JP2010538628A5 - - Google Patents
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Description
関心対象の２本鎖ポリヌクレオチドは、そのプロモーターがポリヌクレオチド構築物において使用される関心対象遺伝子を天然に有しかつ発現し得る細胞において適しており、かつ使用される。
本発明の特定の実施態様において、２本鎖ポリヌクレオチドは、その５’末端（そのプラス鎖上）が、関心対象遺伝子のプロモーター配列で本質的に始まり、かつその３’末端が、認識結合部位の配列で本質的に終結するようにデザインされている。従って本発明のそのような特定のポリヌクレオチドは、本明細書に明らかにされたプロモーターと認識結合部位とによって挟まれており（framed）、かつ更なる５’及び３’配列のいずれも含まないか、又はクローニング工程で有用であるエンドヌクレアーゼ制限部位若しくはそれらの一部を示す５’及び／若しくは３’ヌクレオチドノミのみを更に含むかのいずれかである。恐らくバーコード単位でアレンジされた、認識結合部位で作製されたバーコードが、必ず上流に配置されたプロモーターの発現制御下にあるように、該ポリヌクレオチドは、前述の開始プロモーターと終結認識結合部位の間に、追加の連続する認識結合部位及びプロモーター配列を含んでいてもよい。本ポリヌクレオチドは、更なる３’配列、例としてポリＡ尾部及び／又は３’−転写終結シグナルなどを含むことも可能である。本ポリヌクレオチドは、該プロモーターに対しより遠位配列である関心対象遺伝子の配列、例えばエンハンサー領域の配列及び／又は他の発現調節配列なども含んでいてもよい。このプロモーター配列は、標準の定義に従い、転写開始点を決定し、かつ転写因子の認識及び結合を、及び直接又は間接に細胞のポリメラーゼの認識及び結合を可能にし、ＲＮＡ伸長を可能にする遺伝子内の領域である。このプロモーターは一般に、ＴＡＴＡボックス配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターを提供する関心対象遺伝子は、該ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド転写試験のために導入され、その結果未変性のプロモーターを提供する細胞に内在する遺伝子、すなわち細胞の遺伝子内においてプロモーターとして機能する能力を天然に有している遺伝子である。従って本プロモーターは、該細胞に対し内在性であると言われる。この表現は、本プロモーターが、外部転写因子又は他の発現調節構成要素をもたらすことを必要とせずに、細胞の転写因子及びポリメラーゼを含む、細胞（特に真核細胞）の内部転写機構により認識されることも意味する。別の言い方をすると、本プロモーターは、その転写活性が試験される細胞の、又は本明細書に明らかにされたようなプロモーターに由来する細胞の天然のプロモーターである。本発明の目的のために、そのような未変性の又は天然のプロモーターは、変更されてよく、特に該ポリヌクレオチド内のそのような変種プロモーターを使用する場合にそのような変更の影響を試験するために、１又は２以上のヌクレオチドの付加、欠失、挿入により変異される。
特定のポリヌクレオチドにおいて、バーコードの各タンデム反復配列は、１つ又は２以上の制限部位により挟まれて（framed）いる。
Claims (56)
- 遺伝子発現プロファイリングの対象となる関心対象遺伝子を天然で有し且つ発現し得る細胞に組み込まれ、当該関心対象遺伝子の遺伝子発現プロファイリングアッセイに用いられる２本鎖ポリヌクレオチドであって、そのプラス鎖上に、５’末端から３’末端に向けて、
（ｉ）細胞に対し内在性であると共に、当該細胞の内部転写機構により認識される１又は２以上の関心対象遺伝子のプロモーター、及び
（ii）１又は２以上のバーコード配列
を含んでなり、各バーコード配列が、少なくとも１つのバーコード配列単位を含み、ここでバーコード配列単位は、１種又は異なる２種以上のビーコン結合部位のタンデム反復配列を含むＤＮＡ構築物であり、かつ該バーコード配列は各々、転写について該プロモーターの少なくとも１つの制御下にある、２本鎖ポリヌクレオチド。 - バーコード配列において、認識結合部位の少なくとも２つが隣接するか、及び／又はバーコード配列単位の少なくとも２つが隣接している、請求項１記載のポリヌクレオチド。
- バーコード配列において、認識結合部位の少なくとも２つが、スペーサーにより分離され、及び／又はバーコード配列単位の少なくとも２つが、スペーサーにより分離されている、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド。
- １つのバーコード配列内の認識結合部位の数が、１よりも多く最大５００である、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- バーコード配列単位が、少なくとも１つの認識結合部位のタンデム反復配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- バーコード配列単位が、少なくとも２つの異なる認識結合部位のタンデム反復配列を含んでなる、請求項５記載のポリヌクレオチド。
- 各バーコード配列単位が、少なくとも３つの異なる認識結合部位を含んでなるか又はからなり、及び各バーコードが、３つの認識結合単位を含んでなるか又はからなる、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 前記バーコード配列単位が、１６〜２００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- プロモーターの下流に、該プロモーターにより制御された、マーカータンパク質をコードするＤＮＡを更に含み、該コードＤＮＡは、該プロモーターの制御下を含む、発現調節エレメントの制御下に配置される、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 関心対象遺伝子のコード配列を、転写及び発現のための該プロモーターの制御下に更に含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 前記関心対象遺伝子のプロモーターが、免疫応答、特に先天性免疫応答に関与した遺伝子のプロモーター、例えばケモカイン又はサイトカイン遺伝子のプロモーターなど、特にインターロイキン遺伝子のプロモーター、又はＩＣＡＭ遺伝子などの細胞接着分子遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺伝子のプロモーターの群から選択されるか、若しくは腫瘍関連タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターから選択される、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 前記認識結合部位の配列が、非哺乳類の、特に非ヒトの配列である、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- １つの認識結合部位が、下記配列の１つを有する、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリヌクレオチド：
５’−ＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＴ−３’、又は
５’−ＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＧＴＣ−３’、又は
５’−ＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＣ−３’、
及び５’−ＧＣＴＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＡＣＣＣ−３’。 - 各タンデム反復配列が、１つ又は２以上の制限部位に挟まれている、請求項５〜１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 前記バーコード配列が、転写終結配列、ポリＡ配列から選択される、１つ又は２以上のヌクレオチド配列又は２以上のそれらの反復配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- 前記認識結合部位が、ビーコン結合部位であり、かつ前記バーコード配列が、ビーコンバーコード配列である、請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
- クローニングされた請求項１〜１６のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを内部に含んでなるベクター。
- プラスミド、コスミド、ウイルス又はｂａｃである、請求項１７記載のベクター。
- 請求項１〜１６のいずれか１項記載の１又は２以上のポリヌクレオチドを含む、特に安定して組込んでいる、生細胞又は株化細胞。
- 特に哺乳類細胞、特にヒトから選択された真核細胞であり、かつ分化細胞、多能性細胞及び幹細胞の中で選択されるか、又はそのような細胞由来の株化細胞、特に哺乳類の株化細胞、とりわけヒト株化細胞である、請求項１９記載の生細胞又は株化細胞。
- 請求項１〜１６のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによる細胞又は株化細胞のトランスフェクションから生じる、請求項１９又は２０記載の細胞又は株化細胞。
- 前記細胞の各々が、請求項１〜１６のいずれか１項記載の１又は２以上のポリヌクレオチドを、その中に含む、特に安定して組込んでいる、細胞又は株化細胞のセットであり、各細胞又は株化細胞は、他の細胞又は株化細胞のものとは異なる、該ポリヌクレオチドの含量を有する、細胞又は株化細胞のセット。
- 請求項１〜１６のいずれか１項記載の異なる複数のポリヌクレオチドのセット。
- （ｉ）請求項１〜１６のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項２２記載の異なる複数のポリヌクレオチドのセット、及び
（ii）該ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセット、及び／又は１つ又は２以上の分子検出プローブの組込みに適した、細胞若しくは株化細胞又は細胞若しくは株化細胞のセット：を備える、キット。 - 請求項２２記載の細胞又は株化細胞のセット、及びそこに組込まれたポリヌクレオチドの転写活性をアッセイするのに適した条件において該細胞を維持するのに好適な試薬を備える、キット。
- 前記バーコード配列のビーコン結合部位とハイブリダイズすることが可能である１つ又は２以上の検出プローブを更に備えるキットであり、該検出プローブが、それらの標的配列にハイブリダイズされた場合の可視化又は測定に適している、請求項２４又は２５記載のキット。
- 前記検出プローブが、前記ビーコンバーコード配列のビーコン結合部位とハイブリダイズすることが可能である１又は２以上の分子ビーコンであり、該分子ビーコンが、ステムループポリヌクレオチド構造を有し、かつそれらの標的配列と、特に可逆的方式でハイブリダイズされた場合に、可視化又は測定に適している、請求項２６記載のキット。
- 前記検出プローブのそれらの標的とのハイブリダイゼーションの可視化が、検出プローブがその標的配列に結合した時にスイッチが入る蛍光の結果として得られる、請求項２６又は２７記載のキット。
- 前記分子ビーコンが、ステムループポリヌクレオチド構造であり、該ポリヌクレオチドのループ部分が、ビーコン結合部位に特異的にハイブリダイズするのに適したプローブ配列であり、かつ該ステム部分が、互いに相補的な配列で形成された２つのアームからなり、各アーム配列が、該ポリヌクレオチドのループ部分に対し反対であるその自由な先端に付着された、蛍光部分又は非蛍光消光部分のいずれかひとつを収容し、該部分が、該アーム配列に付着された場合には、蛍光共鳴エネルギー移動により消光される蛍光部分の蛍光を生じるのに十分な程互いに近く、かつ更に該ポリヌクレオチドの該ループ部分は、各アームポリヌクレオチド構造よりもヌクレオチドで少なくとも２倍長い、請求項２７又は２８記載のキット。
- 前記蛍光部分及び非蛍光消光部分が、該ステムループポリヌクレオチド構造内のアーム配列に共有的に連結されている、請求項２９記載のキット。
- 前記蛍光部分（発蛍光団）が、量子ドット及び誘導体、Alexafluor色素ファミリー、FAM、TET又はCAL FluorGold 540、HEX又はJOE、VICB、CAL Fluor Orange 560A；Cy3c又はNEDB、Quasar 570A、Oyster 556D；TMR又はCAL Fluor Red 590A；ROX又はLC red 610E、CAL FLuor Red 610A；Texas red又はLC red 610E、CAL Fluor Red 610A；LC red 640E又はCAL Fluor Red 635A；Cy5c又はLC red 670E、Quasar 670A、Oyster 645D；LC red 705E又はCy5.5c又は５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、フルオレセイン、アントラニルアミド、クマリン、及びテルビウムキレートの群から選択される、請求項２８〜３０のいずれか１項記載のキット。
- 前記消光分子が、DDQ-IA（最大吸収４３０μｍ）、Dabcyl（最大吸収４７５）、EclipseB（最大吸収５３０）、Iowa Black FQc(最大吸収５３２)、BHQ-1D（最大吸収５３４）、QSY-7E（最大吸収５７１）、BHQ-2 D(最大吸収５８０)、DDQ-IIA（最大吸収６３０）、Iowa Black RQ c（最大吸収６４５）、QSY-21 E（最大吸収６６０）、BHQ-3 D（最大吸収６７０）、金、希土類金属又は４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ローダミン、ピレンブチラート、エオシン、ニトロチロシン、エチジウム及びテトラメチルローダミン−又は４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ローダミン、ピレンブチラート、エオシン、ニトロチロシン、エチジウム及びテトラメチルローダミンの群から選択される、請求項３１記載のキット。
- 前記分子ビーコンのループ部分が、１０〜５５個のヌクレオチドを有し、かつ各アームポリヌクレオチド構造が、４〜１６個のヌクレオチドを有する、請求項２７〜３２のいずれか１項記載のキット。
- 前記分子ビーコンが、下記ヌクレオチド配列のいずれか１つを有する、請求項２７〜３３のいずれか１項記載のキット：
５’−ＧＣＵＧＣ ＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＡＧＵＵＵＧＡＡＧＡＧＡＡ ＧＣＡＧＣ−３’、又は
５’−ＣＧＡＣＣ ＧＡＣＵＵＡＡＧＡＵＡＡＵＡＧＧＵＵＵＵＧＧＣＧ ＧＧＵＣＧ−３’。 - 関心対象遺伝子若しくはプロモーターの下流にクローニングされたバーコード配列ポリヌクレオチドを伴うプラスミド、及び／又はバーコード配列ポリヌクレオチドを認識することができるプローブ、及び／又はプローブ及びプラスミドを株化細胞へ導入するか、若しくはそれらを細胞へ微量注入することができるペプチド、脂質、化学物質などの試薬、及び／又は必要とされる実験手順の各工程の陽性又は陰性対照を更に備える、請求項２６〜３４のいずれか１項記載のキット。
- 請求項２６〜３４のいずれか１項記載の分子検出プローブを１個又は数個更に備える、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の細胞又は株化細胞。
- ａ．請求項１〜１８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、とりわけ安定して組込まれたポリヌクレオチドを含む細胞又は株化細胞を提供する工程、
ｂ．このポリヌクレオチド構築物の転写を誘発、サイレンシング又は制御する工程、
ｃ．工程ａの細胞又は株化細胞を、請求項２６〜３４のいずれか１項記載の検出プローブと接触する工程、
ｄ．ポリヌクレオチド構築物のプロモーターの転写活性のレポーターとして、該検出プローブと、該バーコード配列の認識結合部位の転写産物(transcription)の間のハイブリダイゼーションを検出する工程：を含んでなる、細胞又は株化細胞における遺伝子転写を試験する方法。 - 前記転写の誘発、サイレンシング又は制御の工程が、該細胞又は株化細胞の外部因子との接触後に得られる、請求項３７記載の方法。
- 前記外部因子が、化合物のライブラリー又は生物のライブラリーとして、該細胞又は株化細胞に提供される、請求項３８記載の細胞又は株化細胞における遺伝子転写を試験する方法。
- ポリヌクレオチド転写が、単独細胞上で試験される、請求項３７〜３９のいずれか１項記載の方法。
- ポリヌクレオチド転写が、単独遺伝子ベースで試験される、請求項３７〜４０のいずれか１項記載の方法。
- ポリヌクレオチド転写が、単独細胞内の複数の遺伝子ベースで試験される、請求項３７〜４１のいずれか１項記載の方法。
- ポリヌクレオチド構築物の転写が、実時間及び／又は終了点で試験される、請求項３７〜４２のいずれか１項記載の方法。
- 前記分子検出プローブとバーコード配列の認識結合部位の転写産物の間の結合事象の検出が、定量的である、請求項３７〜４３のいずれか１項記載の方法。
- １〜４、又は１〜１０又は１〜１５又は１〜３２の遺伝子プロモーターの転写活性が、ハイブリダイゼーションから生じる測定可能な変化の結果として、特に蛍光放出として検出される、請求項３７〜４４のいずれか１項記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド構築物によりコードされかつ該ポリヌクレオチド構築物に含まれたプロモーターの１つの制御下で発現された、発現レポータータンパク質の検出を更に含んでなる、請求項３７〜４５のいずれか１項記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド配列に含まれたプロモーターが、免疫応答、特に先天性免疫応答に関与した遺伝子のプロモーター、例えばケモカイン又はサイトカイン遺伝子のプロモーターなど、特にインターロイキン遺伝子のプロモーター、又はＩＣＡＭ遺伝子などの細胞接着分子遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺伝子のプロモーターの群から選択されるか、若しくは腫瘍関連タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターから選択される、請求項３７〜４６のいずれか１項記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、ＳＹＢＲグリーンの群から選択されるレポーターを発現する、請求項４６記載の方法。
- ＲＮＡｉライブラリー、ＤＮＡライブラリー、化学物質ライブラリー、又は病原性生物のライブラリーのスクリーニングにおいて使用するための、請求項３７〜４８のいずれか１項記載の方法。
- 疾患状態又は感染状態の診断に用いられる細胞標的を探索するための方法であって、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法からなる方法。
- 治療的処置の転帰の経過観察に用いられる細胞標的を探索するための方法であって、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法からなる方法。
- 推定治療的化合物のスクリーニングにおいて使用するための、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法。
- 免疫応答と恐らく相互作用する化合物のスクリーニングにおいて使用するための、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法。
- 特に該細胞が該病原体に感染されている状態に配置されている場合に、宿主の細胞又は該細胞由来の細胞のレベルで、病原体と宿主の間の相互作用をモニタリングするための、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法。
- 化合物の又は病原性生物若しくは物質の細胞標的を調べるための、請求項３７〜４９のいずれか１項記載の方法。
- 請求項５１〜５６のいずれか１項記載の方法における、請求項１〜１８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項２３記載のポリヌクレオチドのセット、又は請求項１９〜２２若しくは３６のいずれか１項記載の細胞若しくは株化細胞、又は請求項２４〜３５のいずれか１項記載のキットの使用。
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