JP2011523059A

JP2011523059A - 生物組織中のカロテノイドの非侵襲的測定

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Publication number: JP2011523059A
Application number: JP2011512648A
Authority: JP
Inventors: エルマコフ，イゴール，ヴィ; ゲラーマン，ウェルナー
Original assignee: ロンジェヴィティ・リンク・インコーポレイテッド
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-08-04
Anticipated expiration: 2029-06-04
Also published as: AU2009256144B2; US20090306521A1; US8260402B2; AU2009256144A1; CA2726975A1; EP2294385A4; US20120330164A1; JP5574246B2; EP2294385A2; WO2009149266A3; WO2009149266A2; KR20110038020A

Abstract

生体の皮膚等の生物組織中のカロテノイド抗酸化物質及び類似の化合物を調べる方法及び装置が提供される。この方法及び装置により、非侵襲的で、迅速、正確、かつ安全なカロテノイドレベルの測定が提供され、これにより組織の抗酸化状態の診断情報が提供される。反射分光法を用いて、組織中のカロテノイドの濃度及び類似の物質が測定される。白色光は対象とする組織領域へ方向付けられる。極僅かな拡散的散乱光が集められ測定される。組織を押圧して測定組織容量から血液を一時的に圧搾する間、反射スペクトルをほぼリアルタイムで連続的にモニターし、表示し、分析する。通常１５秒の最適化時間の後に、優先的であったヘモグロビン及びオキシヘモグロビン組織吸収が反射スペクトルに与える影響が最小化される。

Description

関連出願
本願は、米国特許出願第１２／１３４，６６７号（２００８年６月６日提出）に基づき優先権を主張し、この参照によりその内容全体を本願明細書に引用したものとする。

本発明は概して、生物組織中の化合物を測定する光学技術に関する。より具体的には本発明は、抗酸化状態の評価及び悪性疾患（malignancy diseases）又はそのリスクの検出における、診断補助として用いることのできる、生物組織中のカロテノイド及びそれに関連する化学物質のレベルを非侵襲的に検出及び測定する方法及び装置に関する。

果物及び野菜の摂取を多くすることは、様々な癌［非特許文献１、２］、心臓血管疾患［非特許文献３］、黄斑変性症［非特許文献４］の予防に関連があると考えられている。その上、エネルギーの増加と良好な健康全般に寄与する重要な要因であると一般に考えられている。カロテノイドは、果物及び野菜に広く分布しているため、果物及び野菜摂取の客観的なバイオマーカとして用いることができ、またカロテノイド自体が、植物性食物の抗発癌性植物化学物質の１つであると考えられている［非特許文献１］。

カロテノイド状態の評価においては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析用に採取される血漿又は血清試料が利用されることが多い。この方法が現在の基準であると考えられているが、高価であること、血液中のカロテノイド濃度が変動すること（半減期が比較的短い）、静脈穿刺について消極的な参加者による潜在的な選択偏向があること等、幾つかの重大な制約がある。

カロテノイドのような脂溶性栄養素をより安定的に貯蔵する脂肪組織からカロテノイド状態を評価することも、幾つかの疫学研究において検討されている。しかしこの方法は、生検及びＨＰＬＣ分析用のより複雑な試料調製を必要とする。その結果、果物及び野菜摂取を客観的に評価するための、高感度、非侵襲的で安価なカロテノイド評価方法が必要とされている。

光学モニター技術の開発により、ヒト生体組織中のカロテノイドの測定用として、ＨＰＬＣに代わる手段が提供されている。特に、共鳴ラマンスペクトル法（ＲＲＳ）が、カロテノイド状態の客観的指標として提案されている［非特許文献５、６］。光を用いて皮膚中のカロテノイド状態を測定する新規で非侵襲的な技術では、青色波長域における波長が狭い光源をＲＲＳに利用して、皮膚中の総カロテノイド濃度を測定している［非特許文献７］。固有の分子構造とそれに対応する固有の振動エネルギー準位に基づいて、ラマン散乱光により、カロテノイド分子のスペクトルフィンガープリントが得られる［非特許文献８］。

果物及び野菜由来のカロテノイドは皮膚の皮層中に蓄積するため、ＲＲＳを用いてこれら分子の濃度を非侵襲的に検出することができる。測定は、全てのカロテノイドに共通する振動炭素主鎖から生じる共鳴ラマン応答に基づくものである［非特許文献５］。さらに具体的には、主鎖の炭素−炭素の一重結合及び二重結合の伸縮周波数はそれぞれ、その振動伸縮周波数の量だけ励起光周波数からシフトした、スペクトル的にはっきりしたラマン信号を発生する。ラマン線の強度は、分光計又はフィルターを介して励起光から容易に単離され、線形検出器配列で検出され、定量化される。

ラマンスキャニングに好適な体の部位の１つとして、手のひらが用いられている。これは皮膚のメラニン色素が少なく、様々な人種的・民族的背景の個人間であまり変わらないためである。加えて、外皮組織層である角質層は、手のひらにおいて比較的厚い（約４００μｍ）。そのため、励起光がこの強い散乱層（光透過深度２００μｍ範囲内）を越えて、交絡の可能性のある他の発色団を励起しうる、より深い組織層に浸透することがない。

ＲＲＳを用いて５７人の被験者の手のひらにおけるカロテノイドレベルを検出して、有意な幅（中央値の約５０％）の正規分布が得られている［非特許文献８］。これはカロテノイド状態の客観的マーカーの重要な特性である、被験者間の明確なばらつきを意味している。ＲＲＳで測定した手のひら内部のカロテノイドレベルと空腹時血清のＨＰＬＣで得られたカロテノイドレベルとが強力かつ顕著に相互関連付けされることが示されており、従って方法の有効性が間接的に立証されている［非特許文献９］。皮膚カロテノイドのラマン測定及びそれに続く測定組織容量（tissue volume）の生検と、その後のＨＰＬＣ分析とを含む、直接的な確認験が近年行われている［非特許文献１０］。ここでも、両方法に高い相関関係があることが示された。

これまでのところ、反射分光法を用いて、ヒト網膜中のカロテノイド斑状色素が測定されている［非特許文献１１］。皮膚と比較して、健常ヒト斑におけるカロテノイドレベルはおよそ２桁大きく、網膜中の交絡しうる発色団の濃度は比較的低い。その上、網膜の前方にあるヒト眼球の光学的媒体は、比較的透明で光散乱が顕著に少ない。眼球の強膜は、強膜までの全組織層を通過して戻る、励起光の略一直線で二重路の伝搬を実現する光反射体として、用いることができる。このような好都合な要素から、多層連続光透過モデルを用いることが可能となっている。このモデルにおいては、個々の吸収及び／又は散乱効果は、８〜１０個の吸収及び／又は散乱係数によってそれぞれ説明され、斑状カロテノイド色素レベルは、計算した反射スペクトルを測定したスペクトルに当てはめる多重パラメーターから得られる。

しかしヒト皮膚においては、外側角質層によって引き起こされる強い光散乱があるため、組織中の光伝搬の推定や直線光路のモデル化ができない。その上、反射板として用いることのできる効果的な内部界面が存在しない。その結果、［非特許文献１１］の方法論を適用することができない。これまでは皮膚カロテノイドレベルの測定に反射分光法が用いられていたが［非特許文献１２、１３］、これらの著者はデータ導出の詳細を示しておらず、提示された精度は比較的低く、方法の確認も示されていない。その結果、これらの方法は幅広く応用されていない。

生体のヒト組織中の組織発色団分布の不均一性が、非侵襲的反射スペクトルの解析における主な障害となっており［非特許文献１４］、混濁した媒体中では光輸送の拡散理論が無効になると考えられる。その結果、組織の不均一性については、光源と検出装置との距離を短距離（１００μｍの範囲内）に限定し、かつ組織の多区画光伝搬モデルを含む複雑なスペクトル逆重畳積分アルゴリズムを必要とする測定スキームを用いて、特異的に対処する必要があると考えられる。

ヒト皮膚反射スペクトルは、この方法を用いて、ヘモグロビン及びオキシヘモグロビン吸収のスペクトル吸収域において高い精度でモデル化されているが、この方法で測定したスペクトルから得られるカロテノイド吸収の逆重畳積分には問題があることが判明している［非特許文献１４］。というのは、信号が他の交絡発色団吸収によって「かき消される」又は圧倒されてしまうためである。この方法の著者は「βカロテンに関する生体内スペクトルの分析はより精緻であり・・・将来の研究対象となるであろう」と明確に述べている［非特許文献１４］。

皮膚カロテノイド濃度を得る更なる試みでは、皮膚色飽和測定が研究されている［非特許文献１５］。この方法では、色の三刺激ｂ値が測定され、白色反射標準の色度図と比較される。ｂ値は黄色〜青色領域の彩度を測定するものなので、このスペクトル領域において起きる皮膚カロテノイド吸収の影響があることが期待される。しかし測定は、カロテノイド吸収のみによって影響を受けるのではなく、血液及びメラニンの多重の吸収及び散乱効果によっても影響を受けるため、むしろ非特異的な結果が得られる。

ＲＲＳは、高度に分子特異的で高度に適用性があることから、実地使用可能な光学的皮膚カロテノイド検出方法として将来の実現可能性を秘めているが、得られたＲＲＳ応答が適切に解析されるように注意を払う必要がある。異なるカロテノイド種、例えば一方にβカロテン、他方にリコピン等を備えた、異なる長さの共役炭素骨格を有するカロテノイド種は、スペクトル吸収帯が僅かにシフトしている。従って、あるカロテノイド化合物の励起光が他のカロテノイド化合物より重なる場合には、ＲＲＳ検出法は、前者に有利に働きうる。

βカロテン及びリコピンの相対皮膚濃度は事前に知ることができず、それらは個人間で顕著に異なりうる［非特許文献８］ので、この波長依存性が考慮されない場合、ＲＲＳ応答は、実際の複合カロテノイド組織濃度を反映しない。その上、皮膚カロテノイドのＲＲＳ検出法は絶対検出技術であり、すなわちこれはＲＲＳカロテノイド信号応答の強度は励起光強度と直線的に対応し、望ましくない組織発色団吸収や散乱損失が光路に存在する場合、人為的に減少可能であることを意味する。このような理由から、ＲＲＳ測定を外部のカロテノイド較正標準に対して継続的に較正し、交絡組織発色団吸収の存在しない皮膚組織層のＲＲＳ測定に限定するように注意を払う必要がある。これを実現する最良の方法は、励起及び散乱光線路を手のひらの最外層である角質層に限定することである。通常は無機物質である外部のカロテノイド較正標準における光伝播が、生体組織の光学的特性を適切にシミュレートできない場合には、問題が起こる可能性がある。

D. S. Michaud, D. D. Ffeskanich, E. B. Rimm, et al. "Intake of specific carotenoids and risk of lung cancer in 2 prospective UScohorts", Am. J. Clin. Nutr. 92, 990-997 (2000). L. N. Kolonel, J. H. Hankin, A. S. Whittemore, et al., "Vegetables, fruits, legumes, and prostate cancer: a multiethnic case-control study", Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9, 795-804 (2000). S. Liu, J. E. Manson, I. M. Lee, et al., " Fruit and vegetable intake and risk of cardiovascular disease: the Women's Health Study", Am. J. Clin. Nutr. 72, 922-928 (2000). Age-Related Eye Disease Study Group, "The relationship of dietary carotenoid and vitamin A, E, and C intake with age-related macular degeneration in case-control study", ARES Rep. No. 22, Arch. Ophthalmol. (Chicago) 125, 1225-1232 (2007). W. Gellermann, R. W. McClane, N. B. Katz, and P. S. Bernstein, "Method and Apparatus For Noninvasive Measurement Of Carotenoids And Related Chemical Substances in Biological Tissue", U.S.Patent 6,205,354 Bl (March 2001). T. R. Hata, T. A. Scholz, I. V. Ermakov, et al., "Noninvasive Raman spectroscopic detection of carotenoids in human skin", J. Invest. Dermatol. 115, 441-448 (2000). I. V. Ermakov, M. R. Ermakova, R. W. McClane, W. Gellermann, "Resonance Raman Detection of Carotenoid Antioxidants in Living Human Tissues", Opt. Lett. 26, 1179-1181 (2001). I. V. Ermakov, M. R. Ermakova, W. Gellermann, and J. Lademann, "Noninvasive selective detection of lycopene and beta-carotene in human skin using Raman spectroscopy", J. Biomed. Opt. 9, 332-338 (2004). W. Gellermann, J. A. Zidichouski, C. R. Smidt, and P. S. Bernstein, "Raman detection of carotenoids in human tissue", in Carotenoids and Retinoids: Molecular Aspects and Health Issues, L. Packer, K. Kraemer, U. Obermueller-Jervic, and H. Sies, Eds., Chapter 6, pp. 86-114, AOCS Press, Champain, Illinois (2005). S. Mayne et al., manuscript in preparation. J. van de Kraats, D. van Norren, T T.J.M Berendschot, U.S.patent application US2007/0252950. W. Stahl, U. Heinrich, H. Jungmann, J. von Laar, M. Schietzel, H. Sies, and H. Tronnier, "Increased dermal carotenoid levels assessed by noninvasive reflection spectrophotometry correlate with serum levels in women ingesting betatene", J. Nutr. 128, 903 (1998). W. Stahl, U. Heinrich, H. Jungmann, H. Tronnier, and H. Sies, "Carotenoids in Human Skin: Noninvasive Measurement and Identification of Dermal Carotenoids and Carotenol Esters", Methods in Enzymology 319, 494-502 (2000). F. Niedorf, H. Jungmann, and M. Kietzmann, "Noninvasive reflection spectra provide quantitative information about the spatial distribution of skin chromophores", Med. Phys. 32, 1297-1307 (2005). S. Alaluf, U. Heinrich, W. Stahl, H. Tronnier, and S. Wiseman, "Dietary Carotenoids Contribute to Normal Human Skin Color and UV Photosensitivity", J. of Nutrition 132, 399-403 (2002).

従って、生物組織中に様々な度合いで存在するカロテノイド及び他の類似の化合物のレベルについて、安全、非侵襲、迅速、正確、かつ特異的な、改良された測定方法及び装置を提供すること、並びにその情報を抗酸化状態の評価及び悪性疾患又はそのリスクの検出における診断補助として用いることで、改善が得られる。具体的には、皮膚カロテノイド組成物の種類の違いに対して感度が低く、外部のカロテノイド標準を用いる較正を必要としない方法が望ましい。

本発明は、生体の皮膚等の生物組織中のカロテノイド及び他の関連物質を測定する方法及び装置を特徴とする。特に本発明の方法は、非侵襲的で、迅速、安全、安価、かつ正確な、生物組織中のカロテノイド及び類似の物質のレベルの測定であり、ひいては果物及び野菜摂取のバイオマーカとして用いることが可能な測定を提供し、かつ悪性疾患のリスク及びそのリスクに関する診断情報を提供する。このような初期診断情報により、予防処置が可能となる。

好ましい実施形態では、反射分光法を用いて、皮膚などの組織中のカロテノイド及び類似の物質のレベルを定量的に測定する。この技術において、白色光は、送光プローブヘッドに押圧された対象とする組織領域へ方向付けられる。組織から反射した光は、高感度の光検出システムを用いて測定され、スペクトル反射成分に関して分析される。反射光のスペクトル成分と白色反射標準とを比較することで、皮膚カロテノイド化合物の光学濃度及び直接的に相互関連した濃度レベルを非侵襲的に定量化することができる。本発明は特に、ヒト皮膚中の総カロテノイド含有量の検出に有用である。

本発明のこれら及びその他の目的及び特徴は、以下の説明によって更に十分に明らかとなるであろう。あるいは、下記に説明する発明の実施により理解可能となるであろう。

本発明の上述した並びにその他の利点及び目的が得られる方法を例証するために、上で簡単に述べた本発明を、添付の図面に例示される特定の実施形態を参照にしてより具体的に説明する。これらの図面は本発明の典型的な実施形態に過ぎず、従って範囲を限定しないものと見なすべきであると理解されよう。添付の図面を用いて、付加的な特異性と詳細と共に本発明を説明する。
本発明による装置の全体的概略図である。本発明による実験装置の概略図である。ヒト皮膚組織における主な３吸収体のモデル吸収スペクトルを示す。装置の光学プローブヘッドに押圧された皮膚組織部位の反射スペクトル及びそれから得た光吸収スペクトルを示し、皮膚カロテノイドレベル測定の単純化されたデータ解析手順を例示する。制限されない血流及び制限された血流それぞれについての、生体の皮膚組織の反射及びそれから得た吸収スペクトルを示す。測定過程中に測定皮膚組織部位において起こる事象のフロー図を示す。装置の光学プローブヘッドに押圧されたヒト皮膚組織部位の反射スペクトル及びそれから得た吸収スペクトルを示す。測定組織容量がプローブヘッドレンズに押圧される際の、反射率測定値対時間から得た皮膚カロテノイドの見掛けの光学濃度を示す。切除した非観血式の踵組織試料の３５０〜８００ｎｍ波長域における光吸収スペクトル、潜在する散乱、及びそれから得た皮膚カロテノイド光吸収スペクトルを示す。切除した非観血式の踵組織試料について、反射率測定より得た反射及び見掛けの光吸収スペクトルと、これらの測定から得た皮膚カロテノイドの光吸収スペクトルとを示す。切除した非観血式の踵組織試料について、透過率及び反射率測定により得たカロテノイド光吸収スペクトルを示し、これらのスペクトルとβカロテン溶液の光吸収スペクトルとを比較する。反射率に基づいた皮膚カロテノイド測定の短期及び長期再現性を示す。ラマン分光法及び反射分光法それぞれによって調べた皮膚カロテノイドレベルの相互関係を示す。代替として用いられる単純化した反射率の計測手段の配置の概略図を示す。

本発明は、生物組織中のカロテノイド及びそれに関連する化学物質を非侵襲的に検出及び測定する方法及び装置に関する。特に、本方法及び装置は、ヒト皮膚等の生物組織中のカロテノイド、その異性体及び代謝物の濃度の、迅速、非侵襲的かつ定量的な測定を可能にする。これは、従来の「究極基準」技術に必要とされる、組織除去又はＨＰＬＣ分析用の試料調製を必要とすることなく、実現される。

本発明は、無傷組織に低輝度の白色光照射を用い、高空間分解能を提供し、組織中のカロテノイドレベルの正確な定量化を可能にする、直接的かつ定量的な光診断技術において使用することができる。そのような技術は果物及び野菜摂取のバイオマーカとして有用であり、悪性疾患等の組織異常の検出における補助とすることができる。

本発明は、反射分光法の技術を採用し、皮膚等の生物組織中のカロテノイド及び類似の物質の存在の同定及び定量化に用いている。この技術において、白色光、すなわち藍色から近赤外までの波長域の範囲にわたる大きなスペクトル強度分布を有する光が組織に向けられ、拡散的に散乱した光が、スペクトル的に分散し又は除去され、検出される。拡散的散乱光は、メラニン、血液、及び全ての皮膚カロテノイドを含む様々な皮膚発色団の吸収帯によって、光散乱が減少したスペクトル領域を含む。これら吸収の形状及び強度は、反射スペクトルから得ることができ、それらの強度は光学濃度単位で定量化することができ、従ってこの測定法は、被験者の皮膚に存在するカロテノイドの濃度レベルを直接的に示すものとして用いることができる。

本発明で反射率測定を実施する方法は、強力に吸収する交絡発色団の存在下におけるカロテノイドに特異的な分光的特徴の同定に関連して起こる問題を克服する助けとなる。好ましい実施形態では、干渉する血液発色団が測定対象の組織容量から最大限に圧搾されるように、光学プローブヘッドに押圧することのできる指先等の組織部位を用いる。本発明の装置により、反射スペクトルを継続的に測定し表示すること、組織カロテノイドレベルを得るのに有用な反射スペクトルの記録に最適な血液枯渇した組織状態を同定することが可能になる。ここで説明する発明によって被験者の皮膚カロテノイドレベルを評価するのに必要な総時間は、約１５秒である。

本発明による生物組織中のカロテノイド及びそれに関連する化学物質を非侵襲的に測定する方法において、約３５０ｎｍから９００ｎｍ以上の広いスペクトル領域にわたる十分に高い輝度の発光を特徴とする、５０Ｗタングステンハロゲンランプ等の光源を用いる。この広い範囲は、可視／青色スペクトル領域におけるカロテノイドの吸収帯と重なる。切除した（excited）組織容量で光が拡散的に散乱する場合、反射光は、測定組織容量に存在するカロテノイド及び他の発色団の吸収によって影響を受ける。短時間、すなわち約１５秒間、測定組織容量から交絡血液発色団を絞り出した後、被験者の皮膚における複合カロテノイド吸収の強度が得られる。次にこの強度から、カロテノイド組織濃度レベルが得られ、組織の抗酸化状態の評価に用いることができる。濃度レベルを正常生物組織のレベルと比較して、悪性疾患のリスク又は存在を評価することができる。

図１は、反射分光法を用いて生物組織中のカロテノイド及び類似の物質を測定する本発明の装置の全体的概略図である。装置は白色光源１００を備えており、好ましい実施形態の１つにおいて白色光源はタングステンハロゲン光源である。あるいは光源は、広いスペクトルの光を発生する他の装置を含んでいても良い。カロテノイドの場合、光源は、カロテノイドの吸収域を越えて藍色／近紫外領域まで、さらには遠赤色／近ＩＲスペクトル領域まで広がる波長範囲３５０〜８００ｎｍにおいてかなりの強度の光を発生することが好ましい。そのような光は、例えば市販の安価なスライドプロジェクターランプから、容易に得ることができる。しかし、本発明は、所望される場合、例えばカロテノイド吸収域を越えたスペクトル波長域にわたる白色発光ダイオード由来の光等の他の波長の光も用いることができるため、これらの波長内で得られる光に限定されないことは理解されるべきである。

光源１００は、白色光を測定対象の組織に向けて拡散的散乱光を集める様々な光学部品を備えることのできる、送光（１０２）及び集光（１０４）システムと光学的に連通している。図１に示すように、送光及び集光システムの光学部品には、ファイバー束１０６の出力ポートと、ビーム拡大器１０８と、コリメーティングレンズ１０９と、開口部１１０と、平凸レンズ１１２と、第２の開口部１１４と、集光レンズ及び結像レンズ１１６と、第２のファイバー束１１８の入口ポートとが含まれる。これら光学部品と光源からの光との相互作用を、以下に更に詳述する。

送光及び集光システムは、拡散散乱光の光成分をスペクトル的に分散する機能を実行する分光計１２０等のスペクトル選択的システムに光学的に連通している。スペクトル選択的システムの例としては、回折格子、プリズム、ホログラフィックフィルター、誘電性フィルター、それらの組み合わせ等を含む様々な光学部品が挙げられる。

スペクトル選択的システムは、光検出システム１２２等の検出手段に光学的に連通している。この検出手段は、皮膚中のカロテノイドに特徴的な波長範囲等の、対象とする波長範囲における波長の関数として、拡散的散乱光の強度を測定することができる。光検出システムの例としては、ＣＣＤ（電荷結合素子）検出器配列、増強ＣＣＤ検出器配列、光電子倍増管装置、フォトダイオード等の装置が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

スペクトル選択的システム及び光検出システムは、電荷結合シリコン検出器配列で迅速な検出を行う低解像度回折格子分光計等の市販の分光計システムから選択することができる。例えば、３００ライン／ｍｍの分散回折格子と、個々の画素幅１４μｍのシリコン検出器配列を採用する回折格子分光計を用いることができる。別の好適な分光計は、ＣＣＤ検出器配列に連結し、体積ホログラフィック透過回折格子を採用するホログラフィックイメージング分光計である。スペクトル選択的システム及び光検出システムは、増強ＣＣＤカメラ等の低光量ＣＣＤ結像配列に関連して用いられるスペクトル選択的光学素子を含む結像システムに組み込んで用いることもできる。

検出された光は、好ましくは、コンピュータモニター等の出力ディスプレー上に画像表示することのできる信号に光検出システムによって変換する。所望される場合には、光検出システムが、光信号を他のデジタル形式又は数値形式に変換してもよいことは理解されよう。その結果得られる拡散的散乱光信号は、好ましくは、他の実験で化学的に測定したカロテノイドレベルとの比較によって較正される定量システム等の定量化手段を介して分析される。定量システムはコンピュータであってもよく、好ましくは、拡散的に散乱した白色参照基準にスペクトルを正規化する、測定組織容量に存在するカロテノイドの光学濃度値を決定する等の、スペクトル操作が可能なデーター取得ソフトがインストールされたコンピュータである。定量システムは、ＣＣＤ画像表示装置又はモニターを備えていてもよい。定量システムは、１個のコンピュータの出力ディスプレーと組み合わせてもよく、実際のカロテノイドレベルに比例する、光学濃度等の他の実験で得たカロテノイドレベルの結果で較正することができる。

装置の操作中、光ビームが光源から発生し、入力光ファイバーを介して送光及び集光システムへ方向付けられる。拡大光ビームは視準され、測定対象の組織に物理的に接触するレンズへ方向付けられる。組織で拡散的に散乱した光は次いで第２のレンズにより集められ、回折格子分光器等のスペクトル選択的システムに光を送る出力ファイバー束の面上に結像される。スペクトル的に分散した光は、全ての皮膚発色団の吸収帯にわたる波長範囲において、光強度を波長の関数として測定する光検出システムへ方向付けられる。光検出システムは、次いで、拡散的散乱光信号を、コンピュータモニター等における画像表示に好適な形状に変換し、得られたカロテノイド吸収を定量システムで分析する。

反射率を用いたヒト皮膚中のカロテノイドの測定に好適な実験装置を、概略的に図２に示す。装置は、送光及び集光システムを含むプローブヘッドモジュール２０２と、光源並びに光分散、検出及び分析システムを含む光源及び検出モジュール２０４と、データ取得、処理及び表示のためのコンピュータ２１０とを備える。光モジュールは、拡散的に散乱する皮膚組織部位（例えば手の指）への直接接触が可能かつ組織の押圧が可能なレンズを備える、手持ち式送光及び集光装置として設計される。

励起源として、ＢＲＬ５０Ｗタングステンハロゲンランプ（ウシオ電機株式会社）の光出力を用いる。光は、操作中に励起光が多重モード光ファイバーを介してプローブモジュールへ送られるように、プローブモジュールと光学的に連通している。光源は、電流の変動を１％未満に制限した、電流を安定させた電源を用いて操作される。レンズ／反射板の組み合わせは、ランプ出力を同一の光ファイバーに連結する役割を果たす。

双方のファイバーのコア径は５００μｍである。光学プローブヘッドモジュール内部のファイバーの出力端において、高屈折平凸レンズは光を視準し、かつ皮膚組織部位に直接接触させることのできるレンズへ方向付ける。開口部を用いて、励起ビーム直径が３ｍｍに限定される。拡散的散乱光が、後方散乱方向から４５度離れた位置関係で視準される。この位置関係によって、検出システムへの鏡面的反射光の伝搬が最小化される。

拡散的反射光成分は、開口を通過し（apertured）、レンズにより光ファイバー上に結像され、反射光のスペクトル分散とそれに対応するスペクトルを選択的に検出する、線形ＣＣＤ検出器配列を備える分光器へ送られる。ＣＣＤ配列は、検出器配列で検出された信号をコンピュータモニター上に表示するように、パーソナルコンピュータと操作可能に連結される。

皮膚測定に先立って、検出器配列のホットピクセルと光学プローブ及び分光器内での微光散乱とを考慮して、検出器配列の各画素のバックグラウンド信号強度を提供する暗スペクトルＤ（λ）を記録する。次のステップとして、「白色」反射参照基準（「Spectralon」、Lab Sphere社）からの乱反射スペクトルを測定し、コンピュータメモリーに保存する。皮膚カロテノイドレベルの測定には、対象とする組織部位をレンズに押圧する。これにより測定組織容量から血液が圧搾され、容量中に残る僅かな血液の酸素含有量が減少し、新鮮で酸素を豊富に含む血液の再供給も阻害される。その結果、圧搾された組織容量において、血液発色団吸収が皮膚反射スペクトルに及ぼす影響が急激に減少し、従って以下に詳細を記すように、反射率に基づく皮膚カロテノイド測定用に皮膚の光学特性が最適化される。

反射スペクトルＲ（λ）は、下記式

により計算される。ここで、Ｔ（λ）及びＳ（λ）は夫々、波長λで測定した皮膚組織からの信号及び反射標準からの信号であり、Ｄ（λ）は、暗スペクトル強度による任意の波長λにおける信号である。

データ処理により、反射スペクトルのスペクトルデータ点それぞれについて下記関係式

に従って十進数対数をとることによって、正規化反射スペクトルＲ（λ）が「見掛けの」光学濃度スペクトルＡ（λ）に変換される。

以下に詳細を説明する様々な数学的方法によって、記録されたスペクトルから、皮膚カロテノイドのスペクトルに及ぼす影響及び絶対濃度レベルを抽出することが可能である。

皮膚中に存在する様々な発色団の吸収特性を総体的に把握するために、モデル吸収スペクトルを図３に示す。生体のヒト皮膚組織における３つの主な吸収体は、酸素化ヘモグロビン（ＨｂＯ）（破線）、脱酸素化ヘモグロビン（Ｈｂ）（細い実線）、及びカロテノイド（例としてβカロテンを太い実線で示す）である。ＨｂＯ及びＨｂによるカロテノイド吸収への強い干渉が３５０〜４６０ｎｍ領域に存在し、一方、干渉が低減したスペクトルの空白（window）が４６０〜５００ｎｍ範囲に存在する。干渉の程度はもちろん、測定組織容量中に存在する血液発色団の濃度に強く依存し、皮膚カロテノイド吸収を圧倒する程度に高くなりうる。反射率測定に用いられる圧力技術によって、ＨｂＯ及びＨｂにより引き起こされるカロテノイド吸収と吸収バックグラウンドとの間のコントラストが著しく増す。その上、測定組織容量への新鮮血（ＨｂＯ）の供給を阻害しつつ、ＨｂＯをＨｂに変換することで、４８０ｎｍでのカロテノイド領域における吸収コントラストがさらに少なくとも２倍に増す。

左手の人差し指を図２の装置のレンズに１５秒間押圧し、その間にレンズと接触している組織領域を白色励起光で照射した。反射性プローブヘッドレンズへ指を押圧した直後、ほぼリアルタイムで反射スペクトルを取得し、処理し、コンピュータモニター上にモニターする（毎秒スペクトルを更新する）。これにより、測定組織容量におけるＨｂＯ／Ｈｂバランスの変化により引き起こされる反射スペクトルの緩やかな変化をモニターすることが可能になる。

具体的には、５００〜６００ｎｍ範囲において二重帯域（double-band）ＨｂＯが徐々に減少する特徴が見て取れ、従って皮膚カロテノイドレベルの導出に最適な反射スペクトルを記録するのに最適なタイミングを決定することが可能になる。このようにして得た健常な志願被験者の左手の人差し指の最適な反射スペクトルを図４に示す。データは上述した式（２）に従って反射率パーセントとしてプロットされる。

図４における下側のパネル（ｂ）のグラフは、図４の上側に示す反射スペクトルのパネル（ａ）から、上述した関係式（１）を用いてコンピュータソフトウェアにより得た、光吸収スペクトルを示す。皮膚組織部位における皮膚カロテノイドの見掛けの光学濃度は、４７８ｎｍにおける全見掛け吸光度値と残りの発色団全て（残りのＨｂ、ＨｂＯ及びメラニン）による散乱／吸収バックグラウンドを合わせた結果生じる吸光度との間の違いとして選択される。バックグラウンド吸光度レベルは、数種の方法で計算することができる。以下に詳細を説明する相互関係／確認実験では、４７９ｎｍにおけるヒト皮膚の見掛けの吸光度レベルが、血液成分による影響を無視できる６２０ｎｍ付近における吸光度レベルに十分に近似されることを示している。バックグラウンド波長として６２０ｎｍを選択する理由としては、皮膚の散乱特性が４８０〜６２０ｎｍで顕著に変化しないという事実がさらに挙げられる。この場合、皮膚組織から得られるカロテノイド光学濃度の値は、Ａ（４８０）−Ａ（６２０）＝０．８３−０．６３＝０．２光学濃度単位である。

測定した生体内皮膚反射スペクトルに動脈血流制限が与える影響、及びそれに対応する反射率から導出された、「見掛けの吸光度」スペクトル、測定結果をさらに調べた。結果を図５に示す。パネル（ａ）及びパネル（ｂ）のグラフは、測定組織部位への血流が制限されない場合、及び同じ組織部位への血流が制限された後の場合についての、反射率及びそれに対応する光吸収スペクトルをそれぞれ示す。パネル（ｃ）のグラフは、バックグラウンド除去法の後の、制限されない血流及び制限された血流についての見掛けの吸光度を示す。

従来型の血圧計の膨張式アームカフを、志願被験者の左腕の肘より上方に着け、２００ｍｍＨｇに加圧して血液を制限した。カフで圧力を約２分間加えた後、制限された血流スペクトルを測定した。血流制限の前後に得たスペクトルに示すように、測定したスペクトル領域のほとんど全ての波長において、分光反射率及びそれに対応する吸収の急激な変化が起こる。

図５に示す結果から明らかなように、５４０〜５９０ｎｍ範囲の反射スペクトルにおける、酸素を豊富に含む血液（ＨｂＯ）の特徴的で明白な二重帯域スペクトル特性はほぼ消失し、血流制限の後、５７０ｎｍ付近のスペクトル領域において、酸素不足の血液（Ｈｂ）の弱い単帯域成分が現れる。その上、４８０ｎｍ付近の皮膚カロテノイド吸収領域のスペクトル範囲において、吸収が著しく低下する。カロテノイドの最長波長振動遷移ピークを原因として４８０ｎｍにおいて小さな吸収帯が存在するが、重要なことに、この特徴は、血流制限の後に他種の吸収バックグラウンドに対してより顕著になった（図５パネル（ｃ））。

測定した反射スペクトルからカロテノイド吸収強度を定量的に得るために、３５０〜７００ｎｍ波長範囲の反射スペクトルにおける散乱バックグラウンドを、１／λ^ｎ波長依存性（図５パネル（ｂ）における点曲線）に近似させている。散乱バックグラウンドは、血液による吸収の影響が全く存在しないあるいは少なくとも最小であると予想され且つ血流制限によって反射率が変化しない、２個の反射スペクトルの波長位置に固定させている。長波長点は約６２０ｎｍであり、短波長点は約３５０ｎｍである。

送光及び集光モジュール（反射性プローブヘッド）の作用を、皮膚において起こる事象のフロー図として図６に例示する。生体内における反射率測定では、まず、測定対象の皮膚組織部位、通常は手のひら又は指先を、プローブヘッドの凸レンズウインドウに押圧する。これが組織容量を圧搾し、周辺領域に比べて中央領域に、より大きな圧力がかかる。その結果、血液を組織外に絞り出し、このように有効血液（Ｈｂ）量が減少する。加えて、新鮮で酸素化された血液（ＨｂＯ）の供給が阻害される。これにより、残りの血液量における酸素濃度が急激に低下する。これら２つの事象の結果、測定に重要な波長範囲においてＨｂ及びＨｂＯによるスペクトルへの影響が急激に減少するため、反射率に基づいた皮膚カロテノイドの測定用の組織部位が最適に準備される。

プローブモジュールレンズに押圧された組織部位における光学的清浄効果を例示するために、健常な志願被験者の人差し指について、乱反射率測定を行った。反射スペクトル及びそれに対応して得られる吸収スペクトルの結果を図７に示し、指をレンズと緩やかに接触させただけの場合の対応するスペクトルと比較する。ウインドウに対して押圧した際の指による圧力は、〜３気圧とした。パネル（ａ）のグラフから明らかなように、ＨｂＯ及びＨｂのスペクトル成分は可視スペクトル領域からほぼ完全に除去されるので、組織部位における強力な光学的「清浄」効果が実現される。これによって４８０ｎｍ付近のカロテノイド吸収帯のスペクトル範囲には、干渉する血液の吸収がほとんど存在しなくなる。

この組織「清浄」効果を更に定量的に例証するために、志願被験者の指をプローブヘッドレンズに押圧した後、数十の異なる時点で、被験者の皮膚カロテノイドの見掛けの光学濃度を測定した。結果を図８に示す。最初の４秒については、指は、プローブヘッドウインドウに緩やかに接触しただけであり、そのため圧力は加えられていない。この組織状態において、人為的に高い見掛けの光学濃度が反射率測定から得られる。

指をプローブヘッドレンズに押圧し始めると、得られる光学濃度値は数秒内に迅速に〜２．５分の１に減少し、次いで約１０秒後にさらに定常状態レベルまで徐々に減少した。測定された押圧血液量から、干渉する血液発色団が圧搾されるまでに、そしてその結果、皮膚カロテノイドレベルの有意義な導出に用いられる最終反射率測定が記録されるまでに、この約１０秒の時間がかかる。

本発明の反射法の有効性を実証するために、切除した薄い組織試料について、透過分光計で皮膚カロテノイド吸収を直接的に測定し、その結果を、同一の試料について反射法で測定されたカロテノイド吸収と比較した。吸収測定として、厚さ〜０．７ｍｍの組織試料を志願被験者の足の踵から採取し、２枚の薄いガラスカバープレートの間に挟み、吸光度計を用いて３００〜８００ｎｍ波長範囲で測定した。図９のパネル（ａ）のグラフに示すスペクトルにおいて、長波長領域から短波長領域まで単調に増加する散乱バックグラウンド上に重ね合わせたところ、４００〜５００ｎｍ波長範囲のカロテノイド吸収が明らかになった。吸収スペクトルにおける点線は、カロテノイド吸収領域における模擬散乱バックグラウンドを表す。測定したスペクトルからバックグラウンドを差し引いた後、パネル（ｂ）のグラフに示す吸収スペクトルが得られ、カロテノイド吸収帯の区別可能な３つの振動吸収特性が明らかになった。

吸収測定に続き、図２に示す反射装置で切除した試料を測定した。結果を図１０に示す。パネル（ａ）のグラフは、波長範囲３８０〜８５０ｎｍにわたる正規化反射スペクトルを示す。皮膚反射率は短波長から長波長まで徐々に増加するが、カロテノイド吸収範囲（４００〜５２０ｎｍ範囲）において明らかな降下がある。パネル（ｂ）のグラフは、各スペクトルデータ点について関係式Ａ＝−ｌｇ（Ｒ／１００）によりパネル（ａ）の反射スペクトルから得た光吸収スペクトルを示す。点線は、カロテノイド吸収域における散乱バックグラウンドを近似したものである。パネル（ｃ）のグラフは、スペクトル領域３８０〜５４０ｎｍにおける散乱バックグラウンドを差し引いた後の、パネル（ｂ）の光吸収スペクトルから得たカロテノイド光吸収スペクトルを示す。

切除した踵組織試料について、直接的透過率測定によって得た吸収スペクトルと、反射率測定から得た吸光度を同じ波長スケールで図１１にプロットし、β−カロテンのメタノール溶液の吸収スペクトルと比較する。スペクトル位置、半値幅、及び振動部分構造を含む、皮膚カロテノイドスペクトルと純粋カロテノイド溶液の光吸収スペクトルとの酷似は、ここでも明白である。また、透過及び反射技術で測定した組織試料のピーク吸光度レベルは同一である。純粋βカロテン溶液から得たスペクトルと比較して僅かに異なるカロテノイド皮膚スペクトルの形状は、βカロテンに加えて僅かに異なる吸収プロファイルを有する他のカロテノイド種を含む、ヒト皮膚のより複雑なカロテノイド組成物によるものである。

反射率に基づいた皮膚カロテノイド測定の再現性を、３人の志願被験者について測定した。被験者の手のひらにおけるカロテノイドレベルを、数日及び数週間の期間にわたって繰り返し測定した。吸光度レベルの結果を図１２に示す。各データ点は、３回の連続測定の平均を示す。全ての場合において、カロテノイドレベルの良好な短期及び長期再現性が認められる。

図１３は、１０人の志願被験者の手のひらにおけるカロテノイドレベルの測定に用いた、独立した全く異なる２つの光学的方法の間の相互関係を示す。方法の１つは本発明に記載する反射法であり、他方は以前に特許付与されている共鳴ラマン分光法である。反射率の測定から決定したカロテノイド吸光度レベルが、共鳴ラマン法で測定した炭素−炭素二重結合カロテノイドラマン応答の強度に対して被験者毎にプロットされている。相関係数の二乗、Ｒ^２＝０．８５の相互関係が得られる。この高い相関関係レベルは、提案される反射率に基づくカロテノイド測定技術の有効性を実証するものであり、上述したバックグラウンド選択工程の正当性を説明するものである（図４）。

図１４は、戦略的に選択した２個の別々の波長位置における反射率測定に基づく、代替となる単純化した反射率計測手段の配置を示す。この配置では、上述した「白色」光源及び多重チャンネルスペクトル検出を、４８０及び６２０ｎｍのＬＥＤ励起及びこれらの波長における反射率測定に置き換えており、従って反射率に基づいて皮膚カロテノイドレベルを得るのに必要な計測手段のコストがかなり削減される。

参照文献
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Claims

可視及び青色スペクトル領域におけるカロテノイドの吸収帯と重なる光で組織の局所領域を照射するステップと、
前記局所領域中の血液発色団のレベルを低減させるように、所定時間、前記局所領域に圧力を加えるステップと、
前記局所領域中のカロテノイドレベルを反射ラマン分光法で調べるステップとを含む、生物組織中のカロテノイドレベルを非侵襲的に測定する方法。
前記圧力は、前記組織に約５〜２０秒間加えられる請求項１に記載の方法。
前記カロテノイドレベルは、カロテノイドの全見掛け吸光度と、前記局所領域に圧力を加える間に残余している発色団全てによるバックグラウンド吸光度との間の差として選択される請求項１に記載の方法。
前記カロテノイドレベルは、４７８ｎｍ又は約４７８ｎｍにおける全見掛け吸光度と、前記局所領域に圧力を加える間に残余している発色団全てによるバックグラウンド吸光度との間の差として選択される請求項１に記載の方法。
前記局所領域への血流を制限するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
前記光は、約３５０〜９００ｎｍのスペクトル範囲に実質的にわたる白色光である請求項１に記載の方法。
前記光は、一方が４８０ｎｍ又は約４８０ｎｍ、他方が６２０ｎｍ又は約６２０ｎｍである別々の光源から得られる請求項１に記載の方法。
バックグラウンド信号強度を提供する暗スペクトルＤ（λ）を記録するステップと、
反射標準を測定して保存するステップとを更に含み、
前記局所領域における前記カロテノイドに関連する反射スペクトルは下記式

により計算され、ここでＴ（λ）及びＳ（λ）はそれぞれ、波長λで測定した前記組織からの信号及び反射標準からの信号であり、Ｄ（λ）は、暗スペクトル強度による任意の波長λにおける信号である請求項１に記載の方法。
反射スペクトルにおける各スペクトルデータ点について下記関係式

に従って十進数対数をとることによって、正規化反射スペクトルＲ（λ）を「見掛けの」光学濃度スペクトルＡ（λ）に変換するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
前記カロテノイドレベルを、正常な生物組織と比較して、悪性疾患又は他の病状のリスク又は存在を評価するステップを更に含む請求項１に記載の方法。
前記組織は、ヒト皮膚である請求項１に記載の方法。
前記皮膚は、指先又は手の他の部分の皮膚である請求項１１に記載の方法。
可視及び青色スペクトル領域におけるカロテノイドの吸収帯と重なる光で組織の局所領域を照射する光源と、
前記局所領域における血液発色団のレベルを低減させるように、所定期間、前記局所領域に圧力を加える装置と、
前記局所領域におけるカロテノイドレベルを反射分光法で調べるラマン分光器とを備える生物組織中のカロテノイドレベルを非侵襲的に測定するシステム。
前記圧力は、前記組織に約５〜２０秒間加えられる請求項１３に記載のシステム。
前記圧力を加える装置は、光及び反射スペクトルが通過する光透過性部材である請求項１３に記載のシステム。
前記圧力を加える装置は、光及び反射スペクトルが通過するレンズである請求項１３に記載のシステム。
前記局所領域への血流を制限するカフ又は他の装置を更に備える請求項１３に記載のシステム。
前記光源は、約３５０〜９００ｎｍのスペクトル範囲に実質的にわたる白色光源である請求項１３に記載のシステム。
前記光源は、一方が４８０ｎｍ又は約４８０ｎｍ、他方が６２０ｎｍ又は約６２０ｎｍである別々の光源を備える請求項１３に記載のシステム。
前記局所領域に所定期間前記圧力を加える装置がプローブ体に含まれており、
前記光源からの光は、第１の光ファイバーを介して前記プローブまで送られ、
反射スペクトルは、第２の光ファイバーを介して前記プローブ体から前記ラマン分光器まで運ばれる請求項１３に記載のシステム。