JP2009082068A - Composition and kit for extracting nucleic acid, and use of them - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から核酸を高収量で簡便に抽出する技術に関するものである。 The present invention relates to a technique for easily obtaining information on microorganisms in soil, and more particularly, to a technique for easily extracting nucleic acids from soil in a high yield.
生育している植物内での物質の分布および動態を知るために、植物内における物質動態をイメージングする技術が開発されている。 In order to know the distribution and dynamics of substances in growing plants, techniques for imaging the substance dynamics in plants have been developed.
植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることは、植物内における本来の物質動態を知るために重要であると考えられる。土壌のｐＨ、無機塩類濃度といった土壌の理化学性および土壌中に存在する微生物が植物の生育に大きな影響を与えることは、古くから知られている。また、空気中に含まれている物質（特に微生物）も植物の生育に影響を与え得る。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌や、植物が置かれた雰囲気についての情報を解析する、優れた技術が不可欠であると考えられる。 It is considered that the environment at the time of imaging in a plant approximates the original growth environment for the plant in order to know the original material dynamics in the plant. It has long been known that physicochemical properties of soil, such as soil pH and inorganic salt concentrations, and microorganisms present in the soil have a great influence on plant growth. Substances contained in the air (particularly microorganisms) can also affect plant growth. In order to know the original growth environment for a plant, it is considered that an excellent technique for analyzing information on the soil in which the plant grows and the atmosphere in which the plant is placed is indispensable.
微生物は、土壌中に非常に多く存在している（土壌１ｇあたりに１０８〜１０９個）。その種類は極めて多様であり、天然に存在する微生物のうち、かなりの種類が土壌に分布しているといわれている。しかし、土壌中に存在する微生物は、培養が非常に困難であり、培養可能な土壌微生物は全体の１０％に満たない。このように、土壌微生物はそのほとんどが未知の存在である。 Microorganisms are very much present in the soil (10 8 to 10 9 per 1 g of soil). The types are extremely diverse, and it is said that a considerable number of naturally occurring microorganisms are distributed in the soil. However, the microorganisms present in the soil are very difficult to culture, and less than 10% of the total soil microorganisms can be cultured. Thus, most soil microorganisms are unknown.
近年、土壌から核酸を直接抽出して分子生物学的手法での解析を行うことにより、土壌微生物についての情報を得ることが可能になってきた。すなわち、土壌中の微生物に関する情報は、微生物由来の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を土壌から検出することによって得られている。 In recent years, it has become possible to obtain information on soil microorganisms by directly extracting nucleic acids from soil and performing analysis using molecular biological techniques. That is, information on microorganisms in the soil is obtained by detecting nucleic acids (DNA or RNA) derived from microorganisms from the soil.
土壌から微生物ＤＮＡを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌からのＤＮＡの抽出技術は、培養困難な土壌微生物の遺伝子の取得を容易にし、未解明であった土壌微生物の群集解析、および酵素合成などに有用なコンビナトリアルケミストリーへ新たな土壌微生物遺伝子資源の供給を可能とし、学術的にも産業面にも大きく寄与した。 A number of techniques for detecting or separating microbial DNA from soil have been reported so far. DNA extraction technology from soil facilitates the acquisition of genes for soil microorganisms that are difficult to cultivate, and analyzes the community of microbial soil microorganisms that have not been elucidated and the combinatorial chemistry useful for enzyme synthesis, etc. It made it possible to supply, and it contributed greatly to academic and industrial aspects.
しかし、日本特有の土壌である火山灰土壌は、非晶質アルミニウム（アロフェン）を含有しているので、これらの物質が核酸抽出工程において溶液中の核酸を強力に吸着してしまい、その結果として、火山灰土壌からの核酸抽出が困難であった。 However, volcanic ash soil, which is unique to Japan, contains amorphous aluminum (allophane), so these substances strongly adsorb nucleic acids in the solution in the nucleic acid extraction process, Nucleic acid extraction from volcanic ash soil was difficult.
本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。
ＤＮＡは比較的安定な物質であり、土壌に残留する傾向がある。しかし、ＤＮＡはすでに死滅した微生物まで評価している可能性がある。一方、ＲＮＡは化学的に不安定であり、ＤＮＡよりもはるかに分解されやすく、微生物が死滅するとＲＮａｓｅなどによって速やかに分解される。よって、ＲＮＡを抽出および解析することができれば、土壌中の生きた微生物を正確に評価することが可能となる。 DNA is a relatively stable substance and tends to remain in the soil. However, DNA may have evaluated even dead microorganisms. On the other hand, RNA is chemically unstable and is much easier to degrade than DNA. When a microorganism dies, it is rapidly degraded by RNase or the like. Therefore, if RNA can be extracted and analyzed, living microorganisms in the soil can be accurately evaluated.
しかし、ＲＮＡはＤＮＡよりも強力かつ迅速にアロフェンに吸着されてしまうので、特許文献１記載の技術ではＲＮＡ抽出を効率よく行うことができなかった。また、ＲＮＡ抽出に関しては、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ開発されていない。
However, RNA is adsorbed to allophane more powerfully and more rapidly than DNA, and therefore the technique described in
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得ることであり、具体的には、土壌から核酸（特にＲＮＡ）を高収量で簡便に抽出する技術を実現することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to easily obtain information on microorganisms in soil. Specifically, nucleic acid (especially RNA) is obtained in high yield from soil. It is to realize a technique for simple and easy extraction.
火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは試行錯誤の結果、抽出液にフッ素化合物を添加することにより、核酸を効率よく抽出し得ることを見出した。 In order to efficiently extract nucleic acid (DNA or RNA) from soil containing allophane such as volcanic ash soil, allophane that can adsorb nucleic acid is effectively destroyed, or DNA or RNA (particularly adsorbed to allophane is adsorbed). It is necessary to block the allophane adsorption site before it is adsorbed. As a result of trial and error, the present inventors have found that nucleic acid can be efficiently extracted by adding a fluorine compound to the extract.
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。上記化合物は、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６およびＮＨ４ＰＦ６からなる群より選択される化合物であることが好ましく、Ｎａ２ＳｉＦ６であることがより好ましい。なお、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、Ｎａ２ＳｉＦ６を５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含んでいることがなお好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいることが好ましい。 The composition according to the present invention is for preparing a nucleic acid extract, and is characterized by containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound. The above compound, NaF, Na 2 SiF 6, K 2 SiF 6, it is (NH 4) 2 SiF 6, NaPF 6, KPF 6 and a compound selected from the group consisting of NH 4 PF 6 preferably, Na 2 and more preferably SiF 6. In addition, it is still more preferable that the nucleic acid extract prepared using the present invention contains Na 2 SiF 6 at a concentration in the range of 5 to 50 g / L. Therefore, the composition according to the present invention preferably contains Na 2 SiF 6 so as to be supplied into the nucleic acid extract at a concentration in the range of 5 to 50 g / L.
本発明に係る組成物は、ＥＤＴＡおよび／またはリン酸をさらに含んでいてもよい。本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、ＥＤＴＡを５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることが好ましい。また、本発明にリン酸が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、リン酸を１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることが好ましい。 The composition according to the present invention may further contain EDTA and / or phosphoric acid. When EDTA is used in the present invention, the nucleic acid extract prepared using the present invention preferably contains EDTA at a concentration in the range of 50 to 100 mM. Therefore, the composition according to the present invention preferably contains EDTA so as to be supplied to the nucleic acid extract at a concentration in the range of 50 to 100 mM. Moreover, when phosphoric acid is used for this invention, it is preferable that the nucleic acid extract prepared using this invention contains phosphoric acid in the density | concentration within the range of 100-300 mM. Therefore, the composition according to the present invention preferably contains phosphoric acid so as to be supplied into the nucleic acid extract at a concentration in the range of 100 to 300 mM.
本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、界面活性剤を５％以下の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましい。 The composition according to the present invention may further contain a surfactant. When a surfactant is used in the present invention, the nucleic acid extract prepared using the present invention preferably contains a surfactant at a concentration of 5% or less. Therefore, the composition according to the present invention preferably contains a surfactant so as to be supplied into the nucleic acid extract at a concentration of 5% or less. The surfactant usable in the present invention is preferably selected from the group consisting of SDS, CTAB, Triton X-100 and N-lauroyl sarcosine sodium.
本発明に係るキットは、核酸抽出液を調製するためのものであり、上述した組成物の成分を別個に備えている形態であればよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。 The kit according to the present invention is for preparing a nucleic acid extract, and may be in a form in which the components of the composition described above are separately provided. That is, the kit according to the present invention includes at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound, and further includes EDTA, phosphoric acid and / or a surfactant. Also good.
本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましい。 The composition and kit according to the present invention are used for preparing a nucleic acid extract for extracting nucleic acid from a sample derived from at least one selected from the group consisting of soil, compost, aqueous sediment, activated sludge and feces. It is preferred that
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。 The nucleic acid extraction method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned nucleic acid extract, and specifically, a sample in an extract containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound. A step of extracting the nucleic acid from.
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。 The nucleic acid extraction method according to the present invention is preferably used for extracting nucleic acid from a sample derived from at least one selected from the group consisting of soil, compost, aqueous sediment, activated sludge and feces.
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。 The method for producing a nucleic acid extract according to the present invention includes a step of preparing a solution containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound, and the solution contains EDTA. A step of adding a phosphoric acid to the solution, or a step of adding a surfactant to the solution.
本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。 By using the present invention, not only DNA but also RNA can be extracted from soil with high yield.
〔１：核酸抽出液調製用の組成物およびキット〕
本発明は、核酸抽出液を調製するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましく、火山灰土壌に由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることがさらに好ましい。
[1: Composition and kit for preparing nucleic acid extract]
The present invention provides compositions and kits for preparing nucleic acid extracts. The composition and kit according to the present invention are used for preparing a nucleic acid extract for extracting nucleic acid from a sample derived from at least one selected from the group consisting of soil, compost, aqueous sediment, activated sludge and feces. It is preferable to be used for preparing a nucleic acid extract that extracts nucleic acid from a sample derived from volcanic ash soil.
本明細書中において使用される場合、用語「組成物」は、各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図され、用語「キット」は、各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている状態であることが意図される。 As used herein, the term “composition” is intended to be a form in which various components are contained in one substance, and the term “kit” is intended to mean that at least one of the various components is a separate substance. It is intended to be in a state contained in (for example, a container).
上述したように、火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。この技術は、アロフェンを含有する土壌からＤＮＡを効率よく抽出する技術として非常に優れている。しかし、ＲＮＡは高塩濃度条件下で不溶化して沈殿してしまうので、ＲＮＡ抽出用の技術として適切ではない。 As described above, in order to efficiently extract nucleic acid from soil containing allophane such as volcanic ash soil, allophane capable of adsorbing nucleic acid is effectively destroyed, or DNA or RNA (particularly adsorbed by allophane is adsorbed). It is necessary to block the allophane adsorption site before it is adsorbed. The present inventors have developed a technique that inactivates the allophane adsorption ability by using EDTA and a phosphoric acid solution at a high concentration and easily extracts DNA (see Patent Document 1). This technique is very excellent as a technique for efficiently extracting DNA from soil containing allophane. However, since RNA is insolubilized and precipitated under high salt concentration conditions, it is not suitable as a technique for RNA extraction.
本発明者らは土壌からのＲＮＡ抽出技術を開発するために更なる検討を重ねたが、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ知られていないので、開発に適用すべき具体的な指標がなく、試行錯誤を繰り返した。その結果、特定の化合物を用いれば、低塩濃度条件下であってもアロフェンの吸着能力を不活性化し得ることを見出した。 The present inventors have made further studies in order to develop RNA extraction technology from soil, but the technology for extracting RNA from soil in high yield is not yet known. There was no indicator, and trial and error were repeated. As a result, it has been found that if a specific compound is used, the adsorption ability of allophane can be inactivated even under a low salt concentration condition.
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としている。 The composition according to the present invention is for preparing a nucleic acid extract, and is characterized by containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound. The kit according to the present invention is characterized by comprising at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound.
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物としては、例えば、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６、ＮＨ４ＰＦ６などが挙げられるがこれらに限定されない。後述する実施例においてＮａ２ＳｉＦ６を用いて本発明を実証し、Ｎａ２ＳｉＦ６は溶解度が低いがアロフェンとの反応性が高いことを示している。ＲＮＡは塩濃度が高いと不溶化して沈殿してしまうため、塩濃度が高くなる高濃度のＥＤＴＡ、リン酸溶液は使用することが困難である。しかし、水溶液中でＮａ２ＳｉＦ６を土壌と混和すると徐々に反応が進み、塩濃度が比較的低い状態でアロフェンを不活性化し得ることがわかった。なお、本明細書を読んだ当業者であれば、このような効果を奏する化合物はＮａ２ＳｉＦ６に限定されないことを容易に理解する。
Examples of the compound selected from the fluorinated compound and the silicate compound include NaF, Na 2 SiF 6 , K 2 SiF 6 , (NH 4 ) 2 SiF 6 , NaPF 6 , KPF 6 , NH 4 PF 6, and the like. However, it is not limited to these. Demonstrate the invention using Na 2 SiF 6 in the embodiment described below,
本発明においてＮａ２ＳｉＦ６が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＮａ２ＳｉＦ６は好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいる。 If Na 2 SiF 6 is used in the present invention, Na 2 SiF 6 is preferably in a nucleic acid extract prepared in 1 to 100 g / L, more preferably 5 to 50 g / L, more preferably 25 to 50 g / L May be included at concentrations within the range of. Therefore, the composition according to the present invention is preferably supplied into the nucleic acid extract at a concentration in the range of 1 to 100 g / L, more preferably 5 to 50 g / L, and even more preferably 25 to 50 g / L. Contains Na 2 SiF 6 .
特許文献１に開示されるように、ＥＤＴＡもまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、ＥＤＴＡをさらに含んでいてもよい。ただし、特許文献１において用いられているような高濃度のＥＤＴＡでは目的の効果を奏さないので、本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＥＤＴＡは好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいる。なお、ＤＮａｓｅの不活性化を考慮すると、抽出液中のＥＤＴＡの濃度は１００ｍＭ以下で用いられることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００ｍＭ以下で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることがなおさらに好ましい。
As disclosed in
本明細書中で使用される場合、用語「リン酸」はリン酸緩衝液またはリン酸緩衝化剤を包含する。リン酸緩衝液は当該分野において周知であり、ＤＮＡ抽出においてよく用いられている。特許文献１に開示されるように、リン酸もまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、リン酸をさらに含んでいてもよい。特許文献１において用いられているような高濃度でなくても目的の効果を奏し得るが、後述する実施例において示すように、リン酸濃度は高い方が好ましい。本発明にリン酸が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてリン酸は１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいる。本発明に係る組成物が含んでいるリン酸の形態は特に限定されず、固体であっても液体であってもよく、当業者に容易に理解され得る。なお、本発明を実施するにおいて、リン酸はＥＤＴＡと併用されても単独で用いられてもよい。
As used herein, the term “phosphate” includes phosphate buffer or phosphate buffer. Phosphate buffers are well known in the art and are often used in DNA extraction. As disclosed in
細菌や真菌などからの核酸抽出の際には、界面活性剤によって細胞のタンパク質を変性させて細胞構造を破壊することが必要である。よって、本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、調製された核酸抽出液中において、界面活性剤は好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましいがこれらに限定されない。 When nucleic acids are extracted from bacteria or fungi, it is necessary to denature cellular proteins with a surfactant to destroy the cell structure. Therefore, the composition according to the present invention may further contain a surfactant. When a surfactant is used in the present invention, the surfactant may be contained at a concentration of preferably 5% or less, more preferably 3% or less, and even more preferably 2% or less in the prepared nucleic acid extract. Therefore, the composition according to the present invention preferably contains a surfactant so as to be supplied into the nucleic acid extract at a concentration of 5% or less, more preferably 3% or less, and even more preferably 2% or less. Is preferred. The surfactant usable in the present invention is preferably selected from the group consisting of SDS, CTAB, Triton X-100 and N-lauroyl sarcosine sodium, but is not limited thereto.
なお、核酸抽出液のｐＨは好ましくは７以上、より好ましくは７．５以上、さらに好ましくは８．０〜９．０の範囲内である。よって、本発明に係る組成物は、調製された核酸抽出液中において上記ｐＨ環境が提供されるように、緩衝液（または緩衝化剤）をさらに含んでいてもよい。 The pH of the nucleic acid extract is preferably 7 or higher, more preferably 7.5 or higher, and still more preferably in the range of 8.0 to 9.0. Therefore, the composition according to the present invention may further include a buffer (or a buffering agent) so that the pH environment is provided in the prepared nucleic acid extract.
本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つ以外に、上述した組成物の成分をさらに別個に備えている形態であってもよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。また、核酸抽出を実施するために必要な試薬または器具をさらに備えていてもよく、抽出後に精製を行う場合は、精製を実行するに必要な試薬又は器具をさらに備えていてもよい。 The kit according to the present invention may be in a form in which the components of the composition described above are further separately provided in addition to at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound. That is, the kit according to the present invention includes at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound, and further includes EDTA, phosphoric acid and / or a surfactant. Also good. In addition, a reagent or instrument necessary for performing nucleic acid extraction may be further provided, and when purification is performed after extraction, a reagent or instrument necessary for performing purification may be further provided.
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。 As used herein, the term “kit” intends a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material. Preferably instructions for using each of the reagents or instruments are provided. As used herein, in the aspect of a kit, “provided” is intended to mean a state in which a reagent or the like is included in any of the individual containers constituting the kit. The The “instructions” may be printed on paper or other media, or may be recorded on electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, and the like.
〔２：核酸抽出液およびその製造方法〕
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。
[2: Nucleic acid extract and production method thereof]
The method for producing a nucleic acid extract according to the present invention includes a step of preparing a solution containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound, and the solution contains EDTA. A step of adding a phosphoric acid to the solution, or a step of adding a surfactant to the solution.
種々の核酸抽出液が当該分野において知られている。すなわち、本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を公知の核酸抽出液に混合（添加）することによって製造され得る。また、用いられる公知の核酸抽出液がＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤を含んでいない場合は、これらをさらに混合（添加）すればよいといえる。 Various nucleic acid extracts are known in the art. That is, the method for producing a nucleic acid extract according to the present invention can be produced by mixing (adding) a solution containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound to a known nucleic acid extract. . Moreover, when the well-known nucleic acid extract used does not contain EDTA, phosphoric acid, and / or surfactant, it can be said that these may be further mixed (added).
このように本発明に係る核酸抽出液は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでおり、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。 Thus, the nucleic acid extract according to the present invention contains at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound, and may further contain EDTA, phosphoric acid and / or a surfactant. . By using the present invention, not only DNA but also RNA can be extracted from soil with high yield.
〔３：核酸抽出方法〕
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。
[3: Nucleic acid extraction method]
The nucleic acid extraction method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned nucleic acid extract, and specifically, a sample in an extract containing at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound. A step of extracting the nucleic acid from.
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。 The nucleic acid extraction method according to the present invention is preferably used for extracting nucleic acid from a sample derived from at least one selected from the group consisting of soil, compost, aqueous sediment, activated sludge and feces.
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples. Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
〔土壌サンプル〕
図１に示した２種類の土壌を用いた。弥生堆肥区土壌は堆肥を年に一回投入しているため、比較的有機物の集積が進んだ淡色黒ボク土壌である。群馬農業試験場の畑地土壌は有機物の集積があまり進んでいない淡色黒ボク土壌である。
[Soil sample]
Two types of soil shown in FIG. 1 were used. Yayoi compost area is a light-colored black soil with relatively advanced accumulation of organic matter because compost is input once a year. The field soil of the Gunma Agricultural Experiment Station is a light-colored black soil with little organic matter accumulation.
〔土壌核酸溶液の抽出〕
上記２種類の土壌の風乾細土５０ｇに、２０ｍｌのＬＢ培地（ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／１Ｌ）を添加し、３０℃で２日間インキュベートした。インキュベートした土壌０．２５ｇを２ｍｌのスクリューキャップチューブに取り、これに１ｇのシリカ／ジルコニアビーズ（直径０．１ｍｍのものと０．５ｍｍのものとを２：１で混合したもの）と直径５ｍｍのガラスビーズを一個添加した。このチューブにＮａ２ＳｉＦ６溶液（０．５ｇ／ｍｌ）を１０μｌ、２５μｌ、５０μｌまたは１００μｌ添加し、さらに抽出液［Ｉ］〜［ＩＩＩ］のいずれかを先に添加したＮａ２ＳｉＦ６溶液と合わせて１２５０μｌになるように添加した。なお、抽出液にはＲＮａｓｅ阻害剤としてＡＴＡ（aurintricarboxylic acid）を含有させている。
[Extraction of soil nucleic acid solution]
20 ml of LB medium (tryptone 10 g, yeast extract 5 g / 1 L) was added to 50 g of the air-dried fine soil of the above two types of soil and incubated at 30 ° C. for 2 days. 0.25 g of the incubated soil is taken into a 2 ml screw cap tube, to which 1 g of silica / zirconia beads (0.1 mm diameter and 0.5 mm diameter mixed in 2: 1) and 5 mm diameter are mixed. One glass bead was added. The
これらチューブ中の試料に対して、ビーズ破砕機（Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００ トミー精工）で３０００ｒｐｍにて３０秒間のＢｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、次いで、この試料を６５℃で３０分間インキュベートした。続いて、１０，０００×ｇ、２５℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清７５０μｌに等量のクロロホルムを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、１２，０００×ｇ、２５℃で２０分間遠心分離し、上清５００μｌを回収した。この上清を適時希釈後に等量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、ＤＮＡおよびＲＮＡを沈殿として回収した。この沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥した。乾燥させた沈殿物を５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、土壌核酸溶液を得た。 The samples in these tubes were subjected to Beads Beating treatment at 3000 rpm for 30 seconds with a bead crusher (Micro Smash MS-100 Tommy Seiko), and then the samples were incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the mixture was centrifuged at 10,000 × g and 25 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected. An equal volume of chloroform was added to 750 μl of this supernatant, then vortexed and centrifuged at 12,000 × g, 25 ° C. for 20 minutes to recover 500 μl of supernatant. The supernatant was diluted after an appropriate amount of 2-propanol, then vortexed and centrifuged at 20000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to recover DNA and RNA as precipitates. The precipitate was washed with 70% ethanol and then dried. The dried precipitate was dissolved in 50 μl of TE buffer (pH 8.0) to obtain a soil nucleic acid solution.
〔ＤＮＡおよびＲＮＡの定量〕
ＤＮＡとＲＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動（×０．５ ＴＡＥ緩衝液中で５０Ｖにて３０分間）によって分離した後に、このゲルをＳＹＢＲ ＧｒｅｅＩＩで１時間染色した。ＢＡＳ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて、４７３ｎｍ励起、５３２ｎｍカットの条件でＤＮＡ、ＲＮＡを蛍光により定量的に検出した。ゲルの上端に近い５０００ｂｐより大きいサイズの部分をＤＮＡとして、２３Ｓ ｒＲＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡの２本のｒＲＮＡバンドをＲＮＡとして、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅによって輝度を計測した。なお、各ゲルには、４〜５段階の標準としてλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を０．０５μｇ〜０．２５μｇを同時に電気泳動し、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を基準にした検量線に基づいてＤＮＡ量およびＲＮＡ量を定量した。
[Quantification of DNA and RNA]
After separation of DNA and RNA by 1.5% agarose gel electrophoresis (30 min at 50 V in x0.5 TAE buffer), the gel was stained with SYBR Green II for 1 hour. Using BAS3000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.), DNA and RNA were quantitatively detected by fluorescence under conditions of 473 nm excitation and 532 nm cut. Luminance was measured by Image Gauge using a portion having a size larger than 5000 bp near the upper end of the gel as DNA and two rRNA bands of 23S rRNA and 16S rRNA as RNA. In each gel, 0.05 μg to 0.25 μg of λDNA HindIII digest was simultaneously electrophoresed as a 4-5 step standard, and the amount of DNA and the amount of DNA were determined based on a calibration curve based on the HindIII digest of λDNA. The amount of RNA was quantified.
〔結果〕
結果を図２〜４に示す。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加により土壌からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出量が増加したことがわかる。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加量を土壌２５０ｍｇあたり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲内で検討した。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加の必要量は土壌によって異なっていたが、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇ程度添加すると良好な結果が得られた。Ｎａ２ＳｉＦ６を多く入れることによるｐＨ低下に伴って収量が低下することが懸念されたが、特に問題なかった。なお、従来ＤＮＡの抽出が非常に困難であった群馬農業試験場土壌（有機物含量が少ない淡色黒ボク土壌）に対しては、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇのＮａ２ＳｉＦ６の添加により抽出量の大幅な向上が得られた。また、抽出液のリン酸濃度が濃いほど抽出量が向上し、抽出液［ＩＩＩ］が最もよい結果を示した。
〔result〕
The results are shown in FIGS. It can be seen that the amount of DNA and RNA extracted from the soil increased with the addition of Na 2 SiF 6 . The amount of Na 2 SiF 6 was studied in the range of 5mg~50mg per soil 250 mg. The required amount of Na 2 SiF 6 was different depending on the soil, but good results were obtained when about 50 mg was added to 250 mg of soil. Although there was a concern that the yield would decrease with a decrease in pH caused by adding a large amount of Na 2 SiF 6 , there was no particular problem. In addition, for Gunma Agricultural Experiment Station soil (light colored black soil with low organic matter content), where extraction of DNA has been very difficult, the extraction amount is greatly increased by adding 50 mg of Na 2 SiF 6 to 250 mg of soil. Improvement was obtained. In addition, the extraction amount improved as the concentration of phosphoric acid in the extract increased, and the extract [III] showed the best results.
本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術として、土壌からのＤＮＡの抽出技術と同様に有用であるとともに、土壌で活動している微生物を正確に評価し得、その結果、土壌での土壌微生物の生態をリアルタイムに検出し得る。このように、本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術は、植物病害や特定の遺伝子発現解析など幅広い分野への活用が期待し得るとともに、わが国の土壌微生物の生態を明らかにするためにも非常に有用な技術である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful as a technique for extracting RNA from soil, as well as a technique for extracting DNA from soil, and can accurately evaluate microorganisms that are active in the soil. Can detect the ecology of As described above, the present invention can be expected to utilize RNA extraction technology from soil in a wide range of fields such as plant diseases and specific gene expression analysis, and also to clarify the ecology of soil microorganisms in Japan. It is a very useful technique.
Claims (20)
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴とする組成物。 A composition for preparing a nucleic acid extract,
A composition comprising at least one compound selected from a fluorinated compound and a silicate compound.
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