JP2009162701A - 生体サンプル分析用プレート - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡの増幅及び分析を行える生体サンプル分析用プレートにおいて、増幅したＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる生体サンプル分析用プレートを提供する。
【解決手段】反応チャンバの壁面の一部に斜面を設けることにより、斜面に沿って反応液を底面へ移動させることが出来きる。従って、ＰＣＲ反応液が反応チャンバの底面を均一に覆うことが出来るため、サンプル定量部への送液を確実に行うことが出来る。
【選択図】図３

Description

本発明は、ＤＮＡ分析を行う生体サンプル分析用プレートに関し、より詳細には、遠心力を用いることでＤＮＡ増幅から分析までの一連の工程を自動化した生体サンプル分析用プレートに関する。

近年、分子生物学分野の発展に伴い、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。また、農畜産分野においても、品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されてきており、遺伝子はより身近なものとして取り上げられるようになってきた。

これらの技術の進歩を大きく飛躍させた技術としてＰＣＲ（Ｐｏｌｏｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるＤＮＡ増幅技術が挙げられ、ＰＣＲによる増幅の有無を見ることによって判別することもできる。ＰＣＲ技術が広く普及して以来、ＰＣＲを迅速で簡便に行う技術が望まれている。

ＰＣＲは３つの温度工程からなる。二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、一本鎖に解離したＤＮＡに増幅したい部分の両端の配列と相補的な配列を有したプライマーを結合させる工程（アニーリング）、プライマーが結合した配列からＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ鎖を伸長させる工程（伸長反応）である。熱変性では９５℃で１分間温度をかけることによって、ＤＮＡを一本鎖の状態にする。アニーリングの工程では５０〜６０℃で３０秒間反応させることにより、増幅したい領域の末端部分にプライマーと呼ばれる２０塩基程度の短いＤＮＡを結合させる。伸長反応は７２℃の温度でポリメラーゼを鋳型に付加し、ＤＮＡ鎖の伸長を行う。これらの温度サイクルを２５〜４０回行うことで、サイクル数に応じて理論的には２の２５乗から４０乗倍に増幅できる。実質的には目的の領域を１０の６乗倍に増幅している。

ＰＣＲを行うためのＰＣＲ反応液は、増幅するためのポリメラーゼ、ポリメラーゼが最適な環境で働くためのｐＨや塩濃度を調整したバッファ、ｄＮＴＰ、両末端のプライマー、鋳型、トータルボリュームを調整する滅菌水で構成される。これらの試薬のうち、ポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、滅菌水はどのようなＤＮＡ断片を得たい場合でも共通の試薬であるが、両末端のプライマーと鋳型は増幅したい領域に合わせて用意する必要がある。また、ポリメラーゼは活性を失わないよう細心の注意が必要であり、通常はマイナス２０℃で保存されており、ＰＣＲを行う段階での調整が必要であった。

ＰＣＲを行うためにはこれらの試薬の調整を行う必要があるが、ＰＣＲの簡略化のために開発された二つのアプローチ方法がある。一つは温度工程を簡単にし、反応時間を短時間で済ませる方法である。７２℃で反応するポリメラーゼ（酵素）を改良し、６６℃の低温で反応ができるようになった。この酵素の開発によって、プライマーのアニール温度と伸長反応を同じ温度設定で行うことが出来、温度工程をひとつ減らすことが可能になった。また、もう一つは、乾燥状態でも失活しない酵素が開発され、従来、反応前の最終段階で調整しなければならなかった酵素の添加をあらかじめ混ぜて用意しておくことができるようになった。

これらの技術を利用したマイクロタスによるＰＣＲ装置の期待が高まっている。しかし、マイクロタスで行うＰＣＲは反応液の送液の制御が難しく、温度工程時に反応液が流路を移動したり、反応液が蒸発したりするという問題点があった。従来の小型の生体サンプル分析装置は、サンプルを注入する注入部とサンプルからＤＮＡを抽出する抽出チャンバとＰＣＲ反応を行うＰＣＲチャンバとを備えたプレートを用いて、ＰＣＲ増幅を自動で行う構成である。この生体サンプル分析装置は加熱機構と回転機構を持ち、プレート上のサンプル移送は遠心力と毛細管現象を利用している。ＰＣＲチャンバへ接続される流路には、ワックスにより弁をし、ＰＣＲ反応液の移送を制御できる構成になっている。抽出チャンバに入った細胞はアルカリ細胞溶解液で溶解され、抽出されたＤＮＡは回転により抽出チャンバから増幅反応チャンバへ移送される。この増幅チャンバでは中和用の緩衝液が加えられた後、ＰＣＲに必要なｄＮＴＰや塩、緩衝液、酵素と溶出したＤＮＡを含む増幅溶液が加えられ、ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応後は反応サンプルを検出する検出部を設けるか、または別の外部の装置で測定を行う。（例えば、特許文献１参照。）
ＰＣＲ反応後の反応サンプルを検出する検出部を同一プレートに設ければ、ＤＮＡの増幅から検出までを行える生体サンプル分析用プレートが実現出来る。図５に、この生体サンプル分析用プレートの流路ユニットの模式図を示す。この生体サンプル分析用プレートでは、熱溶解したワックス層を蓋として用いてＰＣＲ反応液の蒸発を防ぎ、回転機構を用いて送液を行う。流路ユニットには、ＰＣＲ反応を行うための反応チャンバ６とＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部８とが定量部送液流路７で接続されて配置されている。

図６に反応チャンバ６の断面図を示す。ＰＣＲ反応中は、ワックス２１を熱融解させて生体サンプル分析用プレートを回転させる。ワックス２１の比重はＰＣＲ反応液２０よりも軽いので、図６（ａ）示すように、遠心力により反応チャンバ６の外周側へ押し付けられたＰＣＲ反応液２０の液面に蒸発防止膜が形成される。ＰＣＲ後は生体サンプル分析用プレートの回転を停止させ、ＰＣＲ反応液２０及びワックス２１を反応チャンバ６の底面に移動させた後、加熱をやめることでワックス２１を凝固させる。この時の反応チャンバ６の断面図を図６（ｂ）に示す。

生体サンプル分析用プレートを再度回転させることにより、凝固したワックス２１と底面に挟まれたＰＣＲ反応液２０の一部は流路７を通り、サンプル定量部８へ送液される。正電極１３及び負電極１４に電圧を印加して、緩衝液で満たされた検出用流路１６において電気泳動を行うことによりＤＮＡ検出を行う。
特表２００３−５０２６５６号公報

しかしながら、前記従来の構成では、ＰＣＲ後プレートの回転を停止した際、反応チャンバ６内部のワックス２１の移動が図６（ｂ）にように行なわれず、図７（ａ）及び（ｂ）に示すように反応チャンバ６の一方向の壁面に偏ったまま凝固してしまう。このように偏った凝固をした場合には、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液２０を反応チャンバ６からサンプル定量部８へ確実に送液することが出来ないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、ＰＣＲ反応後に生成物の送液を確実に行うことを目的とした生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析用プレートは、回転すべき中心軸と、前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、前記注入流路に接続され内壁の一部に斜面が形成された反応チャンバと、前記反応チャンバから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、を備えたことを特徴としたものである。

本発明の生体サンプル分析用プレートによれば、一つのプレート上でＤＮＡの増幅から分析まで行う際、増幅したＰＣＲ反応液を分析するためのサンプル定量部へと確実に移送することができる。

以下に、本発明の生体サンプル分析用プレートの実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施の形態における生体サンプル分析用プレート１を示す平面図であり、図２はその拡大図での一つの流路ユニット３を示した図である。

＜プレートの構成＞
図１を用いて、生体サンプル分析用プレート１の説明をする。生体サンプル分析用プレート１の材質はアクリル系の樹脂であり、厚みは５ｍｍである。生体サンプル分析用プレート１の両面に、深さ５０μｍの流路やチャンバとなる溝や孔が掘られ、さらにその上に厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着して密閉流路を形成する。また、生体サンプル分析用プレート１の中心２には、生体サンプル分析用プレート１を生体サンプル分析装置に固定するための孔が設けられている。本発明の実施の形態１においては、生体サンプル分析用プレート１には８つの流路ユニット３が設けられている構成を例としている。

図２を用いて、生体サンプル分析用プレート１の流路ユニット３について詳細に説明する。流路ユニット３には、ＰＣＲ反応液を注入するためのＰＣＲ反応液注入部４と、緩衝剤を注入するための緩衝剤注入部１１が形成されている。ＰＣＲ反応液注入部４は注入流路５により反応チャンバ６と接続され、反応チャンバ６は定量部送液流路７によりサンプル定量部８と接続されている。サンプル定量部８は流路９よりバッファ部１０と接続されている。緩衝剤注入部１１は、流路１２により正電極１３と負電極１４へ接続されている。正電極１３は検出用流路１６によりサンプル定量部８と接続し、負電極１４は流路１５によりサンプル定量部８と接続されている。

反応チャンバ６の形状について詳細に説明する。図３に、図２における反応チャンバ６の破線ＡＡ’の断面図を示す。アクリル製プレート１８の両面にアクリル製フィルム１９を貼り付けて流路を形成している。ＰＣＲ反応液注入部４と反応チャンバ６を接続する注入流路５が形成される面を上面とし、サンプル定量部８と反応チャンバ６を接続する定量部送液流路７が形成される面を下面とする。反応チャンバ６に形成された斜面１７は、注入流路５と反応チャンバ６との接続口に対向するチャンバの内壁に形成される。また、斜面１７は、反応チャンバ６の底面に接続されるように形成されている。
送液流路７は、生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない底面に形成されている。

＜ＰＣＲ＞
生体サンプルは、植物、動物、または人の細胞や血液等から抽出したＤＮＡまたはＲＮＡを使用する。本発明の実施の形態１では、ＤＮＡを用いた。ＰＣＲのために使用する溶液は、分析したいＤＮＡを含む生体サンプルと、ＤＮＡを増幅するための酵素と、酵素が最適環境で作用するためのｐＨや塩濃度を調整するためのバッファと、ｄＮＴＰ、プライマーとを含有するＰＣＲ反応液である。プライマーは、生体サンプルの中で増幅したい領域の末端の配列を持つ配列を選択する。酵素にはＴａｇポリメラーゼを使用する。以上の試薬を調整し、ＰＣＲ反応液を準備する。

ＰＣＲ反応は、反応チャンバ６において行われる。図４は、ＰＣＲ反応中、ＰＣＲ反応後、サンプル定量部への送液後、それぞれの場合の反応チャンバ６内の状態を示す。

図４（ａ）に、ＰＣＲ反応中の反応チャンバ６内の状態を示す。ＰＣＲ反応液２０をＰＣＲ反応液注入部４へ注入し、生体サンプル分析用プレート１を回転させ、ＰＣＲ反応液２０を反応チャンバ６へ送液する。生体サンプル分析用プレート１の回転を継続させたまま、９５℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒という熱サイクルを２５サイクルから４０サイクル行う。５０℃以下の融点をもつワックス２１は、予め反応チャンバ６に封入されており、熱サイクルの加熱により融解する。生体サンプル分析用プレート１の回転により遠心力が発生し、ＰＣＲ反応液２０及び熱融解したワックス２１は反応チャンバ６内の外周側へ寄せられ、ＰＣＲ反応液２０よりも比重が軽いワックス２１の層がＰＣＲ反応液２０の液面に形成される。このワックス２１の層が蒸発防止膜となる。

図４（ｂ）に、ＰＣＲ反応後の反応チャンバ６内の状態を示す。ＰＣＲ反応後、生体サンプル分析用プレート１の回転を停止させ、反応チャンバ６の斜面１７に沿ってＰＣＲ反応液２０及びワックス２１は底面へ移動する。反応チャンバ６の外周側の斜面１７により、ＰＣＲ反応液２０及びワックス２１は、反応チャンバ６の底面に確実に移動出来る。そのため、ＰＣＲ反応液２０及びワックス２１は、反応チャンバ６の底面に均一に拡がる。その後、加熱を停止して、ワックス２１が凝固する温度まで生体サンプル分析用プレート１を冷却する。本実施例では、５０℃になるまで冷却した。

図４（ｃ）に、サンプル定量部への送液後の反応チャンバ６内の状態を示す。図４（ｂ）の状態から、生体サンプル分析用プレート１を再度回転させる。この回転による遠心力により、凝固したワックス２１の層と反応チャンバ６の底面との間に挟まれたＰＣＲ反応液２０を送液流路７へと送液する。送液流路７を通ったＰＣＲ反応液２０は、サンプル定量部８で一定量が保持され、一定量以上は流路９を通りバッファ部１０へと移動する。本発明の実施の形態１で用いた生体サンプル分析用プレート１の反応チャンバ６の直径は６ｍｍであり、深さ４ｍｍである。ＰＣＲ反応液の液量は３０μＬ、ワックスの質量は１４ｍｇとした。

以上のように、本発明の実施の形態１においては、注入流路５と反応チャンバ６との接続口に対抗する反応チャンバ６の内壁に斜面１７を設けた。この斜面１７にそってＰＣＲ反応液２０及びワックス２１を移動させることにより、反応チャンバ６の底面へと確実に移動させることが出来る。ＰＣＲ反応液２０が反応チャンバ６の底面を均一に覆うことにより、サンプル定量部８への送液を確実に行うことが出来る。サンプル定量部８へ充填されたＰＣＲ反応液は、電気泳動を行い、ＤＮＡ解析される。

＜緩衝液＞
ここでは、コンジュゲート法を用いてＤＮＡ解析を行っている。電気泳動するための緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合した。リニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。緩衝剤注入部１１へ注入された緩衝剤は、流路１２より正電極１３および負電極１４へ移動し、さらに、流路１５および流路１６を満たす。

＜電気泳動＞
生体物質の電気泳動を行うため、正電極１３および負電極１４との間に電圧を印加する。電圧の印加は、正電極１３および負電極１４より緩衝剤に接触するように針状の電極を挿入した状態で行う。電圧印加により、流路１５および流路１６に電場が発生して、サンプル定量部８に保持されたＰＣＲ反応液は流路１６中を電気泳動する。

＜検出＞
ＤＮＡの検出は、蛍光標識（Ｃｙ５）を修飾したＤＮＡを６３５ｎｍの光で励起し、６７０ｎｍ付近の光検出によって、流路１６中を電気泳動するＤＮＡサンプルの状態を検出することで行った。さらには、電気泳動する流路１６を円弧状としたことで、生体サンプル分析用プレート１を回転させることにより、流路１６中を電気泳動するＤＮＡサンプルの分布を測定する。

ＤＮＡの増幅から検出までの自動装置の実現のため、同一プレート上でＤＮＡ増幅と検出が行える生体サンプル分析用プレートが必要であり、そのプレートにおけるサンプル液の保持及び送液は非常に重要である。本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、サンプル液のチャンバ間の送液を確実に行えるので、生体サンプル分析用プレートの用途を飛躍的に広げるため有用である。

本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートの平面図 本発明の実施の形態１における流路ユニットの模式図 本発明の実施の形態１における反応チャンバ６部分の断面図 本発明の実施の形態１における反応チャンバ６内でのＰＣＲ反応液の動きを示す模式図 従来の流路ユニットの模式図 従来の反応チャンバ内でのＰＣＲ反応液の動きを示す模式図 従来の流路ユニットにおける問題点を示す図

符号の説明

１ 生体サンプル分析用プレート
２ 中心
３ 流路ユニット
４ ＰＣＲ反応液注入部
５ 注入流路
６ 反応チャンバ
７ 定量部送液流路
８ サンプル定量部
１０ バッファ部
１１ 緩衝液注入部
１３ 正電極
１４ 負電極
１６ 検出用流路
１７ 斜面
１８ アクリル製プレート
１９ アクリル製フィルム
２０ ＰＣＲ反応液
２１ ワックス

Claims (13)

1. 回転すべき中心軸と、
   前記回転により分析すべき生体サンプルを送るための注入流路と、
   前記注入流路に接続され内壁の一部に斜面が形成された反応チャンバと、
   前記反応チャンバから前記生体サンプルを送液するための送液流路と、
   を備えた生体サンプル分析用プレート。
2. 前記生体サンプルは、ＤＮＡである請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
3. 前記生体サンプルは、ＲＮＡである請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
4. 前記注入流路は、前記生体サンプル分析用プレートの上面に配置されている請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
5. 前記反応チャンバは、加熱することにより前記生体サンプルを熱変性するために使用される請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
6. 前記反応チャンバは、熱融解するワックス塊を有する請求項５に記載の生体サンプル分析用プレート。
7. 前記反応チャンバは、前記中心軸に対し前記注入流路より外周側に位置する請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
8. 前記反応チャンバに形成された前記斜面は、前記注入流路と前記反応チャンバとの接続口に対向する前記反応チャンバの内壁に形成される請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
9. 前記反応チャンバに形成された前記斜面は、前記反応チャンバの底面に接続されるように形成されている請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。
10. 前記送液流路は、前記底面に設けられた請求項９に記載の生体サンプル分析用プレート。
11. 前記送液流路は、前記生体サンプル分析用プレート回転時に前記生体サンプルが存在しない前記底面に設けられた請求項１０に記載の生体サンプル分析用プレート。
12. 前記送液流路は、前記生体サンプルに近い位置にある前記底面に設けられた請求項１１の生体サンプル分析用プレート。
13. 前記送液流路は、前記注入流路よりも低い位置に設けられた請求項１に記載の生体サンプル分析用プレート。

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