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JP2011063520A - Skin-beautifying method by heparanase inhibitor and evaluation method of substance exhibiting skin-beautifying effect - Google Patents

Skin-beautifying method by heparanase inhibitor and evaluation method of substance exhibiting skin-beautifying effect Download PDF

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JP2011063520A
JP2011063520A JP2009213095A JP2009213095A JP2011063520A JP 2011063520 A JP2011063520 A JP 2011063520A JP 2009213095 A JP2009213095 A JP 2009213095A JP 2009213095 A JP2009213095 A JP 2009213095A JP 2011063520 A JP2011063520 A JP 2011063520A
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俊介 入山
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Hirofumi Aoki
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潔 佐藤
Satoshi Amano
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel skin-beautifying method and an evaluation method of a substance exhibiting a skin-beautifying effect. <P>SOLUTION: The skin-beautifying method includes inhibiting activities of heparanase existing in the skin. The evaluation method of a skin-beautifying effect of a subject substance includes bringing the subject substance into contact with a skin, a skin tissue or a skin cell of a human or an animal, measuring enzyme activities of heparanase in the skin and evaluating skin-beautifying effects of the subject substance using as an index the changes in the enzyme activities of heparanase. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、ヘパラナーゼ阻害剤による美白方法及び美白効果を有する物質の評価方法に関するものである。   The present invention relates to a whitening method using a heparanase inhibitor and a method for evaluating a substance having a whitening effect.

皮膚のしみ・そばかすなどの色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線、皮膚局所の炎症が原因となってメラニンが過剰に形成され、これが皮膚内に沈着するものと考えられている。皮膚の色素沈着の原因となるこのメラニンは、表皮基底層にある色素細胞(メラノサイト)内で合成され、メラノソームと呼ばれる小胞に貯蔵される。このメラノソームがメラノサイト内に移動し、周囲角化細胞(ケラチノサイト)に取り込まれ、皮膚が黒色化する。このメラノサイト内におけるメラニンは、チロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノンを経て酵素的または非酵素的な酸化反応により黒色のメラニンへと変化して生成される。そこでこれまで、第一段階の反応であるチロシナーゼの活性を抑制することが、メラニンの生成を抑制するうえで重要であると考えられ、チロシナーゼ活性を阻害する物質の開発が行われてきた。   It is thought that pigmentation such as skin spots and freckles causes excessive melanin formation due to hormonal abnormalities, ultraviolet rays, and local inflammation of the skin, which deposits in the skin. This melanin, which causes skin pigmentation, is synthesized in pigment cells (melanocytes) in the basal layer of the epidermis and stored in vesicles called melanosomes. This melanosome moves into the melanocyte, is taken up by surrounding keratinocytes (keratinocytes), and the skin becomes black. Melanin in the melanocytes is produced by converting tyrosine into black melanin through an enzymatic or non-enzymatic oxidation reaction via dopaquinone by the action of the enzyme tyrosinase. Thus, it has been considered that the suppression of tyrosinase activity, which is the first stage reaction, is important in suppressing the production of melanin, and substances that inhibit tyrosinase activity have been developed.

しかしながら、チロシナーゼの活性を抑制する化合物はハイドロキノンを除いてはその効果の発現がきわめて緩慢であるため、皮膚色素沈着の改善効果が十分でない(特開昭58-154507号公報(特許文献1))。一方、ハイドロキノンは効果が認められるが、感作性があるため一般の使用が制限されている。そこで、チロシナーゼ活性阻害以外の作用機序による美白剤の開発が望まれている。   However, the compounds that suppress the activity of tyrosinase exhibit very slow effects except for hydroquinone, so that the effect of improving skin pigmentation is not sufficient (Japanese Patent Laid-Open No. 58-154507 (Patent Document 1)). . On the other hand, hydroquinone has an effect, but its general use is limited because of its sensitization. Therefore, development of a whitening agent by an action mechanism other than tyrosinase activity inhibition is desired.

特開昭58−154507号公報JP 58-154507 A WO 2005/042495 A1WO 2005/042495 A1

Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129Semin Cancer Biol., 2002; 12 (2): 121-129 Mol Cancer Ther., 2004;3(9):1069-1077Mol Cancer Ther., 2004; 3 (9): 1069-1077 Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006;(16):409-412.Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006; (16): 409-412.

本発明は、より効果的な美白方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、より効率的かつ簡便に被験物質の美白効果を評価できる方法を提供することを目的とするものである。   An object of the present invention is to provide a more effective whitening method. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method capable of evaluating the whitening effect of a test substance more efficiently and simply.

本発明者は、以前に、小じわモデルによって誘導されるしわ形成過程を生化学的に解析した結果、しわ形成過程において、ヘパラナーゼの発現が増加し、基底膜のヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンのヘパラン硫酸鎖が分解されることを見出し、ヘパラナーゼの活性を阻害する物質を塗布することによって、しわ形成を抑制できることを発見している(PCT/JP2009/056717)。そこで、ヘパラナーゼの活性を阻害とシミとの関係性についても検討した結果、シミ部位でヘパラン硫酸が特異的に分解を受けている新知見を得た。そして、ヘパラナーゼ阻害剤として公知な化合物1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを美白効果検証用皮膚モデル(メラノサイトを含む皮膚モデル)に作用させることで、コントロールと比較して有意に皮膚の黒色化を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。なお、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアは、ヘパラナーゼ阻害効果が知られているが、美白効果については知られていない。   As a result of biochemical analysis of the wrinkle formation process induced by the fine wrinkle model, the present inventor previously showed that the expression of heparanase increased in the wrinkle formation process, and heparan sulfate of perlecan, a heparan sulfate proteoglycan in the basement membrane. We have found that wrinkle formation can be suppressed by applying a substance that inhibits the activity of heparanase by finding that the chain is degraded (PCT / JP2009 / 056717). Therefore, as a result of investigating the relationship between the inhibition of heparanase activity and stains, new knowledge was obtained that heparan sulfate was specifically decomposed at the stain site. Then, the compound 1- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea known as a heparanase inhibitor is whitened. It was found that by acting on a skin model for effect verification (a skin model including melanocytes), the skin blackening was significantly suppressed as compared with the control, and the present invention was completed. 1- [4- (1H-Benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea is known to have a heparanase inhibitory effect. There is no known whitening effect.

したがって、本願は以下の発明を包含する。
(1)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制することを特徴とする、美白方法。
(2)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する方法として、ヘパラナーゼ遺伝子発現を抑制する物質を適用することを特徴とする、(1)の美白方法。
(3)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する方法として、ヘパラナーゼ遺伝子の翻訳を抑制する物質を適用することを特徴とする、(1)の美白方法。
(4)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する方法として、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害する物質を適用することを特徴とする、(1)の美白方法。
(5)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する方法として、ヘパラナーゼの酵素活性の活性化を阻害する物質を適用することを特徴とする、(1)の美白方法。
(6)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を、経口、注射、外用塗布などの手段にて投与することを特徴とする、(2)の美白方法。
(7)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を有効成分として含有する、経口投与用美白剤。
(8)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を有効成分として含有する、注射用美白剤。
(9)皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を有効成分として含有する、皮膚外用美白剤。
(10)ヘパラナーゼの活性を抑制する物質が4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンである、(7)〜(9)のいずれかの美白剤。
(11)ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖を測定し、ヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として被験物質の美白効果を評価することを特徴とする、被験物質についての美白効果の評価方法。
(12)表皮角化細胞を用いることを特徴とする(11)の方法。
(13)真皮線維芽細胞を用いることを特徴とする(11)の方法。
Therefore, this application includes the following inventions.
(1) A whitening method characterized by suppressing the activity of heparanase present in the skin.
(2) The whitening method according to (1), wherein a substance that suppresses heparanase gene expression is applied as a method for suppressing the activity of heparanase present in the skin.
(3) The whitening method according to (1), wherein a substance that suppresses translation of the heparanase gene is applied as a method for suppressing the activity of heparanase present in the skin.
(4) The whitening method according to (1), wherein a substance that inhibits the enzyme activity of heparanase is applied as a method of suppressing the activity of heparanase present in the skin.
(5) The whitening method according to (1), wherein a substance that inhibits activation of the enzyme activity of heparanase is applied as a method of suppressing the activity of heparanase present in the skin.
(6) The whitening method according to (2), wherein a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin is administered by means such as oral, injection, or external application.
(7) A whitening agent for oral administration containing a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin as an active ingredient.
(8) A whitening agent for injection containing a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin as an active ingredient.
(9) A skin whitening agent containing a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin as an active ingredient.
(10) The whitening agent according to any one of (7) to (9), wherein the substance that suppresses the activity of heparanase is 4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenylamine.
(11) A test substance is brought into contact with human or animal skin, skin tissue or cells, and the enzyme activity, gene expression level or heparan sulfate chain of heparanase in the skin is measured, and the enzyme activity, gene expression level or heparan sulfate of heparanase is measured. A method for evaluating a whitening effect of a test substance, wherein the whitening effect of the test substance is evaluated using a change in chain as an index.
(12) The method according to (11), wherein epidermal keratinocytes are used.
(13) The method according to (11), wherein dermal fibroblasts are used.

本発明の経口、注射、皮膚外用剤を適応することによって、また、本発明の美容方法によって、皮膚に存在するヘパラナーゼを抑制し、非常に効果的に美白効果を得ることが可能である。また、本発明の評価方法によって、効率的かつ簡便に、より高い効果を有する美白効果を有する物質を特定することが可能である。   By applying the oral, injection and skin external preparations of the present invention, and by the cosmetic method of the present invention, it is possible to suppress heparanase present in the skin and obtain a whitening effect very effectively. Moreover, it is possible to specify the substance which has the whitening effect which has a higher effect efficiently and simply by the evaluation method of this invention.

メラノサイトを含む皮膚モデル(MEL-FT、MatTeK社製、USA)の外観写真を示す。An appearance photograph of a skin model containing melanocytes (MEL-FT, manufactured by MatTeK, USA) is shown. 各皮膚モデルの表皮中のメラニン量の比較結果を示す。The comparison result of the melanin amount in the epidermis of each skin model is shown. 老人性色素斑とその近傍部位の正常組織のパールカン、ヘパラン硫酸の免疫染色結果を示す。The results of immunostaining of senile pigment spots and normal tissues of perlecan and heparan sulfate in the vicinity thereof are shown. 血管マーカーである抗CD31抗体による免疫染色の結果と、画像解析結果を示す。The results of immunostaining with an anti-CD31 antibody, which is a blood vessel marker, and the results of image analysis are shown. リンパ管マーカーである抗LYVE-1抗体による免疫染色の結果と、画像解析結果を示す。The results of immunostaining with an anti-LYVE-1 antibody, which is a lymphatic marker, and image analysis results are shown. 老人性色素斑組織におけるin situ bFGF 結合アッセイの結果を示す。The result of the in situ bFGF binding assay in a senile pigment spot tissue is shown. 脂漏性色素斑組織におけるin situ bFGF結合アッセイの結果を示す。The result of the in situ bFGF binding assay in a seborrheic pigment spot tissue is shown. 4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンのヘパラナーゼ活性阻害の評価結果を示す。The evaluation result of heparanase activity inhibition of 4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenylamine is shown.

ヘパラナーゼは、種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞および真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。各種癌細胞でも産生が高まっていることが知られ、癌の悪性度との関連も示唆されている。癌細胞でヘパラナーゼの産生が高いと転移性が高く、血管新生の誘導能も高いことが知られている(Vlodavsky I., et. al., Semin Cancer Biol., 2002;12(2):121-129(非特許文献2)参照)。   Heparanase is an enzyme that exists in various cells and specifically degrades the heparan sulfate chain of various heparan sulfate proteoglycans. In the skin, epidermis keratinocytes constituting the epidermis, dermal fibroblasts, vascular endothelial cells and the like are produced. It is known that the production is also increased in various cancer cells, and a relationship with the malignancy of cancer is also suggested. High production of heparanase in cancer cells is known to be highly metastatic and to induce angiogenesis (Vlodavsky I., et. Al., Semin Cancer Biol., 2002; 12 (2): 121 -129 (see Non-Patent Document 2)).

本発明では、老人性色素斑組織は露光部皮膚と比較して、基底膜のヘパラン硫酸が分解していることを明らかにされた。ヘパラン硫酸の分解に伴い、表皮で発現している血管内皮細胞増殖因子−A(VEGF-A)の制御が破綻し、これにより真皮の血管やリンパ管の変化により炎症を生じさせ、メラノサイトを活性化させメラノソームへのメラニン貯蔵を促進させる。また、真皮で発現している線維芽細胞増殖因子-7(FGF‐7)の制御が破綻することで、メラノサイトから表皮細胞でメラノソームの受け渡しが促進される。すなわち、ヘパラナーゼ活性化に伴うヘパラン硫酸の分解は、炎症によるメラノサイトの活性化とFGF-7制御の破綻によるメラノソーム受け渡し促進により、相乗的にメラノソームがケラチノサイトに蓄積すると考えられる。   In the present invention, it has been clarified that heparan sulfate in the basal membrane is decomposed in the senile pigment spot tissue as compared with the exposed skin. With the degradation of heparan sulfate, the regulation of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) expressed in the epidermis is disrupted, causing inflammation due to changes in vascular and lymphatic vessels of the dermis and activating melanocytes Promotes melanin storage in melanosomes. In addition, disruption of fibroblast growth factor-7 (FGF-7) expressed in the dermis promotes delivery of melanosomes from melanocytes to epidermal cells. That is, it is considered that the degradation of heparan sulfate accompanying heparanase activation synergistically accumulates in keratinocytes by activation of melanocytes due to inflammation and promotion of melanosome delivery due to failure of FGF-7 control.

本発明の美白効果を示す物質としては、皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を阻害する物質、ヘパラナーゼの発現を阻害する物質、ヘパラナーゼの翻訳を阻害する物質、ヘパラナーゼの酵素活性の活性化を阻害する物質等のヘパラナーゼ活性抑制物質を有効成分として含有することを特徴とする。   Substances showing the whitening effect of the present invention include substances that inhibit the activity of heparanase existing in the skin, substances that inhibit the expression of heparanase, substances that inhibit the translation of heparanase, and substances that inhibit the activation of the enzyme activity of heparanase It contains a heparanase activity inhibitory substance such as as an active ingredient.

本発明の美白方法は、皮膚に存在するヘパラナーゼに対して上記ヘパラナーゼ活性抑制物質を経口、注射または外用の方法で投与し、皮膚のヘパラナーゼを抑制することを特徴とする。   The whitening method of the present invention is characterized in that the heparanase activity-suppressing substance is administered to heparanase present in the skin by an oral, injection or external method to suppress heparanase in the skin.

本明細書において、「ヘパラナーゼの活性の抑制」とは、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害するのみならず、遺伝子の発現やタンパク質生合成を阻害する、ヘパラナーゼの酵素活性の活性化を阻害する等、皮膚におけるヘパラナーゼの働きを抑制する任意の作用を含む。ヘパラナーゼの酵素活性を阻害する物質の例としては、1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレア(WO 2005/042495 A1(特許文献2)、スラミンをはじめ、様々な化合物や生薬が知られる。
本発明に係るヘパラナーゼの活性の測定は、ヘパラナーゼ自体あるいはその酵素活性を測定することのできる任意の方法に従い、定量的又は定性的に実施することができる。具体的には、ヘパラナーゼの基質ヘパラン硫酸の分解産物を測定するか、あるいはヘパラナーゼの生合成量を測定するためにヘパラナーゼに特異的な抗体を利用する免疫測定方法、例えば酵素ラベルを利用するELISA法、放射性ラベルを利用するRIA法、免疫比濁法、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法等、様々な方法が挙げられる。免疫測定法の方式には競合法やサンドイッチ法が挙げられる。他に、ヘパラナーゼをコードする遺伝子の量の測定により行うこともできる。この場合、好ましくは、ヘパラナーゼの発現は細胞内のヘパラナーゼをコードするmRNAの量を測定することにより決定する。mRNAの抽出、その量の定量的又は定性的測定も当業界において周知であり、例えばPCR法、3SR法、NASBA法、TMA法など、さまざまな周知の方法により実施することができる。他に、ヘパラナーゼはin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて定性的に決定することができる。
In this specification, “suppression of heparanase activity” means not only inhibiting the enzyme activity of heparanase, but also inhibiting gene expression and protein biosynthesis, inhibiting activation of the enzyme activity of heparanase, etc. It includes any action that suppresses the action of heparanase. Examples of substances that inhibit the enzyme activity of heparanase include 1- [4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -Urea (WO 2005/042495 A1 (Patent Document 2), various compounds and herbal medicines including suramin are known.
Measurement of the activity of heparanase according to the present invention can be carried out quantitatively or qualitatively according to any method capable of measuring heparanase itself or its enzyme activity. Specifically, it measures the degradation product of the heparanase substrate heparan sulfate, or an immunoassay method using an antibody specific to heparanase to measure the amount of heparanase biosynthesis, for example, an ELISA method using an enzyme label There are various methods such as RIA method using radiolabel, immunoturbidimetric method, Western blot method, latex agglutination method, hemagglutination method and the like. Examples of immunoassay methods include competitive methods and sandwich methods. In addition, it can also be performed by measuring the amount of a gene encoding heparanase. In this case, preferably, heparanase expression is determined by measuring the amount of mRNA encoding heparanase in the cell. Extraction of mRNA and quantitative or qualitative measurement of the amount thereof are also well known in the art, and can be performed by various well-known methods such as PCR, 3SR, NASBA, and TMA. In addition, heparanase can be qualitatively determined through in situ hybridization and measurement of its biological activity.

ヘパラナーゼの活性は、例えば対照の皮膚と比べ有意に低下していたら、抑制されていると判断する。「対照の皮膚と比べ有意に低下」とは、「対照の皮膚細胞」、すなわちヘパラナーゼの活性を阻害する物質で処理していない皮膚細胞と比べ、測定されたヘパラナーゼの活性が統計学的に有意に低下していること、例えば95%以下、又は90%以下、又は80%以下、又は70%以下、又は60%以下、又は50%以下、又は30%以下、又は10%以下である場合をいう。   If the activity of heparanase is significantly lower than that of, for example, control skin, it is determined that the activity is suppressed. “Significantly reduced compared to control skin” means that the measured activity of heparanase is statistically significant compared to “control skin cells”, ie, skin cells not treated with a substance that inhibits the activity of heparanase. For example, 95% or less, or 90% or less, or 80% or less, or 70% or less, or 60% or less, or 50% or less, or 30% or less, or 10% or less. Say.

本発明の被験物質の美白効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させ、前記皮膚、組織または細胞におけるヘパラナーゼの酵素活性、遺伝子発現レベルまたはヘパラン硫酸鎖の変化を指標として美白効果を評価することを特徴とする。   The method for evaluating the whitening effect of a test substance of the present invention comprises contacting a test substance with human or animal skin, skin tissue, cells or enzymes, and the enzyme activity, gene expression level or heparan sulfate of heparanase in the skin, tissues or cells. It is characterized by evaluating the whitening effect using the change of the chain as an index.

本明細書において、「美白」とは、基底膜のへパラン硫酸の分解に伴うメラノサイトの活性化の結果生ずるケラチノサイトでのメラノソームの蓄積による皮膚の黒色化を抑え、しみ、そばかす、くすみなどを改善することを意味する。本発明でいう「美白方法」とは特に断りのない限り、美容目的を意味するが、場合により、医療目的とする場合もある。   In this specification, “whitening” refers to the suppression of skin darkening due to melanosome accumulation in keratinocytes resulting from the activation of melanocytes associated with the degradation of heparan sulfate in the basement membrane, and improves spots, freckles, dullness, etc. It means to do. The “whitening method” as used in the present invention means a cosmetic purpose unless otherwise specified, but in some cases, it may be a medical purpose.

本発明の美白方法において、上記のヘパラナーゼを抑制する物質は、本発明の目的を達成できる限り、任意の形態で適用することができ、また単独で適用しても、あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。皮膚への適用する場合には、皮膚の場所も限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。   In the whitening method of the present invention, the above-mentioned substance that suppresses heparanase can be applied in any form as long as the object of the present invention can be achieved, and can be applied alone or together with other optional components. You may mix and apply. When applied to the skin, the location of the skin is not limited, and includes any skin on the body surface including the scalp.

本発明の美白効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織、細胞または酵素に被験物質を接触させる工程を含む。   The method for evaluating the whitening effect of the present invention comprises a step of bringing a test substance into contact with human or animal skin, skin tissue, cells or enzymes.

本評価方法で用いることができるヒトまたは動物の皮膚は、本発明の目的を達成できる限り特に限定はされない。本発明の評価方法において、例えば、美白モデルにおいて亢進された遺伝子発現を低下させる物質、ヘパラン硫酸鎖の分解を阻害する物質を特定することによって、美白効果を示す物質を効率的に特定できると考えられる。   The human or animal skin that can be used in the evaluation method is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved. In the evaluation method of the present invention, for example, by specifying a substance that decreases gene expression enhanced in a whitening model or a substance that inhibits degradation of heparan sulfate chains, a substance that exhibits a whitening effect can be efficiently identified. It is done.

ヘパラナーゼの活性を指標とする一次評価は、例えばビオチン化したヘパラン硫酸を96ウェルに固定化した後、薬剤や生薬存在下にてヘパラナーゼを作用させ、ビオチン化ヘパラン硫酸の減少量をパーオキシダーゼ標識したアビジンを作用させ、発色させることでヘパラナーゼ活性を評価することで行うことができる。一次評価にてヘパラナーゼ活性阻害効果があった薬剤は、一次評価とは異なったヘパラナーゼ活性を指標とした二次評価系にて再現性および濃度依存性の評価を行うことができる。二次評価は、ヘパラナーゼを発現しているHT1080細胞を用いて評価を行うことができる。HT1080細胞は、コンフレントに培養した後に細胞をスクラッチすると、ヘパラナーゼ活性依存的に細胞が遊走することが知られている(Ishida K., et. al., Mol Cancer Ther., 2004;3(9):1069-1077.参照(非特許文献4))。そこで評価薬剤を添加することで、スクラッチ部位の遊走(回復)の程度からヘパラナーゼ阻害活性を評価する。   The primary evaluation using heparanase activity as an index is, for example, biotinylated heparan sulfate was immobilized in 96 wells, then heparanase was allowed to act in the presence of drugs or crude drugs, and the amount of biotinylated heparan sulfate was labeled with peroxidase. It can be carried out by evaluating heparanase activity by allowing avidin to act and color it. A drug having an inhibitory effect on heparanase activity in the primary evaluation can be evaluated for reproducibility and concentration dependency in a secondary evaluation system using heparanase activity different from the primary evaluation as an index. The secondary evaluation can be performed using HT1080 cells expressing heparanase. HT1080 cells are known to migrate depending on heparanase activity when the cells are scratched after culturing confluently (Ishida K., et. Al., Mol Cancer Ther., 2004; 3 (9) : 1069-1077. (Non-Patent Document 4)). Therefore, by adding an evaluation agent, heparanase inhibitory activity is evaluated from the degree of migration (recovery) of the scratch site.

その結果、ヘパラナーゼ活性を有意に抑制する化合物として4‐(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンが見出された。4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミン及びその誘導体はヘパラナーゼ活性阻害作用や美白作用を示すことが従来技術において全く知られていない。   As a result, 4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenylamine was found as a compound that significantly suppresses heparanase activity. It is not known in the prior art that 4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenylamine and its derivatives show heparanase activity inhibitory action or whitening action.

ヘパラナーゼ活性を有する4‐(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンや植物エキスは本願発明の美白方法に使用することができる。特に植物エキスは、安全性が高く、ヘパラナーゼ活性を原因とする種々の症状や疾病、病態等の治療、予防、改善等に役立つ。特に、皮膚におけるヘパラナーゼ活性の阻害に基づくメラノサイトの活性化の予防に好適に適用される。より詳しくは、加齢や光老化等による基底膜プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖の分解に伴うメラノサイトの活性化とFGF-7制御の破綻によるメラノソーム受け渡し促進による相乗的なメラノソームの蓄積を防止、改善し、しみ、そばかす、くすみのない肌の状態を維持すること等に好適に適用される。   4- (1H-Benzimidazol-2-yl) -phenylamine and plant extracts having heparanase activity can be used in the whitening method of the present invention. In particular, plant extracts are highly safe and useful for the treatment, prevention, improvement and the like of various symptoms, diseases, and pathologies caused by heparanase activity. In particular, it is suitably applied to prevention of melanocyte activation based on inhibition of heparanase activity in the skin. More specifically, the prevention and improvement of synergistic melanosome accumulation by the activation of melanocytes associated with the degradation of the heparan sulfate chain of the basement membrane proteoglycan due to aging and photoaging and the promotion of melanosome delivery due to the breakdown of FGF-7 control, It is suitably applied to maintaining a skin state free from spots, freckles, and dullness.

本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を皮膚外用剤に配合する場合、上記各ヘパラナーゼ活性阻害剤配合量は外用剤全量中、乾燥質量(固形分質量)として0.0001〜1質量%が好ましく、特には0.0001〜0.2質量%である。0.0001質量%未満では本発明の効果が十分に発揮され難く、一方、1質量%を超えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められず、また製剤化が難しくなるので好ましくない。   When the heparanase activity inhibitor of the present invention is blended in an external preparation for skin, the blended amount of each heparanase activity inhibitor is preferably 0.0001 to 1% by mass, particularly 0.0001 to dry mass (solid content mass) in the total amount of the external preparation. 0.2% by mass. If it is less than 0.0001% by mass, the effect of the present invention is not sufficiently exerted. On the other hand, if it exceeds 1% by mass, no significant improvement in the effect is observed, and it becomes difficult to formulate it.

本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を、例えば皮膚外用剤に適用する場合、上記必須成分以外に、本発明の効果を損わない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。   When the heparanase activity inhibitor of the present invention is applied to, for example, an external preparation for skin, in addition to the above essential components, components that are usually used for external preparations such as cosmetics and pharmaceuticals within the range that does not impair the effects of the present invention, for example, , Whitening agents, moisturizers, antioxidants, oil components, UV absorbers, surfactants, thickeners, alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients, etc. as required It can mix | blend suitably.

さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、フェノキシエタノール等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンC、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、4-メトキシサリチル酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA誘導体類なども適宜配合することができる。本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤は美白剤と併用することにより更なる美白効果が期待される。   Furthermore, edetate disodium, edetate trisodium, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, sequestering agents such as gluconic acid, methylparaben, ethylparaben, butylparaben, phenoxyethanol and other preservatives, caffeine, Tannin, verapamil, tranexamic acid and its derivatives, licorice extract, grabrizine, hot water extract of karin fruit, various herbal medicines, tocopherol acetate, glycyrrhizic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, ascorbic acid phosphate Whitening agents such as magnesium, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, 4-methoxysalicylic acid, sugars such as glucose, fructose, mannose, sucrose, trehalose, retinoic acid, retinol, retinol acetate, Vitamin A derivatives such as palmitic acid retinol can also be appropriately blended. When the heparanase activity inhibitor of the present invention is used in combination with a whitening agent, a further whitening effect is expected.

またこの皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。   The external preparation for skin can be applied to cosmetics and quasi-drugs applied to the outer skin, and particularly preferably can be widely applied to cosmetics. The dosage form can also be applied to the skin. Any dosage form such as solution system, solubilization system, emulsification system, powder dispersion system, water-oil two-layer system, water-oil-powder three-layer system, ointment, lotion, gel, aerosol, etc. is applicable. Is done.

使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができる。   The use form is also arbitrary, and for example, it can be used for facial cosmetics such as lotions, emulsions, creams and packs, makeup cosmetics such as foundations, lipsticks and eye shadows, aromatic cosmetics, bath preparations and the like.

また、メーキャップ化粧品であれば、ファンデーション等、トイレタリー製品としてはボディーソープ、石けん等の形態に広く適用可能である。さらに、医薬部外品であれば、各種の軟膏剤等の形態に広く適用が可能である。そして、これらの剤型および形態に、本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤の採り得る形態が限定されるものではない。   In addition, makeup cosmetics can be widely applied to foundations and the like, and toiletries such as body soaps and soaps. Furthermore, if it is a quasi-drug, it can be widely applied to various ointment forms. And the form which can take the heparanase activity inhibitor of this invention is not limited to these dosage forms and forms.

本発明のヘパラナーゼ活性阻害剤を医薬製剤として用いる場合、該製剤は経口的にあるいは非経口的(静脈投与、腹腔内投与、等)に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やpH調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。   When the heparanase activity inhibitor of the present invention is used as a pharmaceutical preparation, the preparation is suitably used orally or parenterally (intravenous administration, intraperitoneal administration, etc.). The dosage form is also arbitrary, for example, oral solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, oral liquid preparations such as internal liquids and syrups, and parenteral liquid preparations such as injections. These forms can also be appropriately prepared by known methods. For these pharmaceutical preparations, commonly used binders, disintegrants, thickeners, dispersants, reabsorption accelerators, corrigents, buffers, surfactants, solubilizers, preservatives, emulsifiers, isotonicity Excipients such as agents, stabilizers and pH adjusters may be used as appropriate.

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実験1:ヘパラナーゼ阻害剤による美白効果の評価
メラノサイトを含む皮膚モデルを用いて、ヘパラナーゼ阻害剤である1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの美白効果について検討した。
メラノサイトを含む皮膚モデル(MEL-FT、MatTeK社製、USA)を専用培地(MEL-FT-NMM-113、MatTeK社製、USA)にて培養を開始した。培養2日目からはコントロール群はDMSO、ヘパラナーゼ阻害剤群は終濃度50μMとなるように1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアを加え培養を行い、培地交換を2日または3日おきに行った。培養10日目、14日目に皮膚モデルを採取して外観写真を撮影したところ、ヘパラナーゼ阻害剤群では外観の色がコントロール群より薄く白いことが分かった。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to the following Example.
Experiment 1: Evaluation of whitening effect with heparanase inhibitor Using a skin model containing melanocytes, heparanase inhibitor 1- [4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- ( The whitening effect of 1H-benzoimidazol-2-yl) -phenyl] -urea was investigated.
Culture of a skin model containing melanocytes (MEL-FT, manufactured by MatTeK, USA) was started in a special medium (MEL-FT-NMM-113, manufactured by MatTeK, USA). From the second day of the culture, 1- [4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H--) was prepared so that the control group had DMSO and the heparanase inhibitor group had a final concentration of 50 μM. Benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea was added for culture, and the medium was changed every 2 or 3 days. On the 10th and 14th days of culture, skin models were collected and external appearance photographs were taken. As a result, it was found that the color of the appearance of the heparanase inhibitor group was lighter than that of the control group.

さらにその皮膚モデルの表皮のみを採取し、0.2N水酸化ナトリウム溶液300μLを加え攪拌後、24時間室温にて静置し、30分間95℃で加熱することで表皮を完全に可溶化させた。可溶化後の溶液の475nm吸光度を測定することで表皮中に含まれるメラニン量を検討すると、ヘパラナーゼ阻害剤群はコントロール群と比較して有意にOD475nmの値が低い、すなわちメラニン量が少ないことが明らかとなった。
図1は、MEL-FT皮膚モデルの外観写真を示す。培養10日、14日めでヘパラナーゼ阻害剤群で明らかに白いことが分かる。図2は、各皮膚モデルの表皮中のメラニン量の比較結果を示す。培養10日、14日において、ヘパラナーゼ阻害剤群でメラニンの指標となるOD475nmの吸光度値が優位に低いことがわかる。よって、ヘパラナーゼ阻害剤に美白効果があることが立証された。
Further, only the epidermis of the skin model was collected, added with 300 μL of 0.2N sodium hydroxide solution, stirred, allowed to stand at room temperature for 24 hours, and heated at 95 ° C. for 30 minutes to completely solubilize the epidermis. When the amount of melanin contained in the epidermis is examined by measuring the 475 nm absorbance of the solubilized solution, the heparanase inhibitor group has a significantly lower OD475 nm value than the control group, that is, the amount of melanin is low. It became clear.
FIG. 1 shows an appearance photograph of the MEL-FT skin model. It can be seen that the heparanase inhibitor group is clearly white on the 10th and 14th day of culture. FIG. 2 shows a comparison result of the amount of melanin in the epidermis of each skin model. It can be seen that the absorbance value at OD475 nm, which is an indicator of melanin in the heparanase inhibitor group, is significantly low on the 10th and 14th days of culture. Therefore, it was proved that the heparanase inhibitor has a whitening effect.

実験2:凍結ヒト組織の免疫染色
老人性色素斑及び近傍の正常部位皮膚の凍結組織ブロックを新たに切片化し、8μmの切片を作成した。8μmに剥切した組織切片は、冷アセトンによって固定し乾燥後、PBSにて脱OCTを行った。3%過酸化水素水処理にて組織内在性パーオキシダーゼを不活化してから、10%正常ヤギ血清にてブロッキングし、表1の1次抗体、2次抗体の順番で反応させた。HRP標識させた組織は、PBSにて5回洗浄した後、AECにて発色させた。発色後の組織は、流水にて十分に洗浄してから、水溶性マウント剤を用いて封入した。
Experiment 2: Immunostaining of frozen human tissue Frozen tissue blocks of senile pigment spots and nearby normal site skin were newly sectioned, and 8 μm sections were prepared. The tissue section cut to 8 μm was fixed with cold acetone, dried, and then de-OCTed with PBS. The tissue endogenous peroxidase was inactivated by treatment with 3% hydrogen peroxide solution, blocked with 10% normal goat serum, and reacted in the order of the primary antibody and secondary antibody in Table 1. The tissue labeled with HRP was washed 5 times with PBS and then developed with AEC. The tissue after color development was sufficiently washed with running water and then encapsulated with a water-soluble mounting agent.

実験3:in situ bFGFアッセイ
25μgのbFGFを200μLの膨潤ヘパリン-セファロース(CL-6B; Pharmacia Biotech)に結合させ、DMSOに溶解したNH2-反応性-ビオチン(Dojindo molecular tech.)を室温で5分反応させ、800μLの洗浄バッファー(20mmol/L HEPES, pH7.4, 400mmol/L NaCl )で洗浄し、200μLの溶出バッファー(20mmol/L HEPES, pH7.4, 0.2% BSA, 3mol/L NaCl )で2回溶出させることで、高塩濃度ビオチン化bFGFを回収した。その後、Ultra free C3LGCカラム(アミコン)に入れ、PBSで3回洗浄することで(0.25g/L)ビオチン化bFGFを得た。
Experiment 3: in situ bFGF assay
25 μg of bFGF was bound to 200 μL of swollen heparin-sepharose (CL-6B; Pharmacia Biotech), NH 2 -reactive-biotin (Dojindo molecular tech.) Dissolved in DMSO was reacted at room temperature for 5 minutes, and 800 μL washed Wash with buffer (20mmol / L HEPES, pH7.4, 400mmol / L NaCl) and elute twice with 200μL elution buffer (20mmol / L HEPES, pH7.4, 0.2% BSA, 3mol / L NaCl). High salt concentration biotinylated bFGF was recovered. Thereafter, it was placed in an Ultra free C3LGC column (Amicon) and washed 3 times with PBS (0.25 g / L) to obtain biotinylated bFGF.

5μmに剥切したパラフィン組織切片(老人性、脂漏性角化症部位とその近傍正常部位)を、キシレンにて脱パラ後、エタノール(100%→70%)で置換し、3%過酸化水素水処理にて組織内在性パーオキシダーゼを不活化した。その後、pH5のバッファー(0.5M NaCl含有)、pH10のバッファー(0.5M NaCl含有)で洗浄することで、内在性のヘパラン硫酸結合因子を遊離させた。10%血清にてブロッキングし、ビオチン化bFGF(10nmol/L)を室温1時間反応させ、PBSで3回洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Nichirei, Japan)を室温で15分作用させ、PBSで3回洗浄し、DABにて発色させた。発色後の組織は、流水にて十分に洗浄してから、ヘマトキシリンにて核を染色させ、エタノール(70%→100%)置換、キシレン置換してから封入した。   A paraffin tissue section (senile, seborrheic keratosis site and its normal part in the vicinity) cut into 5 μm was deparaffinized with xylene and replaced with ethanol (100% → 70%) and 3% peroxidation Tissue endogenous peroxidase was inactivated by hydrogen water treatment. Subsequently, the endogenous heparan sulfate binding factor was released by washing with a pH 5 buffer (containing 0.5 M NaCl) and a pH 10 buffer (containing 0.5 M NaCl). Blocked with 10% serum, reacted with biotinylated bFGF (10 nmol / L) for 1 hour at room temperature, and washed 3 times with PBS. Thereafter, peroxidase-labeled streptavidin (Nichirei, Japan) was allowed to act at room temperature for 15 minutes, washed 3 times with PBS, and developed with DAB. The tissue after color development was thoroughly washed with running water, stained with hematoxylin, and substituted with ethanol (70% → 100%) and xylene, and then sealed.

実験4:血管、リンパ管画像解析
CD31染色、LYVE1染色組織は、1切片あたり3枚の写真を撮影し、win roof (Mitani Corporation)にて、染色された血管、リンパ管の数、面積を画像解析にて算出した。さらに、真皮乳頭層エリアの真皮総面積も画像解析にて算出することで、血管やリンパ管の密度、大きさを算出した。
Experiment 4: Blood vessel and lymphatic vessel image analysis
For CD31-stained and LYVE1-stained tissues, three photographs were taken per section, and the number and area of stained blood vessels and lymphatic vessels were calculated by image analysis using win roof (Mitani Corporation). Furthermore, the density and size of blood vessels and lymph vessels were calculated by calculating the total dermis area of the dermal papillary layer area by image analysis.

図3は、老人性色素斑とその近傍部位の正常組織のパールカン、ヘパラン硫酸の免疫染色結果を示す。正常組織では、パールカン、ヘパラン硫酸ともに基底膜が染色されているが、老人性色素斑組織では、パールカン染色のみ染色され、ヘパラン硫酸の染色は著しく低下している。この結果から、老人性色素斑部位ではヘパラン硫酸が特異的に分解を受けていることがわかる。   FIG. 3 shows immunostaining results of senile pigment spots and normal tissues of perlecan and heparan sulfate in the vicinity thereof. In normal tissues, the basement membrane is stained for both perlecan and heparan sulfate, but in senile pigmented spots, only perlecan staining is stained, and the staining for heparan sulfate is significantly reduced. From this result, it can be seen that heparan sulfate is specifically decomposed at the senile pigment spot site.

図4は、血管マーカーである抗CD31抗体による免疫染色の結果と、画像解析結果を示す。各染色組織を画像解析ソフトwin roofにて、cd31で染色された血管の数、太さ、面積を算出することで、老人性色素斑部位とその近傍正常部位の血管の変化を解析した。老人性色素斑部位で血管のサイズ、血管エリアが有意に高いことが明らかとなった。この結果から老人性色素斑部位では血管拡張が起きていることが明らかとなった。   FIG. 4 shows the results of immunostaining with an anti-CD31 antibody, which is a blood vessel marker, and the results of image analysis. By calculating the number, thickness, and area of blood vessels stained with cd31 using the image analysis software win roof, each stained tissue was analyzed for changes in blood vessels in the senile pigmented spot region and its nearby normal region. It was revealed that the size of the blood vessel and the blood vessel area were significantly higher at the senile pigment spot. From these results, it became clear that vasodilation occurred in the senile pigment spot.

図5は、リンパ管マーカーである抗LYVE-1抗体による免疫染色の結果と、画像解析結果を示す。各染色画像を解析ソフトwin roofにて、LYVE-1で染色されたリンパ管の数、太さ、面積を算出することで、老人性色素斑部位とその近傍正常部位のリンパ管の変化を解析した。老人性色素斑部位でリンパ管のサイズ、リンパ管エリアが有意に高いことが明らかとなった。この結果から老人性色素斑部位ではリンパ管拡張が起きていることが明らかとなった。   FIG. 5 shows the results of immunostaining with anti-LYVE-1 antibody, which is a lymphatic marker, and image analysis results. Analyzing changes in lymphatic vessels in senile pigmented spots and nearby normal sites by calculating the number, thickness, and area of lymphatic vessels stained with LYVE-1 using analysis software win roof did. It was revealed that the size of the lymphatic vessel and the lymphatic vessel area were significantly higher at the senile pigment spot. From this result, it became clear that lymphangiectasia occurred in the senile pigment spot.

図6は、老人性色素斑組織におけるin situ bFGF結合アッセイの結果を示す。老人性色素斑の近傍の正常組織では、基底膜が茶色に染色されていることから、bFGFが結合することを示しているが、老人性色素斑部位では、基底膜の染色が見られない、すなわちbFGFが結合できないことを示しており、ヘパラン硫酸の分解によりbFGFが結合できなくかったと考えられる。   FIG. 6 shows the results of an in situ bFGF binding assay in senile pigment spot tissue. In normal tissue near senile pigment spots, the basement membrane is stained brown, indicating that bFGF binds, but in senile pigment spot sites, no staining of the basement membrane is seen, That is, bFGF cannot be bound, and it is considered that bFGF could not be bound due to decomposition of heparan sulfate.

図7は、脂漏性色素斑組織におけるin situ bFGF結合アッセイの結果を示す。脂漏性色素斑の近傍の正常組織では、基底膜が茶色に染色されていることから、bFGFが結合することを示しているが、脂漏性色素斑部位では、基底膜の染色が見られない、すなわちbFGFが結合できないことを示しており、ヘパラン硫酸の分解によりbFGFが結合できなくかったと考えられる。   FIG. 7 shows the results of an in situ bFGF binding assay in seborrheic pigmented tissue. In normal tissues near the seborrheic pigment spot, the basement membrane is stained brown, indicating that bFGF binds, but at the seborrheic pigment spot site, the basement membrane is stained. This indicates that bFGF cannot be bound, and that bFGF could not be bound due to degradation of heparan sulfate.

ヘパラナーゼ活性阻害のスクリーニング
1-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-3-[4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニル]-ユレアの誘導体である4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンについてヘパラナーゼ活性を調べた。
A431細胞(浸潤性ヒト上皮ガン細胞)を10%血清入りDMEM培地にて培養した。培養細胞はLysis Buffer(50mM Tris, 0.5% TritonX-100, 0.15M Nacl, pH4.5)にて可溶化し、スクレイパーにて回収した後、ピペッティングを行いon iceで30分間静置させた。その後10,000rpmで10分遠心することで、不溶解物を除去して上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液中のタンパク量はBCA Protein Assay Kit(PIERCE, CA46141)にて測定した。
Screening for heparanase activity inhibition
4- (1H-benzimidazole, a derivative of 1- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea Heparanase activity was examined for -2-yl) -phenylamine.
A431 cells (invasive human epithelial cancer cells) were cultured in DMEM medium containing 10% serum. The cultured cells were solubilized with Lysis Buffer (50 mM Tris, 0.5% TritonX-100, 0.15 M NaCl, pH 4.5), collected with a scraper, pipetted, and allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 10 minutes to remove insoluble matters, and the supernatant was used as a cell extract. The amount of protein in the cell extract was measured with BCA Protein Assay Kit (PIERCE, CA46141).

細胞抽出液をアッセイBuffer(50mM HEPES, 50mM CH3COONa, 150mM NaCl, 9mM CaCl2, 0.1% BSA)にて所定の濃度に希釈し、4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンを添加、混合してから、ビオチン化ヘパラン硫酸固定化プレートに100μL/wellで播種した。37℃で2時間反応させ、PBS-Tで3回洗浄してから、10,000倍希釈HRP-avidin(Vector, A-2004)/PBS-Tを100μL/wellで播種して37℃で1時間反応させた。再度3回PBS-Tにて洗浄を行い、TMB試薬(BIO-RAD, 172-1066)を100μL/wellで播種して反応させ、1NH2SO4にて反応を止めた後、OD475nmを測定した(特表2003-502054参照(特許文献3))。
ヘパラナーゼ活性は、A431細胞抽出液の検量線から活性を算出し、薬剤抽出物を添加していない資料(コントロール)に対する相対的な値を持って、阻害率(%)を示した。
The cell extract is diluted with assay buffer (50 mM HEPES, 50 mM CH 3 COONa, 150 mM NaCl, 9 mM CaCl 2 , 0.1% BSA) to a predetermined concentration, and 4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenylamine is diluted. Were added and mixed, and then seeded on a biotinylated heparan sulfate-immobilized plate at 100 μL / well. Incubate for 2 hours at 37 ° C, wash 3 times with PBS-T, inoculate 10,000-fold diluted HRP-avidin (Vector, A-2004) / PBS-T at 100 µL / well, and react at 37 ° C for 1 hour I let you. Washed again with PBS-T three times, seeded and reacted with TMB reagent (BIO-RAD, 172-1066) at 100 μL / well, stopped with 1NH 2 SO 4 , and then measured OD475nm (See Special Table 2003-502054 (Patent Document 3)).
The heparanase activity was calculated from the calibration curve of the A431 cell extract, and showed the inhibition rate (%) with a value relative to the data (control) to which no drug extract was added.

その結果、4-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-フェニルアミンが濃度依存的にヘパラナーゼ活性を効果的に抑制することが明らかとなった。この結果を図8に示す。コントロールは、候補薬剤の変わりにDMSOを作用させたものである。
IC50=256μM
As a result, it was revealed that 4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenylamine effectively suppresses heparanase activity in a concentration-dependent manner. The result is shown in FIG. In the control, DMSO was allowed to act instead of the candidate drug.
IC50 = 256μM

Claims (8)

皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制することを特徴とする、美白方法。   A whitening method characterized by suppressing the activity of heparanase present in the skin. 皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する方法として、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害する物質を適用することを特徴とする、請求項1記載の美白方法。   The whitening method according to claim 1, wherein a substance that inhibits the enzyme activity of heparanase is applied as a method of suppressing the activity of heparanase present in the skin. 皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を、経口、注射、外用塗布から選ばれる手段にて投与することを特徴とする、請求項1又は2記載の美白方法。   The whitening method according to claim 1 or 2, wherein a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin is administered by means selected from oral, injection, and external application. 皮膚に存在するヘパラナーゼの活性を抑制する物質を有効成分として含有する、美白剤。   A whitening agent containing, as an active ingredient, a substance that suppresses the activity of heparanase present in the skin. 皮膚外用剤である、請求項4に記載の美白剤。   The whitening agent of Claim 4 which is a skin external preparation. ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚におけるヘパラナーゼの酵素活性を測定し、ヘパラナーゼの酵素活性の変化を指標として被験物質の美白効果を評価することを特徴とする、被験物質の美白効果の評価方法。   The test substance is brought into contact with human or animal skin, skin tissue or cells, the enzyme activity of heparanase in the skin is measured, and the whitening effect of the test substance is evaluated using changes in the enzyme activity of heparanase as an index. Evaluation method of whitening effect of test substance. 表皮角化細胞を用いることを特徴とする、請求項6記載の方法。   The method according to claim 6, wherein epidermal keratinocytes are used. 真皮線維芽細胞を用いることを特徴とする、請求項6記載の方法。   The method according to claim 6, wherein dermal fibroblasts are used.
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