JP2012502030A

JP2012502030A - 抗脂質抗体

Info

Publication number: JP2012502030A
Application number: JP2011526055A
Authority: JP
Inventors: ヘインズ，バートン・エフ; ムーディ，エム・アンソニー; リャオ，ホワ−シン
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2012-01-26
Also published as: WO2010027501A2; WO2010027501A3; EP2331133A2; WO2010027501A8; AU2009288619A1; EP2331133A4; WO2010027501A9; US20110318360A1; CA2736029A1

Abstract

本発明は、一般的に、抗脂質抗体に、そして特に、抗脂質（例えば抗リン脂質）抗体を用いて、ＨＩＶ−１感染を阻害する方法に関する。

Description

本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２００８年９月５日出願の米国仮出願第６１／１３６，４４９号、および２００８年１０月１０日出願の米国仮出願第６１／１３６，８８４号の優先権を請求する。

本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第Ｕ０１ＡＩ０６７８５４号のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

技術分野
本発明は、一般的に、抗脂質抗体に、そして特に、抗脂質（例えば抗リン脂質）抗体を用いて、ＨＩＶ−１感染を阻害する方法に関する。

Ｔ細胞および単核食細胞のＨＩＶ−１感染を強力に阻害するヒト抗体を利用する戦略の開発は、ＨＩＶ−１感染の治療および防止のため、高い優先度を持つ（Ｍａｓｃｏｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０３−１０１０７（２００５））。ｉｎｖｉｔｒｏで広くＨＩＶ−１を中和可能であり、そしてｉｎｖｉｖｏでＳＨＩＶ感染から非ヒト霊長類を防御可能である、ｇｐ１６０に対するいくつかの稀なヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が単離されてきている（Ｍａｓｃｏｌａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２０７−２１０（２０００）、Ｂａｂａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２００−２０６（２０００））。これらのｍＡｂには、ｇｐ４１の膜近位領域に対する抗体２Ｆ５および４Ｅ１０（Ｍｕｓｔｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６４２−６６４７（１９９３）；Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，ＡＩＤＳＲｅｓ．＆Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ．１７：１７５７−１７６５（２００１）、Ｚｗｉｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０８９２−１０９０５（２００１））、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対するＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４８２１−４８２８（１９９４））、ならびにｇｐ１２０高マンノース残基に対するｍＡｂ２Ｇ１２（Ｓａｎｄｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２９３−７３０５（２００２））が含まれる。

ＨＩＶ−１は、中和抗体から回避するためのいくつかの有効な戦略を発展させてきており、これには中和エピトープのグリカン遮蔽（Ｗｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ４２２：３０７−３１２（２００３））、中和抗体結合に対するエントロピーバリア（Ｋｗｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ４２０：６７８−６８２（２００２））、および非中和抗体による抗体反応のマスキングまたは転換（Ａｌａｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１１５−１２５（２００８））が含まれる。熱心な研究にもかかわらず、ｇｐ１２０ＣＤ４結合部位またはｇｐ４１の膜近位領域のいずれかに対して広く中和する抗体が、動物またはヒトのいずれにおいてもルーチンに誘導されないのはなぜであるかは謎のままである。

広く中和する抗体を誘導するのが困難であるのはなぜかに関する１つの手がかりは、上記ｍＡｂがすべて、珍しい特性を有するという事実の中に見出されうる。ｍＡｂ２Ｇ１２は、宿主グリコシルトランスフェラーゼによって合成され、そして修飾され、そしてしたがって、自己炭水化物と認識される可能性がある炭水化物に対するものである（Ｃａｌａｒｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１３３７２−１３３７７（２００５））。２Ｇ１２はまた、連結されたＶＨドメイン交換二量体に組み立てられるＦａｂを持つユニークな抗体でもある（Ｃａｌａｒｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：２０６５−２０７１（２００３））。２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、長いＣＤＲ３ループを持ち、そして宿主脂質を含む多数の宿主抗原と反応する（Ｚｗｉｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０８９２−１０９０５（２００１）、Ａｌａｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ｚｗｉｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３１５５−３１６１（２００４）、Ｓｕｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２８：５２−６３（２００８））。同様に、ＩｇＧ１ｂ１２もまた、長いＣＤＲ３ループを持ち、そしてｄｓＤＮＡと反応する（Ｈａｙｎｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｓａｐｈｉｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３：１１５５−１１５９（２００１））。これらの発見を、自己免疫疾患を持つ患者における臨床的ＨＩＶ−１感染が稀であるという知見（ＰａｌａｃｉｏｓおよびＳａｎｔｏｓ，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ＳＴＤＡＩＤＳ１５：２７７−２７８（２００４））と合わせると、広い反応性の中和抗体のいくつかの種は、免疫寛容機構による下方制御のために作製されないという仮説が生じた（Ｈａｙｎｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｈａｙｎｅｓら，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１４：５９−６７（２００５））。この仮説の帰結として、自己免疫疾患患者には、防御に相関するものとしてのある種の中和抗体を伴う「曝露され、そして感染していない」被験体がいる可能性がある（Ｋａｙ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．１１１：１５８−１６７（１９８９））。

この仮説を評価する手がかりは、ＨＩＶ−１感染性を阻害する、自己免疫疾患患者由来のヒト抗体の同定である。本発明は、少なくとも部分的に、ヒト・モノクローナル抗脂質抗体が、原発性抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＡＳ）および全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患患者から、ならびに健康な被験体由来のＰＢＬ抗体ライブラリーから単離可能であり、そしてこうした抗体が、ｉｎｖｉｔｒｏで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＨＩＶ−１感染性を阻害可能であるという立証から生じる。ＨＩＶ−１阻害性抗脂質抗体は、脂質へのβ２−糖タンパク質−１の結合を必要とせず、そしてＨＩＶ−１がターゲットＴ細胞と接触した４８時間後まで有効でありうる。こうした抗体は、ＰＢ単球、およびおそらく他の抗原提示細胞に結合し、そしてＣＣＲ５結合性ケモカイン、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ１−βを誘導することによって、ＣＣＲ５を利用する伝染したＨＩＶ−１株を広く中和するが、ＣＸＣＲ４を利用するＨＩＶ−１株を中和しない。このクラスの抗体が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養にＨＩＶ−１を添加した４８時間後に、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染性を阻害可能であり、そしてＲ５ウイルスにのみ作用することから、ＨＩＶ−１の伝染の防止の環境において、または曝露後の予防の環境においてのいずれかで、これらの抗体の療法剤としての有用性が立証される。

Ｍａｓｃｏｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０３−１０１０７（２００５））Ｍａｓｃｏｌａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２０７−２１０（２０００）Ｂａｂａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２００−２０６（２０００）Ｍｕｓｔｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６４２−６６４７（１９９３）Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，ＡＩＤＳＲｅｓ．＆Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ．１７：１７５７−１７６５（２００１）Ｚｗｉｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０８９２−１０９０５（２００１）Ｒｏｂｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４８２１−４８２８（１９９４）Ｓａｎｄｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２９３−７３０５（２００２）Ｗｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ４２２：３０７−３１２（２００３）Ｋｗｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ４２０：６７８−６８２（２００２）Ａｌａｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１１５−１２５（２００８）Ｃａｌａｒｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１３３７２−１３３７７（２００５）Ｃａｌａｒｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３００：２０６５−２０７１（２００３）Ａｌａｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１７８：４４２４−４４３５（２００７）Ｚｗｉｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３１５５−３１６１（２００４）Ｓｕｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２８：５２−６３（２００８）Ｈａｙｎｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０８：１９０６−１９０８（２００５）Ｓａｐｈｉｒｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３：１１５５−１１５９（２００１）ＰａｌａｃｉｏｓおよびＳａｎｔｏｓ，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ＳＴＤＡＩＤＳ１５：２７７−２７８（２００４）Ｈａｙｎｅｓら，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１４：５９−６７（２００５）Ｋａｙ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．１１１：１５８−１６７（１９８９）

本発明は、一般的に、抗脂質抗体に関する。より詳細には、本発明は、抗脂質（例えば抗リン脂質）抗体を用いて、Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法に関する。
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。

ＨＩＶ−１感染性を阻害する抗脂質ｍＡｂは、その脂質結合活性に関して、β−２−糖タンパク質１への結合に依存せず、一方、ＨＩＶ−１感染性を阻害しない抗脂質ｍＡｂは、その脂質結合活性に関して、β−２−糖タンパク質１への結合に依存する（左から右に：ＩＳ４、ＣＬ１、Ｐ１、１１．３１（ＰＧＮ６３２）、バビツキシマブ、Ｂ１、Ｂ２、１Ｎ１１（ＰＧＮ６３５）、３Ｊ０５（ＰＧＮ６３４）、陰性対照）。抗脂質ｍＡｂによるウイルス捕捉の欠如。一団のｍＡｂを捕捉し、そしてＨＩＶ−１ＢＧ１１６８ビリオンとインキュベーションした；ウイルス捕捉を、放出されたｐ２４のＥＬＩＳＡによって測定した。ｇｐ４１免疫優性領域に対するｍＡｂ７Ｂ２およびｇｐ１２０Ｖ３ループに対するｍＡｂＦ３９Ｆのみが、可溶性ＣＤ４誘発の非存在下で、ビリオンを捕捉した。抗ｇｐ１２０ＣＣＲ５結合部位ｍＡｂ１７ｂは、ＣＤ４誘発の存在下で捕捉可能であったが、この誘発がないと不可能であった。対照的に、抗脂質ｍＡｂはいずれも、このアッセイにおいて、ビリオンを捕捉しなかった。ＨＩＶ−１単離体ＳＦ１６２に関して、類似の結果が見られた（抗体Ｐ３は、マウス骨髄腫、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８０またはＣＲＬ−１５７９であり；抗体Ａ３２はＪａｍｅｓＲｏｂｉｎｓｏｎ／チューレーン大学によるヒト抗ＨＩＶ−１エンベロープである）。抗脂質ｍＡｂは、宿主細胞に結合することによって、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３またはＱＨ０６９２を阻害する。細胞添加前に、ｍＡｂとウイルスストックを１時間プレインキュベーションすることによって（白抜きポイントの曲線）、またはターゲット細胞と抗体を１時間インキュベーションした後、過剰な抗体を洗浄し、そして次いでウイルスストックを添加することによって（黒塗りポイントの曲線）のいずれかで、Ｂ．ＱＨ０６９２に対して試験する抗体ＩＳ４およびＣＬ１、ならびにＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３に対して試験するＰ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）をＰＢＭＣアッセイに添加した。試験したｍＡｂ各々に関して、阻害活性の有意な変化は見られず、この活性が主に、ターゲット細胞に対して向けられることが示唆された。図４Ａおよび４Ｂ。図４Ａ。植物性血球凝集素（ＰＨＡ）活性化ヒトＰＢＭＣへの抗脂質ｍＡｂの結合。ｍＡｂをＰＢＭＣと、そして次いで、ＦＩＴＣにコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧとインキュベーションし、そしてフローサイトメトリーによる間接的免疫蛍光においてアッセイした。図４Ｂ。ＨＩＶ−１ＭＮ感染Ｈ９ヒトＴ細胞は、増殖性ＨＩＶ−１感染を示す、抗ｇｐ１２０Ｖ３ｍＡｂＦ３９Ｆに結合した。ｍＡｂ２Ｆ５、４Ｅ１０、バビツキシマブ、および１１．３１（ＰＧＮ６３２）は、類似の効力で、生存感染細胞表面に結合した。ｍＡｂＰ１によって示される生存細胞結合は限定されており、そしてこれは、Ｐ１ｍＡｂがＨＩＶ−１感染性を阻害可能な抗脂質抗体のうち、効力が最も低いことと相関した。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ表面への１１．３１（ＰＧＮ６３２）の結合。脂質の表面染色のためコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）で、そしてフィコエリトリンで標識した１１．３１（ＰＧＮ６３２）で標識した、ＰＢＭＣを示す。１１．３１（ＰＧＮ６３２）ｍＡｂおよびＣＴＢのＰＢＭＣ細胞膜への同時局在を示す（矢印）。脂質の多様な多形型とプレインキュベーションすることによる、ＨＩＶ−１Ｂ．６５３５の阻害の遮断。ＰＢＳ、０．５ｍＭＤＯＰＥ（六方晶ＩＩ多形型）、または０．５ｍＭＣＬ（リポソーム型）とプレインキュベーションしたｍＡｂは多様な効果を示す。ｍＡｂＰ１およびＩＳ４は、脂質インキュベーションしても効力のわずかな（または最小限の）変化しか示さなかった。ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）は、ＤＯＰＥと反応させた際には、まったく影響を示さなかったが、ＣＬによっては、それぞれ１１倍および２００倍の減少で強く阻害された。Ｐ１は、ＤＯＰＥインキュベーションで穏やかな阻害を、そしてＣＬインキュベーションで中程度の増進を示した。したがって、ＣＬおよび１１．３１（ＰＧＮ６３２）ｍＡｂに関して、脂質の正しい多形型が見出された。これらのデータによって、ＩＳ４およびＰ１に対して、ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）の反応性に相違があることが示唆される。図７Ａおよび７Ｂ。ＩＲＢが認可したプロトコルに基づいて、米国赤十字（ＣａｒｏｌｉｎａｓＢｌｏｏｄＳｅｒｖｉｃｅｓＲｅｇｉｏｎ）から得た廃棄白血球バフィーコートから密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。調製されたままで細胞を用いるか、またはａｕｔｏＭＡＣＳＰｒｏ分離装置（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、さらに精製するか、いずれかとした。生じた細胞を、精製後ＦＡＣＳ分析によって、純度に関してチェックした。単球（９４％純粋、＜１％残留Ｔ細胞）、単球枯渇ＰＢＭＣ（＜１％残留単球）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（９３％純粋、＜０．５％ＣＤ８＋Ｔ細胞、＜０．５％単球）、ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ（＜１％残留ＣＤ４＋Ｔ細胞）、および未精製ＰＢＭＣを、モノクローナル抗体の連続希釈の存在下または非存在下で、ＨＩＶ−１Ｂ．ＰＶＯに感染させた。図７Ａ。対照ウェル中で見られる感染の８０％を中和する濃度として決定した抗体中和。抗体１１．３１（ＰＧＮ６３２）は、単球を含有する細胞試料中のみで中和し、そして単球が枯渇した試料においては、感染阻害をまったく示さなかった。図７Ａおよび７Ｂ。ＩＲＢが認可したプロトコルに基づいて、米国赤十字（ＣａｒｏｌｉｎａｓＢｌｏｏｄＳｅｒｖｉｃｅｓＲｅｇｉｏｎ）から得た廃棄白血球バフィーコートから密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。調製されたままで細胞を用いるか、またはａｕｔｏＭＡＣＳＰｒｏ分離装置（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、さらに精製するか、いずれかとした。生じた細胞を、精製後ＦＡＣＳ分析によって、純度に関してチェックした。単球（９４％純粋、＜１％残留Ｔ細胞）、単球枯渇ＰＢＭＣ（＜１％残留単球）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（９３％純粋、＜０．５％ＣＤ８＋Ｔ細胞、＜０．５％単球）、ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ（＜１％残留ＣＤ４＋Ｔ細胞）、および未精製ＰＢＭＣを、モノクローナル抗体の連続希釈の存在下または非存在下で、ＨＩＶ−１Ｂ．ＰＶＯに感染させた。図７Ｂ。抗体を含まない対照ウェルに比較した感染の減少として決定される抗体中和。抗体１１．３１（ＰＧＮ６３２）およびＣＬ１は、それぞれ、９８％および９３％、単球の感染を減少させ；どちらの抗体も、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を阻害しなかった。対照的に、２Ｇ１２およびＩｇＧ１ｂ１２は、どちらの細胞種の感染も阻害し、２Ｇ１２がより強力な抗体であった。精製単球またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃で３０分間、１１．３１で前処理し、そして次いで洗浄した。次いで、前処理した細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞培養に添加し、そしてＨＩＶ−１Ｂ．６５３５に感染させ、そして未処理対照ウェルに比較したｐ２４産生減少として、阻害を測定した。単球の前処理は、感染の８７％減少を生じる一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞の前処理は、３５％の減少しか生じなかった。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。図９Ａ〜９Ｃ。抗脂質抗体は、ＰＢＭＣからＲ５ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、合わせて、ＰＢ単球から、高レベルのＣＣＲ５ケモカインを誘導可能である。図９Ａは、抗脂質抗体ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）が、ＨＩＶ−１の非存在下で、ケモカインを誘導し、そしてＨＩＶ−１の存在下で、より高レベルのケモカインを誘導することを示す。図９Ｂは、２４時間の時点から取ったデータのみを含む、ＣＬ１の同じデータの要約を示す。図９Ｃは、異なる個体のＰＢＭＣを用いた第二の実験を示す−この場合、脂質抗体は、単独で、２４時間の時点で、ＰＢＭＣから最大レベルのケモカインを誘導した。どちらにおいても、脂質抗体効果は、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βに対して最も顕著であり、そしてＲＡＮＴＥＳに対しては顕著でなかった。さらに、ＣＸＣＲ４ケモカインＳＤＦ−１に対しては効果がなく、脂質抗体がＲ５ＨＩＶ−１単離体に対してのみ効果があることを説明した。抗ケモカイン抗体による、抗脂質抗体のＨＩＶ−１阻害活性の遮断。ＰＢＭＣをまず、３７℃で一晩、５μｇ／ｍｌＰＨＡで活性化し、そして示すような（ｘ軸中）中和抗ケモカインｍＡｂまたは対照（Ｐ３）８．３μｇ／ｍｌの存在下で、抗体を含まず、または飽和未満の濃度（３．３μｇ／ｍｌ）のｍＡｂＣＬ１と、インキュベーションした。ＨＩＶ−１感染５日後に培養上清を採取し、そしてｐ２４アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、ｐ２４産生に関してアッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂ。図１１Ａ。ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）の配列。図１１Ｂ。ＣＬ１の配列。図１１Ａおよび１１Ｂ。図１１Ａ。ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）の配列。図１１Ｂ。ＣＬ１の配列。図１２Ａおよび１２Ｂ。図１２Ａ。ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＨＩＶ−１感染性を阻害する抗脂質抗体は、非病原性であり、そして脂質への結合のため、β−２−糖タンパク質−１に依存しない。一般的に、脂質への結合のため、β−２−糖タンパク質−１を必要としない抗体は、非病原性であり、一方、病原性抗脂質抗体は、脂質への抗体結合のため、β−２−糖タンパク質−１を必要とする（ＤｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：１８５４−１８６０（２００５））ため、この観察は重要である。研究した抗体のうち、脂質への結合のため、β−２−糖タンパク質−１に依存しないもののみが、ＨＩＶ−１感染性を阻害可能であった。脂質への結合のため、β−２−糖タンパク質−１に依存する他の抗体はすべて、ＨＩＶ−１感染性を阻害する能力を持たない。したがって、これらのβ−２−糖タンパク質−１非依存性抗体は、通常、ヒトによって、脂質に対して作製され（Ａｌｖｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１２：３４２−３４４（１９８４））、そして梅毒およびＨＩＶ−１を含む多様な感染性病原体に感染した後でしばしば見られる（いわゆる「感染性脂質またはカルジオリピン抗体」（Ａｓｈｅｒｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６２：３８８−３９３（２００３）Ｓｉｌｖｅｒｓｔｒｉら，Ｂｌｏｏｄ８７：５１８５−５１９５（１９９６）））、「天然」抗脂質抗体を含む、非病原性抗脂質抗体クラス中にある。図１２Ｂ。抗脂質抗体は、Ｒ５ＨＩＶ−１初代単離体を、２Ｆ５、２Ｇ１２および１ｂ１２ｍＡｂよりも広い幅で阻害する。ＣＣＲ５を利用するＨＩＶ株はすべて、前例のない幅および効力で、４つの非病原性脂質ｍＡｂＩＳ４、ＣＬ１、Ｐ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）によって中和される一方、ＣＸＣＲ４を利用するＨＩＶまたはＳＨＩＶ株はいずれも、脂質抗体によってはＰＢＭＣ感染を防止されない。抗脂質抗体のこの驚くべき効果は、抗脂質抗体が宿主細胞に対してのみ作用し、そしてウイルスには作用しないという観察（図２および３を参照されたい）と合わせて、脂質抗体が、ＣＣＲ５を利用するウイルスを阻害するための因子を、宿主細胞から特異的に誘導したことを強く示唆する。粘膜透過の粘膜ボトルネックを横断するウイルスのほぼすべてが、ＣＣＲ５を利用するウイルスであるため、これは重要である（Ｋｅｅｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７５５７−７，Ｅｐｕｂ２００８Ｍａｙ１９（２００８））。カルジオリピンは、ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）およびＣＬ１がＰＢＭＣにおいてＨＩＶ−１感染を遮断する能力を競合的に阻害する。図１４Ａ〜１４Ｄ。７５人のドナーＰＢＭＣに対するヒト抗体の活性。図１４Ａ。１１．３１。図１４Ｂ。ＩｇＧ１ｂ１２。図１４Ｃ。４Ｅ１０。図１４Ｄ。ＨＩＶＩＧ。図１５Ａ〜１５Ｆ。抗脂質モノクローナル抗体と単球をインキュベーションすると、多核細胞形成が刺激される。図１５Ａ。１１．３１。図１５Ｂ。ＣＬ１、図１５Ｃ。ＩＳ４。図１５Ｄ。Ｐ１。図１５Ｅ。ＬＰＳ。図１５Ｆ。１７ｂ。図１６Ａおよび１６Ｂ。抗脂質抗体とインキュベーションしたＰＢＭＣ由来の培養上清による、ＴＺＭ−ｂｌ細胞におけるＨＩＶ−１ＷＩＴＯ偽ウイルスの阻害。図１６Ａ。１１．３１。図１６Ｂ。ＣＬ１。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。抗脂質ヒト・モノクローナル抗体は、宿主細胞に結合することによって、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する。

本発明は、１つの態様において、ＨＩＶ−１のＣＣＲ５向性株による被験体の細胞（例えばＴ細胞）の感染を阻害する方法に関する。該方法は、ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）またはＣＬ１などの抗ヒト細胞抗体（例えば抗脂質（例えば抗リン脂質）抗体）、あるいはその断片が：ｉ）ＣＣＲ５結合性ケモカインを産生可能であり、そしてｉｉ）その表面上に該抗体によって認識される抗原を有する患者細胞に結合する量および条件下で、該抗体またはその断片を被験体（例えばヒト被験体）に投与する工程を含む。抗体またはその断片が結合すると、ＨＩＶ−１のＣＣＲ５向性株の非存在下または存在下のいずれかで、細胞によるＣＣＲ５結合性ケモカインの産生が、ＣＣＲ５受容体を利用するＨＩＶ−１感受性細胞（例えばＴ細胞）の感染を阻害するのに十分なレベルまで誘導される。都合よくは、抗体またはその断片を、ＨＩＶ−１のＣＣＲ５向性株への被験体曝露の４８時間以内に投与する。

本発明で使用するのに適した抗脂質抗体は、健康な対照被験体から、そして原発型および続発型ＡＰＡＳ患者から（例えばこうした患者由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から生成された抗体ライブラリーから）、得られうる。ＳＬＥ患者由来（ＣＬ１、Ｐ１）、抗リン脂質症候群患者由来（ＩＳ４）、そして正常被験体由来（１１．３１（ＰＧＮ６３２））のこうした抗体の例は、表３に見られる。さらに、ＨＩＶ−１自体が、ＨＩＶ−１感染後、これらのタイプの抗体産生を刺激する（表１において、ＨＩＶ−１伝染３ヶ月後の、被験体由来のＡＣＬ４ｍＡｂでのデータを参照されたい）。

表１
ＬｕｃＲ取り込みＨＩＶ−１を用いたＰＢＭＣに基づく中和アッセイにおける、抗脂質抗体によるＨＩＶ−１の阻害

^＊ＣＣＲ５ＨＩＶ−１単離体；＃ＣＸＣＲ４単離体。
上述のような、患者および健康な被験体に由来する抗体をさらに成熟させて、高アフィニティ脂質（例えばリン脂質）結合に関して最適化してもよい。好ましい抗体は、ＣＣＲ５結合性ケモカインを産生する細胞（例えば単球）表面上のリン脂質（例えばホスファチジルセリン（ＰＳ））に直接結合し、すなわち、結合するためにβ２−糖タンパク質−１を必要としない。β２−糖タンパク質−１のドメインＩへの結合は、ＡＰＡＳおよび他の自己免疫症候群で見られる抗リン脂質抗体の病原性と関連づけられてきている（ＤｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：１８５４−１８６０（２００５））。本発明で使用するのに適した抗脂質抗体は、ＣＣＲ−５を利用するＨＩＶ−１株を広く中和可能であるが、ＣＸＣＲ４を利用するものは中和しない。本発明の好ましい療法的抗体は、脂質に結合するために、β−２−糖タンパク質−１を必要としない。こうした抗体は、単離抗体（ＡＣＬ４がこうした抗体の例である）から生じる血栓症の合併症を持たない被験体において生じ、そしてこうした被験体から得られうる。

本発明にしたがって、被験体または被験体の免疫系／細胞とＣＣＲ５を利用するＨＩＶ−１の接触前に、あるいはこうした接触の約４８時間以内に、抗脂質抗体を投与してもよい。この時間枠内での投与は、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１での被験体の脆弱細胞（例えばＴ細胞）の感染阻害を最大限にしうる。ＨＩＶ−１のこの阻害様式は、伝染事象を修飾するかまたは阻害するのに特に有効であり、これは、実質的にすべての伝染ＨＩＶ−１ウイルス擬似種がＣＣＲ５向性であるためである（Ｋｅｅｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７５５２−７５５７，Ｅｐｕｂ２００８Ｍａｙ１９（２００８））。

本発明で使用するための１つの好ましい抗体は、ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）である。この抗体は、健康なドナーのＰＢＬから生成された抗体ライブラリーに由来した。抗体ライブラリーの産生時点で作製されていた抗体を反映しているのかどうかはわかっていない。元来の抗体アイソタイプはＩｇＭまたはＩｇＤであり、これが次いでＩｇＧに変換され、そしてさらに成熟して、高アフィニティＰＳ結合に関して最適化された。ＰＢＭＣがＣＣＲ５を利用するＨＩＶ−１に感染するのを阻害するためのｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）の効力は、報告されるいかなる他の抗体よりも広い。１１．３１（ＰＧＮ６３２）の可変ドメインの配列を表２に示す（ＩｇＧ配列を図１１Ａに示す）。

本発明の方法で使用するのにやはり好ましいのはＣＬ１である。重鎖および軽鎖遺伝子配列を、アミノ酸配列とともに、図１１Ｂに示す。健康な個体由来、ＨＩＶ−１感染被験体由来（ＡＣＬ４など）、他の病原体（梅毒など）に感染した個体由来、または自己免疫疾患患者由来の他の抗体、あるいはこうした抗体の断片もまた、本方法で使用可能である。

上に示すように、損なわれていない抗体またはその断片（例えば抗原結合性断片）のいずれかを本発明の方法で用いてもよい。例示的な機能的断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる。一本鎖抗体もまた使用可能である。適切な断片および一本鎖抗体を調製するための技術が当該技術分野に周知である（例えば、ＵＳＰ５，８５５，８６６；５，８７７，２８９；５，９６５，１３２；６，０９３，３９９；６，２６１，５３５；６，００４，５５５；７，４１７，１２５および７，０７８，４９１ならびにＷＯ９８／４５３３１を参照されたい）。本発明にはまた、本明細書開示の抗体（および断片）の変異体も含まれ、特に開示する抗体（および断片）の結合特性を保持する変異体、ならびに本方法において該抗体を用いる方法が含まれる。

上記抗体およびその断片を組成物（例えば薬学的組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解するかまたは分散した抗脂質抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は、無菌であってもよく、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）をまた、皮膚または粘膜への局所投与に適した組成物として配合してもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。性交後膣洗浄として、またはコンドームとともに投与するように、抗体を配合してもよい。

本方法で使用するのに適した多くの抗脂質抗体が、カルジオリピン（ＣＬ）との反応性によって同定されてきているが、ＣＬは、生存、活性化またはアポトーシス細胞の細胞表面上には発現されず、むしろミトコンドリア膜の脂質である。ＨＩＶ−１感染性を阻害することが以下の実施例に示されている４つのｍＡｂはまた、すべて、ＣＬに結合する一方、ＰＳにも結合する。実施例に提供するデータによって、ＰＳが適切な細胞表面ターゲット細胞分子の１つであることが示される。

抗脂質抗体がＣＣＲ５を利用する初代単離体の感染性のみを阻害することは、感染性阻害機構のため、そしてＨＩＶ−１感染阻害における抗脂質抗体の有用性の環境のため、意義がある。選択された抗脂質抗体（例えばＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２））が、ウイルス添加４８時間後までＨＩＶ−１感染を阻害可能であることによって、これらがビリオン結合および付着を遮断しないことが示される。実施例に提供するデータは、単球および他のケモカイン産生細胞からケモカインを誘導するｍＡｂの作用様式と適合する（図１３を参照されたい）。抗脂質抗体が、感染４８時間後まで作用することによって、例えば以下の環境における、予防のための該抗体の有用性が示される：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対する予期される既知の曝露の環境において、本明細書記載の抗脂質抗体（またはその結合性断片）を、消毒剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる異性愛者間の病気伝染で生じるものなどの、既知のまたは推測される曝露の環境において、本明細書記載の抗脂質抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、そして
ｉｉｉ）ＣＣＲ５伝染ウイルスでの急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗脂質抗体（またはその結合性断片）を、最初のウイルス装填を制御し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよい。

適切な用量範囲は、抗体、そして配合物の性質および投与経路に依存しうる。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる（投与および誘導両方）。

本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載されうる（その全内容が本明細書に援用される、米国仮出願第６１／１３６，４４９号もまた参照されたい）。

実施例１
実験詳細
抗体。本研究で用いたｍＡｂおよびその特性を表３に示す。ＩＳ４は、原発性抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＡＳ）患者由来のヒトｍＡｂである（Ｚｈｕら，Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０５：１０２−１０９（１９９９））（寄託番号ＡＦ４１７８４５およびＡＦ４１７８５１を参照されたい）。ＣＬ１、Ｐ１、Ｂ１、およびＢ２は、続発性ＡＰＡＳおよび全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来のヒトｍＡｂである（Ｗｅｉ−Ｓｈｉａｎｇら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．５６：１６３８−１６４７（２００７））。ｍＡｂｓ１１．３１（ＰＧＮ６３２）、Ｊ３０５（ＰＧＮ６３４）、および１Ｎｌ１（ＰＧＮ６３５）は、健康な被験体の血液から生成されている抗体ライブラリー由来であり、そしてＰＳへの最適結合に関して操作された組換えｍＡｂである。各細胞株を血清不含培地中で増殖させ、そしてプロテインＡ／Ｇ調製カラムを用いて、全免疫グロブリンを精製した。Ｓｙｎａｇｉｓ^ＴＭ（パリビズマブ）は呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質に対するヒト化ｍＡｂであり、そしてこれをＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．（メリーランド州ガイザーズバーグ）より購入した。抗ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）ｍＡｂ２Ｆ５および４Ｅ１０を、ＰｏｌｙｍｕｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（オーストリア・ウィーン）より購入した。ｍＡｂ７Ｂ２、Ｆ３９Ｆ、１７ｂ、およびＡ３２は、ＪａｍｅｓＲｏｂｉｎｓｏｎ（チューレーン大学、ロサンゼルス州ニューオーリンズ）の寛大な寄贈品であった。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をＫＰＬ，Ｉｎｃ（メリーランド州ガイザーズバーグ）より購入し、そして力価決定して、最適濃度を決定した。β２−糖タンパク質−１Ｆｃ二量体は、ＩｇＧ１Ｆｃにスプライシングされた、β２−糖タンパク質−１の全長（ドメインＩ〜Ｖ）の二量体型である（ＰｅｒｅｇｒｉｎｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州タスチン）。

表３：この研究における抗脂質抗体

^＊健康な被験体由来の抗体ライブラリーから得られ、ＰＳへの結合改善のために修飾された
組換えＥｎｖおよび他の試薬。ＰＢＳおよび１％ＢＳＡを含むＰＢＳをＧｉｂｃｏＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ニューヨーク州グランドアイランド）より購入した。メタノール不含ホルムアルデヒド１０％をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（ペンシルバニア州ウォリントン）より購入した。組換えｇｐ１４０ＣＦまたはＣＦＩＭ群コンセンサスＣＯＮ−Ｓ、ＪＲＦＬ、およびＸＥｎｖオリゴマーを、記載されるように、分泌タンパク質として、組換えワクシニアウイルス中で産生した（Ｌｉａｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５５３：２６８−２８２（２００６））。

患者および対照標本。デューク大学ＩＲＢによって認可された臨床プロトコルのもとで、健康な対照被験体および患者試料を得た。デューク大学医学センターに保存されている抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＡＳ）患者試料貯蔵所から、患者試料１〜１０を得た。自己免疫疾患患者および健康な対照を採用するように設計されたＣＨＡＶＩ００５プロトコルのもとで採用した被験体の選択から患者試料１１〜３０を得た。抗カルジオリピン抗体の存在に関してすべての試料を試験し、そしてこれを標準ＨＩＶ−１ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ウイルス装填に関してもまた、ＲＮＡＰＣＲによって、ＣＨＡＶＩ００５試料を試験した。試験したすべての試料は、抗ＨＩＶ抗体に関して陰性であり、そして検出可能なＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡはまったくなかった。

ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋単球の単離。米国赤十字由来の廃棄バフィーコートとして、または未感染正常被験体の白血球除去から得たＰＢＭＣを、陰性選択を用い、ａｕｔｏＭＡＣＳ^ＴＭＰｒｏ分離装置（ＭｉｌｔｅｎｙＢｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して濃縮するか、または水簸装置（ｅｌｕｔｒｉａｔｏｒ）を用いて、単球に関して濃縮した。ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８抗体での染色、ならびにＢＤＬＳＲＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）またはＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅＭｉｎｉ−ＳＳＣ系（ＧｕａｖａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ヘイワード）のいずれかでの分析によって、生じた細胞調製物を分析した。すべての調製物は、≧９５％ＣＤ３＋ＣＤ４＋または＞９５％ＣＤ１４＋であった。

表面プラズモン共鳴およびフローサイトメトリー。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびフローサイトメトリーを用いて、基質へのｍＡｂの結合を研究した。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で標準技術を用いて、ＳＰＲ研究を行った。ヒトＴ細胞株Ｈ９（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）上、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上、または血液単球上で、フローサイトメトリー研究を行った。一次抗体と３０〜６０分間インキュベーションし、そして二次抗体と３０分間インキュベーションして、フローサイトメトリーのための染色を３７℃で行った。ＰＢＳ中のメタノール不含１〜２％ホルムアルデヒド中で、フロー試料を固定し、そしてＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）上で分析する前に、４℃で保存した。

ＴＺＭ−ｂｌ細胞における中和アッセイ。先に記載されるように、ＴＺＭ−ｂｌ細胞における中和抗体アッセイを行った（Ｗｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ４２２：３０７−３１２（２００３）；Ｄｅｒｄｅｙｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８３５８−８３６７（２０００）；Ｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０１０８−１０１２５（２００５）；Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，ＤＣｐｐ１２．１１．１−１２．１１．１５，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中（２００４)）。簡潔には、使用前に、トリプシン／ＥＤＴＡでの処理によって、接着細胞を破壊した。患者血清を１：２０最終希釈から出発して試験する一方、ｍＡｂを５０μｇ／ｍＬ最終濃度から出発して試験した。連続３倍希釈を用いて、両方の力価決定をした。測定可能な感染を生じるようにあらかじめ決定した力価で、抗体希釈に偽ウイルスを添加して、そして１時間インキュベーションした。ＴＺＭ−ｂｌ細胞を添加し、そして４８時間インキュベーションした後、ルミノメーターによって上清を測定した。対照ウェルに比較した発光の減少としてデータを計算し、そしてμｇ／ｍｌでのｍＡｂＩＣ５０として報告した（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｃｏｌｉｇａｎら監修，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ１２．１１．１１−１２．１１．１５（２００４））。

ＰＢＭＣにおける中和アッセイ。全ウイルス調製物を用いてＰＢＭＣを感染させてＰＢＭＣアッセイを行い、ｐ２４ＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ、イリノイ州シカゴ）を用いて感染を検出した。ｍＡｂおよびヒト血清を、示すようにウイルスまたは細胞とインキュベーションし、そして次いで、感染前に、遊離抗体を洗浄した（Ｐｉｌｇｒｉｍら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：９２４−９３２（１９９７））。簡潔には、凍結保存ヒトＰＢＭＣを融解し、そして５μｇ／ｍＬの植物性血球凝集素を含有するＩＬ−２増殖培地（２ｍＭＬ−グルタミン、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２０％熱不活化ウシ胎児血清、５％ＩＬ−２、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０）中で１日間培養して休ませた。次いで、細胞を洗浄し、そして適切なように抗体または血清希釈を含有するＵ底ウェルに添加し、そして１時間インキュベーションした後、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＳＨＩＶ単離体を適切な希釈で添加した。２４時間後、ＩＬ−２増殖培地で細胞を４回洗浄し、そして次いでさらに２４時間インキュベーションした。培地（２５μＬ）を取り除き、そして２２５μＬの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とインキュベーションし、そして次いで、ｐ２４ＥＬＩＳＡによってアッセイした。対照感染ウェルに比較したｐ２４産生の減少としてデータを計算し、そしてμｇ／ｍＬでのｍＡｂＩＣ８０として表した。抗体ストックを２ｍＭカルジオリピン（ＣＬ）、２ｍＭジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはＰＢＳと３７℃で２時間または一晩インキュベーションした後、上述のように混合物をアッセイして、脂質で前吸収したｍＡｂの研究を行った。０時間、２４時間、４８時間、または７２時間でｍＡｂを添加することによって、時間経過研究を行った。これらの実験において、アッセイ全体に渡って、一定濃度の抗体が存在するように、各洗浄工程後に抗体を再導入した。

ＨＩＶ−１が誘導する合胞体形成の、抗体による阻害。ＬａｒｒｙＡｒｔｈｕｒおよびＪｅｆｆｒｅｙＬｉｆｓｏｎ（ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＣａｎｃｅｒＦａｃｉｌｉｔｙ、メリーランド州フレデリック）の寛大な寄贈品として供給された２，２’−ジピリジルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ^ＴＭ−２）不活化ビリオンを用いて、合胞体阻害アッセイを行った。連続希釈中で調製された抗体を、不活化ビリオンと３７℃で１時間インキュベーションした。５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中の１０％ＦＢＳ中で増殖させたＳＵＰ−Ｔ１細胞を抗体−ウイルス混合物に添加し、そして３７℃、５％ＣＯ_２で１６時間インキュベーションした。倒立位相差顕微鏡を用いて合胞体を画像化し、そして計数した。抗体を含有しないウェルに比較して、合胞体形成を９０％阻害した抗体濃度として、力価を表した。

ヒト血清からのＩｇＧの精製。ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．のＳｔａｐｈＡＧカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによって、血清からＩｇＧを精製した。

ＰＢＭＣの蛍光顕微鏡。水性生体染色色素（ａｑｕａｖｉｔａｌｄｙｅ）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識コレラ毒素Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）の存在下で、一次ｍＡｂとＰＢＭＣを４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて、試料を洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ（ＫＰＬＩｎｃ、メリーランド州ガイザーズバーグ）で３０分間染色した。最終洗浄後、細胞をＰＢＳ中の最小１％ＢＳＡに再懸濁し、そしてＳＰＯＴＣＣＤカメラ（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ミシガン州スターリングハイツ）を装備したＯｌｙｍｐｕｓＡＸ−７０顕微鏡上で、蛍光顕微鏡検査下で見るまで、４℃で保存した。

結果
ＰＢＭＣ中、単一ラウンド感染アッセイにおいて、ＨＩＶ−１偽ウイルス感染を阻害し、そして多数ラウンド感染アッセイにおいて、感染性ウイルスを阻害する、抗脂質ｍＡｂ能力のスクリーニング。表３中のｍＡｂが、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ偽ウイルスＢ．６５３５、Ｂ．ＰＶＯおよびＣ．ＤＵ１２３の感染を阻害する能力を決定した（表４Ａ）。いずれのｍＡｂも、上皮細胞株ＴＺＭＢＬ（ＣＣＲ５およびＣＤ４でトランスフェクションされた生殖器上皮細胞）中で培養した場合、３つの偽ウイルスのいずれも阻害しないことが見出された。次に、ＳＵＰ−Ｔ１細胞株において、これらの抗体が、Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ^ＴＭ−２不活化ビリオンによって誘導される合胞体形成を防止する能力の研究を行った（表４Ｂ）。抗脂質抗体はいずれも、合胞体形成を防止しなかった。次いで、多数ラウンドアッセイにおいて、ｍＡｂが感染性ＨＩＶ−１初代単離体によるＰＢＭＣ感染を阻害する能力に関して、同じｍＡｂパネルを試験した（表４Ｃ）。偽ウイルスおよび合胞体阻害アッセイにおいて、抗脂質ｍＡｂの効果が欠如していたのとは対照的に、試験した９つのｍＡｂのうち４つ（１１．３１（ＰＧＮ６３２）、Ｐ１、ＩＳ４およびＣＬ１）が、Ｂ．ＰＶＯ、Ｂ．６５３５、およびＣ．ＤＵ１２３に対して強力な中和活性を有することが見出された。抗体１１．３１（ＰＧＮ６３２）が最も強力な感染阻害剤であり、Ｃ．ＤＵ１２３に対するＩＣ８０は＜０．０２μｇ／ｍｌであった。

表４Ａ：ＴＺＭ−ｂｌＣＤ４＋ＣＣＲ５＋上皮細胞において、抗脂質抗体が、エンベロープ化偽ウイルスを中和不能であること

表４Ｂ：ＳＵＰ−Ｔ１Ｔ細胞株において、抗脂質抗体が、Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ^ＴＭ−２不活化ＨＩＶ−１によって誘導される融合を阻害不能であること

表４Ｃ：ＰＢＭＣに基づくウイルス感染阻害アッセイにおいて、抗脂質抗体がＨＩＶ−１を中和する能力

ＨＩＶ−１感染性を阻害しないものに対して、阻害するｍＡｂの最も際だった特徴は、脂質への結合のために、阻害性ｍＡｂのβ２−糖タンパク質Ｉ（β２−ＧＰ１）への依存が存在しないことであった。ＨＩＶ−１を阻害する４つのｍＡｂは、ＣＬまたはＰＳへの結合のためにβ２−ＧＰ１を必要とせず（Ｐ１、１１．３１（ＰＧＮ６３２）、ＣＬ１、ＩＳ４）、一方、ＨＩＶ−１を阻害しなかった５つのｍＡｂは、脂質結合のためにβ２−ＧＰ１を必要とした（表３）（図１）。

ウイルス感染性阻害の抗脂質ｍＡｂの幅。次に、１１．３１（ＰＧＮ６３２）、Ｐ１、ＩＳ４およびＣＬ１ｍＡｂの中和の幅を決定した。試験した７つのＲ５ウイルスのうち、７つすべての感染性が４つのｍＡｂ各々によって阻害された（表５）。しかし、Ｘ４ウイルスを試験すると、４つのＸ４ウイルスのいずれもが、４つの脂質抗体によって阻害されなかった（表４および未提示）。同様に、Ｒ５ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３に対してｍＡｂを試験すると、このＳＨＩＶの感染性は４つのｍＡｂすべてによって強力に阻害され、最大の阻害は、１１．３１（ＰＧＮ６３２）で見られ、０．０６μｇ／ｍｌＩＣ８０であった。しかし、二重向性（ｄｕａｌｔｒｏｐｉｃ）Ｒ５／Ｘ４ＳＨＩＶ８９．６Ｐはいずれの抗脂質抗体によっても中和されなかった。

表５：４つの抗脂質モノクローナル抗体のＨＩＶ−１感染性阻害の幅

ＨＩＶ−１ビリオンを捕捉する抗脂質抗体の欠如。抗脂質、抗ＨＩＶ−１および対照ｍＡｂをマイクロタイタープレートウェル上にコーティングし、そして次いで、可溶性ＣＤ４の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣ中で産生された初代単離体ビリオンとインキュベーションした。予期されるように、抗ＨＩＶ−１ｇｐ４１免疫優性領域ｍＡｂ７Ｂ２および抗ｇｐ１２０Ｖ３ループｍＡｂＦ３９Ｆは、ＨＩＶ−１ビリオンを捕捉可能であった。さらに、抗ｇｐ１２０ＣＣＲ５結合部位ｍＡｂ１７ｂは、可溶性ＣＤ４による誘発の存在下でビリオンを捕捉可能であったが、誘発の非存在下では捕捉不能であった。対照的に、いずれの抗脂質ｍＡｂもビリオンを捕捉不能であった（図２）。

抗脂質抗体の阻害効果の部位。２つのアッセイプロトコルを研究して、ＰＢＭＣ培養中で、ｍＡｂが作用してＨＩＶ−１感染性を阻害するのはどこか決定した。植物性血球凝集素（ＰＨＡ）活性化ＰＢＭＣにウイルス−抗体混合物を添加する前に、まず、ｍＡｂをウイルスと６０分間プレインキュベーションした。次に、まず、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣに抗脂質ｍＡｂを１時間添加し、次いで、ＰＢＭＣを洗浄し、そしてウイルスをＰＢＭＣに添加した。どちらの環境においても、ｍＡｂ中和効力は等しいことが見出され（図３）、抗脂質抗体が、ターゲットＰＢＭＣ表面に結合することによって、ＨＩＶ−１感染性を阻害することが示された。

次いで、ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）、Ｐ１、ＩＳ４およびＣＬ１がＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ表面に結合可能であるかどうかを調べた。抗脂質ｍＡｂがＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ（図４Ａ）およびＨＩＶＭＮ感染ヒトＨ９Ｔ細胞（図４Ｂ）に結合する能力をフローサイトメトリーによって分析することによって、実際に、あるサブセットのＰＢＭＣおよびＨＩＶ感染Ｈ９Ｔ細胞が抗脂質抗体に結合することが示された。Ｈ９Ｔ細胞がＨＩＶ−１ＭＮに感染すると、ｍＡｂに応じた多様な度合いで、生存感染細胞への脂質ｍＡｂ結合が、１１．３１（ＰＧＮ６３２）＞ＣＬ１＞ＩＳ４＞Ｐ１で上方制御され（図４Ｂ）、そしてこれは、抗脂質抗体がＨＩＶ−１感染性を阻害する効力と相関した。さらに、１１．３１（ＰＧＮ６３２）ｍＡｂは、間接的免疫蛍光アッセイにおいて、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ表面に結合することが見出された（図５）。

抗脂質抗体が、ＨＩＶ−１Ｅｎｖと反応していないことを示す（ｒｕｌｅｏｕｔ）ため、一連の組換えＥｎｖオリゴマーとの抗脂質抗体反応性の表面プラズモン共鳴分析を行った。２Ｆ５および４Ｅ１０は、ＪＲＦＬおよびＣＯＮ−Ｓｇｐ１４０オリゴマーによく結合したが、抗脂質抗体はいずれもＨＩＶ−１Ｅｎｖに結合しなかった（未提示）。さらに、言及するように、脂質抗体は、ＨＩＶ−１ビリオンを捕捉しなかった（図２）。

ｍＡｂが阻害するＨＩＶ−１感染段階を決定するため、ＰＢＭＣにウイルスを添加する時点、ならびにウイルスを添加した２４時間後、４８時間後、および７２時間後にｍＡｂを添加する、タイミング研究を行った。抗体各々に関して、より遅い時点での中和が観察されることが見出された（表６）。すべての抗体に関して、より遅い時点で中和が減弱され、そしてこれは抗体の最初の効力と相関した。重要なことに、ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）はどちらも、感染開始の４８時間後に添加した場合に中和可能であり、それぞれ、０．２２および０．０７μｇ／ｍＬのＩＣ８０であった。

表６ＰＢＭＣアッセイにおいて、Ｂ．６５３５に対する抗脂質抗体の阻害効果に関する導入時点の影響

抗脂質抗体の中和活性は、脂質とのプレインキュベーションによって改変される。これらの抗体の特異性を調べるため、ＰＢＳ、２ｍＭカルジオリピン（ＣＬ）または２ｍＭジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とプレインキュベーションしたｍＡｂで中和アッセイを行った（図６）。Ｂ．６５３５に対して試験した際、抗体のうち２つ、ＣＬ１および１１．３１（ＰＧＮ６３２）は、ＤＯＰＥとインキュベーションした際には効力に変化を示さなかったが、ＣＬとのインキュベーション後には効力の損失を示し、それぞれ１１倍および２００倍、ＩＣ８０が減少した。ＩＳ４は、どちらの脂質とインキュベーションした際も、ほとんど変化を示さず、一方、Ｐ１は、ＤＯＰＥとプレインキュベーションすると、効力の１．６倍の減少を示した。これらのデータは、これらの抗体のターゲットがターゲットＰＢＭＣ上の脂質または脂質と会合する分子であることと一致する。脂質プレインキュベーションによる阻害の変化はまた、吸収されない抗体の効力とも相関した。

ターゲット細胞ＰＳの直接連結は、ウイルス阻害を生じる。β２−ＧＰ−１−Ｆｃ二量体は、ＩｇＧ１Ｆｃによって連結されたβ２−ＧＰ−１の２つの全長（ドメインＩ〜Ｖ）分子の構築物である。β２−ＧＰ−１はＰＳに結合し、そしてＡＰＡＳの原発型または続発型の患者において、多くの病原性抗体のターゲットである（ＤｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：１８５４−１８６０（２００５））。したがって、β２−Ｇｐ−１の二量体がＨＩＶ−１感染性を阻害可能である場合、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１感染性阻害にはＰＳ結合が必要であることの直接の証拠が提供される。実際、抗脂質抗体ほど強力ではないが、β２−ＧＰ−１は、それぞれ１２、１．４、および２９μｇ／ｍＬのＩＣ８０で、Ｂ．６５３５、Ｃ．ＤＵ１２３、およびＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３を阻害した。

ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）を単球とインキュベーションするとＨＩＶ−１感染が防止されるが、ＣＤ４＋ＰＢＭＣＴ細胞とインキュベーションしても防止されない。抗脂質抗体は、ＰＢＣＤ４＋Ｔ細胞のみのＨＩＶ−１感染性を阻害せず；むしろ、抗脂質抗体は、単球が存在する場合にのみ、ＰＢＭＣ培養のＨＩＶ−１感染性を阻害する。対照的に、抗ＨＩＶ−１炭水化物ｍＡｂ２Ｇ１２は、単球が存在するかどうかに関わらず、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞において感染性を阻害する（図７を参照されたい）。

ＰＢ単球上にコーティングされた抗脂質抗体、および抗体でコーティングしたＰＢ単球をＣＤ４＋Ｔ細胞に添加し直すと、今度は、精製ＰＢＣＤ４＋Ｔ細胞の感染性が阻害される。対照的に、精製ＰＢＣＤ４＋Ｔ細胞を抗脂質抗体で前処理し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞に添加し直すと、抗体処理ＰＢＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染性を阻害する能力はまったく見られない。したがって、脂質抗体は、ＨＩＶ−１感染性に対して特異的な阻害効果を有する何らかの活性を、単球から刺激しているに違いないと推測される（図８を参照されたい）。

抗脂質抗体は、ＣＣＲ５（Ｒ５）結合性ケモカインを単球から誘導可能であるが、ＣＸＣＲ４（Ｘ４）結合性ケモカインを誘導不能である。
次の疑問は、抗脂質抗体が単球からＸ４ケモカインではなくＲ５ケモカインを誘導可能であるかどうかであった。図９は、これが実際に当てはまることを示す。抗脂質抗体が存在し、そしてウイルスが存在しないと、単球は、Ｒ５ケモカイン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを誘導するが、Ｘ４ケモカインＳＤＦ−１を誘導しない。さらに、単球に添加されたＨＩＶ−１ウイルスは、Ｒ５ケモカイン誘導に対してわずかなまたは最小限の効果しか持たない。しかし、抗体およびウイルスが両方存在していると、ケモカイン、そして特にＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの産生が増進する。したがって、抗脂質抗体の阻害機構は、抗脂質抗体およびＨＩＶ−１の組み合わせによって、単球（そしておそらく他の骨髄系細胞、例えば樹状細胞および組織マクロファージ）からのＲ５ケモカインの誘導を介する。さらに、抗脂質抗体＋ＨＩＶ−１による、Ｘ４ケモカインではなく、Ｒ５ケモカインのこの選択的誘導は、抗脂質抗体が、Ｒ５ケモカインの感染性のみを阻害し、Ｘ４ケモカインの感染性を阻害しないのはなぜであるかを説明する。最近、Ｋｅｅｌｅらは、ＨＩＶ−１伝染ウイルスが、実質的にすべてＲ５ウイルスであることを示した（Ｋｅｅｌｅ，Ｂｒａｎｄｏｎら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７５５２−７，Ｅｐｕｂ２００８Ｍａｙ１９（２００８））。総合すると、これらのデータは、１１．３１（ＰＧＮ６３２）およびＣＬ１などの抗脂質抗体が、初期ＨＩＶ−１感染の治療として特に有効である可能性もあり、そしてこれらが、ＨＩＶ−１感染の曝露後予防剤として有用である可能性もあり、そしてＲ５伝染ウイルスに対して防御可能な可能性もあることを示す。

Ｒ５ケモカインに対する抗体が、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害する抗脂質抗体の能力を阻害する能力。次に、ＰＢＭＣＨＩＶ−１感染性アッセイに添加した際、Ｒ５ケモカインの効果を中和する抗体が、ｍＡｂ１１．３１（ＰＧＮ６３２）およびＣＬ１がＨＩＶ−１によるＰＢＭＣ感染を阻害する能力を阻害可能であるかどうかを検討した（図１０）。Ｒ５ケモカインＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを中和する抗体は、抗脂質抗体がＨＩＶ感染性を阻害する能力の最強の阻害剤であることが見出された。したがって、実際に、ＨＩＶ−１存在下での、抗脂質抗体によるＲ５ケモカインの誘導は、ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を阻害可能である。

実施例２
７５人の健康なドナーから標準法を用いてＰＢＭＣを得て、そして感染ウイルスとしてＨＩＶ−ＢａＬ．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏ／ｈＰＢＭＣを用いたＰＢＭＣアッセイにおけるターゲットとして用いた。モノクローナル抗体１１．３１（図１４Ａ）、ＩｇＧ１ｂ１２（図１４Ｂ）、および４Ｅ１０（図１４Ｃ）、ならびにヒト・ポリクローナル抗体調製物ＨＩＶＩＧ（図１４Ｄ）を、感染を阻害する能力に関して試験した。抗体を伴わない対照感染に比較したＨＩＶ−１感染の８０％阻害に必要な抗体濃度として、データをプロットする。各棒は、個々のドナーＰＢＭＣ調製物から得られたデータに相当し、そしてグラフ間で対応する。１１．３１は、試験したドナーＰＢＭＣの８５％で感染阻害を示し、平均ＩＣ８０値は３．６μｇ／ｍＬであった。ＩｇＧ１ｂ１２は、試験したＰＢＭＣの９５％を阻害し、平均ＩＣ８０は９．２μｇ／ｍＬであった；４Ｅ１０は、試験したＰＢＭＣの４０％を阻害し、平均ＩＣ８０は２０．４μｇ／ｍＬであった；ＨＩＶＩＧは、試験したＰＢＭＣの９８％を阻害し、平均ＩＣ８０は７８０μｇ／ｍＬであった。

健康なドナーからの水簸によって得られ、そして＞９４％の純度である単球を、モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ最終濃度）、リポ多糖（Ｓｉｇｍａ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）の存在下、または刺激なしで、チャンバースライド中または６ウェルプレート中でインキュベーションした。９６時間インキュベーションした後、チャンバースライド中の上清を取り除き、そしてスライドをＷｒｉｇｈｔ染色し、そして次いで、顕微鏡下で視覚化した。７日後、６ウェルプレート中の細胞を取り除き、そして染色のため、細胞標本スライド上で回転させた。モノクローナル抗体１１．３１（図１５Ａ）、ＣＬ１（図１５Ｂ）、およびＩＳ４（図１５Ｃ）と９６時間インキュベーションした後、多核巨細胞（多核細胞）の形成が誘導された。同様に、７日後、抗体Ｐ１（図１５Ｄ）は、多核細胞の形成を誘導した。リポ多糖（図１５Ｅ）、対照抗体１７ｂ（図１５Ｆ）、あるいはパリビズマブ、Ａ３２、またはＦ３９Ｆ（未提示）での刺激は、多核細胞形成を誘導しなかった。

ＨＩＶ−１ＷＩＴＯ伝染エンベロープ偽ウイルスの存在下で、ＰＢＭＣを抗体１１．３１（図１６Ａ）またはＣＬ１（図１６Ｂ）の連続希釈と２４時間インキュベーションし、そして次いで、抗体および偽ウイルスを含む上清をＴＺＭ−ｂｌ細胞培養に添加した。示すデータは、対照試料に比較した感染の阻害である。どちらのモノクローナル抗体に関しても、ＰＢＭＣ馴化上清を添加した場合に感染阻害が生じたが、抗体のみを添加した場合には阻害は見られなかった。阻害曲線は、抗体のみとインキュベーションしたＰＢＭＣ、または標準的ＰＢＭＣアッセイに関して、類似であった（データ未提示）（図１７もまた参照されたい）。

上に引用するすべての文献および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。

Claims

ＨＩＶ−１のＣＣＲ５向性株による、ヒト被験体の感受性細胞の感染を阻害する方法であって、モノクローナル抗体ＣＬ１またはその断片を、前記抗体または前記その断片が、前記被験体の細胞であって：
ｉ）ＣＣＲ５結合性ケモカインを産生し、そして
ｉｉ）その細胞表面上に前記抗体または前記その断片によって認識される抗原を有し、したがって、前記細胞による前記ケモカインの産生が、単独でまたはＨＩＶ−１の前記株の存在下で、前記抗体または前記その断片によってのいずれかで、前記感受性細胞の感染を阻害するのに十分なレベルまで誘導される
前記細胞に結合する量および条件下で、前記被験体に投与する工程を含み、
前記抗体または前記その断片を、ＨＩＶ−１の前記株への前記ヒト被験体曝露の４８時間以内に投与する
前記方法。
前記感受性細胞がＴ細胞である、請求項１記載の方法。
前記断片が、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２断片である、請求項１記載の方法。
前記抗体または前記その断片を局所投与する、請求項１記載の方法。
前記抗体または前記その断片を、前記被験体の粘膜表面に投与する、請求項４記載の方法。
ＨＩＶ−１のＣＣＲ５向性株による、ヒト被験体の感受性細胞の感染を阻害する方法であって、ＣＬ１の結合特異性を有する抗体またはその断片を、前記抗体または前記その断片が、前記被験体の細胞であって：
ｉ）ＣＣＲ５結合性ケモカインを産生し、そして
ｉｉ）その細胞表面上に前記抗体または前記その断片によって認識される抗原を有し、したがって、前記細胞による前記ケモカインの産生が、単独でまたはＨＩＶ−１の前記株の存在下で、前記抗体または前記その断片によってのいずれかで、前記感受性細胞の感染を阻害するのに十分なレベルまで誘導される
前記細胞に結合する量および条件下で、前記被験体に投与する工程を含み、
前記抗体または前記その断片を、ＨＩＶ−１の前記株への前記ヒト被験体曝露の４８時間以内に投与する
前記方法。
前記感受性細胞がＴ細胞である、請求項６記載の方法。
前記断片が、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２断片である、請求項６記載の方法。
前記抗体または前記その断片を局所投与する、請求項６記載の方法。
前記抗体または前記その断片を、前記被験体の粘膜表面に投与する、請求項６記載の方法。