JP2012526554A - エピメタボリックシフター、多次元細胞内分子、または環境影響因子を使用する代謝性障害の診断のための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,241(代理人整理番号:117732−00601)、“Methods for Treatment of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,243(代理人整理番号:117732−00701)、“Methods for the Diagnosis of Oncological Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,244(代理人整理番号:117732−00801)、“Methods for Treatment of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,245(代理人整理番号:117732−00901)、および“Methods for the Diagnosis of Metabolic Disorders Using Epimetabolic Shifters,Multidimensional Intracellular Molecules or Environmental Influencers”という名称の2009年5月11日に出願された米国仮出願番号61/177,246(代理人整理番号:117732−01001)の優先権を主張する。上述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられている。
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれが、本セクションおける用語と関連する意味を有する。
本発明は、代謝性障害を診断および予後診断するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「代謝性障害」は、患者の代謝の変化から生じる任意の病理学的状態をいう。このような障害には、異常な全身グルコース、脂質および/またはタンパク質の代謝、ならびにそこから発生する病理学的な結果に関連するものが含まれる。代謝性障害には、例えば、高血糖を生じる、グルコース恒常性の変化から生じるものが含まれる。本発明に従うと、グルコースレベルの変化は、典型的には、健常個体におけるこのようなレベルと比較して、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%さえのグルコースレベルの増加である。代謝性障害は細胞増殖、成長、分化、または移動、恒常性の細胞調節、細胞内もしくは細胞間の連絡;組織機能、例えば、肝臓機能、筋肉機能、または脂肪細胞機能;生物における全身性応答、例えば、ホルモン応答(例えば、インスリン応答)などの細胞機能に有害な影響を与え得る。代謝性障害には、肥満、糖尿病(本明細書では真性糖尿病ともいわれる)(例えば、I型糖尿病、II型糖尿病、MODY、および妊娠性糖尿病)、前糖尿病、メタボリックシンドローム、満腹、および、例えば、加齢からくる内分泌異常が含まれるがこれらに限定されない。代謝性障害のさらなる例には、過食症、食欲不振、トリグリセリド貯蔵疾患、バルデー−ビードル症候群、ローレンス−ムーン症候群、プラーダ−ラブハート−ウィリー症候群、カーンズ−セイヤー症候群、拒食症、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損、および悪液質が含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態において、代謝性障害はコエンザイムQ10反応性状態である。
本発明は、環境影響因子の投与によって代謝性障害を処置する方法を提供する。「環境影響因子(Env−influencers)」は、有効な方法でヒトの疾患環境に影響を及ぼすかまたはヒトの疾患環境を調節する分子であり、これによりヒトの疾患環境を、正常な環境または正常な状態に通じる健康な環境にシフトさせる、そのような環境に戻して再度確立させる、あるいはそのような環境を維持することが可能となる。env影響因子は、下で定義するような多次元細胞内分子(MIM)およびエピメタボリックシフター(エピシフター)の両方を含む。
「多次元細胞内分子(MIM)」という用語は、体によって自然に産生されるおよび/またはヒトの少なくとも1つの細胞中に存在する内因性分子の単離されたものまたは合成産生されたものである。MIMは、以下の機能の1つ以上、2つ以上、3つ以上、またはすべてによって特徴付けられる。MIMは細胞に進入することが可能であり、細胞への進入は、分子の生物活性部分が完全に細胞に進入する限り、細胞への完全または部分進入を含む。MIMは、細胞内でシグナル伝達および/または遺伝子発現機構を誘導することが可能である。MIMは、治療薬および担体の両方、例えば薬物送達効果を有するという点で多次元である。MIMはまた、疾患状態において1つの方法で作用し、正常な状態においては異なる方法で作用するという点で多次元である。例えばCoQ−10の場合、VEGFの存在下での黒色腫細胞へのCoQ−10の投与は、Bcl2レベルの低下をもたらし、次に黒色腫細胞の発癌能の低下をもたらす。対照的に、正常な線維芽細胞において、CoQ−10およびVEFGの同時投与は、Bcl2のレベルに対する効果は有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞において選択的に作用し、正常な状態の(マッチング)細胞において実質的に効果を有さない。好ましくはMIMは、疾患状態の細胞を、表現型、代謝状態、遺伝子型、mRNA/タンパク質発現レベルなどで正常な状態の(マッチング細胞)に選択的に近づける。
nは0または1の整数であり;
R1、R2、R3およびR4は存在するとき、水素およびヒドロキシルからそれぞれ独立して選択される、またはR1およびR2は、これらが結合されている炭素と共にまとめられてカルボニル(C=O)基を形成し;
Wは−COOHまたは−N(CH3)3 +であり;ならびに
Xは、水素、負の電荷またはNa+などのアルカリ金属カチオンである。
本発明は、MIMを同定する方法を提供する。MIMを同定する方法は、細胞への内因性分子の外部からの添加および内因性分子の細胞、例えば細胞微小環境プロフィールに対する効果の評価を包含する。細胞に対する効果は細胞、mRNA、タンパク質、脂質、および/または代謝産物レベルの1つ以上で評価されて、細胞微小環境プロフィールにおける改変を同定する。1実施形態において、細胞は例えばインビトロで培養された培養細胞である。1実施形態において、細胞は生物中に存在する。内因性分子は、細胞に単一の濃度で添加され得る、または細胞に一連の濃度にわたって添加され得る。1実施形態において、内因性分子は対照の未処置細胞中の内因性分子のレベルと比較して、細胞中の内因性分子のレベルが上昇するように細胞に添加される(例えば1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍またはそれ以上、上昇する)。
本明細書で使用する場合、「エピメタボリックシフター」(エピシフター)は、健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを調節して、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建する分子(内因性または外因性)である。エピシフターは、組織微小環境の正常化を達成することができる。例えば、エピシフターは、細胞に添加されたまたは細胞で消耗されたときに、細胞の微小環境(例えば代謝状態)に影響を及ぼすことができるいずれの分子も含む。当業者は、本発明のエピシフターが2つ以上の分子の混合物を含むことも意図され、混合物が上述の機能の1つ以上によって特徴付けられることを認識するであろう。混合物中の分子は、混合物がエピシフターとして機能するような比で存在する。エピシフターの例は、限定されるわけではないが、CoQ−10;ビタミンD3;フィブロネクチンなどのECM構成要素;TNFαまたはインターロイキンのいずれかなどの免疫調節薬、例えばIL−5、IL−12、IL−23;血管形成因子;およびアポトーシス因子を含む。
エピメタボリックシフター(エピシフター)は、細胞の代謝状態を調節する、例えば健常(または正常な)状態から疾患状態へのおよびまたはその逆の代謝シフトを誘導することが可能である分子であり、これによりヒトにおける細胞、組織、器官系および/または宿主の健康を維持または再建することが可能である。本発明のエピシフターはそれゆえ、罹患状態の診断評価に有用性を有する。本発明のエピシフターは、エピシフターの適用または投与(他の治療分子によるエピシフターの調節)効果が組織微小環境および疾患状態における正常化をもたらす治療用途においてさらなる有用性を有する。
目的の分子および化合物を分離および同定するために用いた本発明の技法および方法は、限定されるわけではないが:液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、ガスクロマトグラフィー(GC)、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC−MS)、核磁気共鳴(NMR)、磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外(FT−IR)、および誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を含む。質量分析技法は、限定されるわけではないが、扇形磁場2重収束型装置、透過型4重極装置、4重極イオントラップ型装置、飛行時間型装置(TOF)、フーリエ変換サイクロトロン共鳴型装置(FT−MS)およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)の使用を含むことが、さらに理解される。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、候補エピシフターが適用された細胞の細胞生体エネルギー分子レベル(例えばATP、ピルビン酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、アセチルCoA、FADH2)の変化によって同定され得る。生体エネルギー分子レベルの例示的なアッセイは、比色(colorometric)、蛍光、および/または生物発光ベースの方法を使用する。このようなアッセイの例は下で提供される。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞エネルギー特性の変化によっても同定され得る。細胞エネルギー特性の測定の1例は、分子酸素の消費および/または細胞培養物の培地のpHの変化のリアルタイム測定である。例えば潜在的エピシフターが細胞の代謝状態を調節する能力は、例えばXF24アナライザ(Seahorse,Inc.)を使用して分析され得る。本技術によって、細胞微小環境の生体エネルギーを評価するための、細胞の単層における酸素およびpH変化のリアルタイム検出が可能となる。XF24アナライザは、どちらも細胞エネルギー特性の主要な指標である、好気性代謝の尺度である酸素消費速度(OCR)および解糖の尺度である細胞外酸化(ECAR)を測定および比較する。
酸化的リン酸化は、ミトコンドリアの膜に埋め込まれたタンパク質複合体を介して真核生物中で行われる栄養化合物の酸化を介して、ATPが発生されるプロセスである。大半の生物の細胞における主なATP源として、酸化的リン酸化活性の変化は、細胞内での代謝およびエネルギーバランスを強力に改変することができる。本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、酸化的リン酸化に対するその効果によって検出および/または同定され得る。いくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、限定されるわけではないが、電子輸送鎖およびATP合成を含む、酸化的リン酸化の特異的な態様に対するその効果によって検出および/または同定され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞増殖および/または炎症に関連する分子の産生または活性に対するその影響によって同定および評価され得る。これらの分子は、限定されるわけではないが、サイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックスの構成要素、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ニューロトロフィンおよび細胞シグナル伝達に関与する他の分子、ならびにシグナル伝達に関与する細胞内分子などの細胞内分子を含む。
環境影響因子(例えばMIMまたはエピシフター)は、細胞死の見込みの上昇または低下を証明する、アポトーシス、壊死もしくは細胞変化を受ける細胞試料の原形質膜完全性の変化および/または細胞の数もしくはパーセンテージの変化によって同定され得る。
本発明は、被験体が代謝性障害に罹患しているか否かをアッセイするための方法を提供する。本発明の方法は、代謝性障害および/または代謝性障害について処置された被験体の生存を予後診断するために熟練の実務者によって使用される任意の他の方法と併せて実施することができる。例えば、本発明の方法は、被験体から得られた試料の形態学的または細胞学的分析と併せて実施されてもよい。細胞学的方法には、任意の他の分子マーカーの、それ自体の、他のマーカーと併せての、および/またはShcマーカーと組み合わせての免疫組織学的または免疫蛍光検出(および適切な場合、定量)が含まれる。他の方法には、インサイチュPCRによる、または組織を抽出することおよびリアルタイムPCRによって他のマーカーを定量することによる、他のマーカーの検出が含まれる。PCRはポリメラーゼ連鎖反応として定義される。
本発明は、表2〜4および6〜29に列挙されるマーカー(本明細書中以後、「バイオマーカー」、「マーカー」、または「本発明のマーカー」)に関する。本発明は、マーカーによってコードされるか、またはマーカーに対応する核酸およびタンパク質(本明細書中以後、それぞれ、「マーカー核酸」および「マーカータンパク質」)を提供する。これらのマーカーは、代謝性障害の存在についてスクリーニングすること、被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測すること、代謝性障害を処置するための化合物を同定すること、および代謝性障害を処置するための治療の有効性または環境影響因子化合物の有効性を評価することにおいて特に有用である。
本発明の1つの態様は、マーカータンパク質またはその一部をコードする核酸を含む単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸には、マーカー核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために十分な核酸分子、およびマーカー核酸分子のフラグメント、例えば、マーカー核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマーとしての使用のために適切なものもまた含まれる。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)およびヌクレオチドアナログを使用して生成されたDNAまたはRNAのアナログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。
本発明はリボザイムもまた包含する。リボザイムは、一本鎖核酸、例えば、リボザイムが相補性領域を有するmRNAを切断可能なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach,1988,Nature 334:585〜591に記載されるようなハンマーヘッドリボザイム)は、mRNA転写物を触媒的に切断するために使用でき、それによって、mRNAによってコードされているタンパク質の翻訳を阻害する。マーカータンパク質をコードしている核酸分子についての特異性を有するリボザイムは、マーカーに対応するcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナL−19 IVS RNAの誘導体が構築でき、ここでは、活性部位のヌクレオチド配列が、切断されるヌクレオチド配列に相補的である(Cech et al.米国特許第4,987,071号;およびCech et al.米国特許第5,116,742号を参照のこと)。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAは、RNA分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択するために使用できる(例えば、Bartel and Szostak,1993,Science 261:1411〜1418を参照のこと)。
別の実施形態において、PNAは、例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増強するために、親油性または他のヘルパー基をPNAに加えることによって、PNA−DNAキメラの形成によって、またはリポソームの使用もしくは当該分野において公知である薬物送達の他の技術によって修飾できる。例えば、PNAおよびDNAの有利な特性を合わせることができるPNA−DNAキメラが生成できる。PNA部分が高い結合親和性および特異性を提供しながら、このようなキメラは、DNA認識酵素、例えば、RNase HおよびDNAポリメラーゼが、DNA部分と相互作用することを可能にする。PNA−DNAキメラは、核酸塩基の間の結合の塩基の積み重ねの数と、配向によって選択される適切な長さのリンカーを使用して連結できる(Hyrup、1996、前出)。PNA−DNAキメラの合成は、Hyrup(1996)、前出およびFinn et al.(1996) Nucleic Acids Res.24(17):3357〜63において記載されるように実施できる。例えば、DNA鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学および修飾ヌクレオシドアナログを使用して、固相支持体上で合成できる。5’−(4−メトキシトリチル)アミノ−5’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトなどの化合物は、PNAとDNAの5’末端の間の連結として使用できる(Mag et al.,1989,Nucleic Acids Res.17:5973−88).次いで、PNAモノマーは、5’PNAセグメントおよび3’DNAセグメントを有するキメラ分子を産生するために、段階的な様式で結合される(Finn et al.,1996,Nucleic Acids Res.24(17):3357〜63)。あるいは、キメラ分子は、5’DNAセグメントおよび3’PNAセグメントを用いて合成できる(Peterser et al.,1975,Bioorganic Med.Chem.Lett.5:1119−11124)。
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため)、または細胞膜(例えば、Letsinger et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553−6556;Lemaitre et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648〜652;PCT公開番号WO88/09810を参照のこと)、もしくは血液脳関門(例えば、PCT公開番号WO89/10134を参照のこと)を通した輸送を容易にする薬剤などの他の添付された基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断因子(例えば、Krol et al.,1988,Bio/Techniques 6:958〜976を参照のこと)またはインターカレート因子(例えば、Zon,1988,Pharm.Res.5:539−549).を参照のこと)を用いて修飾できる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などに結合体化できる。
本発明の1つの態様は、単離されたマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびにマーカータンパク質またはそのフラグメントに対して指向される抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントに関する。1つの実施形態において、ネイティブマーカータンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用して適切な精製スキームによって、細胞または組織の供給源から単離できる。別の実施形態において、マーカータンパク質の全体またはセグメントを含むタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生される。組換え発現の代替としては、このようなタンパク質またはペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学合成できる。
本発明は、診断アッセイ、予測アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床的な痕跡を監視することが予後診断(予測)目的のために使用され、それによって個体を予防的に治療する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の1つの態様は、個体が代謝性障害を発症するリスクがあるか否かを決定するために、1種以上のマーカータンパク質または核酸の発現レベルを決定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイは、予後診断または予測目的のために使用され、それによって、障害の発症の前に個体を予防的に処置できる。
生物試料中のマーカータンパク質または核酸の存在または非存在を検出するための例示的な方法には、試験被験体(例えば、代謝性障害関連体液)から生物試料を入手すること、およびポリペプチドまたは核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNA、またはcDNA)を検出可能な化合物または薬剤と生物試料を接触させることが含まれる。したがって、本発明の検出方法は、例えば、生物試料中で、インビトロならびにインビボで、mRNA、タンパク質、cDNA、またはゲノムDNAを検出するために使用できる。例えば、mRNAの検出のためのインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。マーカータンパク質の検出のためのインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈殿、および免疫蛍光が含まれる。ゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。mRNAの検出のためのインビボ技術には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ノーザンハイブリダイゼーション、およびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、マーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、タンパク質またはそのフラグメントに対して指向される標識された抗体を被験体に導入することが含まれる。例えば、抗体は放射性マーカーで標識でき、被験体におけるその存在および位置が標準的な画像化技術によって検出できる。
本発明のマーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしてもまた有用である。本明細書で使用される場合、「薬理ゲノミクスマーカー」とは、目的の生化学的マーカーであり、その発現レベルは患者の特定の臨床薬物応答または感受性と相関する(例えば、McLeod et al.(1999)Eur.J.Cancer 35(12):1650−1652に概説されている)。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在または量は、患者の予測される応答に関連し、より特定には、特定の薬物または薬物のクラスを用いる治療に対する患者の代謝性障害に関連する。患者における1つ以上の薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量を評価することによって、患者にとって最も適切であり、より大きな程度の成功を有すると予測される薬物治療が選択され得る。例えば、患者における特定のマーカーによってコードされるRNAまたはタンパク質の存在または量に基づいて、患者において存在する可能性がある特定の代謝性障害の処置のために最適化される薬物または処置の経路が選択されてもよい。それゆえに、薬理ゲノミクスマーカーの使用は、異なる薬物またはレジメンを試すことなく、各々の代謝性障害のために最も適切な処置を選択または設計することを可能にする。
本発明のマーカーの発現レベルに対する薬物の影響を監視することは、基礎的な薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においてもまた適用できる。例えば、薬剤がマーカー発現に影響を与えるための有効性は、代謝性障害についての処置を受ける被験体の臨床試験において監視される。好ましい実施形態において、本発明は、(i)薬剤の投与の前に被験体から投与前試料を得る工程;(ii)投与前試料における1種以上の選択された本発明のマーカーの発現レベルを検出する工程;(iii)被験体からの1種以上の投与後試料を得る工程;(iv)投与後試料中のマーカーの発現レベルを検出する工程;(v)投与前試料のマーカーの発現レベルを、投与後試料中のマーカーの発現レベルと比較する工程;および(vi)それに応じて、被験体への薬剤の投与を変更する工程を包含する、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補)を用いる被験体の治療の有効性を監視するための方法を提供する。例えば、処置の過程の間のマーカー遺伝子の発現の増加は、非効果的な投薬量および投薬量の増加が望ましいことを示し得る。逆に、マーカー遺伝子の発現の減少は、有効な処置および投薬量を変更する必要がないことを示し得る。
本発明は、本発明のマーカーを含有するアレイもまた含む。アレイは、アレイ中の1種以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用できる。1つの実施形態において、アレイは、アレイ中の遺伝子の組織特異性を確実にするために組織中の遺伝子発現をアッセイするために使用できる。この様式において、約7600個までの遺伝子が発現について同時にアッセイできる。このことは、1つ以上の組織において特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロフィールが開発されることを可能にする。
本発明の方法において有用な試料には、本発明のマーカーを発現する任意の組織、細胞、生検、または体液試料が挙げられる。1つの実施形態において、試料は、組織、細胞、全血、血清、血漿、口腔掻爬物(buccal scrape)、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、または気管支肺胞洗浄液であり得る。好ましい実施形態において、組織試料は、血液または尿試料を含む代謝性障害試料である。
本発明は、代謝性障害または代謝性障害について処置されている被験体の生存を予後診断するための組成物およびキットもまた提供する。これらのキットは以下の1つ以上を含む:本発明のマーカーに特異的に結合する検出可能な抗体、本発明のマーカーに特異的に結合する検出可能な抗体、染色のために被験体の組織試料を入手および/または調製するための試薬、ならびに使用のための説明書。
本発明は、本発明のマーカーの発現および/または活性を調節することによって代謝性障害を調節する、調節因子、すなわち、候補または試験化合物または因子(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、小分子、または他の薬物)を同定するための方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)もまた提供する。このようなアッセイは、典型的には、本発明のマーカーと1種以上のアッセイ成分の間の反応を含む。他の構成要素は、試験化合物自体、または試験化合物および本発明のマーカーの天然結合パートナーの組み合わせのどちらかであり得る。本明細書に記載されるものなどのアッセイを介して同定された化合物は、例えば、代謝性障害を調節するために、例えば、阻害し、緩和し、処置し、または予防するために有用であり得る。
化合物のライブラリーは、溶液中に(例えばHoughten,1992,Biotechniques 13:412−421)、またはビーズ(Lam,1991,Nature 354:82−84)、チップ(Fodor,1993,Nature 364:555−556)、細菌および/もしくは胞子(Ladner,USP 5,223,409)、プラスミドの上に(Cull et al,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865−1869)またはファージの上に(Scott and Smith,1990,Science 249:386−390;Devlin,1990,Science 249:404−406;Cwirla et al,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378−6382;Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301−310;Ladner、上掲)提供され得る。
潜在的なMIMとしてCoQ10を評価するために、酸化型のCoQ10を癌株化細胞および正常な対照株化細胞の両方を含む株化細胞のパネルに外部から添加して、パネルの各株化細胞について細胞微小環境プロフィールに誘導された変化を影響評価した。mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方を含む、細胞形態/生理機能に対するおよび細胞組成物に対する変化を、正常細胞との比較として罹患細胞について評価および比較した。これらの実験結果は、CoQ10、および特にCoQ10の酸化型をMIMとして同定した。
株化細胞が目的の分子によって処置された細胞ベースアッセイから、処置細胞対非処置細胞の相違をmRNAアレイ、タンパク質抗体アレイ、および2次元ゲル電気泳動によって評価する。比較試料分析からMIMまたはエピシフターによって調節されることが同定されたタンパク質を、経路分析を使用するシステム・バイオロジー・パースペクティブ(Systems Biology perspective using analysis)(Ingenuity IPAソフトウェア)および公知の文献の検討から評価した。潜在的な治療ターゲットまたはバイオマーカーターゲットとして同定されたタンパク質に、ウェスタンブロット分析、siRNAノックダウン、または組換えタンパク質産生およびキャラクタリゼーション方法などの確認アッセイに供する。
コエンザイムQ10ストック
500μMコエンザイムQ10(細胞増殖培地中5%イソプロパノール)を以下のように調製した。500μMコエンザイムQ10ストック10mLは、毎回更新した。分子量:863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)=0.004317g
500μMストック10mLを作製するために、4.32mgコエンザイムQ10を15mLファルコンチューブに秤量して、イソプロパノール500μLを添加した。溶液を完全に溶解するために撹拌しながら、50〜60℃の水浴で加温した。本溶液に培地9.5mL(細胞を培養したのと同じ培地)を添加した。
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
細胞をQ10に曝露する前に85%コンフルエントまで培養した。補足培地をQ10によって50および100マイクロモル濃度に調整した。フラスコを対照、50μMQ10、および100μMQ10によって3通り処置した。タンパク質を処置フラスコおよび対照フラスコから4、8、12、および24時間後に単離した。タンパク質の単離のために、細胞はpH7.4の氷冷PBS 5mLによって3回洗浄した。細胞を次にPBS 3mL中でこすり取り、遠心分離によってペレット化し、pH7.4の溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤およびリン酸阻害剤を含む、80mM TRIS−HCl、1%SDS)に再懸濁させた。BCA法を使用してタンパク質濃度を定量した。
下に挙げる株化細胞を増殖させて、それぞれについて細胞バンクを樹立した。各種のアッセイのための細胞の大規模産生を遂行して、分析のために材料を収集した。一般に、株化細胞の維持に細胞特異的培地が不要であるとき、細胞増殖増殖に使用した培地は5%血清を含むDMEMF−12であった。細胞は通例、続いての分割ならびに細胞アッセイおよび標準実施方法における使用の前に、75〜80%コンフルエント(クリアスペーシング(clear spacing))まで増殖させた。実験のために以下の株化細胞を樹立した:
SK−MEL−28(非転移性皮膚黒色腫)
SK−MEL−2(転移性皮膚黒色腫)
HEKa(ケラチノサイト、皮膚対照)
HEMa(メラノサイト、皮膚対照)
nFIB(新生児線維芽細胞)
HEP−G2(肝臓癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(乳癌、Her2過剰発現)
MCF−7(乳癌、p53突然変異)
PC−3(前立腺癌)[SBH株化細胞]
SkBr−3(ヒト乳腺癌)
NCI−ES−0808
SCC(扁平上皮細胞癌腫)
PaCa−2
NIH−3T3
細胞培養:
細胞をAmerican Type Culture CollectionまたはGibcoから取得した。細胞を5%ウシ胎仔血清、0.25ug/mLアンホテリシン、100ug/mLストレプトマイシン、および100UmL−1ペニシリンを補足したDMEM/F−12培地で培養した。細胞を37℃の95%空気および5%CO2の雰囲気中で維持した。
SK−MEL28細胞を100μM Q10または対照ビヒクルによって処置した。Q10の製剤は以下の通りである。15mLキャップ付きチューブに、Q10 4.32mg(Cytotechより供給)を移し、次にイソプロパノール500μlの添加により溶解させた。得られた溶液を65℃の水浴で加温して、高速でボルテックスした。Q10/イソプロパノール溶液の体積を平衡にした細胞培養培地の添加により、10mLにした。ストック溶液を次にボルテックスして、Q10の溶解性を最大にした。ストック溶液を希釈して(培地8mLによりストック2mL)100μ MQ10の最終濃度を取得した。対照ビヒクルでは、培地9.5mLをイソプロパノール500μLに添加した。対照ストック(ストック2mL)を培地8mLでさらに希釈した。細胞を処置開始の6、16、24、48または72時間後に収集した。
SCC細胞を100μM Q10(上記のように調製)によって6時間または24時間のどちらかで処置した。対照細胞は未処置細胞であった。処置後、各種の時間にて収集およびペレット化して、ペレットを急速凍結させ、RNAを下記のようにXTALにて単離するまで−80℃にて貯蔵した。
RNeasy Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia CA)キットをメーカーの説明書に従って使用して、細胞を各種の処置時間にRNA単離のために溶解させた。RNAを260nmにおける光学密度を測定することによって定量した。
第1鎖cDNAを、RT2第1鎖合成キット(SABiosciences.,Frederick MR)をメーカーの推奨に従って使用して、全RNA 1μgから合成した。
第1鎖合成からの生成物を水で希釈して、SYBRグリーン・マスター・ミックス(SABiosciences.,Frederick MD)と混合し、PCRアレイ上に添加した。リアルタイムPCRをBiorad CFX96でPCRアレイ(アポトーシスアレイ、糖尿病アレイ、酸化ストレスアレイおよび抗酸化防御アレイならびに熱ショックタンパク質アレイ)(SABiosciences,Frederick MD)に対して実行した。
早期および後期アポトーシスでの細胞のパーセンテージをコエンザイムQ10処置の24時間後に定量した。早期および後期アポトーシスを、コエンザイムQ10に対する各種の癌株化細胞の感受性の相違を理解するためのマーカーとして使用した。試験した各種の株化細胞は、PaCa2、HepG2、PC−3、SKBr3、MCF−7およびSK−MEL28であった。細胞を96ウェルプレート内で一晩接着させた。これらの細胞を対照ビヒクル、50μM Q10または100μMコエンザイムQ10のいずれかによって処置した。24時間後、アポトーシス細胞の存在がPCA96フローサイトメータ(Guava Technologies,Hayward、CA)で推定された。加えていくつかの細胞を、アポトーシスの正の対照としての4μMスタウロスポリンで2時間処置した。細胞を最初にPBSで洗浄して、Accumax(Innovative Cell Technologies,San Diego、CA)50μLによって室温にて剥離させた。1%プルロニックF−68(Sigma−Aldrich,St.Louis、MO)を含有する培養培地の添加によって、解離を停止させた。ネキシン試薬100μL(Guava Technologies,Hayward、CA)を各ウェルに添加した。暗所での20分間のインキュベーションの後、アッセイを低結合プレートにて遂行して、細胞の基質への再結合を最小限に抑えた。ネキシン試薬は2種類の染料を含有している。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の特徴である、ホスファチジル(phosphotidyl)セリンを細胞の外部にて検出する。第2の染料7−AADは、生(健常)および早期アポトーシス細胞から排除されるが、後期アポトーシス細胞のみに浸透する。4つの細胞集団;生、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシスおよび破片のパーセンテージは、Cytosoft 2.5.7ソフトウェア(Guava Technologies,Hayward、CA)を使用して決定した。
試料当りおよそ50μgのタンパク質を、免疫ブロッティングによってアッセイした。すべての処置は対照を用いて3通り実行した。タンパク質を12%TRIS−HClゲル上で分離し、電気泳動を介してニトロセルロース膜に移し、1次抗体によるインキュベーションの前に5%牛乳およびTBST溶液を使用して遮断した。1次抗体を5%BSAおよびTBST溶液中4℃にて一晩インキュベートした。2次抗体を4℃にて1時間インキュベートした。すべての抗体をCell Signaling Technologyから購入した。抗体は、1:5000の比のβアクチンを除いて、1:1000の比で使用した。ブロットを展開させて、結果はNIH Javaベースの濃度計分析ソフトウェアImage Jを使用して定量した。すべてのブロットはプローブも行い、そのそれぞれのβアクチン発現に正規化した。
等電点電気泳動(IEF)の前に、試料を40mM Tris、7M尿素、2Mチオ尿素、および1%C7両性イオン洗剤中に溶解させて、トリブチルホスフィンによって還元し、10mMアクリルアミドによって室温にて90分間アルキル化した。試料を10kDaカットオフAmicon Ultraデバイスに通した後、7M尿素、2Mチオ尿素、および2% CHAPSから成る少なくとも3倍量の再懸濁緩衝液によって、試料の伝導率を低下させる。タンパク質100マイクログラムに、11cm pH3〜10、pH4〜7またはpH6〜11の固定化pH勾配ストリップ(GE,Amersham、USA)にて100,000ボルト時までIEFに供した。IEFの後、固定化pH勾配ストリップを6M尿素、2%SDS、50mM Tris酢酸緩衝液、pH7.0、および0.01%ブロムフェノールブルー中で平衡にして、8〜16%Tris−HClプレキャストゲル1mm(Bio−Rad、USA)でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルは2通り実行した。これらにどちらも固定、SYPRO Ruby、80mL/ゲル(Invitrogen、USA)での染色およびFuji FLA−5100レーザスキャナでの撮像、またはPVDF膜上への移動を行った。
すべてのゲル画像の分析は、Progenesis Discovery and Pro(Nonlinear Dynamics Inc.,Newcastle upon Tyne、英国)を使用して遂行した。スポット検出、マッチング、バックグラウンド除去、正規化、およびフィルタリングの後、SYPRO Rubyゲル画像のデータをエクスポートした。Progenesis Discoveryでスチューデントのt検定を使用して群間の対比較を遂行し、発現が著しく改変されたスポットを同定した(p>0.05)。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ、Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、Q10処置細胞(SK−MEL−28、SCC)におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。細胞抽出物におけるタンパク質の発現は、スライド上にスポットされた対応する抗体にタンパク質が結合されたときに検出される。結合の前に、タンパク質を蛍光描出および定量的分析に使用される蛍光染料で直接標識する。アレイを異なるCyDye(Cy3またはCy5)によってそれぞれ標識された2つの試料のタンパク質発現プロフィールを比較するために使用して(試験試料対参照試料)、2つの試料を等しいタンパク質濃度でアレイ上に同時に適用する。次に各試料の蛍光シグナル強度を試料の染料標識に対応する波長にて個別に記録して、比較する。
実験詳細事項:100μM Q10によって24または48時間処置されたSKMEL−28細胞、NCI−ES0808細胞およびNIH−3T3細胞を、t=0にて収集された細胞と共に、T160フラスコから洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離して、ペレット化し、急速凍結させ、ミトコンドリアが単離されるまで−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを解凍して、再懸濁させ、ダウンスホモジナイザで破砕した。ホモジネートを遠心分離して、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(Mitochondria Isolation kit for Cultured cells)(MitoSciences,Eugene OR、カタログ番号MS852)によって推奨された試薬およびプロトコルを使用してミトコンドリアを単離した。ミトコンドリア画分をアリコートし、−80℃で保存した。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chromatogr.A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって行った。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量に、タンパク質沈殿(1−プロパノール300μl中で超音波処理された充填細胞100μl)、液液抽出(上清に水100μlを添加して、X3をn−ヘキサン200μlで抽出する)、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)50μlでの再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。分析は、Prism RP 1×100mm、5μm粒径カラムを備えたWaters Quattro II 3連4重極質量分析計(Keystone Scientific)でのLC−MS/MSによった。流速50μl/分での20%イソプロピルアルコール80%メタノール中の4mMギ酸アンモニウムによる定組成溶離。各試料10μlを注入した。MRM分析は、m/z882.7>197.00(Q10H2)およびm/z880.80>197.00(Q10)トランジションをコーン電圧40および衝突エネルギー30と共に使用して遂行した。
いくつかの株化細胞のQ10に対する感受性を、適用の24時間後に2種類の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含有する試薬(ネキシン試薬)を使用することによって試験した。7AAD染料は、透過性細胞膜によって細胞;主に後期アポトーシスにある細胞の中に進入するであろう。アネキシン−V−PEは、早期アポトーシス細胞の原形質膜の外面に露出されたホスファチジル(Phosphotidyl)セリンに結合する染料である。それゆえネキシン試薬を使用して、フローサイトメータでアポトーシス細胞の異なる集団を区別することができる。
Q10によって処置した試料の細胞ペレットをプロテオミクス法によって分析した。細胞ペレットを溶解させて、2次元ゲルおよびウェスタンブロット分析で使用するために処置した。3つの細胞タイプ(SKMEL−28、SCC、およびnFib)をQ10によって処置して、2次元ゲル電気泳動によるプロテオミクスキャラクタリゼーションに供した。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験セットは、皮膚癌株化細胞SKMEL−28であった。本実験セットは、0、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
別の皮膚癌株化細胞の扁平上皮細胞癌腫(SCC)も調製して、前のSK−MEL−28分析の追跡実験として、2次元ゲル電気泳動によって分析した。SCC細胞を100μM Q10によって、収集前に6時間または24時間処置した。未処置細胞の対照も収集した。細胞ペレットを溶解させ、試料に2次元電気泳動に供した(2通り)。比較試験での600個を超えるタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を6時間および24時間処置に対して比較した。
複数の一連の証拠は、ミトコンドリアタンパク質の役割および癌生物学およびQ10応答のより綿密な評価が正当化されることを示唆した。第1に、正常細胞におけるエネルギー産生のためのミトコンドリア酸化的リン酸化プロセスには、Q10の不可欠の役割がある。しかし、癌細胞に出現するのは、Q10を必要としない解糖の代わりの経路によるエネルギー産生への代謝シフトである。第2に、細胞のアポトーシス応答は、ミトコンドリアタンパク質の出現を必要とする。Q10は、癌細胞における刺激アポトーシスとして樹立されてきた(Bcl−2ファミリータンパク質、シトクロムc)。最後に、ミトコンドリアインポート受容体タンパク質TOM22のタンパク質レベルの調節によって例示されるように(本明細書に記載する実験を参照)、新たなミトコンドリアタンパク質がQ10処置によって調節されていることが同定された。
皮膚癌SKMEL−28細胞を100μM Q10または偽ビヒクルによって6、19、または48時間にわたって処置した。細胞をT−160フラスコ(各時点ごとに4個)から洗浄およびこすり落としによって収集した。細胞を遠心分離によって採取し、ペレットを急速凍結させて−80℃にて貯蔵した。細胞ペレットを再懸濁させ、2mLダウンスホモジナイザを使用して破砕した。試薬および方法は、培養細胞用ミトコンドリア単離キット(MitoSciences、カタログ番号MS852)から取得した。結果として生じたミトコンドリア試料一定分量75μL(1試料に付き、4〜5個の一定分量)に分け、−80℃にて貯蔵した。
2次元ゲル電気泳動は、100μM Q10によって6、19、および48時間処置されたSK−MEL−28ミトコンドリア濃縮試料に2個の一定分量から溶解されたタンパク質に対して(対応する偽ビヒクル対照と共に)遂行した。試料に2次元電気泳動に供した(2通り)。525個のタンパク質スポットの分析を遂行して、対照試料を残りの時点の試料に対して比較した(図11)。
コエンザイムQ10(Q10)および還元型ユビキノール−10(Q10H2)の同時決定の方法は、最近公開された方法(Ruiz−Jimenez,2007,J.Chroma A,1175,242−248)に基づいて、LC−MS/MSを陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化(ESI)と共に使用することによって実行した。Q10およびQ10H2の両方の高選択的同定および高感受性定量は、他の選択された脂質の同定と共に可能である。100μM Q10によって処置されたSK−MEL−28からのミトコンドリア濃縮試料の一定分量に、タンパク質沈殿、液液抽出、合せたヘキサン抽出物の蒸発乾固および95:5 メタノール/ヘキサン(v/v)での再構成に基づく、慣習的な前処置に供した。
実験1:アポトーシスアレイ
実施例3で上述したように、癌細胞のQ10への曝露は、アポトーシスプロセスによりこれらの細胞の部分に死を誘導する。Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、アポトーシスにターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
RT−PCRのアッセイ方法を利用して、合計84のアポトーシス経路関連タンパク質に対するmRNAレベルの変化の尺度を提供した。Q10(24時間)を用いた、SkBr3に対するリアルタイムPCRアポトーシス分析による実験は、以下のmRNA:Bcl2、Bcl2L1、Bcl2L11、Birc6、Bax、Xiap、Hprt1、Apaf1、Abl1、Brafが影響されていることを同定した。これらの結果は再度、Q10処置に対する癌細胞のアポトーシス応答を裏付ける証拠を提供した。
アポトーシス関連タンパク質の調査から、複数のアポトーシス促進因子および抗アポトーシス因子がBCL−2ファミリー中にあること、またはこれらの因子と相互作用するタンパク質が発現レベルを調節したこと(BCL2L11、BNIP2、BAG1、HRK、BAK1、BCL2、BCL2L1)が観察された。これらのタンパク質は、ミトコンドリア外膜透過を支配する。
Q10応答に関与するタンパク質を同定するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法を用いて、酸化ストレスおよび抗酸化防御にターゲットされた経路アレイに関与する遺伝子/タンパク質についてのmRNAのレベルの変化を同定した。
1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
5つの「phox」ユニット(Phoxは、食細胞オキシダーゼを表す。)
・P91−PHOX(ヘムを含有する)
・p22phox
・p40phox
・p47phox(NCF1)
・p67phox(NCF2)
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
SKMEL−28細胞を使用して、さらなる実験を行った。リアルタイムPCR法(RT−PCR)を使用して、100μM Q10によって処置されたSKMEL−28細胞中に存在するmRNAのレベルを未処置細胞のレベルと各種の時点にて比較した。PCRアレイ(SABiosciences)は、経路または疾患に焦点を合せた遺伝子ならびに適切なRNA品質管理のための、96ウェルプレートでの最適化リアルタイムPCRプライマアッセイのセットである。PCRアレイは、マイクロアレイのリアルタイムPCR感受性および多遺伝子プロファイリング能力を用いて遺伝子発現分析を遂行する。
・1つのRhoグアノシントリホスファターゼ(GTPアーゼ)、通常Rac1またはRac2(Racは、Rho関連C3ボツリヌス毒素基質を表す)
・5つの「phox」(食細胞オキシダーゼ)ユニット
P91−PHOX(ヘムを含有する)
p22phox
p40phox
p47phox(NCF1)
p67phox(NCF2)
別のNADPHオキシダーゼレベルが変化しないことに注目される。酵素は、スーパーオキシドを発生して、Ca(2+)依存性方式でH+チャネルとして機能する新規NADPHオキシダーゼである、NOX5である。
本実施例に記載した実験を遂行して、Q10が、複数の遺伝子に影響を有し、細胞の代謝状態を変更するであろうという仮説全体を試験した。100μM Q10によって処置したSKMEL−28細胞からのmRNAを糖尿病および関連経路に関与するターゲットタンパク質のパネルに対して評価した。本実験からの結果は、解糖経路およびインスリンプロセシングに関与する複数のタンパク質のmRNA発現レベルが改変されることを証明している(表14にまとめる)。
Q10の存在によるタンパク質濃度の評価を、抗体マイクロアレイ法の利用によって評価した。マイクロアレイは、700超のタンパク質の抗体を含有し、広範囲のタンパク質タイプおよび潜在的な経路マーカーをサンプリングした。
抗体マイクロアレイ(Panorama XP725抗体アレイ,Sigma)を利用して700超のタンパク質抗体をスクリーニングし、50μM Q10によって24時間処置されたSK−MEL−28細胞におけるタンパク質濃度レベルの変化を影響評価した。
ウェスタンブロットおよび2次元ゲル電気泳動によって処理および評価された第1の実験を皮膚癌株化細胞SKMEL−28に対して行った。本実験セットは、50または100μM Q10によって3、6、12、および24時間処置されたSK−MEL−28細胞を包含していた。
100uM Q10によって処置された試料に、処置後の各種の時間に糖尿病アレイを実行した。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表23に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABCC8、ACLY、ADRB3、CCL5、CEACAM1、CEBRA、FOXG1、FOXP3、G6PD、GLP1R、GPD1、HNF4A、ICAM1、IGFBP5、INPPL1、IRS2、MAPK14、ME1、NFKB1、PARP1、PIK3C2B、PIK3CD、PPARGC1B、PRKAG2、PTPN1、PYGL、SLC2A4、SNAP25、HNF1B、TNRFSF1A、TRIB3、VAPA、VEGFA、IL4RおよびIL6。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料について血管形成アレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表24に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:AKT1、ANGPTL4、ANGPEP、CCL2、CDH4、CXCL1、EDG1、EFNA3、EFNB2、EGF、FGF1、ID3、IL1B、IL8、KDR、NRP1、PECAM1、PROK2、SERPINF1、SPHK1、STAB1、TGFB1、VEGFA、およびVEGFB。
処理後の様々な時点において100μM Q10で処理された試料についてアポトーシスアレイが実行された。実験は本質的に上記のように実施された。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表25に要約される。これらの結果は、以下の遺伝子がQ10処理によって調節されることを示した:ABL1、AKT1、Bcl2L1、BclAF1、CASP1、CASP2、CASP6、CIDEA、FADD、LTA、TNF、TNFSF10A、およびTNFSF10。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9−11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表26において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。結果は、遺伝子PPARGC1A、PRKAA1、およびSNAP25の各々が処理の16時間後に下方調節されたことを示した(それぞれ、約20倍、6倍、および5倍)。処理後48時間において、PPARGC1AおよびPRKAA1は正常化され、またはわずかに上方調節されたのに対して、SNAP25は約2倍下方調節された。
HepG2(肝臓癌)細胞は、24時間ビヒクルと、または様々な時間の間100μM Q10のいずれかで処理された。処理は、PaCa2細胞において利用された手順に従って(上記、実施例9−11)、ウェルあたり1×105細胞で開始された。しかし、これらのサンプルから抽出されたRNAの総量は、予測されたものよりも低かった。逆転写は、通常、1μgの総RNA(260nmにおける測定によって決定される)を使用して行われる。逆転写あたりに使用できる最大量は8μlである。RNA濃度が低いので、ビヒクル、ならびに16時間および48時間Q10処理された試料を使用するRT−PCRアレイ分析が、0.44μgのRNAを使用して実施された。これらのアレイは、以下の表27において要約されるように、100μM Q10処理を用いる、HepG2遺伝子調節における傾向およびパターンの初期の分析を提供した。Q10処理に際して調節されることが見い出された様々な遺伝子が以下の表27に要約される。結果は、遺伝子ANGPTL3、ANGPTL4、CXCL1、CXCL3、CXCL5、ENG、MMP2、およびTIMP3の各々が処理の16時間後に上方調節されたことを示した(それぞれ、対照のそれよりも、約5.5倍、3倍、3倍、3.2倍、3倍、3倍、1倍、および6.5倍、6倍および5倍)。ID3は、Q10処理の16時間後に、対照の約5倍下方調節された。処理の48時間後に、ANGPTL3、CXCL1、CXCL3、ENG、およびTIMP3はまだ上方調節されたのに対して(それぞれ、対照よりも約3.5倍、1.5倍、3.175倍、2倍、および3倍)、ANGPTL4、CXCL5、ID3、およびMMP2は、対照よりも、それぞれ、約1倍、1倍、2倍、および18倍下方調節された。
実施例14:肝臓癌(HEPG2)細胞上のPCRアポトーシスアレイ
アポトーシスアレイは、上記のように、16時間および48時間、100μM Q10で処理された試料について実行された。しかし、48時間のアレイは、SYBRの代わりに蛍光団としてFAMを選んで実行された。FAMとSYBRの両方は同じ波長で蛍光を発する。
選択されたエピシフター、例えば、CoQ10が代謝性障害、例えば、糖尿病を処置することが可能か否かを決定するために、インスリン刺激されたグルコースの取り込みの増加をインビトロで監視する細胞ベースのアッセイが利用される。特に、分化したマウス脂肪細胞が、放射活性グルコースのシンチレーション計数によって検出されるのと同様に(例えば、Perkin Elmer 1450 Microbeta JET readerを使用する)、インスリン刺激の際にグルコース取り込みが増加する能力を有する薬剤を同定するために使用される。これらのアッセイは以下のように実施される。
Prees培地
「Prees」培地とも呼ばれるPrees Media Complete培地は以下のように調製される。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)は、L−グルタミン、ペニシリン−Gおよびストレプトマイシン(pen/strep)、および熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)(65℃で30分間熱不活化)で補充される。 血清は細胞の成長、接着および分化に影響を与え得るので、任意の新たなロットの血清は使用前に最初に試験された。指示色素の赤色/オレンジ色によって示されるように、pHが適正な範囲内(約7)になるまで、培地はインキュベーター(5% CO2)中で平衡化された。培地がピンク色になる場合(高pHを示す)、基礎条件が細胞に影響を与え、分化培地−1(DM1)および分化培地−2(DM2)において使用されるインスリンを変性させる可能性があるので、本発明者らは培地を廃棄した。
分化培地1(DM1)は、10% FBS、L−グルタミン、pen/strep、IBMX(375μM)、インスリン(120nM)、およびデキサメタゾン(188nM)を補充することによって調製された。分化培地2(DM2)は、10% FBSを有するDMEM、L−グルタミン、pen/strep、およびインスリン(120nM)を補充することによって調製された。
細胞培養プレートは以下のようにゼラチン処理される。ゼラチン(蒸留水中1% w/v)は、オートクレーブされ、室温で保存された。各細胞培養ウェルの底はゼラチン溶液で均一に覆われ、泡が形成されていないことを確実にした。この溶液は除去され、ゼラチンの薄膜を残した。これらのプレートは、組織培養フードの下に放置して乾燥させる。次に、プレートはPBSで洗浄され、その後、0.5%グルタル酸ジアルデヒド溶液(蒸留水中グルタルアルデヒド)が細胞培養ウェルに加えられた。10分後、ウェルはpen/strepを含むDMEMで2回洗浄される。各洗浄工程は、約5分間続くべきである。
3T3−L1プレ脂肪細胞は、およそ2〜3日毎に、または約60%のコンフルエンスに到達した際に分けられる。過度のコンフルエンスは、これらの細胞が脂肪細胞に分化する能力に影響を与える可能性がある。
D−(+)グルコース(「コールド」グルコース、放射性標識されていない)が、10mMの最終濃度までDPBSミックスに加えられた。
プレ脂肪細胞3T3−L1細胞は、約5000細胞/ウェルの密度でプレートされる(黒色NUNC96ウェルプレート中)。これらの細胞は、2つの別々の工程で脂肪細胞に分化される。最初に、細胞は、分化培地−1(DM1)中で、2〜3日間の間培養される(脂肪細胞分化の1日目)。DM1は、増殖を妨害し、脂肪細胞特異的遺伝子の発現を誘導する。次に、細胞は分化培地−2(DM2)中で3〜4日間培養され、その後、培養培地は新鮮なDM2によって置き換えられる。グルコース取り込みアッセイは、分化の9〜15日目に実施される。
潜在的なMIMとしての候補分子(例えば、環境影響因子)を評価するために、選択された候補MIMが、疾患(癌)細胞系統と正常対照細胞系統の両方を含む細胞系統のパネルに外因的に加えられ、パネル中の各細胞系統の細胞微少環境プロフィールに対して誘導された変化が評価される。例えば、mRNAおよびタンパク質のレベルを含む、細胞形態学、生理学、および/または細胞組成に対する変化が評価され、正常細胞との比較と同様に、疾患細胞について比較される。
対照細胞系統(ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)およびいくつかの皮膚癌細胞系統(非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルのコエンザイムQ10で処置された。癌細胞系統は、対照細胞系統と比較したときに、用量依存的応答の変化を示し、癌細胞においてのみ、アポトーシスおよび細胞死の誘導を伴った。詳細な例示的な実験は、例えば、本明細書の実施例3に提示される。
対照細胞系統(例えば、ケラチン形成細胞およびメラニン形成細胞の初代培養)および癌細胞系統(例えば、非転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−28;転移性皮膚黒色腫であるSK−MEL−2;または扁平上皮細胞癌であるSCC;膵臓癌細胞系統であるPaCa2;または肝臓癌細胞系統であるHEP−G2)からなる皮膚細胞系統のパネルが様々なレベルの候補エピシフターで処置された。細胞形態学/生理学の変化は、候補エピシフターに対する細胞の感受性およびアポトーシス性応答を調べることによって評価される。これらの実験は、実施例3に詳細に記載されるように実行される。手短に述べると、候補エピシフターに対する細胞系統の感受性は、様々な時間、および適用される濃度の範囲にわたって細胞生存を監視することによって評価される。候補エピシフターに対する細胞系統のアポトーシス性応答は、例えば、フローサイトメトリー方法論と組み合わせたネキシン試薬を使用することによって評価される。ネキシン試薬は、2種の染料、7AADおよびアネキシン−V−PEの組み合わせを含み、初期および後期のアポトーシスにおける細胞集団の定量化を可能にする。例えば、Apostrand(商標)ELISA方法論を使用する、一本鎖DNAを測定するさらなるアポトーシスアッセイが使用されてもよい。疾患および対照の細胞系統の感受性およびアポトーシス性応答が評価および比較される。候補エピシフターは、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的に細胞増殖を阻害するそれらの能力に基づいて評価される。候補エピシフターはさらに、正常または対照細胞と比較された場合に、癌細胞において優勢にまたは選択的にアポトーシスを誘導するそれらの能力に基づいて評価される。
ビタミンD3、すなわち、1α、25−ジヒドロキシビタミンD3(カルシトリオールとしてもまた知られる)は、ビタミンDから2段階酵素プロセスによって合成されるビタミンD代謝物である。ビタミンD3はその遍在性核ビタミンD受容体(VDR)と相互作用し、カルシウムおよびリン酸の恒常性ならびに細胞分裂および分化に関与する遺伝子の広範なスペクトルの転写を調節する。ビタミンD3は、扁平上皮細胞癌、前立腺腺癌、卵巣癌、乳癌、および肺癌を含む多数のモデル系において抗癌効果を有することが報告されている(Deeb et al.2007 Nature Reviews Cancer 7:684−700に概説されている)。
過去50年にわたって、悪性形質転換の根底にある原因としての特定のプロセスに影響を与える内因性/外因性因子に関わりがある膨大な量の情報が生じてきた。臨床的および基礎的文献は、DNA構造および機能の変化が、癌を遺伝病として規定する、癌の開始および進行において顕著な役割を果たすという証拠を提供している(Wooster,2010;Haiman,2010)。1920年代初頭、発癌の病因論の根本的な変化を特徴付けることに従事していたOtto Warburgおよび他の研究者は、2つの主要な観察(a)Warburg効果としてもまた知られる、酸素の存在下でのエネルギー産生のためのATPの生成においてグルコースを輸送および利用する細胞の能力、ならびに(b)ミトコンドリアATPの産生の減少に導く電子伝達の変化を含む、ミトコンドリアの構造および機能の変動を記述した。過去数年間は、癌の病因論、すなわち、癌を転移性疾患として見ることにおける細胞バイオエネルギーの中心的な役割を調べることの復活であった。
本明細書に提示されるデータは、コエンザイムQ10を用いた正常および癌細胞の処置が、解糖−ミトコンドリア酸化ストレス連続体の中で重要な生化学的末端を調節するタンパク質の発現の変化に関与することを実証する。ウェスタンブロッティングおよび酸素消費によるタンパク質発現の評価を説明するデータの組み合わせは、正常細胞において、コエンザイムQ10の曝露後に、正常な解糖およびミトコンドリア速度の有意な変化がないことを実証する。したがって、正常細胞系統、例えば、HDFa(正常ヒト成体線維芽細胞)、HASMC(正常ヒト大動脈平滑筋細胞)、nFib(正常線維芽細胞)、およびHeKa(正常ヒトケラチン生成細胞)におけるタンパク質の発現の値およびミトコンドリア呼吸速度は、ベースライン生理学的状態を表すと見なすことができる。癌細胞系統、例えば、HepG2(肝臓癌)、PaCa−2(膵臓癌)、MCF7(乳癌)、SK−MEL(黒色腫)、およびSCC−25(扁平上皮細胞癌)におけるタンパク質の発現およびミトコンドリア呼吸速度の何らかの逸脱は、この場合は、癌における疾患の開始/進行に起因する変化を表す。実験的証拠は、癌細胞に対するコエンザイムQ10の曝露が、正常細胞を彷彿とさせる細胞の病態生理学的再組織化と関わりがあるという仮説に対するサポートを提供する。具体的には、本明細書に提供されるデータは、癌細胞中でのコエンザイムQ10曝露は、正常細胞において観察される細胞構造に対する、細胞構造の全体的な再組織化の誘導の原因である、解糖経路におけるシフトおよびミトコンドリアの酸化的リン酸化と関わりがあることを実証する。
ウェスタンブロット実験1
実験のために使用された細胞はHDFa細胞およびMCF−7細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。全細胞ペレットが1mLのC7緩衝液中で一度に再懸濁され、ラベルされた15mLチューブに移された。次いで、試料は、低温室にて、氷上で、番号14の設定で6回の超音波パルスを使用して超音波処理された。超音波処理後、試料は2500gで短時間遠心分離し、試料は2mlチューブに移された。50mL試料チューブに残っている泡を使用して、各試料のpHが確認された(pHは9.0であるはずである)。
転写後、各ブロットは、2枚のWhatman濾紙の間に配置され、15−20分間乾燥された。乾燥後、ブロットは、日付、試料の型、およびブロット1かブロット2のいずれかをHB鉛筆でラベルされた。分子量マーカーは、鉛筆で輪郭が描かれ、1本線は青色であり、2本線は着色マーカーであった。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で1時間室温でブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。ブロット1は5% BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)でプローブされ、ブロット2は、振盪しながら4℃で一晩のインキュベーションによって、1:1000希釈の5% BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)を用いた。一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。次いで、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
この実験において使用された細胞は、SKMEL28、SCC−25、nFib、およびHekaであり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の3、6、および/または24時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4−12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
転写後、ブロットは15−20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、5% BSAを有するTBST中のIDH1に対する一次抗体(Cell Signaling番号3997)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。IDH1に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄された。次いで、これは、1:1000希釈の5% BSA中のATPクエン酸リアーゼについてのウサギポリクローナル抗体(Cell Signaling番号4332)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ATPクエン酸リアーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
異なる4つの細胞系統におけるアクチンレベル
ATPクエン酸リアーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のアクチンに対する抗体(Sigma カタログ番号A5316、クローンAC−74)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。アクチンに対する一次抗体との1時間のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
この実験において使用された細胞は、HepG2細胞、HASMC細胞、およびPACA2細胞であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の48時間後に収穫された。この実験において(ウェスタンブロット実験3)、および本実施例において以下に記載される実験のすべてにおいて(すなわち、ウェスタンブロット実験4〜9)、細胞は、5mM グルコース(「5G」)または22mM グルコース(「22G」)のいずれかでさらに処置された。細胞に由来する試料は処理され、そして上記のように4−12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンのレベルは、本質的に、上記のように、IDH1、ATPクエン酸リアーゼ、およびアクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
この実験において使用された細胞はHepG2であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。試料は、上記のように、処理され、4−12% Bis−Tris Novex NuPAGEゲル上で泳動された。ゲルは、本質的に上記のように、泳動され、転写され、そして染色された。
転写後、各ブロットは15−20分間乾燥され、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。次いで、このブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で、室温で1時間ブロッキングされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、5% BSA中の乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体(abcam ab2101;ポリクローナル)(1:1000希釈)を用いて、振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによってプローブされた。乳酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、ブロットは、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(ウサギ抗ヤギ;1:10,000希釈)を用いて、室温で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とともにインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
乳酸デヒドロゲナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:500希釈の5% BSA中のピルビン酸キナーゼM2に対するウサギポリクローナル抗体(NOVUS BIOLOGICALS カタログ番号H00005315−D01P)で、振盪しながら、室温で1時間プローブされた。ピルビン酸キナーゼM2に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ピルビン酸キナーゼブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。抗体が剥がされたことおよびECF試薬が働いたことを確認した後、ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:5000希釈の5% BSA中のピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体(ABNOVA カタログ番号H00005162−M03)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。ピルビン酸デヒドロゲナーゼに対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼブロットは、本質的に上記のように、剥がされ、次いで、アクチンについて再プローブされた。
この実験において使用された細胞はMIAPACA2(PACA2)であり、これらは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。PACA2試料は、本質的に上記のように、処理され、そしてゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
LDHおよびPDHのレベルは、本質的に上記のように、LDHおよびPDHに対する一次抗体でブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
ブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。2つのブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5% BSA中のカスパーゼ3に対する抗体(Santacruz Biotechnology番号sc7272、1:200希釈)で、振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
このウェスタンブロット実験において使用された細胞はPC−3、HepG2、MCF−7、HDFa、およびPACA2であり、これらは、2コエンザイムQ10 IV製剤で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24時間後に収穫された。本質的に上記のように、試料は処理され、ゲルは泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
カスパーゼ3およびアクチンのレベルは、本質的に上記に記載されるように、カスパーゼ3およびアクチンに対する一次抗体を用いて、ブロットを連続的にプローブすることによって決定された。
この実験において使用された細胞はヒト大動脈平滑筋(HASMC)細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HASMC試料は処置され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、1:200希釈の5% BSA中のHif 1α、カスパーゼ3、またはPDHBに対する抗体で、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩プローブされた。Hif 1αに対する一次抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は、5% BSA中で1:500希釈であった。カスパーゼ3に対する一次抗体(Santacruz sc7272;抗ウサギ)は、5% BSA中で1:200希釈であった。ピルビン酸デヒドロゲナーゼβ(PDHB)に対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は、5% BSA中で1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(PDHB抗マウス;Hif 1a、およびカスパーゼ3抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、各ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、TBS−T中の5% BSA中のPKM2、SDHB、またはSDHCに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。SDHCに対する一次抗体(ABNOVA H00006391−M02;抗マウス)は1:500希釈であった。SDHBに対する一次抗体は、Abcam ab4714−200から;抗マウス;1:1000希釈であっった。ピルビン酸キナーゼM2(PKM2)に対する一次抗体は、Novus Biologicals H00005315−D0IPから;抗ウサギ;1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(SDHB&C 抗マウス;およびPKM2 抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは完全な剥がしについてチェックするためにレーザースキャナーでスキャンされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5% BSA中のLDHまたはBikに対する一次抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。LDHに対する一次抗体はAbcam ab2101から;抗ヤギ;1:1000希釈であった。Bikに対する一次抗体は、Cell Signaling番号9942から;抗ウサギ;1:1000希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(LDH抗ヤギ;Jackson LaboratoriesおよびBik抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
使用された細胞はHepG2細胞であり、これは、2つの異なる濃度、50μMおよび100μMでコエンザイムQ10で処置されるかまたは処置されず、そして処置の24または48時間後に収穫された。本質的に上記のように、HepG2試料は処理され、ゲルは、泳動され、転写され、染色され、そしてスキャンされた。
アクチンのレベルは、本質的に上記のように、アクチンに対する一次抗体でブロットをプローブすることによって決定された。
アクチンブロットが、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、5% BSA中のカスパーゼ3またはMMP−6に対する抗体で、穏やかに振盪しながら、インキュベーションにより、4℃で一晩プローブされた。カスパーゼ3に対する一次抗体(Abcam ab44976−100;抗ウサギ)は5% BSA中1:500希釈であった。MMP−6に対する一次抗体(Santacruz scMM0029−ZB5;抗マウス)は5% BSA中1:100希釈であった。一次抗体との一晩のインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、室温にて1時間、二次抗体(MMP−6 抗マウス;カスパーゼ3 抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪を伴う、5% BSA中または5% ミルク中のLDHに対する一次抗体とのインキュベーションによって、4℃で一晩プローブされた。LDH 080309b1に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5% BSA中1:1000希釈であった。LDH 080309b2に対する一次抗体(Abcam ab2101;抗ヤギ)は5% ミルク中1:1000希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、二次抗体(Jackson Immuno Research 抗ヤギ;1:10,000希釈;305−055−045)で1時間プローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5% BSA中のトランスアルドラーゼまたはHif1aに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する抗体(Abcam ab67467;抗マウス)は1:500希釈であった。Hif1aに対する抗体(Abcam ab2185;抗ウサギ)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗マウスまたは抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5% BSA中のIGFBP3またはTP53に対する一次抗体で一晩プローブされた。IGFBP3に対する一次抗体(Abcam ab76001;抗ウサギ)は1:100希釈であった。TP53に対する一次抗体(Sigma Aldrich AV02055;抗ウサギ)は1:100希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ウサギ;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
上記のブロットは、メタノールと30分間インキュベートされ、続いて2回のTBS−Tを用いる10分間の洗浄、次いで50℃のストリッピング緩衝液との30分間のインキュベーション、続いて、100ml以上のTBS−Tを用いる各30分間の2回の洗浄によって剥がされた。ブロットは、メタノールで5秒間活性化され、水で5分間、そしてTBSTで15分間洗浄された。ブロットは、TBS−T中の5%ブロッキング試薬で室温で1時間ブロックされ、次いで、TBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、そして、穏やかに振盪しながら、4℃で一晩のインキュベーションによって、5% BSA中のトランスアルドラーゼまたはPDHBに対する一次抗体で一晩プローブされた。トランスアルドラーゼに対する一次抗体(Santacruz sc51440;抗ヤギ)は1:200希釈であった。PDHBに対する一次抗体(Novus Biologicals H00005162−M03;抗マウス)は1:500希釈であった。一次抗体とのインキュベーション後、膜はTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、旋回角度可変シェーカー上で、室温にて1時間、二次抗体(抗ヤギまたは抗マウス;1:10,000希釈)でプローブされた。二次抗体との1時間のインキュベーション後、ブロットはTBS−T(1×−15’;2×各5’)で3回洗浄され、次いで、5分間、ECF試薬とインキュベートされ、次いで、各ブロットは、5100 Fuji Laserスキャナーで、25μM解像度、16ビット、緑色レーザー、400V、および500Vでスキャンされた。
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−1−(IDH−1)は、ミトコンドリア基質の中に通常存在するTCA回路の一部である酵素の1つである。しかし、IDH1は、イソクエン酸からα−ケトグルタル酸への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、2段階工程で二酸化炭素を生成する細胞質ゾル型の酵素である。IDH1は、細胞質ゾルおよびペルオキシソームに存在するNADP+依存性型である。IDH1はSer113リン酸化によって不活性化され、クエン酸回路がないものを含む多くの種において発現される。IDH1は、部分的にHIF−1の活性化を通して、不活性化が腫瘍形成に寄与する腫瘍抑制因子として通常は機能しているようである(Bayley 2010;Reitman,2010)。最近の研究は、膠芽細胞腫の病因学におけるIDH1の不活性化変異に関わっている(Bleeker,2009;Bleeker,2010)。
ATPクエン酸リアーゼ(ACL)は、細胞質ゾル中でアセチル−CoAおよびオキサロ酢酸の形成を触媒するホモテトラマー(〜126kd)酵素である。この反応は、糖生成と同様に、脂肪酸、コレステロール、およびアセチルコリンの生合成のための最初の非常に重要なステップである(Towle et al.,1997)。栄養およびホルモンがこの重要な酵素の発現レベルおよびリン酸化状態を調節している。AktおよびPKAによるACLのSer454リン酸化が報告されている(Berwick.,DC MW et al.,2002;Pierce MW et al.,1982)。
ピルビン酸キナーゼは、解糖経路に関わる酵素である。これは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸の転移の原因であり、ATPおよびピルビン酸を生成する。PKM2は、解糖のピルビン酸キナーゼのアイソザイムであり、その発現は組織の代謝機能によって特徴付けられ、すなわち、M2アイソザイムは、胚細胞などの高いエネルギーの必要性を伴う正常細胞を迅速に増殖させる際に発現され、高い率の核酸合成を必要とする肺細胞および膵島細胞などの少数の分化した正常細胞においてもまた発現される。PKM2は、細胞のエネルギーの要求に合致するために解糖経路に対するそれらの依存性に起因して、腫瘍細胞中で高度に発現されている。通常は胚に限定されていると考えられているPKM2アイソフォームは、癌性細胞中で再発現されている。PKM2を発現する細胞は、より強力な好気性解糖表現型を好み(代謝表現型のシフトを示す)、乳酸産生の増加および酸化的リン酸化の減少を伴う。したがって、癌細胞におけるPKM2の発現の減少は、解糖経路を経由してエネルギー生成をシフトまたは下方調節し、これは、癌の処置において有用であるストラテジーである。データは、正常細胞および癌細胞におけるPKM2の変動する発現パターンを実証し、癌細胞は正常と比較してより高いレベルの発現を実証する。コエンザイムQ10での細胞の処置は、正常細胞および癌細胞において、PKM2のより上側のおよびより下側のバンドレベルの発現パターンを変化させた。試験された癌細胞においてPKM2発現の用量依存的な減少が存在し、および癌細胞において大きな変化は観察されなかった。結果は以下の表37〜39に要約される。
LDHは、NADH およびNAD+の同時相互変換を伴う、ピルビン酸および乳酸の相互交換を触媒する酵素である。これは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を負担して、還元当量の生成およびATP生成のための低い細胞酸素の緊張の下で、ピルビン酸をラクテート(乳酸)に転換する能力を有する。癌細胞は、典型的には、ATPおよび還元当量および還元ミトコンドリアOXPHOSを生成するために解糖流入を維持するためにLDHの発現の増加を実証する。したがって、癌細胞における還元当量は、TCA回路にピルビン酸が入ることを容易にするための乳酸の生成から代謝をシフトする。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌における乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現を減少させ、これは正常細胞においては最小の効果を伴うものであり、細胞質ピルビン酸から乳酸への転換を最小化することによって、解糖からミトコンドリアOXPHOSへのATPの生成のための癌細胞の生体エネルギーのシフトを誘発する際のコエンザイムQ10の役割を支持する。結果は以下の表40〜42に要約される。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ(PDH−E1)は、ピルビン酸をアセチルCoAに転換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の一部である第1の酵素成分である。PDH−E1は、その活性のためにチアミンをコファクターとして必要とし、ミトコンドリアにおけるTCAサイクルに入るためにピルビン酸からアセチルCoAへの転換のために必須であるPDC複合体における最初の2つの生化学反応を実施する。したがって、癌細胞におけるPDH−E1の発現の増加に伴って、同時に起こるPKM2およびLDHの発現の減少は、ATPの生成のためにミトコンドリアOXPHOSを増強することに向けてピルビン酸が入ることの速度を増強する。データは、正常細胞および癌細胞系統におけるPDH−E1の発現のために、この酵素のベースライン発現が、正常細胞と比較して、癌細胞で減少されていることを示す。コエンザイムQ10を用いる処置は、癌細胞におけるPDH−E1タンパク質の発現の進行的な増加に関連し、正常細胞においては最小限の変化を伴う。結果は以下の表43〜45に要約される。
アポトーシスの開始の制御は、しばしば、開始因子のカスパーゼである、カスパーゼ−2、−9、および−8/10のレベルで発揮される。外部のアポトーシスの経路において、カスパーゼ−8は、一旦活性になると、実行因子のカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−3)を直接切断し、活性化する。活性型カスパーゼ−3は、他のカスパーゼ(6、7、および9)ならびに細胞中の関連する標的(例えば、PARPおよびDFF)を活性化する。これらの研究において、エフェクターカスパーゼ−3タンパク質のレベルは、コエンザイムQ10に応答して、癌細胞系統および正常細胞系統において測定された。アポトーシスの制御は開始因子カスパーゼを通してであり、その代わりに、多数のシグナル伝達経路が、エフェクターカスパーゼの直接阻害を通してアポトーシスシグナルの伝達を遮断することが注目されるべきである。例えば、P38 MAPKは、カスパーゼ−3をリン酸化し、その活性を抑制する(Alvarado−Kristensson et al.,2004)。興味深いことに、同じ研究におけるタンパク質ホスファターゼ(PP2A)またはプロテインキナーゼCデルタ(PKCデルタ)の活性化(Voss et al.,2005)は、カスパーゼ−3活性化を増幅し、そしてアポトーシスシグナルの伝達を強化するように、p38 MAPKの効果と反対に作用できる。それゆえに、カスパーゼ−3活性化のレベルにおける事象またはカスパーゼ3活性化後の事象は、いくつかの場合において細胞の究極の運命を決定するかもしれない。
コハク酸−コエンザイムQ還元酵素としてもまた知られるコハク酸デヒドロゲナーゼは、TCAと電子伝達系の両方に関わるミトコンドリア内膜の複合体である。TCAにおいては、この複合体は、ユビキノンからユビキノールへの同時に起こる還元に伴って、コハク酸からフマル酸への酸化を触媒する(Baysal et al.,Science 2000;およびTomlinson et al.,Nature Genetics 2002)。SDHのB、C、およびDサブユニットにおける生殖系列突然変異は、家族性傍神経節腫または平滑筋腫の開始事象であることが見い出された(Baysal et al.,Science 2000)。
低酸素誘導因子(Hif)は、αおよびβサブユニットから構成される転写因子である。酸素正常状態下では、Hif1αのタンパク質レベルは、翻訳後事象の結果を介するその連続的な分解により、非常に低い。解糖と酸化的リン酸化の間のシフトは、一般的には、ピルビン酸の異化的な運命を決定する2つの酵素PDHおよびLDHの相対的な活性によって制御されると考えられる。Hifは、PDKを刺激することによって、LDHレベルを誘導し、PDH活性を阻害することによって、この決定的な分岐(bifurgation)点を制御する。ミトコンドリアから細胞質ゾルにピルビン酸代謝を迂回させるこの能力により、Hifは、癌細胞における生体エネルギーのスイッチの決定的な媒介因子であると考えられる。
この実施例は、ストレッサー(例えば、高血糖、低酸素、乳酸)の非存在下および/または存在下で、本発明の代表的なMIM/エピシフター−CoQ10−による処置への細胞の曝露が、正常な生理学的条件下での正常細胞において観察される値を代表する解糖/乳酸生合成およびミトコンドリア酸化的リン酸化(ECARおよびOCR値によって測定されるような)へのシフトと関連することを実証する。
・腫瘍の血管形成
・細胞周期のターンオーバーを制御する停止メカニズムの活性化の増加
・免疫監視に対する細胞の回避システムを容易にする免疫調節メカニズム
・解糖流入および乳酸利用への依存性を増加する代謝制御エレメント
・発癌性を増加させるように働く、Bcl−2、IAP、EndoG、AIFなどの重要なアポトーシス遺伝子ファミリーの異常調節。
この実施例は、CoQ10生合成の特定の前駆体、例えば、ベンゾキノン環の生合成のためのもの、およびイソプレノイド反復の生合成のためのもの、ならびにベンゾキノン環へのそれらの付属物(「ビルディングブロック成分」)が、単独で投与でき、もしくは標的細胞と組み合わせて投与でき、ならびにアポトーシス阻害剤Bcl−2の下方調節、および/またはアポトーシス促進因子カスパーゼ−3の上方調節をもたらすことを実証する。特定の前駆体またはそれらの組み合わせは、細胞増殖もまた阻害し得る。データは、CoQ10投与と実質的に同じ結果を達成するために、CoQ10前駆体がCoQ10の代わりに使用されてもよいことを示唆する。
コエンザイムQ10は、酸化的リン酸化に直接的に影響を与えることによって正常なミトコンドリア機能の維持において確立された役割を有する内因性分子である。糖尿病などの代謝性障害の重要な指標として治療の終点を示す様式で働く細胞内標的を調節する際のコエンザイムQ10の能力を実証する実験的な証拠が提示されている。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HK−2 H維持された22mM グルコース;
・HK2(H)+50μM コエンザイムQ10;および
・HK2(H)+100μM コエンザイムQ10。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表66に列挙され、一方それらの機能は表67に含まれる。
糖尿病PCRアレイ(SABiosciences)は、同時に84種の遺伝子のスクリーニングを提供する。本研究において試験された4種の処置は以下の通りである。
・HASMC H維持された22mM グルコース;
・HASMC(H)+50μM コエンザイムQ10;および
・HASMC(H)+100μM コエンザイムQ10。
糖尿病におけるミトコンドリア遺伝子の示差的な発現は、ミトコンドリアアレイ(カタログ番号PAHS 087E、SABisociences Frederick MD)を使用してアッセイされた。慢性高血糖および/またはコエンザイムQ10処置によって調節された遺伝子は表69に示される。
当業者は、日常的な範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載された特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識し、またはそれを確認することが可能である。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含されることが意図される。
Claims (55)
- 被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在する、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されたマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現レベルを決定すること;ならびに
(2)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを、対照試料に存在するマーカーの発現レベルと比較すること
を含み、
ここで、対照試料中のマーカーの発現レベルと比較した、被験体から得られた生物試料中のマーカーの発現レベルの調節は、前記被験体が代謝性障害に罹患していることの指標であり、それによって、前記被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価する、前記方法。 - 被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、マーカーの発現は、細胞代謝エネルギーシフトが正常なミトコンドリアの酸化的リン酸化に向かうように誘導された代謝性障害の疾患細胞において調節されること;および
(2)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを、対照試料に存在するマーカーの発現レベルと比較すること
を含み、
ここで、対照試料中のマーカーの発現レベルと比較した、被験体から得られた生物試料中のマーカーの発現レベルの調節は、前記被験体が代謝性障害に罹患していることの指標であり、それによって、前記被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価する、前記方法。 - 被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在する、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されたマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現レベルを決定すること;ならびに
(2)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを、対照試料に存在するマーカーの発現レベルと比較すること
を含み、
ここで、対照試料中のマーカーの発現レベルと比較した、被験体から得られた生物試料中のマーカーの発現レベルの調節は、被験体が代謝性障害を発症する素因があることの指標であり、それによって、前記被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測する、前記方法。 - 被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、マーカーの発現は、細胞代謝エネルギーシフトが正常なミトコンドリアの酸化的リン酸化に向かうように誘導された代謝性障害の疾患細胞において調節されること;および
(2)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを、対照試料に存在するマーカーの発現レベルと比較すること
を含み、
ここで、対照試料中のマーカーの発現レベルと比較した、被験体から得られた生物試料中のマーカーの発現レベルの調節は、被験体が代謝性障害を発症する素因があることの指標であり、それによって、前記被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測する、前記方法。 - 被験体における代謝性障害を処置するための治療の有効性を評価する方法であって、
(1)被験体に対する処置レジメンの少なくとも一部を投与する前に被験体から得られた第1の試料に存在するマーカーであって、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現レベルを、
(2)処置レジメンの少なくとも一部の投与の後に被験体から得られた第2の試料に存在するマーカーの発現レベル
と比較することを含み、
ここで、第1の試料と比較した場合の第2の試料中のマーカーの発現レベルの調節は、治療が被験体における代謝性障害を処置するために有効であることの指標である、前記方法。 - 被験体における代謝性障害を処置するための治療の有効性を評価する方法であって、
(1)被験体に対する処置レジメンの少なくとも一部を投与する前に被験体から得られた第1の試料に存在するマーカーの発現であって、細胞代謝エネルギーシフトが正常なミトコンドリアの酸化的リン酸化に向かうように誘導された代謝性障害の疾患細胞において調節されるマーカーの発現のレベルを、
(2)処置レジメンの少なくとも一部の投与の後に被験体から得られた第2の試料に存在するマーカーの発現レベル
と比較することを含み、
ここで、第1の試料と比較した場合の第2の試料中のマーカーの発現レベルの調節は、治療が被験体における代謝性障害を処置するために有効であることの指標である、前記方法。 - 代謝性障害をその必要がある被験体において処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、この生物試料は環境影響因子化合物に曝露され、このマーカーは、正の倍率変化および/または負の倍率変化を有する表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択されること;
(2)被験体から得られた第2の生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、この試料は環境影響因子化合物に曝露されていないこと;ならびに
(3)環境影響因子化合物に曝露された生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルと、環境影響因子化合物に曝露されていない生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを比較すること
を含み、
(4)ここで、第2の試料中に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルと比較して、環境影響因子化合物に曝露された生物試料に存在する負の倍率変化を伴う1つ以上のマーカーの発現レベルの減少は、環境影響因子化合物が、代謝性障害を処置するためにそれが必要な被験体において有効であることの指標であり、そして、
第2の試料中に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルと比較して、環境影響因子化合物に曝露された生物試料に存在する正の倍率変化を伴う1つ以上のマーカーの発現レベルの増加は、環境影響因子化合物が、代謝性障害を処置するためにそれが必要な被験体において有効であることの指標であり、
それによって、代謝性障害を処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価する、前記方法。 - 代謝性障害をその必要がある被験体において処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、前記生物試料は環境影響因子化合物に曝露され、前記マーカーの発現は細胞代謝エネルギーシフトが正常なミトコンドリアの酸化的リン酸化に向かうように誘導された代謝性障害の疾患細胞において上方調節または下方調節されること;
(2)被験体から得られた第2の生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、この試料は環境影響因子化合物に曝露されていないこと;ならびに
(3)環境影響因子化合物に曝露された生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルと、環境影響因子化合物に曝露されていない生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを比較すること
を含み、
(4)ここで、第2の試料中に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルと比較して、環境影響因子化合物に曝露された生物試料中での1つ以上の下方調節されたマーカーの発現レベルの減少は、環境影響因子化合物が、代謝性障害を処置するためにそれが必要な被験体において有効であることの指標であり、そして、
第2の試料中に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルと比較して、環境影響因子化合物に曝露された生物試料に存在する1つ以上の上方調節されたマーカーの発現レベルの増加は、環境影響因子化合物が、代謝性障害を処置するためにそれが必要な被験体において有効であることの指標であり、
それによって、代謝性障害を処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価する、前記方法。 - 被験体における代謝性障害を処置するための化合物を同定する方法であって、
(1)被験体から生物試料を入手すること;
(2)その生物試料を試験化合物と接触させること;
(3)被験体から入手された生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、マーカーは、正の倍率変化および/または負の倍率変化を伴って、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されたマーカーからなる群より選択されること;
(4)生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを、試験化合物と接触されていない対照試料と比較すること;ならびに
(5)生物試料中に存在する負の倍率変化を伴う1つ以上のマーカーの発現レベルを減少する試験化合物、および/または生物試料中に存在する正の倍率変化を伴う1つ以上のマーカーの発現レベルを増加する試験化合物を選択すること
を含み、
それによって、被験体における代謝性障害を処置するための化合物を同定する、前記方法。 - 被験体における代謝性障害を処置するための化合物を同定する方法であって、
(1)被験体から生物試料を入手すること;
(2)その生物試料を試験化合物と接触させること;
(3)被験体から入手された生物試料に存在する1つ以上のマーカーの発現レベルを決定することであって、ここで、マーカーの発現は、細胞代謝エネルギーシフトが正常なミトコンドリアの酸化的リン酸化に向かうように誘導された代謝性障害の疾患細胞において上方調節または下方調節されること;
(4)生物試料中の1つ以上のマーカーの発現レベルを、試験化合物と接触されていない対照試料と比較すること;ならびに
(5)生物試料中で、1つ以上の下方調節されたマーカーの発現レベルを減少させ、および/または生物試料中で、1つ以上の上方調節されたマーカーの発現レベルを増加させる試験化合物を選択すること
を含み、
それによって、被験体における代謝性障害を処置するための化合物を同定する、前記方法。 - 代謝性障害が、糖尿病、肥満、前糖尿病、高血圧、心臓血管疾患、メタボリックシンドローム、および代謝性障害の任意の重要な構成要素からなる群より選択される障害である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが、被験体の疾患細胞において、正常化されたミトコンドリアの酸化的リン酸化に向けた細胞の代謝エネルギーシフトを選択的に誘発する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 試料が被験体から得られる流体を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 流体が血液、嘔吐物、唾液、リンパ液、および尿からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 試料が血液試料またはその成分である、請求項14に記載の方法。
- 試料が被験体から得られた組織またはその成分を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 組織が、骨、結合組織、軟骨、肺、肝臓、腎臓、筋肉組織、心臓、膵臓、および皮膚からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 生物試料中のマーカーの発現レベルは、試料中の転写されたポリヌクレオチドまたはその一部をアッセイすることによって決定される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 転写されたポリヌクレオチドをアッセイすることは、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む、請求項19に記載の方法。
- 被験体試料におけるマーカーの発現レベルは、試料中でタンパク質またはその一部をアッセイすることによって決定される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーは、マーカーと特異的に結合する試薬を使用してアッセイされる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 試薬が標識されている、請求項22に記載の方法。
- 試薬が、抗体および抗原結合性抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 試料中のマーカーの発現レベルが、前記試料の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅反応、逆転写酵素PCR分析、一本鎖コンホメーション多型分析(SSCP)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二重鎖分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション、アレイ分析、デオキシリボ核酸配列決定、制限断片長多型分析、およびこれらの組み合わせまたは下位組み合わせからなる群より選択される技術を使用して決定される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のマーカーの発現レベルが、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ELISA、および質量分析からなる群より選択される技術を使用して決定される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが、HNF4アルファ、Bcl−xl、Bcl−xS、BNIP−2、Bcl−2、Birc6、Bcl−2−L11(Bim)、XIAP、BRAF、Bax、c−Jun、Bmf、PUMA、cMyc、トランスアルドラーゼ1、COQ1、COQ3、COQ6、プレニルトランスフェラーゼ、4−ヒドロベンゾエート、好中球サイトゾル因子2、一酸化窒素シンターゼ2A、スーパーオキシドディスムターゼ2、VDAC、Baxチャネル、ANT、シトクロムc、複合体1、複合体II、複合体III、複合体IV、Foxo3a、DJ−1、IDH−1、Cpt1CおよびカムキナーゼIIからなる群より選択されるマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーがアポトーシスと関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが酸化ストレスと関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが熱ショックと関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが血管形成と関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが糖尿病と関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが高血圧と関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- マーカーが心臓血管疾患と関連するマーカーである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 複数のマーカーの発現レベルが決定される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体が、環境影響因子化合物、スルホニルウレア化合物、メグリチニド化合物、プランジン、ナテグリニド化合物、ビグアニド化合物、チアゾリジンジオン化合物、プレコース、シムリン、バイエッタ、DPP−IVインヒビター、およびインスリンからなる群より選択される治療で処置される、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 治療が環境影響因子化合物を含む、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 治療が、スルホニルウレア化合物を用いる処置、メグリチニド化合物を用いる処置、プランジンを用いる処置、ナテグリニド化合物を用いる処置、ビグアニド化合物を用いる処置、チアゾリジンジオン化合物を用いる処置、プレコースを用いる処置、シムリンを用いる処置、バイエッタを用いる処置、DPP−IVインヒビターを用いる処置、およびインスリンを用いる処置からなる群より選択される処置レジメンをさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
- 環境影響因子化合物が、多次元細胞内分子(MIM)またはエピメタボリックシフター(エピシフター)である、請求項36または37に記載の方法。
- 環境影響因子化合物がCoQ10である、請求項36または37に記載の方法。
- 環境影響因子化合物がビタミンD3である、請求項36または37に記載の方法。
- 環境影響因子化合物が、アセチルCoA、パルミチル、L−カルニチン、チロシン、フェニルアラニン、システイン、および小分子からなる群より選択される化合物である、請求項36または37に記載の方法。
- 環境影響因子化合物が、フィブロネクチン、TNFアルファ、IL−5、IL−12、IL−23、血管形成因子、およびアポトーシス因子からなる群より選択される化合物である、請求項36または37に記載の方法。
- 被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価するためのキットであって、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための試薬、および被験体が代謝性障害に罹患しているか否かを評価するためのキットの使用のための説明書を含む、前記キット。
- 被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測するためのキットであって、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための試薬、および被験体が代謝性障害を発症する素因があるか否かを予測するためのキットの使用のための説明書を含む、前記キット。
- 代謝性障害を処置するための治療の有効性を評価するためのキットであって、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための試薬、および代謝性障害を処置するための治療の有効性を評価するためのキットの使用のための説明書を含む、前記キット。
- 代謝性障害を有する被験体において代謝性障害を処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価するためのキットであって、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されるマーカーからなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための試薬、および代謝性障害を有する被験体において代謝性障害を処置するための環境影響因子化合物の有効性を評価するためのキットの使用のための説明書を含む、前記キット。
- 被験体から生物試料を入手するための手段をさらに含む、請求項44〜47のいずれか1項に記載のキット。
- 対照試料をさらに含む、請求項44〜48のいずれか1項に記載のキット。
- 少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための手段が、試料中の転写されたポリヌクレオチドまたはその一部をアッセイするための手段を含む、請求項44〜49のいずれか1項に記載のキット。
- 少なくとも1つのマーカーの発現レベルを決定するための手段が、試料中のタンパク質またはその一部をアッセイするための手段を含む、請求項44〜49のいずれか1項に記載のキット。
- 環境影響因子化合物をさらに含む、請求項44〜51のいずれか1項に記載のキット。
- 複数のマーカーの発現レベルを決定するための試薬を含む、請求項44〜52のいずれか1項に記載のキット。
- 被験体がCoQ10反応性状態に罹患しているか否かを評価する方法であって、
(1)被験体から得られた生物試料に存在する、表2〜4および6〜29および64〜69に列挙されたマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現レベルを決定すること;ならびに
(2)被験体から得られた生物試料に存在するマーカーの発現レベルを、対照試料に存在するマーカーの発現レベルと比較すること
を含み、
ここで、対照試料中のマーカーの発現レベルと比較された、被験体から入手された生物試料中のマーカーの発現レベルの調節は、被験体がCoQ10反応性状態に罹患していることの指標であり、それによって、被験体がCoQ10反応性状態に罹患しているか否かを評価する、前記方法。 - CoQ10反応性状態が代謝性障害である、請求項54に記載の方法。
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