JP2011107099A - 電気化学分析チップおよび電気化学分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】タンパク質等の直接的に電気化学分析を行うことのできない被測定物質に対しても、簡便な方法で電気化学的分析を行うことができ、正確な定量分析が可能な分析チップおよび分析方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、サンプル吸収層と、試薬層と、サンプル測定用電極とを、上方からこの順で含む積層構造を有することを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質についての電気化学分析に用いられる分析チップである。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、サンプル吸収層と、試薬層と、サンプル測定用電極とを、上方からこの順で含む積層構造を有することを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質についての電気化学分析に用いられる分析チップである。
【選択図】図１
Description
本発明は、電気化学分析に用いられる分析チップに関する。より詳しくは、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質についての電気化学分析に用いられる分析チップに関する。
近年、医療や健康、食品、創薬などの分野で、ＤＮＡや酵素、抗原、抗体、タンパク質、ウィルスおよび細胞などの生体物質、ならびに化学物質を検知、検出あるいは定量する重要性が増してきており、それらを簡便に測定できる様々なバイオチップおよびマイクロ化学チップ（以下、これらを総称して分析チップと称する。）が提案されている。分析チップは、実験室で行なっている一連の実験・分析操作を、数ｃｍ角で厚さ数ｍｍ〜１ｃｍ程度のチップ内で簡易に行なえるように作られており、検体および試薬が微量で済むため、コストが安く、反応速度が速く、ハイスループットな検査ができ、検体を採取した現場で直ちに検査結果を得ることができるなど多くの利点を有している。このような分析チップは、たとえば血液検査等の生化学検査用として好適に用いられている。
現在、さまざまな手法で、生体由来の各種物質の簡易測定が行われている。インフルエンザ検査、妊娠検査、血糖値の測定などといった、主に医療分野において、簡易かつ安価であり、一般人の需要も高く、大きな市場を獲得している。今後もますます大きな市場を形成することが期待される。
特許文献１には、水性液体試料中の検体の存在または濃度を測定するための電気化学的試験デバイスが開示されている。具体的な水性液体試料中の検体としては、血液中のグルコースが記載されている。かかる電気化学的試験デバイスを用いることで、血液中のグルコース濃度などであれば簡便な操作で定量を行うことができる。
一方、コルチゾールなどのコルチコイドの一部は、ストレスによって体内濃度が変化するホルモンとして知られている。現在、このようなタンパク質等の実際の測定においては、紙ベースの検査チップに保持された試薬の呈色や発色反応の有無を目視で定性検査するか、もしくは、呈色や発色の強度を光学的に測定することによって定量を行う方法が主流である。しかし、コルチゾールなど生体サンプル中に極微量しか存在しない生理活性物質では、紙ベースの検査チップを用いた場合、感度不足が生じるため正確なタンパク質の定量を行うことは困難である。
また、多くのタンパク質は、その化学反応系において低分子量の単純な分子を生成することはまれなので、グルコースのように酸化還元性の高いＨ２Ｏ２の生成やＯ２の消費に結び付けることが難しく、その結果電気化学測定などを用いた電子の授受から定量分析を行うことが困難である。その場合には、酵素標識免疫測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）のような複雑な方法を介さなければ、定量分析することができない。このため、血中グルコースの電気化学的分析チップのように簡便、迅速、低コストな方法で、タンパク質等を正確に定量分析するための分析チップは、ほとんど実用化されていない。
本発明は、上述のような現状に鑑み、タンパク質等の直接的に電気化学分析を行うことのできない被測定物質に対しても、簡便な方法で電気化学的分析を行うことができ、正確な定量分析が可能な分析チップおよび分析方法を提供することを目的とする。
本発明は、サンプル吸収層と、試薬層と、サンプル測定用電極とを、上方からこの順で含む積層構造を有することを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質についての電気化学分析に用いられる分析チップである。
上記電気化学分析に必要な化学反応は、上記被測定物質との抗原抗体反応を含むことが好ましい。
上記電極の少なくとも一部の表面近傍に抗体が配置されることが好ましい。
さらに、上記電極と上記試薬層との間において上記電極と接した状態で、抗体が固定された抗体固定層を備え、上記抗体固定層のうち少なくとも上記電極の表面上に対応する部分に抗体が配置されていることが好ましい。
さらに、上記電極と上記試薬層との間において上記電極と接した状態で、抗体が固定された抗体固定層を備え、上記抗体固定層のうち少なくとも上記電極の表面上に対応する部分に抗体が配置されていることが好ましい。
上記試薬層は、上記被測定物質と電気化学的に検出可能な標識物質との複合体（以下、被測定物質と電気化学的に検出可能な標識物質との複合体を被測定物質―標識物質複合体と略する）を含有することが好ましい。
上記標識物質は、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼであることが好ましい。
上記被測定物質は、コルチコイドもしくはコルチコイド誘導体であることが好ましい。
さらに、前記積層構造の下部に液体を除去する機構を有することが好ましい。
さらに、前記積層構造の下部に液体を除去する機構を有することが好ましい。
さらに、ブランク測定用電極および／またはスタンダード（標準液：被測定物質の既知濃度の溶液）測定用電極を含むことが好ましい。
さらに、サンプル(測定対象液：被測定物質の未知濃度の溶液)および展開洗浄液の流路を有し、
上記サンプル測定用電極と上記ブランク測定用電極とは、上記サンプルおよび上記展開洗浄液の流路内に配置され、上記スタンダード測定用電極は上記サンプルおよび上記展開洗浄液の流路外に配置されることが好ましい。
上記サンプル測定用電極と上記ブランク測定用電極とは、上記サンプルおよび上記展開洗浄液の流路内に配置され、上記スタンダード測定用電極は上記サンプルおよび上記展開洗浄液の流路外に配置されることが好ましい。
上記サンプル測定用電極および上記スタンダード測定用電極の表面近傍には上記抗体が配置され、上記ブランク測定用電極の表面近傍には上記抗体が配置されないことが好ましい。
上記積層構造の上方に、上記サンプルおよび上記展開洗浄液を滴下するため開口部を有するカバー部材を備えることが好ましい。
また、複数の上記積層構造を備えることが好ましい。
また、本発明は、サンプル吸収層、試薬層および電極を上方からこの順で含む積層構造を有する分析チップを用いて、被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を前記積層構造の上方から下方に移動させることで前記電気化学分析に必要な前処理反応が行われることを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質の電気化学分析方法にも関する。
また、本発明は、サンプル吸収層、試薬層および電極を上方からこの順で含む積層構造を有する分析チップを用いて、被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を前記積層構造の上方から下方に移動させることで前記電気化学分析に必要な前処理反応が行われることを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質の電気化学分析方法にも関する。
本発明の分析チップによれば、タンパク質等の電気化学分析を簡便に行うことができ、分析を迅速化できる。また、現在の紙ベースと同等の価格で、簡便、迅速に定性にとどまらず正確な定量を行うことが出来れば、疾病が重篤であるかどうかを即座に判断するスクリーニングに用いることができ、ポイント・オブ・ケア検査（point-of-care testing、ＰＯＣＴ；患者のそばでの健診）技術として医療分野に大きく貢献できる。
例えば、血液中などに存在するグルコースは、酵素であるグルコースオキシダーゼ等が触媒となる反応により酸化還元電流を生じるため、この電流を測定することにより電気化学的に直接検出することが可能である。一方、生体中に存在する種々のタンパク質の多くは、直接的に酸化還元電流を生じるような反応を行わせて電気化学的に定量・定性することが困難である。このため、生体中のタンパク質などを電気化学的測定を用いて測定する際には、被測定物質と、被測定物質−標識物質複合体とを競合反応させて、標識物質を利用して電気化学的に検出する方法が用いられる。本発明は、このように電気化学的に直接検出することができない被測定物質について、他の間接的な処理反応を介して電気化学的分析を簡便に行うための分析チップである。
電気化学的に直接検出することのできない被測定物質として、具体的には、例えば、酵素などのタンパク質、核酸、ホルモンなどの生理活性物質、神経伝達物質、低分子化合物などの生化学物質が挙げられる。好ましくは、低分子化合物であり、より好ましくは、コルチコイドおよびその誘導体である。コルチコイドとしては、コルチゾール、コルチコステロン、コルチゾンなどが挙げられ、好ましくはコルチゾールである。
分析チップとは、任意の測定原理を採用することによって、被測定物質を含むサンプルを分析（例えば、サンプル中の被測定物質の検出または定量）するために用いられるハンディーサイズの測定部材である。本発明の分析チップは、少なくともサンプル吸収層、試薬層およびサンプル測定用電極を上方からこの順で含む積層構造を有している。
本発明の分析チップの積層構造の一例を図１を用いて説明する。図１は、基板１上の凹部にサンプル測定用電極２１が配置され、その上に試薬層３、さらにその上にサンプル吸収層４１が積層された構造を示している。
サンプル吸収層４１とは、被測定物質を含むサンプルを吸収する部材であり、さらに後述の展開洗浄液を吸収すること等によって、その下方に配置された試薬層３にサンプルおよび展開洗浄液が展開される。サンプル吸収層４１の構成材料は、サンプルを吸収できる材料であり、被測定物質を変性させないようなものであれば、特に限定されないが、例えば、セルロース、グラスファイバー、シリカファイバーなどが挙げられる。好ましくは、セルロース、グラスファイバーである。
サンプル吸収層４１の形状は、上下方向に液体が流れることのできる形状であれば特に限定されないが、多孔質体、繊維素材などのパッドまたはメンブレンなどが挙げられる。サンプル吸収層４１の厚さは、特に限定されないが、１００μｍ〜３ｍｍが好ましく、さらに好ましくは１００μｍ〜１ｍｍである。
試薬層とは、上下方向に液体が流れることのできる担体に、必要な試薬を保持させてある層である。該担体の材料は、被測定物質を変性させないようなものであれば、特に限定されないが、例えば、グラスファイバー、セルロースファイバー、シリカファイバーなどが挙げられる。好ましくは、グラスファイバー、セルロースファイバーである。試薬を担体に保持する方法は、種々公知の方法を使用することができるが、担体に試薬を含む溶液を浸透させたあと乾燥する方法などが挙げられる。なお、試薬は展開洗浄液によって、電極付近まで流されるように適度な強度で保持されることが好ましい。
該担体の形状は、上下方向に液体が流れることのできる形状であれば特に限定されないが、多孔質体、繊維素材などのパッドまたはメンブレンなどが挙げられる。試薬層の厚さは、特に限定されないが、１００μｍ〜３ｍｍが好ましく、さらに好ましくは１００μｍ〜１ｍｍである。
試薬層に保持される試薬は、被測定物質の電気化学分析を行うために必要な前処理反応に用いられる試薬である。被測定物質の電気化学分析に必要な前処理反応については後述するが、例えば、競合反応が挙げられる。上記前処理反応が競合反応である場合に用いられる試薬としては、例えば、抗原抗体反応において被測定物質−標識物質複合体が挙げられる。この複合体および被測定物質を競合させた状態で、電極上に導入すると電極表面近傍に配置された抗体との抗原抗体反応が起こり、抗体と結合した複合体の標識を電気化学分析によって検出することで、結果的に被測定物質の定量等を行うことができる。
なお、１つの試薬層内には、１種の試薬のみが保持されていてもよく、２種以上の試薬が保持されていてもよい。
また、上記サンプル吸収層４１および試薬層３は、必ずしも別の部材とする必要はなく、一体の担体の下側部分に必要な試薬が保持されており、サンプル吸収層４１および試薬層３の両者を兼ねる一体型の構造であってもよい。
サンプル測定用電極には、通常、作用電極（ワーキング電極）、対電極（カウンター電極）および参照電極（リファレンス電極）が含まれる。電気化学分析を行う際には、被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を流した後、一定の状態において、作用電極の参照電極に対する電位変化に対する電流変化（作用電極と対電極との間を流れる電流変化）を検出する。そして、その電流変化を積分計算して得られる電気量（クーロン量）またはピーク電流値または電流変化の微分値などを検量線と比較することにより、被測定物質を分析（定量、定性）することができる。
該作用電極の材料としては、標識物質の電気化学分析に用いられる種々公知の作用電極の材料を用いることができ、例えば、白金、カーボン、金、銀、パラジウム、ルテニウム、ロジウムなどが挙げられる。特に、上記試薬が被測定物質−標識複合体であり、標識物質としてグルコースオキシダーゼを用いる場合、その検出反応（グルコースオキシダーゼによる酸化反応）の触媒となる白金を材料として含む作用電極を用いることが好ましい。本発明における作用電極は、後述のような作用電極の表面上に抗体が固定された電極や、電子メディエータを含む電極も包含される。
対電極の材料としては、標識物質の電気化学分析に用いられる種々公知の対電極の材料を用いることができ、例えば、白金、カーボン、金、銀、パラジウム、ルテニウム、ロジウムなどが挙げられる。好ましくは、白金である。
参照電極の材料としては、標識物質の電気化学分析に用いられる種々公知の参照電極の材料を用いることができ、例えば白金、カーボン、金、銀、パラジウム、ルテニウム、ロジウムなどが挙げられる。好ましくは、白金である。
基板１の材質は、特に制限されず、たとえば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリアリレート樹脂（ＰＡＲ）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン樹脂（ＡＢＳ）、塩化ビニル樹脂（ＰＶＣ）、ポリメチルペンテン樹脂（ＰＭＰ）、ポリブタジエン樹脂（ＰＢＤ）、生分解性ポリマー（ＢＰ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの有機材料；シリコン、シリコーン、ガラス、石英などの無機材料等を用いることができる。
基板表面には、サンプル測定用電極（作用電極、対電極、参照電極を含む）や後述のブランク測定電極、スタンダード測定用電極等を配置するための凹部（配線パターン）を設けることが好ましい。凹部を形成する方法としては、特に制限されず、転写構造を有する金型を用いた射出成形法、インプリント法などを挙げることができる。無機材料を用いて基板を形成する場合には、エッチング法などを用いることができる。
本発明の分析チップにおいて、上記積層構造は、必要に応じて他の層を含んでいてもよく、例えば、図２に示すように、後述の抗体固定層５をサンプル測定用電極２１の上方に接して（試薬層３の下に）設けてもよい。
本発明の分析チップの大きさは、特に限定されず、たとえば縦横数ｃｍ程度、厚さ数ｍｍ〜１ｃｍ程度とすることができる。
本発明の分析チップは、サンプルや展開洗浄液を上下方向に流す構造（バーティカルフロー構造）を有しており、電気化学分析を行う際には、上記被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を上記積層構造の上方から下方に移動させることによって、被測定物質の電気化学分析を行うために必要な前処理反応が行われる。
被測定物質が唾液、汗、血液などの生体由来の液体成分に含まれる場合は、これらの生体由来の液体成分をそのままサンプルとして用いることができる。これらの生体由来の液体成分のうちでも、非浸襲での採取が可能である点で、唾液、汗をサンプルとして用いることが好ましい。なお、液体成分中の夾雑物質などが問題となる場合は、抽出や遠心分離等の処理を行った後に、後述の展開洗浄液と同じ媒質などに分散または溶解させた液をサンプルとして用いてもよい。分析の簡便性の観点からは、生体由来の液体成分そのものをサンプルとすることが好ましい。
また、展開洗浄液とは、展開液としての役割と洗浄液としての役割との両者を有する液である。展開液としての役割とは、サンプル吸収層中の被測定物質を試薬層に展開し、さらに抗体固定層（必要な場合）や電極上に展開することであり、これによって本発明で分析対象となる被測定物質の電気化学分析に必要な前処理反応が進行される。また、洗浄液としての役割とは、例えば、抗体に吸着していない余剰の被測定物質および被測定物質−標識複合体を洗い流して、電極上および抗体固定層から取り除く役割である。
展開洗浄液は、被測定物質の種類や上記被測定物質−標識複合体および抗体の種類などに応じて適宜選択される。例えば、被測定物質がコルチコイドであり、被測定物質−標識複合体がコルチコイド―グルコースオキダーゼ複合体である場合に用いられる展開洗浄液としては、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）緩衝液、Tris buffer、Acetate bufferなどが挙げられる。特にコルチコイドがコルチゾールである場合は、リン酸緩衝液を展開洗浄液として用いることが好ましい。
通常は、まずサンプルがサンプル吸収層に導入されることによって、サンプル吸収層に展開され、その後、展開洗浄液がサンプル吸収層に導入されることによって、被測定物質が試薬層に展開され、さらに電極の表面近傍に配置された抗体または抗体固定層に展開される。
本発明において、分析対象となる被測定物質は、直接的に電気化学分析を行うことができないため、電気化学分析を行うためには、あらかじめ別途の化学反応を用いたサンプルの前処理反応が必要である。この電気化学分析を行うために必要な前処理反応としては、例えば、抗原抗体反応が挙げられる。
分析チップの積層構造において、電気化学分析を行うために必要な前処理反応が被測定物質を抗原とする抗原抗体反応を含む場合、電極が電流を検出し電気化学分析を行うことが出来るようにするために、抗体は電極の表面近傍に配置されることが好ましい。具体的には、電極の少なくとも一部の表面上に抗体を直接的に固定することが好ましい。
また、図２に示すように、上記の積層構造に加えて、さらに、電極２と試薬層３との間に、抗体が固定された抗体固定層５を設けて、電極の少なくとも一部の表面上の対応する位置に抗体が配置されていてもよく、この場合、電極に直接的に抗体を固定する場合よりも多くの抗体を配置させることができる。電極に生じる電流を多くして測定感度を向上させるためには、抗体固定層５が電極２に接して配置されることが好ましい。
なお、電極の表面または抗体固定層に固定された抗体は、少なくともサンプルおよび展開洗浄液によって流されないように固定されている必要がある。抗体の固定方法としては、種々公知の固定方法を用いることができる。
抗体固定層とは、被測定物質を抗原とする抗原抗体反応に用いられる抗体が上下方向に液体が流れることのできる担体に固定されている層である。該担体の材料は被測定物質を変性させるようなもの以外であれば、特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、シリカなどが挙げられる。好ましくは、ニトロセルロースである。
該担体の形状は、担体中を透過して上下方向に液体が流れることのできる形状であれば特に限定されない。なお、担体としてニトロセルロースメンブレンを用いた場合、担体の形状は円形であることが好ましい。カッター等で切断加工を行った場合、切断部に割れ等が生じやすいため、パンチで切り取る方が加工が容易であるためである。抗体固定層の厚さは、特に限定されないが、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍが好ましく、さらに好ましくは０．２ｍｍ〜０．３ｍｍである。
本発明の分析チップは、さらに、上記のサンプル測定用電極を含む分析チップの積層構造において、あるいは、上記積層構造とは別に、ブランク測定用電極および／またはスタンダードを測定するためのスタンダード測定用電極を設けることで、サンプルと、ブランクおよび／またはスタンダードとの測定を同時に行うことが可能な分析チップとすることが好ましい。このとき、サンプル測定用電極とブランク測定用電極とは、サンプルおよび展開洗浄液の流路内に配置されることが好ましく、スタンダード測定用電極はサンプルおよび展開洗浄液の流路外に配置されることが好ましい。なお、スタンダード測定用電極は必要に応じて、数を増やすことも可能であり、必要がなければ無くてもよい。
例えば、図３に示すように、基板１上にサンプル測定用電極２１とブランク測定用電極２２とを配置し、それらの上に第１の試薬層３１、さらにその上にサンプル吸収層４１を積層した積層構造を作製し、それらとは離れた位置の基板１上にスタンダード測定用電極２３を配置し、その上に第２の試薬層３２、さらにその上にスタンダード吸収層４２を積層した積層構造を作製して、２つの積層構造の間に隔壁６を設けることができる。また、図３では、上記の積層構造の上方に、サンプルおよび展開洗浄液を滴下するため開口部７１と、スタンダード（標準液）および展開洗浄液を滴下するための開口部７２を有するカバー部材７が設けられている。
ブランク測定用電極、スタンダード測定用電極のそれぞれには、通常、サンプル測定用電極と同様に、作用電極、対電極および参照電極が含まれる。作用電極、対電極および参照電極の材料としては、上述のサンプル測定用電極に用いられる材料と同様の材料を使用することができる。ただし、ブランク測定用電極の作用電極の表面上には、通常、抗体が固定されたり、抗体固定層が設けられたりすることはない。
サンプル測定用電極の作用電極およびスタンダード測定用電極の作用電極の表面上に、抗体が固定されたり、抗体固定層が設けられたりすることで、サンプル測定用電極およびスタンダード測定用電極では被測定物質の測定が可能になる。他方、ブランク測定用電極の作用電極の表面上には、抗体が固定されたり、抗体固定層が設けられたりしないことによって、ブランク（被測定物質が全く存在しないとき）の作用電極の電流変化を検出することができる。
スタンダード測定用電極２３は、上記サンプル測定用電極２１とブランク測定用電極２２とは別に基板１上に配置され、その上に直接抗体を固定、または抗体固定層が配置される。その上に試薬をしみ込ませた試薬層３２を配置し、その上にスタンダード吸収層４２を配置することで、キャリブレーションに用いられるスタンダードの測定が可能となる。したがって、スタンダード測定用電極２３上のスタンダード吸収層４２においては、サンプルではなくスタンダードをしみ込ませる必要があり、隣のサンプルが混入されないようにサンプル測定用電極２１およびブランク測定用電極２２との間に隔壁６を設けることが好ましい。
本発明の分析チップは、電極の数を必要数用意し、試薬層、サンプル吸収層、抗体固定層などを組み合わせたものを、複数種類１つの分析チップ内に配置することで、１つのサンプルから複数の被測定物質を同時に測定することが可能なタイプ（マルチ分析タイプ）の分析チップとしてもよい。
図４を用いて、マルチ分析タイプの分析チップの一例について説明する。図４においては図３で示したサンプル測定用電極２１、ブランク測定用電極２２、スタンダード測定用電極２３と、第１の試薬層３１、第２の試薬層３２、サンプル吸収層４１、スタンダード吸収層４２および隔壁６を含む部分を測定部８１，８２，８３，８４として示している。測定部８１，８２，８３，８４は、それぞれ異なる種類の被測定物質を測定するための試薬や抗体などを備えており、複数種の被測定物質を測定することができる。なお、複数種の被測定物質を含むサンプルや展開洗浄液が、各測定部の間で互いに混じりあわないようにするため、各測定部８１，８２，８３，８４の間には隔壁９が設けられている。
また、図４では、このようなマルチ分析タイプの分析チップにおいては、サンプルと展開洗浄液を滴下するためにカバー部材７に設けられた開口部（サンプル滴下用の開口部７１、スタンダード滴下用の開口部７２）は、各測定部の電極の種類によって複数個設けられている。
本発明の分析チップは、余剰のサンプル、展開洗浄液等を廃液するための機構を備えていることが好ましい。このような余剰の液を廃液するための機構としては、例えば、吸収パッド、廃液タンクなどが挙げられる。吸収パッドを用いる場合、吸収パッドの材質としては、セルロース、グラスフィルターなどを用いることができる。
また、本発明は、上述の分析チップを用いた電気化学分析方法にも関する。本発明の電気化学分析方法は、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質の電気化学分析方法であって、サンプル吸収層、試薬層および電極を上方からこの順で含む積層構造を有する分析チップを用いて、被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を上記積層構造の上方から下方に移動させることによって上記電気化学分析に必要な前処理反応が行われることを特徴としている。
なお、上記前処理反応が行われた後の工程としては、公知の電気化学分析と同様の手法により、例えば、抗体に結合した被測定物質−標識複合体の標識を検出する工程が挙げられる。具体的には、例えば、標識物質がグルコースオキシダーゼである場合、一定量のグルコースをサンプル吸収層を介して電極表面付近に供給することにより、グルコースオキシダーゼによる酸化反応を行い、その際の電流変化を測定することで、被測定物質と被測定物質−標識複合体の抗体への吸着比を分析し、その結果から被測定物質の定量等を行うことができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
＜抗体固定層＞
１） ニトロセルロース膜（Trans-Blot（登録商標）Transfer Medium Pure Nitrocellulose Menbrane（厚さ０．４５μｍ）、162-0145、Bio-Rad Laboratories Inc.)を３×６ｍｍの長方形に切り出し、蒸留水で３回洗浄した。なお、洗浄方法は洗浄液（蒸留水）を１ｍＬずつ洗浄回数分の本数のエッペンチューブに入れ、その中に膜を入れ洗浄した。以後同様に洗浄する。
＜抗体固定層＞
１） ニトロセルロース膜（Trans-Blot（登録商標）Transfer Medium Pure Nitrocellulose Menbrane（厚さ０．４５μｍ）、162-0145、Bio-Rad Laboratories Inc.)を３×６ｍｍの長方形に切り出し、蒸留水で３回洗浄した。なお、洗浄方法は洗浄液（蒸留水）を１ｍＬずつ洗浄回数分の本数のエッペンチューブに入れ、その中に膜を入れ洗浄した。以後同様に洗浄する。
２） コルチゾール抗体溶液（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および、対照として０μｇ／ｍＬ）４００μＬにニトロセルロース膜を浸漬し、室温で９０分間インキュベートした。
３） 界面活性剤である１０％Ｔｗｅｅｎ２０(１０％Ｔｗｅｅｎ２０Solution、161-0781、Bio-Rad Laboratories Inc.)を０．０５％含むリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ−Ｔと略す）で３回洗浄後、ブロッキング溶液(１μｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液)１ｍＬに浸漬し、４℃で９０分間インキュベートした。さらに、ＰＢＳ−Ｔで三回洗浄し、コルチゾール抗体が固定されたニトロセルロース膜（抗体固定層）を得た。
＜前処理反応＞
グルコースオキシダーゼとコルチゾールとの複合体（以下、ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体と略す）の溶液５００μＬ（０．１０６ｍｇ／ｍＬのＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体溶液１００μＬ＋ＰＢＳ−Ｔ４００μＬ）に上記抗体固定層を浸漬して、抗原抗体反応を進行させた。３０分後、未反応物質を除去するためにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。
グルコースオキシダーゼとコルチゾールとの複合体（以下、ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体と略す）の溶液５００μＬ（０．１０６ｍｇ／ｍＬのＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体溶液１００μＬ＋ＰＢＳ−Ｔ４００μＬ）に上記抗体固定層を浸漬して、抗原抗体反応を進行させた。３０分後、未反応物質を除去するためにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。
＜測定方法＞
１） 上記処理を行ったニトロセルロース膜を白金電極の上に乗せ、蒸留水３５μＬを加え、電気化学アナライザー（Electrochemical Analyzer Model 832A, ALS832A, ALS/chi）を用いて０．６Ｖ（Ｐｔに対して）の電位を印加し、測定を行った。
１） 上記処理を行ったニトロセルロース膜を白金電極の上に乗せ、蒸留水３５μＬを加え、電気化学アナライザー（Electrochemical Analyzer Model 832A, ALS832A, ALS/chi）を用いて０．６Ｖ（Ｐｔに対して）の電位を印加し、測定を行った。
２） 電流値安定後、１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液５μＬを加え、その直後から電流の測定を開始した。測定結果を図５に示す。なお、図５は、上記各濃度のコルチゾール抗体溶液（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および、対照として０μｇ／ｍＬ）における検出電流値と測定時間との関係を示すグラフである。
図５に示すように、コルチゾール抗体の濃度が上昇するにつれて検出電流値も高くなることから、ニトロセルロース膜にコルチゾール抗体が固定化され、コルチゾール抗体とＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体との抗原抗体反応が特異的に起こっていることが確認された。
また、上記実施例１において、コルチゾール抗体溶液の濃度が１０μｇ／ｍＬの場合に、ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体溶液（０．１０６ｍｇ／ｍＬ）に代えて、ＧＯＤ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）溶液または蒸留水（コントロール）を使用し、同様に電流値の測定を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、ＧＯＤ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を用いた場合では、電流値はほとんど検出されないが、ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体の場合は電流値が検出されることが分かる。従って、ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体とコルチゾール抗体との間で抗原抗体反応が特異的に行われていることが確認された。
（実施例２）
＜抗体固定層＞
１０ｍｇ／ｍＬのコルチゾール抗体溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、コルチゾール抗体が固定されたニトロセルロース膜（抗体固定層）を作製した。
＜抗体固定層＞
１０ｍｇ／ｍＬのコルチゾール抗体溶液を用いた以外は実施例１と同様にして、コルチゾール抗体が固定されたニトロセルロース膜（抗体固定層）を作製した。
＜前処理反応＞
ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体の溶液５００μＬ（０．１０６ｍｇ／ｍＬのＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体溶液１００μＬ＋リン酸緩衝液４００μＬ）にコルチゾール標準液（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、上記で得たコルチゾール抗体が固定化されたニトロセルロース膜を浸漬し、競合反応を進行させた。３０分後、未反応物質を除去するためにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。なお、対照として、上記ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体の溶液５００μＬのみに、コルチゾール抗体が固定化されたニトロセルロース膜を浸漬させたものも準備した。
ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体の溶液５００μＬ（０．１０６ｍｇ／ｍＬのＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体溶液１００μＬ＋リン酸緩衝液４００μＬ）にコルチゾール標準液（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え、上記で得たコルチゾール抗体が固定化されたニトロセルロース膜を浸漬し、競合反応を進行させた。３０分後、未反応物質を除去するためにＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。なお、対照として、上記ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体の溶液５００μＬのみに、コルチゾール抗体が固定化されたニトロセルロース膜を浸漬させたものも準備した。
＜測定方法＞
上記処理を行ったニトロセルロース膜について、実施例１と同様にして電流値を測定した。測定結果を図７に示す。図７は、１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬの各濃度のコルチゾール標準液を加えた場合、および、対照としてコルチゾール標準液を加えなかった場合の検出電流値と時間の関係を示すグラフである。
上記処理を行ったニトロセルロース膜について、実施例１と同様にして電流値を測定した。測定結果を図７に示す。図７は、１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬの各濃度のコルチゾール標準液を加えた場合、および、対照としてコルチゾール標準液を加えなかった場合の検出電流値と時間の関係を示すグラフである。
図７において、コルチゾール標準液の濃度が上昇すると検出電流値は低くなっており、コルチゾール標準液の濃度と電流値は反比例の関係を有することが示された。したがって、ニトロセルロース膜上でコルチゾールとＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体との競合反応が行われていることが確認された。このことから抗体固定層および電極を上方からこの順で含む積層構造において、コルチゾールの定量が可能であるといえ、本発明の積層構造を有する分析チップにおいても同様の定量が可能であると考えられる。
（実施例３）
＜抗体固定層＞
ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製 ＨＦ１８０ＵＢＸＳＳ）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取った。切り取った抗体固定層（ニトロセルロースメンブレン）に、コルチゾール抗体０．１ｍｇ／ｍＬを１０μＬ滴下し室温乾燥させた。次に、抗体固定層をブロッキング溶液２０ｍＬに６０分浸漬する。ここで用いたブロッキング溶液は、ＰＢＳ−Ｔおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を重量比でＰＢＳ−Ｔ：ＢＳＡ＝１００：２となるように含む溶液である。次に、ニトロセルロースメンブレンを取り出し、ＰＢＳ−Ｔ２０ｍＬに５分間浸漬して洗浄する操作を３回繰り返した後、室温で乾燥させた。
＜抗体固定層＞
ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製 ＨＦ１８０ＵＢＸＳＳ）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取った。切り取った抗体固定層（ニトロセルロースメンブレン）に、コルチゾール抗体０．１ｍｇ／ｍＬを１０μＬ滴下し室温乾燥させた。次に、抗体固定層をブロッキング溶液２０ｍＬに６０分浸漬する。ここで用いたブロッキング溶液は、ＰＢＳ−Ｔおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を重量比でＰＢＳ−Ｔ：ＢＳＡ＝１００：２となるように含む溶液である。次に、ニトロセルロースメンブレンを取り出し、ＰＢＳ−Ｔ２０ｍＬに５分間浸漬して洗浄する操作を３回繰り返した後、室温で乾燥させた。
＜試薬層＞
グラファイバーコンジュゲートパッド（ミリポア社製 ＧＦＣＰ１０３０００）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取った。切り取ったグラファイバーコンジュゲートパッドに、グルコースオキシダーゼとコルチゾールとの複合体（ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体）を過剰量の濃度で含む溶液を５μＬ滴下し室温乾燥して、試薬層を得た。
グラファイバーコンジュゲートパッド（ミリポア社製 ＧＦＣＰ１０３０００）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取った。切り取ったグラファイバーコンジュゲートパッドに、グルコースオキシダーゼとコルチゾールとの複合体（ＧＯＤ−ＣＯＲＴ複合体）を過剰量の濃度で含む溶液を５μＬ滴下し室温乾燥して、試薬層を得た。
＜サンプル吸収層＞
セルロースファイバーサンプルパッド（ミリポア社製 ＣＦＳＰ２０３０００）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取り、サンプル吸収層とした。
セルロースファイバーサンプルパッド（ミリポア社製 ＣＦＳＰ２０３０００）を、直径６ｍｍの円形状にパンチで切り取り、サンプル吸収層とした。
＜分析チップの組立て＞
上記の通り準備した抗体固定層、試薬層およびサンプル吸収層を、図２に示すように、白金（Ｐｔ）材料からなるサンプル測定用電極２（作用電極、対電極および参照電極を含む）上に、下から抗体固定層５、試薬層２、サンプル吸収層３の順に積層した。なお、このようにして形成された積層構造の側面付近には、別途、余剰のサンプル、展開洗浄液およびグルコース水溶液を吸収するための吸収パッドを設置した。
上記の通り準備した抗体固定層、試薬層およびサンプル吸収層を、図２に示すように、白金（Ｐｔ）材料からなるサンプル測定用電極２（作用電極、対電極および参照電極を含む）上に、下から抗体固定層５、試薬層２、サンプル吸収層３の順に積層した。なお、このようにして形成された積層構造の側面付近には、別途、余剰のサンプル、展開洗浄液およびグルコース水溶液を吸収するための吸収パッドを設置した。
＜スタンダードの分析＞
コルチゾールを純水に溶解させたコルチゾール濃度が１ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬであるスタンダード５μＬを、サンプル吸収層に吸収させる。その後、展開洗浄液として５００μＬのＰＢＳ−Ｔをサンプル吸収層の上方からゆっくりと滴下する。展開洗浄液の全量を滴下し、応答電流が安定した後、グルコース水溶液（１００ｍｇ／ｄＬ）を１０μＬ滴下する。なお、この間において、余剰のサンプル、展開洗浄液およびグルコース水溶液は吸収パッドに吸収される。
コルチゾールを純水に溶解させたコルチゾール濃度が１ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬであるスタンダード５μＬを、サンプル吸収層に吸収させる。その後、展開洗浄液として５００μＬのＰＢＳ−Ｔをサンプル吸収層の上方からゆっくりと滴下する。展開洗浄液の全量を滴下し、応答電流が安定した後、グルコース水溶液（１００ｍｇ／ｄＬ）を１０μＬ滴下する。なお、この間において、余剰のサンプル、展開洗浄液およびグルコース水溶液は吸収パッドに吸収される。
グルコース水溶液の滴下開始直後から電気化学分析を開始し、検出された電流と測定時間との関係を示すグラフを作成した。結果のグラフを図８に示す。
＜実験結果＞
図８に示すグラフは、実線のラインが、コルチゾール濃度１μｇ／ｍＬの標準液を測定したものであり、破線のラインが、コルチゾール濃度１０μｇ／ｍＬの標準液を測定した電気化学測定の結果である。図８に示されるように、コルチゾール濃度が大きいほど出力の電流値が小さくなるという結果が得られた。これにより、サンプル吸収層、試薬層、抗体固定層および電極を上方からこの順で含む積層構造において、競合法を用いてコルチゾールの定量が可能であるといえる。
図８に示すグラフは、実線のラインが、コルチゾール濃度１μｇ／ｍＬの標準液を測定したものであり、破線のラインが、コルチゾール濃度１０μｇ／ｍＬの標準液を測定した電気化学測定の結果である。図８に示されるように、コルチゾール濃度が大きいほど出力の電流値が小さくなるという結果が得られた。これにより、サンプル吸収層、試薬層、抗体固定層および電極を上方からこの順で含む積層構造において、競合法を用いてコルチゾールの定量が可能であるといえる。
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
１ 基板、２１ サンプル測定用電極、２２ ブランク測定用電極、２３ スタンダード測定用電極、３ 試薬層、３１ 第１の試薬層、３２ 第２の試薬層、４１ サンプル吸収層、４２ スタンダード吸収層、５ 抗体固定層、６，９ 隔壁、７ カバー部材、７１，７２ 開口部、８１，８２，８３，８４ 測定部。
Claims (13)
- サンプル吸収層と、試薬層と、サンプル測定用電極とを、上方からこの順で含む積層構造を有することを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質についての電気化学分析に用いられる分析チップ。
- 前記電極の少なくとも一部の表面近傍に抗体が配置された、請求項１に記載の分析チップ。
- さらに、前記電極と前記試薬層との間において前記電極と接した状態で、抗体が固定された抗体固定層を備え、前記抗体固定層のうち少なくとも前記電極の表面上に対応する部分に抗体が配置されている、請求項１に記載の分析チップ。
- 前記試薬層は、前記被測定物質と電気化学的に検出可能な標識物質との複合体を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の分析チップ。
- 前記標識物質は、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項４に記載の分析チップ。
- 前記被測定物質は、コルチコイドもしくはコルチコイド誘導体である、請求項５に記載の分析チップ。
- さらに、前記積層構造の下部に液体を除去する機構を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の分析チップ。
- さらに、ブランク測定用電極および／またはスタンダード測定用電極を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の分析チップ。
- さらに、サンプルおよび展開洗浄液の流路を有し、
前記サンプル測定用電極と前記ブランク測定用電極とは、前記サンプルおよび展開洗浄液の流路内に配置され、前記スタンダード測定用電極は前記サンプルおよび展開洗浄液の流路外に配置される、請求項８に記載の分析チップ。 - 前記サンプル測定用電極および前記スタンダード測定用電極の表面近傍には前記抗体が配置され、前記ブランク測定用電極の表面近傍には前記抗体が配置されない、請求項８または９に記載の分析チップ。
- 前記積層構造の上方に、前記サンプルおよび前記展開洗浄液を滴下するための開口部を有するカバー部材を備えた、請求項１〜１０のいずれかに記載の分析チップ。
- 複数の前記積層構造を備えた、請求項１〜１１のいずれかに記載の分析チップ。
- サンプル吸収層、試薬層および電極を上方からこの順で含む積層構造を有する分析チップを用いて、被測定物質を含むサンプルおよび展開洗浄液を前記積層構造の上方から下方に移動させることで前記電気化学分析に必要な前処理反応が行われることを特徴とする、電気化学的に直接検出することのできない被測定物質の電気化学分析方法。
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