JP2011521976A - 髄膜炎菌性多価未変性外膜小胞ワクチン、その作製方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は、世界的な髄膜炎および敗血症の主な原因である。本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌性疾患、より好ましくはＢ亜型髄膜炎菌性疾患に対して防御免疫を提供するＮｅｉｓｓｅｒｉａの少なくとも１つの遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含むワクチン組成物を提供する。本発明のテクノロジーは、さらに、本発明のワクチン組成物を投与する工程を含む、髄膜炎菌性疾患に対して動物またはヒトを免疫する方法を提供する。

Description

（関連する出願との相互参照）
本願は、「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｎａｔｉｖｅ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅ」と題された、米国仮特許出願第６１／０５７，４６２号（２００８年５月３０日出願）に対する優先権を主張する。この仮特許出願の全開示および全内容は、参照により、それらの全体が本明細書に援用される。

（連邦政府により支援された研究または開発）
合衆国政府は、本発明の権利を有する。

発明の背景
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は、世界的な髄膜炎および敗血症の主な原因である。髄膜炎菌性髄膜炎は、髄膜（脳および脊髄を裏打ちする膜）の炎症である。髄膜炎菌性敗血症および髄膜炎菌性髄膜炎の両方において、損傷は、局在化または全身性の宿主炎症反応の無制御に起因する。Ｂ群髄膜炎菌性疾患は、現在、多数の国（北米、南米、および欧州が含まれる）での全髄膜炎菌性疾患の少なくとも半分を占める。Ｂ群髄膜炎菌の新規の病毒力の強いクローン（ＥＴ５として公知、７０年代後半にノルウェーで発見）の出現により、その後に長期にわたってノルウェー、キューバ、ブラジル、およびチリで流行病となっている。これらの流行病は、深刻な公衆衛生上の問題を生じ、いくつかの発生国（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｃｏｕｎｔｒｙ）では有効なＢ群ワクチンを開発するための集中的な取り組みがなされている。１８ヶ月未満の小児におけるＡ型およびＣ型莢膜ポリサッカリドドワクチンの能力が不十分であることに加えて、米国で承認されているＢ群ワクチンが存在しないことが、髄膜炎菌性疾患に対する日常的な小児期ワクチン接種を深く考慮するための障壁となっている。

髄膜炎菌は、１３の血清群に分類され、そのうちの９群が侵襲性疾患を引き起こす（Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｃ１、Ｃ１−）、Ｘ、Ｙ、Ｗ−１３５、Ｚ、およびＬ）。この血清型のうちの５つが流行病を引き起こす能力を有するためにワクチン開発の標的にされている（多くのワクチン研究の標的である血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５が含まれる）
ほぼ全ての侵襲性髄膜炎菌性疾患を引き起こす髄膜炎菌の血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５に対するワクチンは、利用可能であり、日常的使用によって優れた結果がもたらされる。髄膜炎菌のＢ群菌株に対する適切なワクチンは、種々の理由によって開発がより困難になっている。例えば、血清群を定義する莢膜ポリサッカリドは、一定のヒト細胞、具体的には血液細胞上で見出されるポリシアル酸と同一の構造を有するので、ワクチンでの使用は無効且つ潜在的に危険である。

適切なワクチンの欠如に、表面に露出した莢膜下抗原（外膜タンパク質およびリポオリゴサッカリド（内毒素）など）が抗原性が変動し、そして／またはＢ群菌株間での発現が一貫していないという事実がさらに加わる。有効なワクチンに不可欠な全ての特徴を単独で有する単一の抗原は同定されていない。

発明の概要
１つの態様では、本発明のテクノロジーは、広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも２つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含むワクチンを提供する。未変性の外膜小胞はＰｏｒＡ、ＬＯＳ、および保存外膜タンパク質に基づいた３つの異なる抗原組を含み、遺伝子改変菌株はｌｐｘＬ１遺伝子、ｓｙｎＸ遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されている。２つの髄膜炎菌株は、ともに異なるＬＯＳコア構造を有するＬＯＳを発現し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有することができる。各菌株は、Ｂ群分離菌のうちで最も一般的なＰｏｒＡ亜型に基づいて選択される少なくとも２つの異なるＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現することができる。さらに、ワクチンは、殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質（各菌株で過剰発現する）をさらに含むことができ、このタンパク質は、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、およびＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢからなる群から選択される。

さらなる態様では、本発明のテクノロジーは、３つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌の菌株由来のＮＯＭＶの組み合わせを提供する。少なくとも１つの菌株は、（１）以下の遺伝子改変または特徴を有するＨ４４／７６ ＨＯＰＳ−ＤＬ：ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．７−１，１）の挿入、ＮａｄＡ発現の増加、およびＯｐｃおよびＰｏｒＡの安定化された高発現、（２）以下の遺伝子改変または特徴を有する８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ_ＡＬ：ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬｌ遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、およびＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現、および／または（３）以下の遺伝子改変または特徴を有するＢ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ_２Ａ：ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、およびＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現から選択される。ＮＯＭＶを、界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する。ワクチンを、１つまたは複数のアジュバントと組み合わせ、筋肉内および／または鼻腔内に投与することができる。

別の態様では、本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む、髄膜炎菌性疾患、より好ましくはＢ群髄膜炎菌性疾患（ｍｅｉｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）に対するワクチン組成物を提供する。１つまたは複数の遺伝子改変菌株は、ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ラクト−Ｎ−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）が発現される各菌株中でのｌｇｔＡ遺伝子の不活化、および／またはｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入によって改変されている。別の態様では、遺伝子改変菌株は、少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現および／または少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現をさらに含む。少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子は、Ｂ群髄膜炎菌分離菌の最も一般的なＰｏｒＡ亜型から選択される少なくとも１つのＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現することができる。

さらに別の態様では、本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌亜型Ｂ菌株の遺伝子改変されたワクチン菌株を提供する。遺伝子改変されたワクチン菌株には、菌株Ｈ４４／７６ ＨＯＰＳ−Ｄ（Ｂ１）、菌株８５７０ ＨＯＳ−Ｇ１（Ｂ２），および／または菌株Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ_２Ａ（Ｂ３）が含まれ得る。

さらに別の態様では、本発明のテクノロジーは、ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｉｖ）ｏｐａＤ遺伝子の代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、ｖ）未変性菌株と比較して増加したＮａｄＡ発現、およびｖｉ）Ｏｐｃタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質発現の安定化された増加の遺伝子改変を含む菌株Ｈ４４／７６由来の髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株を提供する。いくつかの態様では、遺伝子改変菌株は、ＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来していた。

別の態様では、本発明のテクノロジーは、ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、ｖ）Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、およびｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加の遺伝子改変を含む８５７０由来の髄膜炎菌亜型Ｂ菌株の遺伝子改変されたワクチン菌株を提供する。いくつかの態様では、遺伝子改変菌株は、ＥＴ−５野生型菌株８５ ７０（Ｂ：４：Ｐ １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来していた。

さらに別の態様では、本発明のテクノロジーは、ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．２２−１，４）の挿入、ｖ）Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、およびｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加の遺伝子改変を含むＢ１６Ｂ６由来の髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株を提供する。いくつかの態様では、遺伝子改変菌株は、ＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来している。

いくつかの態様では、本発明のテクノロジーは、鉄欠損培地で成長した遺伝子改変菌株を提供する。

他の態様では、本発明のテクノロジーは、ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、またはｌｇｔＡ遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、遺伝子改変菌株を提供する。

さらに別の態様では、本発明のテクノロジーの遺伝子改変菌株に由来するＮＯＭＶを含むワクチンを提供する。ＮＯＭＶを、界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する。ワクチンは１つまたは複数のアジュバントをさらに含むことができる。さらなる態様では、遺伝子改変した菌株を、鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる。

さらなる態様では、本発明のテクノロジーは、少なくともいくつかのＮＯＭＶがリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の発現またはシアル酸化を本質的に含まず、ペンタ−アシル（ｐｅｎｔａ−ａｃｙｌｅ）構造を有する脂質Ａを含むＬＯＳを含み、発現レベルの増加した少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質を含み、微量保存外膜タンパク質が殺菌抗体を誘導するタンパク質から選択される、種々の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを提供する。微量保存外膜タンパク質を、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２からなる群から選択することができる。他の態様では、少なくともいくつかのＮＯＭＶはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを本質的に含まない短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを含み、そして／または少なくともいくつかのＮＯＭＶは２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質を含む。

別の態様では、本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌性疾患に対する免疫のためにＮ．Ｍｅｎｉｎｇｉｉｔｄｉｓの少なくとも１つの遺伝子改変した菌株由来のＮＯＭＶを含む組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む、動物またはヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。ワクチンを、Ｂ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために使用する。

さらなる態様では、本発明のテクノロジーは、ａ）遺伝子改変することができる髄膜炎菌Ｂ型菌株を選択する工程、ｂ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化によって菌株を遺伝子改変する工程、ｃ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化によって菌株を遺伝子改変する工程、ｄ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化によって菌株を遺伝子改変する工程、およびｅ）１つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって菌株を遺伝子改変する工程を含む、髄膜炎菌性疾患に対するワクチンで用いる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の遺伝子改変菌株を調製する方法を提供する。さらなる態様では、本方法は、ｏｐａ遺伝子の読み取り枠への少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入によって菌株を遺伝子改変する工程をさらに含む。他の態様では、本方法は、少なくとも１つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−Ｃ配列をＧおよびＣヌクレオチドを含む配列で置換することによって菌株を遺伝子改変して少なくとも１つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む。

さらに別の態様では、本発明のテクノロジーは、ａ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ＩｇｔＡ遺伝子の不活化、ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入、少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現、および／または少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、ｂ）ａ）の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、ｃ）発酵培養物を不活化する工程、ｄ）連続フロー型遠心分離および細胞ペーストの回収によって髄膜炎菌培養細胞を採取する工程、ｅ）細胞ペーストからＮＯＭＶを単離する工程、およびｆ）ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにＮＯＭＶを再懸濁する工程を含む、髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法を提供する。

図１は、ワクチン産生のためのＮｅｉｓｓｅｒｉａの遺伝子改変菌株についての細胞のマスター・セル・バンク調製を示す流れ図である。 図２は、ワクチン産生のためのＮｅｉｓｓｅｒｉａの遺伝子改変菌株の作製のために使用したセル・バンク調製物の産生を示す流れ図である。 図３は、ワクチン産生のためのＮｅｉｓｓｅｒｉａの遺伝子改変菌株の作製のために使用したＮｅｉｓｓｅｒｉａの発酵を示す流れ図である。 図４は、ワクチン産生のためのＮｅｉｓｓｅｒｉａの遺伝子改変菌株からのＮＯＭＶの精製を示す流れ図である。 図５は、図４の流れ図の続きである。 図６は、標準マーカー（レーン１）、コントロール８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶ調製物（レーン２）、濾過バルクワクチン（レーン３）、および最終生成物のワクチン（レーン４）のタンパク質含有量を示すクマシー・ブルー染色ゲルの写真である。 図７は、ワクチンのリポオリゴサッカリド含有量を示す銀染色ゲルである。レーン１はコントロールＭＬ５ ＬＰＳであり、レーン２は濾過バルクワクチンであり、レーン３は最終ワクチン生成物である。１５μｌの１００μｇ／ｍｌのワクチンの１：２希釈物をゲル上で泳動した（２０μｌの１００μｌ／ｍｌのコントロールの１：２希釈物）。 図８は、８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶワクチン中に見出されたタンパク質の同一性および組成を示す抗体染色ウェスタンブロットの写真である。 図９は、異なる濃度のワクチンとのインキュベーション後にヒト血液から放出されたＴＮＦ−αを示すグラフである。 図１０は、異なる濃度の遺伝子改変ＮＯＭＶワクチンとのインキュベーション後のヒト血液からのＩＬ−６放出を示すグラフである。 図１１は、菌株４４／７６由来のＤＯＣ抽出ＯＭＶと比較した異なる濃度の遺伝子改変ワクチンとのインキュベーション後にヒト血液から放出されたＴＮＦ−αを示すグラフである。 図１２は、アジュバントを含むか、または含まない異なる濃度の８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇワクチンを接種したマウスの殺菌力価を示す棒グラフである。 図１３は、異なる試験菌株に対して８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇワクチンを接種したマウスの殺菌力価を示す棒グラフである。 図１４は、ＬＯＳ抗原、ＧＮＡ１８７０抗原、ＮＯＭＶ抗原、およびＯｐｃ抗原についての殺菌抗体枯渇アッセイの結果を示すグラフである。 図１５は、アジュバントを含むか、または含まない８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶワクチンを接種したウサギの抗体応答を示す。 図１６は、８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１ ＮＯＭＶワクチンに対する試験菌株についての殺菌枯渇アッセイの結果を示すグラフである。 図１７は、８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１ ＰｏｒＡノックアウト菌株についてのＬＯＳ抗原およびＦＨＢＰ抗原の殺菌枯渇アッセイの結果を示すグラフである。 図１８は、本発明のテクノロジーのＮｅｉｓｓｅｒｉａの３つの遺伝子改変菌株（Ａ＝Ｂ１、Ｂ＝Ｂ２、およびＣ＝Ｂ３）の表現型を表わす。 図１９は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの遺伝子改変菌株を構築するために使用したプラスミドを表わす：ａ）ｌｇｔＡをノックアウトするために構築されたプラスミド、ｂ）第２のＰｏｒＡを発現させるためのプラスミド、ｃ）オルソロガス（Ｅ．ｃｏｌｉの場合Ｐｔａｃ）プロモーターによって駆動されるｆＨｂｐを過剰発現させるためのプラスミド、およびｄ）相同プロモーター（髄膜炎菌のＰｏｒＡプロモーター）によって駆動されるＮａｄＡを過剰発現させるためのプラスミド、およびｅ）ＮｓｐＡ遺伝子を置換する相同組換えによるｆＨｂｐ（バリアント１および２）およびＮａｄＡ過剰発現プラスミドでのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓの代表的な形質転換スキーム。 図２０ａは、３つの遺伝子改変菌株のｌｇｔＡ遺伝子のノックアウトによるＮＯＭＶワクチン菌株の切り詰めたＬＯＳ免疫型の安定化の描写である。図２０ｂは、Ｌ３、７、９（左）およびＬ８（右）に対するモノクローナル抗体を使用した、遺伝子改変菌株Ｂ２および親菌株（Ｂ１６Ｂ６）によるＬＯＳα鎖の発現の免疫ブロットの写真である。 図２１は、遺伝子改変菌株Ｂ３におけるｆＨｂｐバリアント２の発現を示す画像を表わす。図２１ａ）は、免疫ブロッティングによる過剰発現ｆＨｂｐを含むゲンタマイシン耐性組換えを含む菌株の選択を示す。図２１ｂ）は、ｆＨＢｐに対するＪＡＲ４モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットであり、ｆＨＢｐ発現増加を示す。

本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌性疾患、より好ましくは髄膜炎菌亜群Ｂ型に対する免疫で用いるための広範な防御ワクチン組成物を提供する。本発明のテクノロジーの１つの実施形態は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの髄膜炎菌の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含むワクチン組成物を提供する。ブレブとしても公知の未変性の外膜小胞は、増殖中に天然に生じるグラム陰性菌外膜のフラグメントから形成されるかそれに由来する小胞であり、界面活性剤または変性溶媒を使用しない穏やかな方法によって培養培地または細胞から得ることができる。これらのＮＯＭＶは、典型的には、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、脂質、リン脂質、周辺質物質、およびリポ多糖（ＬＰＳ）（リポオリゴサッカリドが含まれる）を含む。グラム陰性細菌、特に髄膜炎菌のような病原体は、しばしば、ブレブ形成として公知の過程において病毒力の強い感染の間にＮＯＭＶを剥落させる。本発明のテクノロジーでは、ＮＯＭＶは化学的変性過程を使用せずに細菌外膜から産生される小胞であり、抗原性が多様であり、且つそれぞれ安全性、抗原安定性、および防御免疫応答範囲を改善するために遺伝子改変されている遺伝子改変菌株から産生される。

本発明の１つの実施形態は、髄膜炎菌の少なくとも２つ以上の遺伝子改変菌株、好ましくは少なくとも３つの異なる遺伝子改変菌株に由来する未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含むワクチン組成物を提供する。

本発明のテクノロジーのいくつかの実施形態は、抗原性が多様な髄膜炎菌の菌株、好ましくは、細菌ゲノム内に少なくとも３つの遺伝子改変、より好ましくは少なくとも５つの遺伝子改変、より適切には少なくとも６つの遺伝子改変を含む亜型Ｂを提供する。遺伝子改変は、１つまたは複数の以下を含むことができる：１）シアル酸生合成に不可欠であり、莢膜発現またはリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）のシアル酸化が起こらないｓｙｎＸ遺伝子の不活化；２）ペンタ−アシル構造を有する脂質Ａを有する有意に毒性の低いＬＯＳが得られるｌｐｘＬ１遺伝子の不活化；３）ｏｐａ遺伝子（ＯｐａＣまたはＯｐａＤ）の１つの代わりの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入；４）少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質（微量保存外膜タンパク質は殺菌抗体（例えば、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２であるが、これらに限定されない）を誘導する能力が証明されている）の発現の増加；５）ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを欠く短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを発現する各菌株中のｌｇｔＡ遺伝子の不活化；および／または６）野生型菌株の相変異に感受性を示す一定の外膜タンパク質（ＯｐｃおよびＰｏｒＡなど）の安定化させた発現。

本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌性疾患に対する防御抗体応答の使用時の安全性およびその応答の範囲の両方を増加させる遺伝子改変菌株を提供する。１つの実施形態では、遺伝子改変菌株は、細菌ゲノム内の以下の変異の少なくとも１つの組み込みによって安全性が増加する：キャプシドのシアル酸合成を遮断し、そして莢膜陰性表現型ＮＯＭＶを形成させるｓｙｎＸ遺伝子の欠失、ペンタ−アシル脂質Ａ構造が得られることによって内毒素活性が軽減するｌｐｘＬ１遺伝子の欠失、および／またはリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）上のラクト−Ｎ−ネオテトラオース生合成を遮断し、切り詰められたＬＯＳ構造を安定化させたｌｇｔＡ遺伝子の欠失。より好ましくは、遺伝子改変菌株はこれらの変異のうちの２つを備え、最も好ましくは遺伝子改変菌株はこれらの３つの変異全てを備える。本発明のテクノロジーの別の実施形態では、遺伝子改変菌株は、ＮＯＭＶ内に含まれる３つの可能な防御抗原組のうちの少なくとも１つを標的とすることによって防御抗体応答範囲が増大される。標的とされる３つの可能な抗原には、以下のうちの少なくとも１つが含まれる：ＰｏｒＡタンパク質、少なくとも１つの保存微量タンパク質、および／またはＬＯＳコア構造、およびその任意の組み合わせが含まれる。より好ましい実施形態では、遺伝子改変菌株は、少なくとも２つの可能な防御抗原を標的とし、最も好ましくは３つ全ての可能な防御抗原を標的とする。

本発明のテクノロジーのいくかの実施形態では、ｓｙｎＸ変異（ｓｙｎＸ遺伝子の不活化）を、米国特許第６，５５８，６７７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の方法によって遺伝子改変菌株に挿入した。簡潔にまとめると、２００ｂｐ配列をカナマイシン耐性遺伝子で置換したｓｙｎＸ遺伝子を含むｐＵＣ１９ベースのプラスミドを使用して遺伝子改変菌株を形質転換する。Ｋａｎ耐性形質転換体を選択し、破壊されたｓｙｎＸ遺伝子の存在および莢膜陰性表現型についてＰＣＲによって試験した。このｓｙｎＸ変異体を、ｓｙｎＸ遺伝子へのトランスポゾンの挿入によって莢膜陰性表現型が得られることを示しているＳｗａｒｔｌｅｙおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（ＳｗａｒｔｌｅｙおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１５３０−１５３４）によって報告された結果および配列情報に基づいて構築した。同一または等価な変異を、任意の形質転換可能な髄膜炎菌の菌株に導入することができる。髄膜炎菌の形質転換での使用に適切なプラスミドを、以下の手順を使用して構築した。３つのＤＮＡ配列を、オーバーラップ・イクステンション（ＳＯＥ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７７：６１−６５）によるスプライシングを使用して合わせた。３つのＤＮＡ配列には、５'末端からはじまる順序で、ｓｙｎＸＢ塩基６７〜６８１、ｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性遺伝子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．）６７１〜１６２３、およびｓｙｎｘＢ塩基８８６〜１５８９を含んでいた。さらに、５'末端で、推定取り込み配列ＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡを、ｓｙｎＸＢの６７〜６９１塩基配列の増幅のために使用されるＰＣＲプライマーの末端に含めることによって付加した。完全な構築物をＰＣＲによって増幅し、精製し、ｐＵＣ１９に平滑ライゲーションした。ｐＵＣ１９を使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇカナマイシンを含むＬＢ寒天上で選択した。カナマイシン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを抽出し、精製し、ＸｂａＩで切断した。推定取り込み配列の別のコピーをこの多重クローニング領域の部位にライゲーションし、得られたプラスミドを再度使用してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、カナマイシン耐性コロニーをさらなる取り込み配列の存在についてＰＣＲによってスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを選択されたコロニーから単離し、プライマーを使用したＰＣＲのテンプレートとして使用し、髄膜炎菌に導入されるべきではないアンピシリン耐性遺伝子を除外したプラスミドの挿入部分のみを増幅させた。次いで、増幅されたＤＮＡを精製し、これを使用して遺伝子改変髄膜炎菌の菌株を形質転換した。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのｓｙｎＸ（-）変異体をカナマイシン耐性によって選択し、改変領域のＰＣＲ増幅によって確認した。

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子改変菌株中のｌｐｘＬ１遺伝子を不活化して、ワクチン組成物中のＮＯＭＶ上で発現する内毒素ＬＯＳを軽減して産生させた。髄膜炎菌のＬＯＳの脂質Ａは、通常、ヘキサアシル構造であり、ＬＯＳの内毒性を担う。脂質Ａ中に存在する２つのアシル−オキシ−アシル連結二次脂肪酸は、内毒素活性に重要である。遺伝子改変菌株には、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙおよび共同研究者による記載のｌｐｘＬ１変異体が含まれる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ，Ｐ．、Ｓｔｅｅｇｈｓ，Ｌ．、Ｈａｍｓｔｒａ，Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ Ｈｏｖｅ，Ｊ．、Ｚｏｍｅｒ，Ｂ．、およびｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ，Ｌ． Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｌｐｘＬ ｍｕｔａｎｔｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９（１０）、５９８１−５９９０、２００１）。ｌｐｘＬ１遺伝子の欠失により、ウサギ発熱物質試験および全血由来のヒト単球を使用したサイトカイン放出アッセイの両方によって試験したところ内毒素性が非常に減少した通常レベルのペンタ−アシルＬＯＳが発現された。ｌｐｘＬ１遺伝子の他の破壊方法は、遺伝子改変菌株の開発で用いる本発明のテクノロジーのさらなる実施形態で意図される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変菌株は、ｏｐａ遺伝子（ＯｐａＣまたはＯｐａＤ）の１つの代わりに第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入を含む。髄膜炎菌の主な外膜タンパク質ポーリンＡまたはＰｏｒＡは、ｐｏｒＡの遺伝子産物である。ＰｏｒＡは広範な抗原変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｉｏｎ）を有し、免疫選択圧を回避するための相変異に供される。したがって、ｐｏｒＡは他の亜型と常に交差防御するわけではない。異なるＰｏｒＡ亜型に対するワクチン組成物の反応性を増加させるために、少なくとも１つのさらなるｐｏｒＡ遺伝子を、遺伝子改変した菌株のｏｐａＣまたはｏｐａＤ遺伝子に挿入する。挿入のために選択したＰｏｒＡ血清型を、Ｂ亜型髄膜炎菌性疾患の場合に見出されたＰｏｒＡの最も一般的な形態に基づいて選択する。適切なＰｏｒＡ血清型には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐ１．７−１（菌株Ｍ１０８０由来）、Ｐ１．２２，１４（菌株Ｍ４４１０由来）、Ｐ１．２２，１，４、または当業者に理解されているかまたは最新論文（例えば、Ｓａｃｃｈｉら、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＰｏｒＡ ｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、１９９２−１９９８、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０００ Ｏｃｔ；１８２（４）：１１６９−７６に記載のように）に記載の他の適切なＰｏｒＡ血清型。第２のＰｏｒＡ遺伝子は、ＰｏｒＡタンパク質発現が得られる任意の適切な強力プロモーター（例えば、適切な菌株（例えば、菌株Ｈ４４／７６）由来のＰｏｒＡプロモーターの調節下にあり得る。遺伝子改変した菌株へのｐｏｒＡ遺伝子の適切なクローニング方法は、当業者に公知であろう。このクローニング方法には、相同組換えが含まれ得るがこれに限定されない。例えば、ｐｏｒＡ遺伝子を、細菌染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、クローニングベクターにクローン化し、オーバーラップ・イクステンションＰＣＲ技術の改変による遺伝子スプライシングを使用して、適切に構築されたプラスミド（例えば、ｐＵＣ１９）に再クローン化することができる。この構築プラスミドを、相同組換えによって細菌ゲノムに導入してｏｐａ遺伝子などと置換することができる。形質転換体を、ポーリンに対するモノクローナル抗体を使用したコロニーブロッティングによって選択することができる。これらの方法は、当業者に公知である。

本発明のテクノロジーのさらなる実施形態では、改変菌株は、少なくとも１つの微量外膜タンパク質の発現が安定および／または増加する。適切な微量外膜タンパク質は、殺菌抗体（例えば、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２であるが、これらに限定されない）を誘導する能力を実証する。いかなる理論にも拘束されないが、ゲノム分析によって防御抗体を誘導する潜在力を有すると同定された高度に保存された表面が露出した微量外膜タンパク質の発現の安定化および／または増加させることにより、交差防御免疫応答が増加し得る。適切な保存微量タンパク質には、ＮａｄＡ、ＦＨＢＰバリアント１および２、ならびにＯｐｃが含まれるが、これらに限定されない。微量外膜タンパク質（ＯＭＰ）の安定化および／または過剰発現の方法には、発現プラスミドおよび相同組換えの使用または当業者に公知の他の適切な方法が含まれる。微量ＯＭＰは、強力プロモーター（例えば、髄膜炎菌 ＰｏｒＡプロモーターまたはＩＰＴＧ誘導性Ｅ．Ｃｏｌｉ ｐｔａｃプロモーターであるが、これらに限定されない）下にあり得る。

以下の実施例に記載のように、構築プラスミドを使用して遺伝子改変菌株中のｆＨｂｐ１およびｆＨｂｐ２発現の増加を確立した。ここで、過剰発現したタンパク質は、適切にプロセシングされ、脂質付加され（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）、外膜表面への移行を生じた。例えば、菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ（Ｂ２）におけるＩＰＴＧ誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｔａｃプロモーターの調節下でのバリアント１の発現は親菌株８５７０の約４倍高く、菌株Ｂ１６Ｂ２ ＨＰＳ−Ｇ_２Ａ（Ｂ３）におけるバリアント２の発現は親菌株Ｂ１６Ｂ６の３２〜６４倍高かった（図２０を参照のこと）。あるいは、ＰｏｒＡプロモーターを使用した発現系を使用して、微量の保存タンパク質を安定化／過剰発現することができた。

本発明のテクノロジーのさらなる実施形態では、遺伝子改変菌株は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを欠く短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを発現するｌｇｔＡ遺伝子の不活化を含む。

髄膜炎菌性ＬＯＳの重要な特徴は、相変異である。相変異は、ｌｇｔＡおよび他のナイセリア遺伝子中のヌクレオチド残基のホモポリマートラクトの非常に頻繁な変異に起因して起こる。これらの変異は、ＬＯＳα鎖のアセンブリを媒介するＬｇｔＡトランスフェラーゼの発現のオン−オフを切り換える（ヘプトース上の置換基の立体配置を２相に変化させる）。このｌｇｔＡ遺伝子の相変異性活性化により、ＬＯＳα鎖が望ましくない伸長をもたらし、それにより、ヒト血液細胞抗原と類似の構造を有するラクトＮ−ネオテトラオースが生じ得る。本発明のテクノロジーの遺伝子改変菌株は、抗生物質マーカーまたは他の適切なマーカー（遺伝子変化のスクリーニングに使用するため）（例えば、ゼオマイシン耐性遺伝子であるが、これに限定されない）での未変性遺伝子の破壊によってノックアウトされたｌｇｔＡ遺伝子を有する。ｌｇｔＡ遺伝子のノックアウト方法は当業者に公知であり、構築プラスミドおよび相同組換えまたは形質転換が含まれるが、これらに限定されない。変異したΔｌｇｔＡ遺伝子は、少なくとも２２継代の観察中に全ての改変菌株で不活性であった。これは、ＬＯＳコア構造の安定化された切り詰めた形態であった。ｌｇｔＡ遺伝子の欠失によって切り詰めたαコアＬＯＳ構造が安定化され、例えば、図１９に示す切り詰めたコア構造が得られる。図１９に、３つの例示的な改変菌株（例えば、菌株Ｂ３がＬ３コア構造を有するＬ８α鎖を含む）を示す。本発明のテクノロジーの遺伝子改変菌株は、免疫応答を開始することができる安定化されたコア構造が得られる免疫型Ｌ３、Ｌ５、およびＬ２に対応する特異的ＬＯＳコア構造を含み、以下の例では、全長ＬＯＳを発現する野生型菌株を死滅させることができる切り詰めたＬ８様ＬＯＳ（Ｌ８−３、Ｌ８−５、およびＬ８−２）を実証する。ΔｌｇｔＡ菌株は、ヒト血液細胞上に見出されるラクト−Ｎ−ネオテトラオースオリゴサッカリドと交差反応することなくＬＯＳ構造の切り詰めた形態および全長形態の両方を認識する抗体を誘発することができる。

本発明のテクノロジーのさらなる実施形態では、髄膜炎菌の遺伝子改変菌株は、通常は野生型菌株の相変異に感受性を示す外膜タンパク質（例えば、ＯｐｃおよびＰｏｒＡであるが、これらに限定されない）の発現が安定化されている。これらのタンパク質の発現を、当該分野で公知の方法によって安定化することができ、安定化された遺伝子のプロモーター中または読み取り枠内のいずれかのポリマー反復配列を最大の発現に適切な長さの非反復配列で置換する方法を含む。例えば、これらの遺伝子のプロモーター中のポリＣ配列またはポリＧ配列の一部を、ＣヌクレオチドおよびＧヌクレオチドの両方を含む同一の長さの配列で置換することができる（例えば、ｏｐｃＡ（配列番号１を参照のこと）のプロモーターの１２ｂｐポリＧ配列をＣヌクレオチドおよびＧヌクレオチドの両方およびＮｏｔＩ部位を含む同一の長さの新規の配列で置換した（配列番号２を参照のこと、ＮｏｔＩ部位に下線を付けている））。他の適切な実施形態では、ＰｏｒＡプロモーター中のポリＧ配列（例えば、配列番号３を参照のこと）を、ＣヌクレオチドおよびＧヌクレオチドの両方を含む新規の配列で置換することができる。

本発明のテクノロジーのさらなる実施形態は、鉄取り込みに関与するタンパク質（例えば、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）結合タンパク質ＡおよびＢ）のタンパク質発現を誘導するために低レベルの鉄を含む液体培地中でのワクチン菌株の増殖を提供する。いくつかの実施形態では、使用培地は、デスフェラール（ｄｅｓｆｅｒｏｌ）などの鉄キレート剤を特には添加しなかった。１つの適切な培地は、いくつかの（ｓｅｖｅｒ）個別のアミノ酸を１％カザミノ酸（認定、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で置き換えることにより、ＢＷ Ｃａｔｌｉｎによって公表された培地（Ｃａｔｌｉｎ ＢＷ．（１９７３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１２８：１７８−１９４）から改変されている。培地は１リットルあたり以下を含んでいた：０．４ｇ ＮＨ_４Ｃｌ、０．１６８ｇ ＫＣｌ、５．８５ｇ ＮａＣｌ、１．０６５ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．１７ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．６４７ｇクエン酸ナトリウム、６．２５ｇ乳酸ナトリウム（６０％シロップ）、０．０３７ｇ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．００１３ｇ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、５ｇグリセロール、０．０２ｇシステイン、１０ｇカザミノ酸、０．６１６ｇ ＭｇＳＯ_４、および１リットルになるまでの蒸留水。同一の鉄欠損培地を、スターターフラスコおよび最終培養フラスコまたは発酵槽のために使用した。

亜群Ｂの少なくとも３つの異なる遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む本発明のテクノロジーのワクチン組成物は、３つの潜在的な防御レベルまたはそれぞれ防御抗体応答を潜在的に誘導する３つの抗原型を提供することができる。３つの抗原は、ＰｏｒＡタンパク質（６つの異なるＰｏｒＡ亜型がワクチン中に存在する（３つのワクチン菌株の各々につき２つ）；リポオリゴサッカリド（３つの異なるＬＯＳコア構造がワクチン中に存在する（各菌株から１つ））；およびワクチン菌株中で過剰発現した保存された微量タンパク質ＮａｄＡ、ＦＨＢＰバリアント１および２、ならびにＯｐｃである。ＰｏｒＡが比較的高レベルの抗原変異（数百個の異なる配列変異が同定されている）を有するにもかかわらず、他よりも一定のＰｏｒＡ血清亜型によりいっそう頻繁に遭遇し、中程度の数の異なる血清亜型がＢ群疾患の半分より多くを潜在的に防御することができる。抗原の表面密度が低い場合、抗原に対する抗体が補体媒介溶解事象を開始することができないことが示されているので、ワクチン中で殺菌抗体を誘導することができる１つを超える抗原を有することが重要である。しかし、２つ以上のかかる抗原に対する抗体が存在する場合、抗体は共に補体媒介溶解を開始することができる。本発明の遺伝子改変菌株には、図１８に示す３つの菌株（Ｂ１（４４／７６ ＨＯＰＳ−Ｄ）、Ｂ２（８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１）、および菌株Ｂ３（Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ２）が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のテクノロジーは、髄膜炎菌性疾患、特に髄膜炎菌亜型Ｂに原因する髄膜炎菌性疾患を広範に防御するワクチンを提供する。本発明のワクチン組成物を、既存の四価のＡ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５ワクチンと組み合わせて、髄膜炎菌の大部分の病原性血清群に対して防御することができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ベースとなる莢膜下抗原が髄膜炎菌の全血清群にわたって共有されているので、本発明のテクノロジーのワクチンは他の病原性血清群および髄膜炎菌の少数の血清群に対するバックアップ防御を提供することもできる。

本発明のテクノロジーの好ましい実施形態では、目的の遺伝子または目的のＤＮＡを、相同組換えおよび／または部位特異的組換えによって細菌染色体に送達させ、組み込む。かかる遺伝子および／またはオペロンを送達させるために使用した組み込みベクターは、当業者に公知の制限加水分解またはＰＣＲ増幅によって得た条件付で複製プラスミドまたは自殺プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、または線状ＤＮＡフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、組み込みは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に必ずしも必要でない染色体領域を標的にする。他の実施形態では、目的の遺伝子または目的のＤＮＡを、エピソームベクター（環状／線状複製プラスミド、コスミド、プラスミド、溶原性バクテリオファージ、または細菌人工染色体など）によって細菌に送達させることができる。組換え事象の選択をを、選択遺伝子マーカー（抗生物質（例えば、カナマイシン、ゼオマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシンなど）に耐性を付与する遺伝子、重金属および／または有毒化合物に耐性を付与する遺伝子、または栄養要求性変異を補完する遺伝子など）によって選択することができる。あるいは、組換えを、ＰＣＲ増幅、配列決定、制限消化、または当業者に公知の他の方法によってスクリーニングすることができる。

「ワクチン」は、本明細書中で言及する場合、生物、好ましくは病原性生物による感染に対して動物を免疫するために動物に接種するために使用される薬学的組成物または治療組成物と定義する。ワクチンは、典型的には、動物への投与によって能動免疫が刺激され、これらまたは関連する病原性生物の感染から動物を防御する、１つまたは複数の生物に由来する１つまたは複数の抗原を含む。

精製されたＮＯＭＶを、当該分野で公知の方法（溶液の濾過滅菌、溶液の希釈、アジュバントの添加、および溶液の安定化を含み得る）によって哺乳動物、適切にはヒト、マウス、ラット、またはウサギへの投与のために調製する。

本発明のワクチンを、多数の経路（例えば、非経口（例えば、筋肉内、経皮）、鼻腔内、経口、局所、または当業者に公知の他の経路が含まれるが、これらに限定されない）によってヒトまたは動物に投与することができる。用語非経口には、本明細書の以下で使用する場合、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、動脈内への注射または注入技術が含まれる。ワクチンは、集団予防接種プログラムのために使用することができる単回投与調製物または複数回投与フラスコの形態であり得る。適切なワクチンの調製および使用方法を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，Ｏｓｏｌ（編）（１９８０）およびＮｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖｏｌｌｅｒら（編）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９７８）（参考として援用される）中に見出すことができる。

本発明のテクノロジーのワクチン組成物を、典型的には、標準的な周知の非毒性の生理学的に許容可能なキャリア、アジュバント、および／またはビヒクルを含む投薬単位処方物で非経口投与する。

本発明のテクノロジーのワクチン組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含むことができる。「アジュバント」は、特異的ワクチン抗原と組み合わせて使用した場合に抗原の抗原特異的免疫応答を増強するか、促進するか、延長する働きをするが、単独使用の場合に免疫応答を刺激しない物質である。適切なアジュバントには、無機または有機アジュバントが含まれる。適切な無機アジュバントには、例えば、アルミニウム塩（水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム（好ましくは、水酸化アルミニウム）など）が含まれるが、これらに限定されないが、カルシウム（特に、炭酸カルシウム）、鉄、または亜鉛の塩であり得るか、アシル化チロシン、またはアシル化糖、カチオン性またはアニオン性に誘導されたポリサッカリドまたはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であり得る。他の適切なアジュバントは、当業者に公知である。適切なＴｈ１アジュバント系も使用することができ、例えば、モノホスホリル（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｐｈｏｒｌｙ）脂質Ａ、ＬＰＳの他の非毒性誘導体、およびモノホスホリル脂質Ａ（３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル（ａｃｒｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｌｙ）脂質Ａ（#Ｄ−ＭＰＬ）など）とアルミニウム塩との組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

アジュバントの他の適切な例には、ＭＦ５９、ＭＰＬＡ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、細菌のリポ多糖、アミノアルキルグルコサミンホスファート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくはアナログ（Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）から利用可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載）（例えば、２−[（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル、２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−[（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｏｘｙ）テトラデカノイル]−２−[（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｏｘｙ）テトラデカノイルアミノ]−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＰＬ（商標））（米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル 脂質Ａ）（Ｃｏｒｉｘａから利用可能）、合成ポリヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）など）、ＣＯＧ−ＯＤＮ（ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）、ポリペプチド、サポニン（米国特許第５，０５７，５４０号に記載のＱｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）など）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）（特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９））（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９３／１３３０２号およびＷＯ９２／１９２６５号を参照のこと）、コレラ毒素（野生型または変異体形態のいずれか）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、種々のオイル処方物（ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特許第４，２５８，０２９号を参照のこと）、ＭＤＰとして公知のジペプチド、サポニン、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）（遺伝的にトキソイド化された変異体ＬＴが開発されている）、およびＥｍｕｌｓｏｍｅｓ（Ｐｈａｒｍｏｓ，ＬＴＤ．、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）など）。種々のサイトカインおよびリンホカインは、アジュバントとしての使用に適切である。１つのかかるアジュバントは、米国特許第５，０７８，９９６号に記載のヌクレオチド配列を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。サイトカインのインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、米国特許第５，７２３，１２７号に記載の別のアジュバントである。他のサイトカインまたはリンホカインは、免疫調節活性を有することが示されており（インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、および１８、インターフェロン−α、β、およびγ、顆粒球コロニー刺激因子、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβが含まれるが、これらに限定されない）、アジュバントとしての使用に適切である。

ワクチン組成物を凍結乾燥して、輸送および保存を容易にするための乾燥形態の髄膜炎菌に対するワクチンを生産することができる。さらに、添加した抗原がワクチンの有効性を妨害せず、副作用および有害反応が相加的または相乗的に増加しない限り、上記の遺伝子改変した菌株由来のタンパク質を含むＮＯＭＶおよび少なくとも１つの他の抗原を含む混合ワクチンの形態でワクチンを調製することができる。ワクチンを、ワクチンの溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる化学的部分と結合することができる。あるいは、この部分は、ワクチンの毒性を軽減するか、ワクチンの任意の望ましくない副作用を排除または希釈することができる。かかる効果を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。かかる部分の分子へのカップリング手順は当該分野で周知である。

ワクチンを、密封したバイアル中またはアンプル中などに保存することができる。本発明のワクチンを、一般に、鼻腔内投与のための噴霧、点鼻薬、吸入剤、扁桃腺上のスワブ、または経口投与のためのカプセル、液体、懸濁液、もしくはエリキシルの形態で投与することができる。ワクチンが乾燥形態である場合、ワクチンを、投与前に滅菌蒸留水に溶解または懸濁する。任意の不活性キャリア（食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、またはＮＯＭＶワクチンが適切な溶解性を有する任意のかかるキャリアなど）を使用することが好ましい。

本発明のテクノロジーのワクチン組成物は、キャリアを含むことができる。溶液または液体エアゾール懸濁液の場合、適切なキャリアには、塩溶液、スクロース溶液、または他の薬学的に許容可能な緩衝液が含まれ得るが、これらに限定されない。エアゾール溶液は、界面活性剤をさらに含むことができる。

使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液（リン酸塩、乳酸塩、およびＴｒｉｓなどで緩衝化した食塩水が含まれる）が含まれる。さらに、滅菌固定油を、溶媒または懸濁化媒質として慣習的に使用し、例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、脂肪酸（オレイン酸など）は、注射剤の調製で使用される。

注射用調製物（例えば、滅菌された注射用の水性または油性懸濁液）を、公知の技術にしたがって適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して処方する。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口に許容可能な希釈剤または溶媒を含む滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液として）である。

本明細書に記載のテクノロジーおよびその利点は、以下の実施例を参照してより深く理解されるであろう。これらの実施例を、本発明のテクノロジーの特定の実施形態を説明するために提供する。これらの特定の実施例の提供により、本出願人らは、本発明のテクノロジーの範囲および精神を制限しない。本明細書に記載のテクノロジーの全範囲は本明細書に添付した特許請求の範囲に定義される主題、特許請求の範囲の任意の変更形態、修正形態、または等価物を含むと当業者に理解される。

実施例１：髄膜炎菌の遺伝子改変されたワクチン菌株の誘導および遺伝子改変されたワクチン菌株の外膜タンパク質を含むＮＯＭＶの産生
遺伝子改変菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１を、菌株を得た研究所によって多座酵素電気泳動により分析し、ＥＴ−５クローン複合体に属することが決定された親菌株８５７０由来の５つの遺伝子改変によって改変した（Ｃａｕｇａｎｔら）。ＰｏｒＡ変異領域を配列決定し、分類し、遺伝子改変を行う前にＬＯＳ免疫型を検証した。菌株８５７０は、ＥＴ−５クローン４：Ｐ１．１９、１５：Ｌ７ｖ、ＰｒｏＢ３（ＳＴ４）Ｔｂｐ２ ＩＩ型であった。一連の５つの連続的な遺伝子改変を、下記のように菌株に対して行った。

１）第２の異なるｐｏｒＡ遺伝子をｏｐａＤ遺伝子座に挿入してｏｐａＤ遺伝子をノックアウトした。ｐＵＣ１９ベースのプラスミドｐＡ１８．４は、インサート中に抗生物質耐性マーカーを持たず、これを使用して第２のｐｏｒＡ遺伝子を染色体のｏｐａＤ遺伝子座に挿入し、遺伝子の中央の１００ｂｐ配列をインサートで置換することによってｏｐａＤを無力にした。インサートは、菌株Ｍ４４１０（Ｂ：１５：ＰＩ．２２，１４）から得た新規のｐｏｒＡ遺伝子を含んでおり、菌株Ｈ４４／７６から得たｐｏｒＡプロモーターの後ろに配置した。得られたｐｏｒＡ型は、２つのポーリンＡ遺伝子を含むＰ１．１９，１５：Ｐ１．２２，１４であった。

２）第２のＰｏｒＡが発現する１から得られた菌株から開始して、ｏｐｃＡのプロモーター中の１２ｂｐポリＣ配列をＣヌクレオチドおよびＧヌクレオチドの両方を含む同一の長さの新規の配列で置換することによって外膜タンパク質ＯｐｃＡの発現を安定化させた。元のプロモーター配列（配列番号１）（太字のイタリックで示したポリＧ配列）

を、ＮｏｔＩ部位（下線）を有するＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの両方を含む改変プロモーター配列（配列番号２）

で置換した。置換配列の存在を検証することができるようにＮｏｔＩの制限部位を含むように置換配列を選択した。形質転換のために使用したプラスミドはｐＯｐｃ７９（配列番号４）であった。プラスミドインサートは、抗生物質マーカーを含まない。形質転換体の選択は、ＯｐｃＡに対するモノクローナル抗体を使用したコロニーブロッティングに基づいた。形質転換すべき菌株をＯｐｃＡ陰性相バリアントであるように選択し、強いＯｐｃＡ陽性クローンをコロニーブロッティングによって同定した。真の形質転換体を、ＰＣＲおよび制限酵素（ＮｏｔＩ）分析によってＯｐｃＡ陽性相バリアントと区別した。

３）２から得た菌株から開始して、２つのアシル−オキシ−アシル結合脂肪酸の１つのＬＯＳの脂質Ａへの結合を担うアシルトランスフェラーゼである遺伝子ｌｐｘＬｌを、ｌｐｘＬｌ遺伝子の中央の２６０ｂｐ配列をｔｅｔＭ抗生物質耐性遺伝子を含むインサートで置換することによって無力にした。ｔｅｔＭ遺伝子を、トランスポゾンＴｎ９１６由来のプラスミドｐＪＳ１９３４から得た（Ｓｗａｒｔｌｅｙら、１９９３．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：２９９−３１０）。ｌｐｘＬ１遺伝子を無力にするために使用したプラスミドはｐＭｎ５（配列番号５）であった。ｌｐｘＬｌ遺伝子中のインサートの存在を、ＩｐｘＬｌ遺伝子の最初および最後にプライマーを使用して３．３ｋｂｐアンプリコンを産生したＰＣＲによって検証した。

４）工程３から得た菌株から開始して、保存外膜タンパク質ＧＮＡ１８７０（バリアント１）（ＦＨＢＰ ｖ．１）の発現を、ｎｓｐＡ遺伝子座中のＧＮＡ ｌ８７０ バリアント１遺伝子の第２のコピーの挿入（ＮｓｐＡ発現をノックアウトする）によって増加させた。新規に挿入した遺伝子は、ゲンタマイシン抗生物質耐性遺伝子、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔａｃプロモーターを有するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、ＧＮＡ１８７０バリアント１遺伝子、およびｒｒｎＢターミネーターを含むインサートの一部であった。使用プラスミドを図１９ｃおよび配列番号６に示す。ＰＵＣ１９ベースのプラスミドｐＢＥ／ＧＮＡ１８７０／１０１を形質転換および相同組換えで使用して、ＧＮＡ１８７０バリアント１遺伝子を改変菌株に挿入した。ｐＢＥ／ＧＮＡ１８７０／１０１プラスミド（７６８７ｂ．ｐ．）を、表１に記載の特徴（配列は配列番号６に見出すことができる）を使用して構築した。

５）工程４に由来する菌株を、２００ｂｐ配列がカナマイシン耐性遺伝子に置換されたｓｙｎＸ遺伝子を含むｐＵＣ１９ベースのプラスミドで形質転換した。Ｋａｎ耐性形質転換体を選択し、破壊されたｓｙｎＸ遺伝子の存在および莢膜陰性表現型についてＰＣＲによって試験した。結果により、ｓｙｎＸ遺伝子のノックアウトが立証された。

６）工程４に由来する菌株を、ｌｇｔＡ遺伝子がノックアウトされたゼオマイシン遺伝子を含むプラスミドｐＢＥ−５０１（配列番号９）で形質転換した。プラスミドｐＢＥ−５０１は、表２に見出される特徴を含んでいた。ｌｇｔＡ遺伝子のノックアウトにより、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを欠く短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳが発現された（図２０を参照のこと）。

この遺伝子改変菌株は、不確実な５つ全ての変異の保持および全ての予想される抗原の発現について試験した。

実施例２：遺伝子改変菌株からのワクチン量の生産
次いで、遺伝子改変菌株を用いて、図１〜５の流れ図に詳述するようなワクチン製造に用いるためのマスター・セル・バンクおよびプロダクション・セル・バンクを生産し、ＮＯＭＶの組成物を生産した。ＮＯＭＶ培養物を、外膜タンパク質およびＬＯＳの発現について試験する。

実施例３：ワクチンの特徴付け
実施例２から得た最終生成物を、マウスおよびウサギにおける品質管理試験ならびに前臨床安全性および免疫原性試験に供した。

最終生成物のワクチンの組成は以下であった：
タンパク質 2001ag/ml
リポオリゴサッカリド 36tg/ml
核酸 2.5μg/ml
塩化ナトリウム 0.9%
トリス-HCI緩衝液 0.01MpH7.6
ワクチン組成物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによってさらに分析した。図６は、コントロール（レーン２）および濾過バルクロット（レーン３）と比較したワクチン（レーン４）中のタンパク質含量を示すクマシー・ブルー染色ゲルを示す。図７は、コントロール（ＭＬ５ ＬＰＳ、レーン（ｌａｎｄ）１）および濾過バルクワクチンロット（レーン２）と比較した、ワクチン（レーン３）のリポサッカリド成分を示す銀染色ゲルを示す。図８は、表３に列挙の抗体によるＮＯＭＶワクチンの主成分についてのワクチンの同一性試験の結果を示す。

結果を図６、７、および８に示す。図は、遺伝子改変菌株８５７０ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶ由来のワクチンのＮＯＭＶ中に見出されたタンパク質が記載のようなタンパク質およびＬＯＳを含むことを示す。

実施例４：ワクチンの一般安全性試験
ワクチンを、２１ ＣＦＲ ６１０．１１に規定の一般安全性試験で試験した。ワクチンの結果を表４に示す。

実施例５：ウサギ発熱性試験*
遺伝子改変ワクチン８５７０ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶのみおよび水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させたワクチンの内毒素活性についてのウサギ発熱物質試験の結果を、表３に示す。示した値は、ウサギにおいて発熱（０．５℃超の体温上昇）を誘導しなかった最も高い試験量であり、その結果を表５に示す。

まとめると、ワクチンのみでは０．４ｐｇ／ｋｇで合格し、水酸化アルミニウムアジュバントは１５ｐｇ／ｋｇ（臨床研究で使用されるｋｇあたりの最大量）で合格し、水酸化アルミニウムに吸着したワクチンは０．５ｌａｇ／ｋｇで合格したが、１．０ｐｇ／ｋｇで不合格であった。ｐｇ／ｋｇに基づいたこれらの結果の外挿により、吸着ワクチンがヒトにおいて２５〜５０μｇの範囲の用量まで非発熱性であることが示唆される。

実施例６：ヒト全血からのサイトカイン放出
ワクチンを、新鮮なヒト全血由来から炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を誘導する能力の測定によって内毒素含量について試験した。結果を図９および１０に示す。データは、３試験（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＬＰＳ標準およびｌｐｘＬ２ ＬＯＳを有するＮＯＭＶワクチンロット１１１９）または５試験（野生型ＬＯＳを有するロット０８３２ ＮＯＭＶおよびｌｐｘＬｌ ＬＯＳを有するロット１２８９ ＮＯＭＶワクチン）の平均値である。エラーバーは、平均値の標準誤差である。ＮＯＭＶ濃度はタンパク質に基づくが、Ｅ．Ｃｏｌｉ標準ＬＰＳはＬＰＳ重量に基づく。いかなる特定の理論にも拘束されないが、これらの結果により、現在のワクチンがｌｐｘＬ２ ＬＯＳ含有ワクチン（髄膜炎菌性４４／７６ ＭＯＳ ５Ｄ ＮＯＭＶワクチン、ロット番号１１１９、ＢＢ−ＩＮＤ １２６８７）に類似のヒトボランティアにおける安全性プロフィールを有し得ることが示唆される。

８５７０ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶワクチンロット番号１２８９の活性を、デオキシコラート抽出した外膜小胞（ＯＭＶ）の活性と比較した。手順を通して超遠心分離ペレットの再懸濁に１．２％デオキシコラート（ＤＯＣ）を使用するよりもむしろ０．５％ＤＯＣを使用したことを除いて、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎ ＪＨら、ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌｓ、１４：６７−８０，１９９１に記載の基本的方法を使用して小胞を調製した。この比較の結果を図１１に示す。

実施例７：マウスにおける免疫原性および殺菌抗体応答
水酸化アルミニウムアジュバント（Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＬＶ）に吸着させたか、または吸着させなかった遺伝子改変ワクチン菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇを、マウスに４週間間隔で３回投与した。１０匹のマウスからなる群に、０．１、０．３、１．０、または３．０μｇのＮＯＭＶを、０、４、および８週間目に腹腔内にワクチン接種した。ワクチン群を表６に列挙する。０、７、および１０週目に血清を採取した。補体供給源として正常なヒト血清を使用して、４つの異なる菌株に対する殺菌抗体、ワクチン菌株の親、およびいくつかの関連菌株について血清を試験した。ワクチン接種前の血清は、細菌活性を一様に欠いていた。

１０週目の血清（ワクチンの３回用量）を使用して得た結果を図１２に示す。図は、遺伝子改変菌株に対する異なるワクチン群の細菌力価を示す。試験菌株のうちの２つは、ワクチン菌株の親と同質遺伝子であった。これらは、異なる血清亜型特異性を有する代替ｐｏｒＡとのｐｏｒＡ遺伝子の置換によって親菌株に由来した。これらの試験菌株中で発現したＰｏｒＡタンパク質のうちの２つはワクチン中に存在するが（Ｐ１．１９，１５およびＰ１．２２，１４）、第３のＰｏｒＡタンパク質（Ｐ１．２２−１，４）は存在しない。第４の菌株である４４／７６は、ワクチン菌株と比較して異なるＰｏｒＡ、異なるＰｏｒＢ、および異なるＬＯＳコア構造を有する。驚いたことに、デオキシコラート抽出小胞ワクチンが典型的にはドミナント抗原としてＰｏｒＡ抗原を示す公開された研究と異なり、本発明のテクノロジーのワクチンの結果は、大部分の殺菌活性が標的菌株の血清亜型に依存せず、したがって、ＰｏｒＡに対してではなかったことを実証する。

マウスにおいて８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ ＮＯＭＶワクチンによって誘導された殺菌抗体は、血清亜型特異性を示さないが、血清亜型および血清型とほとんど無関係なようである（図１３）。菌株４４／７６を死滅させる抗体は、主にＬＯＳに指向することが見出された。バーは、平均値の標準誤差である。ワクチンを、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ ＬＶ 水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させるか、または吸着させないで投与した。

異種菌株４４／７６に対する殺菌抗体応答の特異性の分析を、異なる単離抗原を用いた殺菌活性の枯渇によって行った。ワクチン接種後マウス血清を殺菌エンドポイント（−５０％死滅）まで希釈し、異なる濃度のいくつかの抗原でコーティングした９６ウェルマイクロプレートのウェル中でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、血清を殺菌活性について試験し、殺菌抗体の除去率を決定した。標的菌株（免疫型Ｌ３，７）から調製した精製ＬＯＳは、ほぼ全ての抗体を除去することができた。ワクチン菌株から調製した精製ＬＯＳ（免疫型Ｌ８ｖ）は、約７０％の抗体を除去することができた。保存タンパク質ＧＮＡ１８７０（精製された組換えタンパク質）は約２０％の殺菌活性を除去するようであった。これは、いかなる特定の理論にも拘束されないが、図１４に示すように、抗ＬＯＳ抗体および抗ＧＮＡ１８７０抗体の両方に関与するいくつかの協力的死滅を示し得る。

実施例８：ウサギの免疫原性
ワクチンを、ウサギにおける免疫原性についても試験した。４つのウサギ群に、水酸化アルミニウムアジュバントをに吸着させたか、または吸着させていない異なる用量のワクチンを筋肉内に接種した。６週間間隔で３回投与し、最後の注射の２週間後採血した。４つの試験菌株に対するウサギの殺菌抗体応答を決定した。試験菌株は、異なるＰｏｒＡタンパク質およびＬ３，７ｖ ＬＯＳを発現する８５７０の３つの同質遺伝子バリアントならびに異なるコア構造を有する異種ＰｏｒＡおよびＬＯＳを有する菌株４４／７６を含んでいた。ＰｏｒＡタンパク質Ｐ１．１９，１５およびＰ１．２２，１４はワクチン中に存在していたが、Ｐ１．２２−１，４は存在しなかった。殺菌試験の結果を図１５に示す。菌株４４／７６に対する交差反応性殺菌活性を、マウス血清と同一の様式で分析し、結果は本質的に同一であった。ほとんどの交差反応性殺菌抗体を、試験菌株に相同な精製ＬＯＳによって除去することができた。

実施例９：完全多価ＮＯＭＶワクチンの実験室ロットの調製および動物試験
上記実施例に記載した菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇｌに加えて、２つの更なるワクチン菌株を選択し、遺伝子改変した。第１は菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ１．５，２：Ｌ２）であった。この菌株は、遺伝子群ＥＴ−３７に属し、クラス２ ＰｏｒＢタンパク質およびＩ型トランスフェリン結合タンパク質Ｂを有する。第２は菌株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ３，７）であった。これは、遺伝子群ＥＴ−５に属し、１９７０年代および１９８０年代のノルウェーにおいてＢ群髄膜炎菌性流行病を担った代表的な流行菌株である。これは、クラス３ ＰｏｒＢタンパク質およびＩＩ型トランスフェリン結合タンパク質Ｂを発現する。

菌株Ｂ１６Ｂ６を、菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１について記載の様式とほとんど同一の様式で遺伝子改変した。２つの遺伝子（ｓｙｎＸおよびｌｐｘＬ１）を無力にし、ＬＯＳの莢膜合成およびシアル酸化を防止し、ＬＯＳの毒性を軽減した。第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．２２−４）をｏｐａＤ遺伝子の代わりに挿入した。ＩＰＴＧ誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｔａｃプロモーターを有するＧＮＡ １８７０（ＦＨＢＰ）のバリアント２を、プラスミドｐＢＥ−２０１（配列番号７）を使用して第２のコピーとしてｎｓｐＡ遺伝子の代わりに挿入した。表７に記載の特徴を有するプラスミドｐＢＥ−２０１（ｆＨＢＰ（バリアント２）のさらなる発現のための７６８７ｂ．ｐ．）を構築した。

グルコースおよびガラクトースからなる切り詰めたα鎖を発現する得られた菌株の相変異。コロニーブロッティングによってＬ２ ＬＯＳを選択した。得られた遺伝子改変菌株を、Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ２と命名した。図１８を参照のこと。

菌株４４／７６も菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１について記載のパターンと同一のパターンで遺伝子改変した。２つの遺伝子ｓｙｎＸおよびｌｐｘＬｌを挿入変異誘発によって無力にし、第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．７−１，１）をそのプロモーターと共にｏｐａＤ遺伝子の代わりに挿入し、ｎａｄＡの第２のコピーをｎｓｐＡ遺伝子の代わりにｐｏｒＡプロモーターの後ろに挿入した。プラスミドｐＢＥ−３１１を相同組換えのために使用してＮａｄＡ遺伝子を挿入し、表８に記載の特徴を有するプラスミド３−１１を構築した。配列を、配列番号８に見出すことができる。

さらに、ＯｐｃＡの発現をその遺伝子に関連する相変異の矯正によって安定化させた。実施例１中のそのプロモーター中のポリＧストリングの破壊によって菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇｌのために記載のようにこれを行った。ｌｇｔＡ遺伝子を実施例１に記載のように妨害されて、切り詰めたＬＯＳを産生した。Ｌ８免疫型を発現する得られた菌株の相バリアントを、Ｌ８特異的モノクローナル抗体を使用したコロニーブロッティングによって選択した。図１８に示すように、この遺伝子改変菌株を４４／７６ ＨＯＰＳ−Ｄと命名した。２つのさらなる菌株を特徴づけて全ての遺伝子改変が安定であることを確認し、各ストックを凍結した。

実施例１０：菌株Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ２および菌株４４／７６ ＨＯＰＳ−Ｄ由来のＮＯＭＶワクチンの調製
３つの遺伝子改変菌株を使用して、ＮＯＭＶワクチン組成物の実験室ロットを調製した。菌株を、回転式震盪機上のフェルンバッハフラスコ中の１リットルの培養物としてＣａｔｌｉｎ改変培地中で増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、秤量し、細胞ペーストを凍結した。細胞ペーストを解凍し、これを使用して、実施例２に記載のように菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１由来のワクチンの臨床ロットについて記載の手順と本質的に同一の手順にしたがってＮＯＭＶを調製した。この過程をスケールダウンし、２〜８℃にて２２５，０００×ｇで６０分間の超遠心分離を２回行って核酸および全ての可溶性の非小胞物質を除去した。

実施例１１：完全多価ワクチンを使用したマウスの免疫
１０匹のＣＤ−１マウスからなる群に、それぞれの遺伝子の改変されたワクチン菌株由来の２ｐｇのＮＯＭＶワクチン（３菌株由来のＮＯＭＶとの混合ワクチンについて全部で６ｐｇ）を腹腔内に接種した。３回の投与を、０、４、および８週間目に投与した。ワクチン接種前および最後のワクチン接種から２週間後（１０週目）に採血した。

個別のマウス由来の血清を相同菌株に対する殺菌抗体について試験し、１０匹のマウスからなる各群由来のプールした血清を１４種の一連の異種Ｂ群菌株および広範な異なる莢膜下抗原を発現する１Ｃ群菌株に対して試験した。

混合多価ワクチンは、３つのワクチン菌株各々に対して幾何平均で１：２５６の力価を誘導し、１５種の異種菌株のうちの１３種に対して４倍以上殺菌抗体の増加を誘導した。試験菌株のうちの２つは、ワクチン菌株の１つと抗原を共有するにも関わらず死滅しなかった。一連の菌株に対して認められた殺菌力価を、表９に示す。

これらの結果は、混合ワクチンが広範なＢ群菌株および潜在的に他の血清群の菌株に対しても同様に殺菌（防御）抗体を誘導する能力を証明している。

殺菌枯渇試験を使用した殺菌抗体の分析により、３つ全ての抗原組に対する抗体が少なくともいくつかの試験菌株の死滅に関与することが証明された。いくつかの場合、１つを超える抗原に対する抗体が関与し、共に作用して所与の菌株に対する殺菌活性を生じるようであった。

さらなるマウス群に、菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１の同質遺伝子変異体から調製したＮＯＭＶワクチンを接種した。変異菌株は、そのＰｏｒＡ発現が異なっていた。２つの変異体は単一のＰｏｒＡ（多価ワクチン菌株中の２つのＰｏｒＡのうちの一方または他方）を発現し、３番目の変異体はＰｏｒＡタンパク質を発現しないＰｏｒＡノックアウト変異体であった。いくつかの異なる試験菌株に対する４つの各菌株によって誘導された殺菌力価を表１０に示す。

表１０中の最初の５つの試験菌株について、ＰｏｒＡ発現はワクチンによって誘導された殺菌抗体の力価に影響を及ぼさなかった。共にＰ１．１４を発現する最後の２つの菌株について、ワクチン中のＰ１．１４エピトープの存在は、各血清の菌株を死滅させる能力と相関した。これは、ＰｏｒＡに対する抗体がいくつかの菌株について認められた死滅に関与することを実証する。相同菌株および菌株４４／７６などの他の菌株について、他の抗原がほとんどの殺菌活性を担う。これは、殺菌枯渇アッセイを使用した分析によって証明された。１つのかかるアッセイの結果を図１６に示す。図１７に示した結果は、ＬＯＳおよびＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）に対する抗体が８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ１のＰｏｒＡノックアウト変異体に対する抗血清による菌株８５７０の死滅に関与していたことを証明している。

Claims (47)

1. 広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも２つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞を含むワクチンであって、前記未変性の外膜小胞が、ＰｏｒＡ、ＬＯＳ、および保存外膜タンパク質に基づいた３つの異なる抗原組を含み、前記遺伝子改変菌株が、ｌｐｘＬ１遺伝子、ｓｙｎＸ遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されている、ワクチン。
2. 各菌株によって発現された前記ＬＯＳが異なるＬＯＳコア構造を有し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有する、請求項１に記載のワクチン。
3. 各菌株がＢ群分離菌のうちで最も一般的なＰｏｒＡ亜型に基づいて選択される少なくとも２つの異なるＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、請求項１に記載のワクチン。
4. 殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質が各菌株で過剰発現され、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、およびＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
5. ３つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌株由来のＮＯＭＶの組み合わせであって、少なくとも１つの菌株が、以下：
   （１）以下の遺伝子改変または特徴を有するＨ４４／７６ ＨＯＰＳ−ＤＬ：
   ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
   ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．７−１，１）の挿入、
   ＮａｄＡ発現の増加、および
   ＯｐｃおよびＰｏｒＡの安定化された高発現、
   （２）以下の遺伝子改変または特徴を有する８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ_ＡＬ：
   ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
   ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
   Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
   ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現、および
   （３）以下の遺伝子改変または特徴を有するＢ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ_２Ａ：
   ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
   ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
   Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
   ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現
   から選択される、組み合わせ。
6. 菌株Ｈ４４／７６ ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
7. 菌株８５７０ ＨＯＰＳ−Ｇ_ＩＬがＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
8. 菌株Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ_２ＬがＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
9. 前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、請求項１に記載のワクチン。
10. 前記ワクチンを賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、請求項１に記載のワクチン。
11. 前記ＮＯＭＶを、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＭＦ５９、ＣＰＧ−ＯＤＮ、またはＭＰＬＡを含む１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項１に記載のワクチン。
12. 髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および／または鼻腔内に投与する請求項１に記載のワクチンの使用方法。
13. Ｂ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および／または鼻腔内に投与する請求項１に記載のワクチンの使用方法。
14. 髄膜炎菌の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチン組成物であって、前記１つまたは複数の遺伝子改変菌株が、
    ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
    ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
    ｉｉｉ．ラクト−Ｎ−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）が発現される各菌株中でのｌｇｔＡ遺伝子の不活化、および
    ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入
    によって改変された、ワクチン組成物。
15. 前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現をさらに含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
16. 前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化された発現をさらに含み、前記外膜タンパク質がＯｐｃおよびＰｏｒＡを含む群から選択される、請求項１４から１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
17. 前記少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子が髄膜炎Ｂ群分離菌の最も一般的なＰｏｒＡ亜型から選択される少なくとも１つのＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、請求項１４から１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
18. 前記少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質が、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、ＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ、およびＢからなる群から選択される、請求項１５から１７に記載のワクチン組成物。
19. 菌株Ｈ４４／７６ ＨＯＰＳ−Ｄを含む髄膜炎菌亜型Ｂ菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
20. 以下：
    ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
    ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
    ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
    ｉｖ）ｏｐａＤ遺伝子の代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
    ｖ）未変性菌株Ｈ４４／７６と比較して増加したＮａｄＡ発現、および
    ｖｉ）Ｏｐｃタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質発現の安定化された増加
    の遺伝子改変を含む菌株Ｈ４４／７６由来の髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
21. 菌株Ｈ４４／７６ ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、請求項１９または２０に記載の遺伝子改変菌株。
22. 菌株８５７０ ＨＯＳ−Ｇ１を含む髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
23. 以下：
    ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
    ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
    ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
    ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
    ｖ）Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
    ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
    の遺伝子改変を含む８５７０由来の髄膜炎菌亜型Ｂ菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
24. 前記遺伝子改変菌株がＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、請求項２２または２３に記載の遺伝子改変菌株。
25. 菌株Ｂ１６Ｂ６ ＨＰＳ−Ｇ_２Ａを含む髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
26. 以下：
    ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
    ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
    ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
    ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．２２−１，４）の挿入、
    ｖ） Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
    ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
    の遺伝子改変を含むＢ１６Ｂ６由来の髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
27. 前記遺伝子改変菌株がＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、請求項２５または２６に記載の遺伝子改変菌株。
28. 前記菌株を鉄欠損培地で生育させる、請求項１９から２７のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
29. ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、またはｌｇｔＡ遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、請求項１９から２８のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
30. 請求項２０から２９のいずれか１項に記載の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含むワクチン組成物。
31. 前記ワクチン組成物が２つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
32. 前記ワクチン組成物が３つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
33. 前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、請求項１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
34. 前記ワクチン組成物を賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、請求項１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
35. 前記ＮＯＭＶを１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
36. 前記遺伝子改変した菌株を鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる、請求項１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
37. 種々の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチンであって、少なくともいくつかのＮＯＭＶがリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の発現またはシアル酸化を本質的に含まず、ペンタ−アシル構造を有する脂質Ａを含むＬＯＳを含み、発現レベルの増加した少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質を含み、前記微量保存外膜タンパク質が殺菌抗体を誘導するタンパク質から選択される、ワクチン。
38. 前記微量保存外膜タンパク質が、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２からなる群から選択される、請求項３８に記載のワクチン。
39. 少なくともいくつかのＮＯＭＶがラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを本質的に含まない短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを含む、請求項３８に記載のワクチン。
40. 少なくともいくつかのＮＯＭＶが２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質を含む、請求項３８に記載のワクチン。
41. 前記少なくとも２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）亜群Ｂ菌株の最も一般的な菌株から選択される、請求項４３に記載のワクチン。
42. 髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために請求項１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む該動物または該ヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発する方法。
43. 前記ワクチンをＢ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために使用する、請求項４３に記載の方法。
44. 髄膜炎菌性疾患に対するワクチンで用いる髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を調製する方法であって、
    ａ）遺伝子改変することができる髄膜炎菌Ｂ型菌株を選択する工程、
    ｂ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程，
    ｃ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、
    ｄ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、および
    ｅ）１つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって前記菌株を遺伝子改変する工程
    を含む、方法。
45. ｏｐａ遺伝子の読み取り枠への少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入によって前記菌株を遺伝子改変する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
46. 少なくとも１つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−Ｃ配列をＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドを含む配列で置換することによって前記菌株を遺伝子改変して少なくとも１つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
47. 髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法であって、
    ａ）以下：
    ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
    ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
    ｉｉｉ．ＩｇｔＡ遺伝子の不活化、
    ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
    ｖ．少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加した発現または安定した発現、および
    ｖｉ．少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現
    からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、
    ｂ）前記ａ）の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、
    ｃ）前記発酵培養物を不活化する工程、
    ｄ）連続フロー型遠心分離によって髄膜炎菌培養細胞を採取し、そして細胞ペーストを回収する工程、
    ｅ）前記細胞ペーストからＮＯＭＶを単離する工程、および
    ｆ）ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにＮＯＭＶを再懸濁する工程
    を含む、方法。