JP2012193959A - 試料中の総プロテインｓタンパク質量の測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中に存在する全てのプロテインＳのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが出来る、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法を提供する。
【解決手段】試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する測定試薬及び測定方法において、当該プロテインＳタンパク質量の測定反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させるものである。
【選択図】なし

Description

本発明は、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定することができる測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。

プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。

このプロテインＳは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。

なお、活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子；ＦＶＩＩＩａ）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。

プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。

このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。

そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、下記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。

通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」（すなわち、結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち、遊離型）である。

なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＳの活性を上昇させることができるのである。

なお、本明細書において、「プロテインＳ」又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に複合体（若しくは結合型）又は遊離（若しくは遊離型）等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体（又は結合型）及び遊離状態（又は遊離型）のものの総称を意味するものとする。

活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。

プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性は上昇し、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は促進される。

血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＳの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＳの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＳの活性の低下又は異常が認められる。

即ち、プロテインＳの活性の低下又は異常を伴う遺伝子変異の検出は、血栓症の病態解明に大いに役立つものと思われる。例えば、プロテインＳ徳島のような遺伝子変異は、血中に分泌されるプロテインＳタンパク質量は正常であるが、活性が低下するＩＩ型異常症であるため、プロテインＳ活性とプロテインＳタンパク質量を測定し、プロテインＳ比活性（比活性＝活性／タンパク質量）を求めることで、間接的にプロテインＳ遺伝子変異を検出することが可能であると考えられる。

また、遊離プロテインＳは総プロテインＳに比べて血中濃度が低く、測定誤差の影響を受けやすいので、プロテインＳ遺伝子変異の検出には、総プロテインＳの測定が最適であると思われる。

現在、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法として、例えば、総プロテインＳに対する抗体を使用したＥＬＩＳＡ法（例えば、非特許文献１参照）等が提案されているが、用手法であり、操作が煩雑なものであった。

「アセラクロム トータルプロテインＳ ＴＭＢ」添付文書、製造者：ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ社、フランス国；製造販売者：ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国、２００８年３月改訂（第２版）

従って、本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来る、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法を提供することである。

本発明者らは、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する測定試薬及び測定方法において、抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させることにより、試料中の総プロテインＳ蛋白質量を簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させることを特徴とする測定方法。
（２） 担体粒子がラテックス粒子である、前記（１）記載の測定方法。
（３） 試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定が、次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）又は（２）に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法。
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。
（４） プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む測定試薬において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有することを特徴とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
（５） 担体粒子がラテックス粒子である、請求項４記載の測定試薬。
（６） 次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定のためのものである、前記（４）又は（５）に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。

本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来るものである。

本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法及び測定試薬における、検量線を示した図である。 本発明による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬との相関を示したグラフである。 本発明による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬との相関を示したグラフである。 本発明による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬との相関を示したグラフである。 本発明による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬との相関を示したグラフである。 本発明による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬との相関を示したグラフである。 試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果との比較を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕プロテインＳに対する抗体
本発明において、プロテインＳに対する抗体とは、プロテインＳに結合することができる抗体（抗プロテインＳ抗体）のことをいう。

この抗プロテインＳ抗体としては、例えば、（プロテインＳに結合することができる）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの抗体の断片〔Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖなど〕等を挙げることができる。
また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。

なお、抗プロテインＳ抗体の由来については特に限定はなく、例えば、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等を挙げることができる。

また、本発明においては、抗プロテインＳ抗体が、Ｃ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成したプロテインＳに、より強い反応性を示す抗体であることがより好ましい。

〔２〕担体粒子
本発明において、担体粒子は、前記の抗プロテインＳ抗体を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。

すなわち、プロテインＳと抗プロテインＳ抗体との抗原抗体反応を利用して試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体粒子、又は使用することが可能な担体粒子であればよい。

この担体粒子の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。

そして、この担体粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子等を挙げることができる。
また、本発明における担体粒子としては、ラテックス粒子であることが好ましい。

本発明において、抗プロテインＳ抗体を担体粒子に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解した抗プロテインＳ抗体を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。

更に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体粒子のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

なお、本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体粒子の大きさ（粒径）については、特に制限はない。
しかし、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたプロテインＳとの凝集物（凝集塊）を生成する程度、及びこの生成した凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ（粒径）は、その平均径（平均粒径）が、０．０１μｍ〜１０μｍであることが好ましく、０．０４μｍ〜１μｍであることがより好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法において、担体粒子は、その大きさ（粒径）、材質、又は形状等が異なる２種類以上の担体を使用してもよい。

なお、本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料中に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。

本発明の測定試薬及び測定方法においては、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。

そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

〔３〕Ｃ４ｂ結合タンパク質
本発明の測定試薬及び測定方法においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させる。ここで、Ｃ４ｂ結合タンパク質とは、肝細胞やマクロファージで産生される高分子糖タンパク質であり、プロテインＳと１対１で特異的に結合し、複合体を形成するものをいう。

また、本発明において用いるＣ４ｂ結合タンパク質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。

本発明において、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比が０．９以上（Ｃ４ｂ結合タンパク質／プロテインＳ≧０．９）となるように設定することが好ましい。

なお、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる方法であるが、このＣ４ｂ結合タンパク質を、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させることができればいかなる方法でも良い。

例えば、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を緩衝液に含有させた試薬を調製し、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を含む試薬と混合することによって、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、Ｃ４ｂ結合タンパク質を存在させるようにすれば良い。

なお、通常、健常者の試料中には、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」と、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の両方が存在しているが、本発明においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を、試料と混合、接触させることにより、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成する。
すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。
これにより、本発明の測定試薬及び測定方法では、全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが可能となる。

〔４〕試料
本発明において、試料とは、プロテインＳが存在する可能性があり、かつプロテインＳの存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、羊水、腹水などの体液、又は肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、プロテインＳが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。

〔５〕測定試薬
本発明の測定試薬は、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む総プロテインＳタンパク質量の測定試薬において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有することを特徴とするものである。

これにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に測定することができるものである。

本発明の測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。この場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、その一つの測定試薬に含有される。

また、本発明の測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってもよい。この場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。

例えば、本発明の測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。

本発明の測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、第１試薬にのみ含有させることが好ましい。

また、本発明の測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有しない方の試薬は、例えば、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む緩衝液等であってよい。

なお、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。

この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。

また、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬には、前記のプロテインＳに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子、及び前記のＣ４ｂ結合タンパク質の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などの蛋白質；カルシウムイオンなどの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。

なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。

なお、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定に使用することができる。
また、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定に使用することもできる。

前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。

〔６〕測定方法
本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法は、担体粒子に固定化された「プロテインＳに対する抗体」と試料中に含まれていた「プロテインＳ」との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させるものである。

本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。

この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。

以下、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬を用いて、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。

（１）まず、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬として、以下のものを準備する。
第１試薬：Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有する緩衝液
第２試薬：プロテインＳに対する抗体を固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液

（２）血漿等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。

試料と第１試薬との混合により、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成する。
すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。

（３）一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
そして、前記の静置の時間は、１分以上、１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、５分以下の一定時間であることがより好ましい。

試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗プロテインＳ抗体と、試料中のプロテインＳ（プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型））との抗原抗体反応（測定反応）を行わせる。

そして、この抗原抗体反応（測定反応）により、「…〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕−〔プロテインＳ〕−〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕…」の架橋が形成され、抗プロテインＳ抗体を固定化したラテックス粒子同士の凝集物が生成する。

（４）そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の凝集物により生ずるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記凝集物の量、すなわち、試料中の総プロテインＳタンパク質量を求める。

（５）そして、「試料の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」と、「標準液、標準血清等の標準物質（既知濃度のプロテインＳを含む試料）の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」とを比較することにより、測定を行った試料中の総プロテインＳタンパク質量（濃度）の算出を行う。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

〔実施例１〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法の効果の確認−１）
本発明の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬における検量線を作成した。

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ
ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ及び８μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、Ｃ４ｂ結合タンパク質濃度の異なる５種類の試薬を第１試薬とした。

（２）第２試薬の調製
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインＳ抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。

このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。

次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を得た。

（ｂ）抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１．０ｍＬと５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕１．０ｍＬとを混和し、更に３２０ｍＭカルボジイミド（同仁化学研究所；製品番号：３４８−０３６３１）水溶液３２μＬを添加して混和し、氷上で１０分間放置した。
前記の氷上で１０分間放置したラテックス粒子懸濁液１．２ｍＬに、前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を０．０８３ｇ／ｄＬの濃度で５０ｍＭ
ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕に混和した液１．８ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を０．８％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕にて懸濁し、３７℃で３時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長７００ｎｍにおける吸光度が１５．０ＯＤとなるように懸濁した。
これを抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。

（ｃ）第２試薬の調製
前記（ｂ）で調製した抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で１０倍希釈し、０．１％の「抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第２試薬とした。

２．試料
（１）試料希釈液の調製
抗プロテインＳ抗体結合アフィニティカラムを用いて調製したプロテインＳ欠損血漿（３．２％クエン酸血漿）を試料希釈液とした。
なお、プロテインＳ欠損血漿は、実施例１の（２）で作製したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を結合させたアフィニティカラム（９Ｈ６-Sepharose）を作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。
また、前記アフィニティカラム（９Ｈ６-Sepharose）は、CNBr activated Sepharose（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。

（２）試料の調製
（ａ）試料１
前記（１）で調製した試料希釈液を、プロテインＳタンパク質濃度０．０μｇ／ｍＬの試料１とした。
（ｂ）試料２
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿を前記（１）の試料希釈液で希釈することにより、プロテインＳタンパク質濃度１２．４μｇ／ｍＬの試料２を調製した。なお、この試料２において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、５μｇ／ｍＬであった。
（ｃ）試料３
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿を、プロテインＳタンパク質濃度２４．２μｇ／ｍＬの試料３とした。なお、この試料３において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、９．６μｇ／ｍＬであった。
（ｄ）試料４
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿に、プロテインＳ精製品（Enzyme Research Laboratories社製）を添加することにより、プロテインＳタンパク質濃度が３１．６μｇ／ｍＬの試料４を調製した。なお、この試料４において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、１７．６μｇ／ｍＬであった。
（ｅ）試料５
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿に、プロテインＳ精製品（Enzyme Research Laboratories社製）を添加することにより、プロテインＳタンパク質濃度が３８．７μｇ／ｍＬの試料５を調製した。なお、この試料５において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、２５．７μｇ／ｍＬであった。

なお、ここで調製した試料２〜５は、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」と、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の両方が存在している試料である。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質濃度の測定
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝−１２０ＦＲ形自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１〜５の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。

これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインＳと、前記の第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となった。

（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｂ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。

（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分３５秒目（１９ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。

（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分４７秒目（３３ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。

（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインＳタンパク質量（濃度）に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体（３．２％クエン酸血漿）を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳタンパク質濃度を求めた。

（２）測定結果
前記（１）において、試料中のプロテインＳの測定を行って得られた、前記各試料の測定値、即ち検量線を図１に示した。

なお、この図１において、横軸は試料中に含まれる総プロテインＳタンパク質の濃度、縦軸は７００ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。

４．考察
図１から明らかなように、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度に比例して試料中の総プロテインＳタンパク質量に比例した吸光度の上昇が見られる。また、各試料を測定した際の吸光度の上昇は、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質の濃度が６μｇ／ｍＬ以上で、ほぼ飽和状態になることが確認できる。
なお、試料２及び試料３では、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質の濃度が０μｇ／ｍＬでも、試料中のプロテインＳタンパク質量に比例した吸光度の上昇が確認できるが、これは、元々試料に含まれていたＣ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとの複合体に起因するものであり、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に反映した吸光度の上昇ではない。

これらのことより、本発明のＣ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させた試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法であれば、試料中に含まれる総プロテインＳタンパク質量を正確に測定できることが確かめられた。
すなわち、本発明は、試料中に含まれる全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

〔実施例２〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。

Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例１の１の（１）の第１試薬を用いた。

（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。

２．試料
健常人９名の血漿を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。

この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２〜５に示した。

ここで、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度が２μｇ／ｍＬのものが図２、４ｇ／ｍＬのものが図３、６μｇ／ｍＬのものが図４、そして、８μｇ／ｍＬのものが図５である。なお、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度が０μｇ／ｍＬでは、検量線が作成できなかったため、測定を行っていない。

ＩＩ．ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬
（１）Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
（ａ） Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。

（ｂ）この調製したＣ４ｂ結合タンパク質を、炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））に２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解した。
これを、９６ウェル−マイクロプレート（「MODULE
PLATE F8」（商品名）；ヌンク社製）の各ウェルに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置して、Ｃ４ｂ結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。

（ｃ）このマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液〔０．０５％ツイーン２０（Tween20）を含む５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕で３回洗浄した後、ブロッキング液〔「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）を純水に溶解し、２５％の濃度としたもの〕を１ウェル当たり２５０μＬずつ加え、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。

（２）パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
実施例１の１の（ａ）に記載した方法に従ってメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。

（ｂ）パーオキシダーゼの調製
２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ、又はＨＲＰ）〔ホースラディシュ由来；東洋紡績社製〕を、０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
これに、０．２５ｍｇのＮ−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを３０μＬ加えて、３０℃で６０分間インキュベートした。

その後、これを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。

（ｃ）前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．２５ｍＬに溶解した。
これに、前記（ｂ）で調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを添加した。

この混合物を、３０℃で２０時間インキュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいた、ウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。

（ｄ） 前記（ｃ）で得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、検体希釈液〔２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７.５）〕で、１μｇ／ｍＬになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を調製した。

２．試料
前記のＩの２における試料（健常人９名の血漿）を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
（１）測定手順
（ａ）前記１の（１）で調製した「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記１の（２）で調製した「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用いて前記２の試料の測定を行った。

（ｂ） 前記２の試料と検体希釈液〔０．１％ＢＳＡ、０．１％塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で、５２７１倍希釈し、前記１の（１）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
この操作を、前記マイクロプレートの９枚について行った。

そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、３７℃で４時間静置して反応を行わせた。

（ｃ） この３７℃での４時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記１の（１）の（ｃ）の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）

（ｄ） 前記１の（２）で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記（ｃ）で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。そして、これを２５℃で１時間静置して反応を行わせた。

この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。

（ｅ） この２５℃、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）

（ｆ）その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ
Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記（ｅ）で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１０分間、発色反応を行わせた。

（ｇ） この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ
Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。

（ｈ） このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。

（ｉ）そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
実施例１の２で調製した試料を標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中の総プロテインＳタンパク質濃度の算出を行った。

この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２〜５に示した。

ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図２〜５に示した。

これらの図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、これらの図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。

また、相関の関係式を求めた結果を表１に示した。

この表１において、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度毎に、回帰式及び相関係数を示した。

この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、Ｃ４ｂ結合タンパク質の濃度が６μｇ／ｍＬ以上の場合に、ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量とより良好な相関性を示すことが分かる。

このようにＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。

そして、このようにＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。

また、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度が６μｇ／ｍＬ以上の場合、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比は、０．９であった。
すなわち、本発明において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比が０．９以上（Ｃ４ｂ結合タンパク質／プロテインＳ≧０．９）となるように設定することが好ましいことが確かめられた。

〔実施例３〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法の再現性の検討）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法により試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する際の測定の再現性について検討した。

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
Ｃ４ｂ結合タンパク質を２５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加すること以外は、前記の実施例１の１の（１）と同様に第１試薬を調製した。

（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。

２．試料
ヒトの血漿の４検体を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
（１）前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行った。

（２）前記（１）の操作を繰り返して計５回行い、同時再現性の検討を行なった。

（３）また、前記（１）の操作を連続する３日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。

４．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を表２に示した。

この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差（ＳＤ）」及び「変動係数（ＣＶ）」を示した。

この表より、同時再現性における変動係数（ＣＶ）は０．４％〜１．２％の範囲のものであり、測定値のバラツキが小さく、精密に測定できていることが分かる。

また、日差再現性における変動係数（ＣＶ）は０．７％〜１．４％の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。

これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。

〔実施例４〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＩＳＡ法との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。

Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定
１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例３の１の（１）の第１試薬を用いた。

（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。

２．試料
健常人５０名の血漿を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。

この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図６に示した。

ＩＩ．ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬
ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬として、市販の「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」（製造者：ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ社、フランス国；製造販売者：ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国）を用いた。

なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」は次のものより構成される。
（ａ）抗体コーティングストリップ（抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｂ）抗体コンジュゲート（ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｃ）基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、及び３０％過酸化水素水）
（ｄ）希釈緩衝液
（ｅ）洗浄液
（ｆ）スタンダード（総プロテインＳ・キャリブレーター）
（ｇ）コントロール（総プロテインＳ・コントロール）
（ｈ）プレートフレーム
（ｉ）プレートカバー

２．試料
前記のＩの２における試料（健常人５０名の血漿）を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行った。

なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」における操作方法は次の通りである。
（ａ） 検体（クエン酸血漿）を希釈緩衝液で１０１倍に希釈し、試料とする。
（ｂ） 希釈緩衝液で１０１倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
（ｃ） 抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを５０μＬ分注する。
（ｄ） 試料又は希釈したスタンダード２００μＬをそれぞれ分注し、１８〜２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｅ） 各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄する。
（ｆ） 洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液２００μＬを分注し、１８〜２５℃で５分間インキュベーションする。
（ｇ） １Ｍ硫酸５０μＬを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。１５分間放置した後、１時間以内に波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
（ｈ） スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインＳ濃度を求める。

このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。

この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図６に示した。

ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図６に示した。

この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。

この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はｙ＝０．９０８ｘ−１．２８２であり、相関係数はｒ＝０．９７であった。（ｘ：前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定結果、ｙ：前記Ｉの本発明による総プロテインＳタンパク質量の測定結果）

この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。

このようにＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。

そして、このようにＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を測定することが出来るものであることが分かる。

これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。

〔実施例５〕
（総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値との比較）
本発明の試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定試薬及び測定方法により得た総プロテインＳのタンパク質量と、比色法による試料中の総プロテインＳの活性値の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインＳの活性値とを比較した。

Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．総プロテインＳのタンパク質量の測定試薬
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例３の１の（１）の第１試薬を用いた。

（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。

２．試料
次の（１）〜（４）をそれぞれ試料として用いた。
（１）健常人２１１名の血漿
（２）プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している７名の血漿
（３）プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している１名の血漿
（４）プロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿

３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳのタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。

この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図７に示した。

ＩＩ．比色法による試料中の総プロテインＳの活性値の測定方法及び測定試薬による測定
１．比色法による総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、希釈液を調製した。

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．０６％（Ｗ／Ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
クエン酸三ナトリウム １０．６ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ

（２）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。

活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ３９７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ

なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。

また、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、２４μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）」ということがある。〕

（３）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。

活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ３５７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ

なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。

また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。

（４）第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第３試薬を調製した。

活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国） ５０ｐＭ
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ７３８ｎＭ
Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ-Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、イタリア国） ７５０μＭ
リン脂質
塩化カルシウム ５．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ

なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．６ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）１．０ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５（すなわち、３０％（Ｗ／Ｖ）：２０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、７．５μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）」ということがある。〕

２．試料
前記のＩの２の（１）〜（４）の各試料を、試料として用いた。

３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
各試料の総プロテインＳの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１７０Ｓ形汎用自動分析装置を使用して行った。

（１）前記２の試料それぞれについて、前記１の（１）の希釈液により希釈倍率１５倍で希釈を行った。

（２）前記（１）で希釈した試料２．０μＬに、前記１の（２）の第１試薬の９８μＬを添加し、３７℃で１．４分間反応させた。

（３）次に、前記１の（３）の第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で８．３分間反応させた。

（４）次に、前記１の（４）の第３試薬の２３６μＬを添加し、３７℃で反応させた。

（５）前記（４）における第３試薬の添加の後、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の変化を１２、３分間測定した。

４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３の（５）において測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。

なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。

そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。

なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインＳ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）の１μｇ／ｍＬが有する総プロテインＳ活性値を、総プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインＳの活性は、「μｇ／ｍＬ当量」を用いて表している。

この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図７に示した。

ＩＩＩ．測定結果
１．図の説明
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果とを比較する図を、図７として示した。

この図において、横軸（ｘ）は前記Ｉの本発明による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記ＩＩにおける比色法による試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。

２．健常人の試料の比較
前記Ｉの本発明による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの比色法による総プロテインＳの活性値の測定結果との比較を、次のようにして行った。

試料が健常人２１１名の血漿である場合について、前記Ｉの総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの総プロテインＳの活性値の測定結果より、プロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）を求めた。

この健常人２１１名の血漿の試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（以下、ＳＤということがある）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、総プロテインＳの活性値の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）範囲を求めた。

なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。

この図において、比活性の平均値であるｙ＝０．９９ｘの式の線を実線で表した。
また、この式ｙ＝０．９９ｘの上及び下に、平均±２ＳＤを示す線（ｙ＝１．１９ｘ、及びｙ＝０．７９ｘ）を破線でこの図に表した。
そして、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上に平均＋３ＳＤを示す線（ｙ＝１．２９ｘ）を点線で、またこの式ｙ＝０．９９ｘの線の下に平均−３ＳＤを示す線（ｙ＝０．６９ｘ）を実線でこの図に表した。

健常人２１１名の血漿の試料の測定結果において、この図７で、前記のｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れるものが、７つ認められた。
すなわち、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下の試料が、７つ認められた。

これらの比活性が０．６９以下の７つの試料のうち、すなわち総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離している７の試料のうち、同意が得られた３つの試料についてプロテインＳ遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの３つの試料のいずれもプロテインＳ遺伝子のＰＳ−Ｋ１５５Ｅ変異（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明した。〔図７において、これらの３つの試料に矢印（↓又は↑）を付した。〕

このことより、試料中の総プロテインＳのタンパク質量及び試料中の総プロテインＳの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。

３．プロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料の比較
前記Ｉの２の（２）〜（４）のプロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料（計９名の試料）のそれぞれについて、前記Ｉの本発明による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの比色法による総プロテインＳの活性値の測定結果との比較を行う。

図７において、前記Ｉの２の（２）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している７名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Ｉの２の（３）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Ｉの２の（４）のプロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「□」で示した。

プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、前記の図７におけるｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下であることが分かる。
つまり、これらの９つの試料は、総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。

よって、試料中の総プロテインＳのタンパク質量及び試料中の総プロテインＳの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインＳの遺伝子変異の９つの試料の比較結果からも確かめられた。

本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが出来るものである。
よって、本発明により総プロテインＳタンパク質量を求めた試料について、別途総プロテインＳの活性値を求め、その試料におけるプロテインＳの比活性（活性値／タンパク質量）を算出することにより、プロテインＳの異常症を検出することができる。

すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。

そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、上記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。

なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができるのである。

なお、本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料中に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０．００５〜１％（Ｗ／Ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。

１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ及び８μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、Ｃ４ｂ結合タンパク質濃度の異なる５種類の試薬を第１試薬とした。

３．試料中の総プロテインＳタンパク質濃度の測定
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝−１２０ＦＲ自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１〜５の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。

（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。

この健常人２１１名の血漿の試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（以下、ＳＤということがある）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、総プロテインＳの活性値の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）の範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）の範囲を求めた。

Claims (6)

1. プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させることを特徴とする測定方法。
2. 担体粒子がラテックス粒子である、請求項１記載の測定方法。
3. 試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定が、次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法により行われるものである、請求項１又は２に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法。
   （ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
   （ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。
4. プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む測定試薬において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有することを特徴とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
5. 担体粒子がラテックス粒子である、請求項４記載の測定試薬。
6. 次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定のためのものである、請求項４又は５に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
   （ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
   （ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。

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