JP2009532025A - アデノ関連ウイルスベクターからの組換えタンパク質の制御された発現 - Google Patents

Abstract

免疫グロブリン分子またはその断片の制御された発現のための単一のＡＡＶベクター構築物ならびに上記ベクター構築物を作製および使用する方法が、記載される。ＡＡＶベクターは、第１および第２の免疫グロブリンコード配列のコード配列に作動可能に連結された制御プロモーター、第１および第２の免疫グロブリンコード配列のコード配列間の自己プロセシング切断部位をコードする配列、ならびに付加的なタンパク質分解的切断部位を含み、これは、発現された免疫グロブリン分子またはその断片から自己プロセシングペプチド配列を除去する手段を提供する。上記ベクター構築物は、インビトロおよびインビボにおける生物学的に活性な免疫グロブリンまたはその断片の産生の増強において有用である。

Description

（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／７８８，５６１号（２００６年３月３１日出願）に基づく優先権の利益を主張する。この先の出願は、明確にその全体が本明細書に援用される。

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、組換え全長タンパク質またはその断片の発現を制御する新規なアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター構築物に関する。ＡＡＶ構築物は、細胞または器官による異種タンパク質コード配列のエクスビボ発現またはインビボ発現のためか、あるいはＡＡＶベクターによって形質導入された細胞による組換えタンパク質の厳密に制御された産生のためにインビトロで使用することができる。

（背景技術）
モノクローナル抗体は、癌およびその他の疾患に対する有効な治療薬であることが証明されている。現在の抗体療法は、しばしば、反復投与や長期間の処置レジメンを伴い、これらは、例えば血中濃度に一貫性がないことや、１回の投与についての効力持続期間が限られており、それにより再投与が頻繁に必要になりコストが高くなることなどの多くの欠点を伴う。診断ツールおよび治療法としての抗体の使用は、近年、その用途が増加している。ＦＤＡに承認された癌処置のための最初のモノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）が、非ホジキンリンパ腫に罹患した患者の処置のために１９９７年に承認され、そのすぐ後の１９９８年に、転移性乳癌に罹患した患者の処置のためのヒト化モノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）が承認された。臨床開発の様々な段階にある数多くの抗体による療法が、有望視されている。抗体技術の広く普及した臨床的応用の一つの限界は、治療効力を得るために通常は大量の抗体が必要であり、その産生に関わるコストが非常に大きいということである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２０骨髄腫細胞およびＮＳＯ２骨髄腫細胞は、抗体などのグリコシル化ヒトタンパク質の商業規模での産生のために、最も一般的に使用される哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株の産生から得られる収量は、通常、バッチ式発酵装置内で５〜７日間培養した場合、５０〜２５０ｍｇ／Ｌの範囲内であり、フェドバッチ式発酵装置内で７〜１２日間培養した場合、３００〜１０００ｍｇ／Ｌである。高レベルの産生は、しばしば、遺伝子増幅および最も性能のよいクローンの選択に依存し、これは、時間がかかり開発および産生のコストをさらに増加させる。さらに、抗体産生細胞株に関する安定性の問題は、複数代を継代した後で顕在化することが多い。

治療用途のためのインビトロおよびインビボでの全長免疫グロブリンおよびその断片の制御された産生のために、改良された系に対する必要性が依然として存在する。

アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、その安全性プロフィールおよびインビボで長期間にわたって遺伝子を発現できる能力に起因して、治療遺伝子の送達に好ましいベクターである。組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、これまでインビボで単鎖抗体を発現させるために使用されてきた。ＡＡＶの導入遺伝子パッケージング能は限られており、その形質導入効率は低いので、全長抗体を生成するために、単一のＡＡＶベクターを使用して抗体の重鎖および軽鎖を発現させるための厳密に制御された系を設けることは、一つの技術的課題であった。

本発明は、組換えＡＡＶベクターの単回注射の後に、全長抗体の制御された一貫して高い血中濃度を達成するための新規なアプローチの実現可能性および使用を実証することによって、上記の必要性に対処する。

本発明は、単一細胞からのタンパク質またはポリペプチドのオープンリーディングフレームの制御された発現のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター構築物、および上記構築物の使用方法を提供する。

ある好ましいアプローチにおいて、該ベクターは、タンパク質コード配列またはポリペプチドコード配列間に、自己プロセシング切断配列とタンパク質分解的切断部位とを有するヌクレオチド配列と作動可能に連結されたラパログ制御プロモーターを有し、２つ以上の機能タンパク質またはポリペプチドの厳密に制御された発現を可能にする。本発明は、２つ以上のタンパク質またはポリペプチド、もしくは２つ以上のドメイン（または鎖）を有するタンパク質またはポリペプチドの、ＡＡＶベクターを使用した産生において有用であり、該ＡＡＶベクターにおいては、単一細胞中で制御可能な持続的な発現が起こる。例示的なＡＡＶ構築物は、自己プロセシング切断配列と、発現されたタンパク質またはポリペプチドから自己プロセシング切断配列を除去するためのタンパク質分解的切断部位とを有するヌクレオチド配列と作動可能に連結されたラパログ制御ハイブリッドＺＦＨＤ１／ＩＬ−２プロモーターを含む。このベクター構築物は、インビトロおよびインビボでの生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の産生の増強に関する方法において、有用である。

本発明は、組換え免疫グロブリン分子またはその断片の制御された発現のためのＡＡＶウイルスベクター構築物、および上記構築物のインビトロまたはインビボでの使用方法を提供する。ベクターは、免疫グロブリンの重鎖コード配列と軽鎖コード配列との間にタンパク質分解的切断部位と自己プロセシング配列とを有し、制御されたプロモーターによって駆動される単一の発現カセットからの機能的抗体分子の発現を可能にする。例示的なＡＡＶベクター構築物は、免疫グロブリンの重鎖コード配列と軽鎖コード配列との間の自己プロセシング切断部位をコードする配列と作動可能に連結されたラパログ制御プロモーターを含み、さらに、切断の後に残存する自己プロセシング切断部位由来のアミノ酸を除去するために、自己プロセシング切断部位に隣接するタンパク質分解的切断部位を含む。本発明のＡＡＶベクター構築物は、インビトロおよびインビボにおける全長の生物学的に活性な免疫グロブリンまたはその断片の制御された発現に関する方法において、有用である。

本発明の様々な組成物および方法を、以下に記載する。本明細書において特定の組成物および方法を例示するが、数々の代替的な組成物および方法のいずれもが、本発明の実施における使用に適用可能でありかつ好適であることが理解される。本発明のタンパク質発現構築物またはポリペプチド発現構築物（ベクター）および方法の評価は、当該分野における標準的な手順を使用して行うことができることも、理解されよう。

定義
別途指示しない限り、本明細書中で使用するすべての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有するものとし、本発明の実施には、別途指示しない限り、当業者には既知である細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。それらの技術は、文献、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）に十分に説明されている。

本明細書において、用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルスまたはその他のビヒクルなどのＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいい、該ベクターは、１つ以上の異種ＤＮＡ配列または組換えＤＮＡ配列を含み、異なる宿主細胞間で伝達するように設計されている。用語「発現ベクター」および「遺伝子治療ベクター」は、異種ＤＮＡ断片を細胞内に取り込んで発現するのに有効なあらゆるベクターをいう。クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有し得、したがって該ベクターは、２種の生物内（例えば発現のためにヒト細胞内、クローニングおよび増幅のために原核宿主内）で維持することができる。タンパク質またはポリペプチドの発現が起こるように、核酸の細胞への導入に有効なあらゆる好適なベクター、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクターを使用することができる。本発明の実施においては、発現に有効なあらゆる細胞、例えば昆虫細胞や、酵母や哺乳類細胞などの真核細胞が有用である。

用語「異種ＤＮＡ」および「異種ＲＮＡ」は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部に対して内因性（ネイティブ）でないヌクレオチドをいう。一般に、異種ＤＮＡまたは異種ＲＮＡは、以下にさらに記載するように、形質導入、感染、トランスフェクション、形質転換等によって細胞に添加される。上記ヌクレオチドは、一般に少なくとも１つのコード配列を含むが、該コード配列は発現されていなくてよい。用語「異種ＤＮＡ」は、「異種コード配列」または「導入遺伝子」をいい得る。

本明細書において、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され得、通常は、本発明の自己プロセシング切断部位含有ベクターを使用して発現される目的の「タンパク質」および「ポリペプチド」をいう。上記「タンパク質」および「ポリペプチド」は、以下にさらに記載するように、研究目的、診断目的または治療目的に有用ないかなるタンパク質またはポリペプチドであってもよい。

本明細書において、本発明のウイルス遺伝子治療ベクターに対する用語「複製欠損の」とは、該ウイルスベクターが、そのゲノムを単独でさらに複製およびパッケージングできないことを意味する。例えば、被験体の細胞がｒＡＡＶビリオンに感染している場合、感染した細胞内で異種遺伝子が発現するが、感染した細胞がＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、ｒＡＡＶは複製することができない。

本明細書において、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに対する用語「作動可能に連結された」とは、組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分が、選択されたコード配列の作動的な制御のために互いに機能的に関連していることを意味する。一般に、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続的であり、分泌リーダーの場合は、連続的でありかつリーディングフレーム中に存在する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。

本明細書において、用語「遺伝子」または「コード配列」は、適切な制御配列に作動可能に連結されている場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡ）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡ）される核酸配列をいう。遺伝子は、個々のコードセグメント（エクソン）間に、コード領域の前後の領域、例えば５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）すなわち「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに介在配列（イントロン）を含んでいてもいなくてもよい。

本明細書において、「免疫グロブリン分子またはその断片の第１鎖のコード配列」とは、限定されないが、抗体すなわち免疫グロブリンの軽鎖または重鎖あるいはその断片を含むタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列をいう。

本明細書において、「免疫グロブリン分子またはその断片の第２鎖のコード配列」とは、限定されないが、抗体すなわち免疫グロブリンの軽鎖または重鎖あるいはその断片を含むタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列をいう。

「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡの合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち転写を指示するに足りる最短の配列である。プロモーターおよびそれに対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、細胞種特異的、組織特異的、または種特異的であり得る。また、プロモーター配列と連続的であってもなくてもよいエンハンサー配列が、本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存的な遺伝子発現に影響を与え、ネイティブな遺伝子の５’領域または３’領域に位置し得る。

「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、いずれの方向においても、コード配列および転写される領域の下流の位置から数キロベース（ｋｂ）までの距離にわたって、機能することができる（すなわち、コード配列と関連づけられ得る）。

「制御可能なプロモーター」とは、その活性がシスまたはトランス作用因子によって影響を受けるあらゆるプロモーターである（例えば、外部シグナルや外部物質などの誘導プロモーター）。

「ラパマイシン」とは、ＦＫ５０６結合タンパク質、すなわちＦＫＢＰに高い親和性で結合してラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体を形成するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって産生されるマクロライド系抗生物質である。ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体は、高い親和性で大きな細胞タンパク質、すなわちＦＲＡＰに結合して、ＦＲＡＰとＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体を形成する。ラパマイシンは、ＦＫＢＰをＦＲＡＰに連結するための二量体化因子またはアダプターとして作用する。

本明細書において、用語「ラパログ」とは、ラパマイシンと構造的に関連のあるラパマイシンの構造改変体、例えばアナログ、ホモログ、誘導体およびその他の化合物を含むことを意図する。このような構造改変体としては、Ｃ７、Ｃ４２および／またはＣ２９におけるメトキシの脱メチル化、除去または置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／またはＣ２８におけるヒドロキシの除去、誘導体化または置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／またはＣ３０におけるケトンの還元、除去または誘導体化；６員ピペコラート環の５員プロリル環での置換；ならびにシクロヘキシル環の代替的置換またはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環での置換等の改変が挙げられる。例えば、米国特許第６，１８７，７５７号、同第５，５２５，６１０号、同第５，３１０，９０３号および同第５，３６２，７１８号を参照のこと。例示的なラパログとしては、限定されないが、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、エベロリムス、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３およびバイオリムスが挙げられる。

「ラパマイシン制御プロモーター」とは、その活性がラパマイシンの存在または非存在によって制御されるプロモーターをいう。

用語「転写制御タンパク質」、「転写制御因子」および「転写因子」は、本明細書において交換可能に使用され、ＤＮＡ応答エレメントに結合し、それによって関連する遺伝子の発現を転写的に制御する核タンパク質をいう。転写制御タンパク質は、一般にＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、ＤＮＡへの結合は、ＤＮＡ応答エレメントに同様に結合しているか結合させられている別のタンパク質への結合による間接的なものである場合もある。

本明細書において、用語「配列同一性」とは、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合の、２つ以上の整列した配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性を意味する。用語「％相同性」および「％同一性」は、本明細書において交換可能に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合の、２つ以上の整列した配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性のレベルをいう。例えば、８０％の相同性とは、規定の条件下における規定のアルゴリズムによって決定される８０％の配列同一性と同じことを意味する。

２つ以上の核酸配列またはタンパク質配列に関する用語「同一」または％「同一性」とは、本明細書に記載する配列比較アルゴリズムの１つ、例えばＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して測定してか、または目視点検によって、最大一致について比較し整列させた場合に、同一であるか、または同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する２つ以上の配列または部分配列をいう。

「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」とは、本明細書において、翻訳後または翻訳と同時の切断部位または配列であると定義される。上記「自己プロセシング切断」部位または「自己プロセシング切断」配列は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列をいい、本明細書において２Ａ部位、２Ａ配列もしくは２Ａドメインまたは２Ａ様部位、２Ａ様配列または２Ａ様ドメインによって例示される。本明細書において、「自己プロセシングペプチド」とは、自己プロセシング切断部位、自己プロセシング切断配列または自己プロセシング切断ドメインをコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物であると定義され、これは翻訳の間、該自己プロセシング切断部位を含むタンパク質またはポリペプチドの急速な分子内（シス）切断を媒介して、別個の成熟タンパク質産物または成熟ポリペプチド産物を生じる。

本明細書において、用語「付加的なタンパク質分解的切断部位」とは、自己プロセシング切断部位、例えば２Ａ配列または２Ａ様配列に隣接して本発明の発現構築物に組み込まれる配列をいい、自己プロセシング切断配列による切断の後に残存する付加的なアミノ酸を除去する手段を提供する。例示的な「付加的なタンパク質分解的切断部位」が本明細書において説明されており、限定されないが、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフリン切断部位が挙げられる。該フリン切断部位は、内因性のサブチリシン様プロテアーゼ、例えばタンパク質分泌経路内のフリンその他のセリンプロテアーゼによって切断され得る。

本明細書において、用語「免疫グロブリン」および「抗体」は、交換可能に使用され得、完全な免疫グロブリンまたは抗体分子とともに、抗原決定基に結合することができるそれらの断片、例えばＦａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖをいう。該「免疫グロブリン」および「抗体」は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一のポリペプチド軽鎖と、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖からなる。これらの４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で連結される。重鎖は、γ（ＩｇＧ）、μ（ＩｇＭ）、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）またはε（ＩｇＥ）に分類され、免疫グロブリンの種類指定の基礎であって、これにより所与の抗体のエフェクター機能が決まる。軽鎖は、κまたはλに分類される。本明細書において、「免疫グロブリンまたはその断片」に言及する場合、「その断片」は免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片であることが理解されよう。

用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体の抗原結合領域の１つ以上のアミノ酸が、ヒト抗体に一層近似するように置換されているが、元の非ヒト抗体の結合活性を保持している抗体分子をいう。例えば、米国特許第６，６０２，５０３号を参照のこと。

本明細書において、用語「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子の断片（すなわち、エピトープ）をいう。タンパク質またはタンパク質の断片の多数の領域が、該タンパク質の三次元構造の所与の領域に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。これらの領域または構造を、抗原決定基という。抗原決定基は、抗体に対する結合に関して完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために使用される免疫原）と競合し得る。

本発明の組換えタンパク質または組換えポリペプチドをいう場合、用語「断片」は、対応する全長タンパク質または全長ポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが一部と同じアミノ酸配列を有し、対応する全長タンパク質または全長ポチペプチドの機能または活性の少なくとも１つを保持しているポリペプチドを意味する。該「断片」は、好ましくは、全長タンパク質または全長ポチペプチドの少なくとも２０〜１００個の連続的なアミノ酸残基を含む。

本明細書において、用語「投与すること」または「導入すること」とは、被験体の細胞および／または器官に、組換えタンパク質の発現のためにベクターを送達することをいう。該投与または導入は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで行われ得る。組換えタンパク質または組換えポリペプチドの発現のためのベクターは、トランスフェクションによって細胞内に導入され得、このことは通常、異種ＤＮＡが細胞内に物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはリポフェクション）；感染（通常は、感染性因子、すなわちウイルスによる導入をいう）；または形質導入（通常は、ウイルスによる細胞の持続感染、またはウイルス性因子（例えばバクテリオファージ）による１つの微生物から別の微生物への遺伝物質の伝達を意味する）によって挿入されることを意味する。

「形質転換」とは、代表的に、異種ＤＮＡを含む細菌、または癌遺伝子を発現し、したがって持続的成長様式に変換された腫瘍細胞などの細胞をいうために使用される。細胞を「形質転換」するために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルであり得る。

代表的に、細胞は、該細胞への異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）の投与、導入または挿入のために使用される手段によって、「形質導入された」、「感染した」、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」といわれる。用語「形質導入された」、「トランスフェクトされた」および「形質転換された」は、異種ＤＮＡの導入方法とは関係なく、本明細書において交換可能に使用され得る。細胞は、ウイルスベクターでの感染によって形質導入され得る。

本明細書において、用語「安定的に形質転換された」、「安定的にトランスフェクトされた」および「トランスジェニック」とは、ゲノムに組み込まれた非ネイティブ（異種）核酸配列を有する細胞をいう。安定的なトランスフェクションは、そのゲノムに安定的に組み込まれたトランスフェクトされたＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンの確立によって実証される。場合によっては、トランスフェクションは安定的ではない。すなわち、一過性である。一過性のトランスフェクションの場合、外来性または異種のＤＮＡが発現するが、導入された配列はゲノムに組み込まれず、エピソーム性であると考えられる。

本明細書において、「エクスビボ投与」とは、被験体から一次細胞を採取し、該細胞にベクターを投与して、形質導入された、感染した、またはトランスフェクトされた組換え細胞を産生し、該組換え細胞を同じかもしくは異なる被験体に再投与する過程をいう。

「マルチシストロン性転写産物」は、２つ以上のタンパク質コード領域、すなわちシストロンを含むｍＲＮＡ分子をいう。２つのコード領域を含むｍＲＮＡを、「バイシストロン性転写産物」と呼ぶ。「５’−近位」のコード領域すなわちシストロンは、その翻訳開始コドン（通常はＡＵＧ）がマルチシストロン性ｍＲＮＡ分子の５’−末端に最も近いコード領域である。「５’−遠位」のコード領域すなわちシストロンは、その翻訳開始コドン（通常はＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンでないものである。用語「５’−遠位」および「下流」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接していないコード領域をいうために同義的に使用される。

本明細書において、「同時転写された」とは、２つ（以上）のコード領域またはポリヌクレオチドが、単一の転写制御エレメントまたは調節エレメントの転写制御下にあることを意味する。

本明細書において、「治療」遺伝子とは、発現したときに、該遺伝子が存在する細胞または組織に有益な効果を与える遺伝子や、該遺伝子が発現した哺乳動物に有益な効果を与える遺伝子をいう。有益な効果の例としては、状態または疾患の徴候または症状の緩和、状態または疾患の予防または阻害、もしくは望ましい特性の付与が挙げられる。治療遺伝子には、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を是正する遺伝子が含まれる。

本明細書において、用語「宿主細胞」とは、ベクターによって形質導入されたか、感染したか、トランスフェクトされたか、形質転換された細胞をいう。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞についてこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。用語「宿主細胞」は、形質導入された、感染した、トランスフェクトされた、または形質転換された元の細胞およびその子孫をいうことが理解されよう。

用語「発現」とは、細胞内の内因性の遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および／または翻訳をいう。アンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡの転写のみをいうことがある。

本明細書において、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」とは、培養下またはインビボでの細胞株内の特定のタンパク質に起因する活性をいう。「免疫グロブリン」「抗体」またはその断片の「生物学的活性」は、抗原決定基に結合し、それによって免疫学的機能を助長する能力をいう。

本明細書において、用語「腫瘍」および「癌」は、成長制御の喪失を示し、異常に大きな細胞のクローンを形成する細胞をいう。腫瘍または癌細胞は、一般に、接触阻止を喪失しており、侵襲性であり得るとともに／または転移する能力を有し得る。

免疫グロブリンおよびその断片
抗体は、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体である免疫グロブリンタンパク質であり、哺乳類の培養発現系内の単一ベクターから全長形態で発現しにくいことが証明されている。脊椎動物抗体の産生のために、現在、３つの方法が使用されている。すなわち、「ポリクローナル」抗体を産生するための動物のインビボ免疫化、モノクローナル抗体を産生するためのＢ細胞ハイブリドーマのインビトロ細胞培養（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１、１９７６年；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）および組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号に記載）である。

免疫グロブリンポリペプチドの基本的な分子構造は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖と、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖とを含むことが周知であり、４つの鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」配置に連結される。アミノ酸配列は、Ｙの最上部のＮ末端から、各鎖の最下部のＣ末端へと延びる。Ｎ末端には、抗原結合の特異性を提供する可変領域（長さ約１００アミノ酸）がある。

本発明は、あらゆる種類の免疫グロブリンを産生するための改良された方法に関する。免疫グロブリンとしては、限定されないが、ネイティブ配列（すなわち抗原による刺激に応答して産生された配列）を有する全長抗体および抗体断片、単一の安定的に折りたたまれたポリペプチド鎖内で重鎖および軽鎖の両方の抗原結合可変領域を組み合わせた単鎖抗体；一価抗体（第２重鎖のＦｃ領域に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む）；免疫グロブリン分子の「Ｙ」領域全体、すなわち軽鎖または重鎖単独であるかその一部である「Ｙ」の分枝を含む「Ｆａｂ断片」（すなわち、一般にＦａｂ’として知られる１本の重鎖と１本の軽鎖との集合体）；２つ以上の異なる抗原に対して特異性を有する「ハイブリッド免疫グロブリン」（例えば米国特許第６，６２３，９４０号に記載のクアドローマまたは二重特異性抗体）；重鎖および軽鎖が別の種または特異性の重鎖および軽鎖を模倣している「複合免疫グロブリン」；ならびに重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の部分が、２つ以上の種に由来する（すなわち、可変領域がある源、例えばマウス抗体に由来するが、定常領域が別の源、例えばヒト抗体に由来する）「キメラ抗体」が挙げられる。

本発明の組成物および方法は、その重鎖または軽鎖が、「哺乳類」の鎖、「キメラ」鎖であるか、その効力を高めるように改変されている免疫グロブリンまたはその断片の産生に有用である。改変された抗体としては、非改変形態と同じ生物学的に活性なを保持しているアミノ酸およびヌクレオチド配列改変体、およびその活性が変化するように改変（すなわち補体結合、膜との相互作用およびその他のエフェクター機能を改良する定常領域の変化、または抗原結合特性を改良する可変領域の変化）されているものの両方が挙げられる。本発明の組成物および方法は、触媒性免疫グロブリンまたはその断片をさらに含む。

「改変体」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、参照ポリペプチド配列から１つ以上のアミノ酸が変化している「改変体」免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。改変体ポリヌクレオチド配列は、「保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得、ここで、置換アミノ酸は、それが置換するアミノ酸に類似した構造特性または化学特性を有する。さらに、または代替的に、改変体ポリヌクレオチド配列は、「非保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得、ここで、置換アミノ酸は、それが置換するアミノ酸とは異なる構造特性または化学特性を有する。改変体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失、もしくはその両方を含む改変体アミノ酸配列をもコードし得る。さらに、改変体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と同じポリペプチドをコードし得るが、遺伝暗号の縮退のために、参照ポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基が変化しているポリヌクレオチド配列を有する。

用語「断片」は、本発明の組換え免疫グロブリンをいう場合、対応する全長免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列の全部ではないが一部と同じアミノ酸配列を有し、対応する全長タンパク質と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているか、対応する全長タンパク質の機能または活性の少なくとも１つを保持しているポリペプチドを意味する。断片は、好ましくは、全長免疫グロブリンの連続的なアミノ酸残基を少なくとも２０〜１００個含む。

治療法としての抗体の可能性は、現在の技術の産生能力および過剰なコストによって、現在では限られている。本発明の単一のｒＡＡＶベクターによる免疫グロブリン発現系は、２つ以上のコード配列、すなわち二重特異性または多重特異性を有する免疫グロブリンの単一のＡＡＶベクターからの発現および送達を可能にする。本発明は、従来技術の限界に対処し、本明細書にさらに詳述するように、あらゆる免疫グロブリン（すなわち、抗体）またはその断片、例えば改変抗体（例えば、単鎖抗体、全長抗体または抗体断片）に適用できる。

本発明は、重鎖と軽鎖とが実質的に同じ割合で発現している単一の制御プロモーターを使用した免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現に依存する。ポリタンパク質の形態におけるタンパク質の結合は、ピコルナウイルスを含む多くのウイルスの複製に採用される方策である。翻訳の際に、ウイルスでコードされた自己プロセシングペプチドは、ポリタンパク質の急速な分子内（シス）切断を媒介して、別個の成熟タンパク質産物を生じ、その後のタンパク質分解的切断部位での切断によって、残存する自己プロセシング配列の大半が除去される。本発明は、自己プロセシングペプチド（本明細書における例として、２Ａペプチドが挙げられる）を含む組換え免疫グロブリンの発現のためのベクターが提供されるという点において、ＩＲＥＳの使用に勝る利点を提供し、このことは、単一の制御プロモーターを使用した免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のコード配列の発現を助長し、ここで、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のコード配列は、実質的に等モル比で発現される。重鎖および軽鎖の実質的に等モル比での発現は、例えばウエスタンブロット分析によって実証され得、ここで、重鎖および軽鎖タンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体または抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を使用してプローブされ、市販のキットを製造業者の説明書に従って使用して可視化される。

自己プロセシング切断部位または配列
先に定義した「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列をいい、ここで、翻訳の際に、該自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの急速な分子内（シス）切断が生じて、別個の成熟タンパク質産物が生じる。該「自己プロセシング切断部位」は、翻訳後または翻訳と同時にプロセシングを行う切断部位ともいわれ、本明細書において２Ａ部位、配列またはドメインが例として挙げられる。２Ａ部位、配列またはドメインは、リボソームの活性を改変してエステル結合の加水分解を促進し、それによって、別個の下流の翻訳産物の合成が進行するように翻訳複合体からポリペプチドを放出することによって、翻訳的効果を示す（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ、２００１年）。もしくは、２Ａ部位または２Ａドメインは、それ自体のＣ末端をシスで切断することによって「自己タンパク質分解」または「切断」を示し、一次切断産物を産生する（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０年））。

その機序は本発明の一部をなすものではないが、２Ａの活性は、コドン間のリボソームのスキッピングを伴い得、これはペプチド結合の形成を防ぐ（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１９２１−１９３１（２０００年）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−１０２５（２００１年）；ただし、該ドメインはむしろ自己分解酵素のように作用すると考えられていた（Ｒｙａｎら、Ｖｉｒｏｌ．１７３：３５−４５（１９８９年））。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域を発現ベクターにクローニングし、標的細胞にトランスフェクトした研究によって、人工レポーターポリタンパク質のＦＭＤＶ ２Ａ切断が、広範囲の異種発現系において効率的であることが確立された（小麦胚芽ライセートおよびトランスジェニックタバコ（Ｈａｌｐｉｎら、ＵＳＳＮ５，８４６，７６７（１９９８年）およびＨａｌｐｉｎら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １７：４５３−４５９（１９９９年））；Ｈｓ６８３ヒトグリオーマ細胞株（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１９８−２０８（１９９９年）；以下、「ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ＩＩ」という）；ウサギ網状赤血球ライセートおよびヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：９２８−９３３（１９９４年））；および昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７０３−１７１１（１９９０年））。ＦＭＤＶ ２Ａが媒介する異種ポリタンパク質の切断は、ＩＬ−１２について説明されている（ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体；Ｃｈａｐｌｉｎら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９：２３５−２４１（１９９９年））。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞において、ＦＭＤＶ ２Ａは、ｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質の、ＩＬ−１２に関連する活性を有する生物学的に機能性のサブユニットｐ４０およびｐ３５への切断を媒介した。

ＦＭＤＶ ２Ａ配列は、単独か、または様々なＩＲＥＳ配列と組み合わされてレトロウイルスベクターに組み込まれ、バイシストロン性、トリシストロン性およびテトラシストロン性ベクターを構築してきた。動物における２Ａ媒介遺伝子発現の効率は、ａ−シヌクレインおよびＥＧＦＰ、またはＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）およびＦＭＤＶ ２Ａ配列によって結合したＥＧＦＰをコードする組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｆｕｒｌｅｒ（２００１年）によって実証された。ＥＧＦＰおよびａ−シヌクレインは、対応するＩＲＥＳベースのベクターと比較して、２Ａ配列を含むベクターからかなり高いレベルで発現されたが、ＳＯＤ−１は、比較的高いか少し高いレベルで発現された。Ｆｕｒｌｅｒはまた、２Ａ配列が、２Ａ含有ＡＡＶベクターのラットの黒質への注入後に、インビボでのバイシストロン性の遺伝子発現に至ったことを実証した。近年、２Ａペプチドおよび２Ａ様配列は、レトロウイルスベクターを使用した４つのシストロンの効率的な翻訳に効果的であることが実証された（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年５月２２日、（５）：５８９−９４）。

本発明に関して、自己プロセシング切断部位をコードするＤＮＡ配列としては、ピコルナウイルス、すなわち、限定されないが、エンテロウイルス、ライノウイルス、カーディオウイルス、アフトウイルスまたは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来するウイルス配列が挙げられる。好ましい実施形態において、自己プロセシング切断部位をコードする配列は、ＦＭＤＶ由来である。自己プロセシング切断部位としては、限定されないが、２Ａおよび２Ａ様ドメインが挙げられる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１年））。

本発明のベクター構築物について、２つ以上の異種ＤＮＡ配列間の２Ａ配列のポジショナルサブクローニングは、単一の発現ベクターによる２つ以上の遺伝子の送達および発現を可能にする。好ましくは、ＦＭＤＶ ２Ａ配列などの自己プロセシング切断部位は、単一のウイルスベクターから、抗体、ヘテロ二量体レセプターまたはヘテロ二量体タンパク質などの個々の部分であり得る２つまたは複数のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを、発現し送達する独特な手段を提供する。

ＦＭＤＶ ２Ａは、ＦＭＤＶゲノム内で機能してそれ自体のＣ末端で単一の切断を指示し、それによってシスで機能するポリタンパク質領域である。ＦＭＤＶ ２Ａドメインは、通常は約１９アミノ酸長（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号１）；（ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２；Ｒｙａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２（１９９１年））であると報告されているが、１４アミノ酸残基のような数の少ないオリゴペプチド（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号３）は、ネイティブＦＭＤＶポリタンパク質プロセシングにおけるその役割に似た形で、２ＡのＣ末端で切断を媒介することが示されている。

２Ａ配列の改変体が、ポリタンパク質の効率的なプロセシングを媒介する該改変体の能力について研究されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ＭＬら、２００１年）。２Ａ配列のホモログおよび改変体が、本発明の範囲内に含まれ、限定されないが、以下の表１に示す配列が挙げられる。

２Ａ配列およびその改変体の別個の利点は、ポリタンパク質の自己プロセシングの助長におけるそれらの用途である。本発明は、自己プロセシング切断部位、例えば２Ａドメインの存在によるポリタンパク質の切断後に、個々のタンパク質が等モル量または等モル量に近い量で発現されるように、自己プロセシング切断部位を介して結合されたタンパク質またはポリペプチドのコード配列を含む（プラスミドまたはウイルスベースの）あらゆるベクターを包含する。これらのタンパク質は、ベクターそれ自体か、相互にか、または自己プロセシング切断部位、例えばＦＭＤＶに対して、異種であり得る。

２Ａコード配列の小さなサイズは、さらに、ＡＡＶなどのコード配列について、限られたパッケージング能を有するベクターにおけるその使用を可能にする。２Ａ配列は２つのプロモーターの必要性をなくすため、ＡＡＶベクターの有用性はさらに拡大され得る。個々のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの、２Ａと関連する３つ以上のコード配列を含む単一のオープンリーディングフレームを駆動するプロモーターからの発現レベルは、ＩＲＥＳ配列または２つのプロモーターを使用して達成できる発現レベルと比較して、より等モルに近い。２つのプロモーターの排除により、各コード配列についての発現レベルの減少および／または低下を引き起こし得るプロモーター干渉も減少する。

１つの好ましい実施形態において、本発明によるベクターに含まれるＦＭＤＶ ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）を含むアミノ酸残基をコードする。もしくは、本発明によるベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１年）に記載されているように、他の２Ａ様領域（ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列またはバクテリアのＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからの２Ａ様ドメインを含むが、それらに限定されない）のアミノ酸残基をコードし得る。

本発明は、２Ａまたは２Ａ様ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列改変体、例えば親ヌクレオチドのそれと比較して、１つ以上のアミノ酸について異なるコドンを有する２Ａまたは２Ａ様ポリペプチドの核酸コード配列の使用を意図している。このような改変体は、本発明によって明確に意図され、包含される。２Ａペプチドおよび２Ａポリペプチドの配列改変体も、同様に本発明の範囲に含まれる。

比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによってか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８年）の同一性法によってか、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能なソフトウェアを使用したＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）のＢＬＡＳＴアルゴリズムによってか、または目視検査（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと）によって行うことができる。本発明において、比較のための最適な配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズムによって最も好適に実施される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．．Ｆ．ら（１９９０年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．．Ｆ．ら（１９９７年）も参照のこと。

本発明によると、自己プロセシング切断ポリペプチドをコードする配列改変体、およびネイティブ配列に８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドそれ自体もまた包含される。

ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列とが中〜高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照ヌクレオチド配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの溶融温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃下で起こり、「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０〜２５℃下で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性または厳密に近い同一性を有する配列を同定するために使用され得るが、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するのに使用される。

中程度のストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、第９章および第１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３年を参照のこと）。高ストリンジェンシー条件の一例は、約４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍＬの変性キャリアＤＮＡでのハイブリダイゼーションの後に、室温で２回、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで洗浄し、４２℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳでさらに２回洗浄することである。本明細書に記載の２Ａポリペプチドと同じ生物学的に活性なを有するポリペプチドをコードし、中から高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２Ａ配列改変体は、本発明の範囲に含まれると考えられる。

遺伝暗号の縮退の結果として、同じ２Ａまたは２Ａ様ポリペプチドをコードする数々のコード配列を産生することができる。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸であるアルギニンをコードする。あるいは、アルギニンは、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧでコードされる。したがって、コード領域におけるこのような置換が、本発明が対象としている配列改変体に該当することが理解される。

このような配列改変体が、高ストリンジェンシーの条件下で親配列にハイブリダイズする場合としない場合とがあることも、さらに理解される。これは、例えば、親ヌクレオチドにコードされるアミノ酸のそれぞれについて、配列改変体が異なるコドンを含む場合に起こり得る。それでも、このような改変体は、本発明によって明確に意図され、包含される。

自己プロセシング切断ペプチド配列の除去
２Ａ配列または２Ａ様配列などの自己プロセシングペプチドの使用に関連する一つの関心事は、第１のポリペプチドのＮ末端が、自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸、すなわち２Ａ由来アミノ酸残基を含むことである。これらのアミノ酸残基は、宿主に対して「異種」であり、組換えタンパク質がインビボで発現または送達された（すなわち、遺伝子治療においてウイルスベクターまたは非ウイルスベクターから発現されたか、インビトロで産生された組換えタンパク質として投与された）場合に、免疫応答を引き出し得る。さらに、２Ａ由来アミノ酸残基は、除去されない場合、産生細胞におけるタンパク質の分泌に干渉し、および／またはタンパク質構造を変化させ得、その結果、組換えタンパク質の最適レベルに満たない発現レベルおよび／または減少した生物学的に活性なをもたらし得る。本発明は、残存する自己プロセシング切断部位に由来するアミノ酸残基を切断の後に除去する手段として、ポリペプチドコード配列と自己プロセシング切断部位（すなわち、２Ａ配列）との間にタンパク質分解的切断部位が提供されるように設計された、遺伝子発現構築物を含む。

タンパク質分解的切断部位の例としては、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフリン切断部位が挙げられ、これは、内因性のサブチリシン様プロテアーゼ、例えばタンパク質分泌経路内のフリンその他のセリンプロテアーゼによって切断され得る。米国特許公報第２００５−００３４８２号に示されるように、本発明者らは、第１タンパク質のＮ末端の２Ａ残基が、第１ポリペプチドと２Ａ配列との間にフリン開裂部位ＲＡＫＲ（配列番号１１）を導入することによって効率的に除去され得ることを実証した。さらに、２Ａ配列と該２Ａ部位に隣接するフリン切断部位とをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドの使用は、２Ａ配列のみを含有するプラスミドよりも高いレベルのタンパク質発現をもたらすことが示された。この改良によって、２Ａ残基をタンパク質のＮ末端から除去する場合に、さらに長い２Ａ配列または２Ａ様配列もしくは他の自己プロセシング配列を使用することができるというさらなる利点が提供される。２Ａ配列または２Ａ様配列などのこのようなさらに長い自己プロセシング配列は、単一のプロモーターによって、２つ以上のポリペプチドのより良い等モル発現を助長し得る。

完全にヒト的な特性を有する抗体またはそのアナログを使用することは、有利である。これらの試薬は、非ヒト種起源の抗体またはアナログによって誘発される望ましくない免疫応答を回避する。自己プロセシングペプチド由来のアミノ酸残基に対して起こり得る宿主免疫応答に対処するために、タンパク質分解的切断部位のコード配列を（当該分野で既知の標準的な方法論を使用して）、発現されたポリペプチド、すなわち抗体から自己プロセシングペプチド配列を除去するように、第１タンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列との間に挿入することができる。これは、インビボで使用される治療抗体や診断用抗体に、特に有用である。

組換えＤＮＡ技術のベクターを使用して発現することができる当該分野で既知のあらゆる付加的なタンパク質分解的切断部位を、本発明の実施に使用することができる。ポリペプチドまたはタンパク質コード配列と自己プロセシング切断配列（例えば２Ａ配列）との間に挿入することができる例示的な付加的なタンパク質分解的切断部位としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
ａ）フリン切断部位：ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）；
ｂ）ファクターＸａ切断部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号１２）；
ｃ）シグナルペプチダーゼＩ切断部位：例えば、ＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号１３）；および
ｄ）トロンビン切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１４）。

本明細書に詳述するとおり、２Ａペプチド配列は、翻訳過程の間に免疫グロブリンまたはその他のタンパク質の両鎖の生成を助長する「切断」部位を提供する。ある例示的な実施形態では、第１タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖のＣ末端は、２Ａ配列それ自体に由来する約１３個のアミノ酸残基を含有する。残存するアミノ酸の数は、使用される２Ａ配列によって決まる。先に説明し実施例に示すように、フリン切断部位配列、例えばＲＡＫＲが第１タンパク質と２Ａ配列との間に挿入されている場合、２Ａ残基は第１タンパク質のＣ末端から除去される。しかし、質量スペクトルデータによると、ＲＡＫＲ−２Ａ構築物から発現された第１タンパク質のＣ末端は、フリン切断部位ＲＡＫＲ由来の２つの付加的なアミノ酸残基ＲＡを含有することが示されている。

１つの実施形態では、本発明は、これらの残存アミノ酸の除去方法およびその発現のための組成物を提供する。タンパク質のＣ末端からのこれらの付加的なアミノ酸の除去を提供する数多くの新規な構築物が設計されている。フリン切断は、コンセンサス配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒ（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸である）を有する切断部位のＣ末端で起こる。１つの局面では、本発明は、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ、カルボキシペプチダーゼＤ、ＥおよびＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）を含む）と呼ばれる酵素の群から選択される酵素を使用して、新たに露出した塩基性アミノ酸残基ＲまたはＫをタンパク質のＣ末端から除去する手段を提供する。ＣＰはタンパク質のＣ末端の塩基性アミノ酸残基を除去することができるため、塩基性アミノ酸ＲまたはＫのみを含有するフリン切断部位、例えばＲＫＫＲ（配列番号１８）、ＲＫＲＲ（配列番号１９）、ＲＲＫＲ（配列番号２０）、ＲＲＲＲ（配列番号２１）等に由来するすべてのアミノ酸残基を、ＣＰによって除去することができる。２Ａ配列とフリン切断部位とを含み、Ｃ末端に塩基性アミノ酸残基を有する一連の免疫グロブリン発現構築物が、切断および残基の除去の効率を評価するために構築された。例示的な構築物の設計は、以下のとおりである：Ｈ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲまたはＲＲＲＲ）−２Ａ−Ｌ鎖またはＬ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ、ＲＫＲＲ、ＲＲＫＲまたはＲＲＲＲ）−２Ａ−Ｈ鎖。

当業者には明らかであろうように、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖のＣ末端には塩基性アミノ酸残基（Ｋ）があるが（該鎖がカルボキシペプチダーゼでの切断を受けるようにしている）、免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖は、非塩基性アミノ酸Ｃで終わる。本発明のある好ましい実施形態において、フリン部位と２Ａ配列とを含む抗体発現構築物が提供され、ここで、免疫グロブリンＬ鎖は、翻訳の後に付加的なフリンアミノ酸残基がカルボキシペプチダーゼで切断されるように、５’から免疫グロブリンＨ鎖までである。

本発明の実施に使用される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、当業者に既知の標準的な方法論を使用して産生することができ、転写の方向に作動可能に連結された成分として、転写開始および終結配列、ならびに治療化合物またはその生物学的に活性なのある断片のコード配列を含む制御配列を含むように構築されている。これらの成分は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって５’および３’末端に結合している。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」とは、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンの放出、複製およびパッケージングについて、意図したように機能することを意味する。したがって、本発明のベクターに使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変化させられてもよく、もしくはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。ＡＡＶベクターは、アデノ関連ウイルス血清型（限定されないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８等を含む）に由来するベクターである。好ましいＡＡＶベクターは、全部または一部が欠失しながらも機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持している野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子を有する。表２に、遺伝子導入に使用される例示的なＡＡＶ血清型を示す。

通常、ＡＡＶ発現ベクターが産生細胞に導入され、その後にＡＡＶヘルパー構築物が導入されるが、ここで、ヘルパー構築物は、産生細胞内で発現されることができ、ＡＡＶベクターにはないＡＡＶヘルパー機能を補足するＡＡＶコード領域を含む。参照によって本明細書に明確に組み込まれている米国特許第６，５４８，２８６号に記載されるように、ヘルパー構築物は、通常はｐ５の後の開始コドンをＡＴＧからＡＣＧへと変異させることによって、巨大ＲＥＰタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現をダウンレギュレートするように設計され得る。これに続いて産生細胞内にヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターが導入され、ここで、ヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支援することができるアクセサリー機能を提供する。産生細胞は、次いで培養されて、ｒＡＡＶを産生する。これらの工程は、標準的な方法論を使用して行われる。本発明の組換えＡＡＶベクターを被包する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用して、当該分野で既知の標準的な技術によって製造される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号；同第６，０４０，１８３号；同第６，０９３，５７０号；および同第６，５４８，２８６号に見出すことができる。さらなる組成物およびパッケージング方法が、Ｗａｎｇら（米国特許公報第２００２／０１６８３４２号）に記載されており、当業者の知識の範囲内の技術が含まれる。

現在、約４０のＡＡＶの血清型が知られているが、新たな血清型や既存の血清型の改変体が今日でも依然として同定されており、本発明の範囲内に含まれると考えられる。Ｇａｏら（２００２年）、ＰＮＡＳ９９（１８）：１１８５４−６；Ｇａｏら（２００３年）、ＰＮＡＳ１００（１０）：６０８１−６；ＢｏｓｓｉｓおよびＣｈｉｏｒｉｎｉ（２００３年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６７９９−８１０）を参照のこと。特定の標的細胞の形質導入を最適化したり、特定の標的組織、例えば脳内で特定の細胞種を標的化したりするために、様々なＡＡＶ血清型が使用されている。様々なＡＡＶ血清型の使用は、悪性組織の標的化を助長し得る。１、２、４、５および６を含むＡＡＶ血清型は、脳組織に形質導入を来たすことが示されている。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２０００年）、ＰＮＡＳ９７（７）３４２８−３２；Ｐａｓｓｉｎｉら（２００３年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７（１２）：７０３４−４０）を参照のこと。特定のＡＡＶ血清型は、標的組織または細胞内でより効率的に標的化および／または複製し得る。形質導入の効率を増大させ、結果として導入遺伝子の発現の開始を早めるために、単一の自己相補的ＡＡＶベクターを、本発明の実施に使用することができる（ＭｃＣａｒｔｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１年８月；８（１６）：１２４８−５４）。

本発明の実施において、本発明による免疫グロブリンをコードするＡＡＶ構築物は、当業者によって日常的に使用されている標準的な技術を使用して、細胞内に導入することができる。

宿主細胞は、該宿主細胞内にＡＡＶＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子が安定的に保持されているパッケージング細胞でもあり得、もしくは、宿主細胞は、その中にＡＡＶベクターゲノムが安定的に保持されている産生細胞でもあり得る。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当業者が日常的に使用している標準的な技術を使用して、精製および処方される。

本発明の実施において、ｒＡＡＶビリオンを産生するための宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物および酵母が挙げられる。インビトロまたはエクスビボ発現のために、機能性の免疫グロブリンを発現するのに効果的なあらゆる細胞を使用することができる。タンパク質の発現に使用される細胞および細胞株の数々の例が、当該分野で既知である。

免疫グロブリンの発現に有用な細胞の例としては、さらに、哺乳類細胞、例えば線維芽細胞、非ヒト哺乳動物からの細胞、例えばヒツジ、ブタ、マウスおよびウシ細胞、昆虫細胞等が挙げられる。哺乳類細胞の具体例としては、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２０細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞およびＭＤＣＫ細胞が挙げられる。

宿主細胞は、プロモーターを誘導し、形質転換細胞を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された従来の栄養培地で培養される。哺乳類宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販の培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）は、通常、宿主細胞の培養に好適である。所与の培地は、一般に、必要に応じてホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、ＤＨＦＲ、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質、微量元素およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足されている。これ以外に必要ないかなる補足物も、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれていてよい。特定の細胞株について適切な培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、一般に当該分野において既知であり、提供される数々の細胞株の培養について、例えば＜「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｓｅａｒｃｈ ｃａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ」＞でオンラインで入手可能なＡＴＣＣカタログに、培養条件が提案されている。

本発明の免疫グロブリンをコードするベクターは、動物モデルやヒト被験体に該ベクターを送達するのに有効な数々の経路（例えば、皮内、静脈内、腫瘍内、脳内、門脈内、腹腔内、筋肉内、膀胱内等）のいずれを経由してインビボ投与されてもよい。投与経路によって、免疫グロブリンは、局所的または全身的に効果を発揮する。組織特異的プロモーター５’の免疫グロブリンオープンリーディングフレームへの使用は、非組織特異的プロモーターの制御下で発現される組換えタンパク質の発現に関して組織特異性が増大するという結果をもたらす。

例えば、本発明の免疫グロブリンをコードする組換えＡＡＶベクターのインビボ送達は、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺および皮膚を含むがこれらに限定されない様々な種類の器官に対して標的化され得る。組換えＡＡＶベクターのインビボ送達はまた、ウイルスの血清型、細胞の状態に基づいて様々な細胞種に標的化され得る。すなわち、癌細胞は、同じ細胞の非癌（通常の生理学的条件下での非分裂または制御された分裂状態）における場合の典型的な、または通常の生理学的状態から逸脱した細胞周期、細胞環境の低酸素状態もしくはその他の生理学的状態に基づいて標的化され得る。

エクスビボ遺伝子導入の場合、標的細胞は、本発明による免疫グロブリンをコードする組換えベクターおよび当該分野において周知の方法を使用して、実験室で宿主から取り除かれ、遺伝子操作される。

本発明の組換えベクターは、先に述べた様式を含むが、それらに限定されない従来の投与様式を使用して投与することができ、溶液および懸濁液、微小胞、リポソームおよび注射溶液または注入溶液を含むが、これらに限定されない様々な製剤の形態を取り得る。好ましい形態は、投与様式および治療用途によって決まる。

ラパログ制御された発現
様々な発現系、例えば制御された発現系が開発された。制御された発現系は、テトラサイクリン、ＲＵ４８６またはエクジソンなどのような単一の薬剤によって始動されるスイッチに依存するか、またはラパログのような化合物によって始動される三量体化に依存する。ラパログの一例であるラパマイシンは、経口投与可能な薬剤であり、したがって、インビボでもインビトロでも制御された遺伝子発現に有用である。ラパログ制御遺伝子発現系は、例えば米国特許第６，０１５，７０９号；同第６，１１７，６８０号；同第６，１３３，４５６号；同第６，１５０，５２７号；同第６，１８７，７５７号；同第６，３０６，６４９号；同第６，４７９，６５３号および同第６，６４９，５９５号に記載されている。

本発明のある実施形態において、ＡＲＩＡＤの制御技術の変更版が使用され、この技術は、それぞれが転写活性化因子またはＤＮＡ結合タンパク質に連結された２つの細胞間分子を連結するための小分子の使用に基づく。これらの成分が合わさると、免疫グロブリンの転写が活性化される。ＡＲＩＡＤの技術を使用する２つの主要な系としては、ホモ二量体化に基づく系と、ヘテロ二量体化に基づく系とが挙げられる（Ｒｉｖｅｒａら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、２（９）：１０２８−１０３２；Ｙｅら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８８−９１；Ｒｉｖｅｒａら、ＰＮＡＳ、Ｖｏｌ．９６（１５）：８６５７−８６６２、１９９９年）。

この系において、この二量体化誘導遺伝子制御系は、３つの個々の成分、すなわち活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および目的とする抗体発現カセットの下流の誘導プロモーターからなる。ある例示的な実施形態において、活性化ドメインは、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットからのカルボキシ末端と、大型のＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰドメイン（ＦＲＢ）との融合であるが、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子からの亜鉛フィンガー対と、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）の２つの写しに連結したホメオドメインとから構成される。誘導剤、例えばラパマイシンなどのラパログの存在下で、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは、それらのＦＫＢＰドメインとＦＲＢドメインとの相互作用によって二量体化され、免疫グロブリン遺伝子の転写活性化をもたらす。ある例示的な実施形態において、制御されたプロモーターは、８つの結合部位に次いで最小インターロイキン−２（８×ＺＦＨＤ１／ＩＬ−１２）プロモーターを含む。（例えば、Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５．１０５（４）：ｐ．１４２４−３０を参照のこと）。

実施例に記載するように、ラパログ制御系の３つの成分は、２つの個別のＡＡＶベクター構築物（図１および図２）にクローニングされている。第１のＡＡＶ構築物は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）最小プロモーターに融合した肝臓特異的マウストランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターを含む双方向性プロモーターを使用しており、それぞれ活性化タンパク質（ＦＲＢ−ｐ６５）およびＤＮＡ結合タンパク質（ＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰ）を発現する（図１）。これらの２つのプロモーターは、ＦＲＢ−ｐ６５およびＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰの反対の方向への肝臓特異的発現を可能にするＴＴＲエンハンサーエレメントを共有している。第２のＡＡＶ構築物は、タンパク質分解的切断部位、自己プロセシング切断部位（２Ａ）ならびに免疫グロブリンの重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖をコードするヌクレオチド配列を含む抗体発現カセットのヌクレオチド配列と作動可能に連結されたラパマイシン制御プロモーター８×ＺＦＨＤ１／ＩＬ−１２を含む（図２）。

（実施例１）
ラパマイシン制御ＡＡＶベクター構築物の構築
ラパマイシン制御プロモーターからの転写を活性化するために必要なトランス活性化調節エレメントを含むＡＡＶベクターを構築した。ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＴＦ１Ｎｃ（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００２．６（２）：ｐ．２３８−４２）を、ＡＡＶ２ＩＴＲ、ＦＲＢ−ｐ６５活性化ドメインおよびＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰ ＤＮＡ結合ドメインの源として使用した。ＩＲＥＳ配列を欠失させ、このプラスミドの中へ、以下のエレメントを挿入した：ＦＲＢ−ｐ６５コード配列の上流にマウストランスサイレチンｍＴＴＲプロモーター（Ｃｏｓｔａ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９８８．８（１）：ｐ．８１−９０）、ｍＴＴＲプロモーターとＦＲＢ−ｐ６５コード配列との間に合成イントロン：

、ＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰの下流に最小ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルｈＧＨｐＡ

１０２２ｂｐ断片に含まれるＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰコード配列は、その上流に最小ＳＶ４０プロモーターを配置され、その下流に最小ウサギβグロブリンポリＡ

を配置され、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＴＦ１Ｎｃに対して、ｈＧＨｐＡと共に、逆向きでｍＴＴＲＦＲＢ−ｐ６５カセットに挿入された（図１）。

ラパマイシン制御プロモーターの制御下で、自己プロセシング切断配列（２Ａ）およびタンパク質分解的切断部位を有し、ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体の全長重鎖および軽鎖をコードする第２のＡＡＶベクターを構築した（図２）。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域および定常領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して親ハイブリドーマ細胞のｃＤＮＡからクローニングした。ｃＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎの全ＲＮＡ精製キットを使用して、ハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡから逆転写酵素で合成した。モノクローナル抗体のヌクレオチド配列を、自動配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析し、複数の独立したＰＣＲ反応から得られた配列決定データから、コンセンサス配列を得た。

いずれかのラットｍＡｂの重鎖、２Ａ配列および抗体軽鎖をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲ伸張によって連結した。人工ＦＭＤＶ ２Ａオリゴヌクレオチドを、２Ａペプチド配列ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）に基づいて合成した。重鎖および軽鎖断片を、それぞれ全長抗体重鎖および軽鎖をコードするクローニングされたプラスミドから増幅した。ＰＣＲの間、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレオチダーゼ部位を、重鎖の５’末端および軽鎖の３’末端に加えた。融合した重鎖−２Ａ−軽鎖ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＥｃｏＲＩ部位に隣接して配置されたＡＡＶプラスミド骨格に挿入した。フリンコンセンサス切断配列の部類に属するタンパク質分解的切断部位ＲＡＫＲ（配列番号１１）を、自己プロセシング部位と重鎖コード領域の３’末端との間の２Ａ配列に導入した。ラパマイシン制御プロモーター８×ＺＦＨＤ１／ＩＬ−１２を含む２７７ｂｐ断片を、ＡＡＶ−Ｚ１２Ｉ−ｒｈＥｐｏ２Ｓ６から単離し（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２００２．６（２）：ｐ．２３８−４２）、同じ転写方向で免疫グロブリン発現カセットの上流に挿入した。キメライントロンｐＣ１を、ラパマイシン制御プロモーターと重鎖をコードするヌクレオチド配列との間にクローニングした。合成の際にポリペプチドの分泌を助長するために、改変体の形で、ネイティブなシグナルペプチド（リーダー）を、それぞれ重鎖または軽鎖に含めた。

該構築物は、５’から３’方向に以下を含む：５’ＡＡＶ ＩＴＲ、ラパマイシン制御プロモーター、抗体重鎖（Ｈ）のコード配列、付加的なタンパク質分解的切断部位コード配列（例えばフリン切断部位コード配列）、自己プロセシング切断配列のコード配列（例えば２Ａ配列）、抗体軽鎖（Ｌ）のコード配列、およびポリＡ配列（例えばＨ−Ｆ２Ａ−Ｌ）。すべての構築物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して十分に配列させた。

（実施例２）
インビトロでのＡＡＶプラスミドからのＤＣ１０１抗体の制御された発現
ラパマイシンを欠く対照と比較して増加したラパマイシン濃度の存在下で、６ウェルプレートで培養したＨｕＨ７細胞を使用して、制御されたＡＡＶプラスミドからインビトロでモノクローナル抗体を発現させた。細胞を、製造業者の説明書に従って、ＦｕＧＥＮ６トランスフェクションキット（Ｒｏｃｈｅ）によって、実施例１に記載の２つのＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、培養培地を新しい培地と交換し、さらに４８時間培養するために、細胞を培養器に戻した。次いで、細胞培養上清を回収し、ラットＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してＩｇＧ１を定量した。ラパマイシンの存在下で、プラスミドでトランスフェクトしたＨｕＨ７細胞の細胞培養上清中でラットのモノクローナル抗体タンパク質を検出した（図３）。対照的に、培養培地中ラパマイシンの非存在下では、２つのプラスミドでトランスフェクトした細胞の上清中で抗体は検出されなかった。さらに、抗体をコードするＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされなかった対照のウェルから得られた上清中に、検出可能なラットの抗体はなかった。

図３に示す結果は、誘導因子であるラパマイシンの存在下においてのみ、２つのＡＡＶプラスミドの同時トランスフェクションを使用してインビトロで全長抗体を発現することができることを示しており、ここで、抗体重鎖および軽鎖は、２Ａなどの自己プロセシング配列を使用して単一のオープンリーディングフレームとして発現される。さらに、ＤＣ１０１の発現は、誘導に使用されるラパマイシンの濃度によって決まると思われる。

（実施例３）
ＡＡＶの産生
本発明の１つの実施例において、制御されたＡＡＶベクターが提供され、このベクターは、抗ＦＬＫ−１抗体を発現するために単一のプロモーターを使用することによって、生物学的に活性なのある抗体を高いレベルで産生した。発現は、抗体重鎖−フリン切断部位−２Ａ−軽鎖（Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ）構築物を使用して達成され、これは、同じ細胞内での抗体重鎖および軽鎖の単一のオープンリーディングフレームとしての発現を可能にした。偽型ｒＡＡＶ血清型−８ベクターを、ｒＡＡＶベクター発現プラスミドのリン酸カルシウム・トリプルトランスフェクションと、ＡＡＶ−８血清型ヘルパープラスミドｐ５ｅ１８−ＶＤ２／８（Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２．３５９（６３９８）：ｐ．８４５−８）およびｐＸＸ−６ Ｇａｌａｎｉｓ，Ｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２００５．２３（２３）：ｐ．５２９４−５３０４）とを組み合わせて使用して、ＨＥＫ２９３細胞内で産生した。ビリオンを２つの連続的なＣｓＣｌ勾配上で単離し、力価を免疫グロブリン遺伝子に特異的な放射性プローブを使用してドットブロットで測定した。

（実施例４）
インビボでの免疫グロブリンの発現の制御
ラパマイシン制御ＡＡＶベクター構築物からの全長ラット抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１ ＩｇＧ１）のインビボでの制御された発現を、図４に示す。０日目に、実施例に記載する各ＡＡＶベクター約２．５×１０^１１ｖｐを、６〜８週齢の雌性ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕヌードマウスの尾静脈に同時静脈内投与した。マウスに、４０μｌのラパマイシン（ＤＭＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）、５％ＰＥＧ−４００（Ｓｉｇｍａ）および４５％Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ）中の３ｍｇ／ｍＬの５０％ラパマイシンストック）を腹腔内注射し、第２１、２４、２８、３１、３５および３８日目に３ｍｇ／ｋｇの用量を送達した。マウスを、血中濃度を測定するために予定された間隔をおいて交互の眼窩後穿刺によって出血させ、様々な時点で血清試料中に存在するＤＣ１０１抗体の量（ｍｃｇ／ｍＬ）を、ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。

図４に示すように、ラパマイシンの投与後１週間以内にＤＣ１０１の発現が誘導されたが、ベクターおよびビヒクルのみを投与された対照動物では、実質的に発現は観察されなかった。ラパマイシンの複数回投与は、さらに抗体の発現を誘導し、１ｍｇ／ｍＬを超えるＤＣ１０１の濃度が、ラパマイシンの用量４回分の後、すなわち第３４日および第４１日に観察された。ラパマイシンの最終の投与（第５５日目）後約２週間にわたって、測定可能な発現が検出できた。これらのデータは、インビボにおける組換え抗体の厳密に制御された誘導可能な発現を実証している。

図１は、ラパログ制御タンパク質発現を指示するためのトランス活性化調節エレメントをコードするＡＡＶベクターの概略図である。該ベクターは、肝臓特異的マウストランスサイレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターに作動可能に連結されたラパマイシン結合ｐ６５−ＦＲＢ融合タンパク質（活性化ドメイン）と、最小ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されたラパマイシン結合亜鉛フィンガー融合タンパク質ＺＦＨＤ１−２×ＦＫＢＰ（ＤＮＡ結合ドメイン）とを含む。 図２は、ラパマイシン制御ハイブリッドＺＦＨＤ１／ＩＬ−２プロモーターに作動可能に連結された、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖および免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖を発現するための、タンパク質分解的切断部位（フリン切断部位；「Ｆ」）と口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロセシング部位（２Ａ）とを含むＡＡＶ発現カセットの概略図である。ラパマイシンは、ＤＮＡ結合ドメインの各ＦＫ５０６結合タンパク質ドメイン（ＦＫＢＰ）に結合し、これに、大型のＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰドメイン（ＦＲＢ）と結合したラパマイシンとの間の相互作用によって、２つの活性化ドメインが二量体化する。ハイブリッドＺＦＨＤ１／ＩＬ−２プロモーターからのｐ６５活性化転写は、亜鉛フィンガーＺＦＨＤ１ドメインとの相互作用によって、プロモーター内のＺＦＨＤ１部位への結合時に起こる。 図３は、ラパマイシンの非存在下あるいは０．３、１、３、１０または３ｎＭのラパマイシンの存在下での、図１および図２のＡＡＶプラスミドでの同時トランスフェクション後の、ＨｕＨ７細胞における全長ラット抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１ ＩｇＧ１）の、厳密に制御されたラパマイシン依存性発現を示す。 図４は、全長ラット抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１ ＩｇＧ１）の、ラパマイシン依存性のインビボ発現を示す。０日目に、図１および図２に示す約２．５×１０^１１ｖｐの各ＡＡＶベクターを、ＮＣＲヌードマウスの静脈内に同時投与し、次いで、第２１、２４、２８、３１、３５および３８日目に、３ｍｇ／ｋｇ体重のラパマイシンまたは対照ビヒクルを、腹腔内投与した。指定の日にマウスを出血させ、選択された時点で血清試料中に存在するＤＣ１０１抗体の濃度（ｍｃｇ／ｍＬ）を、ＥＬＩＳＡによって測定した。

Claims (15)

1. 組換え免疫グロブリンの発現のためのＡＡＶベクターであって、５’から３’方向に、免疫グロブリン分子またはその断片の第１鎖のコード配列に作動可能に連結されたラパログ制御プロモーター、タンパク質分解的切断部位、２Ａ自己プロセシング切断部位をコードする配列および免疫グロブリン分子またはその断片の第２鎖のコード配列を含み、該自己プロセシング切断部位をコードする配列が、該免疫グロブリン分子の第１鎖のコード配列と第２鎖のコード配列との間に挿入されている、ＡＡＶベクター。
2. 前記２Ａ配列が、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
3. 前記２Ａ配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９で示される配列からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むペプチドをコードする、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
4. 前記２Ａ配列が、アミノ酸残基ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）、ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）またはＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）を含むオリゴペプチドをコードする、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
5. 前記免疫グロブリン分子またはその断片の第１鎖のコード配列が、免疫グロブリン重鎖をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
6. 前記免疫グロブリン分子またはその断片の第１鎖のコード配列が、免疫グロブリン軽鎖をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
7. 前記コード配列が、全長のコード配列である、請求項５または６に記載のＡＡＶベクター。
8. 前記タンパク質分解的切断部位が、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有するフリン切断部位である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
9. 前記重鎖免疫グロブリンコード配列および軽鎖免疫グロブリンコード配列が、等モル比で発現される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
10. シグナル配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
11. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
12. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターによって形質導入された細胞によって産生される、組換え免疫グロブリン分子。
14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターによって形質導入された、宿主細胞。
15. 組換え免疫グロブリン分子を産生するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターの使用であって、
    ａ．前記ベクターによって宿主細胞に形質導入する工程；および
    ｂ．該形質導入された宿主細胞中で該組換え免疫グロブリンを発現させる工程であって、前記第１の免疫グロブリンコード配列および前記第２の免疫グロブリンコード配列が、実質的に等モル比で発現される、工程；
    を含む、使用。

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