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JP2009514536A - Ｃｄ４０リガンド融合蛋白質ワクチン - Google Patents

Ｃｄ４０リガンド融合蛋白質ワクチン Download PDF

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JP2009514536A JP2008539106A JP2008539106A JP2009514536A JP 2009514536 A JP2009514536 A JP 2009514536A JP 2008539106 A JP2008539106 A JP 2008539106A JP 2008539106 A JP2008539106 A JP 2008539106A JP 2009514536 A JP2009514536 A JP 2009514536A
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Abstract

感染性因子抗原等の外来抗原を含む種々の抗原のいずれかに対する免疫応答を生成させる方法が提供される。一般に，本発明の方法は，分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットをコードする発現ベクターを投与し，ここで，融合蛋白質は外来抗原およびＣＤ４０リガンドを含み，さらに，コードされる融合蛋白質も投与することを含む。別の方法においては，外来抗原に対する免疫応答は，ベクターを投与することなく，コードされる融合蛋白質を用いて引き起こされる。本発明の方法を用いて，インフルエンザウイルス等の感染性因子に対して個体を免疫感作することができる。高齢の個体において免疫応答を得る方法も記載される。

Description

本発明は，一般にワクチンの分野に関する。特に，本発明は，ＣＤ４０リガンドと抗原との融合蛋白質を用いて，外来蛋白質または感染性因子に対する免疫を発現させることに関する。
発明の背景についての以下の議論は，単に読者が本発明を理解することを助けるために提供され，本発明に対する従来技術を記述または構成すると認めるものではない。
インフルエンザは急性の伝染性の病気であり，しばしば，気道の炎症，発熱，悪寒，筋肉痛，衰弱および倦怠感により特徴づけられ，インフルエンザウイルスのＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーにより引き起こされる。感染は軽い病気から重い病気まで引き起こすことができ，時には死亡につながりうる。
インフルエンザウイルスはＡ型，Ｂ型およびＣ型の３つの型に分類される。Ａ型インフルエンザは，パンデミクスの原因であり，広い地理的範囲に広がり，人口の大部分に影響を及ぼす。Ａ型インフルエンザウイルスは鳥および哺乳動物を含む多くの動物（例えば，ヒト，イヌ，ウマ，ウシ，ヒツジ，ブタおよびアザラシ）に感染することが知られている。対照的に，Ｂ型インフルエンザは，通常はヒトにのみ感染する傾向がある。Ａ型およびＢ型インフルエンザは，毎年生ずるインフルエンザ関連疾患の増加，入院および死亡の原因である。Ｃ型インフルエンザは最も懸念が少ない。ヒトへの感染は軽い呼吸困難を引き起こすかまたは全く症状がない。
Ａ型インフルエンザウイルスはさらに株に分類される。株の名前は，いずれもウイルス表面に存在する２つの抗原性蛋白質であるヘマグルチニン（“ＨＡ”）およびノイラミニダーゼ（“ＮＡ”）の相違を識別することにより決定される。これらの２つの蛋白質の配列の急速な変化（“抗原性シフト”と称される）は，免疫原性が毎年変化し，毎年新たなワクチンが必要となる主な原因である。抗原性シフトおよび同時に起こる株変化の例は明確である：１９１８年と１９５７年の間にはＨ１Ｎ１株が優勢であり；１９５７年と１９６８年の間にはＨ２Ｎ２株が優勢であり；次に，１９６８年からは，Ｈ３Ｎ２ウイルスが優勢である。最近，１９９７年に鳥インフルエンザのＨ５Ｎ１株がヒトに感染することが見いだされた。抗原性シフトに加えて，インフルエンザウイルスの抗原性の特性も，“抗原性ドリフト”，すなわちウイルス進化のゆっくりした漸次的プロセスによりゆっくり変化しうる。ＨＡ配列の抗原性の変動（ドリフト）が見られ，例えば，ヒト臨床試験において，ウイルス株はワクチンにより誘導される免疫から回避した。
“抗原性シフト”に関連する急速な配列変化の１つの原因は，再集合体ウイルス株の形成である。ブタはヒトおよび鳥インフルエンザ株の両方に感染することができ，ブタの中でヒトと鳥株との間のＲＮＡ鎖の交換が生じうる。これらの“再集合体”ウイルスは，ヒト種に感染することができ，インフルエンザの年ごとに毎年の流行の原因となっている。すなわち，抗原性シフトによって生ずるＨＡおよびＮＡ蛋白質の急速な変化により古いインフルエンザウイルスワクチンが無効になる。
ヘマグルチニン（“ＨＡ”）は，抗原性シフトにより影響を受ける蛋白質の１つであり，インフルエンザウイルスの表面に見いだされる抗原性糖蛋白質である。ＨＡは，宿主細胞レセプター上のＮ−アセチルノイラミン酸またはシアル酸に結合することによりウイルスを標的細胞に固定するよう機能する。ＨＡは２つのサブユニット，すなわちＨＡ１およびＨＡ２から構成される。ＨＡ２はウイルス膜アンカリングドメインであり，ＨＡ１は宿主細胞レセプターへの結合を担う。上述したように，ＨＡは高度に変異性であり，主としてＨＡ１における変動は，免疫系を回避する能力を付与するウイルス抗原の可変性の鍵となる原因である。現在のところ，１６−２０種の異なるＨＡ変種が知られている。Ｈ１，Ｈ２およびＨ３は，優勢なヒトインフルエンザサブタイプであるが，Ｈ５およびＨ７サブタイプは鳥類の種に広まっている。
ノイラミニダーゼ（“ＮＡ”）もまたウイルス表面に存在し，グリコシル基の末端シアル酸残基の除去を触媒し，このことによりヘマグルチニンの潜在的レセプターを破壊する。ノイラミニダーゼは，おそらく，ウイルスの凝集を防止して，ウイルスが細胞から細胞により効率的に広がることを促進するのに必要である。ノイラミニダーゼ蛋白質配列もまた高度に可変性であり，現在９種の異なるノイラミニダーゼ変種が知られている。したがって，この蛋白質配列の変化もまた，抗原性のシフトにおいて役割を果たしている。
ウイルスインフルエンザ表面上に存在する別のウイルス蛋白質はマトリクスプロテイン２（“Ｍ２”）である。これはプロトンを選択的にウイルスに入れることができるイオンチャネル蛋白質である。ウイルスが細胞内に入った後，プロトンの流入はウイルス蛋白質外殻の除去の鍵である。Ｍ２蛋白質は，３つのドメイン，すなわち，ウイルス外部に存在する２３アミノ酸領域（細胞外ドメイン），ウイルス内部の５４アミノ酸領域（細胞質ドメイン）および１９アミノ酸の貫膜ドメインから構成されるホモテトラマーである。Ｍ２はウイルス表面で低レベルで発現されるが，インフルエンザ感染細胞では高レベルで存在する。Ｍ２蛋白質配列は，ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼと比較して安定である。実際，Ｍ２の２３アミノ酸の細胞外ドメインは，多くの既知のインフルエンザ株でよく保存されている（例外としては，Ａ／ＰＲ／８／３４，Ａ／ＢｒｅｖｉｇおよびＭｉｓｓｉｏｎ／１／８がある）。この蛋白質は通常は免疫原性ではないが，Ｍ２の細胞外ドメインと，Ｂ型肝炎ウイルスコア蛋白質等の“アジュバント蛋白質”から作成されたキメラ分子が強い免疫応答を誘導したことが示されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５ ３３７：１４９−１６１；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００２ ７０：６８６０−７０）。
アジュバント（例えば，解毒化エンテロトキシンアジュバント）とともに経鼻投与されたＭ２ＨＢコア粒子は，２−４月齢のＢａｌｂＣマウスをヒトインフルエンザウイルスのチャレンジから防御した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５ ３３７：１４９−１６１）。宿主の範囲の決定に重要なＭ２（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９ ７３：３３６６−３３７４）は，抗体が生成しない程度に低いレベルでウイルス中に存在する。ＨＡに対する抗体はインフルエンザウイルス感染を予防することが示されているため，ＨＡはワクチンの標的とされてきた。
インフルエンザのＨ５Ｎ１株に対する市販のヒトワクチンはまだ開発されていないが，１９９７年に鳥インフルエンザウイルスのＨ５株がヒトに直接感染したことがわかった。感染者の６／１８が死亡した。そのとき以来，２００３年に香港で（２名死亡，３症例），２００４年にベトナム／タイで（３９の感染症例のうち２８名死亡（Ｋａｓｈ Ｊ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：９４９９−９５１１（２００４）；Ａｐｉｓａｒｎｔｈａｎａｒａｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０（２００４））で発生した。２００５年には，Ｈ５Ｎ１に感染したヒトの７９／１５０が死亡した。感染したＨ５Ｎ１ウイルスの配列の９９％以上が鳥であり，家禽からヒトへの直接の伝染が示唆された（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ ２９３：１８４０−１８４２；Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００ ７４：１４４３−１４５０）。鳥インフルエンザウイルスが鳥からヒトに直接ジャンプする能力を獲得すれば，パンデミックの可能性がある。これが起こるためには，ウイルスはエアロゾル中でヒトからヒトに伝染することができなければならない。伝染が鳥：ヒトからヒト：ヒトに遷移することによりパンデミックが発生することは，１９１８年にＨ１Ｎ１株において最初に確認された。その結果は，米国で６００，０００人以上，世界で４０００万人以上の死亡であった（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００４ ７８：９４９９−９５１１）。統計は，死亡のほとんどが混雑した状態で暮らす若い個体（第１次世界大戦の軍人）に限定されていたことを示す。
Ｈ５Ｎ１株はヒトに感染することが報告されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００ ７４：１４４３−１４５０）。このウイルスがヒトからヒトへ広がる能力を獲得すれば，米国におけるその影響は２００，０００名以上の死亡，７００，０００名以上の入院，４０００万人以上の外来患者，および１０００億ドルの経済的影響があると見積もられている（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９９ ５：６５９−６７１）。鳥インフルエンザウイルスに感染したと考えられる個体の死亡の報告の増加についての最近の明らかな傾向は，世界中の政府に懸念を引き起こしている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００４ ７８：９４９９−９５１１；Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００４１０；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００３ ２０８：２７０−２７８；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９ ２６０：１６６−１７５）。
マウスおよびフェレットを用いてＨ５Ｎ１鳥インフルエンザに対するワクチンの効力の試験が実施されたが，フェレットにおける種々のヒト株の病原性はヒトにおいて見られるものと近かった（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５ ７９：２１９１−２１９８）。種々の株の病原性がＨＡ蛋白質構造と関連づけられてきた（同上）。１９９７年の香港の症例の後，Ｈ５Ｎ１株に対するワクチンについて２つの戦略が試験された。第１には，サブユニットＨ５ワクチンはヒトにおいて免疫原性ではなさそうであることが発見された（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００５ １９１：１２１３−１２１５；Ｖａｃｃｉｎｅ ２００３２１：１６８７−１６９３）。しかし，ＭＦ５９アジュバントを加えると抗体応答が増加した（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００５ １０２：１２９１５−１２９２０）。第２のアプローチでは，多価ワクチン（Ｈ３Ｎ１およびＨ５Ｎ１）が用いられたが，これは同じく有効ではないことが立証された（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９７ ３：２０９４−２０９８）。
最近，ＨＡ ＤＮＡワクチンがマウスをＨ５Ｎ１株から保護することが示され（ｃｌｉｎｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ／ｇｕｉ／ｓｈｏ／ＮＣＴ００１１０２７９；ｊｓｅｓｓｉｏｎｉｄ＝７４３２５９ＦＣＣ０Ａ６８０６０３ＥＡ），現在，ヒトにおいてＨ９Ｎ２鳥インフルエンザに対する免疫応答を評価する臨床試験が行われている（Ｖａｃｃｉｎｅ ２００２ ２０：１０９９−１１０５）。Ｈ９Ｎ２の研究は，筋肉内注射により投与した低温に適合した選別された脆弱化ウイルスワクチンを用いて行われている。この研究はＨ５Ｎ１免疫応答に対する洞察を与えることが期待されている。さらに，Ｈ５ＨＡを発現するバキュロウイルスから得たワクチンを１４７名の成人に筋肉内投与する試験が行われた。１回の注射後に２３％の抗体応答が，２回の注射後に５２％の応答が認められた（Ｌａｎｃｅｔ ２００４３５７：１９３７−１９４３）。
高齢者は，インフルエンザ感染に関して特に高いリスクを有しており，可能性のある致死的な感染の合併症，例えば肺炎または気管支炎を予防するために，高齢の個体にはインフルエンザに対するワクチン接種が推奨されている。高齢者における高いリスクの１つの原因は，免疫系の機能が年齢とともに低下することである。例えば，抗原に暴露されていないナイーブのＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の数が減少する。さらに，実年齢が高くなるにつれてナイーブ細胞と記憶ＣＤ８／ＣＤ４細胞との比率が低下する。さらに，ＣＤ４細胞は，正常に機能しなくなり，量的なおよび機能性の両方の欠損を獲得し，例えば，ＣＤ４細胞の表面上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のレベルが低下し，ならびに活性化の後にＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）がＣＤ４細胞の表面上で発現される速度が一時的に遅くなる。したがって，感染または慣用のワクチン接種後に高齢者のシステムが生成することができる抗体の量は少ないであろう。
試験により，現在のワクチン接種の方法は，最もよくても中程度にしか有効ではないことが示されている。通常は，ヒトインフルエンザウイルスの３つの株を卵で成長させ，精製し，次に化学的に不活性化する。ワクチンを接種した個体における中和抗体の誘導を応答のエンドポイントとして用いると，ワクチンに対する応答は６５−７０％の範囲である（Ｌａｎｃｅｔ ２００４ ３５７：１９３７−１９４３）。５５歳以上でワクチンを接種した個体では，応答は４倍低い。
ＣＤ４０リガンドに融合された抗原を含む融合蛋白質をコードする発現ベクターを含むワクチンが記載されている。例えば，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３，表題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願）を参照。
発明の概要
本発明にしたがえば，ＣＤ４０リガンドおよび外来抗原を有する融合蛋白質に対する免疫応答を生成する方法が提供される。ある態様においては，融合蛋白質は，融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとして投与される。別の態様においては，融合蛋白質は，蛋白質として直接投与される。ベクターおよび蛋白質を投与するワクチン接種計画も提供される。
すなわち，第１の観点においては，インフルエンザウイルスによる感染に対して防御するための新規なワクチンが提供される。インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする発現ベクターを投与することによりインフルエンザ抗原に対する免疫応答が達成される。
インフルエンザ抗原は，個体または動物においてそれに対する免疫応答を生ずることができる任意のインフルエンザ抗原であることができる。好ましい態様においては，インフルエンザ抗原は，哺乳動物インフルエンザウイルス抗原（例えば，ヒトインフルエンザ抗原）または鳥ンフルエンザウイルス抗原である。別の態様においては，インフルエンザ抗原は，哺乳動物と鳥のインフルエンザウイルス抗原の組み合わせ，例えば，ヒトと鳥のインフルエンザウイルス抗原の組み合わせであってもよい。インフルエンザ抗原は，好ましくはインフルエンザウイルス蛋白質または少なくとも１つの抗原決定基を含むそのフラグメントである。
好ましい態様においては，融合蛋白質のインフルエンザ抗原はマトリクスプロテイン２（“Ｍ２”）イオンチャネル蛋白質である。Ｍ２蛋白質は，ウイルスの指向性に関与するテトラマーの２３アミノ酸長さのＩＩＩ型貫膜蛋白質であり，インフルエンザウイルス中ではほとんど検出されないが，インフルエンザウイルス感染細胞では高レベルで発現されている。ＨＡ蛋白質とは対照的に，Ｍ２は異なるインフルエンザ株の間で長年の間安定な配列を有する。
本発明のワクチン設計においては，ＣＤ４０リガンドと融合されたときのＭ２抗原の不変の性質のため，現存のワクチンとは異なり，抗原性ドリフトから生ずるインフルエンザの種々の株に対して有効な“万能”インフルエンザワクチンが提供されると考えられる。このことは，各年にヒトインフルエンザ遺伝子再集合ウイルスが存在するため，一旦パンデミックが生じれば，鳥インフルエンザウイルスの既知のユニークＨＡ抗原に対するワクチンを製造する時間がないという点において，特に重要である。
１つの態様においては，融合蛋白質のＭ２抗原はＭ２貫膜ドメインのすべてまたは実質的にすべてを欠失している。好ましくは，融合蛋白質のＭ２抗原は，Ｍ２の細胞外ドメインのすべてまたはＭ２の細胞外ドメインの少なくとも抗原性フラグメントを含む。
別の態様においては，インフルエンザ抗原は少なくとも２つのウイルスインフルエンザ蛋白質からの少なくとも１つの抗原決定基を有するキメラインフルエンザ抗原であってもよい。そのような異なる抗原は，同じ抗原の変種（例えば，Ｈ５Ｎ１，Ｈ２Ｎ２，Ｈ３Ｎ２またはＨ１Ｎ１株等の異なるウイルス株のヘマグルチニン）であってもよく，少なくとも２つの異なるウイルスインフルエンザ蛋白質（例えば．ＨＡおよびＭ２）の少なくとも１つの抗原決定基を有するキメラインフルエンザ抗原であってもよい。
ある態様においては，インフルエンザ抗原はウイルス蛋白質またはそのフラグメントであってもよい。例えば，ウイルス蛋白質またはフラグメントは，ヘマグルチニン（“ＨＡ”），ノイラミニダーゼ（“ＮＡ”），Ｍ２，またはＨＡ，ＮＡまたはＭ２の任意の組み合わせであってもよい。インフルエンザ抗原は，以下を含むことができる：ウイルス抗原（例えば，ＨＡ，ＮＡまたはＭ２）の細胞外ドメインまたはドメインフラグメント；細胞質ドメインまたはドメインフラグメント；または同じ蛋白質からの細胞外および細胞質配列の組み合わせ。ある態様においては，インフルエンザ抗原は，異なるインフルエンザ蛋白質の任意の免疫原性の組み合わせを有する蛋白質キメラ（例えば，ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはＭ２蛋白質またはこれらのフラグメントの任意の組み合わせ）であってもよい。インフルエンザ蛋白質は，防御が求められる任意の株由来のものであることができる。ある態様においては，インフルエンザ抗原は，Ｈ５Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，Ｈ１Ｎ１またはＨ２Ｎ２インフルエンザ株由来のものであることができる。ある態様においては，インフルエンザ抗原は，ＨＡとＭ２蛋白質またはこれらのフラグメントのキメラである。別の態様においては，インフルエンザ抗原は，１またはそれ以上のインフルエンザ株（例えば，Ｈ５Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，Ｈ１Ｎ１またはＨ２Ｎ２）のＨＡとＭ２細胞外ドメイン領域とのキメラであってもよい。
本明細書において用いる場合，“抗原”とは，抗体の結合部位またはＴ細胞抗原レセプターの結合部位により特異的に結合される任意の外来物質である。抗原はまた，免疫応答を引き起こすことができる場合には免疫原であり，そうでない場合にはハプテンである。
本明細書において用いる場合，“抗原決定基”とは，複雑な抗原性分子または粒子上の単一の抗原性部位またはエピトープであって，抗体またはＴ細胞レセプターと相互作用する分子の最小部分を表す。抗原決定基は直線状でもよく，不連続であってもよい。
インフルエンザ抗原をコードする融合蛋白質は，ベクターの投与の前に，同時に，または後に投与することができる。好ましくは，融合蛋白質はベクターの後に投与する。ベクターによりコードされ融合蛋白質中に存在するインフルエンザ抗原の配列は，同じであっても，異なっていてもよい。異なる場合には，好ましくはこれらの２つは少なくとも１つの抗原決定基を共通して有する。
１つのアプローチにおいては，融合蛋白質転写ユニット中のインフルエンザ抗原をコードする配列は，ＣＤ４０リガンドをコードする配列の５’側にある。別のアプローチにおいては，融合蛋白質転写ユニット中のＣＤ４０リガンドをコードする配列はインフルエンザ抗原をコードする配列の５’側にある。好ましい態様においては，ＣＤ４０リガンドはその貫膜ドメインのすべてまたは一部を欠失している。
別の観点においては，本発明は，インフルエンザウイルスによる感染に対して個体を免疫する方法を提供する。この方法は，関与するインフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを含む発現ベクターを投与することを含む。また，ウイルスに関連するインフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドをコードする融合蛋白質を，ベクターの投与の前に，同時にまたは後に投与してもよい。好ましくは，融合蛋白質は，ベクターの後に投与する。この方法においては，ベクターにコードされるインフルエンザ抗原は，それに対する防御が求められるインフルエンザウイルスに交叉反応するよう選択される。この方法により生成する免疫応答は，細胞媒介性および液性（抗体応答）の両方である。抗体応答は感染性インフルエンザウイルスを中和することができる。
好ましい態様においては，発現ベクターはウイルス発現ベクターであっても非ウイルス発現ベクターであってもよく；発現ベクターはアデノウイルスベクターであってもよく；ベクターは皮下に投与することが有利であってもよく；ベクターはその後の機会（単数または複数）に投与して免疫応答を高めてもよく；シグナル配列を融合蛋白質の上流に配置して融合蛋白質を分泌させてもよく；抗原に対する免疫は長く続くことができ，抗原発現細胞に対する細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成および抗原に対する抗体の産生を伴い；転写ユニットは抗原とＣＤ４０リガンドとの間にリンカーをコードする配列を含んでいてもよく；適当なリンカーは種々の長さおよび組成であることができ；発現ベクターは転写ユニットの転写を制御するためにヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーを含んでいてもよく；ＣＤ４０リガンドはヒトＣＤ４０リガンドであってもよい。
さらに別の観点においては，本発明は，抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする発現ベクターを投与することにより，高齢の個体を効率よく免疫する方法を提供する。本発明の方法を用いて他の免疫感作方法と比較して改良された免疫応答を示すことができる高齢の個体は，少なくとも５０歳であり，さらに少なくとも５５歳または少なくとも６０歳である。
本発明の方法による改善された免疫応答の達成は，他の免疫感作方法とは異なり，ＣＤ４０リガンドと融合された種々の抗原の任意のものに対して適用可能である。そのような抗原としては，癌抗原（腫瘍関連または腫瘍特異的）または感染性因子抗原が挙げられる。感染性因子抗原は，細菌，ウイルス，真菌，原生動物などであることができる。ウイルス抗原は，上述したように，インフルエンザ抗原であることができる。ウイルス抗原はヒトパピローマウイルスからのものであってもよい。ウイルス抗原はヒトパピローマウイルスのＥ６またはＥ７蛋白質であってもよい。
高齢者においては，若い健康な個体と比較して，活性化の後のＣＤ４細胞の表面におけるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の発現レベルが非常に低いため，伝統的なワクチン接種は，高齢者にはあまり有効ではないと考えられる。この機能的ＣＤ４欠失のみに基づけば，組換え抗原および不活性化ウイルス粒子ワクチンを用いる慣用的なワクチン接種の後に生成する抗体のレベルは，アジュバントを用いたとしても，高齢の個体では若い個体より低いと考えられる。さらに，高齢の個体において免疫応答が低いことは，ＣＤ４細胞によるＣＤ４０Ｌの発現が減少しているためかもしれないと考えられる。本発明の方法にしたがう発現ベクターを投与すると，ベクター感染細胞から融合蛋白質が放出された後に，樹状細胞（ＤＣ）のインビボ活性化および抗原負荷が生じたと考えられる。融合蛋白質からのＣＤ４０リガンドをＤＣに負荷することは，ＣＤ４０Ｌが不十分な高齢の個体においてＣＤ４細胞をバイパスする。このワクチンベクターを２回皮下注射すると，１年以上にわたって維持され，かつＣＤ４細胞に非依存的な免疫応答が誘導されることが見いだされた。
さらに別の観点においては，本発明は，個体においてインフルエンザ抗原に対して免疫応答を生成することについての本明細書の記載にしたがって，ベクターおよびこれにコードされる融合蛋白質を提供する。
さらに別の観点においては，若い健康な個体と比較してＣＤ４０リガンドのレベルが低下しているＣＤ４Ｔ細胞を有する個体の，癌抗原または感染性因子抗原に対するワクチン接種に対する免疫応答性を増加する方法が提供される。この方法は，個体に癌または感染性因子抗原およびＣＤ４０リガンドを有する分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを有する有効量の発現ベクターを投与することにより達成される。
別の観点においては，５０歳より上の個体を外来抗原に対して免疫する方法が提供される。この方法は，インフルエンザＡならびに鳥インフルエンザの予防が必要である主要な集団である高齢者に，インフルエンザに対する免疫を生じさせるのに特に適している。
別の観点においては，本発明は，個体において外来抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。この方法は，融合蛋白質をコードする発現ベクターを投与することなく，個体に有効量の融合蛋白質を投与することにより行われ，ここで，投与は反復され，融合蛋白質は抗原およびＣＤ４０リガンドを含む。外来抗原は，インフルエンザ等の感染性因子のものであってもよい。融合蛋白質の外来抗原は，グリコシル化されていてもよく，グリコシル化されていなくてもよい。この方法により生ずる免疫応答は，細胞媒介性および液性（すなわち抗体応答）の両方でありうる。抗体応答は感染性インフルエンザウイルスを中和することができる。
本明細書において用いる略号には，“Ａｄ”（アデノウイルス）；“ｓｉｇ”（シグナル配列）；および“ｅｃｄ”（細胞外ドメイン）；“ｓｃ”（皮下）が含まれる。
これらのおよび他の態様を以下に詳細に説明する。
図面の簡単な説明
図１は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３６３５８，配列番号１）。
図２は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質（Ｎ末端１６アミノ酸シグナルペプチドなし）のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３６３５６，配列番号２）。
図３は，Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ４３２７６，配列番号３）。
図４は，Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質のアミノ酸配列を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０１０８５，配列番号４）。
図５は，Ａ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質のフラグメント，およびＢ）Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のフラグメントをコードするヌクレオチド配列を示す（それぞれ配列番号５および６）。
図６は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチンを接種したマウスにおける，Ｅ７陽性ＴＣ−１およびＥ７陰性ＥＬ−４細胞の成長を示す。Ｅ７陽性ＴＣ−１細胞（菱形）；Ｅ７陰性ＥＬ−４細胞（四角）。
図７は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種したドナーマウスからの脾臓Ｔリンパ球を注射したマウスにおける，Ｅ７陽性ＴＣ−１細胞対Ｅ７陰性ＥＬ−４細胞の成長を示す。
図８は，試験マウスの注射後の生存日数のパーセントを示す。まず試験マウスに，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチンを接種したマウスからのＣＤ８＋細胞（黒菱形），ＣＤ４細胞（三角）または細胞なし（四角）を注射した。７日後，試験マウスにＥ７陽性Ｔｃ−１細胞を注射した。
図９は，種々のベクターコンストラクトを注射した後のＥ７特異的Ｔ細胞応答のレベルを示す。
図１０は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチンを接種したマウスおよびワクチン接種していない若年および老齢マウスにおける，インターフェロンγおよびＩＬ４を産生する脾臓細胞のレベルを示す。
図１１は，免疫していない（対照）およびＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターで免疫した老齢動物のＣＤ８集団抗原陽性腫瘍における抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
図１２は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種した老齢動物およびワクチン接種していない若年動物における，腫瘍結節に浸潤したＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
図１３は，若年および老齢マウスへのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターのワクチン接種により誘導された細胞毒性Ｔ細胞活性を種々のエフェクター対標的比で示す。
図１４は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種した老齢および若年マウスにおけるＥ７腫瘍成長の抑制を示す。
図１５は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターおよび蛋白質ブーストによりワクチン接種した後の老齢および若年マウスにおけるＥ７腫瘍なしマウスのパーセンテージを示す。
図１６は，老齢（１８月齢）マウス（老齢）における，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種する前（対照）および後の，腫瘍中のリンパ球に浸潤している腫瘍の間のＦｏｘＰ３制御ＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。
図１７は，Ａｄ−ｓｉｇ−ｒＨ２Ｎ／ｅｃｄΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターを注射したｒＨ２ｎ．Ｔｇ（すなわちＨＥＲ２トランスジェニック）マウスの腫瘍結節におけるエフェクターＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。
図１８は，ＥＬＩＳＡｓｐｏｔアッセイでのインターフェロンガンマ検出による，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌでワクチン接種したマウスの脾臓におけるＨ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを，ワクチン接種していないマウスと比較して示す。
図１９は，ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ｇ２８６５３７７（それぞれ配列番号７および配列番号８）のノイラミニダーゼＨ５Ｎ１の例示的アミノ酸配列（図１９Ａ）およびこれをコードするヌクレオチド配列（図１９Ｂ）を示す。
図２０は，Ｈ５Ｎ１（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２８６５３８０）のＨＡの例示的アミノ酸配列を示す。下線はレセプター結合に関与していると報告されている残基である。
図２１は，Ｈ３Ｎ２株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０１０８６；配列番号１０）の例示的前駆体ＨＡ分子を示す。下線および斜体配列は，レセプター結合に関与しているか，またはそれに対して中和抗体が生成されたエピトープを表す。
図２２は，インフルエンザＡウイルス株Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／３１／９８（Ｈ３Ｎ２），ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３０３８５６９９（配列番号１１）のノイラミニダーゼの例示的アミノ酸配列を示す。既知のエスケープ変異体において変異していると報告されている残基は下線および太字で示す。細胞外ドメインは影付きで示す。
図２３は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌでワクチン接種した老齢および若年マウスの脾臓細胞の調製物における，ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでのインターフェロンガンマ検出により測定したＨ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを，ワクチン接種していないマウスと比較して示す。
図２４は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種した後，ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質で３回の蛋白質ブーストを行った老齢および若年マウスの血清におけるＨＡに対する抗体の存在を示す。
図２５は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌでワクチン接種した老齢および若年マウスの脾臓細胞の調製物における，ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでのインターフェロンガンマ検出により測定したＭ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを，ワクチン接種していないマウスと比較して示す。
図２６は，老齢および若年マウスの血清における，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターによるワクチン接種および続くＭ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質による２回の蛋白質ブースト後の，Ｍ２に対する抗体の存在を示す。
図２７は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された２月齢マウス（“若年”）の脾臓細胞の調製物におけるＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示し，ここで，“Ｖ”はＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０Ｌの投与を意味し，“Ｐ”はＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の投与を意味する。
図２８は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された２月齢マウスの血清におけるＥ７特異的抗体のレベルを示し，ここで，“Ｖ”はＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０Ｌの投与を意味し，“Ｐ”はＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の投与を意味する。
図２９は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された１８月齢マウス（“老齢”）の脾臓細胞の調製物におけるＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示し，ここで，“Ｖ”はＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０Ｌの投与を意味し，“Ｐ”はＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の投与を意味する。
図３０は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された１８月齢マウス（“老齢”）の血清におけるＥ７特異的抗体のレベルを示し，ここで，“Ｖ”はＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０Ｌの投与を意味し，“Ｐ”はＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の投与を意味する。
図３１は，ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質の３回投与によるワクチン接種後のマウスの血清におけるＨＡに対する抗体の存在を示す。
図３２は，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質の３回投与によるワクチン接種後のマウスの血清におけるＭ２に対する抗体の存在を示す。
発明の詳細な説明
本発明の１つの観点にしたがえば，発現ベクターおよび／またはこれにコードされる融合蛋白質を用いてインフルエンザ抗原に対する免疫応答を生成する方法が提供される。ベクターは，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを含む。好ましい態様においては，転写ユニットは，アミノ末端から，分泌シグナル配列，インフルエンザ抗原，リンカーおよび分泌型のＣＤ４０リガンドを含む。好ましい態様においては，分泌型のＣＤ４０リガンドはその貫膜ドメインのすべてまたは実質的にすべてを欠失している。
好ましいアプローチにおいては，まず個体にベクターを１またはそれ以上の機会で投与して，一次免疫応答を生じさせる。さらに，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンド蛋白質を有する融合蛋白質を，ベクターの投与の後に抗原に対する免疫応答がベクター投与単独で得られるより高くなるようブーストするのに有効な量で投与する。
融合蛋白質の投与に関して“有効量”との用語は，発現ベクターを単独で用いたときに得られるより高い免疫応答を生ずる量を表す。最適な結果を得るためには，一般に投与と投与の間の時間間隔が必要である。免疫応答の増加は，Ｔ細胞活性または抗体産生の増加として測定することができる。一般に，ベクター投与と蛋白質ブーストとの間に少なくとも１週間あることが有効であるが，より短い間隔も可能である。投与と投与の間の有効な間隔は，１週間から１２週間であり，またはそれより長くてもよい。複数回のブーストを投与してもよく，これは１−１２週間またはそれより長い間の間隔をあけることができる。
免疫応答をブーストするために融合蛋白質を用いることにより，多数回の注射に対する過敏性を生ずるかもしれない発現ベクターの繰り返し投与の必要性を回避することができる。融合蛋白質の抗原部分は，好ましくは最初の投与に用いた発現ベクターの転写ユニットによりコードされる融合蛋白質である。融合蛋白質の抗原部分はコードされる抗原と異なっていてもよいが，ただし，発現ベクターの抗原とブーストに用いられる融合蛋白質の抗原とに共通する少なくとも１つの抗原決定基ないしエピトープが存在する。
融合蛋白質は，種々の細胞系で製造することができる。ある態様においては，抗原をグリコシル化することが望ましい。これらの態様においては，外来蛋白質がグリコシル化シグナルを有している場合，グリコシル化した蛋白質を産生する細胞系，例えば真核生物細胞，好ましくは哺乳動物細胞を用いることができる。例示的細胞系としては，ＣＨＯ細胞，ＣＯＳ細胞，およびＭＤＣＫ細胞が挙げられる。鳥特異的グリコシル化が望ましい場合には鳥細胞も用いることができる。ある態様においては，融合蛋白質を合成で製造することにより，または非グリコシル化系，例えば細菌発現系を用いることにより，融合蛋白質の外来蛋白質部分のグリコシル化を回避することができる。
融合蛋白質は，ベクターに適合した哺乳動物細胞株系において製造することができる。例えば，アデノウイルスの場合，細胞株系は，初期領域１（Ｅ１）遺伝子を含みＥ１置換組換えアデノウイルスの増殖を支持しうる２９３細胞であることができる。アデノウイルスベクターを産生細胞に感染させると，ウイルスベクターはウイルス複製サイクルにしたがってそれ自体で増殖する。しかし，ウイルスベクターの発現カセット中で運ばれる目的とする遺伝子は，ウイルス増殖プロセスの間に発現される。これを利用して，ベクターを製造するものと同じシステムにおいて，ベクターによりコードされる融合蛋白質を製造することができる。ベクターおよび融合蛋白質の製造は，製造系において同時に起こる。このようにして製造されたベクターおよび蛋白質は，種々の方法によりさらに単離し，精製することができる。
融合蛋白質はまた，細菌細胞等の非哺乳動物細胞において製造してもよい。例えば，融合蛋白質をコードするｃＤＮＡをｐＴｒｉＥｘＨｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）等のベクターにサブクローニングし，Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばＲｏｓｅｔｔａ ｃｅｌｌ，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にトランスフォームし，ここで，融合蛋白質を産生させることができる。他の非哺乳動物細胞としては，酵母，藻類，昆虫および植物細胞が挙げられる。
融合蛋白質は，非経口的に，例えば，脈管内，静脈内，動脈内，筋肉内，または皮下に投与することができる。投与はまた，経口，経鼻，経直腸，経皮またはエアロゾルとしての吸入であってもよい。蛋白質ブーストは，ボーラスとして投与してもよく，またはゆっくり注入してもよい。蛋白質ブーストは，好ましくは皮下に投与される。
融合蛋白質ブーストは，アジュバントとともに製剤して，得られる免疫応答を増強することができる。本明細書において用いる場合，"アジュバント"との用語は，ワクチンとともに投与されたときにワクチンに対する免疫応答を増強する化学物質を意味する。アジュバントは免疫原または抗原と化学的に結合していない点において，担体蛋白質とは区別される。アジュバントは当該技術分野においてよく知られており，例えば，フロインド完全またはフロインド不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ，Ａｄｖ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｒｅｓ．７：１３０（１９５６）；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）等のミネラルオイルエマルジョン（米国特許４，６０８，２５１，上掲），アルミニウム塩，特に水酸化アルミニウムまたはＡＬハイドロゲル（ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによりヒトにおける使用について認可されている），ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびその類似体，例えば［Ｔｈｒ１］−ＭＤＰ（Ｂｙｅｒｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ ５：２２３（１９８７）），モノホスホリル脂質Ａ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９：Ｓ５１２（１９８７））等が挙げられる。
融合蛋白質は，当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，マイクロカプセル化またはマクロカプセル化した形で投与することができる。融合蛋白質は，リポソーム中に（例えば，Ｇａｒｃｏｎ ａｎｄ Ｓｉｘ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３６９７（１９９１）を参照），ウシロタウイルスの内部カプシド蛋白質中に（Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２６９（１９９１）），ＱｕｉｌＡ等のサポニンから構成される免疫刺激分子（ＩＳＣＯＭＳ）中に（Ｍｏｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０８：４５７（１９８４））；Ｍｏｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓａｌ．ｅｄｓ．）ｐｐ．１５３−１６２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８７）），またはラクチド−グリコシドコポリマー等から構成される制御放出生物分解性微少球中に（Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７３：２３９（１９９１）；Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１４９（１９９３）），カプセル化することができる。
融合蛋白質はまた，Ｌ−１２１等のＰＬＵＲＯＮＩＣブロックコポリマーを用いて調製され，ＴＷＥＥＮ８０等の界面活性剤により安定化されているスクアレンまたはスクアレンエマルジョンを含む脂質微少球の表面に吸着させることができる（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｙｅｒｓ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ（Ｒ．Ｅｌｌｉｓｅｄ．）ｐｐ．４３１−４４９，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｍａｎ Ｎ．Ｙ．（１９９２）を参照）。マイクロカプセル化またはマクロカプセル化融合蛋白質は，アジュバントを含んでいてもよい。
融合蛋白質はまた，担体または外来分子，例えば蛋白質ブーストを投与すべき個体にとって外来である担体蛋白質とコンジュゲートしてもよい。免疫応答を活性化し，本明細書に記載される融合蛋白質とコンジュゲートすることができる外来蛋白質には，少なくとも約２０，０００ダルトン，好ましくは少なくとも約４０，０００ダルトン，より好ましくは少なくとも約６０，０００ダルトンの分子量の蛋白質または他の分子が含まれる。本発明において有用な担体蛋白質としては，例えば，ＧＳＴ，キーホールリンペット等のヘモシアニン類，血清アルブミンまたはカチオン化血清アルブミン，チログロブリン，オバルブミン，破傷風毒素またはジフテリア毒素等の種々の毒素蛋白質，イムノグロブリン，熱ショック蛋白質等が挙げられる。
１つの蛋白質を別の（担体）蛋白質に化学的に結合させる方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の水溶性カルボジイミドによるコンジュゲート化，例えばＮＨＳエステル基またはスルホ−ＮＨＳエステル類似体を有するホモ二官能性クロスリンカーによるコンジュゲート化，例えばＮＨＳエステルおよびスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート等のマレイミドを有するヘテロ二官能性クロスリンカーによるコンジュゲート化，およびグルタルアルデヒドを用いるコンジュゲート化が挙げられる（例えば，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）を参照）；米国特許４，６０８，２５１および４，１６１，５１９も参照）。
本明細書において用いる場合，転写ユニットを含む“ベクター”（別名“発現ベクター”）との用語は，投与されたときに，インビボで標的細胞に入り，コードされる蛋白質を発現することができるウイルスおよび非ウイルス発現ベクターを表す。インビボデリバリーおよび外来蛋白質の発現に適したウイルスベクターはよく知られており，例えば，アデノウイルスベクター，アデノ随伴ウイルスベクター，レトロウイルスベクター，ヘルペス単純ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターは，好ましくは正常細胞における複製ができないようにされている。米国特許６，６６９，９４２；６，５６６，１２８；６，７９４，１８８；６，１１０，７４４；６，１３３，０２９を参照。
本明細書において用いる場合，“細胞”との用語は任意の生きた細胞，例えば，哺乳動物細胞，植物細胞，真核生物細胞，原核生物細胞等を包含するよう拡張して用いられる。
本明細書において用いる場合，“アデノウイルス発現ベクター”との用語は，そのポリペプチドをコードする外来ＤＮＡがゲノム中に挿入されているアデノウイルス由来の任意のベクターを表す。ベクターは，任意の欠損した必須の遺伝子がトランスで提供されたときに，複製しパッケージングされることができなければならない。アデノウイルスベクターは，ウイルスＤＮＡの複製を支持するために必要な各末端反復の少なくとも一部を含むことが望ましく，好ましくは全ＩＴＲ配列の少なくとも約９０％，およびゲノムをウイルスカプシド中にカプシド化するのに必要なＤＮＡを含む。当該技術分野においては，多くの適当なアデノウイルスベクターが記述されている。米国特許６，４４０，９４４および６，０４０，１７４（複製欠損Ｅ１欠失ベクターおよび特殊なパッケージング細胞株）を参照。好ましいアデノウイルス発現ベクターは，正常細胞において複製できないものである。
“アデノウイルス発現ベクター”には，特定の細胞タイプ（例えば，線維芽細胞および樹状細胞）をよりよく標的として感染するよう改変されているベクター，またはあらかじめ存在する高いタイター抗体，例えばヒトで循環しているＡｄ５およびＡｄ２に対する抗体により中和されることを回避するよう改変されているベクターも含まれる。
アデノ随伴ウイルスは，ウイルスの遺伝的材料を染色体１９の特定の部位に挿入することができる一群の小さい一本鎖ＤＮＡウイルスを表す。遺伝子デリバリー用のアデノ随伴ウイルスベクターの調製および使用は，米国特許５，６５８，７８５に記載されている。
遺伝子デリバリー用の非ウイルスベクターは，種々のタイプの発現ベクター（例えばプラスミド）を含み，これらは，デリバリーの間にベクターのＤＮＡを保護するために，脂質，蛋白質および他の分子（またはこれらの組み合わせ）と組み合わせる。融合可能な非ウイルス粒子は，ウイルス融合蛋白質と発現ベクターを記載されるようにして組み合わせることにより構築することができる（Ｋａｎｅｄａ，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ（２００３）４（８）：５９９−６０２）。再構成されたＨＶＪ（日本の赤血球凝集ウイルス；センダイウイルス）−リポソームを用いて，発現ベクターをデリバリーすることができ，またはベクターをリポソームなしで不活性化ＨＶＪ粒子に直接取り込ませてもよい。Ｋａｎｅｄａ，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ（２００３）４（８）：５９９−６０２を参照。ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ脂質混合物は，非ウイルス発現ベクター用の有用なベヒクルである。米国特許６，１４７，０５５を参照。ポリカチオン−ＤＮＡ複合体もまた非ウイルス遺伝子デリバリーベヒクルとして用いることができる。Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６２（１）：２７−３４を参照。
本明細書において発現ベクターに関連して用いる場合，“転写ユニット”との用語は，ＲＮＡポリメラーゼにより単一の連続したｍＲＮＡ鎖として転写されるＤＮＡのストレッチを表し，転写の開始および終了のシグナルを含む。例えば，１つの態様においては，本発明の転写ユニットは，５’から３’方向に，分泌シグナル配列，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドをコードする核酸を含む。転写ユニットは，転写および／または翻訳発現制御要素，例えばプロモーターおよび任意の上流または下流のエンハンサー要素と動作可能なように連結されている。有用なプロモーター／エンハンサーは，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサーである（米国特許５，８４９，５２２および６，２１８，１４０を参照）。
本明細書において用いる場合，“分泌シグナル配列”（別名“シグナル配列”，“シグナルペプチド”，リーダー配列”，またはリーダーペプチド”）との用語は，一般に疎水性の性質であり，ポリペプチドのＮ末端に合成される約２０−３０アミノ酸を含み，ポリペプチドを小胞体に向ける短いペプチド配列を表す。分泌シグナル配列は，一般に，ポリペプチドが小胞体に移動するときに切断される。発現ベクターの外来遺伝子産物の分泌を指示するためには，真核生物の分泌シグナル配列が好ましい。種々の適当なそのような配列が当該技術分野においてよく知られており，例えば，ヒト成長ホルモン，イムノグロブリンカッパ鎖等の分泌シグナル配列が挙げられる。ある態様においては内因性腫瘍抗原シグナル配列も分泌を指示するために用いることができる。
本明細書において用いる場合，“抗原”との用語は，ヒト，哺乳動物，鳥または他の動物がそれに対する免疫応答を生ずることができる任意の抗原を広く表す。本明細書において用いる場合，“抗原”とは，それに対する免疫応答が生じうる少なくとも１つの抗原決定基を含む分子を広く表す。免疫応答は，細胞媒介性でもよく，液性でもよく，両方であってもよい。
当該技術分野においてよく知られるように，抗原は天然の蛋白質，天然の炭水化物，天然の脂質，または天然の核酸，またはこれらの生物分子の組み合わせであることができる。当該技術分野においてよく知られるように，抗原は天然のものであっても，組換えまたは合成であってもよい。例えば，抗原は，非天然分子，例えばポリマー等を含むことができる。抗原は自己抗原および非自己抗原の両方を含む。“自己”抗原には，宿主ゲノムによりコードされる抗原が含まれる。自己抗原には，宿主ゲノムにおける自然の組換え事象により生ずる変種配列が含まれる。例えば，イムノグロブリン遺伝子の可変領域は多くの組み合わせで組換えられて，非常に多様なイムノグロブリンを生成する。他の自己抗原としては，癌等の疾病状態において過剰発現または過少発現される蛋白質が含まれる。例えば，種々のムチンアイソフォームがある種のタイプの癌で過剰発現されている。
本明細書において用いる場合，“外来”抗原とは，非自己抗原を表す。外来抗原は，他の生物ゲノムの産物またはこれによりコードされていてもよい。例えば，哺乳動物に対する外来抗原は，病原菌等の感染性因子によりコードされる抗原でありうる。感染性因子抗原は，細菌，ウイルス，真菌，原生動物等であることができる。
本明細書において用いる場合，“インフルエンザウイルス”との用語は，哺乳動物または鳥類に感染しうるインフルエンザウイルスＡ，ＢおよびＣ型の任意のものを表す。本明細書において用いる場合，“インフルエンザ”とは，急性の伝染性インフルエンザウイルス感染を表す。これは一般に，発熱，悪寒，筋肉痛，衰弱を特徴とし，一般に呼吸系が関与し，気道の炎症等の症状を有する。
“ヘマグルチニン”（“ＨＡ”）との用語は，インフルエンザウイルス粒子中に存在するエンベロープ蛋白質の８０％以上を含む主要な糖蛋白質である。ヘマグルチニンは細胞表面上のシアル酸含有レセプターに結合して，ウイルス粒子を細胞に接着させる。ヘマグルチニンはまた，取り込まれたウイルス粒子の膜とエンドソーム膜との融合を媒介することにより，ウイルスの細胞質への侵入を担う。エンドソーム中の低いｐＨは，ＨＡ２の不可逆的なコンフォメーション変化を誘導し，融合された疎水性ペプチドが放出される。
“ヘマグルチニン”との用語は，全長蛋白質および全長ヘマグルチニンと少なくとも１つの抗原決定基を共有するそのフラグメントを表す。本明細書において用いる場合，“ヘマグルチニン”は，天然のものであってもよく，組換えまたは合成のものであってもよく，グリコシル化および／またはパルミトイル化により翻訳後修飾を受けていてもよい。現在，少なくともヘマグルチニンの１６種の異なる既知のサブタイプの抗原性が特性決定されており，Ｈ１からＨ１６と名付けられている。
ヘマグルチニンは約５６６アミノ酸の前駆体として合成される。Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡの例示的アミノ酸配列を図２に示し，Ｈ３Ｎ２ウイルスのＨＡを図４に示す。種々のヘマグルチニンの配列は，蛋白質およびヌクレオチドのデータベース，例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＧｅｎＢａｎｋに見いだされる。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０３４３７，Ｐ０３４４１，Ｐ１９６９４，Ｐ１９６９５，Ｐ１２５８１，Ｐ０７９７６，Ｐ０７９７７，Ｐ０９３４５，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３６３５６（Ｈ５Ｎ１ウイルス）；およびＶ０１０８５（Ｈ３Ｎ２ウイルス）を参照。これらのデータベースは，ＨＡ蛋白質の種々の機能的ドメインの注釈を記載する。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０３４３７は，Ｈ３ヘマグルチニンの配列を開示する。この分子は，５６６アミノ酸の前駆体として合成される。アミノ酸１−１６は１６アミノ酸のシグナル配列を表し；１７−５３０は５１４アミノ酸の細胞外ドメインを表し；５３１−５５１は２１アミノ酸の貫膜ドメインを表し；５５２−５６６は１５アミノ酸の細胞質ドメインを表す。ＨＡの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を図５ａに示す。５６６アミノ酸前駆体はインフルエンザウイルスの細胞膜に暴露され，ここで切断されてＨＡ１およびＨＡ２サブユニットとなる。ＨＡ１サブユニットはＨＡ前駆体の１７−３４４を表し，ＨＡ２サブユニットはＨＡ前駆体の３４５−５６６を表す。ＨＡ分子は約５００アミノ酸の大きな細胞外ドメインを有する。宿主由来の酵素による翻訳後切断により，２つのポリペプチドが生じ，これはジスルフィド結合により連結されたままである。すなわち，長い方のＮ末端フラグメントであるＨＡ１は約３２０-３３０アミノ酸を含み，レセプター結合部位およびウイルス中和抗体により認識されるほとんどの抗原決定基を含む約１７０アミノ酸の膜から遠い球形ドメイン（またはヘッド）を形成する。短い方のＣ末端部分のＨＡ２は，約１８０アミノ酸（貫膜および細胞質ドメインを除く）を含み，球形のドメインを細胞またはウイルスの膜にアンカリングするステム様構造を形成する。ヒンジ領域はステムドメインと球形ドメインとの間に位置する。
現在，インフルエンザＡウイルスの中で１６種のＨＡサブタイプが同定されている。これらのうち３つ（Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３）は伝統的なインフルエンザ単離物と関連し，３つ（Ｈ５，Ｈ７，Ｈ９）は最近の散在性ヒト単離物と関連する。インフルエンザＢウイルスは，１つのＨＡサブタイプのみを有する。すなわち，各ＨＡの配列およびＨＡの種々の機能的ドメインの位置は様々であり，当業者は容易に決定することができる。
ある態様においては，抗原はＨＡの全細胞外ドメインである。あるいは，細胞外ドメインのより小さい領域が本発明のワクチンの抗原として働くことができる。抗原の選択においては，当業者は，ＭＨＣクラスＩＩ分子により認識されて抗体（“液性”）応答を引き起こす抗原，またはＭＨＣクラスＩ分子により認識されて細胞毒性Ｔ細胞（“細胞性”）応答を引き起こす抗原を選択しうることを理解するであろう。好ましい態様においては，ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの両方により認識される抗原を包含するウイルス蛋白質の領域が選択される。そのような領域は，天然の蛋白質からのアミノ酸の連続するストレッチであってもよく，または非連続的領域が一緒に連結されたものであってもよい。
さらに，抗体の産生によりＨＡ分子の抗原性領域が同定されており，このうちのいくつかは中和活性をもつ。文献ではＨＡ分子上の抗体応答を引き起こす傾向のある４つの部位（ＡからＤ）が同定されている。部位Ａ，Ｂ，およびＤはＨＡ分子のヘッド部分に見いだされるが，部位Ｃはヒンジ部分に見いだされる（Ｎａｔｕｒｅ １９８１ ２８９：３７３−８）。
１つの例においては，インフルエンザのＨ５Ｎ１株のＨＡのフラグメントをインフルエンザ抗原として用いる。配列番号９に記載される配列はＨ５Ｎ１株の前駆体ＨＡ分子の例示的アミノ酸配列を表す（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２８６５３８０）。この配列の細胞外ドメインはおよそアミノ酸１７から５３０である。ある態様においては，全細胞外ドメインをインフルエンザ抗原として用いる。別の態様においては，ＨＡの細胞外ドメインの１またはそれ以上のフラグメントを用いる。配列番号９の細胞外ドメインの好ましいフラグメントは以下に示される。さらに，この領域内にはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合すると予測される多数のエピトープがある。例示的予測ＭＨＣクラスＩエピトープおよびＭＨＣクラスＩＩエピトープは，下記の配列においてそれぞれ下線および斜体で示される。
追加の抗原配列も可能であり，この目的のために当該技術分野において知られる多数のコンピュータプログラムの任意のものを用いて同定することができる。例えば，“ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ”はＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフの公共的に入手可能なデータベースであり，ＤＦＧ−Ｓｏｎｄｅｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｂｅｒｅｉｃｈ，５１０およびｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ：ＥＵ ＢＩＯＭＥＤ ＣＴ９５−１６２７，ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＴ９５−０２６３，およびＥＵＱＬＱ−ＣＴ−１９９９−００７１３によりサポートされている（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍ）。
インフルエンザ抗原に焦点をあてた別の態様においては，中和抗体（すなわち，例えばＨＡのＨＡレセプターへの結合を妨害することにより宿主の感染を防御する抗体）を引き起こすＨＡレセプター結合部位の一部を主とする抗原を設計することができる。例えば，文献には，Ｈ５Ｎ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２８６５３８０，配列番号９）に対する中和抗体が，主としてアミノ酸残基Ｙ９１，Ｗ１４９，Ｅ１８６，およびＬ１９０および配列ＳＧＶＳＳ（配列番号１９，アミノ酸残基１２９−１３３に対応）およびＮＧＱＳＧ（配列番号２０，アミノ酸残基２２０−２２４に対応）と反応することが記載されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３９３−６，１９９８，図１）。これらの残基は，図２０に下線を施した残基として示される。すなわち，インフルエンザ抗原は，主として２つの部位ＳＧＶＳＳ（配列番号１９）およびＮＧＱＳＧ（配列番号２０）を含むことができる。当該技術分野において知られるように，レセプター結合部位は，ＨＡ分子とＨＡ分子とで，異なる株で，さらに同じ株の中でも異なりうる。
例示的“インフルエンザ抗原”としては，Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡのレセプター結合領域を表す蛋白質フラグメント，すなわちアミノ酸１３４−２０５（図２を参照）が挙げられる。
上述のフラグメントの２またはそれ以上の組み合わせを抗原として用いることができる。そのようなフラグメントは，リンカーにより連結してもよく，互いにすぐに隣接していてもよい。２つのフラグメントの組み合わせの一例は下記のとおりである。
KSSWSNHDASSGVSSACPYLGRSSFFRNVVWLIKKNSAYPTATRPKVNGQSGRMEFFWTILK（配列番号２１）
これは，配列番号１８の上流にすぐに隣接している配列番号１５を表す。当業者は，これらのフラグメントは，配列番号１５の上流に配列番号１８が連結されていてもよいことを理解するであろう。
別の例においては，インフルエンザのＨ３Ｎ２株のＨＡのフラグメントがインフルエンザ抗原である。配列番号１０に記載され，図２１に示される配列は，Ｈ３Ｎ２株の前駆体ＨＡ分子の例示的アミノ酸配列を表す（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ受託番号Ｖ０１０８６）。この配列の細胞外ドメインはおよそアミノ酸１７から５３０である。この配列の細胞外ドメインはよそアミノ酸１７から５３０である。ある態様においては，全細胞外ドメインを本発明のワクチンの抗原として用いる。別の態様においては，ＨＡの細胞外ドメインの１またはそれ以上のフラグメントを用いる。配列番号１０の細胞外ドメインの好ましいフラグメントは以下に示される。
配列番号１０の細胞外ドメインの好ましいフラグメントは以下のとおりである：
TITNDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGINCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSSACKRGPDSGFFSRLNWLYKSGSTYPVQNVTMPNNDNSDKLYIWGVHHPSTDKEQTNLYVQASGKVTVSTKRSQQTIIPNVGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILVINSNGNLIAPRGYFK（配列番号２２）
配列番号２２はＭＨＣクラスＩ分子により認識される抗原性領域を含む。以下の配列は，例示的ＭＨＣクラスＩエピトープを表す。
TITNDQIEV（配列番号２３）；
ILDGINCTLIDA（配列番号２４）；
LFVERSKAF（配列番号２５）；
PYDVPDYASLRSLVASSG（配列番号２６）；
WLYKSGSTY（配列番号２７）
NNDNSDKLY（配列番号２８）；および
STDKEQTNLY（配列番号２９）
配列番号２２はＭＨＣクラスＩＩ分子により認識される抗原性領域を含む。以下の配列は例示的ＭＨＣクラスＩＩエピトープを示す。
TELVQSSSTGKICNN（配列番号３０）；
PHRILDGINCTLIDA（配列番号３１）；および
VPDYASLRSLVASSG（配列番号３２）
別の好ましいフラグメントとしては，株Ｈ３Ｎ２（配列番号１０）からの前駆体ＨＡ分子のレセプター結合に関与すると報告されている残基が挙げられる。そのような残基は，図２１において下線をつけた残基として示される。すなわち，好ましいフラグメントとしては，例えば，ＥＦＩＮＥＧ（配列番号３３）が挙げられる。別の好ましいフラグメントはＫＡＦＳＮＣＹＰＹＤＶＰＤＹ（配列番号３４）であり，これに対する中和抗体が生成したエピトープであることが示されている（Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ １２７：２４５−５０）。
当業者は，上述の配列の２またはそれ以上を連結して抗原を形成しうることを理解するであろう。さらに，いずれかのフラグメントの配列を，一方の末端に，または両方の末端に例えば５アミノ酸，より好ましくは１０アミノ酸延長してもよい。
本明細書において用いる場合，ノイラミニダーゼ（“ＮＡ”）との用語は，インフルエンザウイルスの表面に見いだされる糖蛋白質を表す。ノイラミニダーゼは，グリコシル基の末端シアル酸残基の除去を触媒し，このことによりＨＡの潜在的レセプターを破壊する。ノイラミニダーゼは，ノイラミン酸含有糖蛋白質から成熟ビリオンを解離させることによりウイルスの効率的な伝播を確実にしていると考えられる。すなわち，ＮＡ特異的抗体は，新たに形成されたウイルスの感染宿主細胞からの放出を阻害し，このことにより，ウイルスの伝播および感染の間の脱殻を制限する。
“ノイラミニダーゼ”との用語は，全長蛋白質および全長ノイラミニダーゼと少なくとも１つの抗原決定基を共有するそのフラグメントを表す。本明細書において用いる場合，“ノイラミニダーゼ”は，天然のものであってもよく，組換えまたは合成のものであってもよく，転写後修飾，例えばグリコシル化を受けていてもよい。現在，少なくとも９種のノイラミニダーゼのサブタイプがある。
ノイラミニダーゼは約４６９アミノ酸の前駆体として合成される。種々のＮＡの配列は，蛋白質およびヌクレオチドデータベース，例えば，Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＧｅｎＢａｎｋに見いだされる。例えば，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０６８１８，Ｐ２６１４３，Ｑ９Ｑ０Ｕ７，Ｐ０６８２０，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２８７０８（Ｈ５Ｎ１ウイルス），およびＡＢ１２４６５８（Ｈ３Ｎ２ウイルス）を参照。これらのデータベースは，ＮＡ蛋白質の種々の機能性ドメインに注釈をつけている。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６８１８は，インフルエンザＡウイルス（株Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／１／７９）のＮ２ノイラミニダーゼの配列を開示する。この分子は４６９アミノ酸の前駆体として合成される。アミノ酸１−６は６アミノ酸の細胞質ドメインを；７−３５は２９アミノ酸の貫膜ドメインを；３６−４６９は４３４アミノ酸の細胞外ドメインを表す。細胞外ドメインは，５５アミノ酸の超可変のスターク領域（アミノ酸残基３６−９０）および３７９アミノ酸のヘッド領域（アミノ酸残基９１−４６９）から構成される。各ＮＡの配列およびＮＡの種々の機能性ドメインの位置は異なっていてもよく，当業者は容易に決定することができる。
ある態様においては，インフルエンザ抗原はノイラミニダーゼ蛋白質由来である。好ましい態様においては，ノイラミニダーゼの全細胞外ドメインをインフルエンザ抗原として用いる。あるいは，細胞外ドメインのフラグメントをインフルエンザ抗原として選択してもよい。そのようなフラグメントにおいては，当業者は，ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のための抗体エピトープまたは抗原を選択するための当該技術分野において知られ，上で議論される多くのコンピュータソフトウエアプログラムの任意のものを使用することができる。好ましい態様においては，抗原は抗原性であることが当該技術分野において知られているノイラミニダーゼ蛋白質の領域，より好ましくは既知のエスケープ変異体の残基を含む領域の周りに焦点をあてる。本明細書において用いる場合，“エスケープ変異体”とは，その領域に以前に結合した抗体がもはや結合できないように抗原性領域に変異を有する蛋白質を表す。このようにして，そのような変異体は，免疫応答から回避ないし逃れる。別の態様においては，ＮＡの細胞外ドメインの１またはそれ以上のフラグメントを用いる。
一例として，インフルエンザ抗原はインフルエンザウイルスＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／３１／９８，Ｈ３Ｎ２のノイラミニダーゼである。Ｈ３Ｎ２の例示的配列ＮＡは配列番号１１に示され（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ｇ３０３８５６９９），図２２に示される。配列番号１１の細胞外ドメインは図２２に示され（影領域），これはある態様においてはインフルエンザ抗原である。さらに，いくつかのエスケープ変異体が文献に記載されている。例えば，Ｇｕｌａｔｉおよび共同研究者は，１９８，１９９，２２０，および２２１位のアミノ酸に変異を有するエスケープ変異体を記載する（図２２において下線および太字で示す）（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２７６（２３）：１２２７４−８０）。配列番号１１の好ましいフラグメントを以下に示す。
QCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNRHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGHDENATASFIYDGRLVDSIGSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGRADTKILFIEEGKIVHISPLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINVKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKFRSGYETFKVIEGWSKPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI（配列番号３５，ＮＡのヘッド領域に対応）；
AWLHVCVTGHDENATASFIYDGRLVDSIGSWSKKILRTQESECV（配列番号３６）；
CVTGHDENATASFIYDGRLVDSIGSWSKKILRTQ（配列番号３７）；および
DENATASFIYDGRLVDSIGSWSKK（配列番号３８）
本明細書において用いる場合，マトリクスプロテイン２（“Ｍ２”）との用語は，インフルエンザウイルスおよび感染細胞の表面で発現されている膜内在性蛋白質を表す。Ｍ２はインフルエンザウイルス感染細胞で高レベルで発現されており，ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼと比較して，種々のインフルエンザ株の間で長年安定な配列を有する。この蛋白質は典型的には免疫原性ではないが，Ｍ２の細胞外ドメインおよび“アジュバント蛋白質”，例えばＢ型肝炎ウイルスコア蛋白質から作成されたキメラ分子が強い免疫応答を誘導することが示されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５ ３３７：１４９−１６１；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００２ ７０：６８６０−７０）。
Ｍ２は，約１０９アミノ酸の前駆体として合成される。Ｈ５Ｎ１ウイルスのＭ２の例示的アミノ酸配列は図１に示され，Ｈ３Ｎ２ウイルスのＭ２は図３に示される。種々のＭ２の配列は，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＧｅｎＢａｎｋ等の蛋白質およびヌクレオチドデータベースに見いだすことができる。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３８８１，Ｐ１３８８２，Ｐ０３４９３，Ｑ８０ＤＮ６，Ｐ０８３８３，Ｐ０Ｃ０Ｘ４，Ｐ２１４３０，Ｐ０３４９１，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３６３５８（Ｈ５Ｎ１ウイルス）；およびＡＡＡ４３２７６（Ｈ３Ｎ２ウイルス）を参照。これらのデータベースはＭ２蛋白質の種々の機能性ドメインに注釈をつけている。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２１４３０（インフルエンザＡウイルス）は，Ｍ２の配列を開示する。この分子は，９７アミノ酸前駆体として合成される。アミノ酸１−２２は２２アミノ酸の細胞外ドメインを表し；２３−４３は２１アミノ酸の貫膜ドメインを表し；４４−９７は５４アミノ酸の細胞質ドメインを表す。Ｍ２の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は図５ｂに示される。各Ｍ２の配列およびＭ２の種々の機能的ドメインの位置は異なっていてもよく，当業者は容易に決定することができる。例えば，インフルエンザＢウイルスからのＭ２は非常に短い４アミノ酸の細胞外ドメインを有する。
本明細書において用いる場合，“インフルエンザ抗原”との用語は，哺乳動物または鳥類において免疫応答を引き起こすことができる，インフルエンザウイルス蛋白質の一部，部分または領域を表す。インフルエンザ抗原は，天然であっても，組換えまたは合成であってもよい。“インフルエンザ抗原”は，単一のウイルス型または株から，または複数のウイルス型または株に由来するエピトープを含むことができる。“インフルエンザ抗原”は，同じまたは異なるウイルス型または株からのエピトープの融合蛋白質であってもよい。本明細書において用いる場合，“インフルエンザ抗原”は，ＨＡ，ＮＡまたはＭ２蛋白質，または１またはそれ以上のエピトープを含むこれらのフラグメントを含むことができ；“インフルエンザ抗原”は，ＨＡ，ＮＡまたはＭ２の全細胞外ドメイン，ＨＡ，ＮＡまたはＭ２の細胞質ドメインおよび／またはこれらの蛋白質またはドメインの任意の免疫原性の組み合わせを含むことができる。
ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８５／９７（Ｈ５Ｎ１）マトリクスプロテイン２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２７８６４８）からのＭ２の例示的細胞外ドメインは次のとおりであり：
MSLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD（配列番号３９），
これは次のヌクレオチド配列によりコードされる。
5’-ATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGAT-3’（配列番号４０）
Ｍ２抗原インフルエンザＡウイルスのさらに別の例は以下のものである（Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／５２２／１９９７（Ｈ３Ｎ２）ＣＹ００６５０８）。
5’-ATGAGCCTTCTAACCGAGGTCGAAACACCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGATTCAAGTGAC-3’（配列番号４１）。
上述の配列は，Ｍ２蛋白質のアミノ酸１−２４に対応する以下の配列をコードする。
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号４２）
インフルエンザ抗原の別の例は，ＨＡのセグメントとＭ２蛋白質のセグメント（例えばＨ５Ｎ１またはＨ３Ｎ２ウイルス由来）を有するキメラ蛋白質である。キメラインフルエンザ抗原の１例は以下の配列であり，これはＨ５Ｎ１からのＨＡ−Ｍ２キメラを含む。
5’-AAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGGATATCATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGAT-3’（配列番号４３）。
上述の例示的配列においては，ＨＡおよびＭ２フラグメントは任意の２アミノ酸リンカーにより連結されている（リンカーをコードするヌクレオチドは上述の配列中で下線で示す）。ＨＡフラグメントはリンカーの前にあり，Ｍ２フラグメントはリンカーの後にある。当業者は，これらのフラグメントの順番は逆であってもよく，Ｍ２フラグメントがＨＡフラグメントの前にあってもよいことを理解するであろう。そのようなフラグメントをコードする例示的ヌクレオチド配列は以下のとおりである。
5’-ATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGATAAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAG-3’（配列番号４４）
キメラインフルエンザ抗原の別の例としては，Ｈ３Ｎ２からのＨＡおよびＭ２（下線）のフラグメントが挙げられ，これは以下のとおりである。
TITNDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGINCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSSACKRGPDSGFFSRLNWLYKSGSTYPVQNVTMPNNDNSDKLYIWGVHHPSTDKEQTNLYVQASGKVTVSTKRSQQTIIPNVGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILVINSNGNLIAPRGYFKMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号４５）。
ノイラミニダーゼおよびＭ２またはＨＡのフラグメントから他のキメラを構築することができる。例えば，以下の配列は，両方ともＨ３Ｎ２からのノイラミニダーゼのヘッド領域およびＭ２の細胞外ドメイン（下線）から構成される。
QCKITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNRHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGHDENATASFIYDGRLVDSIGSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGRADTKILFIEEGKIVHISPLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINVKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLNPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKFRSGYETFKVIEGWSKPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVWWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPIMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号４６）
当業者は，インフルエンザウイルスの異なる株の異なる蛋白質からのフラグメントを組み合わせて抗原を形成しうることを理解するであろう。ある態様においては，Ｍ２は２つのフラグメントの一方を含む。以下の例では，Ｈ５Ｎ１からのＨＡのフラグメントをＨ３Ｎ２からのＭ２フラグメント（下線）と組み合わせている。
KSSWSNHDASSGVSSACPYLGRSSFFRNVVWLIKKNSAYPTATRPKVNGQSGRMEFFWTILKMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD（配列番号４７）
本明細書において用いる場合，“インフルエンザ抗原−ＣＤ４０Ｌ”とは，ＣＤ４０Ｌに連結されたインフルエンザ蛋白質を意味する。例えば，これは，ＣＤ４０Ｌに連結されたＨ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ＨＡ抗原であってもよく；ＣＤ４０Ｌに連結されたＨ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ＨＡ−Ｍ２キメラ抗原であってもよく；またはＣＤ４０Ｌに連結されたＨ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１Ｍ２であってもよい。上述の例ではＨ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１が挙げられているが，本明細書において用いる場合，“インフルエンザ抗原”とは，インフルエンザウイルスにより発現される抗原を表し，他のＡ，ＢまたはＣ型インフルエンザウイルスからの蛋白質またはフラグメントを含む。
分泌型の抗原は，成熟蛋白質において貫膜ドメインが存在する場合，そのすべてまたは実質的にすべてが欠失しているものである。例えば，ヘマグルチニンの場合，貫膜ドメインは，存在する場合には，一般に約１９−２１アミノ酸の長さであり，ヘマグルチニンまたはヘマグルチニンのフラグメントを細胞膜にアンカリングするよう機能する。例えば，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０３４３７に開示されるヘマグルチニンの場合，このヘマグルチニンの貫膜ドメインが欠失している分泌型は，前駆体蛋白質の残基５３１−５５１を欠失している。実質的にすべての貫膜ドメインを欠失したヘマグルチニンは，ドメインが貫膜ドメインの一方の末端に６残基またはそれより少ない配列を含むものであり，より好ましくは貫膜ドメインの一方の末端に約４残基未満の配列，さらにより好ましくは貫膜ドメインの一方の末端に約２残基未満の配列，最も好ましくは貫膜ドメインの一方の末端に１残基またはそれ以下を含む。好ましい態様においては，ワクチンベクター転写ユニットは全貫膜ドメインを欠失した分泌型のヘマグルチニンをコードする。実質的にすべての貫膜ドメインを欠失してヘマグルチニンを分泌型としたヘマグルチニンは，ドメインの一方の末端に６残基未満の配列を含むものである。ヒトＨＡの細胞外ドメインは本明細書において“ｅｃｄＨＡ”と称される。
機能的貫膜ドメインを欠失した（すなわち分泌型の）ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはＭ２蛋白質はなお細胞質ドメインのすべてまたは一部を含むことが理解されるべきである。
種々のヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはＭ２抗原をコードするＤＮＡの起源は，ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはＭ２発現細胞株から，市販のｃＤＮＡ合成キットを用いて得ることができ，公表されているＤＮＡ配列から設計しうる適当なＰＣＲプライマー対を用いて増幅することができる。ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはＭ２をコードするＤＮＡはまた，感染したヒトまたは他の動物組織または細胞またはウイルス単離物から得るかまたは調製したＲＮＡまたはｃＤＮＡから増幅することにより得ることができる。あまり大きくないＤＮＡセグメントについては，ＤＮＡは自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成してもよい。
本明細書において用いる場合，発現ベクターの転写ユニットに関して“リンカー”との用語は，抗原のカルボキシ末端とＣＤ４０リガンドのアミノ末端との間の１またはそれ以上のアミノ酸残基を表す。リンカーの組成および長さは，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって決定し，その効力について試験することができる（例えば，Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋｅｒ ｓｗｈｉｃｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８，５２９−５３２，Ａｕｇｕｓｔ２００１を参照）。リンカーは一般に，約３から約１５アミノ酸の長さであり，より好ましくは約５から約１０アミノ酸の長さであるが，より長いまたは短いリンカーも用いることができ，またはリンカーは全くなくてもよい。より長いリンカーは，約５０アミノ酸まで，または約１００アミノ酸までであることができる。Ｍ２またはヘマグルチニン抗原ＣＤ４０リガンドのＮ末端にある場合には約３０残基のリンカーが好ましい。当該技術分野においてよく知られるリンカーの一例は，４個のグリシンおよび１個のセリンの３回の反復（すなわち［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３）から構成される１５アミノ酸のリンカーである。
本明細書において用いる場合，“ＣＤ４０リガンド”（ＣＤ４０Ｌ）との用語は，ＣＤ１５４またはＴＮＦ５としても知られる分子の全長または一部を表す。そのＮ末端に細胞質ドメイン，貫膜領域，および次にそのＣ末端に細胞外ドメインを有するＣＤ４０ＬはＩＩ型膜ポリペプチドである。特に記載しないかぎり，全長ＣＤ４０Ｌは本明細書において“ＣＤ４０Ｌ”，“ｗｔＣＤ４０Ｌ”または“ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌ”と称される。細胞質ドメインが欠失している形のＣＤ４０Ｌは，本明細書において“ΔＣｔＣＤ４０Ｌ”と称される。貫膜ドメインが欠失している形のＣＤ４０Ｌは，本明細書において“ΔＴｍＣＤ４０Ｌ”と称される。細胞質および貫膜ドメインの両方が欠失している形のＣＤ４０Ｌは，本明細書において“ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ”または“ｅｃｄＣＤ４０Ｌ”と称される。マウスおよびヒトからのＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は当該技術分野においてよく知られており，例えば，米国特許５，９６２，４０６（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．）に見いだすことができる。また，ＣＤ４０リガンドの意味には，リガンドが本発明の融合蛋白質と組み合わせてムチンに対する免疫応答を引き起こす能力を変更しない，保存的アミノ酸変更などの配列の変種が含まれる。
ネズミＣＤ４０Ｌ（ｍＣＤ４０Ｌ）は２６０アミノ酸の長さである。ｍＣＤ４０Ｌの細胞質（Ｃｔ）ドメインは，およそ１−２２位にわたり，貫膜ドメインはおよそ２３−４６位にわたり，細胞外ドメインはおよそ４７−２６０位にわたる。
ヒトＣＤ４０Ｌ（ｈＣＤ４０Ｌ）は２６１アミノ酸の長さである。ｈＣＤ４０Ｌの細胞質ドメインはおよそ１−２２位にわたり，貫膜ドメインはおよそ２３−４６位にわたり，細胞外ドメインはおよそ４７−２６１位にわたる。
本明細書において用いる場合，“ＣＤ４０リガンドは貫膜ドメインのすべてまたは実質的にすべてを欠失しておりＣＤ４０リガンドを分泌型としている”との語句は，細胞から分泌されることができる組換え型のＣＤ４０リガンドを表す。約２４アミノ酸を含むＣＤ４０Ｌの貫膜ドメインは，ＣＤ４０リガンドを細胞膜にアンカリングするよう機能する。貫膜ドメインのすべてが欠失しているＣＤ４０Ｌは，残基２３−４６を欠失したＣＤ４０リガンドである。貫膜ドメインの実質的にすべてを欠失したＣＤ４０リガンドは，６残基またはそれ未満の貫膜ドメイン，より好ましくは約４残基未満の貫膜ドメイン配列，さらにより好ましくは約２残基未満の貫膜ドメイン配列，最も好ましくは貫膜ドメイン配列の１残基を含む。ＣＤ４０Ｌに存在する任意の貫膜配列は，ドメインの一方の末端にあってもよく，または両方の末端により貫膜ドメイン配列を構成してもよい。すなわち，貫膜ドメインの実質的にすべてを欠失しておりＣＤ４０Ｌを分泌型とするＣＤ４０Ｌは，貫膜ドメインの配列の６以下の残基を保持しているものである。そのようなＣＤ４０Ｌは，細胞外ドメインおよび任意に細胞質ドメインに加えて，アミノ酸４１−４６または２３−２８を超えないもの，またはＣＤ４０Ｌの貫膜ドメインの両方の末端から組み合わせて合計６残基またはそれ以下のものを含むであろう。好ましい態様においては，ワクチンベクター転写ユニットは貫膜ドメインの１０％未満を含む分泌型のＣＤ４０をコードする。より好ましくは，ＣＤ４０Ｌは貫膜ドメインを含まない。
機能的貫膜ドメインを欠失しているＣＤ４０Ｌは，なお細胞質ドメインのすべてまたは一部を含んでいてもよいことが理解されるべきである。同様に，機能的貫膜ドメインを欠失しているＣＤ４０Ｌは，細胞外ドメインのすべてまたは実質的な部分を含んでいてもよい。
インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする発現ベクターは，当該技術分野において知られる方法にしたがって構築することができる。例えば，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３，標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願，図面を含めその全体が参照として本明細書に取り込まれる）を参照。
本明細書において用いる場合，発現ベクターおよび融合蛋白質ブーストは，ワクチンとして投与されて，インフルエンザ抗原に対する免疫を誘導する。発現ベクターおよび蛋白質ブーストは，適当な薬学的に許容しうる担体とともに適宜製剤することができる。したがって，ベクターまたは蛋白質ブーストは，医薬品または医薬組成物の製造において用いることができる。発現ベクターおよび融合蛋白質は，非経口投与用に溶液または凍結乾燥粉体として製剤することができる。粉体は，使用前に，適当な希釈剤または他の薬学的に許容しうる担体を加えることにより再構成することができる。液体製剤は，緩衝化された等張の水性溶液であってもよい。粉体はまた乾燥形でスプレイしてもよい。適当な希釈剤の例としては，通常の等張食塩水，標準的な水中５％デキストロース，または緩衝化酢酸ナトリウムもしくはアンモニウム溶液が挙げられる。このような製剤は，特に非経口投与に適しているが，経口投与に用いてもよく，または吸入用に定量吸入器またはネブライザに含ませてもよい。ポリビニルピロリドン，ゼラチン，ヒドロキシセルロース，アカシア，ポリエチレングリコール，マンニトール，塩化ナトリウム，クエン酸ナトリウム等の賦形剤を加えることが望ましいであろう。
あるいは，発現ベクターおよび融合蛋白質は，経口投与用に調製することができる。薬学的に許容しうる固体または液体の担体を加えて，組成物を増強または安定化するか，またはベクターの調製を容易にすることができる。固体担体としては，デンプン，ラクトース，硫酸カルシウム二水和物，白土，ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸，タルク，ペクチン，アカシア，寒天またはゼラチンが挙げられる。液体担体としては，シロップ，ピーナッツ油，オリーブ油，食塩水および水が挙げられる。担体はまた，持続放出材料，例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを，単独でまたはワックスとともに含むことができる。固体担体の量は様々でありうるが，好ましくは，１回投与量あたり約２０ｍｇから約１ｇの間であろう。液体担体を用いる場合には，製剤はシロップ，エリキシル，乳濁剤または水性もしくは非水性の懸濁液であることができる。
発現ベクターおよび融合蛋白質は，他の医学的に有用な薬剤または生物学的製剤を含むよう製剤してもよい。ベクターはまた，本発明の化合物が標的とする疾病状態に有用な他の薬剤または生物学的製剤の投与と組み合わせて投与してもよい。
本明細書において用いる場合，“有効量”との語句は，レシピエントにおいて免疫応答を生ずる（またはその生成に寄与する）のに十分な濃度を与えるのに十分な投与量を表す。任意の特定の被験者について特定の有効量のレベルは，種々の因子，例えば，治療している疾患，疾患の重篤度，特定の化合物の活性，投与の経路，ウイルスベクターのクリアランス速度，治療の持続時間，ウイルスベクターと組み合わせてまたは同時に使用する薬剤，被験者の年齢，体重，性別，食事，および一般的健康状態等の，医学および医科学でよく知られる因子によって異なるであろう。“治療上有効量”を決定する際に考慮される種々の一般的事項は当業者には知られており，例えば，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載されている。ベクターの投与については，１回投与あたりの粒子の範囲は，典型的には，約１Ｘ１０７から１Ｘ１０１１，より好ましくは１Ｘ１０８から５Ｘ１０１０，さらにより好ましくは５Ｘ１０８から２Ｘ１０１０である。ベクターは非経口的に，例えば，脈管内，静脈内，動脈内，筋肉内，または皮下に投与することができる。投与はまた，経口，経鼻，経直腸，経皮またはエアロゾルとしての吸入であってもよい。ベクターはボーラスとして投与してもよく，またはゆっくり注入してもよい。ベクターは好ましくは皮下に投与される。
本明細書に記載されるように，インフルエンザ抗原をコードするベクターは，例えばそれに対する耐性が発現しているような抗原に対する防御性の細胞性および液性免疫を誘導する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが，本発明のワクチンを投与すると，分泌型のＣＤ４０リガンドに連結された分泌型の抗原から構成される融合蛋白質の連続的な局所的放出が生ずると考えられる。本明細書において示されるように，これはＤＣの成熟を促進し，有効な抗原特異的免疫の発現を刺激する。また，本明細書においては，アデノウイルスベクターにより産生される，Ｈ５Ｎ１ＨＡの細胞外ドメインおよび貫膜および細胞質ドメインを欠失したネズミＣＤ４０Ｌをコードする分泌型融合蛋白質（すなわち，Ｈ５ＨＡ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）は，Ｈ５ＨＡに応答性のＣＤ８Ｔ細胞の数を劇的に増加させたことが示された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターの皮下注射は，強力なＨＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫を引き起こすと考えられる。
本発明の方法を用いて抗原に対して生成される免疫は長期にわたる。本明細書において用いる場合，長期にわたるとの用語は，ベクターによりコードされる抗原により引き起こされる免疫が，最後の投与から６か月まで，より好ましくは８か月まで，より好ましくは１年まで，より好ましくは１．５年まで，より好ましくは少なくとも２年間示されることができることを意味する。
１つの態様においては，インフルエンザヘマグルチニンに対する免疫は，貫膜ドメインおよび細胞質ドメインが欠失したＣＤ４０リガンドのアミノ末端に融合されたヘマグルチニンの細胞外ドメインの一部を含む融合蛋白質を産生することにより生ずることができる。そのようなベクターの構築は実施例に開示されている。本明細書に記載されるように，このアデノウイルスベクターヘマグルチニンワクチンを皮下投与すると，ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞のリンパ球依存性全身免疫応答が誘導された。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが，ベクターの皮下注射の部位の近傍で感染した細胞が分泌性の抗原／ＣＤ４０リガンドを放出し，これが感染細胞の近傍の抗原提示細胞（例えばＤＣ）に取り込まれると考えられる。内在化したインフルエンザ抗原は，プロテオソーム中で消化され，得られたインフルエンザ抗原ペプチドは小胞体に輸送され，ここでクラスＩＭＨＣ分子に結合する。最終的に，ＤＣはクラスＩＭＨＣ分子の表面にインフルエンザ抗原を提示するであろう。活性化された，インフルエンザ抗原負荷抗原提示細胞は，リンパ球をもつ二次臓器，例えば局所のリンパ節または脾臓に移動する。抗原／ＣＤ４０融合蛋白質が２週間連続して放出される間に，活性化され抗原を負荷した樹状細胞の存在により，抗原をもつ細胞を認識して殺す能力のあるＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞リンパ球が，リンパ節および脾臓において拡大する。ベクター感染細胞からの連続的な放出によりインフルエンザ抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞が連続的に刺激および拡大する性質のため，非分泌性の抗原／ＣＤ４０リガンドをもつベクターを用いて可能な程度より高い免疫応答が生ずると考えられる。
本発明の新規インフルエンザワクチン，蛋白質およびワクチン接種方法を試験する方法としては，当該技術分野においてよく知られるインビトロおよびインビボの方法および本明細書に記載される方法があり，また，マウスモデルおよびマウスに適合させたウイルスを利用する方法も含まれる。例えば，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ’ｓ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭ．Ｋ．ＳｉｍおよびＶｉｎｃｅｎｔ Ｃｈｏｗの研究室では，Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルスに対するＡｄ−ｓｉｇ−Ｈ３Ｎ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌワクチンを研究するマウスモデルを開発した。Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）株（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９８３ ７５：１７−２７；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ２１２：５２６−５３４）を，数バッチの２月齢マウスを用いて経鼻投与により継代することによりマウスに適合させた。簡単には，インフルエンザウイルスを最初に６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻投与した。２日後，動物を犠牲死させ，肺ホモジネートを分離し，“継代−１肺ホモジネート”と名付けた。２番目のバッチのＢＡＬＢ／ｃマウスを５０μＬの継代−１肺ホモジネートに感染させ，継代のプロセスを繰り返した。各継代の肺ホモジネートにおけるウイルスの病原性およびタイターを，インフルエンザＡウイルス複製を許容する宿主細胞であるＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞における感染性をアッセイすることによりモニターした。インフルエンザＡウイルスタイターは各継代にしたがって次第に増加した。すなわち，Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスをＢａｌｂ／Ｃマウス株に適合させることが可能である。
同様にして，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスを，２月齢マウスを経鼻投与により数バッチ継代することによりマウス系統に適合させることができる。上述したＣｈｏｗの方法を用いて．簡単には，ウイルスを最初に６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻投与した。２日後，動物を犠牲死させ，肺のホモジネートを調製し，“継代−１肺ホモジネート”と名付けた。２番目のバッチのＢＡＬＢ／ｃマウスを，５０μＬの継代−１肺ホモジネートに感染させ，この継代プロセスを繰り返した。各継代の肺ホモジネートにおけるウイルスの病原性およびタイターを，Ｈ５Ｎ１ウイルス複製を許容する宿主細胞における感染性をアッセイすることによりモニターした。
別の観点においては，本発明は，抗原およびＣＤ４０リガンドを含む分泌型融合蛋白質をコードする発現ベクターを投与することにより，高齢の個体を有効に免疫する方法を提供する。本発明の方法を用いて他の免疫感作方法と比較して改善された免疫応答を実現することができる高齢の個体は，少なくとも５０歳，または少なくとも５５歳，または少なくとも６０歳である。
本発明の方法は，高齢の個体において免疫応答を高める点において，伝統的ワクチン接種より有利である。癌抗原（腫瘍関連または腫瘍特異的）または感染性因子抗原等の抗原について，高齢の，少なくとも５０歳，さらに少なくとも５５歳または少なくとも６０歳の個体を免疫することの利点が提供される。感染因子抗原は，細菌，ウイルス，真菌，原生動物等であってもよい。ウイルス抗原は，上述したようにインフルエンザ抗原であってもよい。ウイルス抗原はヒトパピローマウイルスからのものであってもよい。ウイルス抗原はヒトパピローマウイルスのＥ６またはＥ７蛋白質であってもよい。
本明細書において用いる場合，“腫瘍関連抗原”（ＴＡＡ）との用語は，腫瘍細胞上に存在し，および胎生期の間に正常細胞に（腫瘍胎児性抗原），誕生後選択された臓器に，または多くの正常細胞に腫瘍細胞よりはるかに低い濃度で存在する蛋白質を表す。本発明の方法において老齢の個体を免疫するために用いることができる種々のＴＡＡが記述されており，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３，表題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願）に記載されている。この特許公開は，種々のムチンＴＡＡ，例えばＭＵＣ１およびムチンＶＮＴＲ領域のタンデム反復，およびＨＥＲ２（ｎｅｕ）を記載する。他のＴＡＡとしては，限定されないが，癌胎児性抗原，前立腺特異的抗原，ＣＡ１２５，ＣＡ１５−３，およびＥＦＧｒが挙げられる。
本明細書において用いる場合，腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）（別名“腫瘍特異的移植抗原またはＴＳＴＡ）とは，正常細胞には存在しない蛋白質を表す。ＴＳＡは，通常は，感染性ウイルスが細胞を不死にさせてウイルス抗原を発現させるときに出現する。例示的なウイルスＴＳＡは，ＨＰＶ１６型のＥ６またはＥ７蛋白質である。ウイルスにより誘導されないＴＳＡとしては，Ｂ細胞リンパ腫に関連する免疫グロブリンイディオタイプまたはＴ細胞リンパ腫上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が挙げられる。
以下の実施例は本発明を例示する。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
１．アデノウイルス発現ベクターの構築（一般的検討）
ＣＤ４０リガンドに融合した抗原を含む融合蛋白質をコードする転写ユニットを含むアデノウイルス発現ベクターを構築するための詳細は，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３），標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願に見いだすことができる。この公開は，シグナル配列（Ｉｇカッパ鎖より），次に細胞外ドメインを含み貫膜または細胞質ドメインを含まないＣＤ４０リガンド（ヒトまたはマウス）のフラグメントにリンカーを介して連結されたヒトＭＵＣ１の細胞外ドメインをコードする発現ベクターであるｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ１−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌの製造を記載する。融合蛋白質は，カッパ鎖シグナル配列を融合蛋白質のアミノ末端に付加することにより，ベクター感染細胞から分泌されるよう遺伝子工学処理されている。この公開に記載されるように，転写ユニットはアデノウイルスベクター骨格のＥ１遺伝子領域に挿入された。ＨＥＫ２９３細胞中でアデノウイルスベクター粒子を生成した後，ベクターＤＮＡは塩化セシウム勾配遠心分離により精製された。アデノウイルスベクター中のシグナルペプチドの存在は制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定により確認された。
米国特許公開２００５−０２２６８８８はまた，ヒトＭＵＣ−１をコードするＤＮＡの上流にマウスＩｇＧカッパ鎖遺伝子のシグナル配列をコードするＤＮＡを含む転写ユニット（“ｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ−１”）をどのようにして作成するかを記載している。転写ユニットは，ｐｓｈｕｔｔｌｅ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし，ネズミＣＤ４０Ｌ）を利用して，米国特許公開２００５−０２２６８８８に記載されるようにして形成した。抗原とＣＤ４０Ｌとの間にスペーサー（リンカー）（１０残基スペーサーＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；１文字コード；配列番号４８）をコードするようにプライマーを用いた。ｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬをコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３ＴＯＰＯベクターからＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ制限を用いて切り出し，ｐｓｈｕｔｔｌｅＣＭＶ（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３８：７３−７８，１９９９を参照）のＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。プラスミドをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ１−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌと名付け，これは，マウスＩｇＧカッパ鎖分泌シグナルをコードする転写ユニットｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ１−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ，次にヒトＭＵＣ１の細胞外ドメイン，次に１０アミノ酸のリンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ）；配列番号４８），次にネズミＣＤ４０リガンド残基５ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ２−２６０を含む。
米国特許公開２００５−０２２６８８８はまた，ＰＣＲによりｅｃｄｈＭＵＣ１（抗原）をコードするＤＮＡとΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌとの間にマウスＨＳＦ１三量体ドメインをクローニングしたことを記載する。コンストラクトの設計には，三量体セグメントの各末端にスペーサーを用いることが含まれる。米国特許公開２００５−０２２６８８８はまた，ＰＣＲを用いてΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌの末端にＨｉｓタグをコードする配列を付加することを記載する。
組換えアデノウイルスベクターは，ＡｄＥａｓｙベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて作成した。簡単には，得られたプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅｓｉｇ−ｅｃｄｈＭＵＣ１−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ，および他の対照アデノウイルスベクターをＰｍｅＩで線状にし，Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３にｐＡｄＥａｓｙ−１（ウイルスＤＮＡプラスミド）とともにコトランスフォームした。カナマイシンで組換え体を選択し，制限酵素分析によりスクリーニングした。次に，組換えアデノウイルスコンストラクトをＰａｃＩで切断して，その逆方向末端反復（ＩＴＲ）を露出し，２９３Ａ細胞にトランスフェクトして，ウイルス粒子を産生させた。組換えアデノウイルスのタイターは，組織培養感染用量法（ＴＣＩＤ５０）により測定した。
２．融合蛋白質およびベクターの作成
インフルエンザウイルス抗原融合蛋白質は，融合蛋白質をコードする融合遺伝子の発現カセットを有するアデノウイルスベクターから直接製造した。成長培地中で８０％コンフルエントの産生細胞（例えば２９３細胞株）をウイルスベクターで細胞１個につき１０−１００個のウイルス粒子の比率で感染させた。感染した細胞をさらに４８−７２時間培養し，このとき，ウイルスベクターは細胞中で増殖し，腫瘍抗原融合蛋白質は細胞中で発現され，培養液に分泌された。感染した細胞の７０−９０％が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したときに回収した。細胞培養液は別途回収した。３回の凍結溶解サイクルにより細胞溶解物を調製した。ウイルス粒子は標準的な方法により単離した（例えば，ＰＮＡＳ２００３１００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３）を参照）。腫瘍抗原融合蛋白質は，回収した細胞培養液からアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
融合蛋白質は，細菌細胞で以下のようにして製造した。融合蛋白質をコードするｃＤＮＡをｐＴｒｉＥｘ−２ｈｙｇｒｏベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。コンピテント細胞（Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）細胞，ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．）を得られたプラスミドでトランスフォームした。細胞をＩＰＴＧを補充した培地で４時間インキュベートした後，ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）ＢＰｌｕｓＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞溶解物を調製した。融合蛋白質はＨＩＳ−選択ニッケルアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）により可溶性画分から精製した。次に，蛋白質を濃縮し，Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５Ｂｉｏｍａｘ−５０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した遠心分離により脱塩し，ＰＢＳで溶出した。
３．ＨＰＶＥ７-ＣＤ４０リガンド融合蛋白質をコードするアデノウイルスベクターの構築
Ｅ７はヒトパピローマウイルスによりコードされる蛋白質であり，これは異形成および新生物細胞に関連するすべてのＨＰＶに見いだされる。転写ユニットは，９８アミノ酸からなり以下のアミノ酸配列を有する，全長ＨＰＶ１６型Ｅ７蛋白質をコードするＤＮＡの上流に，ＨＧＨ遺伝子からのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP（配列番号４９）。
このＥ７蛋白質のコーディング配列は，転写ユニット中で，１０アミノ酸スペーサーのコーディング配列の上流にあり，これはΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌのコーディング配列の上流にある。
分泌型のＣＤ４０リガンドに連結されたＥ７を構成する転写ユニット融合蛋白質を発現するアデノウイルスベクターの構築は，例えば，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３），標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願に記載されている。この方法は以下に詳細に説明する。
ａ）ｐｓｈｕｔｔｌｅｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）の構築
プラスミドｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌは，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。マウスＣＤ４０リガンドの５２位から２６０位（すなわち細胞質および貫膜ドメインなし）を増幅し，アンプリコンの５’末端にリンカー（“＋スペーサー“と表される）をコードする配列を含むよう，１対のＰＣＲプライマー（配列番号５０および５１）を設計した。
マウスΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーフォワードプライマー（ＭＣＤ４０ＬＳＰＦ）（ＸｈｏＩ認識部位は太字下線で示す；スペーサー配列は下線で示す（ＸｈｏＩ部位を含む）；ＣＤ４０Ｌ配列は斜体で示す）：
マウスＣＤ４０Ｌリバースプライマー（ＭＣＤ４０ＬＲ）（ＸｂａＩ認識部位は太字下線で示す）
フォワードプライマーＭＣＤ４０ＬＳＰＦは，転写ユニットの腫瘍抗原とＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ４０Ｌ）との間に配置すべき１０残基スペーサー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；一文字コード；配列番号４８）をコードする。ＰＣＲは，フォワードおよびリバースプライマー（配列番号５０および５１）およびテンプレートとしてプラスミドｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌを用いて，以下の条件で行った：９４℃で３分間保持；９４℃で４５秒間，５５℃で４５秒間，７２℃で７０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；および４℃で保持。このＰＣＲによりフラグメント“スペーサー＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ”を得，これをＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で制限エンドヌクレアーゼ消化したプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅＣＭＶ（Ｍｕｒｐｈｙｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３８：７３−８，１９９９）に挿入した。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）と名付けた。
ベクターは，切断型ではなく全長ＣＤ４０Ｌをコードする以外は同様にして作成した。このベクターは，ネズミＣＤ４０Ｌの出発コドンにアニーリングするＣＤ４０フォワードプライマーを用いて作成した。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）と名付けた。
ｂ）ｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）の構築
ｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）は，以下のようにして，ＨＰＶ−１６Ｅ７をＣＤ４０リガンド配列の上流に挿入することにより作成した：全長ＨＰＶ−１６Ｅ７蛋白質をコードする配列は，ＨＰＶウイルスゲノムから以下のプライマーを用いるＰＣＲ増幅により得た：
ＨＰＶ１６Ｅ７フォワードプライマー
ＨＰＶＥ７リバースプライマー
ＰＣＲは，上述のプライマーおよびテンプレートとしてＨＰＶ１６ウイルスゲノムを用いて，以下の条件で行った：９４℃で３分間保持；９４℃で４０秒間，５８℃で４０秒間，７２℃で４０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；および４℃で保持。得られたアンプリコンはＨＰＶ１６Ｅ７をコードするＤＮＡであり，それぞれ５’末端および３’末端にＮｏｔＩおよびＸｈｏ１制限部位を有する。Ｅ７ＤＮＡをＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限部位を用いてｐｓｈｕｔｔｌｅｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）ベクターのＣＭＶプロモーターとスペーサー−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ配列のスペーサーのすぐ５’側との間に挿入した。得られたプラスミドをｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）と名付けた。
ｃ）ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌの構築
以下のようにして，ｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）ベクターを用いてｏｆＥ７の上流にＨＧＨシグナル配列を挿入して，ＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌを得た。
ヒト成長ホルモンのシグナル配列ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（１文字アミノ酸コード）（配列番号５４）をコードするＤＮＡは，リン酸化したオリゴヌクレオチド（配列番号５５および５６）をアニーリングしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔ１オーバーハングを有する全２６アミノ酸ＨＧＨ配列を生成することにより作成した。
成長ホルモンシグナル上側鎖（コーディング配列は斜体で示す）：
成長ホルモンシグナル下側鎖：
合成ＨＧＨシグナル配列は，上述の上側および下側鎖オリゴをアニーリングすることにより作成した。オリゴを５０μｌのＨ２Ｏに溶解した（約３ｍｇ／ｍｌ）。各オリゴ１μｌ（上側および下側鎖）を４８μｌのアニーリングバッファ（１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．４，および２ｍＭ酢酸Ｍｇ）に加え，９５℃で４分間，７０℃で１０分間インキュベートし，約４℃までゆっくり冷却した。アニーリングしたＤＮＡを，Ｔ４ＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて標準的な条件下でリン酸化した。
ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩのオーバーハングを有するＨＧＨシグナル配列をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを介してｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列なし）に挿入して，ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌを得た。すなわち，転写ユニットＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは，ＨＧＨ分泌シグナル，次に全長ＨＰＶ１６型Ｅ７，次に１０アミノ酸のリンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；配列番号４８），次にネズミＣＤ４０リガンド残基５２−２６０をコードする。
ｄ）ｐｓｈｕｔｔｌｅＫ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌの構築
全長ＨＰＶ１６型Ｅ７蛋白質（“Ｋ／Ｅ７”）をコードするＤＮＡの上流にマウスＩｇＧカッパ鎖遺伝子のシグナル配列をコードするＤＮＡを含む転写ユニットは，ＨＰＶ１６プラスミドおよび以下のプライマーを用いてＰＣＲにより作成した。
上流にカッパシグナル配列を有するＫ／Ｅ７は，４ラウンドのＰＣＲ増幅（第１ラウンド：プライマー４＋５；第２ラウンド：プライマー３を加える；第３ラウンド：プライマー２を加える；第４ラウンド：プライマー１を加える）により作成した。Ｋ／Ｅ７をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ（商標）３．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングして，ｐｃＤＮＡ−Ｋ／Ｅ７を形成した。
貫膜および細胞質ドメインが除去されている（−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）マウスＣＤ４０リガンドの上流の１０アミノ酸スペーサーのコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントは，マウスＣＤ４０リガンドｃＤＮＡプラスミド，ｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から，以下のＰＣＲプライマーを用いて作成した。
フラグメントｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬをＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し，次にｐｃＤＮＡ−Ｋ／Ｅ７にライゲーションした。Ｋ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬフラグメントをｐｃＤＮＡベクターから切り出し，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を用いてｐｓｈｕｔｔｌｅプラスミドに挿入した（ｐｓｈｕｔｔｌｅＫ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）。すなわち，Ｋ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌフラグメントは，カッパ鎖分泌シグナル，次に全長ＨＰＶ１６型Ｅ７，次に１０アミノ酸のリンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；配列番号４８），次にネズミＣＤ４０リガンド残基５２−２６０を含む。
ｅ）ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ＣＤ４０Ｌの構築
融合蛋白質および全長マウスＣＤ４０Ｌ（介在リンカーなし）のＥ７上流をコードするアデノウイルスベクターは，ＰＣＲにより全長マウスＣＤ４０Ｌを増幅するプライマーを用いて作成した。以下のプライマーを用いた：
増幅したＤＮＡは，最初にＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐｃＤＮＡ３−Ｋ／Ｅ７ベクターにサブクローニングした。全長ＣＤ４０Ｌ遺伝子またはΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位によりｐｓｈｕｔｔｌｅプラスミドに直接クローニングした。
ｆ）ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）の構築
Ｅ７／ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質をコードするベクター（ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ））について以下に説明する。ヒトＣＤ４０リガンドｃＤＮＡテンプレートを用いてヒトΔＣｔΔＴＭＣＤ４０Ｌ＋スペーサーを増幅するためのプライマーは下記のとおりである。
ヒトΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーフォワードプライマー（ＨＣＤ４０ＬＳＰＦ）（ＣＤ４０Ｌ配列は斜体で示す）：
ヒトＣＤ４０Ｌリバースプライマー（ＨＣＤ４０ＬＲ）
ＰＣＲは，上述のプライマーおよびテンプレートとしてプラスミドｐＤＣ４０６−ｈＣＤ４０Ｌを用い，以下の条件で行った：９４℃で３分間保持；９４℃で４５秒間，５２℃で４５秒間，７２℃で７０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；４℃で保持。この増幅により，“−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）”フラグメントが得られ，これは，ヒトＣＤ４０Ｌの４４−２６１およびアミノ末端の１０アミノ酸のスペーサーをコードする。フォワードプライマーＨＣＤ４０ＬＳＰＦは，転写ユニットの腫瘍抗原とＣＤ４０リガンド（ｈＣＤ４０Ｌ）との間に位置すべき１０残基スペーサー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；一文字コード；配列番号４８）をコードする。次に，“ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）”フラグメントをＸｂａＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で制限エンドヌクレアーゼ消化したプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅＣＭＶ（Ｍｕｒｐｈｙ ＧＰ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３８：７３−７８（１９９９））に挿入した。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）（シグナル配列なし）と名付けた。ネズミＣＤ４０リガンドをコードするベクターについて上述した方法と本質的に同様にして，ヒトＣＤ４０リガンド配列の上流にＨＰＶ−１６Ｅ７を含むようｐｓｈｕｔｔｌｅｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）（シグナル配列なし）を改変した。得られたプラスミドをｐｓｈｕｔｔｌｅＥ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）（シグナル配列なし）と名付け，これを用いてＥ７の上流にＨＧＨシグナル配列を挿入して，ＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）を得た。すなわち，転写ユニットＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）は，ＨＧＨ分泌シグナル，次に全長ＨＰＶ１６型Ｅ７，次に１０アミノ酸リンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；配列番号４８），次にヒトＣＤ４０リガンドの残基４４−２６１をコードする。
ｈ）組換えアデノウイルス
組換えアデノウイルスベクターＡｄＥａｓｙベクター系（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて作成した。簡単には，得られたプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ，ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／ＣＤ４０Ｌ，ｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ，およびｐｓｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／Ｅ７をＰｍｅＩ消化により直線化し，次にＥ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３株にｐＡｄＥａｓｙ−１とともにコトランスフォームした。組換え体はカナマイシンで選択し，制限酵素分析によりスクリーニングした。次に組換えアデノウイルスコンストラクトをＰａｃＩで切断し，２９３Ａ細胞にトランスフェクションして，ウイルス粒子を産生させた。組換えアデノウイルスのタイターは組織培養感染用量５０法（ＴＣＩＤ５０）により決定した。
４．細菌系での組換えＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の精製およびＥ７アッセイ方法
ａ）組換えＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の精製
Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合ｃＤＮＡを発現ベクターｐＴｒｉのＸｃｍＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入した。発現細菌細胞株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）をｐＴｒｉＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでトランスフェクションし，ＩＰＴＧにより３７℃で３時間誘導した。細菌ペレットを回収し，Ｈｉｓ選択ニッケルアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）により精製した。
ｂ）Ｔ制御細胞のフローサイトメトリ分析
Ｔ制御細胞を定量するため，リンパ節，脾臓または腫瘍結節からのＣＤ４Ｔ細胞をそれぞれ，２種類の異なるマーカー，ＣＤ４ＣＤ２５およびＣＤ４ＦＯＸＰ３で染色した。ＦＩＴＣ−またはＰＥ−コンジュゲート化抗マウスモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ｅＢｉｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて，氷上で３０分間おいた後，標識抗体を用いる免疫染色を行った。Ｔ細胞を最初にＦｃ−γブロッキング抗体（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体）とともにインキュベートして，ｍＡｂｓのＦｃ−γレセプターへの非特異的結合を回避した。次に細胞を２回洗浄し，４％パラホルムアルデヒドで固定し，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメータ（ＦＡＣＳＣａｌｉｐｕｒ）を用いて分析した。
ｃ）テトラマー染色
ＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号６８）を含むＰＥ標識Ｈ−２Ｄｂテトラマーは，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから購入し，ペプチド特異的ＣＴＬ免疫の分析に用いた。免疫感作の１０日後，１ｘ１０６個の赤血球枯渇脾臓細胞を，３％ＦＣＳを補充した１００μｌのＰＢＳ中で１０μｌのテトラマーおよび１／１００希釈フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し，室温で３０分間インキュベーションし，次に３ｍｌのＰＢＳで洗浄した。遠心分離した後，細胞ペレットを５００μｌのＰＢＳ／０．５％パラホルムアルデヒドに再懸濁して，ＦＡＣＳ分析を行った。テトラマー陽性およびＣＤ８＋細胞を総脾臓細胞のパーセンテージとして示す。
ｄ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるサイトカインプロファイル
また，先に記載されているようにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより免疫したマウスにおけるＥ７特異的エフェクターＴ細胞の存在を調べた。簡単には，種々のベクターのそれぞれでワクチン接種したマウスから得た脾臓細胞を，１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下でＴＣ−１細胞株（レスポンダ対刺激剤比＝２５／１）とともに４８時間培養することにより，インビトロで再刺激した。次に，再刺激した脾臓細胞を９６ウエルニトロセルロースフィルタープレート（１００μｌ中５Ｘ１０４細胞）に播種した。ウエルはラット抗マウス抗ＩＦＮ抗体または抗ＩＬ−４抗体であらかじめコーティングした。３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後，プレートをＰＢＳで洗浄し，４℃でビオチン化ヤギ抗ラット第２抗体と，次に１００μｌ／ウエルの西洋ワサビペルオキシダーゼアビジンＤとともにインキュベーションすることにより，サイトカイン産生脾臓細胞の存在を検出した。これに１５０μｌ／ウエルの新たに調製した基質バッファ（０．４ｍｇ／ｍｌ３−アミノ−９−エチル−カルバゾール，合計５０ｍｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファ中）および２０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を加えた。ＩＦＮ産生細胞またはＩＬ−４産生細胞に対応する染色されたスポットを解剖用顕微鏡下で数えた。
ｅ）細胞毒性アッセイ
これらのマウスの脾臓からの単核細胞を，マイトマイシンＣ処理ＴＣ−１細胞とともに，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），５ｍＭの２−メルカプトエタノール，２ｍＭグルタミン，１ｍＭピルビン酸，および非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で５日間インキュベーションした。細胞毒性アッセイを行うためには，最初にＴＣ−１腫瘍細胞／（標的細胞）を赤色蛍光染料ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で製造元の仕様書にしたがって標識した。簡単には，標的細胞をＰＢＳ中で洗浄し，次に１０７細胞／ｍｌで溶液中に再懸濁した。ＰＫＨ２６染料を最終濃度２μＭで加え，混合し，室温でインキュベーションした。５分後，反応を３倍容量のＦＣＳでクエンチし，細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地でさらに３回洗浄し，次に，５Ｘ１０３個の標識ＴＣ−１細胞を刺激した脾臓単核細胞（エフェクター細胞）とともに，種々のエフェクター／標的比で，５％ＦＢＳを含む培養液中で３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーションの終わりに，細胞内カスペース３を製造元のプロトコルにしたがって染色し（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ），生きたゲートのＰＫＨ２６＋細胞のフローサイトメトリにより二重陽性細胞を測定することにより，単核細胞媒介性細胞毒性を判定した。
ｆ）マウスモデルにおけるインビボ効力実験
５ｘ１０５個のＴＣ−１細胞を皮下に注射することにより，マウス（１群あたり５または１０匹）を皮下注射でチャレンジした。翌日，１ｘ１０８ＰＦＵのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌを皮下注射することによりマウスにワクチンを接種した。１週間後，マウスを最初のワクチン接種と同じアデノウイルスベクター投与計画でブーストするか，またはその後に，１０μｇの組換えＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質を毎週ＳＣ注射した。腫瘍体積をカリパーによりセンチメートル単位で測定した。１ヶ月後，腫瘍のないマウスを１ｘ１０７ＴＣ−１細胞で再チャレンジし，腫瘍体積を計算した。
腫瘍体積＝長さｘ（幅２）／２（これは楕円形を仮定している）。
ｇ）統計学
すべてのパラメータは，スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて分析した後，シェフの方法を用いてｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析として多重比較を行った。示されるすべてのデータは，平均（標準偏差）の平均±標準偏差で表す。
５．Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを用いる若年（２月齢）マウスにおけるウイルス抗原に対する免疫の誘導
各１０μｇ／マウスのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌアデノウイルスベクターを６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２回皮下注射（７日間あけて）し，Ｅ７陽性ＴＣ−１細胞の移植に対する耐性の誘導を評価した（ＰＮＡＳ ２００３ １００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照）。最後のワクチン接種注射の７日後に，注射したマウスを５００，０００個のＥ７陽性ＴＣ−１細胞および５００，０００個のＥ７陰性ＥＬ−４細胞の皮下移植（アデノウイルスベクター注射部位とは異なる部位に）でチャレンジした。Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌを注射したマウスではＥ７陰性ＥＬ−４細胞の成長（腫瘍体積により測定）は抑制されなかったが，一方，Ｅ７陽性同系のＴＣ−１細胞の成長は注射したマウスでは完全に抑制された（図６）。これらの結果は，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターが若年の２月齢動物においてＥ７ウイルス抗原に対する特異的免疫応答を誘導することを示す。
６．若年（２月齢）マウスにおいてＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターにより誘導される免疫はＣＤ８依存性である
２月齢マウスへのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの注入が免疫的記憶細胞を誘導するか否かを試験するために，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種した後に１年生存したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから脾臓Ｔリンパ球を回収し，Ｅ７陽性ＴＣ−１細胞でチャレンジした。試験Ｃ５７ＢＬ／６ヌードマウス（ｎ＝７）に，５００，０００個のＴＣ−１細胞を皮下に注入し，５日後に，１年前にＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種したマウスからの１０ｘ１０６個の脾臓リンパ球を腹腔内に注入した。図７に示されるように，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌワクチン接種マウスからのＴ細胞を腹腔内に注入したＣ５７ＢＬ／６ｎｕ／ｎｕマウスにおいては，ＴＣ−１細胞（黒菱形）の過渡的な成長しか生じなかった（◆）。これに対し，ＴＣ−１細胞の５日後に感作していないドナーＣ５７ＢＬ／６マウスからの１０ｘ１０６個の脾臓Ｔ細胞を腹腔内に注入した対照Ｃ５７ＢＬ／６ｎｕ／ｎｕマウスにおいては，ＴＣ−１細胞はよく成長した（黒四角（■）で示される線）。これらの結果は，ベクター注入により誘導された免疫には記憶細胞が関与することを示す。
この免疫抵抗性がＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球に依存するか否かを試験するために，ドナー免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに，第０日および第７日にＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを皮下に注入した。７日後（第１４日）に，マウスに１００，０００個のＥ７陽性ＴＣ−１細胞を皮下に注入した。図８に示されるように，Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスをインビボで細胞溶解性でありＣＤ４（黒菱形）またはＣＤ８（黒三角）陽性細胞に特異的な抗体で処置して，ベクター注入の５，３，および１日前，およびＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを皮下に注入した後の６日ごとに，およびＴＣ−１細胞を注入した後の第６，７，８，１０，１２，および１４日に，それぞれのＴ細胞集団を涸渇させた。次に，１ｘ１０５個のＴＣ−１細胞の皮下注入の７日後に，ＣＤ４涸渇ワクチン接種マウスからの感作したＣＤ８＋Ｔ細胞（図８の黒菱形を参照），または感作したＣ５７ＢＬ／６ドナーからのＣＤ８涸渇ワクチン接種マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球（図８の黒三角を参照）をＣ５７ＢＬヌードマウスの腹腔内に注入した。Ｃ５７ＢＬ／６ヌードマウスの第３群は，対照マウスであり，これはＴＣ−１細胞の皮下注射の７日後にＴ細胞の受動的移動を受けなかった（図８の黒四角を参照）。生存したＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ注入ドナー動物からのＣＤ８＋Ｔ細胞を注入したＣ５７ＢＬ／６ｎｕ／ｎｕマウスは，他の群より統計的に有意に長期間生存した。すなわち，Ａｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの注入によるＴＡＡ陽性腫瘍細胞に対する免疫の誘導は，ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ球に依存し，ＣＤ４細胞には依存しなかった。したがって，このワクチンは，インフルエンザワクチンについて，高齢者におけるＣＤ４欠陥を回避するのに有用である。
７．Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターは若年（２月齢）マウスにおいてＥ７ウイルス抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球を増加させる
１ｘ１０８ＰＦＵのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの２回の注射の前および７日後に，Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎより）から脾臓細胞を単離した。Ｅ７特異的Ｔ細胞のレベルは，上述したテトラマーアッセイにより測定した。
Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクター注入後，Ｔ細胞は脾臓において３倍増加したが，Ｅ７／ＣＤ４０Ｌ蛋白質が感染細胞からの分泌型ではないＡｄ−Ｅ７／ｗｔＣＤ４０Ｌを含めて，他の対照ベクター（Ａｄ−Ｅ７／ｗｔＣＤ４０Ｌ；ａｄ−ｗｔＣＤ４０Ｌ；Ａｄ−ｓｉｇ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌ）では有意な増加は生じなかった。図９を参照。
８．Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターは老齢（１８月齢）マウスにおいてウイルス抗原免疫を増加させる
Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを用いて老齢（１８月齢）マウスにおいてウイルス抗原免疫を引き出す能力を評価した。Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを１ｘ１０８ＩＵで皮下に１回注射した。ベクター注射後第７，１４および２１日に，Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質（１０マイクログラム／注射）をブースターとして皮下注射した。７日後，マウスを犠牲死させ，脾臓におけるＥ７特的Ｔ細胞のレベルをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。
インターフェロンガンマ陽性細胞／１００，０００脾臓細胞のレベルは，高齢マウスにおいては２２５に，若年マウスにおいては７２５に増加したが，ＩＬ−４細胞の数は１００抗原特異的Ｔ細胞／１００，０００脾臓細胞以上に増加した。図１０を参照。１８月齢マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の誘導の大きさは２月齢マウスにおいて見られるより低かったが，１８月齢マウスにおける応答の絶対的大きさは，若年マウスにおいて他のほとんどのワクチンにより誘導される範囲であり，明らかに強い免疫応答を生ずるのに十分である。
老齢マウスの腫瘍組織における抗原特異的Ｔ細胞の総ＣＤ８Ｔ細胞に対するパーセンテージの増加を，ワクチン接種の前後にＥ７テトラマーにより測定した。Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌワクチンは，腫瘍組織における抗原特異的Ｔ細胞のレベルの１０倍の増加を誘導した（図１１）。
老齢マウスにおける，ワクチン接種後の腫瘍組織中の細胞の総数のパーセンテージとしてのＴ細胞の数の増加も測定した。Ｔ細胞のパーセンテージの増加は，老齢マウスにおいてはワクチン接種後に１０倍増加した（図１２）。
また，２月齢および１８月齢マウスにおける，ワクチン接種により誘導される抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球（“ＣＴＬｓ”）の増加のレベルを，蛋白質ブースト免疫感作スキームを用いて評価した。老齢ならびに若年動物における，ワクチン接種後の抗原特異的ＣＴＬの増加を図１３に示す。この場合も，１８月齢マウスにおいて見られるＣＴＬの増加のレベルは，２月齢マウスにおけるものより低いが，１８月齢マウスにおける誘導の絶対的な大きさは印象的である。
９．２月齢（“若年”）マウスにおける，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０ＬベクターＰｒｉｍｅを用いるＶ，ＶＰ，ＶＰＰ，およびＶＰＰＰワクチン接種計画により誘導される免疫応答
２月齢Ｃ５７ＢＬ６マウスに，以下の４種類のワクチン接種計画のいずれかを用いてワクチンを接種した：Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌの１回の皮下注射（“Ｖ”），または１回の皮下ベクター注射の後に，１回の融合蛋白質ブースト（“ＶＰ”），２回の融合蛋白質ブースト（“ＶＰＰ”），または３回の融合蛋白質ブースト（“ＶＰＰＰ”）。ここで，各ブーストは１週ごとにＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質の皮下注射により行った。Ｅ７特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルおよび血清中のＥ７特異的抗体レベルを測定した。図２７に示されるように，ワクチン接種したマウスにおけるＥ７特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルは，ＶからＶＰへ，ＶＰＰへ，さらにＶＰＰＰへと増加した。ＶＰ，ＶＰＰおよびＶＰＰＰは，互いに有意に相違する（ｐ＜０．０５）。図２８に示されるように，ワクチン接種したマウスにおいては，Ｅ７Ｂ細胞エピトープであるＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤに対するＥ７特異的血清抗体のレベルは，最初のベクター注射後の融合蛋白質ブーストの数にしたがって，有意に増加した（ＶＰ＜ＶＰＰ＜ＶＰＰＰ）。希釈率１／１０００において，ワクチン接種した群とワクチン接種していない対照群における血清抗体レベルの相違は，ＶＰマウス（ｐ＝０．００４）；ＶＰＰマウス（ｐ＜０．００１）；およびＶＰＰＰマウス（ｐ＜０．０００１）について統計学的に有意であった。
１０．１８月齢（“老齢”）マウスにおける，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣ４０ＬベクターＰｒｉｍｅを用いるＶ，ＶＰ，ＶＰＰ，およびＶＰＰＰワクチン接種計画により誘導される免疫応答
１８月齢Ｃ５７ＢＬ６マウスに，以下の４種類のワクチン接種計画のいずれかを用いてワクチン接種を行った：Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌの１回の皮下注射（Ｖ），または１回の皮下ベクター注射後に１週ごと１回（ＶＰ），２回（ＶＰＰ）または３回（ＶＰＰＰ）のＥ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質ブーストの皮下注射。Ｅ７特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルおよび血清中のＥ７特異的抗体レベルを測定した。図２９に示されるように，ワクチン接種したマウスにおけるＥ７特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルの増加は，ＶＰＰおよびＶＰＰＰレベルにおいてのみ検出可能であった。図３０に示されるように，ワクチン接種したマウスのＥ７Ｂ細胞エピトープであるＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤに対するＥ７特異的血清抗体のレベルは，最初のベクター注射後に３回の蛋白質ブースト注射（ＶＰＰＰ）を行った場合にのみ有意に増加した。
１１．老齢（１８月齢）マウスにおける，ウイルス抗原に対するＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチンおよび蛋白質ブーストがウイルス抗原に陽性の細胞の成長に及ぼす影響
１８月齢マウスにおけるＥ７陽性腫瘍成長の抑制は，ベクターワクチン接種単独を受けた２月齢マウスにおける腫瘍成長の抑制のレベルとほぼ等しかった（図１４）。Ａｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターにより誘導される免疫応答の誘導に及ぼす蛋白質ブーストの影響を調べた。試験Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスに１ｘ１０８ＰＦＵのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを注射した後，ベクター注射の７，１４および２１日後に３回の蛋白質ブースト（１回の注射につき１０μｇ蛋白質）を行った。
これらの実験のエンドポイントは，腫瘍なしのままであったマウスのパーセンテージにより測定した，Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスにおけるＥ７腫瘍成長のインビボ抑制であった。図１５に示されるように，Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の皮下注射は現存する腫瘍の退行を誘導し，腫瘍陽性マウスを腫瘍陰性マウスに転換した。これらのデータは，Ａｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの皮下および蛋白質ブーストが１８月齢マウスにおいて現存し進行性である腫瘍の完全な退行を誘導しうることを示唆する。
１２．老齢マウスにおけるＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチン接種が腫瘍組織におけるＣＤ４ＦＯＸＰ３陰性制御Ｔ細胞のレベルに及ぼす影響
ＣＤ４ＦＯＸＰ３陰性制御Ｔ細胞の増加は，ワクチンがワクチン接種に対する免疫応答の程度を抑制する程度を制限することが報告されている。ワクチン接種に伴ってＦＯＸＰ３陰性制御ＣＤ４Ｔ細胞のレベルが低下することが報告されている。したがって，１ｘ１０８ＰＦＵのＡｄ−ｓｉｇ−Ｅ７／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクター（蛋白質ブーストを含む）の前後における腫瘍組織におけるＦＯＸＰ３ＣＤ４Ｔ細胞のレベルをＦＡＣＳ分析により測定した。図１６に示されるように，老齢動物におけるワクチン接種は，腫瘍組織におけるＣＤ４ＦＯＸＰ３陰性制御Ｔ細胞を２倍低下させた。
１３．若年（２月齢）マウスにおけるＡｄ−ｓｉｇ−ｒＨ２Ｎ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターワクチン接種後の腫瘍組織におけるＣＤ８エフェクター細胞およびＣＤ４陰性制御Ｔ細胞のレベル
Ａｄ−ｓｉｇ−ｒＨ２Ｎ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターによるワクチン接種の後，腫瘍組織における抗原特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞のレベルを測定した。この製造は，米国特許公開２００５−０２２６８８８（出願番号１１／００９，５３３），標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ”，１２／１０／２００４出願）に記載されている。Ａｄ−ｓｉｇ−ｒＨ２Ｎ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの２回の皮下注射の前および後に，ｒＨ２Ｎ．Ｔｇマウスの皮下腫瘍結節をすりつぶした。１回の注射あたり１ｘ１０８ＰＦＵのベクターを投与し，注射は７日間あけて行い，最後の注射の１０日後に腫瘍結節を単離した。すりつぶした後，腫瘍組織から単一の細胞懸濁液を作成し，０．０３％ＤＮＡｓｅで処理し，次に０．１４％コラゲナーゼＩで処理し，ナイロンメッシュを通して濾過した。ワクチン接種後に腫瘍組織から単離したエフェクターＴ細胞の数（ＣＤ８＋，ＣＤ４４＋，ＬＹ６Ｃ＋およびＣＤ６２Ｌ−）は，およそ５−７倍増加していた（図１７）。このデータは，ｒＨ２Ｎ．ＴｇマウスにおけるＡｄ−ｓｉｇ−ｒＨ２Ｎ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌワクチン接種後のｒＨ２Ｎ陽性腫瘍細胞の成長の抑制は，部分的には，ｒＨ２Ｎ特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞の腫瘍組織への移動により媒介されることを示唆する。
腫瘍浸潤ＣＤ８エフェクターＴ細胞からＲＮＡを単離し，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現系を用いてワクチン接種の前後で遺伝子発現のパターンを比較した。腫瘍組織に浸潤したエフェクターＴ細胞における２１種の既知のケモカインレセプターおよびリガンドの発現レベルも調べた。腫瘍組織中のｒＨ２Ｎ特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞において，組織炎症の血管外部位へのＴ細胞のターゲティングに関与するＣＣＬ３（２．８倍の増加）およびＣＣＲ５（１６倍の増加）のレベルが増加した。ケモカイン経路は，エフェクター細胞および記憶Ｔ細胞の，ワクチン接種または感染のリンパ節漏出部位から炎症または感染を有する組織部位への移動において主要な役割を果たす（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ２００３ １５：３４３−３４８；Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ １９９８ ６：１０５−１１０）。
１４．Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５Ｎ１ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを用いる２月齢マウスおよび１８月齢マウスにおけるＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン蛋白質に対する免疫の誘導
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスからのＨＡ配列の一部をＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターにおける抗原として用いて，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌ発現ベクターを作成した。下記に記載されるように，このベクターはマウスにおいて免疫応答を誘導し，Ｈ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルの有意な増加が観察された。
ａ）Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌ発現ベクターの構築
ｉ）Ｈ５ＨＡ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌ（マウス）
１９９７年に香港で致死的な呼吸器疾患の小児から最初に単離された（例えば，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ ２７９：３９３−９６；Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８ ７３：２０９４−９８；Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２００２ ８（８）：１−１２を参照）Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ株（Ｈ５ＨＡ）の，ヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の残基２３０−２５０（図２を参照，下線）に連結された，レセプター結合領域のアミノ酸残基１３５−１７５に対応する一部をコードするＤＮＡ（配列番号６９）を下記に示す。5’AAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAG-3’(配列番号69)
上述のＨＡコンストラクトは，以下の２つのプライマーを用いて作成した。
フォワードプライマー：
5’AAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGC-3’(配列番号70)および
リバースプライマー：
5’CTTTAAAATTGTCCAGAAGAACTCCATTCTTCCACTTTGCCCGTTTACTTTGGGTCTAGTAGCTGTTGGGTATGCACTGTTCTTTTTGATAAGCCATACCAC-3’(配列番号71)
ＨＡ領域をコードする二本鎖核酸は次のようにして作成した。オリゴを５０μｌのＨ２Ｏ（約３ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。１μｌの各オリゴ（フォワードおよびリバースプライマー）を４８μｌのアニーリングバッファおよび７μＬのｄｄＨ２Ｏ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ）に加え，９５℃で４分間，７０℃で１０分間インキュベートし，約４℃までゆっくり冷却した。
マウスＩｇＧカッパ鎖遺伝子のシグナル配列をコードするＤＮＡを鳥ＨＡ抗原エピトープをコードするＤＮＡの上流に含む転写ユニットは，前節で作成した二本鎖ＨＡおよび下記のプライマーを用いてＰＣＲにより生成した。
Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＨＡ（ｉ．ｅ．，カッパシグナル−Ｈ５フラグメント）は，４ラウンドのＰＣＲ増幅（第１ラウンド：プライマー４＋５；第２ラウンド：プライマー３を加える；第３ラウンド：プライマー２を加える；第４ラウンド：プライマー１を加える）により，以下の条件で作成した。９４℃で３分間保持；９４℃で３０秒間，５５℃で３０秒間，７２℃で３０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；４℃で保持。Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＨＡをコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡTM３．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入して，ｐｃＤＮＡ−Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＨＡを得た。
マウスＣＤ４０リガンドｃＤＮＡテンプレートを用いてマウスΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーを増幅するためのプライマーは以下のとおりである。
マウスΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーフォワードプライマー（ＭＣＤ４０ＬＳＰＦ）：
マウスＣＤ４０Ｌリバースプライマー（ＭＣＤ４０ＬＲ）：
これらのプライマーは，マウスＣＤ４０Ｌの５２−２６０をコードするΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーを増幅する。フォワードプライマーＭＣＤ４０ＬＳＰＦは，転写ユニットの抗原とＣＤ４０リガンド（ＭＣＤ４０Ｌ）との間に位置すべき１０残基スペーサー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ）（配列番号４８）をコードする。ＰＣＲは，フォワードおよびリバースプライマー（配列番号５０および５１）およびテンプレートとしてプラスミドｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌを用いて，以下の条件で行った。９４℃で３分間保持；９４℃で４５秒間，５５℃で４５秒間，７２℃で７０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；４℃で保持。このＰＣＲにより，フラグメント“スペーサー＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ”が得られ，これをｐｃＤＮＡ３ＴＯＰＯにサブクローニングした。次に，“スペーサー＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ”フラグメントを，ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で制限エンドヌクレアーゼ消化したプラスミドｐｃＤＮＡ−ｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡに挿入した。ｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３ＴＯＰＯからＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ制限酵素を用いて切り出し，ｐｓｈｕｔｔｌｅＣＭＶのＣＭＶプロモーターの下流に挿入した（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３８：７３−７８，１９９９を参照）。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）と名付けた。すなわち，転写ユニットｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）は，カッパ分泌シグナル，次に鳥インフルエンザＨＡの細胞外ドメイン，次に１０アミノ酸のリンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；配列番号４８），次にマウスＣＤ４０リガンド残基５２−２６０をコードする。
この増幅したＨ５ＨＡ配列を分泌性マウスＩｇカッパ配列（ｓｉｇ）とリンカー（ｓｐ）との間に位置するようクローニングした。このリンカーは，ＡｄＥａｓｙシャトルベクター中のｅｃｄｈＣＤ４０Ｌ（ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン）をコードする遺伝子につなげる。ベクターおよびここから発現される可溶性融合蛋白質は上述のようにして作成する。
ｉｉ）Ｈ５ＨＡ−ｅｃｄＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）
ＨＡ／ヒトＣＤ４０リガンド融合蛋白質（ｐｓｈｕｔｔｌｅＫ／ＨＡ−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）をコードするベクターの構築を以下に説明する。ヒトＣＤ４０リガンドｃＤＮＡテンプレートを用いてヒトΔＣｔΔＴＭＣＤ４０Ｌ＋スペーサーを増幅するためのプライマーは以下のとおりである。
ヒトΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサーフォワードプライマー（ＨＣＤ４０ＬＳＰＦ）（ＣＤ４０Ｌ配列は斜体で示す）：
ヒトＣＤ４０Ｌリバースプライマー（ＨＣＤ４０ＬＲ）
ＰＣＲは，上述のプライマーおよびテンプレートとしてプラスミドｐＤＣ４０６−ｈＣＤ４０Ｌを用いて，以下の条件で行った。９４℃で３分間保持；９４℃で４５秒間，５２℃で４５秒間，７２℃で７０秒間のサイクル（３０サイクル）；７２℃で７分間保持；４℃で保持。この増幅により，ヒトＣＤ４０Ｌの４４−２６１およびアミノ末端の１０アミノ酸スペーサーをコードする“−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）”フラグメントを得た。フォワードプライマーＨＣＤ４０ＬＳＰＦは，転写ユニットの腫瘍抗原とＣＤ４０リガンド（ｈＣＤ４０Ｌ）との間に位置すべき１０残基スペーサー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；一文字コード；配列番号４８）をコードする。“ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）”フラグメントをｐｃＤＮＡ３ＴＯＰＯにサブクローニングした。次に，“スペーサー＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）”フラグメントをＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で制限エンドヌクレアーゼ消化したプラスミドｐｃＤＮＡ−ｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡに挿入した。ｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３ＴＯＰＯからＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限酵素を用いて切り出し，ｐｓｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＣＭＶプロモーターの下流に挿入した（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３８：７３−７８，１９９９を参照）。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）と名付けた。すなわち，転写ユニットであるｓｉｇ−ＡｆｌｕＨＡ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ｈｕｍａｎ）は，カッパ分泌シグナル，次に鳥ｆｌｕｅＨＡの細胞外ドメイン，次に１０アミノ酸リンカー（ＬＥＮＤＡＱＡＰＫＳ；配列番号４８），次にヒトＣＤ４０リガンド残基４４−２６１をコードする。
この増幅したＨ５ＨＡ配列を，分泌性マウスＩｇカッパ配列（ｓｉｇ）とリンカー（ｓｐ）との間に位置するようにクローニングした。リンカーは，ＡｄＥａｓｙシャトルベクター中のｅｃｄｈＣＤ４０Ｌ（ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン）をコードする遺伝子につながっている。組換えアデノウイルスベクターは上述したようにしてＡｄＥａｓｙベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて作成し，Ａｄ−Ｋ／ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを得た。融合蛋白質は以下のようにして調製した。
ｂ）マウスにおける免疫の誘導
Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ／ｅｃｄｈＣＤ４０Ｌベクターを，参考文献（ＰＮＡＳ ２００３ １００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３）の方法にしたがって投与用に用意し，免疫応答性マウス（２月齢）に２回（７日間隔で）皮下注射した。免疫感作から７日後，ＣＤ８細胞を単離し，Ｈ５ＨＡエピトープの存在下で２日間インキュベートし（ＨＡペプチドでパルスした同系のガンマ線照射脾臓細胞とともに培養し，４８時間培養），ＥＬＩＳＰＯＴプロトコルにしたがって発色させＰＮＡＳ ２００３ １００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照），次にワクチン接種の前後で脾臓細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＨ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルについて調べた。図１８に示されるように，Ｈ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルは，ワクチン接種してないマウス（Ｎ＝４）と比較して，ワクチン接種したマウス（Ｎ＝４）の脾臓において有意に増加した，ｐ＜０．０５。
ｃ）若年および老齢マウスにおける免疫の誘導
２月齢（“若年”）Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝４）および１８月齢（“老齢”）Ｃ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝４）に，Ａｄ−ｓｉｇ−ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの１回の皮下注射を行い，次に最初のベクター注射後第７日から初めて７日間隔で３回，ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質を注射した。年齢のマッチしたワクチン接種していないマウスを対照として用いた。すべての群について，ＨＡ特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定し，ＨＡ特異的血清抗体のレベルはＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。図２３に示されるように，２月齢のマウス（ｐ＝０．０００４）および１８月齢のマウス（ｐ＝０．０００１）について，ワクチン接種したマウスのＨＡ特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルは，年齢のマッチしたワクチン接種していない対照群と比較してワクチン接種した群において統計学的に有意に増加した。図２４は，２月齢のマウス（ｐ＝０．００４）および１８月齢のマウス（ｐ＝０．０１５）について，Ｈ５Ｎ１ＨＡ抗原に特異的な血清抗体のレベルが，年齢のマッチしたワクチン接種していない対照群と比較してワクチン接種した群において統計学的に有意に増加していたことを示す（１／２５０希釈で測定）。
１５．Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質に対するＡｄ−ｓｉｇ−Ｈ５Ｎ１Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターによる２月齢マウスおよび１８月齢マウスにおける免疫の誘導
ＨＡ抗原の配列に転位を有するインフルエンザウイルス株においてはＨ５Ｎ１のＭ２蛋白質は変化していない。しかし，ワクチン接種の間にはこれは弱い抗原である。したがって，Ｍ２遺伝子のコーディング配列の一部をＡｄ−ｓｉｇ−Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ中のＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインに連結してその免疫原性を高めた。
ａ）Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５Ｎ１Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの構築
上述したように，Ｍ２蛋白質は通常は免疫原性ではないが，これを別の免疫原性蛋白質配列とともにキメラ蛋白質中に含ませることにより免疫原性とすることができる。Ｍ２の細胞外ドメインからのアミノ末端または内部の“免疫優性ループ”をそのようなキメラ構造において用いた。
Ｍ２がＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス由来のものであるＡｄ−Ｋ−Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを構築して，Ｍ２に対する免疫応答を生じさせた。
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）のＭ２蛋白質のアミノ酸残基１−２４に対応し，ＤｅＦｉｌｌｅｔｔｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３７：１４９−６１，２００５）により報告されている，天然の蛋白質の１７および１９位のシステイン残基がセリン残基に変異しているＭ２蛋白質の部分のアミノ酸配列を以下に示す。
MSLLTEVDTLTRNGWGSRSSDSSD（配列番号７７）
配列番号７７をコードするＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは次のとおりである：
Ｍ２センスオリゴヌクレオチド：
5’-ATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTCCAGATCCAGCGATTCAAGTGAT-3’（配列番号７８）
Ｍ２アンチセンスオリゴヌクレオチド：
5’-ATCACTTGAATCGCTGGATCTGGACCCCCATCCGTTTCTGGTAAGCGTGTCAACCTCGGTTAGAAGGCTCAT-3’（配列番号７９）
オリゴヌクレオチドをＳＴＥバッファに高濃度で（約１−１０ＯＤ２６０ユニット／１００μＬ）溶解した。２つの鎖を等モル量で一緒に混合し，９４℃に加熱し，約４℃までゆっくり冷却した。アニーリングしたＤＮＡをＴ４ＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて標準的な条件下でリン酸化した。得られた二本鎖ＤＮＡを，以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
プライマー１：
5’-ACGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTG-3’
（配列番号８０）
プライマー２
5’-TCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTC-3’
（配列番号８１）
プライマー３：
5’-TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATG-3’
（配列番号８２）；
プライマー４：
5’-TGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATGATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGAC-3’
（配列番号８３）；および
プライマー５：
5’-CCGCTCGAGATCACTTGAATCGCTGCATCTGCACC-3’
（配列番号８４）．
４ラウンドのＰＣＲ増幅（第１ラウンド：プライマー４＋５；第２ラウンド：プライマー３を加える；第３ラウンド：プライマー２を加える；第４ラウンド：プライマー１を加える）により，上流カッパシグナル配列を有するＫ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２フラグメントを作成した。Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ（商標）３．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローニングして，プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２を得た。
“スペーサー＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）”フラグメントをＸｈｏＩおよびＸｂａＩを用いてｐｃＤＮＡ３ＴＯＰＯ−ｓｐ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌから切り出し，ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で制限エンドヌクレアーゼ消化したプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２に挿入した。Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）をコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３ＴＯＰＯからＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ制限酵素を用いて切り出し，ｐｓｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。このベクターをｐｓｈｕｔｔｌｅｓｉｇＡｆｌｕＭ２／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（マウス）と名付けた。
組換えアデノウイルスベクターは，ＡｄＥａｓｙベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて上述したように作成して，Ａｄ−Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＭ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを得た。融合蛋白質は下記のようにして製造した。
ｂ）老齢および若年マウスにおける免疫の誘導
２月齢のＣ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝５）および１８月齢のＣ５７ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターの１回の皮下注射を行い，次に，最初のベクター注射の後第７日および２１日に，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質を注射した。年齢のマッチしたワクチン接種していないマウスを対照として用いた。すべての群について，Ｍ２特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定し，Ｍ２特異的血清抗体のレベルはＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。図２５に示されるように，２月齢（ｐ＝０．０００６）ならびに１８月齢のマウス（ｐ＝０．０００９）の両方において，ワクチン接種したマウスのＭ２特異的脾臓ＣＤ８Ｔ細胞のレベルは，年齢のマッチしたワクチン接種していない対照群と比較して，ワクチン接種した群において統計学的に有意に増加した。図２６は，２月齢マウス（ｐ＝０．００２８）および１８月齢マウス（ｐ＝０．００２５）について，ワクチン接種した群において，年齢のマッチしたワクチン接種していない対照群と比較して，Ｈ５Ｎ１Ｍ２抗原に特異的な血清抗体のレベルが統計学的に有意に増加したことを示す（１／２５０希釈で測定）。これらのデータは，Ａｄ−ｓｉｇ−Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌワクチンでプライミングし，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質でブーストするワクチンにおけるＣＤ４０ＬとＭ２蛋白質との連結が免疫応答を有意に誘導することを示す。
１６．Ａｄ−ｓｉｇ−Ｈ５ＨＡ−Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌキメラベクターの構築
ＨＡとＭ２蛋白質とのキメラ融合である抗原を有するＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターは，以下のようにして構築した。Ｈ５Ｎ１ＨＡおよびＭ２配列はＨ５Ｎ１テンプレートからＰＣＲ増幅により合成した。Ｈ５Ｎ１ＨＡ抗原をコードする例示的ＤＮＡ配列は下記のとおりである。
5’-AAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAG-3’（配列番号６９）
キメラＨＡ−Ｍ２をコードするＤＮＡ配列は下記に示され，Ｈ５Ｎ１ＨＡ配列をＭ２配列の５’側に示す。下線を施したセグメントはこれらの２つのセグメントの間に付加された配列である。
5’-AAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGGATATCATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGAT-3’（配列番号４３）
上述のＤＮＡは下記のキメラＨＡ−Ｍ２蛋白質をコードする：
KSSWSNHDASSGVSSACPYLGRSSFFRNVVWLIKKNSAYPTATRPKVNGQSGRMEFFWTILKDIMSLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD（配列番号８５）
上述のＨＡ−Ｍ２キメラ配列を分泌シグナル配列（例えば，マウスＩｇＧカッパ鎖シグナルまたは分泌性配列）（ｓｉｇ）の下流にクローニングした。次にこのｓｉｇＨＡ−Ｍ２分子を３０ヌクレオチドリンカー配列を介してｅｃｄｈＣＤ４０ＬのＤＮＡに連結した。ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ転写ユニットを，先に記載され報告された方法によりＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターに挿入した（例えば，ＰＮＡＳ ２００３ １００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照）。次にベクターを２９３細胞から単離し，プラークを精製し，ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ挿入を配列決定し，Ｅ１Ａに対するＰＣＲアッセイにより複製可能アデノウイルスについて調べた。
１７．アデノウイルス発現コンストラクトの試験および使用
Ｈ５Ｎ１，Ｈ３Ｎ２または他のＡ型ウイルス株，例えばＨ２Ｎ２またはＨ１Ｎ１からのＨＡ，ＮＡ，またはＭ２をＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターにクローニングした。インフルエンザ融合蛋白質を発現させ，蛋白質ブーストとして用いた。一般に，ベクターを２回（７日あけて）投与するか，またはベクターを注射した後に第７日および２１日に２回の蛋白質ブーストを行った。被験者はＴＡＡがインフルエンザ抗原で置き換えられているＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターでワクチン接種した。
ａ）ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌのインビトロ安定性およびＤＣの活性化
発現したインフルエンザ抗原蛋白質の安定性は以下のようにして評価した。６ｈｉｓタグを付けたＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質を生成し，一旦２９３感染細胞から放出させた後，ニッケルカラムにより精製した。蛋白質を還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより調べて，ＨＡ，Ｍ２またはＨＡＭ２を抗原としたときに三量体構造が安定であるかどうかを判定した。先に報告されている方法により，ｆｌａｇ抗体を用いるウエスタンブロッティングによりＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０ＬおよびＨＡＭ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質の相対的安定性を調べた（Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照）。先に報告されている方法により，組換え蛋白質をマウス骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）に加えた（Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＤＣ Ｖｅｃｔｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ２００６）。これらの実験のエンドポイントは以下のとおりである：ＣＤ８６の出現についてのＤＣのＦＡＣＳ分析およびＣＣＲ７遺伝子の発現についてのＰＣＲアッセイ（ＰＮＡＳ ２００４ １００：１５１０１−１５１０６；Ｂｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３）。
ｂ）各Ａｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌによる免疫応答のインビボ誘導
各インフルエンザワクチンベクターについて，以下のようにして免疫応答の誘導を評価した。２月齢および１８月齢のＢａｌｂＣマウスに７日あけて２回の皮下注射を行った。最後の注射の７，１４および２１日後に，動物を犠牲死させ，以下のアッセイを行った。
ａ．血清中のＡＧ特異的抗体についてのＥＬＩＳＡ（方法についてはＢｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照）
ｂ．脾臓におけるＡＧ特異的ＣＤ８エフェクター細胞のレベルについてのＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬアッセイ（方法についてはＢｌｏｏｄ ２００４ １０４：２７０４−２７１３を参照）
ｃ）ＡＧＧ炎症の部位におけるＣＤ８エフェクターＴ細胞およびＣＤ４Ｔ陰性制御細胞のレベルの測定
ＣＤ８およびＣＤ４細胞のレベルを評価した。２月齢および１８月齢のＢａｌｂＣマウスに，ＨＡまたはＭ２またはＨＡＭ２転写ユニットを有する同系の腫瘍細胞株を皮下注射した。腫瘍結節が１５０ｍｍ３のサイズに達したとき，試験マウスにＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクター（７日あけて２回の注射）を皮下注射した。最後のワクチン接種から７日後，動物を犠牲死させた。腫瘍をすりつぶし，ＤＮＡａｓｅおよびコラゲナーゼ処理し，ナイロンメッシュを通して濾過し，ワクチン接種の前後にＣＤ８エフェクター細胞およびＣＤ４ＣＤ２５ＦＯＸＰ３Ｔ陰性制御細胞の数をＦＡＣＳにより測定した。
ｄ）ＴＡＡ陽性同系の腫瘍細胞株の成長の抑制
インフルエンザ抗原陽性細胞株の成長の抑制も評価した。ＨＡ陽性またはＭ２陽性またはＨＡＭ２陽性の同系の細胞株（５００，０００細胞）を２月齢または１８月齢のマウスの皮下に注射した。２回のＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ注射（７日あけて）によりワクチン接種した後に，腫瘍細胞株を注射したマウスの成長曲線を追跡した。成長曲線がこの実験のエンドポイントである。
ｅ）１回のＡｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ皮下注射，およびブーストとして２回のＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質注射に基づくワクチン接種の影響
上述の実施例においては，Ａｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌの１回の皮下注射の後，１０マイクログラムのＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質を第７日および第２１日に２回皮下に注射することにより，血清における抗原特異的抗体および試験マウスにおけるＴＡＡ特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞のレベルの両方とも劇的に上昇したことが示された。インフルエンザ抗原Ａｄ−ｓｉｇ−ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌベクターを１回注射した後，第７日および第２１日の２回，ＴＡＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ蛋白質（１０マイクログラム）を皮下注射によりブースター投与した。
ブースターの回数，ワクチンの投与の経路，およびアジュバントの添加を調節すると，抗原性特異的ＣＤ８細胞（ＥＬＩＳＰＯＴにより測定して２００個の陽性細胞／１００，０００個の脾臓細胞）または抗体（６倍の増加）の適切な増加が引き出される。
１８．Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニン蛋白質に対するインフルエンザ抗原／ＣＤ４０リガンド融合蛋白質を用いる，２月齢マウスにおける免疫の誘導
配列番号２１は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）からのＨＡ配列の一部を示し，これをＨＡ−ＣＤ４０Ｌ融合蛋白質中の抗原として用いた。以下に記載されるように，この融合蛋白質は，ワクチン接種した動物の血清における抗Ｈ５ＨＡ抗体のレベルにより示されるように，マウスにおいて免疫応答を誘導した。
配列番号２１は，アミノ酸残基１３５−１７５に対応するレセプター結合領域に存在し，Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ株（Ｈ５ＨＡ）のヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の残基２３０−２５０（図２を参照，下線）に連結されている。この株は，１９９７年に香港で致死的な呼吸器疾患の小児から最初に単離された（例えば，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ ２７９：３９３−９６；Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８ ７３：２０９４−９８；Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２００２ ８（８）：１−１２を参照）。
KSSWSNHDASSGVSSACPYLGRSSFFRNVVWLIKKNSAYPTATRPKVNGQSGRMEFFWTILK（配列番号２１）
ＨＡ−ＣＤ４０Ｌ融合は以下のようにして調製した。ＣＤ４０Ｌプラスミドは，プラスミドｐｃＤＮＡ−ｓｉｇ−ｈＭＵＣ−１／ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（このプラスミドの構築は，米国特許公開２００５−０２２６８８８に記載されている）をテンプレートとして用いて，ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬをＰＣＲ増幅することにより作成した。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲの条件は以下のとおりである：
プライマー１（フォワード）（ＸｃｍＩ制限部位は下線で示す；ＥｃｏＲＶ制限部位は下線および斜体で示す）：
プライマー２（フォワード）（ＥｃｏＲＶ制限部位は下線および斜体で示す）：
および
プライマー３（リバース）（ＥｃｏＲＩ制限部位は下線および太字で示す）：
ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは，２ラウンドのＰＣＲ増幅により増幅した（第１ラウンド：プライマー２＋３；第２ラウンド：プライマー１＋３）。ＰＣＲは，ＧＣ−ＲＩＣＨＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ）を用いて，以下の条件下で行った：
ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬをコードするＤＮＡをｐＴｒｉＥｘ−２制限部位ＸｃｍＩ（ＣＣＡＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧ）およびＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）に挿入した。最終的なベクターをｐＴｒｉＥｘ−２ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌと名付けた。
上述のＨＡ抗原をコードするｃＤＮＡ（配列番号２１）を，プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｋ／ＡｖｉａｎＦｌｕＨＡ（上述）から下記のＰＣＲプライマーを用いて増幅した：
ＨＡフォワードプライマー（ＸｃｍＩ制限部位は下線で示す）：
5’-AACCATCACTCTTCTGGTAGATCTAAAAGTTCTTGGTCCAATC-3’（配列番号８９）および
ＨＡリバースプライマー（ＸｈｏＩ制限部位は下線で示す）：
5’-AAACTCGAGTCTGATATCCTTTAAAATTGTCCAGAAGAACTC-3’（配列番号９０）．
ＰＣＲは以下の条件下で行った：
ＰＣＲ増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯＴＡベクターにライゲーションして，ｐｃＤＮＡ３．１／ＨＡと名付け，次にＸｃｍＩおよびＥｃｏＲＶ部位を用いて発現プラスミドｐＴｒｉＥｘ−２ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ中にサブクローニングして，プラスミドｐＴｒｉＥｘ−２ＨＡ／ｍＣＤ４０Ｌを作成した。コンピテント細胞（Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３ ｐＬａｃＩ）をｐＴｒｉＥｘ−２ＨＡｍＣＤ４０Ｌでトランスフォームし，トランスフォームした細胞の単一コロニーを選択した。トランスフォームした細胞からＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてＨｉｓタグ付きＨＡ／ｍＣＤ４０Ｌ融合蛋白質を生成した。蛋白質発現の後，得られた細胞を含む培地を５０００ｇで１０分間遠心分離し，得られた上清を廃棄した。細胞は，ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）を用いて次のようにして溶解した：ペレット化した細胞１ｇあたり１０ｍＬの溶解バッファを加え；溶解バッファは，１０ｍＬのＣｅｌＬｙｔｉｃＢ試薬，０．２ｍＬのリゾチーム，０．１ｍＬのプロテーゼ阻害剤および５００Ｕのベンゾナーゼを加えることにより調製し；細胞を溶解バッファに再懸濁し，振盪しながら室温で１０−１５分間インキュベートし；溶解した細胞を１６，０００ｇで１０分間遠心分離した。融合蛋白質は，ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）を用いて次のようにして精製した：各１０ｍＬの細胞溶解物上清について１ｍＬのＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用意し，製造元の“バッチ法”プロトコルを用いて融合蛋白質を単離し，３回の洗浄工程を実施した後，最後にＨｉｓタグ付き融合蛋白質を溶出し；溶出した蛋白質（３ｍＬバッファ中）を１０ＤＧ脱塩カラムに負荷し，４ｍＬのＰＢＳを用いてカラムから抽出した。溶出した蛋白質はＶｉｖａｓｐｉｎカラムにより濃縮した。
Ｈ５ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質（１０μｇ）を，免疫応答性マウス（２月齢）に，第０，７，および２１日に，１００μｇの水酸化アルミニウムハイドロゲルとともにまたはこれを用いずに皮下に注射した。３回目の免疫感作の７日後，血清サンプルを回収し，ＥＬＩＳＡによりＨＡに対する抗体についてアッセイした。図２５に示されるように，両方の群（すなわち，水酸化アルミニウムありおよびなし）について，ワクチン接種したマウス（Ｎ＝４）の血清のＨ５ＨＡ特異的抗体のレベルは，ＰＢＳのみを注射した対照マウス（Ｎ＝４）と比較して，有意に高かった。
ＨＡに対する抗体の中和用量（ＮＤ５０）は，次の方法を用いて決定した。
ＭＤＣＫ細胞を回収し，細胞懸濁液を３ｘ１０５細胞／ｍＬ（またはアッセイの最初に細胞が少なくとも９０％コンフルエントとなる他の適当な濃度）に希釈した。２００μＬの希釈細胞懸濁液を９６−ウエルマイクロプレートの各ウエルに移し，湿潤インキュベータで３７±２℃および５．０±２％ＣＯ２で，ウエルが少なくとも９０％コンフルエントとなるまで少なくとも１６時間インキュベートした。血清サンプルは，ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌでワクチン接種し，３回目の免疫感作から７日後の上述のマウスから取得した。３００μＬの血清のアリコートを播種培地で連続希釈した（希釈率１：５から１：２５６０）。ウイルスチャレンジ溶液は，チャレンジウイルスを播種培地で２００ＴＣＩＤ５０／１００μＬ（または２ｘ１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）で希釈することにより調製した。３００μＬのウイルスチャレンジ溶液を各血清希釈物に加えて，最終血清希釈率１：１０から１：５１２０の播種溶液を作成し，湿潤インキュベータで３７±２℃および５．０±２％ＣＯ２で１時間±５分間インキュベートした。ＭＤＣＫ細胞を含むプレートの各ウエルを２００μＬのハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄した後，１００μＬの播種溶液を接種し，湿潤インキュベータで３７±２℃および５．０±２％ＣＯ２で，１６時間以上，または対照（ウイルスなし）ウエルと比較して細胞病理学的効果（ＣＰＥ）が明白になるまでインキュベートした。ＮＤ５０は，播種したウエルの５０％でＣＰＥが存在しない希釈率であり，Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ法を用いて計算した。
２０（ＴＣ５０／ｍＬ）の標的チャレンジ濃度のウイルスにおいて，ＨＡで免疫した動物からの血清は，４．５６ｘ１０３の中和タイターを示した。１０倍高い希釈率のチャレンジウイルス（すなわち，２００（ＴＣ５０／ｍＬ））では，ＨＡで免疫した動物からの血清の中和効果は認められなかった。
１９．Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスのＭ２蛋白質に対するインフルエンザ抗原／ＣＤ４０リガンド融合蛋白質による２月齢マウスにおける免疫誘導
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）からのＭ２アミノ酸配列の一部をＭ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質中の抗原として用いた。下記に示すように，この融合蛋白質はマウスにおいて免疫応答を誘導した。すなわち，ワクチン接種した動物の血清において有意なレベルの抗Ｍ２抗体が検出された。
Ｍ２蛋白質の一部のアミノ酸配列は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）のＭ２蛋白質のアミノ酸残基１−２４に対応し，ここで，ＤｅＦｉｌｌｅｔｔｅら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３７：１４９−６１，２００５）に報告されるように，天然の蛋白質の１７および１９位のシステイン残基は，セリン残基に変異している。このアミノ酸配列を以下に示す：
MSLLTEVDTLTRNGWGSRSSDSSD（配列番号７７）
配列番号７７をコードするＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは以下のとおりである：
Ｍ２センスオリゴヌクレオチド：
5’-ATGAGCCTTCTAACCGAGGTTGACACGCTTACCAGAAACGGATGGGGGTCCAGATCCAGCGATTCAAGTGAT-3’（配列番号７８）
Ｍ２アンチセンスオリゴヌクレオチド：
5’-ATCACTTGAATCGCTGGATCTGGACCCCCATCCGTTTCTGGTAAGCGTGTCAACCTCGGTTAGAAGGCTCAT-3’（配列番号７９）
オリゴヌクレオチドを高濃度（約１−１０ＯＤ２６０ｕｎｉｔｓ／１００μＬ）でＳＴＥバッファに溶解した。２本の鎖を等モル量で一緒に混合し，９４℃に加熱し，約４℃までゆっくり冷却した。アニーリングしたＤＮＡをＴ４ＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて標準的な条件下でリン酸化した。得られた二本鎖ＤＮＡは，以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
Ｍ２フォワードプライマー（ＸｃｍＩ制限部位は下線で示す）：
Ｍ２リバースプライマー（ＸｈｏＩ制限部位は下線で示す）：
5’-AAACTCGAGTCTGATATCATCACTTGAATCGCTGGATCTGG-3’（配列番号９２）
ＰＣＲは以下の条件で行った。
ＰＣＲ増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯＴＡベクターにライゲーションし，ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍ２と命名し，次にＸｃｍＩおよびＥｃｏＲＶ部位を用いて発現プラスミドｐＴｒｉＥｘ−２ＨＳＦ１／ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌにサブクローニングして，プラスミドｐＴｒｉＥｘ−２Ｍ２／ｍＣＤ４０Ｌを生成した。コンピテント細胞（Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３ ｐＬａｃＩ）をｐＴｒｉＥｘ−２Ｍ２ｍＣＤ４０Ｌでトランスフォームし，トランスフォームした細胞の単一コロニーを選択した。Ｈｉｓタグ付きＭ２／ｍＣＤ４０Ｌ融合蛋白質は，トランスフォームした細胞からＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて製造した。蛋白質発現の後，得られた細胞を含む培地を５０００ｇで１０分間遠心分離し，得られた上清を廃棄した。細胞は，ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）を用いて以下のようにして溶解した。１グラムのペレット化した細胞につき１０ｍＬのＬｙｔｉｃバッファを加え；Ｌｙｔｉｃバッファは，１０ｍＬのＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ試薬，０．２ｍＬのリゾチーム，０．１ｍＬのプロテーゼ阻害剤および５００Ｕのベンゾナーゼを加えることにより調製し；細胞をＬｙｔｉｃバッファ中に再懸濁し，振盪しながら室温で１０−１５分間インキュベーションし；そして溶解した細胞を１６，０００ｇで１０分間遠心分離した。融合蛋白質は，ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）により，次のようにして精製した。１０ｍＬの細胞溶解物上清について１ｍＬのＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用意し，製造元の“バッチ法”プロトコルを用いて，３回の洗浄工程を行った後にＨｉｓタグ付き融合蛋白質を最終溶出することにより，融合蛋白質を単離し；溶出した蛋白質（３ｍＬバッファ中）を１０ＤＧ脱塩カラムに負荷し，４ｍＬのＰＢＳを用いてカラムから抽出した。溶出した蛋白質はＶｉｖａｓｐｉｎカラムを用いて濃縮した。
第０，７，および２１日に，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質（１０μｇ）を，１００μｇの水酸化アルミニウムハイドロゲルとともにまたはなしで，免疫応答性マウス（２月齢）に皮下注射した。３回目の免疫感作の７日後，血清サンプルを採取し，ＥＬＩＳＡによりＭ２に対する抗体についてアッセイした。図２６に示されるように，両方の群（すなわち，水酸化アルミニウムハイドロゲルありおよびなし）におけるＭ２特異的抗体のレベルは，ＰＢＳ（Ｎ＝４）のみを注射した対照マウスと比較して，ワクチン接種したマウス（Ｎ＝４）の血清において有意に高かった。
Ｍ２で免疫したマウスからの血清の中和用量（ＮＤ５０）は，上述の実施例に記載される方法を用いて決定した。標的化チャレンジ濃度のウイルス，すなわち２０（ＴＣ５０／ｍＬ）において，Ｍ２で免疫した動物からの血清は１．２７ｘ１０２の中和タイターを示した。チャレンジウイルスの１０倍高い希釈（すなわち２００（ＴＣ５０／ｍＬ））では，Ｍ２で免疫した動物の血清の中和効果は認められなかった。
本明細書で言及される全ての特許および文献は本発明が属する分野の技術者のレベルを示す。全ての特許および文献は，個々の文献が特定かつ個別に参照によって組み込まれることが示されるのと同じ程度で，参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例証的に記載する本発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素（単数または複数），制限（単数または複数）無しで適切に実施することができる。したがって，例えば本明細書においてそれぞれの場合で，“〜を含む”，“本質的に〜からなる”，および“〜からなる”という用語の任意のものを他の２つのいずれかで置き換えてもよい。使用した用語および表現は制限ではなく説明のための用語として使用されるものであり，それらの用語および表現の使用に際して明示および記載する特徴と同等のものまたはそれらの一部のいずれを排除することも意図しないが，認識されるように，本発明の特許請求の範囲内で種々の修飾が可能である。したがって，好ましい態様および任意の特徴によって本発明を特定的に開示したが，当業者は本明細書に開示する概念の改変および変更を行ってもよく，それらの修飾および変更は添付する請求の範囲に定義する本発明の範囲内にあると見なされることは理解すべきである。
他の態様は，添付の特許請求の範囲の範囲内である。
図１は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のアミノ酸配列を示す。 図２は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質のアミノ酸配列を示す。 図３は，Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のアミノ酸配列を示す。 図４は，Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質のアミノ酸配列を示す。 図５は，Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質のフラグメント，およびＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスのＭ２蛋白質のフラグメントをコードするヌクレオチド配列を示す。 図６は，ワクチンを接種したマウスにおける，Ｅ７陽性ＴＣ−１およびＥ７陰性ＥＬ−４細胞の成長を示す。 図７は，ワクチン接種したドナーマウスからの脾臓Ｔリンパ球を注射したマウスにおける，Ｅ７陽性ＴＣ−１細胞対Ｅ７陰性ＥＬ−４細胞の成長を示す。 図８は，試験マウスの注射後の生存日数のパーセントを示す。 図９は，種々のベクターコンストラクトを注射した後のＥ７特異的Ｔ細胞応答のレベルを示す。 図１０は，ワクチンを接種したマウスおよびワクチン接種していない若年および老齢マウスにおける，インターフェロンγおよびＩＬ４を産生する脾臓細胞のレベルを示す。 図１１は，免疫していないおよび免疫した老齢動物のＣＤ８集団抗原陽性腫瘍における抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 図１２は，ワクチン接種した老齢動物およびワクチン接種していない若年動物における，腫瘍結節に浸潤したＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 図１３は，ワクチン接種により誘導された細胞毒性Ｔ細胞活性を種々のエフェクター対標的比で示す。 図１４は，ワクチン接種した老齢および若年マウスにおけるＥ７腫瘍成長の抑制を示す。 図１５は，ワクチン接種した後の老齢および若年マウスにおけるＥ７腫瘍なしマウスのパーセンテージを示す。 図１６は，ワクチン接種する前後の，腫瘍中のリンパ球に浸潤している腫瘍の間のＦｏｘＰ３制御ＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。 図１７は，ワクチン接種したｒＨ２ｎ．Ｔｇマウスの腫瘍結節におけるエフェクターＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。 図１８は，ワクチン接種したマウスの脾臓におけるＨ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示す。 図１９Ａは，ノイラミニダーゼＨ５Ｎ１の例示的アミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列を示す。 図１９Ｂは，ノイラミニダーゼＨ５Ｎ１の例示的アミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列を示す。 図２０は，Ｈ５Ｎ１のＨＡの例示的アミノ酸配列を示す。 図２１は，Ｈ３Ｎ２株の例示的前駆体ＨＡ分子を示す。 図２２は，インフルエンザＡウイルス株Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／３１／９８（Ｈ３Ｎ２）のノイラミニダーゼの例示的アミノ酸配列を示す。 図２３は，ワクチン接種した老齢および若年マウスの脾臓細胞の調製物における，Ｈ５ＨＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示す。 図２４は，ベクターでワクチン接種した後，融合蛋白質で３回の蛋白質ブーストを行った老齢および若年マウスの血清におけるＨＡに対する抗体の存在を示す。 図２５は，ワクチン接種した老齢および若年マウスの脾臓細胞の調製物における，Ｍ２特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示す。 図２６は，老齢および若年マウスの血清における，ワクチン接種および融合蛋白質による２回の蛋白質ブースト後の，Ｍ２に対する抗体の存在を示す。 図２７は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された２月齢マウス（“若年”）の脾臓細胞の調製物におけるＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示す。 図２８は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された２月齢マウスの血清におけるＥ７特異的抗体のレベルを示す。 図２９は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された１８月齢マウス（“老齢”）の脾臓細胞の調製物におけるＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを示す。 図３０は，Ｖ，ＶＰ，ＶＰＰ，またはＶＰＰＰワクチン接種計画にしたがってワクチンを接種された１８月齢マウス（“老齢”）の血清におけるＥ７特異的抗体のレベルを示す。 図３１は，ＨＡ／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質の３回投与によるワクチン接種後のマウスの血清におけるＨＡに対する抗体の存在を示す。 図３２は，Ｍ２／ｅｃｄＣＤ４０Ｌ融合蛋白質の３回投与によるワクチン接種後のマウスの血清におけるＭ２に対する抗体の存在を示す。

Claims (87)

  1. 個体においてインフルエンザ抗原に対する免疫応答を生成させる方法であって，個体に有効量の発現ベクターを投与することを含み，ここで，前記ベクターは，分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを含み，前記融合蛋白質はインフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含むことを特徴とする方法。
  2. さらに，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む有効量の融合蛋白質を投与することを含む，請求項１記載の方法。
  3. 前記蛋白質は，ベクターの投与の後に投与される，請求項２記載の方法。
  4. 前記融合蛋白質の前記インフルエンザ抗原はグリコシル化されている，請求項１記載の方法。
  5. 前記融合蛋白質の前記インフルエンザ抗原はグリコシル化されていない，請求項１記載の方法。
  6. 前記インフルエンザ抗原はＨ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する，請求項１記載の方法。
  7. 前記インフルエンザ抗原は，インフルエンザウイルス蛋白質の少なくとも１つの抗原決定基を含み，前記ウイルス蛋白質はヘマグルチニン，ノイラミニダーゼおよびマトリクスプロテイン２からなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  8. 前記インフルエンザ抗原は，前記ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼおよびマトリクスプロテイン２の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む，請求項６記載の方法。
  9. 前記インフルエンザ抗原は，少なくとも２つの異なるウイルスインフルエンザ蛋白質に由来する少なくとも１つの抗原決定基を含むキメラインフルエンザ抗原を含む，請求項１記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つの抗原決定基は，ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはマトリクスプロテイン２の細胞外ドメインに由来するものである，請求項８記載の方法。
  11. 前記キメラインフルエンザ抗原は，ヘマグルチニンの細胞外ドメインのすべてまたは一部および，マトリクスプロテイン２の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む，請求項９記載の方法。
  12. 前記転写ユニットは，前記インフルエンザ抗原と前記ＣＤ４０リガンドとの間のリンカーをコードする，請求項１記載の方法。
  13. 前記ベクターはウイルスベクターである，請求項１記載の方法。
  14. 前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである，請求項１３記載の方法。
  15. 前記ＣＤ４０リガンドはヒトＣＤ４０リガンドである，請求項１記載の方法。
  16. 前記ＣＤ４０リガンドは細胞質ドメインを欠失している，請求項１記載の方法。
  17. 前記ＣＤ４０リガンドはその貫膜ドメインのすべてまたは実質的にすべてを欠失している，請求項１記載の方法。
  18. 前記ベクターは，貫膜ドメインの一部を含むＣＤ４０Ｌをコードし，ここで前記一部は６残基以下を含み，前記６残基は貫膜ドメインのいずれかの末端からのものである，請求項１記載の方法。
  19. 前記ＣＤ４０リガンドは残基４７−２６１を含む，請求項１記載の方法。
  20. 前記ＣＤ４０リガンドは残基４４−２６１を含む，請求項１記載の方法。
  21. 前記ＣＤ４０リガンドは残基１−２３および４７−２６１を含む，請求項１記載の方法。
  22. 前記免疫応答は，前記インフルエンザ抗原に対する細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を含む，請求項１記載の方法。
  23. 前記免疫応答は，前記インフルエンザ抗原に対する抗体の生成を含む，請求項１記載の方法。
  24. 前記融合蛋白質はアジュバントとともに投与される，請求項２記載の方法。
  25. 前記融合蛋白質は皮下に投与される，請求項２記載の方法。
  26. 前記ベクターによりコードされるＣＤ４０リガンドの配列と，融合蛋白質として投与されるＣＤ４０リガンドの配列とが異なるものである，請求項２記載の方法。
  27. 前記ベクターによりコードされるインフルエンザ抗原の配列と，融合蛋白質として投与されるインフルエンザ抗原の配列とが異なるものである，請求項２記載の方法。
  28. 転写ユニットは分泌シグナル配列をコードする，請求項１記載の方法。
  29. 前記個体は少なくとも５０歳である，請求項１記載の方法。
  30. 前記個体は少なくとも５５歳である，請求項１記載の方法。
  31. 前記個体は少なくとも６０歳である，請求項１記載の方法。
  32. 若い健康な個体と比較して低下したレベルのＣＤ４０リガンドを示すＣＤ４Ｔ細胞を有する個体の，癌抗原または感染性因子抗原に対するワクチン接種に対する免疫応答性を増加させる方法であって，個体に有効量の発現ベクターを投与することを含み，ここで，前記ベクターは，分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを含み，前記融合蛋白質は，癌または感染性因子抗原およびＣＤ４０リガンドを含むことを特徴とする方法。
  33. さらに，癌または感染性因子抗原およびＣＤ４０リガンドを含む有効量の融合蛋白質を投与することを含む，請求項３２記載の方法。
  34. 前記個体は少なくとも５０歳である，請求項３２記載の方法。
  35. 前記個体は少なくとも５５歳である，請求項３２記載の方法。
  36. 前記個体は少なくとも６０歳である，請求項３２記載の方法。
  37. 前記癌抗原は腫瘍関連抗原である，請求項３２記載の方法。
  38. 前記感染性因子抗原はインフルエンザ抗原である，請求項３２記載の方法。
  39. 前記融合蛋白質の前記感染性因子抗原はグリコシル化されている，請求項３８記載の方法。
  40. 前記融合蛋白質の前記感染性因子抗原はグリコシル化されていない，請求項３８記載の方法。
  41. 少なくとも５０歳の個体の癌抗原または感染性因子抗原に対するワクチン接種に対する免疫応答性を増加させる方法であって，個体に有効量の発現ベクターを投与することを含み，ここで，前記ベクターは，分泌型融合蛋白質をコードする転写ユニットを含み，前記融合蛋白質は，癌抗原または感染性因子抗原およびＣＤ４０リガンドを含む，ことを特徴とする方法。
  42. 前記個体は，若い健康な個体と比較して低下したレベルのＣＤ４０リガンドを示すＣＤ４Ｔ細胞を有する，請求項４１記載の方法。
  43. さらに，癌または感染性因子抗原およびＣＤ４０リガンドを含む有効量の融合蛋白質を投与することを含む，請求項４１記載の方法。
  44. さらに，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む有効量の融合蛋白質の第２回の投与を含む，請求項４３記載の方法。
  45. さらに，インフルエンザ抗原およびＣＤ４０リガンドを含む有効量の融合蛋白質の第３回の投与を含む，請求項４４記載の方法。
  46. 前記個体は少なくとも５５歳である，請求項４１記載の方法。
  47. 前記個体は少なくとも６０歳である，請求項４１記載の方法。
  48. 前記癌抗原は腫瘍関連抗原である，請求項４１記載の方法。
  49. 前記感染性因子抗原はインフルエンザ抗原である，請求項４１記載の方法。
  50. 前記融合蛋白質の前記インフルエンザ抗原はグリコシル化されている，請求項４９記載の方法。
  51. 前記融合蛋白質の前記インフルエンザ抗原はグリコシル化されていない，請求項４９記載の方法。
  52. 個体において外来抗原に対する免疫応答を生成させる方法であって，個体に，融合蛋白質をコードする発現ベクターを投与せずに，有効量の前記融合蛋白質を投与し，ここで，前記投与は複数回繰り返され，および前記融合蛋白質は抗原およびＣＤ４０リガンドを含むことを特徴とする方法。
  53. 前記複数回投与は３回の投与を含む，請求項５２記載の方法。
  54. 前記外来抗原は感染性因子抗原である，請求項５２記載の方法。
  55. 前記融合蛋白質の前記感染性因子抗原はグリコシル化されている，請求項５２記載の方法。
  56. 前記融合蛋白質の前記感染性因子抗原はグリコシル化されていない，請求項５２記載の方法。
  57. 前記感染性因子抗原はウイルス抗原である，請求項５６記載の方法。
  58. 前記ウイルス抗原は，ヒトパピローマウイルスに由来する，請求項５７記載の方法。
  59. 前記ヒトパピローマウイルス抗原は，Ｅ６蛋白質またはＥ７蛋白質に由来する，請求項５８記載の方法。
  60. 前記ウイルス抗原はインフルエンザ抗原である，請求項５７記載の方法。
  61. 前記インフルエンザ抗原はＨ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する，請求項６０記載の方法。
  62. 前記インフルエンザ抗原は，インフルエンザウイルス蛋白質の少なくとも１つの抗原決定基を含み，前記ウイルス蛋白質はヘマグルチニン，ノイラミニダーゼおよびマトリクスプロテイン２からなる群より選択される，請求項６０記載の方法。
  63. 前記インフルエンザ抗原は，前記ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼおよびマトリクスプロテイン２の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む，請求項６０記載の方法。
  64. 前記インフルエンザ抗原は，少なくとも２つの異なるウイルスインフルエンザ蛋白質に由来する少なくとも１つの抗原決定基を含むキメラインフルエンザ抗原を含む，請求項６０記載の方法。
  65. 前記少なくとも１つの抗原決定基は，ヘマグルチニン，ノイラミニダーゼまたはマトリクスプロテイン２の細胞外ドメインに由来する，請求項６４記載の方法。
  66. 前記キメラインフルエンザ抗原は，ヘマグルチニンの細胞外ドメインのすべてまたは一部，およびマトリクスプロテイン２の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含む，請求項６４記載の方法。
  67. 前記融合蛋白質は，前記インフルエンザ抗原と前記ＣＤ４０リガンドとの間にリンカーを含む，請求項５４記載の方法。
  68. 前記ＣＤ４０リガンドはヒトＣＤ４０リガンドである，請求項５４記載の方法。
  69. 前記ＣＤ４０リガンドは細胞質ドメインを欠失している，請求項５４記載の方法。
  70. 前記ＣＤ４０リガンドはその貫膜ドメインをすべてまたは実質的にすべて欠失している，請求項５４記載の方法。
  71. 前記ＣＤ４０Ｌは，貫膜ドメインの一部を含み，ここで，前記一部は，６残基以下を含み，前記６残基は貫膜ドメインのいずれかの末端からのものである，請求項５４記載の方法。
  72. 前記ＣＤ４０リガンドは残基４７−２６１を含む，請求項５４記載の方法。
  73. 前記ＣＤ４０リガンドは残基４４−２６１を含む，請求項５４記載の方法。
  74. 前記ＣＤ４０リガンドは残基１−２３および４７−２６１を含む，請求項５４記載の方法。
  75. 前記免疫応答は，前記インフルエンザ抗原に対する細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を含む，請求項５４記載の方法。
  76. 前記免疫応答は，前記インフルエンザ抗原に対する抗体の生成を含む，請求項５４記載の方法。
  77. 前記融合蛋白質はアジュバントとともに投与される，請求項５４記載の方法。
  78. 前記融合蛋白質は皮下に投与される，請求項５４記載の方法。
  79. 前記個体は少なくとも５０歳である，請求項５４記載の方法。
  80. 前記個体は少なくとも５５歳である，請求項５４記載の方法。
  81. 前記個体は少なくとも６０歳である，請求項５４記載の方法。
  82. 請求項１にしたがう発現ベクター。
  83. 請求項８２記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
  84. さらにアジュバントを含む，請求項８３記載の医薬組成物。
  85. 請求項１にしたがう発現ベクターによりコードされる融合蛋白質。
  86. 請求項８５記載の融合蛋白質を含む医薬組成物。
  87. さらにアジュバントを含む，請求項８６記載の医薬組成物。
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