JP2011239707A

JP2011239707A - Method of producing peptide

Info

Publication number: JP2011239707A
Application number: JP2010113150A
Authority: JP
Inventors: Kuniki Kino; 邦器木野; Toshinobu Arai; 利信新井
Original assignee: Waseda University; Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Waseda University; Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2010-05-17
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2011-12-01

Abstract

【課題】ペプチドの製造法の提供。
【解決手段】以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質、該蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるか、または該蛋白質を発現する形質転換体を培養することによる、ペプチドの製造法。[１]特定のアミノ酸配列を有する蛋白質。[２]特定のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質。
[３]特定のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質。
【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a peptide.
SOLUTION: The protein according to any of the following [1] to [3], a culture of a transformant expressing the protein or a treated product of the culture is used as an enzyme source, or the protein is used. A method for producing a peptide by culturing a transformant that expresses. [1] A protein having a specific amino acid sequence. [2] A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted, or added in a specific amino acid sequence, and which has peptide synthesis activity.
[3] A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with a specific amino acid sequence and having peptide synthesis activity.
[Selection diagram] None

Description

本発明は、ペプチド合成活性を有する蛋白質、または該蛋白質を発現する形質転換体を用いたペプチドの製造法に関する。該蛋白質は遊離のアミノ酸を基質としてペプチドを合成することができる。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a peptide using a protein having peptide synthesis activity or a transformant expressing the protein. The protein can synthesize a peptide using a free amino acid as a substrate.

L-アミノ酸リガーゼ（Lal, EC 6.3.2.28）は保護基を持たない遊離のアミノ酸を基質として、ＡＴＰの加水分解反応と共役することでペプチドを合成可能な微生物由来酵素である（非特許文献１および２）。 L-amino acid ligase (Lal, EC 6.3.2.28) is a microorganism-derived enzyme capable of synthesizing a peptide by coupling with a hydrolysis reaction of ATP using a free amino acid having no protecting group as a substrate (Non-Patent Document 1). And 2).

Lal遺伝子を発現する組換え微生物を用いることで、ペプチドを発酵法によって合成することも可能であることから（非特許文献３）、Lalは工業的にも非常に有用性の高い酵素であるといえ、これまで数種類のLalの報告がある（非特許文献４〜７）。しかしながら、Lalの基質特異性によって、蛋白質を構成するアミノ酸20種から組み合わされる400種のジペプチドすべてを効率よく製造することができるわけではない。 By using a recombinant microorganism that expresses the Lal gene, it is possible to synthesize the peptide by a fermentation method (Non-Patent Document 3). Therefore, Lal is an enzyme that is extremely useful industrially. No, there have been reports of several types of Lal so far (Non-patent documents 4 to 7). However, due to the substrate specificity of Lal, it is not possible to efficiently produce all of the 400 dipeptides that are combined from the 20 amino acids that make up the protein.

タブトキシン（Tabtoxin）は、シュードモナス・シリンジ（Pseudomonas syringae）由来の植物病原ペプチドとして知られている化合物であり、P. syringe BR2株ではTabtoxin生合成クラスターも特定されている（非特許文献８）。しかしながら、各遺伝子産物がどのような機能を担っているかは知られておらず、またこのクラスター中にL-アミノ酸リガーゼが含まれているかもわかっていなかった。 Tabtoxin is a compound known as a plant pathogenic peptide derived from Pseudomonas syringae , and a Tabtoxin biosynthetic cluster has also been identified in the P. syringe BR2 strain (Non-patent Document 8). However, it was not known what function each gene product has, and it was not known whether the L-amino acid ligase was included in this cluster.

J. Bacteriology, 81, 13-22 (2008)J. Bacteriology, 81, 13-22 (2008) J. Bacteriology, 187, 5195-5202 (2005)J. Bacteriology, 187, 5195-5202 (2005) Appl. Environ. Microbiol., 73, 6378-6285 (2007)Appl. Environ. Microbiol., 73, 6378-6285 (2007) Biosci. Biotechnol. Biochem., 273, 901-907 (2009)Biosci. Biotechnol. Biochem., 273, 901-907 (2009) Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 3048-3050 (2008)Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 3048-3050 (2008) J. Biosci. Bioeng., 106, 313-315 (2008)J. Biosci. Bioeng., 106, 313-315 (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun., 371, 536-540 (2008)Biochem. Biophys. Res. Commun., 371, 536-540 (2008) J. Antibiot. 58, 817-821 (2005)J. Antibiot. 58, 817-821 (2005)

本発明の目的は、ペプチド合成活性を有する蛋白質を酵素源に用いたペプチドの製造法、該ペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたペプチドの製造法および該蛋白質を発現する形質転換体を培養することによるペプチドの製造法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing a peptide using a protein having a peptide-synthesizing activity as an enzyme source, a culture of a transformant expressing a protein having the peptide-synthesizing activity, or a treated product of the culture as an enzyme source. It is intended to provide a method for producing a peptide used and a method for producing a peptide by culturing a transformant expressing the protein.

本発明は、以下の（１）〜（８）に記載の方法に関する。
（１）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１] 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２] 配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３] 配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（２）ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって生成されるＡＴＰであることを特徴とする上記（１）の製造法。
（３）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１] 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２] 配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３] 配列番号２で表されるアミノ酸配列と、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（４）形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする上記（３）のペプチド製造法。
[１] 配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２] 配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３] 配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（５）ＡＴＰがポリリン酸キナーゼによって生成されるＡＴＰであることを特徴とする上記（３）または（４）の製造法。
（６）以下の[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中より該ペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。
[１] 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２] 配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３] 配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
（７）形質転換体が、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたものであることを特徴とする上記（３）のペプチド製造法。
[１] 配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
[２] 配列番号１または３で表される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[３] 配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ The present invention relates to the methods described in (1) to (8) below.
(1) The protein according to any of the following [1] to [3], one or more kinds of amino acids, and ATP are allowed to exist in an aqueous medium, and a peptide is produced and accumulated in the medium, A method for producing a peptide, which comprises collecting the peptide.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity (2) ATP is ATP produced by polyphosphate kinase. The method according to (1) above, which is characterized.
(3) A culture of a transformant expressing the protein according to any one of the following [1] to [3] or a treated product of the culture, one or more amino acids, and ATP present in an aqueous medium. And a peptide is produced and accumulated in the medium, and the peptide is collected from the medium.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein (4) transformant comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity is represented by the following [1] to [3 ] The method for producing a peptide according to (3) above, which is transformed with the DNA according to any one of the above.
[1] DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
[2] A DNA consisting of a base sequence having 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and encoding a protein having peptide synthesis activity
[3] A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having peptide synthesis activity
(5) The method according to (3) or (4) above, wherein ATP is ATP produced by polyphosphate kinase.
(6) A transformant that expresses the protein according to any one of [1] to [3] below and has the ability to produce one or more amino acids is cultured in a medium, and the peptide is added to the culture. A method for producing a peptide, which comprises producing and accumulating and collecting the peptide from the culture.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein (7) transformant comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity is represented by the following [1] to [3] The method for producing a peptide according to (3) above, which is transformed with the DNA according to any one of 1.
[1] DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
[2] A DNA consisting of a base sequence having 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and encoding a protein having peptide synthesis activity
[3] A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having peptide synthesis activity

本発明によれば、遊離のアミノ酸を基質に用いてペプチドを効率よく製造する方法が提供される。 According to the present invention, a method for efficiently producing a peptide using a free amino acid as a substrate is provided.

1.本発明の製造法で用いられる蛋白質
本発明の製造法で用いられる蛋白質としては、以下の[１]〜[３]のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
[１] 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[２] 配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質
[３] 配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質 1. Protein used in the production method of the present invention Examples of the protein used in the production method of the present invention include proteins having the amino acid sequences described in any of the following [1] to [3].
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity

上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつペプチド合成活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。 In the above, a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added, and having peptide synthesis activity is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). (Hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 3rd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as Current Protocols in Molecular Biology), Nucleic Acids Research, 10 , 6,487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 , 6409 (1982), Gene, 34 , 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13 , 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Using the site-directed mutagenesis method described in Sci. USA, 82 , 488 (1985), etc., for example, to introduce a site-directed mutation into DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Can be obtained.

欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。 The number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the above site-specific mutation method, and is 1 to several tens. The number is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.

配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。 The deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 means 1 to several tens, preferably 1 to 20 at any position in the same sequence. , More preferably 1 to 10 and even more preferably 1 to 5 amino acid residues may be deleted, substituted or added.

アミノ酸残基の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１０アミノ酸残基をあげることができる。 Examples of the positions of amino acids at which amino acid residues can be deleted or added include 10 amino acid residues on the N-terminal side and the C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.

欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。 Deletions, substitutions or additions may occur at the same time, and the substituted or added amino acids may be natural or non-natural. Examples of natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine and L. -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。 Below, the example of the amino acid which can be mutually substituted is shown. Amino acids included in the same group can be substituted with each other.

Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid C group: asparagine, glutamine D group: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid E group: proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline F group: serine, threonine, homoserine G group: phenylalanine, tyrosine

また、ペプチド合成活性を有する蛋白質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ他のタブトキシン生合成クラスターにコードされる蛋白質と共同してタブトキシンを合成する活性を有する蛋白質をあげることができる。 Further, as a protein having peptide synthesis activity, the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly It is preferably a protein consisting of an amino acid sequence having homology of 98% or more, most preferably 99% or more, and a protein having the activity of synthesizing tabtoxin in cooperation with a protein encoded by another tabtoxin biosynthetic cluster. I can give you.

アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。gapped alignmentを得るために、Altschulら(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを用いて、分子間の位置関係（Id.）および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰返し検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。 For homology of amino acid sequences and nucleotide sequences, the algorithms BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90 , 5873 (1993)] and FASTA [Methods Enzymol., 183 , 63 (1990)] by Karlin and Altschul were used. Can be decided. Programs called BLASTN and BLASTX have been developed based on this algorithm BLAST [J. Mol. Biol., 215 , 403 (1990)]. When the nucleotide sequence is analyzed by BLASTN based on BLAST, the parameters are, for example, Score=100 and wordlength=12. When the amino acid sequence is analyzed by BLASTX based on BLAST, the parameters are, for example, score=50 and wordlength=3. Gapped BLAST can be utilized as described in Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) to obtain gapped alignment. Alternatively, PSI-Blast or PHI-Blast can be used to perform an iterated search that detects positional relationships (Id.) between molecules and relationships between molecules that share a common pattern. When using the BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast, and PHI-Blast programs, the default parameters of the respective programs can be used (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

本発明においてペプチド合成活性とは、アミノ酸を基質とし、アデノシン−５´−三リン酸（以下、ＡＴＰと略す）を利用してペプチドを生成する活性をいい、好ましくはL-アミノ酸、グリシンまたはペプチドのＣ末端を、L-アミノ酸、グリシンまたはペプチドのＮ末端に結合する反応によりペプチドを生成する活性をいう。 In the present invention, the peptide synthesis activity means an activity of producing a peptide by using adenosine-5'-triphosphate (hereinafter, abbreviated as ATP) using amino acid as a substrate, and preferably L-amino acid, glycine or peptide Refers to the activity of forming a peptide by the reaction of binding the C-terminus of L-amino acid, glycine or the N-terminus of a peptide.

本発明の製造法で用いられる蛋白質が、ペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いてペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を精製した後、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。 As a means for confirming that the protein used in the production method of the present invention is a protein having peptide synthesis activity, a transformant expressing the protein having peptide synthesis activity is prepared by using, for example, DNA recombination method. After purifying the protein of the present invention using the transformant, the purified protein is used as an enzyme source to allow the enzyme source, one or more amino acids, and ATP to exist in an aqueous medium. A method of analyzing by HPLC or the like whether or not a peptide is produced and accumulated therein can be mentioned.

２．本発明の製造法に用いられるＤＮＡ
本発明の製造法に用いられるＤＮＡとしては、
［４］配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［５］配列番号１または３で表される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の相同性を有し、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
［６］配列番号１または３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。 2. DNA used in the production method of the present invention
The DNA used in the production method of the present invention includes
[4] DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
[5] A DNA encoding a protein having 80% or more homology with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and [6] SEQ ID NO: 1 or 3. A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the represented base sequence under stringent conditions and that encodes a protein having peptide synthesis activity;
Can be raised.

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、オリゴヌクレオチドプライマーとして用いられるＤＮＡとしては少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。 The term "hybridize" as used herein refers to a step in which the DNA has a specific base sequence or a part of the DNA hybridized with the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or has a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. May be. The DNA used as a probe for Northern or Southern blot analysis can be at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, and at least 10 bases can be used as the DNA used as the oligonucleotide primer. As mentioned above, DNA having preferably 15 bases or more can be mentioned.

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。 Methods for DNA hybridization experiments are well known, for example, Molecular Cloning 2nd Edition, 3rd Edition (2001), Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic press( In addition to those described in (Molecular), hybridization conditions can be determined and experiments can be performed according to a number of other standard textbooks.

上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750ｍMの塩化ナトリウム、75mmol/Lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/Lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/Lの塩化ナトリウム、0.2mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。 The stringent conditions are, for example, 50% formamide of a filter on which DNA is immobilized and probe DNA, 5×SSC (750 mM sodium chloride, 75 mmol/L sodium citrate), 50 mmol/L sodium phosphate. (PH 7.6), 5× Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg/L denatured salmon sperm DNA after incubation at 42° C. overnight, eg, 0.2× at about 65° C. The conditions for washing the filter in the SSC solution can be raised, but lower stringent conditions can also be used. The stringent condition can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the concentration of formamide, the lower the stringency), the salt concentration and the temperature condition. Low stringent conditions include, for example, 6×SSCE (20×SSCE is 3 mol/L sodium chloride, 0.2 mol/L sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol/L EDTA, pH 7.4), 0.5% Incubate at 37°C overnight in a solution containing SDS, 30% formamide, and 100 μg/L denatured salmon sperm DNA, then wash with 50°C 1xSSC, 0.1% SDS solution. I can give you. Further, as the lower stringent condition, there may be mentioned the condition of washing after performing hybridization using a solution having a high salt concentration (for example, 5×SSC) under the above-mentioned low stringent condition.

ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより、上記した様々な条件を設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加には、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。 The various conditions described above can be set by adding or changing a blocking reagent used for suppressing the background of the hybridization experiment. The addition of the blocking reagents described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、上記した［４］に記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。 Examples of the DNA hybridizable under the above stringent conditions include, for example, the bases of the DNA described in [4] above when calculated based on the above parameters using the programs such as BLAST and FASTA described above. A DNA having at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more homology with the sequence can be mentioned.

塩基配列の相同性は、上記したBLASTまたはFASTA等のプログラムを用いて決定することができる。 The homology of nucleotide sequences can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、該ＤＮＡを発現する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該酵素源、並びに１種以上のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法によって確認することができる。 The fact that the DNA that hybridizes with the above-mentioned DNA under stringent conditions is a DNA encoding a protein having peptide synthetic activity means that a recombinant DNA that expresses the DNA is prepared and The protein is purified from a culture obtained by culturing a transformant obtained by introducing the enzyme into a host cell, and using the purified protein as an enzyme source, the enzyme source and one or more amino acids, amino acid derivatives Alternatively, it can be confirmed by allowing a peptide to exist in an aqueous medium and analyzing by HPLC or the like whether or not the peptide is produced and accumulated in the aqueous medium.

３．本発明の製造法に用いられる形質転換体
本発明の製造法に用いられる形質転換体としては、本発明の製造法に用いることができる限り、形質転換体であれば特に限定されないが、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体、および上記［４］〜[６]のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体をあげることができる。宿主細胞としては、細菌等の原核生物をあげることができ、好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物をあげることができる。 3. The transformant used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it can be used in the production method of the present invention, as long as it can be used in the production method of the present invention, the above [ Using a transformant expressing the protein according to any one of 1] to [3] and a recombinant DNA containing the DNA according to any of the above [4] to [6], a known host cell is used. The transformant obtained by transforming by the method can be mentioned. Examples of host cells include prokaryotes such as bacteria, and preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia .

４．本発明の製造法で用いられるＤＮＡの調製
本発明の製造法で用いられるＤＮＡは、配列番号１または３で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブやプライマーを用い、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、好ましくはシュードモナス・シリンジ（Pseudomonas syringe）、より好ましくはP. syringe NBRC14081株の染色体に対するサザンハイブリダイゼーション、または染色体を鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]等の手法により取得することができる。 4. Preparation of DNA used in the production method of the present invention The DNA used in the production method of the present invention uses Pseudomonas ( Pseudomonas ) using a probe or primer that can be designed based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3. Microorganisms belonging to the genus, preferably Pseudomonas syringe , more preferably Southern hybridization for the chromosome of P. syringe NBRC14081 strain, or a method such as PCR using the chromosome as a template [PCR Protocols, Academic Press (1990)] Can be obtained by

また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１または３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。 Further, it is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% with the nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 in various gene sequence databases. % Or more preferably 99% or more homologous sequences, and based on the base sequence obtained by the search, the chromosomal DNA of the organism having the base sequence, cDNA library, etc. It is also possible to obtain the DNA used in the production method of the invention.

取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。 The obtained DNA is directly or after cleaved with an appropriate restriction enzyme and the like, and incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant DNA is introduced into a host cell, and then a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, dideoxy method [ Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 , 5463 (1977)] or a nucleotide sequence analyzer such as ABI3700 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems) to determine the nucleotide sequence of the DNA. can do.

塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。 When the obtained DNA has a partial length as a result of determining the nucleotide sequence, the full-length DNA can be obtained by the Southern hybridization method or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. ..

更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。 Furthermore, the target DNA can also be prepared by chemical synthesis based on the determined nucleotide sequence of the DNA using a Perceptive Biosystems Model 8905 DNA synthesizer or the like.

上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。 As the DNA obtained as described above, for example, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned.

本発明の製造法で用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。 As a vector incorporating the DNA used in the production method of the present invention, pBluescriptII KS(+) (manufactured by Stratagene), pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18 , 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK(+). (Stratagene), pT7Blue (Novagen), pCR II (Invitrogen) and pCR-TRAP (Gene Hunter).

宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等をあげることができる。 Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia. Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia.・Coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia coli ME8415 etc. it can.

組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。 As a method for introducing the recombinant DNA, any method can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the above-mentioned host cell. For example, a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69 , 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), the electroporation method [Nucleic Acids Res., 16 , 6127 (1988)] and the like.

上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリBL21 (DE3)/ pTABSをあげることができる。 Examples of the transformant of the present invention obtained by the above method include Escherichia coli BL21 (DE3)/pTABS which is a microorganism having a recombinant DNA containing a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:1. I can give you.

５．本発明の製造法に用いられる形質転換体の製造法
本発明で用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。 5. Method for Producing Transformant Used in Production Method of the Present Invention Based on the DNA used in the present invention, a DNA fragment having an appropriate length containing a protein-encoding portion is prepared, if necessary. Further, by substituting the bases of the nucleotide sequence of the portion encoding the protein so that the codons are optimal for host expression, a transformant with an improved production rate of the protein can be obtained.

該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。 A recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.

該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。 A transformant producing the protein of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.

宿主細胞としては、細菌等の原核生物であればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 Any prokaryotic organism such as bacteria can be used as the host cell.
As the expression vector, one that can autonomously replicate in the above host cell or can be integrated into the chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.

形質転換体の取得に用いる組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 Recombinant DNA used for obtaining transformants is a set composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA encoding a protein having peptide synthesizing activity, and a transcription termination sequence while being capable of autonomous replication in a prokaryote. It is preferably a recombinant DNA. A gene that controls the promoter may be included.

発現ベクターとしては、pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1（いずれもロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48,669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。 As the expression vector, pBTrp2, pBTac1, pBTac2, pHelix1 (all manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (promega) Manufactured), pQE-8 (manufactured by Qiagen), pET-3 (manufactured by Novagen), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48 , 669 (1984)], pLSA1[ Agric. Biol. Chem., 53 , 277 (1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82 , 4306 (1985)], pBluescriptII SK(+), pBluescript II KS(-) (Strata) Gene), pTrS30 [prepared from Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrS32 [prepared from Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (WO98/12343), pUC19 [ Gene, 33 , 103 (1985)], pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.), pPA1 (JP-A-63-233798) and the like.

プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐ_trp）、lacプロモーター（Ｐ_lac）、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、Ｐ_SEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰ_trpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。 Any promoter may be used so long as it can function in a host cell such as Escherichia coli. Examples include promoters derived from Escherichia coli and phages such as trp promoter (P _trp ), lac promoter (P _lac ), P _L promoter, P _R promoter and P _SE promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter and the like. be able to. Further, artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two P _trp are connected in series, tac promoter, lacT7 promoter, let I promoter and the like can also be used.

さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。 The xylA promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35 , 594-599 (1991)] for expression in microorganisms belonging to the genus Bacillus and P54- for expression in microorganisms belonging to the genus Corynebacterium 6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53 , 674-679 (2000)] and the like can also be used.

また、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。 In addition, it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).

本発明のＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。 In the recombinant DNA in which the DNA of the present invention is bound to the expression vector, the transcription termination sequence is not always necessary, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.

原核生物としては、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.）ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができる。 The prokaryotic organisms, Escherichia, Bacillus, Brevibacterium (Brevibacterium), Corynebacterium, micro Agrobacterium (Microbacterium) genus Serratia (Serratia) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus, Agrobacterium (Agrobacterium) genus Alicyclobacillus Bacillus (Alicyclobacillus) genus Anabaena (Anabena) genus Anashisutisu (Anacystis) genus Arthrobacter (Arthrobacter) genus Azotobacter (Azotobacter) genus Kuromachiumu (Chromatium) genus Erwinia (Erwinia) genus, methylol bacterium (Methylobacterium) genus, Phormidium (Phormidium) genus Rhodobacter (Rhodobacter) genus, Rhodopseudomonas (Rhodopseudomonas) genus, Rodosupiriumu (Rhodospirillum) genus Scenedesmus (Scenedesmus) genus Streptomyces (Streptomyces) genus, Shinekokkasu ( Synechoccus) genus Zymomonas (Zymomonas) microorganism belonging to the genus, such as, for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5α, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia coli BL21 (Bacillus subtilis) ATCC33712, Bacillus megaterium (Bacillus megaterium), Brevibacterium ammonia monocytogenes (Brevibacterium ammoniagenes), Brevibacterium Lee Mario film (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, Burebibakute Potassium Sacca Lori tee cam (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, Brevibacterium flavum (Brevibacterium flavum) ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetamide A Sid film (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, micro Corynebacterium ammoniagenes film (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, Serratia Fikaria (Serratia ficaria), Serratia Fonchikora (Serratia fonticola), Serratia Rikefashiensu (Serratia liquefaciens), Serratia marcescens (Serratia marcescens), Pseudomonas sp. (Pseudomonas sp.) D-0110 , Agrobacterium radiobacter (Agrobacterium radiobacter), Agrobacterium Rizzo jeans (Agrobacterium rhizogenes), Agrobacterium ruby (Agrobacterium rubi), Anabaena-Shirindorika (Anabaena cylindrica), Anabaena-Doriorumu (Anabaena doliolum), Anabaena floss Aqua (Anabaena flos-aquae), Arthrobacter Ore' sense (Arthrobacter aurescens), Arthrobacter citreus (Arthrobacter citreus ), Arthrobacter globformis , Arthrobacter hydrocarboglutamicus , Arthrobac ter mysorens), Arthrobacter Nicotiana (Arthrobacter nicotianae), Arthrobacter paraffineus (Arthrobacter paraffineus), Arthrobacter proto folder Mie (Arthrobacter protophormiae), Arthrobacter Rose opal Rafi eggplant (Arthrobacter roseoparaffinus), ground Robakuta sulphureus (Arthrobacter sulfureus), Arthrobacter urea tumefaciens (Arthrobacter ureafaciens), Kuromachiumu-Buderi (Chromatium buderi), Kuromachiumu-Tepidamu (Chromatium tepidum), Kuromachiumu-Binosamu (Chromatium vinosum), Kuromachiumu-Wamingi (Chromatium warmingii), Kuromachiumu-Furubiatatire (Chromatium fluviatile), Erwinia Uredobara (Erwinia uredovora), Erwinia Karotobara (Erwinia carotovora), Erwinia Anas (Erwinia ananas), Erwinia Herikora (Erwinia herbicola), Erwinia Pankutata (Erwinia punctata) , Erwinia terreus (Erwinia terreus), Methylobacterium-Rodeshianamu (Methylobacterium rhodesianum), Methylobacterium-exo torque Enns (Methylobacterium extorquens), Phormidium sp (Phormidium sp.) ATCC29409, Rhodobacter Kapusuratasu (Rhodobacter capsulatus), Rhodobacter sphaeroides (Rhodobacter sphaeroides), Rod Pseudomonas Burasuchika (Rhodopseudomonas blastica), Rod Pseudomonas Marina (Rhodopseudomonas marina), Rod Pseudomonas pulse tris (Rhodopseudomonas palustris), Rodosupiriumu-Riburamu (Rhodospirillum rubrum), Rodosupiriumu-Sarekishigensu (Rhodospirillum salexigens), Rodosupiriumu-Sarinaramu (Rhodospirillum salinarum), Streptomyces ambofaciens (Streptomyces ambofaciens), Streptomyces aureofaciens (Streptomyces aureofaciens ), Streptomyces aureus , Streptomyces fungicidicus , Streptomyces griseochromogenes , Streptomyces griseus , Streptomyces griseus (Streptomyces lividans, Streptomyces Oriboguriseusu (Streptomyces olivogriseus), Streptomyces Rameusu (Streptomyces rameus), Streptomyces Tanashienshisu (Streptomyces tanashiensis), Streptomyces Binaseusu (Streptomyces vinaceus), Zymomonas mobilis (Zymomonas mobilis ) And so on.

また、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、ペプチド合成活性を有する蛋白質を発現する形質転換体を取得することもできる。 A transformant expressing a protein having peptide synthesis activity can also be obtained by incorporating a DNA encoding a protein having peptide synthesis activity at an arbitrary position of chromosomal DNA.

ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE. coliを用いる場合にはProc. Natl. Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。 As a method for incorporating a DNA encoding a protein having peptide synthesis activity into a chromosomal DNA of a microorganism, a method utilizing homologous recombination can be mentioned. When E. coli is used as a host, that is, a parent strain. Can be exemplified by the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. US A., 97 , 6640 (2000).

６．本発明のペプチドの製造法
（１）ペプチド合成活性を有する蛋白質の取得
上記１．のペプチド合成活性を有する蛋白質は、上記５．の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物から該蛋白質を単離することにより取得することができる。
形質転換体の培養は、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える天然培地または合成培地培を用いて培養することができる。 6. Method for producing peptide of the present invention (1) Acquisition of protein having peptide synthesis activity The protein having the peptide synthesis activity of the above-mentioned 5. It can be obtained by culturing the transformant obtained by the above method in a medium and isolating the protein from the culture.
Cultivation of the transformant is carried out using a natural medium or a synthetic medium culture containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the transformant and capable of efficiently culturing the transformant. be able to.

炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、キシロース、アラビノースこれらを含有する糖蜜、セルロース系バイオマスの糖化液、グリセロール、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。 The carbon source may be any as long as the transformant can assimilate, glucose, fructose, sucrose, xylose, arabinose molasses containing these, saccharified liquid of cellulosic biomass, glycerol, starch or starch hydrolyzate, etc. The organic acids such as carbohydrates, acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。 As a nitrogen source, ammonia, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein Hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells, digested products thereof, and the like can be used.

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。 As the inorganic salt, potassium dihydrogenphosphate, dipotassium hydrogenphosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.

培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。 The culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culturing temperature is preferably 15 to 40° C., and the culturing time is usually 5 hours to 7 days. The pH is maintained at 3.0 to 9.0 during the culture. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.

また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 In addition, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culturing, if necessary.

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターを有する形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 When culturing a transformant having an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium, if necessary. For example, when culturing a transformant having an expression vector using the lac promoter, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like is used, and when culturing a transformant having an expression vector using the trp promoter, indole acrylic is used. You may add an acid etc. to a culture medium.

上記１．の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。 Above 1. The protein can be produced in the host cell, secreted to the outside of the host cell, or produced on the outer membrane of the host cell, depending on the method selected. Can be changed.

上記１．の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)] 、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] 、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、上記１．の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 Above 1. When the protein of E. coli is produced in the host cell or on the outer membrane of the host cell, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264 , 17619 (1989)], the method of Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci ., USA, 86 , 8227 (1989), Genes Develop., 4 , 1288 (1990)], or the method described in JP-A-05-336963, WO94/23021, etc. Can be secreted outside the host cell.

すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、該蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 That is, by using a gene recombination technique, a protein containing the active site of the protein is produced in the form in which a signal peptide is added in front of the protein, whereby the protein can be actively secreted outside the host cell.

また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 Further, according to the method described in JP-A-2-227075, the production amount can be increased by utilizing a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.

該形質転換体を用いて製造された上記１．のペプチド合成活性を有する蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。 The above 1. produced by using the transformant. As a method for isolating and purifying the protein having the peptide-synthesizing activity, the usual enzyme isolation and purification methods can be used.

例えば、該蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。 For example, when the protein is produced in a dissolved state in cells, the cells are recovered by centrifugation after the completion of culturing, suspended in an aqueous buffer solution, ultrasonically disrupted, French press, Mantongaurin homogenizer. The cells are crushed with, for example, Dynomill to obtain a cell-free extract.

該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF（GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。 From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a usual method for isolating and purifying an enzyme, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino, etc. Anion exchange chromatography using resins such as ethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), cations using resins such as S-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Bioscience) Exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoretic method such as isoelectric focusing, etc. A purified standard can be obtained by using the above methods alone or in combination.

また、上記１．の蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 In addition, the above 1. When the protein of (1) is produced by forming an insoluble substance in the cells, cells are similarly collected, crushed, and then centrifuged to perform precipitation, and then the protein is recovered by an ordinary method. , The insoluble matter of the protein is solubilized with a protein denaturing agent.

該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。 After diluting or dialysis the solubilized solution into a solution that does not contain a protein denaturant or a protein denaturant is diluted to such an extent that the protein does not denature, or the protein is made into a normal three-dimensional structure, A purified preparation can be obtained by the same isolation and purification method.

上記１．の蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。 Above 1. When the above protein is secreted extracellularly, the protein or its derivative such as a glycosylated product can be recovered in the culture supernatant.

即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。 That is, a soluble preparation is obtained by treating the culture with a method such as centrifugation similar to the above, and a purified preparation is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.

このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。 Examples of the protein thus obtained include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.

また、上記１の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288 （1990)] 、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、上記１．の蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。 It is also possible to produce the above protein 1 as a fusion protein with another protein and purify it using affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein. For example, the method described in Low et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 , 8227 (1989), Genes Develop., 4 , 1288 (1990)], JP-A-5-336963, WO94/23021. In accordance with 1. above. Can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.

また、上記１．の蛋白質をFlagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989) 、Genes Develop., 4, 1288（1990)] や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。 In addition, the above 1. Affinity chromatography using the anti-Flag antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 , 8227 (1989), Genes Develop., 4 , 1288 (1990). Alternatively, it can be produced as a fusion protein with polyhistidine and purified by affinity chromatography using a metal coordination resin having a high affinity for polyhistidine. Furthermore, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.

上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 The protein of the present invention is produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) based on the amino acid sequence information of the protein obtained above. be able to. In addition, chemical synthesis can also be performed using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu.

（２）上記１．の蛋白質を酵素源として用いるペプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として上記１の蛋白質を用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸、より好ましくは２種のアミノ酸としては、アミノ酸、好ましくはL-アミノ酸、グリシン（Gly）およびβ-アラニン（β-Ala）からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ−アミノ酸としては、例えばL-アラニン（L-Ala）、L-グルタミン（L-Gln）、L-グルタミン酸（L-Glu）、L-バリン（L-Val）、L-ロイシン(L-Leu)、L-イソロイシン(L-Ile)、L-プロリン（L-Pro）、L-フェニルアラニン(L-Phe)、L-トリプトファン（L-Trp）、L-メチオニン（L-Met）、L-セリン（L-Ser）、L-スレオニン（L-Thr）、L-システイン（L-Cys）、L-アスパラギン（L-Asn）、L-チロシン（L-Tyr）、L-リジン（L-Lys）、L-アルギニン（L-Arg）、L-ヒスチジン（L-His）、L-アスパラギン酸（L-Asp）、L-ホモアルギニン(L-HomoArg)、L-α-アミノ酪酸、L-アザセリン、L-テアニン、L-4-ヒドロキシプロリン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-オルニチン、L-シトルリンおよびL-6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシンなどをあげることができる。 (2) The above 1. Method for producing a peptide using the above protein as an enzyme source In the production method of the present invention, when the above protein 1 is used as an enzyme source, one or more amino acids used as a substrate, preferably 1 or 2 amino acids, more preferably Is an amino acid selected from the group consisting of amino acids, preferably L-amino acids, glycine (Gly) and β-alanine (β-Ala), any amino acid may be used in any combination. Good. Examples of L-amino acids include L-alanine (L-Ala), L-glutamine (L-Gln), L-glutamic acid (L-Glu), L-valine (L-Val) and L-leucine (L-Leu). ), L-isoleucine (L-Ile), L-proline (L-Pro), L-phenylalanine (L-Phe), L-tryptophan (L-Trp), L-methionine (L-Met), L-serine (L-Ser), L-Threonine (L-Thr), L-Cysteine (L-Cys), L-Asparagine (L-Asn), L-Tyrosine (L-Tyr), L-Lysine (L-Lys) , L-arginine (L-Arg), L-histidine (L-His), L-aspartic acid (L-Asp), L-homoarginine (L-HomoArg), L-α-aminobutyric acid, L-azaserine, Examples thereof include L-theanine, L-4-hydroxyproline, L-3-hydroxyproline, L-ornithine, L-citrulline and L-6-diazo-5-oxo-norleucine.

上記製造法に用いられる、好ましいアミノ酸としては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaをあげることができる。 As a preferred amino acid used in the above-mentioned production method, L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L- Mention may be made of Met, L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala.

より好ましいアミノ酸としては、L-CysとL-MetまたはL-Leuとの組合せ、L-MetとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ValとL-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-LeuとL-Ala、L-Gln、L-Leu、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-IleとL-Ala、L-Gln、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Arg、L-His、L-Aspおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、GlyとL-Pro、L-PheまたはL-Trpとの組合せ、L-SerとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-ArgおよびL-Hisから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ThrとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-ArgとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-LysとL-TrpまたはL-Pheの組合せ、L-HisとL-Gln、L-Phe、L-TrpおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-GlnとL-Pro、L-Phe、L-Trp、L-AsnおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-AsnとL-Pro、L-PheまたはL-Trpとの組合せ、L-AspとL-Trpとの組合せ、L-ProとL-Pro、L-Phe、L-Trpおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸との組合せ、L-TrpとL-Pro、L-Phe、L-Trpまたはβ-Alaとの組合せ、L-PheとL-PheまたはL-Tyrとの組合せ、並びにβ-Alaのみをあげることができる。 More preferred amino acids include a combination of L-Cys and L-Met or L-Leu, L-Met and L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L. -Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β -Combination with an amino acid selected from Ala, L-Val and L-Ala, L-Gln, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, A combination with an amino acid selected from L-Thr, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, Gly and β-Ala, L-Leu and L-Ala, L-Gln, L -Leu, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala L-Ile and L-Ala, L-Gln, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Tyr, Combination with an amino acid selected from L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala, L-Ala and L-Ala, L-Gln, L-Pro, L-Phe, L -A combination with an amino acid selected from Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Arg, L-His, L-Asp and β-Ala, Gly and L-Pro, L-Phe or L- In combination with Trp, L-Ser with an amino acid selected from L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Arg and L-His From combinations, L-Thr and L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Thr, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His and β-Ala Combination with selected amino acids, L-Arg and L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His and β-Ala A combination with an amino acid selected from, a combination of L-Lys and L-Trp or L-Phe, a combination with L-His and an amino acid selected from L-Gln, L-Phe, L-Trp and L-Tyr, L -Gln and L-Pro, L-Phe, L-Trp, A combination with an amino acid selected from L-Asn and L-Tyr, a combination with L-Asn and L-Pro, a combination with L-Phe or L-Trp, a combination with L-Asp and L-Trp, L-Pro and L -A combination of amino acids selected from Pro, L-Phe, L-Trp and β-Ala, a combination of L-Trp and L-Pro, L-Phe, L-Trp or β-Ala, L-Phe and L Only -Phe or L-Tyr in combination, as well as β-Ala can be mentioned.

さらに好ましいアミノ酸としてはL-AlaとL-Proの組合せ、L-LeuとL-Proの組合せ、L-ValとL-Proの組合せ、L-Proのみ、およびL-Pheとβ-Alaの組合せをあげることができる。 More preferred amino acids are L-Ala and L-Pro combination, L-Leu and L-Pro combination, L-Val and L-Pro combination, L-Pro only, and L-Phe and β-Ala combination. Can be raised.

上記製造法において、ペプチド合成活性を有する蛋白質は、基質として用いるアミノ酸1mgあたり0.01〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mg添加する。 In the above production method, the protein having peptide synthesis activity is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 mg to 10 mg, per 1 mg of the amino acid used as the substrate.

上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。 In the above-mentioned production method, the amino acid used as a substrate is added to the aqueous medium at the initial stage or during the reaction so that the concentration thereof is 0.1 to 500 g/L, preferably 0.2 to 200 g/L.

上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、0.5mmol〜10mol/Lの濃度で用いる。 In the above production method, ATP can be used as an energy source, and ATP is used at a concentration of 0.5 mmol to 10 mol/L.

上記製造法で用いられる水性媒体としては、ペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。 The aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component or composition as long as it does not inhibit the peptide production reaction, and examples thereof include water, phosphate, carbonate, acetate and borate. Buffers such as citrate and Tris. Further, it may contain alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetamide.

ペプチドの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。 The peptide-forming reaction is carried out in an aqueous medium under the conditions of pH 5 to 11, preferably pH 6 to 10, 20 to 50° C., preferably 25 to 45° C. for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours.

上記方法で製造されるペプチドとしては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、好ましくはL-CysとL-Met、L-MetとL-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-ValとL-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-LeuとL-Ala、L-Gln、L-Leu、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-IleとL-Ala、L-Gln、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、Glyおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-AlaとL-Ala、L-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Arg、L-His、L-Aspおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、GlyとL-Pro、L-PheまたはL-Trp、L-SerとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Ser、L-Thr、L-Asn、L-ArgおよびL-Hisから選ばれるアミノ酸、L-ThrとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Thr、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-ArgとL-Gln、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-Hisおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-LysとL-TrpまたはL-Phe、L-HisとL-Gln、L-Phe、L-TrpおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸、L-GlnとL-Pro、L-Phe、L-Trp、L-AsnおよびL-Tyrから選ばれるアミノ酸、L-AsnとL-Pro、L-PheまたはL-Trp、L-AspとL-Trp、L-ProとL-Pro、L-Phe、L-Trpおよびβ-Alaから選ばれるアミノ酸、L-TrpとL-Pro、L-Phe、L-Trpまたはβ-Ala、L-PheとL-PheまたはL-Tyr、並びにβ-Ala同士がペプチド結合で連結したジペプチド、３つのL-Leuがペプチド結合で連結したトリペプチド、３つのL-Metがペプチド結合で連結したトリペプチド、２つのL-LeuとL-Met、L-Arg、L-Ala、L-Lys、L-His、L-ProおよびL-Pheから選ばれるアミノ酸がペプチド結合で連結したトリペプチド、２つのL-PheとL-Leuがペプチド結合で連結したトリペプチドをあげることができる。 The peptide produced by the above method, L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, Amino acids selected from L-Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala are linked by peptide bonds Dipeptides, preferably L-Cys and L-Met, L-Met and L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L -Amino acid selected from Trp, L-Met, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala, L -Val and L-Ala, L-Gln, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Tyr , L-Lys, L-Arg, L-His, Gly and β-Ala, L-Leu and L-Ala, L-Gln, L-Leu, L-Pro, L-Phe, L-Trp , L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and β-Ala, L-Ile and L-Ala, L-Gln , L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly And amino acids selected from β-Ala, L-Ala and L-Ala, L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Arg, L -An amino acid selected from His, L-Asp and β-Ala, Gly and L-Pro, L-Phe or L-Trp, L-Ser and L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L -Amino acids selected from Ser, L-Thr, L-Asn, L-Arg and L-His, L-Thr and L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Thr, L-Asn , L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His and β-Ala, L-Arg and L-Gln, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Asn, L -From Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His and β-Ala Amino acids selected, L-Lys and L-Trp or L-Phe, L-His and L-Gln, L-Phe, L-Trp and L-Tyr selected amino acids, L-Gln and L-Pro, L- Phe, an amino acid selected from L-Trp, L-Asn and L-Tyr, L-Asn and L-Pro, L-Phe or L-Trp, L-Asp and L-Trp, L-Pro and L-Pro, Amino acids selected from L-Phe, L-Trp and β-Ala, L-Trp and L-Pro, L-Phe, L-Trp or β-Ala, L-Phe and L-Phe or L-Tyr, and β -A dipeptide in which Ala is linked by a peptide bond, a tripeptide in which three L-Leus are linked by a peptide bond, a tripeptide in which three L-Mets are linked by a peptide bond, two L-Leu and L-Met, L -A tripeptide in which amino acids selected from Arg, L-Ala, L-Lys, L-His, L-Pro and L-Phe are linked by a peptide bond, and two L-Phe and L-Leu are linked by a peptide bond A tripeptide can be mentioned.

さらに好ましくは、L-AlaとL-Pro、L-LeuとL-Pro、L-ValとL-Pro、L-Proのみ、およびL-Pheとβ-Alaがペプチド結合で連結したジペプチドをあげることができる。 More preferably, L-Ala and L-Pro, L-Leu and L-Pro, L-Val and L-Pro, L-Pro only, and a dipeptide in which L-Phe and β-Ala are linked by a peptide bond. be able to.

より具体的には、上記方法で製造法されるペプチドとしてはL-Pro-L-Ala、L-Pro-L-Leu、L-Pro-L-Val、L-Pro-L-Pro、L-Ala-L-Ala、L-Leu-L-Leuおよびβ-Ala-L-Pheをあげることができる。 More specifically, as the peptide produced by the above method, L-Pro-L-Ala, L-Pro-L-Leu, L-Pro-L-Val, L-Pro-L-Pro, L- Ala-L-Ala, L-Leu-L-Leu and β-Ala-L-Phe can be mentioned.

（３）形質転換体の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いるペプチドの製造法
上記１．の蛋白質を発現する形質転換体の培養物または該培養物の処理物、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中にペプチドを生成、蓄積させ、該媒体からペプチドを単離することにより、ペプチドを製造することができる。 (3) Method for producing peptide using culture of transformant or treated product of culture as an enzyme source Of a transformant expressing the above protein or a treated product of the culture, at least one amino acid, and ATP are allowed to exist in an aqueous medium, and a peptide is produced and accumulated in the medium, and the peptide is produced from the medium. Can be isolated to produce the peptide.

本発明の製造法において酵素源として用いられる形質転換体の培養物としては、該形質転換体を上記（１）の培養方法で培養して得られる培養物をあげることができる。形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。 Examples of the culture of the transformant used as the enzyme source in the production method of the present invention include the culture obtained by culturing the transformant by the culture method of (1) above. As a processed product of the transformant culture, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by centrifuging or filtering the culture, a dried product of the cells, The lyophilized product of the microbial cells, the surfactant-treated product of the microbial cells, the solvent-treated product of the microbial cells, the enzyme-treated product of the microbial cells, and the culture as an enzyme source of an immobilized product of the microbial cells Those containing live cells having the same function, sonicated products of the microbial cells, mechanically milled products of the microbial cells, and crude enzyme extracts obtained from the treated microbial cells, etc. Can be raised.

形質転換体の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられる１種以上のアミノ酸としては、上記（２）と同様のアミノ酸をあげることができる。 When a culture product of a transformant or a treated product of the culture product is used as an enzyme source, the same amino acid as in (2) above can be used as the one or more amino acids used as the substrate.

該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。 Although the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source and the like, for example, 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg as the weight of wet cells per 1 mg of the amino acid used as a substrate is added.

基質として用いるアミノ酸は、上記（２）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（２）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。 The amino acid used as the substrate can be added to the aqueous medium in the same manner as (2) above. Similar to (2) above, ATP can be allowed to exist in an aqueous medium and used as an energy source.

ＡＴＰは、ポリリン酸キナーゼを上記水性媒体中に共存させることによっても供給することができる。ポリリン酸キナーゼ活性は、該活性を有する蛋白質であればその由来、調製方法などは問わないが、例えばAgric. Biol. Chem., 52(6), 1471-1477 (1988)、Biotech. Appl. Biochem., 10, 107-117 (1988)、Biotech. Appl. Biochem., 15, 125-133 (1992)、J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992)などに記載の細菌由来のポリリン酸キナーゼをあげることがでる。 ATP can also be supplied by allowing polyphosphate kinase to coexist in the above aqueous medium. The polyphosphate kinase activity may be derived from any protein having such activity, regardless of its origin, preparation method and the like. For example, Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1471-1477 (1988), Biotech. Appl. Biochem ., 10 , 107-117 (1988), Biotech. Appl. Biochem., 15 , 125-133 (1992), J. Biol. Chem., 267 , 22556-22561 (1992), etc. You can mention acid kinase.

ＡＴＰは、上記のポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、および反応の初発にポリリン酸キナーゼの反応が開始する程度の少量のＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰを水性媒体中に存在させることにより、ＡＤＰからＡＴＰを再生する反応が進行し、反応系にＡＴＰを供給し続けることができる。 ATP regenerates ATP from ADP by allowing the above-mentioned polyphosphate kinase, polyphosphate, and a small amount of AMP, ADP or ATP to the extent that the reaction of polyphosphate kinase starts at the beginning of the reaction, in an aqueous medium. The reaction proceeds and ATP can be continuously supplied to the reaction system.

またポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸キナーゼを生産する微生物の培養物、または該培養物の処理物そのものを酵素源として用いることもできる。微生物の培養法、培養物の処理物は上記と同じである。 As the polyphosphate kinase, a culture of a microorganism producing polyphosphate kinase or a treated product of the culture itself can be used as an enzyme source. The method for culturing the microorganism and the treated product of the culture are the same as above.

水性媒体としては、上記（２）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。 As the aqueous medium, the medium of (2) above can be used, and in addition, the culture supernatant of the culture of the microorganism or transformant used as the enzyme source can also be used as the aqueous medium.

ペプチドの生成反応の反応条件は、上記（２）と同様の条件をあげることができる。
上記方法で製造されるペプチドとしては、上記（２）と同様のペプチドをあげることができる。 The reaction conditions for the peptide production reaction can be the same as those in (2) above.
Examples of the peptide produced by the above method include the same peptides as in (2) above.

（４）形質転換体を培養することによるペプチドの製造法
上記１．の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成、蓄積させ、該培養物中より該ペプチドを採取することによりペプチドを製造することができる。 (4) Method for producing peptide by culturing transformant The above 1. By culturing a transformant having the ability to express the above protein and capable of producing one or more amino acids in a medium, to produce and accumulate the peptide in the culture, and to collect the peptide from the culture. Peptides can be produced.

形質転換体の培養は、上記（１）と同様に行うことができる。
１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体は、該形質転換体の元である宿主細胞が１種以上のアミノ酸を生産する能力を既に有していれば、該形質転換体をそのまま培養することでペプチドを製造することができる。 Cultivation of the transformant can be performed in the same manner as in (1) above.
A transformant having the ability to produce one or more amino acids can be obtained by directly transforming the transformant if the host cell that is the source of the transformant already has the ability to produce one or more amino acids. The peptide can be produced by culturing.

該宿主細胞がアミノ酸を生産する能力を有していない場合は、宿主細胞に１種以上のアミノ酸を生産する能力を人為的に付与する、または上記１．の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られた形質転換体に１種以上のアミノ酸を生産する能力を付与することにより、上記製造法で用いられる上記１．の蛋白質を発現し、かつ１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する形質転換体を取得することができる。 When the host cell does not have the ability to produce an amino acid, the host cell is artificially endowed with the ability to produce one or more amino acids, or the above 1. The transformant obtained by transforming with the DNA encoding the protein of 1. above is used in the above production method by imparting the ability to produce one or more amino acids. It is possible to obtain a transformant having the ability to express the above protein and produce one or more amino acids.

１種以上のアミノ酸としては、L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-AspおよびGlyから選ばれる１種以上のアミノ酸をあげることができる。 The one or more amino acids include L-Ala, L-Gln, L-Glu, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-. One or more amino acids selected from Ser, L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp and Gly can be mentioned.

アミノ酸を生産する能力を人為的に付与する方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。 As a method of artificially imparting the ability to produce amino acids,
(A) a method of relaxing or releasing at least one of the mechanisms controlling amino acid biosynthesis,
(B) a method of enhancing expression of at least one of enzymes involved in biosynthesis of amino acids,
(C) a method of increasing the copy number of at least one enzyme gene involved in amino acid biosynthesis,
(D) a method of weakening or blocking at least one of metabolic pathways branching from an amino acid biosynthetic pathway to a metabolite other than the amino acid, and (e) a cell having a high degree of resistance to an amino acid analog as compared to a wild-type strain How to choose a stock,
The above known methods can be used alone or in combination.

上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。 Regarding the above (a), for example, Agric. Biol. Chem., 43 , 105-111 (1979), J. Bacteriol., 110 , 761-763 (1972) and Appl. Microbiol. Biotechnol., 39 , 318-323. (1993) and the like, for (b) above, see, for example, Agric. Biol. Chem., 43 , 105-111 (1979) and J. Bacteriol., 110 , 761-763 (1972), above (c). For example, Appl. Microbiol. Biotechnol., 39 , 318-323 (1993) and Agric. Biol. Chem., 39 , 371-377 (1987), and the above (d), for example, Appl. Environ. Micribiol., 38 , 181-190 (1979) and Agric. Biol. Chem., 42 , 1773-1778 (1978) and the like, for (e) above, for example, Agric. Biol. Chem., 36 , 1675-1684. (1972), Agric. Biol. Chem., 41 , 109-116 (1977), Agric. Biol. Chem., 37 , 2013-2023 (1973) and Agric. Biol. Chem., 51 , 2089-2094 (1987). ) Etc. Microorganisms capable of producing various amino acids can be prepared with reference to the above-mentioned documents and the like.

さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。 Furthermore, for the method for preparing a microorganism having the ability to produce an amino acid by any of the above (a) to (e), or a combination thereof, Biotechnology 2nd ed., Vol. 6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14b and Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003), Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, Aida Hiro et al. (1986) have many examples. Also, a method for preparing a microorganism having the ability to produce a specific amino acid is disclosed in JP 2003-164297, Agric. Biol. Chem., 39 , 153-160 (1975), Agric. Biol. Chem., 39 , 1149. -1153 (1975), JP-A-58-13599, J. Gen. Appl. Microbiol., 4 , 272-283 (1958), JP-A-63-94985, Agric. Biol. Chem., 37 , 2013-2023 (1973), WO97/15673, JP-A-56-18596, JP-A-56-144092, and JP-A-2003-511086, and there are many reports, and one or more kinds of amino acids are produced by referring to the above-mentioned documents. Microorganisms capable of being prepared can be prepared.

上記方法によって調製することができるアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、例えばＬ−アラニン生産菌として、アラニン脱水素酵素遺伝子（ald遺伝子）の発現が強化された微生物、Ｌ−プロリン生産微生物として、フェニルアラニンの脱感作型pheA遺伝子および／またはチロシンの脱感作型aroF遺伝子を発現する微生物などをあげることができる。 Examples of microorganisms capable of producing amino acids that can be prepared by the above method include L-alanine-producing microorganisms, microorganisms in which expression of the alanine dehydrogenase gene ( ald gene) is enhanced, and L-proline-producing microorganisms. , Microorganisms that express the desensitized pheA gene of phenylalanine and/or the desensitized aroF gene of tyrosine.

上記したアミノ酸を生成、蓄積する微生物としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法が適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。 The microorganism that produces and accumulates the above-mentioned amino acid may be any microorganism to which the methods (a) to (e) can be applied or any microorganism having the above-mentioned genetic trait, and it is preferable. Can be prokaryotes, more preferably bacteria.

原核生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）等をあげることができ、好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。 As prokaryotes, Escherichia (Escherichia) genus Brevibacterium (Brevibacterium) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus, a microorganism belonging to the Streptomyces (Streptomyces) species, such as, for example, Escherichia coli Brevibacterium ammoniagenes , Brevibacterium immariophilum , Brevibacterium saccharolyticum , Brevibacterium flavum , Brevibacterium - Lactobacillus fermentum (Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Corynebacterium aceto A Sid film (Corynebacterium acetoacidophilum), Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Streptomyces aureofaciens (Streptomyces aureofaciens), Streptomyces aureus (Streptomyces aureus), Streptomyces Funjishidikasu (Streptomyces fungicidicus), Streptomyces Gris Theo black Moge eggplant (Streptomyces griseochromogenes), Streptomyces griseus (Streptomyces griseus), Streptomyces lividans (Streptomyces lividans), Streptomyces Oriboguriseusu (Streptomyces olivogriseus), Streptomyces Rameusu (Streptomyces rameus), Streptomyces Tanashienshisu (Streptomyces tanashiensis), strike Examples thereof include Streptomyces vinaceus , and preferred bacteria include Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium lactofermentum, Corynebacterium flavum, and coryne. Examples thereof include Bacterium efficiens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces sericolor or Streptomyces lividans, and particularly preferred is Escherichia coli.

アミノ酸を生産する微生物の具体例としては、Ｌ−アラニン生産株としてald遺伝子発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ JM101株など、Ｌ−フェニルアラニン生産株として脱感作型pheA遺伝子および／またはaroF 遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリ JM101株などをあげることができる。 Specific examples of the microorganism that produces an amino acid include Escherichia coli JM101 strain that retains an ald gene expression plasmid as an L-alanine producing strain, and a desensitized pheA gene and/or aroF gene expression plasmid as an L-phenylalanine producing strain. The Escherichia coli JM101 strain, etc., which owns

Ｌ−バリン生産株としてATCC13005およびATCC19561など、Ｌ−ロイシン生産株としてFERM BP-4704およびATCC21302など、Ｌ−アラニン生産株としてFERM BP-4121およびATCC15108など、Ｌ−プロリン生産株としてFERM BP-2807およびATCC19224などをあげることができる。なお、上記のFERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）からそれぞれ入手することができる。 ATCC13005 and ATCC19561 as L-valine producing strains, FERM BP-4704 and ATCC21302 as L-leucine producing strains, FERM BP-4121 and ATCC15108 as L-alanine producing strains, FERM BP-2807 as L-proline producing strains, and the like. ATCC19224 etc. can be mentioned. The strains represented by the FERM number above should be obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depository Center (Japan), and the strains represented by the ATCC number should be obtained from the American Type Culture Collection (USA). You can

上記（２）〜（４）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。 In the above production methods (2) to (4), the peptides produced and accumulated in the aqueous medium can be collected by a usual method using activated carbon, an ion exchange resin or the like, or extraction with an organic solvent, crystallization, thin layer chromatography. It can be performed by chromatography, high performance liquid chromatography, or the like.

以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例においてペプチドおよびアミノ酸のHPLCによる分析、定量、およびLC-ESI-MSによる解析は以下に示す方法により行った。 Examples will be shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
In the following examples, analysis of peptides and amino acids by HPLC, quantification, and analysis by LC-ESI-MS were performed by the methods described below.

（１）HPLC解析
ペプチドおよびアミノ酸は、１−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミドナトリウム（Ｎα−ＦＤＡＡ）を用いて誘導体化した後にＨＰＬＣで分析した。Ｎα−ＦＤＡＡを用いた誘導体化は、純水で希釈した試料100μlに、50μlの0.5％のＮα−ＦＤＡＡアセトン溶液と40μlの0.5mol/lの炭酸ナトリウム水溶液を加えて攪拌した後、40℃で60分間静置することにより行った。 (1) HPLC analysis Peptides and amino acids were derivatized with 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide sodium (Nα-FDAA) and then analyzed by HPLC. Derivatization with Nα-FDAA was carried out by adding 50 μl of 0.5% Nα-FDAA acetone solution and 40 μl of 0.5 mol/l sodium carbonate aqueous solution to 100 μl of a sample diluted with pure water, and stirring the mixture at 40° C. It was performed by leaving it to stand for 60 minutes.

次に、40μlの1mol/lの塩酸と770μlのメタノールを加えて攪拌したものを、ＦＤＡＡ化試料とした。 Next, 40 μl of 1 mol/l hydrochloric acid and 770 μl of methanol were added and stirred to obtain an FDAA sample.

該ＦＤＡＡ化試料を、ＷＨ−Ｃ１８Ａカラム(日立サイエンスシステムズ、4×150mm)を用いて分析、定量した。ＨＰＬＣ分析の条件には、下記の条件を用いた。 The FDAA-converted sample was analyzed and quantified using a WH-C18A column (Hitachi Science Systems, 4×150 mm). The following conditions were used for the conditions of HPLC analysis.

移動相には、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が90:5:5の移動相Ａ、50mmol/lのリン酸カリウム緩衝液(pH2.7、リン酸でpH調整)とアセトニトリルおよびメタノ−ルの混合比が60:35:5の移動相Ｂ、アセトニトリルとテトラヒドロフランおよび水の混合比が3：1：3の移動相Ｃを用いた。移動相の流速は0.5ml/min、移動相Ａと移動相Ｂおよび移動相Ｃの混合比は、0〜24分は100:0:0から55:45:0への勾配、24〜30分は55:45:0の一定、30〜50分は55:45:0から0:100:0への勾配、50〜55分は0:100:0の一定で、55〜60分は0:100:0から0:0:100への勾配、60〜62分は0:0:100の一定、62〜62.1分は0:0:100から100:0:0への勾配、62.1〜80分は100:0:0の一定に変化させた。カラム温度は40℃、340nmの紫外吸収を測定した。 The mobile phase was 50 mmol/l potassium phosphate buffer (pH 2.7, pH adjusted with phosphoric acid), mobile phase A with a mixing ratio of acetonitrile and methanol of 90:5:5, and 50 mmol/l phosphorus. A mobile phase B having a potassium acid buffer solution (pH 2.7, pH adjusted with phosphoric acid) and acetonitrile and methanol at a mixing ratio of 60:35:5, and a mixing ratio of acetonitrile, tetrahydrofuran and water at a ratio of 3:1:3. Mobile phase C was used. The mobile phase flow rate is 0.5 ml/min, the mixing ratio of mobile phase A to mobile phase B and mobile phase C is 0 to 24 minutes, the gradient from 100:0:0 to 55:45:0, 24 to 30 minutes. Is a constant 55:45:0, 30-50 minutes is a slope from 55:45:0 to 0:100:0, 50-55 minutes is a constant 0:100:0, and 55-60 minutes is 0: Slope from 100:0 to 0:0:100, constant 0:0:100 from 60 to 62 minutes, 62 to 62.1 minutes from 0:0:100 to 100:0:0, 62.1 to 80 minutes Changed to a constant of 100:0:0. The column temperature was 40° C., and the ultraviolet absorption at 340 nm was measured.

（２）LC-ESI-MS解析
HPLCの分離カラムにSunFire C18カラム（Waters、4.6×150mm）を用い、ESI-MSとしてLCQ Deca（Thermo Scientific）を組み合わせたシステムによってサンプルを分析した。 (2) LC-ESI-MS analysis
A sample was analyzed by a system using a SunFire C18 column (Waters, 4.6×150 mm) as an HPLC separation column and combining LCQ Deca (Thermo Scientific) as ESI-MS.

移動相には、50mmol/lのギ酸溶液（移動相A）、およびアセトニトリル（移動相B）を用いた。移動相の流速は1.0ml/min、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、0〜2分は100:0の一定、2〜9分は、100:0から0:100への勾配、9〜15分は0:100の一定、15〜15.1分は0:100から100:0への勾配、15.1〜20分は100:0の一定に変化させた。 For the mobile phase, a 50 mmol/l formic acid solution (mobile phase A) and acetonitrile (mobile phase B) were used. The mobile phase flow rate was 1.0 ml/min, the mixing ratio of mobile phase A and mobile phase B was constant at 100:0 for 0 to 2 minutes, and the gradient from 100:0 to 0:100 for 2 to 9 minutes. The gradient was 0:100 for 9 to 15 minutes, the gradient from 0:100 to 100:0 for 15 to 15.1 minutes, and the constant was 100:0 for 15.1 to 20 minutes.

[実施例１]
ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのクローニングと該蛋白質を発現する形質転換体の作製
独立行政法人製品評価技術基盤研究所生物遺伝資源部門（NRBC）より、Pseudomonas syringe NBRC 14801株を入手し、その染色体ＤＮＡを公知の方法で抽出した。 [Example 1]
Cloning of DNA encoding a protein having peptide synthesizing activity and preparation of transformant expressing the protein Pseudomonas syringe NBRC 14801 strain was obtained from Institute for Product Evaluation Technology, Institute of Biological Genetics (NRBC), The chromosomal DNA was extracted by a known method.

配列番号４および５で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットに用い、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを取得した。 Using the DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 4 and 5 as a primer set, PCR was performed using the above chromosomal DNA as a template to obtain the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

該ＤＮＡおよびpET28a(+)を、NdeIおよびEcoRIで消化した後、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。得られた連結ＤＮＡを用いて、Escherichia coli BL21 (DE3)を形質転換し、ペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する形質転換株を取得した。該組換え体ＤＮＡをpTABS、該形質転換体をE. coli BL21(DE3)/pTABSとそれぞれ命名した。 The DNA and pET28a(+) were digested with Nde I and Eco RI and then ligated with DNA ligase. The resulting ligated DNA was used to transform Escherichia coli BL21 (DE3) to obtain a transformant strain having a recombinant DNA containing a DNA encoding a protein having peptide synthesis activity. The recombinant DNA was named pTABS and the transformant was named E. coli BL21(DE3)/pTABS.

[実施例２]
ペプチド合成活性を有する蛋白質の取得
E. coliBL21(DE3)/pTABSを25μg/mlのカナマイシンを含有するLB液体培地で、37℃、120rpmで1〜2時間培養した後、終濃度が0.1mmol/lになるようにIPTGを添加して、25℃、120rpmで16時間培養した。 [Example 2]
Acquisition of protein with peptide synthesis activity
After incubating E. coli BL21(DE3)/pTABS in LB liquid medium containing 25 μg/ml kanamycin at 37°C and 120 rpm for 1-2 hours, add IPTG to a final concentration of 0.1 mmol/l. Then, the cells were cultured at 25° C. and 120 rpm for 16 hours.

培養物を遠心分離して菌体を集菌して100mmol/lのTris-HCl緩衝液に懸濁した後、菌体を超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離により菌体残渣を除去し、上清を無細胞抽出液として回収した。該抽出液をNi-アフニティーカラム（GEヘルスケア社製）に通塔して精製後、PD-10カラム（GEヘルスケア社製）を用いて脱塩し、精製蛋白質を取得した。本精製蛋白質をTabSと命名した。 The culture was centrifuged to collect the cells, and the cells were suspended in a 100 mmol/l Tris-HCl buffer solution, and then the cells were ultrasonically disrupted. The disrupted cell suspension was centrifuged to remove the cell residue, and the supernatant was collected as a cell-free extract. The extract was passed through a Ni-affinity column (manufactured by GE Healthcare) and purified, and then desalted using a PD-10 column (manufactured by GE Healthcare) to obtain a purified protein. This purified protein was named TabS.

[実施例３]
ペプチドの製造
（１）L-Pro-L-Alaの製造
L-Pro 100mmol/l、L-Ala 20mmol/l、ATP 50mmol/l、MgSO₄ 25mmol/l、TabS 0.5mg/ml、Tris HCl 100mmol/l（pH 9）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。反応液上清を上記したHPLCの条件で分析し、L-Pro-L-Ala 6.3mmol/l、L-Pro-L-Pro 0.4mmol/l、L-Ala-L-Ala 0.6mmol/lの生成を確認した。 [Example 3]
Production of peptides (1) Production of L-Pro-L-Ala
Prepare a reaction solution consisting of L-Pro 100 mmol/l, L-Ala 20 mmol/l, ATP 50 mmol/l, MgSO ₄ 25 mmol/l, TabS 0.5 mg/ml, Tris HCl 100 mmol/l (pH 9) and 30°C. The peptide synthesis reaction was carried out for 20 hours. The reaction solution supernatant is analyzed under the above-mentioned HPLC conditions, L-Pro-L-Ala 6.3 mmol/l, L-Pro-L-Pro 0.4 mmol/l, L-Ala-L-Ala 0.6 mmol/l. Confirmed generation.

（２）L-Pro-L-Leuの製造
L-AlaをL-Leuに変えた以外は、上記（１）と同条件でペプチド合成反応を行い、同じ方法で反応液を分析した。その結果、L-Pro-L-Leu 9.4mmol/l、L-Leu-L-Leu 1.0mmol/lの生成を確認した。 (2) Production of L-Pro-L-Leu
A peptide synthesis reaction was performed under the same conditions as in (1) above, except that L-Ala was changed to L-Leu, and the reaction solution was analyzed by the same method. As a result, production of L-Pro-L-Leu 9.4 mmol/l and L-Leu-L-Leu 1.0 mmol/l was confirmed.

（３）L-Phe-β-Alaの製造
L-Phe 40mmol/l、β-Ala 40mmol/l、ATP 50mmol/l、MgSO₄ 25mmol/l、TabS 0.5mg/ml、Tris HCl 100mmol/l（pH 9）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。反応液上清を上記したHPLCの条件で分析し、L-Phe-β-Ala 0.12mmol/lの生成を確認した。 (3) Production of L-Phe-β-Ala
Prepare a reaction solution consisting of L-Phe 40 mmol/l, β-Ala 40 mmol/l, ATP 50 mmol/l, MgSO ₄ 25 mmol/l, TabS 0.5 mg/ml, Tris HCl 100 mmol/l (pH 9) and 30°C. The peptide synthesis reaction was carried out for 20 hours. The reaction solution supernatant was analyzed under the above-mentioned HPLC conditions to confirm the production of L-Phe-β-Ala 0.12 mmol/l.

（４）各種ペプチドの製造
アミノ酸１ 12.5mmol/l、アミノ酸２ 12.5mmol/l、ATP 12.5mmol/l、MgSO₄ 12.5mmol/l、TabS 0.1mg/ml、Tris HCl 100mmol/l（pH 8.0）からなる反応液を調製し、30℃で20時間ペプチド合成反応を行った。アミノ酸１および２は、それぞれ表１中にアミノ酸１およびアミノ酸２として示す各アミノ酸である。反応終了後、それぞれの反応上清を上記したLC-ESI-MSで分析した。結果を表１に示す。 (4) Production of various peptides From amino acid 1 12.5 mmol/l, amino acid 2 12.5 mmol/l, ATP 12.5 mmol/l, MgSO ₄ 12.5 mmol/l, TabS 0.1 mg/ml, Tris HCl 100 mmol/l (pH 8.0) Was prepared and the peptide synthesis reaction was carried out at 30° C. for 20 hours. Amino acids 1 and 2 are each amino acid shown as amino acid 1 and amino acid 2 in Table 1, respectively. After completion of the reaction, each reaction supernatant was analyzed by LC-ESI-MS described above. The results are shown in Table 1.

表中のグレーで示したアミノ酸の組合せでペプチド合成反応を行った場合、上記システムにおいてジペプチドに相当するピークを検出した。 When the peptide synthesis reaction was carried out with the combination of amino acids shown in gray in the table, a peak corresponding to the dipeptide was detected in the above system.

（５）L-Leu、およびL-Metを含むトリペプチドの製造
上記（４）において、アミノ酸１としてL-Leu、アミノ酸２としてL-Met、L-Arg、L-Ala、L-Lys、L-His、L-ProまたはL-Pheを用いた場合、L-Leu-L-Leu-L-Leu、L-Met-L-Met-L-Met、並びに２つのL-LeuとL-Met、２つのL-LeuとL-Arg、２つのL-LeuとL-Ala、２つのL-LeuとL-Lys、２つのL-LeuとL-His、２つのL-LeuとL-Pro、２つのL-LeuとL-Phe、および２つのL-PheとL-Leuからなるトリペプチドに相当するピークを検出した。 (5) Production of tripeptide containing L-Leu and L-Met In the above (4), L-Leu as amino acid 1 and L-Met, L-Arg, L-Ala, L-Lys, L as amino acid 2 -When using His, L-Pro or L-Phe, L-Leu-L-Leu-L-Leu, L-Met-L-Met-L-Met and two L-Leu and L-Met, Two L-Leu and L-Arg, two L-Leu and L-Ala, two L-Leu and L-Lys, two L-Leu and L-His, two L-Leu and L-Pro, Peaks corresponding to tripeptides consisting of two L-Leu and L-Phe and two L-Phe and L-Leu were detected.

本発明を用いることにより、ペプチドを効率よく製造することが可能となった。 By using the present invention, it has become possible to efficiently produce a peptide.

Claims

The protein according to any of the following [1] to [3], one or more amino acids, and ATP are allowed to exist in an aqueous medium, and a peptide is produced and accumulated in the medium, and the peptide is produced from the medium. A method for producing a peptide, which comprises collecting the peptide.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity

The method according to claim 1, wherein ATP is ATP supplied by polyphosphate kinase.

A culture of a transformant expressing the protein according to any one of the following [1] to [3] or a treated product of the culture, one or more amino acids, and ATP are allowed to exist in an aqueous medium, A method for producing a peptide, which comprises producing and accumulating a peptide in a medium, and collecting the peptide from the medium.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
[2] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity

The method for producing a peptide according to claim 3, wherein the transformant has been transformed with the DNA according to any of the following [1] to [3].
[1] DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
[2] A DNA consisting of a base sequence having 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and encoding a protein having peptide synthesis activity
[3] A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having peptide synthesis activity

ATP is ATP produced by polyphosphate kinase, The manufacturing method of Claim 3 or 4 characterized by the above-mentioned.

A transformant that expresses the protein according to any of the following [1] to [3] and has the ability to produce one or more amino acids is cultured in a medium, and a peptide is produced and accumulated in the culture. And then collecting the peptide from the culture.
[1] A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4
[2] A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 with one or more amino acid residues deleted, substituted, or added, and having peptide synthesis activity
[3] A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having peptide synthesis activity

The method for producing a peptide according to claim 6, wherein the transformant is transformed with the DNA according to any of the following [1] to [3].
[1] DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
[2] A DNA consisting of a base sequence having 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and encoding a protein having peptide synthesis activity
[3] A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions and encodes a protein having peptide synthesis activity