JP2011512875A - 増強されたadcc機能を有する抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)が増強された抗体、及びその調製方法に関する。
Description
本発明は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)が増強された抗体とその調製方法に関する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)は、Fcレセプター(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応である。ヒトIgGクラスの抗体の中でも、IgG1サブクラスは、最も高いADCC活性とCDC活性を有していることが知られており、現在、その効果の発現に対して高いエフェクター機能を必要とする商業的に入手可能なハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)及びリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を含む臨床腫瘍学的診療におけるヒト化抗体の殆どがヒトIgG1サブクラスの抗体である。
治療用抗体の作用強度を増強するために、例えば抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞傷害活性(CDC)を亢進させるようにエフェクター機能について抗体を修飾することがしばしば望ましい。これは、腫瘍学の分野で特に有益である場合があり、治療用モノクローナル抗体は、腫瘍細胞上の特異的抗原に結合し、腫瘍細胞の破壊に至る免疫応答を誘導する。Fcレセプターを有するキラー細胞とのIgGの相互作用を増強させることにより、これら治療用抗体をより強力にすることができる。
ADCC等のエフェクター機能の増強は、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することを含む様々な手段により達成され得る。別法として又は付加的に、システイン残基(群)をFc領域に導入し、それによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合の形成を許容してもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、及び/又は増加された補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を有している場合がある。Caronら, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)、及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。また、増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体も、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用して調製することができる。別法では、二重Fc領域を有し、増強された補体溶解性及びADCC能力を有し得る抗体を設計可能である。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
IgGクラスの抗体を含む抗体のエフェクター機能を増強する別のアプローチ法は、抗体Fc領域のグリコシル化パターンを操作することである。IgG分子は、Fc領域のCH2ドメインのそれぞれの保存されたAsn297に共有的に結合したN結合オリゴ糖を含んでいる。血清IgGのFc領域に見出されるオリゴ糖は、大部分は、複合型の2分岐グリカン類である。多くの抗体グリコフォームは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)を含む抗体エフェクター機能に対してポジティブな影響を有していると報告されている。よって、Fc部位の炭水化物成分の糖鎖工学、特にコアフコシル化の低減は、Shinkawa Tら, J Biol Chem. 2003;278:3466-73; Niwa Rら, Cancer Res 2004;64:2127-33; Okazaki Aら, J Mol Biol 2004;336:1239-49; 及びShields RLら, J Biol Chem 2002;277:26733-40により報告されている。
選択されたグリコフォームを有する抗体は、グリコシル化経路インヒビター、グリコシル化経路の特定の酵素の活性がなくなったか又は低減した変異株化細胞、増強されたか又はノックアウトされたグリコシル化経路における遺伝子発現を有する遺伝子操作細胞、及びグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼを用いたインビトロリモデリングの使用を含む多くの手段により作製されている。Rothmanら, 1989; Molecular Immunology 26: 1113-1123は、グルコシダーゼインヒビターであるカスタノスペルミン及びN-メチルデオキシノジリマイシン(methyldeoxynojirimycin)、及びマンノシダーゼIインヒビターのデオキシマンノジリマイシンの存在下でモノクローナルIgGを発現させた。Umanaら, Nature Biotechnology 1999; 17: 176-180には、GNT-IIIを発現するCHO株化細胞において発現されたキメラIgG1の増強されたエフェクター機能が記載されている。Shieldsら, 2002; JBC 277:26733-26740, 2002には、フコースを付加するその能力が欠損しているLec13株化細胞で発現されたヒトIgG1における増強されたADCCが記載されている。Shinkawaら, 2003; JBC 278: 3466-3473, 2003には、YB2/0細胞で発現された抗CD20IgG1が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞により産生されたものより、エフェクターとして精製されたヒト末梢血単核球を使用して、50倍以上高いADCCを示すことが示されている。単糖組成とオリゴ糖プロファイリング分析により、CHO産生IgG1の高Fuc量と比較して、複合型タイプのオリゴ糖のフコース(Fuc)が低含有量であることはYB2/0産生IgG1における特徴である。Kandaら, 2006; Glycobiology 17, 104-118には、非フコシル複合体、非フコシルハイブリッド、Man5、及びMan8,9グリカンを有するリツキシマブにおけるADCCの増強が記載されている。Yamane-Ohnukiら, Biotechnol Bioeng 2004;87:614-22では、コア-フコシルトランスフェラーゼ活性を欠くCHO細胞における組換え抗体発現により、コアフコシル化の低減が達成されている一方、Moriら, Biotechnol Bioeng 2004;88:901-8では、フコシルトランスフェラーゼに特異的な低分子干渉RNA(siRNA)を使用し、発現した抗体のエフェクター機能が最大化されている。
主としてMan5グリコフォームを有する抗体は、Wright及びMorrison; 1994, J. Exp. Med. 180:1087-1096; 1998; J. Immunology 160: 3393-3402 により記述されている。該抗体は、活性なGlcNAcトランスフェラーゼIを有さないlec1株化細胞中で発現された。J. Exp. Med. paperの図8の2相性クリアランス曲線から判断すると、異なるクリアランス特性を有する少なくとも2種の区別される抗体集団が存在していると思われる。より速やかに排除されるIgG集団は、おそらくはMan7,8,9グリコフォームを有する抗体である。
一態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された(engineered)、GlcNAcトランスフェラーゼI活性を欠く哺乳動物細胞に関する。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、増強されたα-1,2-マンノシダーゼ(ここでは、α-マンノシダーゼIとも称される)活性をさらに有する。
他の態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がRNAiノックダウンにより低減された哺乳動物細胞に関する。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する。
他の態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がRNAiノックダウンにより低減された哺乳動物細胞に関する。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する。
他の態様では、本発明は、GlcNAcトランスフェラーゼI活性が、RNAiノックダウンにより、5%又はそれ以上、又は10%又はそれ以上、又は20%又はそれ以上、又は25%又はそれ以上、又は30%又はそれ以上、又は35%又はそれ以上のMan5,Man6グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減され、増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有していてよい、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。
他の態様では、本発明は、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がゴルジUDP-GlcNAcトランスポーターのRNAiノックダウンにより低減し、さらに増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性を有していてもよい、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。
さらなる態様では、本発明は、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がゴルジUDP-GlcNAcトランスポーターのRNAiノックダウンにより低減し、またRNAiによりノックダウンしたGlcNAcトランスフェラーゼIを有している、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞に関する。
さらなる他の態様では、本発明は、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片が産生される条件下で、請求項2又は請求項22に記載の哺乳動物株化細胞を培養することを含む、主としてMan5グリカンを有する、該抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、RNAiノックダウンの結果として低減したGlcNAcトランスフェラーゼI活性を有する哺乳動物株化細胞において、抗体又は抗体断片をコードする核酸を発現させることを含む、糖鎖構造中に制御された量のMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。
またさらなる態様では、本発明は、α-1,2-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変されたGlcNAcトランスフェラーゼI活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5,6グリカンに転換される、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片の組換え産生方法に関する。
またさらなる態様では、本発明は、このような抗体又はその断片、イムノアドへシン又はその断片が産生される条件下で、請求項2又は請求項14に記載の哺乳動物株化細胞を培養することを含む、5%又はそれ以上、又は10%又はそれ以上、又は20%又はそれ以上、又は25%又はそれ以上、又は30%又はそれ以上、又は35%又はそれ以上のMan5グリカンを有する、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法に関し、ここで、該抗体断片は少なくとも一のグリコシル化部位を有する。
さらに本発明は、α-1,2-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、RNAiノックダウンのためにGlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5,6グリカンに転換される、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片の組換え産生方法に関する。
他の態様では、本発明は、有毒レクチンの存在下で哺乳動物株化細胞を培養して、GlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減したクローンを選択し、α-1,2-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように、GlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減した一又は複数の前記クローンを改変するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有している、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。特定の実施態様では、マンノシダーゼは、組換え産生に使用される細胞に内在性である。
さらなる他の態様では、本発明は、α-1,2-マンノシダーゼの存在下で、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変された、UDP-GlcNAcトランスポータ活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現産物を接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有している、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法に関する。特定の実施態様では、マンノシダーゼは、組換え産生に使用される細胞に内在性である。
全ての態様において、哺乳動物株化細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞でありうる。
全ての態様において、本発明の株化細胞及び方法は、限定されるものではないが、診断又は治療的関心のある抗体、例えば次の抗原:CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、EGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4)、LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、DR5、EGFL7、ニューロピリン及びレセプター、ネトリン及びレセプター、slit及びレセプター、sema及びレセプター、セマフォリン及びレセプター、robo及びレセプター、及びM1の一又は複数に結合する抗体を含む、任意の抗体の生産に使用可能である。
全ての態様において、本発明の株化細胞及び方法は、限定されるものではないが、診断又は治療的関心のある抗体、例えば次の抗原:CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、EGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4)、LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、DR5、EGFL7、ニューロピリン及びレセプター、ネトリン及びレセプター、slit及びレセプター、sema及びレセプター、セマフォリン及びレセプター、robo及びレセプター、及びM1の一又は複数に結合する抗体を含む、任意の抗体の生産に使用可能である。
抗体及び抗体断片は、キメラ又はヒト化であってよく、特にキメラ及びヒト化抗CD20抗体を含み、特定の実施態様では、抗体はリツキシマブ又はオクレリズマブである。
他の実施態様では、ヒト化抗体は抗HER2、抗HER1、抗VEGF又は抗IgE抗体であり、限定されるものではないが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びオマリズマブ、並びにこのような抗体の断片、変異体及び誘導体が含まれる。
抗体断片には、例えば相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ(minibodies)、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドが含まれ、但し、それらはグリコシル化されている。
抗体断片には、例えば相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ(minibodies)、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドが含まれ、但し、それらはグリコシル化されている。
I.定義
「抗体依存性細胞媒介性傷害活性」及び「ADCC」は、Fcレセプター(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現する一方、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血性細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は同第5821337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK)細胞を含む。別法として又は付加的に、対象分子のADCC活性を、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルでインビボにて評価することができる。
「抗体依存性細胞媒介性傷害活性」及び「ADCC」は、Fcレセプター(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現する一方、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血性細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の464頁の表3に要約されている。対象分子のADCC活性を評価するためには、米国特許第5500362号又は同第5821337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK)細胞を含む。別法として又は付加的に、対象分子のADCC活性を、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルでインビボにて評価することができる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のFcRsを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞及び好中球が含まれるが、PBMCとNK細胞が好適である。エフェクター細胞はその天然源、例えばここに記載するようなPBMC又は血液から単離されうる。
「Fcレセプター」又は「FcR」なる用語は、抗体のFc領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(γレセプター)に結合し、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。FcγRIIレセプターは、FcγRIIA(「活性化レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターFcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を有する。阻害レセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ(ITIM)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。FcRはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のFcRが、ここにおける「FcR」なる用語によって包含される。本用語は、胎児への母性IgGの移動の原因であり、よりゆっくりとした異化作用を媒介し、よって半減期が長くなった新生児レセプターのFcRnもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
「補体依存性細胞傷害活性」もしくは「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は補体系(Clq)の第1成分が、同族抗原と結合した分子(例えば、抗体)に結合することにより開始される。補体活性化を評価するためには、CDCアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようにして実施することができる。
「天然抗体」は、通常は、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する3つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主に採る4つのFRをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、FRによって近接して保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接には関連していないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)における抗体の関与を示す。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89−97(L3)、及び重鎖可変ドメインの31−35(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3);Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及び重鎖可変ドメインの残基26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))を含む。「フレームワーク領域」又は「FR」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「フレームワーク領域」なる用語は、より多岐にわたるCDR領域間に存在する抗体可変領域の従来から認識されている部分を意味する。このようなフレームワーク領域は、典型的にはフレームワーク1から4まで(FR1、FR2、FR3、及びR4)を意味し、3次元空間において、重鎖又は軽鎖抗体可変領域に見出される3つのCDRを、該CDRが抗原結合表面を形成可能なように、保持するための足場を提供する。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。抗体には5つの主なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2にさらに分けられうる。
免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。
「モノクローナル抗体」なる用語は、単一のクローンにより合成される抗体分子を指すために使用される。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法により生産されることを必要とすると解釈されるものではない。しかして、モノクローナル抗体は、最初はKohler及びMilstein, Nature, 256:495(1975);Eur. J. Immunol. 6:511(1976)に記載されたハイブリドーマ法、あるいは組換えDNA法によって作製することができ、あるいは、ファージ又は他の抗体ライブラリーから単離されうる。
「ポリクローナル抗体」なる用語は、B細胞の集団により合成される抗体分子の集団を意味するために使用される。
「ポリクローナル抗体」なる用語は、B細胞の集団により合成される抗体分子の集団を意味するために使用される。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般には、その抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含む。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Fab、Fab’、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、及び相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異性抗体、一般的にはポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドが含まれる。特に本発明の範疇に入るのは、二重特異性抗体断片である。
抗体は、Fc領域がグリコシル化された糖タンパク質である。しかして、例えば、IgG免疫グロブリンのFc領域は、鎖間ジスルフィド結合ヒンジ領域、アスパラギン297(Asn-297)でN結合オリゴ糖を有するグリコシル化CH2ドメイン、及び非共有的に対合したCH3ドメインを含むホモ二量体である。グリコシル化はFcγRI、FcγRII、FcγRIII、及びC1qを媒介するエフェクターメカニズムにおいて重要な役割を担っている。しかして、本発明の抗体断片は、グリコシル化Fc領域及び抗原結合領域を含んでいなければならない。
「二重特異性抗体」及び「二重特異性抗体断片」なる用語は、少なくとも2つの標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体断片を意味するためにここで使用される。所望されるならば、多重特異性は、それらの標的の各々に対して1を越える結合部位を有する多価二重特異性抗体を生産するために、多価性により組み合わせることができる。例えば、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを介して2つのscFv融合体を二量体化することにより、(scFv)1-ヒンジ-ヘリックス-ターン-ヘリックス-(scFv)2、三価二重特異性ミニ抗体が生産された(Mullerら, FEBS Lett. 432(1-2):45-9 (1998))。いわゆる「ジ-ビ-ミニ抗体」は、その標的抗原のそれぞれに対して2つの結合部位を有する。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの高頻度可変領域が相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。集合的に、6つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つの高頻度可変領域のみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
Fab断片はまた軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合もまた知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりscFvが抗原結合に対して望ましい構造を形成するのが可能になる。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。HER2抗体scFv断片は、国際公開第93/16185号;米国特許第5571894号;及び米国特許第5587458号に記載されている。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が不可能なリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第404097号;国際公開第93/11161号;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)にさらに詳細に記載されている。
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのFRが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986);Riechmann等, Nature 332:323-329(1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識等の異種分子にコンジュゲートしていない(ここで定義した)抗体である。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、非還元SDS-PAGE、CE-SDS、又はバイオアナライザーにより測定して、抗体が95重量%より多くなるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製されるであろう。
ここで使用される場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と異種タンパク質(「アドヘシン」、例えばレセプター、リガンドあるいは酵素)の「結合ドメイン」を組合わせた抗体様分子を意味する。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位(抗原結合部位)以外の所望の結合特異性を備えた(つまり、「異種性」である)アドヘシンアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含んでなる。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプ、IgA、IgE、IgD又はIgMから得ることができる。イムノアドヘシン、リガンド結合ドメイン、及びレセプター結合ドメインのさらなる詳細については、その開示を出典明示により明示的にここに援用する米国特許第5116964号;同第5714147号;及び同第6406604号を参照。
II.詳細な記載
本発明は、抗体又は抗体様分子を産生する組換え哺乳動物宿主細胞のグリコシル化機構をマニピュレートすることにより、哺乳動物宿主細胞において、主としてMan5グリカンを有するが、Man7、Man8、及びMan9の量が低減している抗体及び抗体様分子、例えばFc融合タンパク質(イムノアドヘシン)を調製する方法を提供する。
本発明は、抗体又は抗体様分子を産生する組換え哺乳動物宿主細胞のグリコシル化機構をマニピュレートすることにより、哺乳動物宿主細胞において、主としてMan5グリカンを有するが、Man7、Man8、及びMan9の量が低減している抗体及び抗体様分子、例えばFc融合タンパク質(イムノアドヘシン)を調製する方法を提供する。
抗体の組換え産生のための一般的方法
ここでの抗体及び他の組換えタンパク質は、組換えDNA技術のよく知られている技術により生産することができる。よって、ここで特に同定した抗体の他に、当業者は、例えば以下に記載の技術を使用し、関心のある抗原に対して抗体を生産することができる。
ここでの抗体及び他の組換えタンパク質は、組換えDNA技術のよく知られている技術により生産することができる。よって、ここで特に同定した抗体の他に、当業者は、例えば以下に記載の技術を使用し、関心のある抗原に対して抗体を生産することができる。
本発明で生産される抗体は、関心ある抗原に対するものである。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、疾病や疾患を患っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的恩恵がもたらされうる。しかしながら、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許第5091178号参照)に対する抗体もまた考慮される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通型分子(例えばレセプター)又はリガンド、例えば増殖因子でありうる。本発明に包含される抗体に対する例示的な分子標的は、CDタンパク質、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40;ErbBレセプターファミリーのメンバー、例えばEGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)又はHER4(ErbB4)レセプター;細胞接着分子、例えばLFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及びαv/β3インテグリンで、そのα又はβ何れかのサブユニットを含むもの(例えば、抗CD11a、抗CD18あるいは抗CD11b抗体);VEGFのような成長因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、ニューロピリン類及びレセプター、EGF-C、エフリン及びレセプター、ネトリン及びレセプター、slit及びレセプター、抗M1、又はここに記載の任意の他の抗原を含む。上に列挙した抗体が結合する抗原が特にここでの範囲に含まれる。
抗体の組換え産生では、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能ベクター中に挿入しうる。他の実施態様では、抗体は、例えば出典明示により特にここに援用される米国特許第5204244号に記載されているように、相同組換えにより生産することができる。モノクローナル抗体をコードするDNAは容易に単離され、常套的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。該ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、次のもの:シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列、例えば、特に出典明示によりここに援用される1996年7月9日発行の米国特許第5534615号に記載されているものの一又は複数を含む。
本発明の抗体は、グリコシル化されていなければならず、よって抗体鎖又は他の抗体様分子をコードするDNAをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞には、哺乳動物宿主細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞には大きな興味があり、培養(組織培養)での脊椎動物細胞の増殖は、常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ベビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34);バッファロラット肝臓細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATTC CCL51);TRI細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝細胞腫(Hep G2)が含まれる。
宿主細胞は、抗体生産のための発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された一般的な栄養培地で培養される。
哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ham)のF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM)、Sigma)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第4767704号;同第4657866号;同第4927762号;同第4560655号;又は同第5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国特許第再発行第30985号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシンTM)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充してもよい。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーは一次精製工程である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、ヒトγ2、又はヒトγ4の重鎖(Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))をベースにした抗体を精製するのに使用可能である。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3について推奨される(Gussら, EMBO J. 5:15671575 (1986))。親和性リガンドが結合する基質は最も多くはアガロースであるが、他の基質も利用可能である。機械的に安定した基質、例えば調整された多孔質ガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンにより、アガロースで達成されるよりも、流速がより速くなり、処理時間が短縮される。抗体がCH3ドメインを含有している場合、BAKERBOND ABXTM樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技術、例えばイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(SEPHAROSE)TMでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製工程に続き、関心ある抗体と汚染物質とを含む混合物に、所望レベルの純度を得るために、さらなる精製工程を施してもよい。
ヒト化抗体は非ヒトである供給源からその中に導入される一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の対応配列を置換することによりWinter及び共同研究者(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って本質的に実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖でも重鎖でも、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット(best-fit)」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーからスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトFRとして受容される(Simsら,J. Immunol., 151:2296 (1993))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来した特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体のために使用してもよい(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaら, J. Immunol, 151:2623 (1993))。
抗体は抗原への高親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能で、当業者にはなじみが深い。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を例証し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能中で残基の可能な役割の分析、つまり、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選び、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。
別法として、内在性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993);Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993);Duchosalら, Nature 355:258(1992)を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーから得ることもできる(Hoogenboomら, J. Mol. Biol., 227:381(1991);Marksら, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991);Vaughanら, Nature Biotech 14:309(1996))。
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は通常二つの抗原に結合するだけであるが(つまり二重特異性抗体、BsAbs)、ここで使用される場合、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を備えた抗体もこの表現に包含される。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、二つの鎖が異なる特異性を持っている二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、二つの鎖が異なる特異性を持っている二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づく(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
国際公開第96/27011号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を改変して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの代償的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第二抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような他の望まれない最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合し、他方はビオチンに結合できる。そのような抗体は、例えば、望まれない細胞に対して免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4676980号)、及びHIV感染の治療のため(国際公開第91/00360号、同92/200373号、及び欧州特許第03089号)に提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、多くの架橋技術と共に当該分野において良く知られており、米国特許第4676980号に開示されている。
2価以上の抗体も考慮される。例えば、三重特異性抗体も調製可能である。Tuttら, J. Immunol. 147:60(1991)。
2価以上の抗体も考慮される。例えば、三重特異性抗体も調製可能である。Tuttら, J. Immunol. 147:60(1991)。
イムノアドヘシン
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))を免疫グロブリン重鎖のFc領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合されるが、N末端融合もまた可能である。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン(例えば、レセプターの細胞外ドメイン(ECD))を免疫グロブリン重鎖のFc領域及びヒンジと組み合わせるものである。通常は、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合されるが、N末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの少なくとも機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持するであろう。融合はまた定常ドメインのFc部分のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない;特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好適な実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFcドメインのN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を114として残基216)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(a)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(b)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される;IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
抗体及び抗体断片として、本発明のイムノアドへシン構造は、Fc領域を有していなければならない。ここでの範囲内の様々な例示的組み立てられたイムノアドヘシンを以下に概略的に模式化する:
ACH-(ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、又はVLCL-ACH);
ACL-ACH-(ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-ACH、又はVLCL-VHCH);
ACL-VHCH-(ACH、又はACL-VHCH、又はVLCL-ACH);
VLCL-ACH-(ACL-VHCH、又はVLCL-ACH);及び
(A-Y)n-(VLCL−VHCH)2、
ここで、各Aは、同一又は異なるアドヘシンアミノ酸配列を表し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔にするため、上記構造はキーとなる特徴を示しているのみである;これらは、免疫グロブリンの結合する(J)又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
ACH-(ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、又はVLCL-ACH);
ACL-ACH-(ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-ACH、又はVLCL-VHCH);
ACL-VHCH-(ACH、又はACL-VHCH、又はVLCL-ACH);
VLCL-ACH-(ACL-VHCH、又はVLCL-ACH);及び
(A-Y)n-(VLCL−VHCH)2、
ここで、各Aは、同一又は異なるアドヘシンアミノ酸配列を表し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡潔にするため、上記構造はキーとなる特徴を示しているのみである;これらは、免疫グロブリンの結合する(J)又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3'末端に、ヒンジとCH2ドメインの間、又はCH2とCH3ドメインの間で融合される。同様なコンストラクトがHoogenboom等, Mol. Immunol. 28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有的に結合されて存在するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時にハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有的に結合されて、二つのジスルフィド結合された免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造をもたらす。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4816567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等, Cell 61:1303-1313(1990);及びStamenkovic等, Cell 66:1133-1144(1991)を参照のこと)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から得られたcDNAライブラリーからの公開配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部が、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデム挿入される。
増強ADCC機能を有する抗体
真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞中でのタンパク質の発現後、タンパク質は、多くの場合、一般に「グリコシル化」と称される糖残基の酵素的付加を含む、翻訳後修飾を受ける。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の結合を意味する。アスパラギン(Asn)-X-セリン(Ser)及びアスパラギン(Asn)-X-スレオニン(Thr)(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)とのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、N-アセチルグルコサミン、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまたO結合グリコシル化に関与している。
真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞中でのタンパク質の発現後、タンパク質は、多くの場合、一般に「グリコシル化」と称される糖残基の酵素的付加を含む、翻訳後修飾を受ける。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の結合を意味する。アスパラギン(Asn)-X-セリン(Ser)及びアスパラギン(Asn)-X-スレオニン(Thr)(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)とのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、N-アセチルグルコサミン、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまたO結合グリコシル化に関与している。
哺乳動物により生成されるタンパク質のグリコシル化パターンは、The Plasma Proteins: Structure, Function and Genetic Control, Putnam, F. W編, 第2版, Vol. 4, Academic Press, New York, 1984, 特にpp. 271-315に記載されている。この章においては、複合体、高マンノース、及びハイブリッド構造と称される少なくとも3つの群への細分化を含み、アスパラギン結合オリゴ糖、並びにグリコシド結合オリゴ糖が検討されている。
N結合グリカン類の場合、オリゴ糖の還元末端N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基のアノマー炭素(C-1)と、ポリペプチドのアスパラギン(Asn)の窒素とを結合させるアミド結合が存在する。動物細胞では、O結合グリカン類は、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、フコース、N-アセチルグルコサミン、又はキシロースと、いくつかのヒドロキシアミノ酸の一つ、最も一般的にはセリン(Ser)又はスレオニン(Thr)、いくつかの場合には、ヒドロキシプロリン又はヒドロキシリジンとの間のグリコシド結合を介して結合している。
O結合オリゴ糖の生合成経路は、一連の特定のグリコシルトランスフェラーゼによる、ヌクレオチド糖からの単一の糖残基の段階的移動からなる。単糖類ドナーとして機能するヌクレオチド糖は、ウリジン-ジホスホ-GalNAc(UDP-GalNAc)、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、グアニジン-ジホスホ-フコース(GDP-Fuc)、及びシチジン-モノホスホ-シアル酸(CMP-SA)である。
N結合オリゴ糖合成において、N結合オリゴ糖のアセンブリの開始は、タンパク質のAsn残基について直接生じないが、mRNAからの翻訳中又は極めて直後に、ついでタンパク質に移動する、脂質結合前駆体オリゴ糖のプレアセンブリに関与している。この前駆体オリゴ糖(Glc3Man9GlcNAc2)は、多くの膜結合グリコシルトランスフェラーゼを用いて、ポリイソプレノイド担体脂質、ドリコールへのピロリン酸架橋を介して結合しつつ、合成される。脂質結合前駆体のアセンブリが完了した後、別の膜結合酵素が、配列-Asn-X-Ser/Thr-の一部として生じる、立体的に接近可能なAsn残基に、それを移動させる。
新たに合成された糖タンパク質のグリコシル化されたAsn残基は、唯一の種類のオリゴ糖Glc3Man9GlcNAc2のみを一過性に有する。このオリゴ糖構造のプロセシングは、成熟した糖タンパク質に見出される非常に多様な構造を生じせしめる。
N結合オリゴ糖のプロセシングは、多くの膜結合酵素の連続的作用により達成され、3つのグルコース残基の除去、可変数のマンノース残基の除去、及び得られたトリミングされたコアへの様々な糖残基の付加を含む。
N結合オリゴ糖のプロセシングは、多くの膜結合酵素の連続的作用により達成され、3つのグルコース残基の除去、可変数のマンノース残基の除去、及び得られたトリミングされたコアへの様々な糖残基の付加を含む。
N-グリカン生合成経路の一部を図1に示す。
Man9GlcNAc2部分のマンノース残基の4つは、α-マンノシダーゼIにより除去することができ、N結合Man5−9GlcNAc2が生じるが、その全てが脊椎動物糖タンパク質によく見出される。図1に示されるように、Man5GlcNAc2は、UDP-GlcNAcからのβ1→2-結合GlcNAc残基を、α1→3-結合マンノーズ残基に移動させて、GlcNAcMan5GlcNAc2を形成させ、α-マンノシダーゼIIによりさらにトリミングし、2つのマンノーズ残基を除去して、組成GlcNAcMan3GlcNAc2を有するタンパク質結合オリゴ糖を生じせしめる、GlcNAcトランスフェラーゼI(GlcNAcT-I)用の基質となりうる。この構造はGlcNAcトランスフェラーゼII用の基質である(図示せず)。
Man9GlcNAc2部分のマンノース残基の4つは、α-マンノシダーゼIにより除去することができ、N結合Man5−9GlcNAc2が生じるが、その全てが脊椎動物糖タンパク質によく見出される。図1に示されるように、Man5GlcNAc2は、UDP-GlcNAcからのβ1→2-結合GlcNAc残基を、α1→3-結合マンノーズ残基に移動させて、GlcNAcMan5GlcNAc2を形成させ、α-マンノシダーゼIIによりさらにトリミングし、2つのマンノーズ残基を除去して、組成GlcNAcMan3GlcNAc2を有するタンパク質結合オリゴ糖を生じせしめる、GlcNAcトランスフェラーゼI(GlcNAcT-I)用の基質となりうる。この構造はGlcNAcトランスフェラーゼII用の基質である(図示せず)。
この段階には、様々な細胞型の間で異なる一連の膜結合グリコシルトランスフェラーゼによる、オリゴ糖鎖への単糖類の逐次付加を含む、複雑な一連のプロセシング工程が続く。その結果、様々な分岐状、例えば二分岐(2つの分岐状)、三分岐(3つの分岐状)又は四分岐(4つの分岐状)構造を含む多様なファミリーの「複合」オリゴ糖が生成される。
多くの抗体グリコフォームは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ADCC)を含む抗体エフェクター機能に対してポジティブな影響を有していることが報告されている。これは、腫瘍学分野で特に有益であり、そこでは、治療用のモノクローナル抗体が腫瘍細胞上の特異的抗原に結合し、腫瘍細胞の破壊をもたらす免疫反応を誘導する。Fcレセプターを有するキラー細胞とのIgGの相互作用の増強により、これらの治療用抗体は、より強力にされうる。
本発明は、以前に記載されていたものに対してMan7,8,9の量を減少させながら増加した量のMan5グリコフォームを有する抗体を生産する方法を開示する。本発明はまた生産したMan5グリコフォームの量を調節する方法も記載する。
上で検討したように、その一部を図1に示したN-グリカン生合成経路において、GlcNAcトランスフェラーゼIが、GlcNac部分を、ついでα-マンノシダーゼIIによって作用可能であるMan5の末端α-1,3アームに付加する。GlcNAcトランスフェラーゼIの活性を無効にするか又は調節することにより、Man5グリカン類を有する抗体の割合を増加させることができる。
Man7,8,9グリコフォームの量は、α-1,2マンノシダーゼ活性を増強することにより減少させることができる。インビボ又はインビトロのいずれかでα-1,2-マンノシダーゼを使用することにより、より素早く浄化されるMan7,8,9グリカン類を、Man5に転換させることができる。
また本発明は、RNA干渉(RNAi)ノックダウンを使用する、可変量のMan5を有する抗体を生産する方法を提供する。
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子発現を調節するための方法である。RNA分子は、相補的配列を有する単鎖mRNA分子に結合し、特定の遺伝子の翻訳を阻止することができる。RNAは、RNA産生遺伝子(マイクロRNA、すなわちmiRNA)により、外因的(低分子干渉RNA、すなわちsiRNA)、又は内因的に導入され得る。例えば、GlcNAcトランスフェラーゼIに相補的な二本鎖RNAは、抗体発現株化細胞において発現されるこのグリコシルトランスフェラーゼの量を低減させることができ、産生された抗体中のMan5グリコフォームのレベルを増加させる。標的遺伝子の発現レベルがゼロまで低下する遺伝子ノックアウトとは異なり、特定の遺伝子の異なった断片を使用することにより、阻害量が変わり得、所望のグリコフォームが最適量生産されるように特定の断片が使用され得る。最適なレベルは、Fcレセプター結合性、ADCC、効能及び毒性を含むエフェクター機能についてのインビボ又はインビトロアッセイを含む、当該分野でよく知られている方法により測定することができる。完全なノックアウトよりもむしろ、RNAiノックダウンアプローチを使用すると、Man5グリカンの量を最適レベルに微調整することが可能になり、100%未満のMan5グリカン類を有する抗体の生産が所望される場合、大きな恩恵がある。
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子発現を調節するための方法である。RNA分子は、相補的配列を有する単鎖mRNA分子に結合し、特定の遺伝子の翻訳を阻止することができる。RNAは、RNA産生遺伝子(マイクロRNA、すなわちmiRNA)により、外因的(低分子干渉RNA、すなわちsiRNA)、又は内因的に導入され得る。例えば、GlcNAcトランスフェラーゼIに相補的な二本鎖RNAは、抗体発現株化細胞において発現されるこのグリコシルトランスフェラーゼの量を低減させることができ、産生された抗体中のMan5グリコフォームのレベルを増加させる。標的遺伝子の発現レベルがゼロまで低下する遺伝子ノックアウトとは異なり、特定の遺伝子の異なった断片を使用することにより、阻害量が変わり得、所望のグリコフォームが最適量生産されるように特定の断片が使用され得る。最適なレベルは、Fcレセプター結合性、ADCC、効能及び毒性を含むエフェクター機能についてのインビボ又はインビトロアッセイを含む、当該分野でよく知られている方法により測定することができる。完全なノックアウトよりもむしろ、RNAiノックダウンアプローチを使用すると、Man5グリカンの量を最適レベルに微調整することが可能になり、100%未満のMan5グリカン類を有する抗体の生産が所望される場合、大きな恩恵がある。
α-1,2-マンノシダーゼ活性は、様々な方法により増強することができる。例えば、α-1,2-マンノシダーゼ活性は、抗体生産に使用される組換え宿主細胞中に存在するα-マンノシダーゼIの付加的なコピーを提供することにより、増強することができる。
他の実施態様では、微生物株化細胞からのα-1,2-マンノシダーゼを、発現株化細胞に形質移入してもよい。異なった種由来のα-1,2-マンノシダーゼは、様々な高マンノースグリカン類に対して異なった特異性を有する。商業的に入手可能なα-マンノシダーゼIのAspergillus saitoi由来のα-1,2-マンノシダーゼは、高度にリッチなMan9グリコフォームのMan5への強いインビトロトリミングを示した。Contrerasらは、Trichoderma reesei由来のα-1,2-マンノシダーゼ単独で、Man9から4つ全てのマンノースをトリミングし、同種のMan5グリカンが生じることを示している(Marasら, J. Biotechnol., 77: 255-263 (2000); Petegemら, J. Mol. Biol., 312: 157-165 (2001))。A. Saitoi又はT. reeseiのα-1,2-マンノシダーゼは、基質として、高レベルのMan9を有するプロテインA-精製オクレリズマブに使用することができる。
他の実施態様では、他の哺乳動物種由来のα-1,2-マンノシダーゼも、発現株化細胞に形質移入されうる。
異なった内在性マンノシダーゼがMan9をMan5に転換させる各マンノシダーゼのトリミングに関与していることも、高等生物においてまた明らかとなっている。実際、ほとんどの種が、一方は小胞体(ER)、他方はゴルジ体における、2つのマンノシダーゼを利用しており、2段階反応でMan9をMan5にトリミングする(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Mast及びMoremen, Methods Enzymol., 415: 31-46 (2006))。2段階プロセシングは、Ichishimaらの論文において検討されている(Ichishimaら, Biochem. J., 339: 589-597 (1999))。Man8Bは、ゴルジマンノシダーゼを使用し、Man5に転換される最も高い可能性を有している最適な中間体であると思われる。Man9をMan8Bに成功裏に転換させる多くのERマンノシダーゼが同定されており(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Jelinek-Kelly及びHerscovics, J. Biol. Chem., 263(29): 14757-14763 (1988))、これは、別の実施態様では、続いて、Aspergillus saitoi又はTrichoderma reesei由来のいずれかのα-1,2-マンノシダーゼを使用し、Man5にトリミングされうる。
異なった内在性マンノシダーゼがMan9をMan5に転換させる各マンノシダーゼのトリミングに関与していることも、高等生物においてまた明らかとなっている。実際、ほとんどの種が、一方は小胞体(ER)、他方はゴルジ体における、2つのマンノシダーゼを利用しており、2段階反応でMan9をMan5にトリミングする(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Mast及びMoremen, Methods Enzymol., 415: 31-46 (2006))。2段階プロセシングは、Ichishimaらの論文において検討されている(Ichishimaら, Biochem. J., 339: 589-597 (1999))。Man8Bは、ゴルジマンノシダーゼを使用し、Man5に転換される最も高い可能性を有している最適な中間体であると思われる。Man9をMan8Bに成功裏に転換させる多くのERマンノシダーゼが同定されており(Gonzalezら, J. Biol. Chem., 274(30): 21375-21386 (1999); Jelinek-Kelly及びHerscovics, J. Biol. Chem., 263(29): 14757-14763 (1988))、これは、別の実施態様では、続いて、Aspergillus saitoi又はTrichoderma reesei由来のいずれかのα-1,2-マンノシダーゼを使用し、Man5にトリミングされうる。
同種のMan5グリコフォームを生じせしめるための他のアプローチは、上で検討したRNA干渉技術とインビトロトリミング反応とを組み合わせることを含む。CHO細胞は、Man9をMan5に転換させるのに2つのマンノシダーゼを使用するため、CHOゴルジマンノシダーゼは、Man8Bの蓄積に至りうるRNAiを使用し、ノックダウンさせることができる。続いて、Man8Bに富む抗体を精製し、Aspergillus saitoi又はTrichoderma reesei由来のα-1,2-マンノシダーゼを使用し、同じインビトロトリミング反応により、Man5に転換させることができる。また、インビトロトリミング反応は、CHOゴルジマンノシダーゼが特異的にノックダウンされる同じ細胞において、α-1,2-マンノシダーゼを発現させることにより、インビボで導入されうる。これにより、Man8BからMan5への転換前の精製工程が除去される。
さらなる他の実施態様では、これまでに記載されたマンノシダーゼのいずれも、Man6、7、8、9をMan5にトリミングするために、インビトロで発現後に使用されうる。
以下の実施例は例証目的のだめにのみ提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体が出典明示によりここに援用される。
以下の実施例は例証目的のだめにのみ提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
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実施例1
低分子干渉RNA(siRNA)によるN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT-I)のノックダウン
GnT-I cDNAのクローニングと単離cDNAのFLAG(登録商標)タグ化:
CHO細胞でオリゴマンノース型グリカン類を有する抗体を得るために、RNAiアプローチを使用して内在性GnT-I遺伝子の発現をノックダウンした。GnT-Iコード化配列(NCBI受入番号:U65791)の1.3kb断片を、CHO DP12細胞から精製された全RNAを使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりクローニングした。ついで、PCR断片をStrategeneからのpCMV-3Tag-6ベクター(Cat # 240195)中にクローニングした(図2)。完全長GnT-Iタンパク質をコードするDNA配列を、BamHI及びHindIII部位にクローニングした。FLAG(登録商標)タグの3つのコピー(MetAspTyrLysAspAspAspAspLys)(配列番号:1)を、抗FLAG(登録商標)抗体を用いたウエスタンブロット分析のために、単離されたGnT-I cDNA配列の5'末端に融合させた。
低分子干渉RNA(siRNA)によるN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnT-I)のノックダウン
GnT-I cDNAのクローニングと単離cDNAのFLAG(登録商標)タグ化:
CHO細胞でオリゴマンノース型グリカン類を有する抗体を得るために、RNAiアプローチを使用して内在性GnT-I遺伝子の発現をノックダウンした。GnT-Iコード化配列(NCBI受入番号:U65791)の1.3kb断片を、CHO DP12細胞から精製された全RNAを使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりクローニングした。ついで、PCR断片をStrategeneからのpCMV-3Tag-6ベクター(Cat # 240195)中にクローニングした(図2)。完全長GnT-Iタンパク質をコードするDNA配列を、BamHI及びHindIII部位にクローニングした。FLAG(登録商標)タグの3つのコピー(MetAspTyrLysAspAspAspAspLys)(配列番号:1)を、抗FLAG(登録商標)抗体を用いたウエスタンブロット分析のために、単離されたGnT-I cDNA配列の5'末端に融合させた。
低分子干渉RNA(siRNA)プローブの設計と発現ベクター中へのクローニング:
CHO GnI-T遺伝子を標的とするために5つのsiRNAブローブ(配列番号:2-6)を設計するのに使用される方法は、Elbashirら, Methods 26(2):199-213 (2002)により記載されている。siRNAプローブは、Ambion, Inc. (Austin, TX)からのpSilencer 3.1-H1ヒドロプラスミド(図3)中に独立してクローニングされ、アニール化された合成オリゴヌクレオチド類を使用して構築し、低分子ヘアピンsiRNAを生成させた。siRNAプローブをコードするDNA配列を、PolIII型H1プロモーターの制御下、BamHI及びHindIII部位中にクローニングした。H1プロモーターからの転写物は、9のヌクレオチドヘアピン様配列によりその逆相補鎖アンチセンス配列に連結した、GnT-I遺伝子に対して特異的な19のヌクレオチドセンス配列からなるヘアピン-ループsiRNAを形成する。
CHO GnI-T遺伝子を標的とするために5つのsiRNAブローブ(配列番号:2-6)を設計するのに使用される方法は、Elbashirら, Methods 26(2):199-213 (2002)により記載されている。siRNAプローブは、Ambion, Inc. (Austin, TX)からのpSilencer 3.1-H1ヒドロプラスミド(図3)中に独立してクローニングされ、アニール化された合成オリゴヌクレオチド類を使用して構築し、低分子ヘアピンsiRNAを生成させた。siRNAプローブをコードするDNA配列を、PolIII型H1プロモーターの制御下、BamHI及びHindIII部位中にクローニングした。H1プロモーターからの転写物は、9のヌクレオチドヘアピン様配列によりその逆相補鎖アンチセンス配列に連結した、GnT-I遺伝子に対して特異的な19のヌクレオチドセンス配列からなるヘアピン-ループsiRNAを形成する。
各siRNAプローブは、GnT-I遺伝子に特異的な19のヌクレオチドセンス配列からなり、9のヌクレオチドヘアピン-ループ配列により、その逆相補アンチセンス配列に結合し、3'末端に5 6U'sが続く(図3)。図4は、GnT-I遺伝子を標的とする5つのsiRNA配列を示す。GnT-I転写物を切断するこれらsiRNAプローブの能力を、CHO細胞中へFLAG(登録商標)タグ化GnT-Iプラスミドを用いた各siRNA発現プローブプラスミドを一過性に同時形質移入することにより試験した。また、ネガティブコントロールとなるエンプティpSilencer(Ambion, Inc.)ベクタープラスミドも、FLAG(登録商標)タグ化GnT-Iプラスミドと共に同時形質移入された。細胞を溶解させ、形質移入の24時間後に抽出し、細胞溶解物を、抗FLAG(登録商標)M2抗体(Sigma, MO)を用いたウエスタンブロットにより分析した。予想通り、コントロールプラスミドはFLAGタグ化GnT-Iの発現を阻害しなかったが、siRNAプローブはFLAG(登録商標)タグ化GnT-I融合タンパク質発現について様々な度合いの阻害性を有していた(図5)。残りのRNAiよりも顕著に強い阻害効果を示したRNAi1及びRNAi3を、さらなる評価のために選択した。
オクレリズマブ産生株化細胞中へのsiRNA発現プラスミドの一過性発現
RNAi1及びRNAi3(RNAi13)の配列を含む組合せsiRNAプラスミドと共に、5つのsiRNA発現プラスミド(RNAi1、RNAi2、RNAi3、RNAi4、及びRNAi5)を、オクレリズマブ産生のための株化細胞に一過性に形質移入させた。コントロールとして、GnT-I又は任意の既知の遺伝子に対して相同性を有さないランダムなマウス配列を含むスクランブルプラスミドを、平行して形質移入させた。形質移入方法にリポフェクタミン(LIPOFECTAMINE)TM 2000を用いた標準血清含有一過性形質移入プロトコルを続けた。簡潔に述べると、形質移入の日に、ウシ胎児血清(FBS)の存在下で非選択的増殖培地に細胞を1.5×106細胞/mLで播種した。DNA及びリポフェクタミンTMを別々のチューブの形質移入用培地に添加し、続いて混合し、室温で30分インキュベートした。ついで、DNA複合体を細胞培養に添加した。24時間後、形質移入した培養体を生産培地に培地交換した。収集細胞培養液(HCCF)及び細胞ペレットを、形質移入の1、2及び5日後に収集した。CE-グリカンアッセイを使用してHCCFを分析し、異なったグリコフォームのレベルを測定し、定量的qPCR分析用に細胞ペレットを使用し、GnT-Iの内在性mRNAレベルを測定した。qPCRを実施するために、RNeasy(登録商標)96ウェルキット(Qiagen)又はMagMAXTM-96全RNA単離キット(Ambion)により、mRNAを単離した。TAQMAN(登録商標)分析を実施し、実験過程中のGnT-I mRNA発現レベルを測定した(図6A)。cDNA(bp1260−1324)の3'末端をカバーするプライマー及びプローブの配列は以下の通りである:
順プライマー
CGTTGTCACTTTCCAGTTCAG(配列番号:7)
逆プライマー
AGCCTTCCCAGGTTTGTG(配列番号:8)
プローブ
FAM-ACGTGTCCACCTGGCACCCC-TAMRA(配列番号:9)
RNAi1及びRNAi3(RNAi13)の配列を含む組合せsiRNAプラスミドと共に、5つのsiRNA発現プラスミド(RNAi1、RNAi2、RNAi3、RNAi4、及びRNAi5)を、オクレリズマブ産生のための株化細胞に一過性に形質移入させた。コントロールとして、GnT-I又は任意の既知の遺伝子に対して相同性を有さないランダムなマウス配列を含むスクランブルプラスミドを、平行して形質移入させた。形質移入方法にリポフェクタミン(LIPOFECTAMINE)TM 2000を用いた標準血清含有一過性形質移入プロトコルを続けた。簡潔に述べると、形質移入の日に、ウシ胎児血清(FBS)の存在下で非選択的増殖培地に細胞を1.5×106細胞/mLで播種した。DNA及びリポフェクタミンTMを別々のチューブの形質移入用培地に添加し、続いて混合し、室温で30分インキュベートした。ついで、DNA複合体を細胞培養に添加した。24時間後、形質移入した培養体を生産培地に培地交換した。収集細胞培養液(HCCF)及び細胞ペレットを、形質移入の1、2及び5日後に収集した。CE-グリカンアッセイを使用してHCCFを分析し、異なったグリコフォームのレベルを測定し、定量的qPCR分析用に細胞ペレットを使用し、GnT-Iの内在性mRNAレベルを測定した。qPCRを実施するために、RNeasy(登録商標)96ウェルキット(Qiagen)又はMagMAXTM-96全RNA単離キット(Ambion)により、mRNAを単離した。TAQMAN(登録商標)分析を実施し、実験過程中のGnT-I mRNA発現レベルを測定した(図6A)。cDNA(bp1260−1324)の3'末端をカバーするプライマー及びプローブの配列は以下の通りである:
順プライマー
CGTTGTCACTTTCCAGTTCAG(配列番号:7)
逆プライマー
AGCCTTCCCAGGTTTGTG(配列番号:8)
プローブ
FAM-ACGTGTCCACCTGGCACCCC-TAMRA(配列番号:9)
図6Aに示すmRNA分析は、GnT-Iを標的とする全てのRNAiプラスミドが、GnT-I mRNAを有意にノックダウンでき、形質移入の5日後、コントロール(スクランブルプラスミドで形質移入)と比較して、最大で80%のノックダウンを有することを示している。コントロールのGnT-I発現レベルを100%に設定した。TAQMAN(登録商標)アッセイにおけるノックダウン活性は、FLAG(登録商標)タグ化GnT-Iのウエスタンブロット分析とよく相関しており、双方のアッセイにおいて、RNAi1とRNAi3が、最も強いインヒビターであると思われた。RNAi13は、RNAi1及びRNAi3と個々に比較して、さらなる阻害をもたらし、全ての次の研究に対する主要なRNAiベクターとして選択した。
実施例2
抗体のMan5レベルの測定
HCCFに収集された抗体の実際のMan5レベルを決定するために、「CE-グリカン」と称されるキャピラリー電気泳動を選択し、抗体から放出されたグリカン類を測定するための標準的方法とした。簡潔に述べると、分取プロテインA精製方法を使用し、HCCFからの抗体を精製した。ついで、Fc領域に結合したN結合グリカンを、37℃で一晩インキュベートして、ペプチド-N-グリコシダーゼF(PNGアーゼF)により切断する。反応後、タンパク質を沈殿させ、切断されたグリカン類から分離し、還元的アミノ化により、8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホナート(APTS)で標識した。ついで、標識されたグリカン類を、特定の溶出プロファイルを有するAPTS標識グリカン標準体に対して、キャピラリー電気泳動法を使用して分析した。アッセイの詳細はベックマン・コールターのウエブサイトに見出すことができる。5日目にアッセイされた抗体のMan5含有量は、TAQMAN(登録商標)データとよく相関しており(図6A)、RNAi13は、約9%で最も高いMan5含有量を有していた(図6B)。
抗体のMan5レベルの測定
HCCFに収集された抗体の実際のMan5レベルを決定するために、「CE-グリカン」と称されるキャピラリー電気泳動を選択し、抗体から放出されたグリカン類を測定するための標準的方法とした。簡潔に述べると、分取プロテインA精製方法を使用し、HCCFからの抗体を精製した。ついで、Fc領域に結合したN結合グリカンを、37℃で一晩インキュベートして、ペプチド-N-グリコシダーゼF(PNGアーゼF)により切断する。反応後、タンパク質を沈殿させ、切断されたグリカン類から分離し、還元的アミノ化により、8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホナート(APTS)で標識した。ついで、標識されたグリカン類を、特定の溶出プロファイルを有するAPTS標識グリカン標準体に対して、キャピラリー電気泳動法を使用して分析した。アッセイの詳細はベックマン・コールターのウエブサイトに見出すことができる。5日目にアッセイされた抗体のMan5含有量は、TAQMAN(登録商標)データとよく相関しており(図6A)、RNAi13は、約9%で最も高いMan5含有量を有していた(図6B)。
一過性形質移入実験の14日間の実施中において安定なMan5レベル
RNAi13プラスミドの一過性発現でMan5レベルを増加させるために、同じ株化細胞において、より長い細胞培養期間を試験した(14日まで)。他の抗体を用いた経験では、生産培養期間を長くすると、Man5レベルが増加することが示された(図10A)。14日間の実験では、同様の一過性形質移入プロトコルを使用した。株化細胞を、リポフェクタミンTMを使用し、スクランブル又はRNAi13ベクターを用いて形質移入した。形質移入から様々な日数後、HCCFを収集し、CE-グリカンアッセイを使用して試料を分析し、Man5レベルを測定した。図7は、示されている培養期間でのMan5レベルを示すが、RNAi13プラスミドはコントロール条件よりもほぼ10倍高いMan5レベルとなり、そのレベルは、実験全体を通して安定していたようである。さらに、この特定の実験に対するGnT-I mRNAレベルは、5日間の培養と同様であった(データは示さず)。
RNAi13プラスミドの一過性発現でMan5レベルを増加させるために、同じ株化細胞において、より長い細胞培養期間を試験した(14日まで)。他の抗体を用いた経験では、生産培養期間を長くすると、Man5レベルが増加することが示された(図10A)。14日間の実験では、同様の一過性形質移入プロトコルを使用した。株化細胞を、リポフェクタミンTMを使用し、スクランブル又はRNAi13ベクターを用いて形質移入した。形質移入から様々な日数後、HCCFを収集し、CE-グリカンアッセイを使用して試料を分析し、Man5レベルを測定した。図7は、示されている培養期間でのMan5レベルを示すが、RNAi13プラスミドはコントロール条件よりもほぼ10倍高いMan5レベルとなり、そのレベルは、実験全体を通して安定していたようである。さらに、この特定の実験に対するGnT-I mRNAレベルは、5日間の培養と同様であった(データは示さず)。
実施例3
CHO α-マンノシダーゼI cDNAのクローニング
上述のGnT-Iをクローニングするのに使用したものと同じ全RNAを、CHO α-マンノシダーゼIをクローニングするために使用した。α-マンノシダーゼIはグリコシル化経路における別の重要な酵素である。それにより、高マンノース構造のMan7,8,9はMan5、6に転換される。このタンパク質を過剰発現させることにより、潜在的に、Man5へのより均質な転換が可能となる。先ず、ヒト、マウス、ラットからの相同体のコード化配列を、CHO遺伝子をクローンアウトするのに使用できるであろう保存領域を明らかにするために整列させた。コード化配列の5'末端の上流の保存領域と終止コドンの後の小領域を、CHO α-マンノシダーゼIからクローンアウトした。cDNAのサイズは1.9kBである(図8A)。アラインメントがタンパク質レベルでなされた場合、アミノ酸配列に基づきCHO細胞とマウスのマンノシダーゼの間には有意に高い相同性(95%)が存在した。CHO α-マンノシダーゼIのcDNAとGnT-I RNAi13カセットを、別の発現ベクターSV40.GS.CMV.nbe中にクローニングした(図8C)。
CHO α-マンノシダーゼI cDNAのクローニング
上述のGnT-Iをクローニングするのに使用したものと同じ全RNAを、CHO α-マンノシダーゼIをクローニングするために使用した。α-マンノシダーゼIはグリコシル化経路における別の重要な酵素である。それにより、高マンノース構造のMan7,8,9はMan5、6に転換される。このタンパク質を過剰発現させることにより、潜在的に、Man5へのより均質な転換が可能となる。先ず、ヒト、マウス、ラットからの相同体のコード化配列を、CHO遺伝子をクローンアウトするのに使用できるであろう保存領域を明らかにするために整列させた。コード化配列の5'末端の上流の保存領域と終止コドンの後の小領域を、CHO α-マンノシダーゼIからクローンアウトした。cDNAのサイズは1.9kBである(図8A)。アラインメントがタンパク質レベルでなされた場合、アミノ酸配列に基づきCHO細胞とマウスのマンノシダーゼの間には有意に高い相同性(95%)が存在した。CHO α-マンノシダーゼIのcDNAとGnT-I RNAi13カセットを、別の発現ベクターSV40.GS.CMV.nbe中にクローニングした(図8C)。
実施例4
GnT-Iの一定のノックダウンのためにshRNAを発現させる安定株化細胞の開発
オクレリズマブにRNAi13ベクターを一過性形質移入させることで、Man5レベルは、0.5−1%から9%まで、ざっと10倍に増加した。Man5レベルをさらに増加させるため、安定した株化細胞の開発に着手し、ゲノムに導入されたshRNAを用いて安定したクローンを作製し、よって、さらに一貫した様式で、GnT-Iをノックダウンさせる安定した発現レベルをもたらされることが予想される。安定した細胞クローンを開発するための標準的なプロトコルは、RNAi13プラスミド(Shenら. (2007), Metabolic engineering to control glycosylation In M. Butler (Ed.), Cell culture and Upstream Processing (pp.131-148). New York, NY: Taylor & Francis Group)を用いて実施され、ベクターに存在する耐性遺伝子のためにハイグロマイシン選択を使用した(図3)。要するに、形質移入は、リポフェクタミンTMを使用する一過性形質移入実験と同じようにして実施した。形質移入から24時間後に生産培地に交換する代わりに、細胞を、0.5mg/mLのハイグロマイシン選択圧を含む選択培地に交換し、ついで、様々な播種密度でペトリ皿に配した。皿(全体で20−50皿)を、クローンが観察されるまで、37℃で2−3週間、CO2加湿インキュベータでインキュベートした。個々のクローンを96−ウェルプレート(1クローン/ウェル)に移し、約200−300のクローンを第1段階で採取した。潜在的に高いMan5レベルを有するクローンを選択するために、全てのクローンのGnT-I mRNAレベルを、TAQMAN(登録商標)アッセイを使用して測定し、最も低いGnT-I mRNAレベルを有するクローンを選択した。続いて、選択されたクローンを48ウェルプレート、24ウェルプレート、6ウェルプレート、T75培養フラスコ、ついで最終的には振盪フラスコにスケールアップした。大ざっぱに12クローンを選択し、3日目に10%の栄養素補給がなされた生産培地において14日間、最初の生産培養を実施した。最も多くの量のMan5を有する上位クローンを、さらなる使用のために保存し、保管した。
GnT-Iの一定のノックダウンのためにshRNAを発現させる安定株化細胞の開発
オクレリズマブにRNAi13ベクターを一過性形質移入させることで、Man5レベルは、0.5−1%から9%まで、ざっと10倍に増加した。Man5レベルをさらに増加させるため、安定した株化細胞の開発に着手し、ゲノムに導入されたshRNAを用いて安定したクローンを作製し、よって、さらに一貫した様式で、GnT-Iをノックダウンさせる安定した発現レベルをもたらされることが予想される。安定した細胞クローンを開発するための標準的なプロトコルは、RNAi13プラスミド(Shenら. (2007), Metabolic engineering to control glycosylation In M. Butler (Ed.), Cell culture and Upstream Processing (pp.131-148). New York, NY: Taylor & Francis Group)を用いて実施され、ベクターに存在する耐性遺伝子のためにハイグロマイシン選択を使用した(図3)。要するに、形質移入は、リポフェクタミンTMを使用する一過性形質移入実験と同じようにして実施した。形質移入から24時間後に生産培地に交換する代わりに、細胞を、0.5mg/mLのハイグロマイシン選択圧を含む選択培地に交換し、ついで、様々な播種密度でペトリ皿に配した。皿(全体で20−50皿)を、クローンが観察されるまで、37℃で2−3週間、CO2加湿インキュベータでインキュベートした。個々のクローンを96−ウェルプレート(1クローン/ウェル)に移し、約200−300のクローンを第1段階で採取した。潜在的に高いMan5レベルを有するクローンを選択するために、全てのクローンのGnT-I mRNAレベルを、TAQMAN(登録商標)アッセイを使用して測定し、最も低いGnT-I mRNAレベルを有するクローンを選択した。続いて、選択されたクローンを48ウェルプレート、24ウェルプレート、6ウェルプレート、T75培養フラスコ、ついで最終的には振盪フラスコにスケールアップした。大ざっぱに12クローンを選択し、3日目に10%の栄養素補給がなされた生産培地において14日間、最初の生産培養を実施した。最も多くの量のMan5を有する上位クローンを、さらなる使用のために保存し、保管した。
複数の形質移入実験を実施し、スクリーニングのための多くの安定したクローンをつくり出した。TAQMAN(登録商標)アッセイを使用し、全体で〜350のクローンをスクリーニングし、GnT-Iの内在性mRNAレベルを測定したが、ここで、mRNAレベルのパーセントは、未形質移入株化細胞におけるGnT-I mRNAレベルに対するものである。数回のスケールアップ後、ある形質移入実験からの上位5クローンと、他の形質移入実験からの上位13クローンを選択し、それらの相対的GnT-I mRNAレベルを図9Aに示す。安定したクローンにおけるGnT-Iノックダウンレベルは、一過性形質移入で観察されたノックダウンレベルと非常に類似し、80%で最大のノックダウンを有している。18クローンを、14日間の生産実験でさらに評価し、ついで、CE-グリカン分析を使用し、実施の終わりにHCCFを分析した。Man5レベルを図9Bに示す。再び、結果には、安定なクローンのMan5グリコフォームのパーセント(Man5%)が、一過性形質移入実験で観察されたものに類似していることが示された。Man5レベルの約5倍の増加が観察され、クローンP2-10CついてはMan5レベルは6%で最も高いレベルであった。
実施例5
Man5レベルを増加させるための細胞培養条件の操作
GnT-IのRNAiノックダウンと併せて、最適化された細胞培養パラメータを使用することで、得られるMan5の量を増加させることができる。培養期間を長くし、培地浸透圧を増加させることは、評価される別の抗体では有益であることが見出されており、他での結果(米国特許出願第2007/0190057-A1号の図2及び図4)には、浸透圧を増加させることで、高マンノースグリコフォームを有する抗体の割合を増加させることができることが示されている。
Man5レベルを増加させるための細胞培養条件の操作
GnT-IのRNAiノックダウンと併せて、最適化された細胞培養パラメータを使用することで、得られるMan5の量を増加させることができる。培養期間を長くし、培地浸透圧を増加させることは、評価される別の抗体では有益であることが見出されており、他での結果(米国特許出願第2007/0190057-A1号の図2及び図4)には、浸透圧を増加させることで、高マンノースグリコフォームを有する抗体の割合を増加させることができることが示されている。
図10Aは、評価される抗体の生産実験の一例であり、多量のMan5抗体が14日間の培養の終わりに生産されたことが、明確に示されている。さらに、基本培地中の増加したNaCl(又は浸透圧)濃度を、Man5レベルに関してまた試験した。図10Bに示すように、300から400mOsmに基本浸透圧が増加することで、Man5含有量をさらに増加させることができる。しかしながら、高浸透圧の栄養素補給溶液を添加しても、高浸透圧の基本培地における有益性以上には、Man5レベルは上昇しない(データは示さず)。より高い浸透圧とより長い培養期間の効果を、他の分子について、Man5レベルを増加させるために、組合せて使用することができる。これらの知見のため、オクレリズマブを生成する株化細胞と、上のセクションに記載されたオクレリスマブのトップ5のGnT-Iノックダウン安定クローンを用いて、これらの条件を試験するように実験をデザインした。
浸透圧及び培養期間に起因する効果に加えて、少量の塩化マンガンが培養に供給された場合、マンガンの添加により、Man5レベルが低減することが示されている。図10Cには、同じ抗体を用いた14日間の生産実験の結果が要約されており、そこでは、1μMの塩化マンガンが3日、3及び6日、又は3、6及び9日で供給されている。全ての場合において、Man5レベルは、コントロールと比較して50%低減した。Man5レベルを増加させるためには、マンガン濃度をより低くするという条件が有益であると予期される。
GnT-I活性のRNAiノックダウンにより生成されるトップ5の安定クローンを、この実験に含めた。クローン6Dからの結果の例を図10Dに示す。一般に、Man5レベルは、全ての条件に対して、培養期間の増加につれて増加している。基本培地が高浸透圧であることは、Man5レベルの増強に最も強い効果を有しており、マンガンが存在しないことは、コントロールと比較してわずかに有益であると思われる。生産培養を14日から21日に延長し、高浸透圧の基本培地を使用することにより、Man5レベルを、約2倍まで増加させることができる。したがって、細胞培養条件を操作することにより、Man5レベルを、RNAiノックダウンアプローチに関して、さらに増強することができる。
実施例6
GnT-Iの下流で生産されたグリカン類を有する細胞に結合しこれを殺すためのレクチンの使用
細胞におけるGnT-I活性を低減させる他の方法を、GnT-Iノックダウンと別に、又はそれと組合せて使用してもよい。高レベルのMan5を有する株化細胞は、GnT-Iの活性喪失とMan5グリコフォームの蓄積を生じる、GnT-I変異を有する細胞クローンをスクリーニングすることによりまた選択することができる。レクチン耐性法は、Stanleyら(Stanleyら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(9): 3323-3327 (1975); Patnaik及びStanley, Methods Enzymol., 416:159-182 (2006))により研究されている。例えば、GnT-Iの下流で作製されるグリカンに結合するレクチンは、高レベルのRNAiノックダウンを有する細胞を選択することができる。フィトヘマグルチニン(PHA)、つまり有毒の植物性レクチンは、少量の複合グリカンを有する細胞を選択するために、細胞培養に添加することができる。GnT-I活性を欠く細胞は、細胞表面に存在する欠陥性のあるレクチン-結合糖タンパク質をもたらし、ついで、細胞が、PHAを含む環境において生存できるようにする。このアプローチは、レクチンストレス条件下で生存する細胞の可能性を増加させるために、GnT-IのRNAiノックダウンと関連させて使用することができる。また、これにより、高レベルのノックダウンを有する変異体を見出す効率を増加させることができる。
GnT-Iの下流で生産されたグリカン類を有する細胞に結合しこれを殺すためのレクチンの使用
細胞におけるGnT-I活性を低減させる他の方法を、GnT-Iノックダウンと別に、又はそれと組合せて使用してもよい。高レベルのMan5を有する株化細胞は、GnT-Iの活性喪失とMan5グリコフォームの蓄積を生じる、GnT-I変異を有する細胞クローンをスクリーニングすることによりまた選択することができる。レクチン耐性法は、Stanleyら(Stanleyら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(9): 3323-3327 (1975); Patnaik及びStanley, Methods Enzymol., 416:159-182 (2006))により研究されている。例えば、GnT-Iの下流で作製されるグリカンに結合するレクチンは、高レベルのRNAiノックダウンを有する細胞を選択することができる。フィトヘマグルチニン(PHA)、つまり有毒の植物性レクチンは、少量の複合グリカンを有する細胞を選択するために、細胞培養に添加することができる。GnT-I活性を欠く細胞は、細胞表面に存在する欠陥性のあるレクチン-結合糖タンパク質をもたらし、ついで、細胞が、PHAを含む環境において生存できるようにする。このアプローチは、レクチンストレス条件下で生存する細胞の可能性を増加させるために、GnT-IのRNAiノックダウンと関連させて使用することができる。また、これにより、高レベルのノックダウンを有する変異体を見出す効率を増加させることができる。
実施例7
UDP-GlcNAcゴルジ膜トランスポーターのノックダウン
別法として、一又は複数の付加的な遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることで、Man5のパーセントを増加させることが予期される。GnT-Iは基質としてUDP-GlcNAcを必要とする。UDP-GlcNAcはサイトゾル中で合成され、ゴルジのルーメンに運搬される。Guillenら(PNAS 95: 7888-7892, 1998)は、哺乳動物のゴルジ膜トランスポーターをクローニングした。このトランスポーターをノックダウン又はノックアウトすることで、ゴルジ体におけるUDP-GlcNAcのプールが除去されるか、又は大きく低減させることが予期される。従って、GnT-I用の基質のレベルを低減させると、Man5レベルがより高くなることが予期される。
UDP-GlcNAcゴルジ膜トランスポーターのノックダウン
別法として、一又は複数の付加的な遺伝子をノックダウン又はノックアウトすることで、Man5のパーセントを増加させることが予期される。GnT-Iは基質としてUDP-GlcNAcを必要とする。UDP-GlcNAcはサイトゾル中で合成され、ゴルジのルーメンに運搬される。Guillenら(PNAS 95: 7888-7892, 1998)は、哺乳動物のゴルジ膜トランスポーターをクローニングした。このトランスポーターをノックダウン又はノックアウトすることで、ゴルジ体におけるUDP-GlcNAcのプールが除去されるか、又は大きく低減させることが予期される。従って、GnT-I用の基質のレベルを低減させると、Man5レベルがより高くなることが予期される。
実施例8
変動量のMan5グリカンを有する抗体の精製及び特徴付け
Man5グリコフォームに富む抗体を、可溶性レセプターに結合するヒト化IgG1のCHO細胞発酵からの収集され清澄にされた細胞培養液(HCCF)のCon Aセファロースクロマトグラフィーにより精製した。この抗体を発現する株化細胞は、通常よりも多い量のMan5を有するグリカンを産生した(5−20%)。
変動量のMan5グリカンを有する抗体の精製及び特徴付け
Man5グリコフォームに富む抗体を、可溶性レセプターに結合するヒト化IgG1のCHO細胞発酵からの収集され清澄にされた細胞培養液(HCCF)のCon Aセファロースクロマトグラフィーにより精製した。この抗体を発現する株化細胞は、通常よりも多い量のMan5を有するグリカンを産生した(5−20%)。
2LのHCCF(1.29g/L mAb)を、25mMのトリス、25mMのNaCl、5mMのEDTA、pH7.1で平衡にしたプロセップ(PROSEP)TMAカラム(2.5×14cm、Millipore)で精製した。平衡用バッファー及び0.4Mのリン酸カリウムバッファーを使用する一連の充填後洗浄工程の後に、0.1Mの酢酸,pH2.9を使用し、結合した抗体を溶出させ、1.5Mのトリス塩基でpH7.4に調節した。ついで、溶出したプロテインAのプールを、1mMのMnCl2、1mMのCaCl2、0.5MのNaCl、25mMのトリス、pH7.4で平衡にされたCon AセファロースTMカラム(2.5×5cm、GE HealthCare)において処理した。0.5Mのα-D-マンノピラノシド、0.5MのNaCl、25mMのトリス、pH7.4を使用し、結合した抗体を溶出させた。
Con AセファロースTMプール中の抗体をプロテインAカラムで回収し、ついで、二度目に、Con AセファロースTMでのクロマトグラフィーを施した。プロテインAでの回収後、三度目に、プールにCon AセファロースTMで再びクロマトグラフィーを施したが、今度は、平衡用バッファーと溶出用バッファーの15カラム容量の勾配を用い、溶出を実施した。プロテインAクロマトグラフィーにより、生成物を再び単離した。
グリカン分析により、出発物質が15%のMan5グリコフォームを含んでいたことが明らかとなった。Con Aに1回通過させた後、Man5含有量は43%まで増加しており、2度目に通過させた後、Man5は57%まで、三度目の通過後には、Man5は62%まで増加していた。
リッチ化されていない(5%のMan5及び16%のMan5)抗体の2つの試料と、Con Aでリッチ化された抗体(62%)の1つの試料を、ELISAによりFcガンマレセプターIIIa結合について評価し、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)及びハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)と比較した。
リッチ化されていない(5%のMan5及び16%のMan5)抗体の2つの試料と、Con Aでリッチ化された抗体(62%)の1つの試料を、ELISAによりFcガンマレセプターIIIa結合について評価し、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)及びハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)と比較した。
図11は、FcガンマレセプターIIIa-V158への抗体結合性を示す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は5%のMan5(7-9%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は16%のMan5(14.6%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は62%のMan5(11%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。
図12は、FcガンマレセプターIIIa-F158に結合する抗体を示す。白丸はハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)を表し、白四角はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)を表し、白三角は5%のMan5(7-9%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、白菱形は16%のMan5(14.6%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表し、黒丸は62%のMan5(11%の非フコシルグリカン)を有する抗レセプター抗体を表す。
上の明細書を通して、本発明を、所定の実施態様を参照して検討したが、それに限定されるものではない。実際、ここに示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、上の明細書から当業者には明らかであろうし、添付される特許請求の範囲に入る。
Claims (59)
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、GlcNAcトランスフェラーゼI活性を欠き、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
- 増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する請求項1に記載の哺乳動物細胞。
- 株化細胞である請求項2に記載の哺乳動物細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である請求項3に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又は抗体断片が、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、EGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4)、LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、DR5、EGFL7、ニューロポリン及びそのレセプター、VEGF-C、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、slit及びそのレセプター、sema及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、robo及びそのレセプター、及びM1からなる群から選択される抗原に結合する請求項3に記載の哺乳動物細胞。
- 前記抗体がキメラ又はヒト化されている請求項5に記載の哺乳動物細胞。
- キメラ抗体が抗CD20抗体である請求項6に記載の哺乳動物細胞。
- 抗CD20抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである請求項7に記載の哺乳動物細胞。
- ヒト化抗体が抗HER2、抗HER1、抗VEGF又は抗IgE抗体である請求項6に記載の哺乳動物細胞。
- 抗HER2抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである請求項9に記載の哺乳動物細胞。
- 抗VEGF抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである請求項9に記載の哺乳動物細胞。
- 抗IgE抗体がオマリズマブである請求項9に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体断片が、相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成された多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される請求項5に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がRNAiノックダウンにより低減され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
- GlcNAcトランスフェラーゼI活性が、RNAiノックダウンにより、20%又はそれ以上のMan5,Man6グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減している、請求項14に記載の哺乳動物細胞。
- GlcNAcトランスフェラーゼI活性が、RNAiノックダウンにより、25%又はそれ以上のMan5,Man6グリカンを含む糖鎖構造となるのに十分な程に低減している、請求項14に記載の哺乳動物細胞。
- 増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項14に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該抗体又はその断片が、20%又はそれ以上のMan5,Man6グリカンの糖鎖構造を含む、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、該抗体又はその断片が、25%又はそれ以上のMan5,Man6グリカンの糖鎖構造を含む、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
- 株化細胞である、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である、請求項20に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又は抗体断片が、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、EGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4)、LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、DR5、EGFL7、ニューロポリン及びそのレセプター、VEGF-C、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、slit及びそのレセプター、sema及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、robo及びそのレセプター、及びM1からなる群から選択される抗原に結合する、請求項17に記載の哺乳動物細胞。
- 前記抗体がキメラ又はヒト化されている、請求項14に記載の哺乳動物細胞。
- キメラ抗体が抗CD20抗体である、請求項23に記載の哺乳動物細胞。
- 抗CD20抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである、請求項24に記載の哺乳動物細胞。
- ヒト化抗体が抗HER2、抗HER1、抗VEGF又は抗IgE抗体である、請求項23に記載の哺乳動物細胞。
- 抗HER2抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである、請求項26に記載の哺乳動物細胞。
- 抗VEGF抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである、請求項26に記載の哺乳動物細胞。
- 抗IgE抗体がオマリズマブである、請求項26に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体断片が、相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される、請求項26に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変された、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がゴルジUDP-GlcNAcトランスポーターのRNAiノックダウンにより低減され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
- 哺乳動物細胞が増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項31に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を発現するように改変され、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がゴルジUDP-GlcNAcトランスポーターのRNAiノックダウンにより低減され、RNAiによりノックダウンされたGlcNAcトランスフェラーゼIをさらに有する、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する哺乳動物細胞。
- 哺乳動物細胞が増強されたα-1,2-マンノシダーゼ活性をさらに有する、請求項33に記載の哺乳動物細胞。
- 抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片が生成される条件下で、請求項3又は請求項20従い、哺乳動物株化細胞を培養することを含み、該抗断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、主としてMan5グリカンを有する、抗体又はその断片、又はイムノアドへシン又はその断片を作製する方法。
- 哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、20%又はそれ以上のMan5グリカンを担持している、請求項35に記載の方法。
- 哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、25%又はそれ以上のMan5グリカンを担持している、請求項35に記載の方法。
- 哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、30%又はそれ以上のMan5グリカンを担持している、請求項35に記載の方法。
- 哺乳動物株化細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞であり、抗体又はその断片、又はイムノアドヘシン又はその断片が、35%又はそれ以上のMan5グリカンを担持している、請求項35に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片が、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、EGFレセプター(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)、HER4(ErbB4)、LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3インテグリン、CD11a、CD18、CD11b、VEGF;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満(OB)レセプター;mplレセプター;CTLA-4;プロテインC、DR5、EGFL7、ニューロポリン及びそのレセプター、VEGF-C、エフリン及びそのレセプター、ネトリン及びそのレセプター、slit及びそのレセプター、sema及びそのレセプター、セマフォリン及びそのレセプター、robo及びそのレセプター、及び抗M1からなる群から選択される抗原に結合する、請求項35に記載の方法。
- 前記抗体がキメラ又はヒト化されている、請求項40に記載の方法。
- キメラ抗体が抗CD20抗体である、請求項41に記載の方法。
- 抗CD20抗体がリツキシマブ又はオクレリズマブである、請求項42に記載の方法。
- ヒト化抗体が抗HER2、抗HER1、抗VEGF又は抗IgE抗体である、請求項41に記載の方法。
- 抗HER2抗体がトラスツズマブ又はペルツズマブである、請求項44に記載の方法。
- 抗VEGF抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである、請求項44に記載の方法。
- 抗IgE抗体がオマリズマブである、請求項44に記載の方法。
- 抗体断片が、相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含んでいるポリペプチドからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- α-1,2-マンノシダーゼの存在下、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、GlcNAcトランスフェラーゼI活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項35に記載の方法。
- RNAiノックダウンの結果として、低減したGlcNAcトランスフェラーゼI活性を有する、哺乳動物株化細胞において、抗体又は抗体断片をコードする核酸を発現させることを含み、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に約20%〜100%のMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
- 抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、RNAiノックダウンの故にGlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養することを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
- α-1,2-マンノシダーゼの存在下、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、RNAiノックダウンの故にGlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減した哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Man7,8,9グリカンがMan5,6グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項52に記載の方法。
- GlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減したクローンについて選択されるように、有毒レクチンの存在下、哺乳動物株化細胞を培養し、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように、GlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減した一又は複数の該クローンを操作することを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
- 有毒レクチンがフィトヘマグルチニンである、請求項54に記載の方法。
- GlcNAcトランスフェラーゼI活性が低減したクローンの選択が、GlcNAcトランスフェラーゼI活性がRNAiノックダウンにより低減した細胞を同定するのに使用される、請求項54に記載の方法。
- α-1,2-マンノシダーゼの存在下で哺乳動物細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項54に記載の方法。
- 抗体、イムノアドへシン、又はその断片を発現するように改変され、UDP-GlcNAcトランスポーター活性を欠く哺乳動物株化細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることを含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、糖鎖構造中に主としてMan5グリカンを有する、抗体、イムノアドへシン、又はその断片を組換え産生させる方法。
- α-1,2-マンノシダーゼの存在下で哺乳動物細胞を培養するか、又はこのようなα-1,2-マンノシダーゼと発現した生成物とを接触させることをさらに含み、Man7,8,9グリカンがMan5グリカンに転換され、該断片が少なくとも一のグリコシル化部位を有する、請求項58に記載の方法。
- 細胞に内在するマンノシダーゼ活性が、抗体又はその断片の組換え産生に使用される、請求項58に記載の方法。
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