって、前記免疫原性ポリペプチド断片は、以下：
（ａ）配列番号７７〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７７〜９５と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化；
（ｃ）配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性；または
（ｄ）配列番号７７〜９５のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である
を含むアミノ酸配列を含み、免疫原性ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して低い毒性を有し、前記免疫原性ポリペプチドが被験体において前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド断片。
前記免疫原性ポリペプチド断片に、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２５個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３個のＮ末端アミノ酸が含まれていない、請求項１９に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０個のＣ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７個のＣ末端アミノ酸が含まれていない、請求項１９または２０に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質が配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
アジュバントをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞。
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片を含むワクチン成分。
請求項２７に記載のワクチン成分を含むワクチン。
アジュバントをさらに含む、請求項２８に記載のワクチン。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ抗原、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、さらなるＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択されるさらなるワクチン成分をさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載のワクチン。
免疫原性ポリペプチド断片であって、前記免疫原性ポリペプチド断片は、以下：
（ａ）配列番号２０〜５７からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２０〜５７と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化；
（ｃ）配列番号２０〜５７のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性；または
（ｄ）配列番号２０〜５７のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である
を含むアミノ酸配列を含み、免疫原性ポリペプチドは、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド断片。
前記免疫原性ポリペプチドに、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０個のＣ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８個のＣ末端アミノ酸が含まれていないか、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０個のＮ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０個のＮ末端アミノ酸が含まれていない、請求項３１に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質が配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項３１または請求項３２に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記免疫原性ポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に関して、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して前記免疫原性ポリペプチドの溶解度を増大させる欠失をさらに含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的にすべての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記欠失が、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の１０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０個のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４個のＮ末端アミノ酸の除去である、請求項３４に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項３１〜３６いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド断片。
アジュバントをさらに含む、請求項３１〜３７いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド断片。
請求項３１〜３６いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
請求項３１〜３６いずれかに記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞。
請求項３７に記載の免疫原性ポリペプチド断片を含むワクチン成分。
請求項４１に記載のワクチン成分を含むワクチン。
アジュバントをさらに含む、請求項４２に記載のワクチン。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ抗原、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、さらなるＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択されるさらなるワクチン成分をさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載のワクチン。
免疫原性ポリペプチド断片であって、前記免疫原性ポリペプチド断片は、以下：
（ａ）配列番号７７〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７７〜９５と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化；
（ｃ）配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性；または
（ｄ）配列番号７７〜９５のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である
を含むアミノ酸配列を含み、免疫原性ポリペプチドは、被験体においてＥ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２５個のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０個のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３個のＮ末端アミノ酸が含まれていない、請求項３１に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００個のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０個のＣ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７個のＣ末端アミノ酸が含まれていない、請求項３１または４６に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質が配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
アジュバントをさらに含む、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片。
請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片をコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞。
請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の免疫原性ポリペプチド断片を含むワクチン成分。
請求項５３に記載のワクチン成分を含むワクチン。
アジュバントをさらに含む、請求項５４に記載のワクチン。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ抗原、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、さらなるＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択されるさらなるワクチン成分をさらに含む、請求項５４または請求項５５に記載のワクチン。
配列番号７７〜９５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチド断片を含む免疫原性組成物であって、前記免疫原性ポリペプチド断片に、Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質のＣ末端の１８０個のアミノ酸が含まれていないか、または、前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質のＣ末端の２００個のアミノ酸が含まれていない、免疫原性組成物。
前記Ｅ．ｃｏｌｉＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質が配列番号１〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項５７に記載の免疫原性組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項５７または請求項５８に記載の免疫原性組成物。
前記アジュバントが、（ａ）１体積％〜１２体積％の代謝可能な油と、（ｂ）０．２重量％〜２．５重量％の乳化剤とを含み、前記代謝可能な油と前記乳化剤が、実質的に全部が１ミクロン未満の直径である油滴を持つ水中油型エマルジョンの形態で存在している、請求項５９に記載の免疫原性組成物。
アジュバントが、（ａ）４体積％〜５体積％のスクアレンと、（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとソルビタントリオレエートを含む約１％の乳化剤とを含み、前記スクアレンおよび前記乳化剤が、実質的に全部が１ミクロン未満の直径である油滴を有する水中油型エマルジョンの形態で存在している、請求項５９に記載の免疫原性組成物。
被験体に、請求項１６〜１８、２８〜３０、４２〜４４、および５４〜５６のいずれか１項に記載のワクチンまたは請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、Ｅ．ｃｏｌｉに対する免疫応答の誘導方法。