JP2008512353A - 主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むイムノグロブリン - Google Patents

Abstract

本発明は、特定のエフェクター機能を付与するイムノグロブリン糖タンパク質上の主要なＮ−グリカン構造を有するイムノグロブリン糖タンパク質組成物に関する。さらに、本発明は、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂である特異的な富化されたＮ−グリカン構造を有する抗体を含む医薬組成物

Description

（関連出願）
本出願は、２００４年７月２１日付出願の米国特許仮出願第６０／５９０，０１１号、および２００４年７月２１日付出願の米国特許仮出願第６０／５９０，０５１号の利益を主張するものである。また、本出願は、２００４年６月２５日付出願の米国特許出願第１０／５００，２４０号の一部継続出願（「ＣＩＰ」）でもあるが、この出願は、２００１年１２月２７日付出願の米国特許仮出願第６０／３４４，１６９号の利益を主張する、２００２年１２月２４日付出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／４１５１０号の国内段階出願である。また、本出願は、２００３年２月２０日付出願の米国特許出願第１０／３７１，８７７号のＣＩＰであるが、この出願は、２０００年６月２８日付出願の米国仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６月３０日付出願の米国仮出願第６０／２１５，６３８号、および２００１年３月３０日付出願の米国仮出願第６０／２７９，９９７号の利益を主張する、２００１年６月２７日付出願の米国出願第０９／８９２，５９１号のＣＩＰである。上記引用出願は、それぞれ、その全体が参照されて本明細書に組み入れられる。

本発明は、特異的Ｎ−結合型グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を製造するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、特異的なＮ−グリカン構造を有する複数のＮ−グリカンを含むイムノグロブリン糖タンパク質の組成物に関し、より具体的には、複数のＮ−グリカンの内部に、特定のエフェクター機能を調節、例えば促進する、１又はそれ以上の主要なグリコフォーム構造がイムノグロブリン上に存在するイムノグロブリン糖タンパク質を含む組成物に関する。

糖タンパク質は、ヒトおよびその他の哺乳動物において、触媒、シグナル伝達、細胞間連絡、ならびに分子の認識および会合など、多数の必須の機能に介在する。糖タンパク質は、真核生物における大部分の非サイトゾルタンパク質を構成している（Lis and Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27）。多くの糖タンパク質が、治療目的で利用されており、この２０年間で、天然の糖タンパク質を組換えたものがバイオテクノロジー産業の大部分を占めるようになっている。治療薬として使用されている組換えグリコシル化タンパク質の例は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＨ）などである（Cumming et al, 1991, Glycobiology 1:115-130）。最近では、予防薬および治療薬となり得るものとして産生された組換えタンパク質が臨床に近づくにつれ、組換えによって産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変動性が、科学界において大いに注目される話題となっている。

抗体またはイムノグロブリン（Ｉｇ）は、体液性免疫反応において中心的な役割を果たしている糖タンパク質である。抗体は体液と細胞の防御機構の間の結びつきを提供するアダプター分子と考えられる。抗体の抗原特異的認識によって、複数のエフェクター機構を活性化させる可能性のある免疫複合体の形成がもたらされ、この複合体の除去および破壊という結果ももたらされる。イムノグロブリンの一般的クラスの中では、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの５つのクラスの抗体を生化学的および機能的に区別することができるが、可変領域に限局されるよりわずかな相違によって抗原結合の特異性が説明される。これら５つのＩｇクラスでは、２つの型の軽鎖しか存在せず、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれている。λ鎖またはκ鎖をもつ抗体の間では、いかなる機能的な相違も見つかっておらず、これら２つの型の軽鎖の比率は種ごとに異なっている。５つの重鎖のクラスまたはアイソタイプがあり、これらが抗体分子の機能活性を決定する。イムノグロブリンの５つの機能性クラスは、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＤ（ＩｇＤ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、およびイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）である。各アイソタイプは免疫反応において特別な機能をもち、重鎖のカルボキシル末端部分が軽鎖に結合していない場合、そのカルボキシル末端部分によって、特定の機能的特性が付与される。ＩｇＧは、血漿中に最も豊富に存在するイムノグロブリンのアイソタイプである（例えば、Immunobiology, Janeway et al., 6^th Edition, 2004, Garland Publishing, New York参照）。

イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）分子は、定常領域および可変領域をもつＦａｂ（抗原結合性断片）ドメイン、およびＦｃ（結晶化可能断片）ドメインを含む。各重鎖のＣＨ２ドメインは、アスパラギン残基、通常はＡｓｎ−２９７残基において、Ｎ−グリカンをＩｇ分子に結合する単一のＮ結合型グリコシル化部位を含む（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。

Ｎ結合型オリゴサッカライド類の構造面および機能面の解析は、以下の３つの理由により生物学的な興味の対象となっている：（１）ＣＨ２ドメインのグリコシル化は進化の全過程で保存されてきており、オリゴサッカライドにとって重要な役割を示唆していること；（２）イムノグロブリン分子が、オリゴサッカライドの不均一性を解析するためのモデル系として役立つこと（Radamacher and Dwek, 1984; Radamacher et al., 1982）；および（３）抗体が、２つのオリゴサッカライドを互いに直接接触させる２つの重鎖のダイマー結合を含み、そのため、イムノグロブリン分子はタンパク質−炭水化物間および炭水化物−炭水化物間の特異的相互作用をともに含むこと。

Ｉｇのさまざまなグリコシル化パターンがさまざまな生物学的特性に関連していることが示されている（Jefferis and Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol., 15:26-32）。しかし、わずか数種の特異的グリコフォームが、所望の生物学的機能を付与することが知られている。例えば、Ｎ結合型グリカン上においてフコシル化の低下が見られるイムノグロブリン組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩに強く結合するために、強い抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもつことが報告されている（Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J.Biol. Chem. 278: 3466-3473）。そして、ＣＨＯ細胞の中で作られるフコシル化Ｇ２（Ｇａｌ₂ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂）ＩｇＧの組成物が、不均一な抗体(heterogenous antibodies)の組成物よりも大幅に補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性を増加させることが報告されている（Raju, 2004, US Pat. Appl. No. 2004/0136986）。腫瘍に対する最適な抗体は、選択的に結合してＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）を活性化し、阻害性ＦｃγＲＩＩｂレセプターには最小限に結合したものであろうことも示唆されている（Clynes et al., 2000, Nature, 6:443-446）。従って、Ｉｇ糖タンパク質上の特異的なグリコフォームを富化する能力が非常に望ましい。

一般に、糖タンパク質上のグリコシル化構造（オリゴサッカライド）は、発現宿主および培養条件に応じて変化するものである。非ヒト宿主細胞内において産生される治療用タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性反応を誘発する可能性のある非ヒト型グリコシル化、例えば、酵母菌における高度マンノシル化（Ballou, 1990, Methods Enzymol. 185:440-470）；植物におけるα（１，３）フコースおよびβ（１，２）キシロース、（Cabanes-Macheteau et al., 1999, Glycobiology, 9:365-372）；チャイニーズハムスター卵巣細胞中のＮ−グリゴリルノイラミン酸（Noguchi et al., 1995, J.Biochem. 117:5-62）、およびマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Borrebaeck et al., 1993, Immun. Today, 117:477-479）を含むであろう。さらに、ガラクトシル化は細胞の培養条件によって変わることがあり、そのため、イムノグロブリン組成物には、その特異的なガラクトースパターンに応じて免疫原性となるものがある（Patel et al., 1992, Biochem.J. 285: 839-845）。非ヒト哺乳動物細胞によって産生される糖タンパク質のオリゴサッカライド構造は、ヒト糖タンパク質のものにより近似する傾向がある。そのため、市販のイムノグロブリンのほとんどは哺乳動物で産生される。しかし、哺乳動物細胞には、タンパク質産生のための宿主細胞としていくつかの重大な欠陥がある。高価であることに加え、哺乳動物においてタンパク質を発現させる工程により、グリコフォームの不均一集団が産生され、容量力価が低く、かつ、安定的な細胞系統を作出するのにウイルスの継続的含有（containment）とかなりの時間を必要とする。

さまざまなグリコフォームが、治療薬の性質、例えば、薬物動態、薬力学、レセプターの相互作用、および組織特異的ターゲティングなどに大いに影響することがあると理解されている（Graddis et al., 2002, Cur Pharm Biotechnol. 3:285-297）。特に抗体に関しては、オリゴサッカライド構造がプロテアーゼ抵抗性に関連する性質、ＦｃＲｎレセプターが介在する抗体の血清半減期、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導する補体複合体Ｃ１への結合、および、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路、ファゴサイトーシス、および抗体によるフィードバックの調節に関与するＦｃγＲレセプターへの結合に影響することがある（Nose and Weigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al., 1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289）。

さまざまなグリコフォームがさまざまな生物学的特性に関連しているので、１又はそれ以上の特定のグリコフォームを富化する能力を利用して、特異的なグリコフォームと特異的な生物学的機能の間の関係を解明することができる。所望の生物学的機能を特定のグリコフォームパターンに関連付けると、有利なグリコフォーム構造を富化された糖タンパク質組成物を製造することができる。従って、特定のグリコフォームについて富化された糖タンパク質を産生する能力は非常に望ましい。

本発明は、各イムノグロブリンが、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含む複数のイムノグロブリンを含む組成物であって、それによって、該組成物が、主なＮ−グリカンが本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物を提供する。好ましい実施形態において、前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントよりも多くが本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる。より好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセントよりも多くが本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる。他の公的な好適な実施形態において、前記ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造は、前記した複数のＮ−グリカン構造の中で２番目に最も主要なＮ−グリカンより約５０モルパーセントよりも多い量で存在する。

本発明は、イムノグロブリン上の特異的なグリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂）を富化して、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ受容体への結合を増加させ、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合を減少させる方法を提供する。好適な実施形態は、複数のイムノグロブリンを含む組成物を製造する方法であって、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって、前記組成物が、本質的に少なくともＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含み、前記方法が、前記イムノグロブリンおよびその断片を発現するよう操作または選択された宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。別の好適な実施形態は、複数のイムノグロブリンを含む組成物を製造する方法であって、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、そのため、前記組成物が、本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含み、前記方法が、前記イムノグロブリンおよびその断片を発現するよう操作または選択された下等真核生物宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。本発明の他の実施形態において、宿主細胞は、イムノグロブリンまたはその断片をコードする外来遺伝子を含み、前記宿主細胞を操作または選択して、前記イムノグロブリンまたはその断片を発現させ、それによって、複数のイムノグロブリンを含む組成物であって、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含むことによって、本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生する。本発明のさらに他の実施形態において、下等真核生物宿主細胞は、イムノグロブリンまたはその断片をコードする外来遺伝子を含み、前記宿主細胞を操作または選択して、前記イムノグロブリンまたはその断片を発現させ、それによって、複数のイムノグロブリンを含む組成物であって、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含むことによって、本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生する。

本発明の好適な実施形態において、複数のイムノグロブリンを含み、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含むことによって、本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物であって、前記のイムノグロブリンがＦｃγＲＩＩｂレセプターへの結合アフィニティーの低下を示す組成物。本発明の他の好適な実施形態において、複数のイムノグロブリンを含み、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含むことによって、主要なＮ−グリカンが、本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなり、前記イムノグロブリンがＦｃγＲＩＩＩａレセプターおよびＦｃγＲＩＩＩｂレセプターへの結合アフィニティーの上昇を示す組成物。本発明のさらに別の実施形態において、複数のイムノグロブリンを含み、その各イムノグロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含むことによって、主要なＮ−グリカンが本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンからなり、前記イムノグロブリンが抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の上昇を示す組成物。

１つの実施形態において、本発明の組成物は、本質的にフコースを含まないイムノグロブリンを含む。別の実施形態において、本発明の組成物は、フコースを欠くイムノグロブリンを含む。また、本発明の組成物は、医薬組成物および医薬上許容され得る担体も含む。また、本発明の組成物は、精製されて診断キットに組み込まれた、イムノグロブリンの医薬組成物も含む。

従って、本発明は、所定のグリコシル化構造を有する糖タンパク質の組成物、具体的には、本質的に７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを有するイムノグロブリンまたは抗体分子を産生するための材料および方法を提供する。

本明細書において別段の定義がないかぎり、本発明に関して使用される科学技術用語および語句は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途必要とされないかぎり、単数形の用語は複数形の用語を含み、複数形の用語も単数形の用語を含むものとする。一般に、本明細書に記載した生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝子学ならびにタンパク質化学およびハイブリダイゼーションに関連した命名法、および、それらの技術は、当技術分野において周知のものであって、普通に使用されているものである。本発明の方法および技術は、当技術分野において周知の常法に従って、また、別段の記載がない限り、本明細書を通じて引用され検討されている、さまざまな一般的な参考文献、および、より細目にわたる参考文献に記載されているようにして一般的に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）（1989）；Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）グリーンパブリシングアソシエイツ社（Greene Publishing Associates）（１９９２、および２００２年までの補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）；ＴａｙｌｏｒおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ、糖鎖生物学概論（Introduction to Glycobiology）、オクスフォード大学プレス社（Oxford Univ. Press）（２００３）；ワーシントン酵素マニュアル（Worthington Enzyme Manual）、ワーシントンバイオケミカル社（Worthington Biochemical Corp.）、ニュージャージー州フリーホルド（Freehold）；生化学ハンドブック：Ａ節タンパク質（Handbook of Biochemistry: Section A Proteins）Ｖｏｌ Ｉ、ＣＲＣプレス社（CRC Press）（１９７６）；生化学ハンドブック：Ａ節タンパク質、Ｖｏｌ ＩＩ、ＣＲＣプレス社（１９７６）；糖鎖生物学精解（Essentials of Glycobiology）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社、（１９９９）；免疫生物学（Immunobiology）、Ｊａｎｅｗａｙら、第６版、２００４、ガーランドパブリシング社（Garland Publishing）、ニューヨーク参照。

本明細書に記載したすべての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照されて本明細書に組み込まれる。

以下の用語は、別段の記載がない限り、以下の意味を有するものと解されなければならない：
本明細書において使用される「Ｎ−グリカン」、「グリカン」および「グリコフォーム」という用語は互換的に使用され、Ｎ結合型オリゴサッカライド、例えば、タンパク質のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基が結合していたか、結合しているオリゴサッカライドを意味する。糖タンパク質上に存在する主な糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖類のプロセッシングは、ＥＲ内腔において同時翻訳的に起こり、Ｎ−結合型糖タンパク質になるようゴルジ体内でも続く。

Ｎ−グリカンは、共通にＭａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂のペンタサッカライドコアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを、「Ｇｌｃ」はグルコースを、および「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「ペンタサッカライドコア」または「パウシマンノースコア（paucimannose）」とも呼ばれるＭａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂（「Ｍａｎ₃」）コア構造に付加される末梢糖（peripheral sugars）（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、その分枝状構成成分に従って分類される（例えば高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは典型的に、「トリマンノース」コアの１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ−グリカンは、任意には、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）により修飾されているガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基も有することが可能である。複合型Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換（intrachain substitutions）も有する。また、複合型Ｎ−グリカンは、しばしば「多アンテナグリカン（multiple antennary glycan）」と呼ばれる「トリマンノースコア」を有する可能性もある。「ハイブリッド型」Ｎ−グリカンはトリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０又はそれ以上のマンノースを有する。さまざまなＮ−グリカンも「グリコフォーム」と呼ばれる。

本明細書で使用する略語は、当技術分野において一般的に用いられているものであり、上記の糖類の略語を参照。他の一般的な略語は、すべてペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ ３．２．２．１８）を意味する「ＰＮＧアーゼ」、または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」などがある。

「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、その天然の宿主細胞において本来のポリヌクレオチドと本来は一緒に存在する他の細胞成分、例えば、天然ではそれが結合しているリボソーム、ポリメラーゼおよびゲノム配列から実質的に分離されているものである。この用語は以下のような核酸またはポリヌクレオチドを含む。（１）その天然の環境から取り出され、（２）その「単離ポリヌクレオチド」が天然で存在するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しておらず、（３）天然では連結することがないポリヌクレオチドに動作可能に連結しているか、または（４）天然では生じることがない核酸またはポリヌクレオチドを含む。「単離された」または「実質的に純粋な」という用語は、組換えＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログを指すときに使用することができる。

しかし、「単離された」ということは、上記の核酸またはポリヌクレオチド自体がその天然の環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。例えば、異種配列が内在する核酸配列に隣接して置かれて、この内在核酸配列の発現が変化する場合、本明細書では、生物のゲノムの内在核酸は「単離された」と考える。これに関連して、異種配列とは、天然では内在性核酸配列に隣接しない配列であって、その異種配列自体は内在性（同一の宿主細胞またはその子孫細胞に由来する）であると、外来性（異なる宿主細胞またはその子孫細胞に由来する）であるとを問わない。一例として、プロモーター配列を、（例えば、相同組換えによって）宿主細胞のゲノム内遺伝子の本来のプロモーターと置換して、この遺伝子の発現パターンを変化させることができる。この遺伝子は、天然でその近傍にある配列の少なくとも一部から分離していることから、今や「単離」していることになる。

核酸も、ゲノムにある対応する核酸に天然では生じない何らかの改変を含んでいれば、「単離された」と見なされる。例えば、ヒトの介在によって人為的に導入された挿入、欠失または点突然変異を含んでいれば、内在性のコード配列は「単離された」と見なされる。また、「単離された核酸」は、非相同部位において宿主細胞の染色体に組み入れられた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物などがある。さらに、「単離された核酸」は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞物質を実質的に含まないか、培養培地を実質的に含まないことがあり、または、化学的に合成された場合、化学的前駆体またはその他化学物質を実質的に含まないことがある。

本明細書において、参照核酸配列の「縮重変異体」という語句は、標準的な遺伝子コードに従って翻訳され、参照核酸配列から翻訳されたものと同じアミノ酸配列を提供することができる核酸配列を含む。「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」という用語が、必ずしも配列が同一でなくとも、１又はそれ以上の特定のセグメントの内部で互いに相同である標的核酸配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。

核酸配列に関して「配列同一性の割合」または「同一の」という用語は、最大限に一致するよう整列された場合に同一である２つの配列の残基を意味する。配列同一性を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチドまたはそれ以上のストレッチにわたる。ヌクレオチド配列の同一性を測定するために使うことができる、当技術分野において周知のいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列はファスタ(FASTA)、ギャップ(Gap)、またはベストフィット(Bestfit)を用いて比較することができるが、これらはウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０（Wisconsin Package Version 10.0）、ジェネティックコンピュータグループ（Genetics Computer Group）（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン（Madison）に収められているプログラムである。ＦＡＳＴＡによって、クエリー配列とサーチ配列の間の最適なオーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性の割合が提供される。ピアソン（Peason）、Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（本明細書にその全体を参照して組み込まれる）。例えば、核酸間の配列同一性の割合は、ＦＡＳＴＡをその初期パラメーター（ワードサイズが６、スコアリングマトリクスに対してＮＯＰＡＭファクター）で用いるか、またはＧａｐを、参照して本明細書に組み込まれるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供されているその初期パラメーターで用いて決定することができる。あるいは、配列は以下のコンピュータープログラムを用いて比較することができる。ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet, 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Gemone Res. 7:649-656 (1997)）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）。

核酸またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、別の核酸（またはその相補鎖）と、適当なヌクレオチドの挿入または欠失を用いて最適にアラインメントされたときに、周知の配列同一性アルゴリズム、例えば、上記のＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなどによって測定すると、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、通常はヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、および、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％でヌクレオチド配列が同一になっていることを示す。

あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはその断片がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。核酸のハイブリダイゼーション実験に関連した「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな洗浄条件」は、いくつかの異なった物理的パラメーターに応じて変わる。核酸のハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする分子種の塩基組成、およびハイブリダイズする核酸同士のヌクレオチド塩基のミスマッチ数などの条件により影響を受ける。当業者は、これらのパラメーターを変えて、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成する方法を認識している。

一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、一連の具体的な条件下で、特定のＤＮＡハイブリッドの熱融解点（Ｔ_m）よりも約２５℃低い温度で行う。「ストリンジェントな洗浄」は、一連の具体的な条件下で、特定のＤＮＡハイブリッドのＴ_mよりも約５℃低い温度で行う。Ｔ_mは、完全に一致しているプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、第９．５１頁参照（Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), page 9.51）、これは参照されて本明細書に組み込まれる。本発明の目的にとって、「ストリンジェントな条件」は、液相ハイブリダイゼーションについて定義され、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣが３．０ＭのＮａＣｌおよび０．３Ｍのクエン酸ナトリウムを含む場合）、１％ ＳＤＳにおいて６５℃で８〜１２時間行われ、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて６５℃で２０分間の洗浄２回行うことと定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、いくつかの要素、例えば、ハイブリダイズしている配列の長さおよび同一性の割合に応じてさまざまな速度で起こるであろうことが当業者には解るはずである。

「変異した」という用語は、核酸配列に適用される場合、参照核酸配列と比較して、核酸配列のヌクレオチドを挿入、欠失または変更できることを意味する。単一の変更を１つの遺伝子座に加えることができ（点突然変異）、または、複数のヌクレオチドを単一の遺伝子座に挿入、欠失、または変更することもできる。さらに、核酸配列内部の任意の数の遺伝子座において、１又はそれ以上の変更を加えてもよい。核酸配列は、当技術分野において公知のいずれかの方法、例えば、「エラープローンＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行って、ＰＣＲ生成物の全長にわたって高率の点突然変異が得られる工程、例えば、Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)およびCaldwell and Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)参照）、および「オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発」（対象となるクローン化ＤＮＡセグメントのいずれかにおいて部位特異的突然変異の発生を可能にする工程、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57 (1988)参照）などの突然変異誘発技術であるが、それらに限定されない方法で変異させることができる。

本明細書において「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加ＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖のＤＮＡループを意味する。別のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる（より詳細に後述する）。一定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自己複製する能力がある（例えば、宿主細胞において機能する複製開始点をもつベクター）。別のベクターは、宿主細胞に導入されると同時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、その結果、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、一定の好ましいベクターは、作動可能に連結している遺伝子の発現を指令する能力がある。このようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と呼ぶ。

本明細書において「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、通常は宿主細胞において産生されない核酸配列であって、典型的にはタンパク質をコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示した方法によって、１又はそれ以上の目的の配列または目的の遺伝子を、安定して宿主細胞に組み込むことが可能となる。目的の配列の非限定的な例は、酵素活性を有する１又はそれ以上のポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を与える酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼをコードする配列などである。

「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」は、宿主細胞内における配列の存否を陽性選択または陰性選択できるようにする活性を発現することができる核酸配列を意味する。例えば、Ｐ．パストリスＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、この遺伝子を含む細胞はウラシル不在下で増殖する能力があるため、その存在を選択することができるからである。また、この遺伝子の存在は、この遺伝子を含む細胞には５−ＦＯＡ存在下で増殖する能力がないことから、逆選択することもできる。マーカー配列または遺伝子は必ずしも陽性選択性および陰性選択性の両方を示す必要はない。Ｐ．パストリス由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な例は、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３などである。抗生物質耐性マーカー遺伝子については、カナマイシン、ネオマイシン、ジェネテシン（すなわちＧ４１８）、パロモマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために広く使用されている。

「作動可能に連結した」発現調節配列は、発現調節配列が目的の遺伝子に隣接して目的の遺伝子を調節する結合、および、トランスまたは離れた位置で作用して目的の遺伝子を調節する発現調節配列を意味する。

本明細書で使用される「発現調節配列」という用語は、作動可能に連結しているコード配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現調節配列は、転写、転写後の事象、および核酸配列の翻訳を調節する配列である。発現調節配列は、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサーの配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を向上させる配列（例えばリボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を向上させる配列；および、所望であれば、タンパク質分泌を亢進させる配列などである。このような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物においては、このような調節配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列などである。「調節配列」という用語は、最小限、その存在が発現に必須である全ての成分を含むものであり、その存在が有益である付加的成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。

本明細書で使用される「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）という用語は、組換えベクターを導入した細胞を意味するものである。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味するものと理解すべきである。ある特定の改変は、突然変異または環境の影響せいで後世代に生じる可能性があるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書における「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、培養された単離細胞または細胞株であってよく、または生きた組織または生物に存在する細胞であってもよい。

「真核の」という用語は有核の細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞、および下等真核細胞を含む。

「下等真核細胞」という用語は、酵母菌、菌類、襟鞭毛虫、微胞子虫、アルベオラータ（例えば、渦鞭毛虫）、ストラメノパイル類（例えば、褐藻類、原生動物）、紅藻植物（例えば、紅藻類）植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ類）および他の原生生物を含む。酵母菌および菌類は、ピキア種（Pichia sp.）、例えばピキア・パストリス（Pichia Pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィリア（Pichia trehalophilia）、ピキア・コクラマエ（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ミヌータ（Pichia minuta）（オガタエア・ミヌータ（Ogataea minuta）、ピキア・リンドネリ（Pichia Lindneri））、ピキア・オプンチアエ（Pichia opuntiae）、ピキア・テルモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・グエルクウム（Pichia guerucuum）、ピキア・ピイペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スチプチス（Pichia stiptis）およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）；サッカロミセス種（Saccharomyces sp.）、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）；ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス種（Kluyveromyces sp.）、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギス・ニジェール（Aspergillus niger）、アスペルギス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーサイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム種、例えば、フザリウム・グラミニューム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ベネナトゥム（Fusarium venenatum）；フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）およびニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）などであるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長よりも短く、より典型的には約３０アミノ酸長よりも短いものを意味する。本明細書で使用されるこの用語は、構造ひいては生物学的機能を模倣するアナログおよび模倣体を含む。

「ポリペプチド」という用語は、天然および非天然タンパクの質、ならびにその断片、変異体、誘導体、およびアナログを意味する。ポリペプチドは単量体または多量体であってもよい。さらに、ポリペプチドは、それぞれが１又はそれ以上の別個の機能を有する、いくつかの異なるドメインを含んでいてもよい。

「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または由来源のせいで、（１）天然状態ではそれと一緒に存在する、天然の随伴成分に結合していないか、（２）他の細胞物質の存在に対して純度を調節できる場合（例えば、同一種由来の他のタンパク質を含まない）、天然には無い純度で存在するか、（３）異種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然には存在しないタンパク質またはポリペプチドである（例えば、天然に存在するポリペプチドの断片であるか、または天然には存在しないアミノ酸アナログもしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）。従って、化学的に合成されるか、それが天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然の随伴成分から「単離され」ている。また、ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を用いて、単離により天然の随伴成分を実質的に含まないようにすることもできる。このように定義されているため、「単離」は、上記のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要とするものではない。

本明細書において「ポリペプチド断片」という用語は、完全長ポリペプチドと比較して、欠失、例えばアミノ末端および／またはカルボキシル末端の欠失を有するポリペプチドを意味する。好適な実施形態において、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が天然配列の対応する位置で同一である連続配列である。断片は典型的には少なくとも長さが５、６、７、８、９、または１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、または１８アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０、または４５アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸、およびさらに一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸である。

「修飾された誘導体」は、一次構造配列が実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的および生化学的な修飾を含むか、または天然のポリペプチドには存在しないアミノ酸を取り込んでいるポリペプチドまたはその断片を意味する。当業者には容易に理解されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核物質による標識、およびさまざまな酵素的修飾などがある。ポリペプチドを標識する多様な方法、および、このような目的にとって有用である多様な置換基または標識が当技術分野において周知であり、放射性同位体、例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、および³Ｈ、標識された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、蛍光プローブ、化学発光剤、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして働くことができる抗リガンドなどがある。標識の選択は、必要とされる感度、プライマーとの結合の容易さ、安定性条件、および利用可能な器具に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当技術分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学最新プロトコル、グリーンパブリシングアソシエイツ社（１９９２、および２００２年までの補遺）（Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)参照（参照して本明細書に組み込まれる）。

「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列と結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２又はそれ以上の異なるタンパク質に由来する２又はそれ以上の所望の機能的要素を含むよう構築することができるので有用である。融合タンパク質は、目的とするペプチド由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０個または３０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４０、５０または６０個のアミノ酸、さらになお好ましくは少なくとも７５、１００または１２５個のアミノ酸を含む。本発明のタンパク質全体を含む融合体が特に有用性をもつ。本発明の融合タンパク質の内部に含まれる異種ポリペプチドは、長さが少なくとも６アミノ酸、しばしば長さが少なくとも８アミノ酸であって、有用には長さが少なくとも１５、２０、および２５アミノ酸である。より大きいポリペプチド、例えばイムノグロブリンＦｃ断片、またはイムノグロブリンＦａｂ断片、または完全なタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、発色団含有タンパク質、もしくは完全長イムノグロブリンなどで行われる融合は特定の有用性をもつ。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を、異なったタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列とインフレームで構築し、その後融合タンパク質を発現させることによって組換えにより作製することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋して化学的に生成することができる。

本明細書において「抗体」、「イムノグロブリン」、「Ｉｇ」および「Ｉｇ分子」という用語は同義的に使用される。各抗体分子はその特異的な抗原に結合できるよう独特な構造を有するが、すべての抗体／イムノグロブリンが、本明細書に記載されているような同一の全体構造を有する。基本的な抗体構造ユニットが、サブユニットのテトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは２対の同一のポリペプチド鎖を有し、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能の関与する定常領域を画定している。軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖として分類される。重鎖はガンマ鎖、ミュー鎖、アルファ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖は可変領域および定常領域に分けられる（一般的には、基礎免疫学（Fundamental Immunology）（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989）第７章参照（すべての目的のためにその全体を参照して本明細書に組み込む）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、完全抗体は２つの結合部位を有する。ただし、二官能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。これらの鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域が連結した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列されているため、特異的エピトープに結合することができる。これらの用語は、天然の形態、ならびに断片および誘導体を含む。これらの用語の範囲には、Ｉｇのクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤが含まれる。また、これらの用語の範囲には、ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。この用語は最も広義に使われ、単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体など）、および複数のエピトープまたは抗体に結合する抗体組成物を含む。これらの用語は、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および、Ｃ_H２ドメインのＮ結合型グリコシル化部位を含む重鎖イムノグロブリン定常領域のＣ_H２ドメインの部分を少なくとも含むか、含むように改変されている場合に限り、抗体断片、またはそれらの変異体を包含する。これらの用語の範囲内には、Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国特許出願第２００４／０１３６９８６号）、Ｆｃ融合体、および抗体様分子が含まれる。あるいは、これらの用語は、少なくともＮ結合型グリコシル化部位を含む少なくともＦａｂ領域の抗体断片を意味することもできる。

「Ｆｃ」断片という用語は、Ｃ_H２およびＣ_H３ドメインを含む抗体のＣ末端領域の「結晶化可能断片」を意味する（図１）。「Ｆａｂ」断片という用語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬドメインを含む抗体の「断片抗原結合性」領域を意味する（図１）。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体集団を意味する。すなわち、その集団を構成する各抗体は、少量ながら存在する可能性のある自然に生じ得る突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的なため、単一抗原部位に向けられる。さらに、一般的にはさまざまな決定基（エピトープ）に対するさまざまな抗体を含む従来型（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは抗原上の単一決定基に向けられる。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、ハイブリドーマ培養により合成可能であり、他のイムノグロブリンの混入がない点で有益である。「モノクローナル」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を表すものであって、いずれかの特定の方法によって抗体を産生する必要があると解されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975) Nature, 256:495によって最初に記述されたハイブリドーマ法、または、組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。

本明細書記載のモノクローナル抗体は、元の分子種またはイムノグロブリンのクラスもしくはサブクラスの指定とは無関係に、抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインとを継ぎ合わせ（例えば、「ヒト化」抗体）、または、軽鎖を重鎖と、または、ある種由来の鎖を別の種由来の鎖、または融合体を異種タンパク質とを継ぎ合わせて作製されるハイブリッドおよび組換えによる抗体を含む（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号; Mage and Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）参照）。本明細書において、モノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、ある種に由来する抗体の対応配列と同一または相同であるか、または、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、他方、鎖の残部が、別の種に由来する抗体の対応配列と同一または相同であるか、または、別の抗体クラスまたはサブクラスに属している「キメラ」抗体（イムノグロブリン）、および少なくとも１つのＣ_H２を含むか、含むように改変されている限り、そのような抗体の断片も含む。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型が、ヒトイムノグロブリンに由来する配列を含む、具体的なキメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、または、その他抗体の抗原結合配列）である。抗体のＦｖ断片は、分子全体の結合特性および特異性を保持する、抗体の最小単位である。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが非共有結合によって結合しているヘテロダイマーである。Ｆ（ａｂ’）₂断片は、ジスルフィド架橋によって連結されたＦａｂ断片の両方のアームを含む断片である。

ヒト化抗体の最も一般的な形はヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、非ヒト分子種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲであって、所望の特異性、アフィニティー、および能力を有するＣＤＲに由来する残基（ドナー抗体）によって置換されているヒトイムノグロブリンである。いくつかの実例において、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト型残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入されたＣＤＲまたはフレームワークの配列にも存在しない残基を含むことがある。これらの修飾は抗体の能力をさらに改良して最大化するように行われるものである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含むものであって、そこでは、ＣＤＲ領域のすべて、または実質的にすべてが非ヒト型イムノグロブリンのそれらに対応しており、また、ＣＤＲ領域のすべて、または実質的にすべてがヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最適には、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒトイムノグロブリンのものを含む。さらなる詳細に関しては、Jones et al., 1986, Natue 321:522-524; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327, and Presta, 1992, Cur. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照。

抗体またはイムノグロブリンという用語の範囲に含まれる「断片」は、標的分子に特異的に結合する能力がある限り、さまざまなプロテアーゼによる分解によって産生されたもの、化学的切断および／または化学的分離によって産生されたもの、および組換えによって産生されたものなどである。このような断片にはＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）₂および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片がある。

本発明の抗体の目的となる標的は、増殖因子レセプター（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲ、およびＶＥＧＦ）およびそれらのリガンドを含む。他の標的は、Ｇタンパク質レセプターであり、サブスタンスＫレセプター、アンジオテンシンレセプター、α−およびβ−アドレナリンレセプター、セロトニンレセプター、およびＰＡＦレセプターなどである。例えば、Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649 (1987)参照。その他の標的は、イオンチャンネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャンネル）、ムスカリンレセプター、アセチルコリンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、グルタミン酸レセプター、およびドーパミンレセプターなどである（Ｈａｒｐｏｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号および米国特許第５，４３６，１２８号参照）。その他の標的は、接着性タンパク質、例えばインテグリン、セレクチン、およびイムノグロブリンのスーパーファミリーの分子などである(Springer, Nature 346: 425-433 (1999); Osborn, Cell 62:3(1990); Hynes, Cell 69:11 (1992)参照）。その他の標的はサイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１からＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）などである。ヒトサイトカイン：基礎および応用研究のためのハンドブック(Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research)、Ａｇｇｒａｗａｌら編、ブラックウェルサイエンティフィック社(Blackwell Scientific)、マサチューセッツ州ボストン(Boston)、１９９１、参照。その他の標的はホルモン、酵素、ならびに細胞内および細胞間のメッセンジャー、例えばアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣである。その他の目的となる標的は、白血球抗原、例えばＣＤ２０およびＣＤ３０である。薬剤も目的の標的となることができる。標的分子はヒト、哺乳動物、細菌のものであってもよい。その他の標的は、抗原、例えばタンパク質、糖タンパク質および炭水化物であって、ウイルス性および細菌性の微生物病原体、および腫瘍由来のものである。さらに別の標的が米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。

本明細書において検討する免疫Ｆｃレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃＲｎ（新生児のレセプター）などであろう。ＦｃγＲＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩサブタイプを意味することができる。ＦｃγＲＩＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩＩ受容体を意味することができる。ＦｃγＲＩＩＩという用語は、別段の指定がない限り、任意のＦｃγＲＩＩＩサブタイプを意味することができる。

「誘導体」という用語の範囲には、配列は改変されているが、依然として標的分子に特異的に結合できる抗体（または、その断片）が含まれ、例えば種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合物；ヘテロマー性抗原複合体および抗原融合物、例えばダイアボディー（二重特異性抗体）、単鎖ダイアボディー、およびイントラボディー（例えば、細胞内抗体：研究と疾患への応用（Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications）、マラスコ(Marasco)編、シュプリンガー・フェアラーク・ニューヨーク社（Springer-Verlag New York, Inc）、１９９８年参照）。

「非ペプチドアナログ」という用語は、参照ポリペプチドの特性に類似した特性を有する化合物を意味する。非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」と呼ばれることもある。例えば、Ｊｏｎｅｓ、アミノ酸およびペプチドの合成（Amino Acid and Peptide Synthesis）、オクスフォード大学プレス社（Oxford University Press）（１９９２年）；Ｊｕｎｇ、ペプチドおよび非ペプチドのコンビナトリアルライブラリー：ハンドブック（Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook）、ジョン・ワイリー社（John Wiley）（１９９７）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、ペプチド化学−実用教科書（Peptide Chemistry--A Practical Textbook）、シュプリンガー・フェアラーク社（Springer Verlag）（１９９３）；合成ペプチド：ユーザーガイド（Synthetic Peptides: A Users Guide）（Ｇｒａｎｔら、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（W. H. Freeman and Co）、1992）；Evans et al., J. Med. Client. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, Trends Neurosci., 8:392-396 (1985)；および上記のそれぞれで引用されている文献を参照のこと。これらは参照されて本明細書に組み込まれる。このような化合物はしばしばコンピューター化分子モデリングによって開発される。本発明に係る有用ペプチドに構造的に類似したペプチド模倣体を用いて同等の効果を得ることができるために、それらも本発明の一部と想定されている。

アミノ酸置換は、以下のものを含み得る。（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成する結合アフィニティーを変えるもの、（４）結合アフィニティーまたは酵素活性を変えるもの、および（５）このようなアナログの他の生理化学的または機能的な特性を付与するか、変更するもの。

本明細書において、２０の通常のアミノ酸およびその略記法は通常の用法に従う。免疫学−合成（Immunology- A Synthesis）（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編、シナウアーアソシエイツ社（Sinauer Associates）、マサチューセッツ州サンダーランド（Sunderland, Mass.）、第２版、１９９１）参照。これは参照されて本明細書に組み込まれる。これら２０の通常型アミノ酸の立方異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然型アミノ酸、例えば、α−，α−２置換アミノ酸など、Ｎ−アルキルアミノ酸、およびその他の非通常型アミノ酸も、本発明のポリペプチドにとって適当な成分であり得る。非通常型アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、およびその他の類似アミノ酸ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）などである。本明細書において使用するポリペプチド表示法では、標準的な用法および慣例に従って、左側の末端はアミノ末端に対応し、右側の末端はカルボキシ末端に対応している。

タンパク質は、このタンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有するならば、第２のタンパク質と「相同性」を有するか、「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が「類似」のアミノ酸配列を有していれば、タンパク質は第２のタンパク質と相同性を有する。（このように、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が「類似」したアミノ酸配列を有することを意味するものと定義されている。）好適な実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも６５％の配列相同性を示すものであり、より好ましいのは、少なくとも７０％の配列相同性を示すものである。さらに好ましいのは、野生型タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％の配列相同性を示すものである。さらに好ましい実施形態において、相同タンパク質は、少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．９％の配列相同性を示す。本明細書において使用される場合、アミノ酸配列の２つの領域間の相同性は（特に、予測される構造上の類似点に関して）、機能の類似性を示すものと解釈される。

タンパク質またはペプチドに関して「相同な」が用いられる場合、同一でない残基部位はしばしば保存的アミノ酸置換によって異なると認められる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）をもつ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えるものではない。２又はそれ以上のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換によって互いに異なる場合、配列同一性の割合すなわち相同性の程度を上方に調節して、置換の保存的性質を補正することができる。この調節を行う手段は当業者に周知のものである。例えば、Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 and 25:365-89を参照（この文献は参照されて本明細書に組み込まれる）。

以下の６つの基はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

ポリペプチドの配列同一性は、配列一致率とも呼ばれるが、一般的には配列解析ソフトウエアを用いて測定する。例えば、ジェネティックコンピュータグループ（ＧＣＧ）の配列解析ソフトウエアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ウィスコンシン州５３７０５マディソン、ユニバーシィティーアベニュー９１０番地（the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 5370）参照。タンパク質解析ソフトウエアは、さまざまな置換、欠失、および、その他の変更、例えば、保存的アミノ酸置換などに割り当てられた相同性の尺度を用いて、類似配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、初期パラメーターで使用して、密接な関係にあるポリペプチド、例えば、さまざまな生物種由来の相同ポリペプチドの間の、または野性型タンパク質とそのムテインの間の配列相同性または配列同一性を決定することができるプログラム、例えば「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」を含む。例えば、ＧＣＧバージョン ６．１参照。

特定のポリペプチド配列を、さまざまな生物に由来する多数の配列を含むデータベースと比較する際に好適なアルゴリズムはＢＬＡＳＴコンピュータープログラムである（Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al, Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ(Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。

ＢＬＡＳＴｐにとって好適なパラメーターは：期待値：１０（初期値）、フィルター：ｓｅｇ（初期値）、ギャップを開くコスト：１１（初期値）、ギャップを広げるコスト：１（初期値）、アラインメント：１００（初期値）、ワードサイズ：１１（初期値）、記述数：１００（初期値）、ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。

相同性を比較するポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基であり、好ましくは約３５残基よりも長い。多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する際、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を用いたデータベース検索は、当技術分野において周知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムで測定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１に含まれるプログラムであるＦＡＳＴＡを用いて、ポリペプチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列の間で最適に重複する領域のアラインメントと配列一致率とを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)参照（この文献は、参照して本明細書に組み込まれる）。例えば、アミノ酸配列間の配列一致率は、ＧＣＧバージョン６．１で提供されているように、ＦＡＳＴＡをその初期パラメーター（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアマトリクス）で用いて決定することができる。この文献は参照して本明細書に組み込まれる。

「特異的結合」は、２つの分子が環境内の別の分子に結合するよりも、互いに結合しようとする能力を意味する。典型的には、「特異的結合」は、ある反応における偶発的な結合から少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍差をつけて区別できる。典型的には、特異的結合反応のアフィニティーまたはアビディティーは約１０^-7Ｍ以上（例えば、約１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ、またはそれ以上）である。

本明細書において使用される「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合には、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって画定される。

本明細書において使用される「ドメイン」という用語は、生体分子の公知の機能、または推測される機能に寄与する生体分子の構造を意味する。ドメインは、その領域または一部と同一の範囲を有することができ、また、ドメインは、生体分子の別個の非連続領域を含むこともできる。

本明細書において使用される「分子」という用語は、任意の化合物、例えば低分子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などであるが、これらに限定されず、また、このような化合物は天然のものでも、合成されたものでもよい。

本明細書において使用される「含む（comprise）」という用語、または、その変形である、例えば、「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」は、規定された整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を除くことを意味するものではないと理解されるであろう。

本明細書において使用される「から本質的になる」という用語は、規定された整数または整数群を含むが、規定された整数に本質的に影響を与えるか、それを変えるような変更または他の整数を除く意味であると理解されるべきである。Ｎ−グリカンの分子種に関して、規定されたＮ−グリカン「から本質的になる」という用語は、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接連結したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）において、Ｎ−グリカンがフコシル化しているか否かにかかわらず、Ｎ−グリカンを含むと理解されるべきである。

本明細書において、「主に」という用語、またはその変化形、例えば「主要な」または「主要である」は、糖タンパク質がＰＮＧアーゼにより処理されて、質量分析法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって解析されたグリカンを放出後、全Ｎ−グリカンのモルパーセント（％）が最も高いグリカン種を意味すると理解されるべきである。すなわち、「主に」という語句は、個々の存在物、例えば特定のグリコフォームが、他の個々の存在物よりも大きいモルパーセントで存在していることと定義される。例えば、ある組成物が、４０％モルパーセントの分子種Ａ、３５％モルパーセントの分子種Ｂ、および２５％モルパーセントの分子種Ｃからなっている場合、この組成物は主に分子種Ａを含み、分子種Ｂは２番目に最も主な分子種であろう。

本明細書において、特定の糖残基、例えばフコース、またはガラクトースなど「を本質的に含まない」という用語は、その糖タンパク質組成物が、このような残基を含むＮ−グリカンを実質的に欠いていることを示す。純度に関して表現される場合、「本質的に含まない」とは、このような糖残基を含むＮ−グリカン構造体の量が、重量パーセントまたはモルパーセントで、１０％を超えず、好ましくは５％よりも少なく、より好ましくは１％よりも少なく、最も好ましくは０．５％よりも少ないことを意味する。従って、本発明に係る糖タンパク質組成物中のＮ−グリカン構造体の実質的に全てが、フコースを含まないか、ガラクトースを含まないか、あるいは両者を含まないかである。

本明細書において、いずれの時点でもＮ−グリカン構造上に特定の糖残基、例えばフコースまたはガラクトースが検出可能な量存在しない場合に、糖タンパク質組成物が、これらの糖残基を「欠く」または「欠いている」と言う。例えば、好適な実施形態において、糖タンパク質組成物は、上記したような下等真核生物、例えば、酵母菌［例えば、ピキア種(Pichia sp.)、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)］によって産生されるが、これらの生物の細胞はフコシル化Ｎ−グリカン構造体を産生するのに必要な酵素を持たないため、「フコースを欠く」。従って、「フコースを本質的に含まない」という用語は「フコースを欠く」と言う用語を包含する。しかし、ある組成物が、一時フコシル化Ｎ−グリカン構造体を含んでいたか、上記したように、限定的ではあるが検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造体を含んでいても、その組成物は「フコースを本質的に含まない」ということができる。

本明細書で使用される「結合活性の増加」という語句は、「結合アフィニティーの増加」と同義的に使用され、ＩｇＧ分子とレセプターまたは別段に記載された分子との結合の増加を意味する。

本明細書で使用される「結合活性の低下」という語句は、「結合アフィニティーの低下」と同義的に使用され、ＩｇＧ分子とレセプターまたは別段に記載された分子との結合の低下を意味する。

本明細書で使用される「ファゴサイトーシス」という語句は、免疫複合体を除去することと定義される。ファゴサイトーシスは、免疫細胞、例えばマクロファージおよび好中球であるが、これらに限定されない免疫細胞の免疫学的活性である。

抗体および抗体抗原複合体の免疫系細胞との相互作用、およびさまざまな反応、例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体の除去（ファゴサイトーシス）、Ｂ細胞による抗体産生、ならびにＩｇＧ血清半減期などは、それぞれ以下に定義されている：Daeron et al, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol. 2:77-94; Cox and Greenberg, 2001, Semin. Immunol. 13: 339-345; Heyman, 2003, Immunol. Lett. 88:157-161; and Ravetch, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 121-125。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味と同一の意味を有する。例示的な方法および材料を以下で説明するが、本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料も、本発明を実施する際に使用することができ、それらは、当業者には明白である。本明細書に記載されているすべての刊行物およびその他の参考文献は、それら全体が参照されて本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含み本明細書の記載が優先する。材料、方法、および例は単に説明のためのものであり、限定するものではない。

組換えＩｇ−ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ 分子
本発明は、主なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ結合型グリコフォームをもつグリコシル化Ｉｇ集団を含む組成物を提供する。また、本発明は、抗体のエフェクター機能、例えばレセプター結合を媒介する主なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ結合型グリコフォームをもつＩｇおよびＩｇ組成物も提供する。好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩＩレセプターとの相互作用が、直接結合活性の増加をもたらす。そして、好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩｂレセプターとの相互作用が、直接結合活性の低下（または欠乏）をもたらす。別の実施形態において、本発明のＩｇまたはＩｇ組成物は、グリコフォーム構造の増加／優勢によって付与される結合活性の増加を示す。本発明の顕著な特徴は、抗体のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ活性の上昇、またはＢ細胞による抗体産生の増加などを媒介する主要な特異的グリコフォームをもつＩｇおよびＩｇ組成物を提供することである。別の実施形態において、本発明のＩｇおよびＩｇ組成物は、グリコフォーム構造の増加／優勢によって付与される、ＡＤＣＣ活性の上昇、またはＢ細胞による抗体産生の増加を示す。さらに、主要なグリコフォームを有するＩｇ組成物を作製する利点は、望ましくないグリコフォームをもつＩｇの産生、および／または、望ましくない効果を誘発し、および／またはより効果的なＩｇグリコフォームの濃度を低下させ得る不均質なＩｇ混合物の産生を避けることにあることは、当業者には容易に分かることであろう。従って、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリコフォームをもつＩｇを含む医薬組成物は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合低下、およびＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇などであるが、これらに限定されない有益な特徴を有し、また、それゆえ、低用量で効果があるため、より高い効率／効能をもち得る。

一つの実施形態において、本発明のＩｇ分子は、Ｉｇ分子における抗体エフェクター機能を媒介するＦｃ領域上にある重鎖のＣ_H２ドメインのＡｓｎ−２９７に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を含む。好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造は、ダイマーになったＩｇの各ＣＨ２領域の各Ａｓｎ−２９７上にある（図１）。別の実施形態において、本発明は、本質的にＡｓｎ−２９７のＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造からなるＮ−グリカンによって主にグリコシル化されているＩｇを含む組成物を提供する（図１）。あるいは、Ｉｇ分子上に存在する１又はそれ以上の炭水化物成分を欠失したり、および／またはその分子に付加することができ、それによって、Ｉｇ上のグリコシル化部位の数を増やしたり削除したりすることができる。さらに、Ｉｇ分子のＣ_H２領域内にあるＮ結合型グリコシル化部位の位置は、分子内のさまざまな位置にアスパラギン（Ａｓｎ）またはＮ−グリコシル化部位を導入することによって変えることができる。Ａｓｎ−２９７は、典型的には、マウスおよびヒトのＩｇＧ分子に見られるＮ−グリコシル化部位である(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest), 1991)が、この部位が、想定できる唯一の部位ではなく、また、この部位が、必ずしも機能のために維持されなければならないということでもない。公知の変異誘発法を用いて、当業者は、本発明のＩｇをコードするＤＮＡ分子を改変して、Ａｓｎ−２９７のグリコシル化部位を欠失させ、さらには、ＤＮＡ分子を改変して、Ｉｇ分子内の別の位置にＮ−グリコシル化部位を作出することができる。Ｉｇ分子のＣ_H２領域内にＮ−グリコシル化部位を作出するのが好適である。しかし、ＩｇのＦａｂ領域のグリコシル化が３０％の血清抗体で、一般的にはＡｓｎ−７５で見られると記載されている(Rademacher et al, 1986, Biochem. Soc. Symp., 51: 131-148)。Ｉｇ分子のＦａｂ領域におけるグリコシル化は、Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシル化とともに、または単独で起こり得る付加的な部位である。

一つの実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。好適な実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約１０モルパーセントから約２５モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。より好適な実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約２５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する組成物を提供する。好適な実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約５０モルパーセントよりも多いレベルで存在する組成物を提供する。別の好適な実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約７５モルパーセントよりも多いレベルで存在する組成物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物であって、該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、その組換えＩｇ組成物の２番目に主要なグリカン構造よりも少なくとも約９０モルパーセントよりも多いレベルで存在する組成物を提供する。主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造（８９．７％）を有するＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図３に示す。

Ｉｇ−ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ のＦｃγＲＩＩＩへの結合増加
ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに結合するＩｇのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣの活性化は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。さまざまな機能が、この領域のさまざまなドメインによって媒介される。従って、本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実行することのできる主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子および組成物を提供する。一つの実施形態において、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａ（図６）レセプターおよびＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）レセプターへの結合の増加をもたらす。別の実施形態において、Ｆｃは主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9: 195-200）、Ｆｃ融合タンパク質、および抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者にとって容易に分かることである。

Ｉｇ分子のＦｃレセプターへの結合活性（アフィニティー）を測定法によって決定することができる。ＩｇＧによるＦｃγＲＩＩＩ結合測定法の例が実施例６に記載されている。当業者は、この測定法があらゆるイムノグロブリン分子の測定法とともに使用できるよう簡単に適合させ得ることを認識している。

主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明に従って作製されたＩｇ）は、図４および図５に示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に比べ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａへの結合活性が５から１００倍高くなっている。

非常に興味深いことに、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の二形性は２つのアロタイプ、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆを形成する（Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res. 64: 4664-4669）。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖについてホモ接合の遺伝子型は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に対する高い臨床反応と関連する（Cartron et al., 2002, Blood, 99: 754-758）。しかし、ほとんどの集団は、１つのＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆアリルを持っており、それによって、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）は、ほとんどの集団に対し、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してＡＤＣＣを誘導する効果が低くなっている。ただし、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）様抗ＣＤ２０抗体が、フコシルトランスフェラーゼ活性を持たない宿主細胞で発現されると、この抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖのどちらを介するＡＤＣＣも促進するのに等しく有効である。（Niwa et al., 2004, Clin. Canc Res. 10: 6248-6255）。本発明の一定の好適な実施形態の抗体は、Ｎ−グリカンにフコースを付加しない宿主細胞（例えば、Ｐ．パストリス、すなわちフコースを欠乏した酵母菌宿主；実施例１、２参照）で発現される。従って、フコースを含まず、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆに対する結合を向上させている本発明の抗体は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に対する臨床反応の低下を示している多くの患者を治療するのに特に有用であろう。

Ｉｇ−ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ のＦｃγＲＩＩｂレセプターへの結合低下
ＦｃγＲＩＩｂに結合するＩｇのエフェクター機能、例えばＢ細胞による抗体産生の増加、およびＡＤＣＣ活性の増加などは、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。さまざまな機能が、この領域のさまざまなドメインによって媒介される。従って、本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実行することができる主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子および組成物を提供する。一つの実施形態において、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対する結合の低下をもたらす。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr Opin. Immunol. 9: 195-200）、Ｆｃ融合タンパク質、および抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者にとって容易に分かることである。

Ｉｇ分子のＦｃレセプターへの結合活性（アフィニティー）を測定法によって決定することができる。ＩｇＧ１によるＦｃγＲＩＩｂ結合測定法の例が実施例６に開示されている。当業者は、この開示された測定法をあらゆるイムノグロブリン分子に関連して使用できるよう簡単に適合させ得ることを認識している。

主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明のＩｇ）は、図６に示すように、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）に比べ、ＦｃγＲＩＩｂへの結合活性が２〜３倍低くなっている。

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の増加
さらに別の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを主要なＮ−グリカンとして有するＩｇのＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の増加は、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性ＡＤＣＣの増加をもたらす。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）レセプターがＡＤＣＣ活性に関与することは十分に確認されている（Daeron et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234）。別の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を主要なＮ−グリカンとして有するＩｇのＦｃγＲＩＩｂへの結合の低下は、ＡＤＣＣの増加をもたらす（Clynes et al., 2000、前掲）。本発明のＩｇ分子は、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカンが存在することによって高いＡＤＣＣ活性を示す。

Ｂ細胞枯渇を測定するインビトロ測定法、および蛍光放出ＡＤＣＣ測定法の例が実施例７に開示されている。当業者は、これら開示された測定法を、任意のＩｇ分子に関する条件に簡単に適合させうることを承知している。さらに、動物モデルにおけるインビボＡＤＣＣ測定法を、Borchmann et al., 2003, Blood, 102: 3737-3742, Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133、および実施例７から、任意の特異的ＩｇＧに対して適合させることができる。

Ｂ細胞による抗体産生の増加
制御ＦｃγＲ経路を介した腫瘍に対する抗体の関与が明らかにされている（Clynes et al., 2000, Nature, 6: 443-446）。すなわち、ＦｃγＲＩＩｂが、免疫受容体活性型チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含むレセプター、例えば、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃεＲＩと共架橋すると、ＩＴＡＭ介在シグナルを阻害することが知られている（Vivier and Daeron, 1997, Immunol. Today, 18: 286-291）。例えば、ＦｃｇＲＩＩ特異的抗体を加えると、ＦｃｇＲＩＩＢに対するＦｃ結合が阻害され、増強されたＢ細胞増殖がもたらされる（Wagle et al., 1999, J of Immunol. 162: 2732-2740）。従って、一つの実施形態において、本発明のＩｇ分子は、ＦｃγＲＩＩｂレセプター結合の低下を媒介して、Ｂ細胞の活性化をもたらし、ひいては、形質細胞による抗体産生を触媒することができる（Parker, D.C. 1993, Annu. Rev. Immunol. 11 : 331-360）。Ｂ細胞により、ＩｇＧ１を用いて行われる抗体産生を測定する測定法の例を実施例６に記載する。当業者は、この測定法を、任意のイムノグロブリン分子を測定する方法とともに使用するために簡単に適合させ得ることを認識している。

その他の免疫学的活性
好中球におけるエフェクター細胞分子の改変された表面発現が、細菌感染に対する感受性を上昇させることが示されている（Ohsaka et al, 1997, Br. J. Haematol. 98: 108-113）。さらに、ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞レセプターへの結合が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現を制御することが明らかにされている（Blom et al., 2004, Arthritis Rheum., 48: 1002-1014）。さらには、Ｆｃγによって誘導されたＴＮＦ−αも、好中球がＩｇＧコートされた赤血球に結合してそれを貪食する能力を高める（Capsoni et al, 1991, J. Clin. Lab Immunol. 34: 115-124）。従って、ＦｃγＲＩＩＩへの結合の上昇を示す本発明のＩｇ分子および組成物は、ＴＮＦ−αの発現上昇をもたらすことができると考えられる。

ＦｃγＲＩＩＩレセプター活性が上昇すると、リソソームベータ−グルクロニダーゼ、およびその他のリソソーム酵素を上昇させることが示されている（Kavai et al., 1982, Adv. Exp Med. Biol. 141: 575-582; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol., 2: 77-94）。さらに、免疫レセプターが、それらのリガンドによって結合した後の重要な工程は、それらを内部移行させてリソソームに運搬することである（Bonnerot et al., 1998, EMBOJ., 17: 4906-4916）。従って、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の上昇を示す本発明のＩｇ分子および組成物は、リソソーム酵素の分泌の増加をもたらすことができると考えられる。

専ら好中球上だけに存在すると、ＦｃγＲＩＩＩｂは、免疫複合体の集合に主要な役割を果たし、また、それが凝集すると、オプソニン化された病原体の破壊をもたらすファゴサイトーシス、脱顆粒、および呼吸バーストを活性化させる。好中球の活性化は、タンパク質分解によって切断されたレセプターの可溶型であって、レセプターの２つの細胞外ドメインに対応するものの分泌をもたらす。可溶型ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＦｃγＲ依存性エフェクター機能の競合的阻害によって、そして、補体レセプターＣＲ３への結合を介して調節機能を発揮し、炎症性メディエーターの産生をもたらす（Sautes-Fridman et al., 2003, ASHI Quarterly, 148-151）。

このように、本発明は、本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを含むイムノグロブリン分子を提供し、イムノグロブリン、およびそれに結合した複数のＮ−グリカンを含む組成物であって、該複数のＮ−グリカン内の主要なＮ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる組成物を提供する。いずれの実施形態においても、イムノグロブリンにおける該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンの優勢が、好ましくは、本明細書に示すようなＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの結合の向上、およびＦｃγＲＩＩｂへの結合の低下に加えて、所望の治療エフェクター活性を付与する。

イムノグロブリンのサブクラス
ＩｇＧサブクラスは、Ｆｃレセプターに対するさまざまな結合アフィニティー（Huizinga et al., 1989, J. of Immunol, 142: 2359-2364）をもつことが示されている。各ＩｇＧサブクラスは、本発明のさまざまな態様において特別な利点を提供することができる。すなわち、一つの態様において、本発明は、ＩｇＧ１分子に結合した主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を含むＩｇＧ１組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＩｇＧ２分子に結合した主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を含むＩｇＧ２組成物を含む。さらに別の態様において、ＩｇＧ３分子に結合した主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を含むＩｇＧ３組成物を含む。別の態様において、本発明は、ＩｇＧ４分子に結合した主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を含むＩｇＧ４組成物を含む。

あるいは、本発明は、５つの主な種類のイムノグロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧのすべてに適用することが可能である。好適な本発明のイムノグロブリンは、ヒトＩｇＧであり、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のサブタイプの一つに由来するものである。より好ましくは、本発明のイムノグロブリンはＩｇＧ１分子である。

抗体のエフェクター機能および活性を媒介する組換えイムノグロブリン（Ｉｇ）の作製
一つの態様において、本発明は、本質的にＣ_H２ドメインのＡｓｎ−２９７にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造からなるＮ−グリカンを有する組換えＩｇ分子であって、抗体のエフェクター機能および活性を媒介するＩｇ分子を作製する方法、および、同じく、イムノグロブリンに結合した主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂であるイムノグロブリン組成物を提供する。一つの実施形態において、Ｉｇの重鎖および軽鎖を、重複オリゴヌクレオチドを用いて合成し、宿主細胞の中で発現させるために発現ベクター（実施例１）の中に別々にクローニングする。好適な実施形態において、組換えＩｇの重鎖および軽鎖を、主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂の付加を触媒する宿主株の中で発現させる。一つの実施形態において、このグリコフォーム構造は、より具体的に、ＩｇのＦｃ領域のアミノ酸Ａｓｎ−２９７の窒素と、ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン上のＮ−アセチル−β−１，４−Ｄ−グルコサミンのヒドロキシル基の間に結合を形成する［（ＧｌｃＮＡｃβｌ，２−Ｍａｎαｌ，３）（ＧｌｃＮＡｃβｌ，２−Ｍａｎαｌ，６）−Ｍａｎβｌ，４−ＧｌｃＮＡｃβｌ，４−ＧｌｃＮＡｃ］と表記される。さらに別の実施形態において、この主要なグリカンを、Ｉｇ分子内のさまざまな部位のアスパラギンに、または、Ｆａｂ領域のＮ−グリコシル化部位と組み合わせて付加することができる。

主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ を有するＩｇの下等真核生物における産生
本発明の一つの態様は、自然にグリコフォームを低収率で産生する哺乳動物細胞で発現された糖タンパク質の組成物よりも優れている該ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリコフォームを主にもつイムノグロブリンまたは抗体分子を産生するために使用することができる組換え下等真核生物宿主細胞を提供する。

糖タンパク質の組成物が、容易に再現可能な所定のグリコシル化パターンで提供されることが、本発明のもう一つの利点である。このような組成物の特性を測定し、所望の特性となるよう最適化する一方で、有害な作用を最小化するか完全に回避することができる。

また、本発明は、本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなるＮ−グリカンを含むＩｇ分子、およびＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造をもつＩｇ組成物を産生するために１又はそれ以上の核酸を発現するよう改造または選択された組換え宿主細胞を作製する方法も提供する。本発明の一定の実施形態において、組換え宿主細胞は、好ましくは組換え下等真核生物宿主細胞を用いて、主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカンをもつ該Ｉｇ分子および組成物を産生する。

他の好適な実施形態において、本発明は、組換え宿主細胞から、または本発明の方法によって得ることができる糖タンパク質を含む。

本発明の宿主細胞は、所望のＩｇ領域をコードするベクターで、および、１又はそれ以上の本明細書記載のグリコシル化関連酵素で形質転換して、その後、主要なＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを有する組換えＩｇ分子または組成物の発現を選択することができる。本発明の組換え宿主細胞は、真核生物または原核生物の宿主細胞、例えば、動物、植物、昆虫、細菌などの細胞であって、主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造を有するＩｇ組成物を産生するよう改造または選択された宿主細胞でもよい。

好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、当技術分野において既述されている（WO 02/00879、WO 03/056914、WO 04/074498、WO 04/074499、Choi et al, 2003, PNAS, 100: 5022-5027；Hamilton et al, 2003, Nature, 301: 1244-1246、およびBobrowicz et al, 2004, Glycobiology, 14: 757-766）ように遺伝子操作された下等真核生物宿主細胞である。具体的には、国際公開公報番号ＷＯ ０２／００８７９は、下等真核生物宿主において特にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造をもつ糖タンパク質を発現させるための教示内容を開示している。すなわち、ＷＯ ０３／０５６９１４は、糖タンパク質上に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン構造を得るための方法（図２２）を開示し、また、図３０、３１、および第２０７〜２１１段落でイムノグロブリンを開示している。

本発明の一つの実施形態において、ＩｇＧ１をコードするベクター、例えば、ＪＣ−ＩｇＧを含むＡＯＸｌ／ｐＰＩＣＺＡベクター（実施例１）を、酵母Ｐ．パストリスＹＡＳ３０９菌株に導入する。このＹＡＳ３０９菌株は、Ｋ３レポータータンパク質が除去されたＹＳＨ４４菌株に類似しており(Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-1246)、しかも、既述されているように（米国特許出願第１１／０２０８０８号）破壊されたＰＯＮ１遺伝子とＭＮＮ４ｂ遺伝子、および既述されているようにして（米国特許出願第１１／１０８０８８号）導入されたβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をもつ。Δｐｎｏ１Δｍｎｎ４ｂという二重破壊は、マンノシルリン酸化(mannosylphosphorylation)の消失をもたらす。ＵＲＡ５遺伝子に隣接するＹＳＨ４４(Hamilton et al., 2003)について記載されているようにして導入されたマンノシダーゼＩＩ遺伝子は、菌株を５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）上で増殖させることによってノックアウトした（Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 169, Academic Press, San Diego）。そして、マンノシダーゼＩＩ活性をＡＭＲ２遺伝子座に再導入し、その結果、マンノシダーゼＩＩ活性が再導入され、ＡＭＲ２遺伝子が喪失し、それによって、既述のとおりβ−マンノシル化を消失させた（米国特許出願第１１／１１８００８号）。このＹＡＳ３０９菌株由来の糖タンパク質は、主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンをもち、さらにβ−ガラクトシダーゼ処理によって（実施例３）、ＪＣ−ＩｇＧ上のＮ−グリカンは８９．７％のＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を有する（実施例３）。

あるいは、当技術分野において知られているいくつかの方法を用いて、本発明の抗体を発現させることができる(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)。

主にＧｌｃＮＡｃ ₂ Ｍａｎ ₃ ＧｌｃＮＡｃ ₂ を有するＩｇのΔａｌｇ３酵母宿主における産生
あるいは、本発明のイムノグロブリンを、インビボでＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを合成する下等真核生物宿主の中で発現させることができる。このような宿主を、既述した（ＷＯ０３／０５６９１４）ようにΔａｌｇ３変異体であって、既述したようにして（前掲）導入されたα−１，２マンノシダーゼ遺伝子、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ遺伝子、α−マンノシダーゼＩＩ遺伝子、およびＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ遺伝子をもつ変異体に改造することができるであろう。このような宿主に導入されたイムノグロブリンは、インビボ法によって、主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカンを発現する。

下等真核生物におけるグリコシルトランスフェラーゼの発現および安定した遺伝子組み込み
下等真核生物宿主株（例えばＰ．パストリス）において、選択マーカー、例えば、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ、またはＳＨ ＢＬＡを用いて異種遺伝子を導入し、その組み込みを確認する方法が記載されている。そのような方法は、発現系が下等真核生物で産生される場合には、本発明のＩｇを産生するのに合わせて変えることができる。さらに、ＵＲＡ３マーカーを反復して用いて不要なマンノシルトランスフェラーゼ活性を除去できるようにする方法が記載されいる。Alani et al., 1987, Genetics, 116: 541-545および米国特許第６，０５１，４１９号には、Ｐ．パストリスのＵＲＡ３遺伝子を破壊することに基づく選抜系が記載されている。好ましくは、ＰｐＵＲＡ３−またはＰｐＵＲＡ５−ブラスターカセット（blaster cassette）を用いて、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、またはウラシル生合成経路の任意の遺伝子を破壊して、ウラシルに対する栄養要求性、および５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）（Boeke, et al, 1984, Mol. Gen. Genet, 197: 345-346）に基づいた陽性選抜および陰性選抜の両方が可能になる。従って、当業者は、このようなシステムによって、選抜および逆選抜による複数の異種遺伝子の挿入が可能になることを認識している。

さらなる酵素修飾
さらなる酵素欠失が、ヒトで異常な免疫原活性を付与する可能性のあるマンノシルホスホリレーション（mannosylphosphorylation）またはβ-マンノシル化を含まないＩｇを単離するために有益または必要であり得る。既述したとおり、米国特許出願第１１／０２０８０８号は、マンノシルホスホリレーションを消失させる方法を開示しており、米国特許出願第１１／１１８００８号は、β−マンノシル化を失わせる方法を開示している。

主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ グリカン構造をもつＩｇの別のタンパク質発現系における産生
主要なグリカン構造をもつＩｇを発現させるために改造を必要とするか、またはそれを必要としない異種タンパク質を発現させるために発現宿主系（生物）が選択されることが、当業者には理解されている。本明細書に記載されている実施例は、Ａｓｎ−２９７または別のＮ−グリコシル化部位、またはその両方に特定のグリカンをもつＩｇの発現を実施する一方法の例である。当業者は、これらの発明の詳細および実施例の記載を、容易に任意のタンパク質発現宿主系（生物）に適合させることができる。

その他のタンパク質発現宿主系、例えば動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞などを用いて、本発明に係るＩｇ分子および組成物を作出することができる。このようなタンパク質発現宿主系を改造または選択して、主要なグリコフォームを発現させることができ、あるいは、自然に主要なグリカン構造を有する糖タンパク質を産生させることができる。主要なグリコフォームを有する糖タンパク質を産生する改造されたタンパク質発現宿主系の例は、遺伝子ノックアウト／変異（Shields et al, 2002, JBC, 277: 26733-26740）；における遺伝子操作（Umana et al, 1999, Nature Biotech., 17: 176-180）、または両者を併用する系などである。あるいは、特定の細胞は、主要なグリコフォームを自然に発現する。例えば、ニワトリ、ヒト、およびウシである（Raju et al, 2000, Glycobiology, 10: 477-486）。従って、本発明に従った主に特定の１つのグリカン構造をもつＩｇ糖タンパク質または組成物の発現を、多くの発現宿主系の少なくとも１つを選択することによって、当業者により得ることができる。さらに、当技術分野に存在する糖タンパク質を産生させるための発現宿主系は、ＣＨＯ細胞：Ｒａｊｕ ＷＯ９９２２７６４Ａ１およびＰｒｅｓｔａ ＷＯ０３／０３５８３５Ａ１；ハイブリドーマ細胞：Trebak et al, 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70；昆虫細胞：Hsu et al, 1997, JBC, 272:9062-970、および植物細胞：Gerngross et al, WO04/074499A2などである。

ＩｇＧの精製
抗体を精製および単離する方法は公知であり、当技術分野において開示されている。例えば、Kohler & Milstein, (1975) Nature 256:495；Brodeur et al, モノクローナル抗体産生の技術および応用（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications）、ｐｐ．５１−６３、マーセル・デッカー社（Marcel Dekker, Inc）、New York, 1987)；Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理と実用（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）ｐｐ．５９−１０４（アカデミックプレス社（Academic Press）、1986）； and Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:2551-255 and Jakobovits et al, (1993) Nature 362:255-258を参照。さらなる実施形態において、抗体または抗体断片を、McCafferty et al (1990) Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を用いて作製した抗体ファージライブラリーから、適当な抗体または抗体断片を選択するために目的の抗原を用いて単離することができる。

本発明の方法に従って産生された組換えＩｇ分子は、実施例３に概略された方法に従って精製することができる。図２は、ＹＡＳ３０９から精製されたＪＣ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲルを示している。一つの実施形態において、精製されたＩｇ抗体は、主要なＮ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を有する。グリカンの分析およびＩｇ分子上での分布を、当業者に公知のいくつかの質量分析法、例えばＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣＭＳ、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳであるが、これらに限定されない方法で決定することができる。好適な実施形態において、実施例５に開示されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析法によってグリカン分布を決定する。図３は、ＹＡＳ３０９から精製され、β−ガラクトシダーゼで処理された（実施例３）ＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示している。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、全Ｎ−グリカンの約８９．７モル％がＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂であることを示している。

医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療因子としての抗体、およびその他さまざまな医薬上許容され得る成分を含む医薬組成物に取り込ませることができる。レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Science）、（第１５版、マックパブリシング社（Mack Publishing Company）、ペンシルバニア州イーストン（Easton）1980））参照。好適な形態は、所望の投与方法および治療用途に応じて変わる。また、組成物は、所望の処方に応じて、医薬上許容され得る非毒性の担体または希釈剤、すなわち、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を処方するために一般的に使用されている賦形剤と定義されるものも含むことが可能である。希釈剤は、組み合わせたものの生物学的活性に影響を与えないよう選択する。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。さらに、医薬的な組成物または処方剤は、その他の担体、アジュバント、または非毒性非治療性非免疫原性の安定剤などを含むこともできる。

非経口投与するための医薬組成物は、滅菌され、実質的に等張で、発熱物質を含まず、また、ＦＤＡまたは同様の組織のＧＭＰに従って調製される。抗体は、生理学的に許容される希釈剤に、滅菌液、例えば水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールでもよい医薬用担体とともに入った物質の溶液または懸濁液の注射用調剤として投与することができる。さらに、補助剤、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などを組成物に入れることもできる。医薬組成物のその他の成分は、石油、動物、植物、または合成に由来するもので、例えば、ピーナッツオイル、大豆油、および鉱油である。一般的には、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが好適な液体担体であり、特に、注射溶液として好適である。抗体は、活性成分の徐放が可能になるように処方することができる蓄積注射またはインプラント用製剤の形態にして投与することができる。一般的には、組成物は、溶液または懸濁液である注射液として調製されるが、注射の前に液体賦形剤で溶液とするか、または懸濁液とするのに適した固形のものを調製することも可能である。また、上記したように、調製剤を乳化するか、またはリポソームまたはマイクロ粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリド、または高いアジュバント効果を生じさせるコポリマーにカプセル封入することもできる。（Langer, Science 249, 1527 (1990), and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997) 参照）。

診断用製品
本発明の抗体は、さまざまな診断用キット、およびその他の診断用製品、例えばアレイに取り入れることもできる。しばしば抗体は、固相、例えばマイクロタイター皿に予め結合させて提供される。また、しばしばキットは、抗体結合を検出するための試薬、およびそのキットを使用するための指示を記載したラベルも含む。免疫測定法またはサンドイッチ測定法が、診断キットに好適な方法である（米国特許第４，３７６，１１０号、第４，４８６，５３０号、第５，９１４，２４１号、および第５，９６５，３７５号参照）。抗体アレイは、例えば米国特許第５，９２２，６１５号、第５，４５８，８５２号、第６，０１９，９４４号、および第６，１４３，５７６号に記載されている。

治療用途
本発明は、糖タンパク質上に特定のグリコフォームを主に含む糖タンパク質組成物を提供する。ヒトを含む哺乳動物に投与されると、新規の糖タンパク質組成物を含む医薬組成物が、好適な実施形態において、同じような一次構造をもつ他の糖タンパク質組成物と比べて優れたインビボ特性を有利に示すことが、本発明の特徴である。このため、本発明の新規な組成物は、糖タンパク質の医薬剤が使用中であればいつでも利用することができ、また、優れた特性、および製品ロット間、および全製品ロットにわたって高い均一性を有利に提供することができる。本発明の調製剤は、溶液に、単位投薬形態、例えば、経口投与用の錠剤およびカプセル剤に、また、懸濁液、軟膏などに取り込むことが可能である。

特定の態様において、本発明は、糖タンパク質医薬品用の剤、薬剤、または薬物のための新規組成物であって、その糖タンパク質がイムノグロブリン分子を含み、その組成物が糖タンパク質剤の特定のグリコフォームを主に含む新規組成物を提供する。本発明の特定の態様に従って、本明細書に記載されているＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造のＮ−結合型オリゴサッカライドを主にもつイムノグロブリン糖タンパク質を含む組成物が提供される。好適な態様において、糖タンパク質は抗体である、特にモノクローナル抗体であることが可能である。さらに、本発明は、本発明の組成物を製造するための方法および手段を提供する。

さらに、本発明は、本発明のグリコフォーム調製物を含む医薬組成物を含む。この組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物が水溶液である場合には、好ましくは、糖タンパク質は可溶性である。組成物が凍結乾燥粉末の場合には、好ましくは、この粉末を適当な溶媒で再構成することができる。

別の態様において、本発明は、病気の状態を治療する方法であって、それを必要としている哺乳動物に治療上有効な用量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を含む。グリコフォーム調製剤を、病気または疾患を治療する目的で使用することができる製品またはキットにして提供することが本発明のさらなる目的である。

主にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン有する本発明のＩｇ分子は、適応症、例えば癌、炎症性疾患、感染症、免疫疾患、自己免疫疾患、例えば特発性血小板減少性紫斑病、関節炎、全身性エリテマトーデス、および自己免疫性溶血性貧血などの適応症に多くの治療用途をもつ。

以下は、Ｉｇ糖タンパク質組成物の製造に関して、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例を制限的なものと解してはならず、実施例は、例示目的のためだけに含まれている。当業者は、本開示内容の数多くの変更および拡張、例えば最適化が可能であることを認識する。そのような変更および拡張は、本発明の一部と見なされる。

Ｐ．パストリス（P. pastoris）で発現させるためのＪＣ−ＩｇＧｌのクローニング
ＪＣ−ＩｇＧｌの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖は、マウスの可変領域とヒトの定常領域とからなっている。マウスの可変軽鎖は配列番号１（ジェンバンク＃ＡＦ０１３５７６）として、マウスの可変重鎖は配列番号２（ジェンバンク＃ＡＦ０１３５７７）として開示されている。重鎖および軽鎖の配列を、インテグレイティッド・ディーエヌエー・テクノロジーズ社（ＩＤＴ）から購入した重複オリゴヌクレオチドを用いて合成した。軽鎖については、１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号３〜１４）を購入し、ＰＣＲ反応でエクスタック（Extaq）（タカダ）を用いてアニールさせて、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＫｐｎＩ部位をもつ、６６０塩基対の軽鎖を作出した。そして、この軽鎖を、ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片として、ｐＰＩＣＺａベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。重鎖については、Ｆａｂ断片に相当する１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号１５〜２６）を購入し、エクスタックを用いてアニールさせて、６６０塩基対のＦａｂ断片を作出した。Ｆｃ断片は、同じようにオーバーラップＰＣＲ反応でアニールされた１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号２７〜３８）を用いて合成した。そして、この重鎖のＦａｂ断片およびＦｃ断片を、重鎖Ｆａｂ断片の５’末端に相当する５’ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号１５）、およびＦｃ断片の３’末端に相当する３’Ｋｐｎ１プライマー（配列番号３９）を用い、ｐＦＵターボ（Turbo）ポリメラーゼ（ストラタジーン社（Stratagene））を用いてアニールし、１，３３０塩基対の重鎖を作出した。プライマー中にコードされている５’ＥｃｏＲＩ部位および３’Ｋｐｎ１部位を用いて、重鎖をｐＰＩＣＺａベクターの中にクローニングした。組み込み遺伝子座として機能するＡＯＸ２プロモーターを、最終のｐＰＩＣＺａベクターの中にクローニングした。次に、ＡＯＸ１プロモーターを含むＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＢ１断片、ならびに、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来のＨＳＡ配列（配列番号４０）、トロンビン部位（配列番号４１）、およびＪＣ−ＩｇＧ軽鎖を含むＢｓｔＢ１−ＢａｍＨ１断片を、ＡＯＸ２／ｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。そして、ＡＯＸ１プロモーターを含む別のＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＢＩ断片、ならびに、ＨＳＡ配列、トロンビン部位、およびＪＣ−ＩｇＧ重鎖を含むＢｓｔＢ１−ＢａｍＨ１断片を、この同じｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この最終的なベクターは、ＡＯＸ２組み込み遺伝子座、ＨＡＳタグ付きＪＣ−ＩｇＧ軽鎖、およびＨＡＳタグ付きＪＣ−ＩｇＧ重鎖を含んだ。この発現カセットを、Ｐ．パストリス株のＡＯＸ２遺伝子座の中に、ゼオシン耐性について選択された形質転換体によって組み込んだ。

Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）／Ｒｉｔｕｘａn（登録商標）は、カリフォルニア州サンフランシスコ（San Francisco）にあるバイオジェン−ＩＤＥＣ／ジェネンテック社（Biogen-IDEC/Genentech）から購入した抗ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧ１である。

ＰＣＲ増幅。すべてのＰＣＲ反応についてエッペンドルフ（Eppendorf）マスター・サイクラーを用いた。ＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡ、１２５μＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼバッファー（タカラバイオ社（Takara Bio Inc.））、およびＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ、またはｐＦＵターボポリメラーゼバッファー（ストラタジーン社）およびｐＦＵターボポリメラーゼを含んでいた。ＤＮＡ断片を、最初に９７℃で２分間という変性工程を用い、９７℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で９０秒間を３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間の伸長工程によって増幅した。

ＰＣＲ試料をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡバンドを、キアゲン社（Qiagen）のゲル抽出キットを用いて抽出および精製した。すべてのＤＮＡ精製物を、１０ｍＭ トリス（Tris）、ｐＨ８．０で溶出したが、但し、最終ＰＣＲ（３つの断片すべての重複）だけは、脱イオンＨ₂Ｏで溶出した。

ＩｇＧ ｐＪＣ１４０ベクターのＰ．パストリス菌株ＹＡＳ３０９への形質転換。
酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍになるよう加えて、ｐＪＣ１４０のベクターＤＮＡを調製した。次に、１００％の氷冷エタノールを最終濃度が７０％となるようＤＮＡ試料に加えた。遠心分離（１２０００ｇｘ１０分）によってＤＮＡをペレット化し、７０％ 氷冷エタノールで２回洗浄する。ＤＮＡを乾燥させ、５０μｌの１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０に再懸濁する。形質転換させるべきＹＡＳ３０９の酵母培養（前掲）（Choi et al, 2003; Hamilton et al, 2003）を、少量の培養細胞をＢＭＧＹ（緩衝最小グリセロール：１００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ６．０；１．３４％ 酵母窒素ベース；４ｘ１０^-5％ ビオチン、１％ グリセロール）中でＯ．Ｄ．がほぼ２〜６になるまで増大させる。そして、これらの酵母細胞を、１Ｍ ソルビトールで３回洗浄し、約１〜２ｍｌの１Ｍ ソルビトールに再懸濁してエレクトロコンピテントにする。Ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ（１〜２μｇ）を１００μｌのコンピンテントな酵母と混合して、氷上に１０分間放置する。次に、以下のパラメータを用いて、ＢＴＸエレクトロセルマニピュレーター６００（Electrocell Manipulator 600）で酵母細胞をエレクトロポレーションする：１．５ｋＶ、１２９オーム、および２５μＦ。１ｍｌのＹＰＤＳ（１％ 酵母抽出物、２％ ペプトン、２％ デキストロース、１Ｍ ソルビトール）をエレクトロポレーションされた細胞に添加した。次に、形質転換された酵母を、ゼオシンを含む選択アガープレート上で平板培養した。

Ｐ．パストリスにおけるＩｇＧｌの培養条件。ｐＪＣ１４０で形質転換されたＹＡＳ３０９のシングルコロニーを、５０ｍｌのファルコン（Falcon）遠心分離用チューブに入れた１０ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％ 酵母抽出物、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）；１．３４％ 酵母窒素ベース；４ｘ１０^-5% ビオチン、および１％ グリセロールからなる）に植菌した。この培養液を、２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら４８時間インキュベートして、培養液を飽和させた。そして、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地を５００ｍｌのバッフル付きフラスコに加えた。次に、種培養を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地を含むバッフル付きフラスコに加えた。この培養液を、２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。フラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心分離用チューブにデカントして、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、グリセロールを含まない２０ｍｌのＢＭＧＹで１回洗浄した後、２０ｍｌのＢＭＧＹ（１％ グリセロールの代わりに１％ ＭｅＯＨを含むＢＭＧＹ）で穏やかに再懸濁した。懸濁細胞を２５０ｍｌのバッフル付きフラスコに移した。培養液を、２４℃／１７０〜１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。そして、フラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心分離用チューブにデカントして、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培養上清をＥＬＩＳＡで解析して、タンパク質を単離する前におよその抗体力価を測定した。培養上清中の抗体の定量を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行った。すなわち、高結合マイクロタイタープレート（コースター社（Costar））を、２４μｇのヤギ抗ヒトＦａｂ（バイオカルタ社（Biocarta Inc.）、カリフォルニア州サンディエゴ）を１０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に入れたものでコートして、４℃で一晩インキュベートした。バッファーを除去し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ ＢＳＡ）を加えてから、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去し、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄を行った後、抗体培養上清の容量を増加させながら（０．４、０．８、１．５、３．２、６．２５、１２．５、２５、および５０μｌ）加えて、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ ツィーン（Tween）２０で洗浄した。最後の洗浄を行った後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰをＰＢＳ溶液で１：２０００にして加えた後、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートを、ＰＢＳ−ツィーン２０で４回洗浄した。ＴＭＢ基質キットを、製造業者（ピアースバイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology）の指示に従って使用して、プレートを解析した。

ＩｇＧｌの精製
モノクローナル抗体は、ストリームライン（Streamline）プロテインＡカラムを用いて、培養上清から取得した。抗体をトリス−グリシンｐＨ３．５で溶出し、１Ｍ トリスｐＨ８．０を用いて中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、さらなる精製を行った。具体的なＨＩＣカラムのタイプは、抗体に応じて決まる。ＪＣ−ＩｇＧには、フェニルセファロースカラム（またはオクチルセファロースでも使用可）を、２０ｍＭトリス （７．０）、１Ｍ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄バッファーとともに用いて、１Ｍから０Ｍの直線的濃度勾配バッファーによって溶出させた。フェニルセファロースカラムからの抗体画分をまとめ、カチオン交換（ＳＰセファロースファーストフロー（Fast Flow）（ＧＥ ヘルスケア社（GE Healthcare））カラムによって最終精製を行うために５０ｍＭ ＮａＯＡｃ／トリス ｐＨ５．２のバッファーに交換した。５０ｍＭトリス、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた直線的濃度勾配によって抗体を溶出した。

β−ガラクトシダーゼによるＪＣ−ＩｇＧの処理
５ｍｇの精製した ＩｇＧ ＪＣ−ＩｇＧを、５０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃ ｐＨ ５．０にバッファー交換した。シリコン処理したチューブ内で、０．０３Ｕβ−１，４ガラクトシダーゼ（EMDバイオサイエンス社（EMD Bioscience）、カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla））を、５０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃ ｐＨ５．０に入った精製ＩｇＧに加え、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。このサンプルを脱水して乾燥させ、水に再懸濁し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって解析した。そして、上記したようにフェニルセファロース精製法を用いて、抗体をβ−１，４ガラクトシダーゼから精製した。

精製されたＩｇの検出
精製したＪＣ−ＩｇＧを適当な容量のサンプルローディングバッファーに混ぜ、製造業者の指示に従って既製ゲル（ＮｕＰＡＧＥビス−トリス電気泳動装置；インビトロジェン社（Invitrogen Corporation）、カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad, Calif））によるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ゲル中のタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色法（バイオラド社（Bio-Rad）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Hercules））によって染色した。図２参照。

抗体濃度
タンパク質クロマトグラフィー画分の濃度を、アルブミンを標準として用いたブラッドフォードタンパク質分析法（Bradford, M. 1976, Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254）を用いて測定した。(Pierce, Rockford, IL)。

ＩｇＧｌの炭水化物分析
マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）。アスパラギン結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析：パパクら（Papac et al., Glycobiology 8, 445-454（1998））の方法を改変した方法を用いてＪＣ−ＩｇＧからＮ結合型グリカンを遊離させた。抗体のサンプルを還元しカルボキシメチル化し、また、膜をブロックし、ウェルを水で３回洗浄した。ＩｇＧタンパク質を１ｍＵのＮ−グリカナーゼ（ＥＭＤバイオサイエンス社、カリフォルニア州ラホヤ）を含む３０μｌの１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）を加えて脱グリコシル化した。３７℃で１６時間置いた後、グリカンを含む溶液を遠心分離で取り出し、脱水して乾燥させた。乾燥させたグリカンを各ウェルから１５μｌの水に溶解させて、０．５μｌをステンレス鋼製のプレートにスポットし、０．５μｌのＳ−ＤＨＢ基質（１：１水／アセトニトリル／０．１％ トリフルオロ酢酸中９ｍｇ／ｍｌのジヒドロキシ安息香酸／１ｍｇ／ｍｌの５−メトキシサリチル酸）と混合した後乾燥させた。パルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）を４−ｎｓのパルス時間で照射してイオンを発生させた。この機器を、１２５−ｎｓ遅延および２０ｋＶの加速電圧のディレイド・エクストラクション（delayed extraction）モードで操作した。格子電圧は９３．００％、ガイドワイアー電圧は０．１％、内部圧力は＜５×１０^-7トル（１トル＝１３３Ｐａ）、および低質量ゲートは８７５Ｄａであった。スペクトルを、全部で１００〜２００レーザーパルスから発生させ、５００ＭＨｚのデジタイザーで取得した。（Ｍａｎ）₅（ＧｌｃＮＡｃ）₂オリゴサッカライドを外部分子量標準として使用した。すべてのスペクトルを、装置を陽イオンモードにして発生させた。

抗原結合ＥＬＩＳＡ測定
高結合マイクロタイタープレート（コースター社）を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇの抗原でコートし、４℃で一晩インキュベートした。バッファーを除き、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ ＢＳＡ）を加えて室温で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去して、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。最後に洗浄した後、抗体の量を０．２ｎｇから１００ｎｇまで増加させながら加えて室温で１時間インキュベートした。そして、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ ツィーン２０で洗浄した。最後に洗浄した後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００の割合でＰＢＳ溶液に加えてから、室温で１時間インキュベートした。そして、プレートをＰＢＳ−ツィーン２０で４回洗浄した。ＴＭＢ基質キットを製造業者（ピアースバイオテクノロジー社）の指示に従って使用して、プレートを解析した。

Ｆｃレセプター結合測定
既述のプロトコール（Shields et al, 2001 , J.Biol. Cheｍ, 276: 6591-6604）に従ってＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂについてＦｃレセプター結合測定を行った。ＦｃγＲＩＩＩ結合には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩｂ（図４）とＦｃγＲＩＩｂ（図６）との融合タンパク質、または０．８μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ（図５）融合タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレート（ナルジェ−ヌンク社（Nalge-Nunc）イリノイ州ネーパービル（Naperville））に４℃で４８時間コートした。プレートを、ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって２５℃で１時間ブロックした。ＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧのダイマー複合体を、２：１モル量のＪＣ−ＩｇＧまたはＤＸ−ＩｇＧ、およびＨＲＰ結合のＦ（Ａｂ’）２抗Ｆ（Ａｂ’）２と２５℃で１時間混合してＰＢＳ中１％ ＢＳＡの中で調製した。そして、ダイマー複合体を１％のＢＳＡ／ＰＢＳ（１:２）で連続的に希釈して、２５℃で１時間、プレート上にコートした。使用した基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories）である。４５０ｎｍにおける吸光度を、製造業者の指示に従って読み取った。（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories）。

Ｂ細胞における抗体フィードバックのＥＬＩＳＰＯＴ測定
この測定法は、ウエストマンら（Westman, et al, 1997, Scand. J. Immunol. 46: 10-15）に記載されているように行われた。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を、まず、ＩｇＧ抗体に結合させて、ＢＳＡ−ＩｇＧ複合体とする。ＥＬＩＳＰＯＴ測定法を用いて、ＢＳＡ特異的ＩｇＧを分泌するＢ細胞の数を測定する。注射されたマウスから脾臓を取り出し、０．５％ 正常マウス血清入りのＤＭＥＭ（ギブコ社（Gibco）ニューヨーク（New York）で細胞懸濁液を調製した。１００マイクロリットルの細胞懸濁液を、ＢＳＡでコートしたマイクロタイタープレートに適用し（上記ＥＬＩＳＡプロトコール参照）、３７℃、５％ ＣＯ₂で３．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、４℃またはそれに近い値で、アルカリホスファターゼを結合したヒツジ抗マウスＩｇＧをＰＢＳ−ツィーン中１／１００に希釈した液５０μｌとインキュベートする。スポットを、５０μｌの５ブロモ−４−クロロ−３−インドイルリン酸（indoyl phosphate）（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich））中、室温で1時間発色させて、立体顕微鏡下で計測した。

Vugmeyster and Howell, 2004, Int. Immunopharm. 4: 1117-1124に記載された血液マトリクス研究法（blood matrix study）（例えばＢ細胞枯渇）を用いて測定されたＡＤＣＣについて。血漿および赤血球（ＲＢＣ）を除去した全血を染色用バッファー（１％ ＢＳＡおよび０．１％ アジ化ナトリウム入りのハンクス液（Hank's balanced salt solution）（ＨＢＳＳ））中で再構成して、染色用バッファーの白血球懸濁液とする。そして、全血サンプルを１０００ｇで５分間スピンして上清（血漿）を捨て、ペレットを塩化アンモニウム溶解（ＡＣＬ）試薬で処理し、洗浄し、等量の染色用バッファーで再懸濁する。Ｂ細胞枯渇測定法について： １０μｌの１００μｇ／ｍｌ抗体溶液または染色用バッファーを９０μｌのＳＢマトリクスに加え、３７℃で１時間インキュベートする。サンプルを直ちに抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４５−ＰＥにより２５℃で３０分間染色する。そして、サンプルを１％ ホルムアミドで固定し、３回反復する。Ｂ細胞枯渇の定量化はフローサイトメトリーによって得られる。Ｂ細胞枯渇のフローサイトメトリー解析：自動ＦＡＣＳローダーおよびセルクエスト（Cell Quest）ソフトウエアを装備したファックスキャリバー（FACS Calibur）（ＢＤバイオサイエンス社）装置を用いて、すべてのサンプルの取得および解析を行う。サイトメーターのＱＣおよび設定は、キャリブライト（CaliBrite）ビーズおよびスフェロテック（SpheroTech）レインボービーズ（BDバイオサイエンス社）を作動させて、装置の機能と検出装置の直線性を確認することを含む。アイソタイプ対照および代償対照（compensation controls）を各測定について測定して装置の設定を確認する。全白血球に占めるＢ細胞の割合を以下のゲーティング法によって得る。白血球集団を、前方散乱／側方散乱散布図上にマークして領域１（Ｒ１）を画定する。Ｒ１におけるイベントを用いて、ＣＤ１９およびＣＤ４５のマーカーについての蛍光強度ドットプロットを表示する。蛍光標識されたアイソタイプ対照を用いて、ＣＤ１９陽性およびＣＤ４５陽性について各々のカットオフ点を決定する。セルクエストを用いて、％Ｂを、Ｒ１領域におけるＣＤ１９陽性およびＣＤ４５陽性の表現型をもつ細胞画分として決定する。各処理群についてサンプルを３回反復して処理する。Ｂ細胞枯渇の割合を、［１００＊（１−対照抗体で処理されたＢの割合（％））］の平均値／［ＳＢで処理されたＢの割合（％）］の平均値という計算式を用いて計算する。蛍光色素放出ＡＤＣＣ測定法：ＰＢＭＣ単離法：健常な個体または血液ドナー（１０〜２０）からの抹消静脈血を集めて、ヘパリン化したバキュテナー（vacutainer）採血管に入れる（ベクトン・ディキンソン・バキュテナーシステムズ社（Becton Dickinson Vacutainer Systems）米国ニュージャージー州ラザフォード（Rutherford））。２匹のマウスに移植するのに約５ｍｌの血液が必要である。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、オプティプレップ（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）を製造業者の指示に従って使用する遠心分離によって分離する。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ／ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））に２０％ ウシ胎仔血清を加えたものからなる完全培養培地（ＣＭ）で１回洗浄してから、１×１０⁶ｍｌ ＣＭの濃度に再懸濁し、単球を枯渇させるために２５０ｍｌの培養フラスコ（ファルコン社（Falcon）、米国ニュージャージー州）に移す。３７℃および５％ ＣＯ₂内で１時間インキュベートした後、非接着細胞を回収し、培養培地で洗浄し、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を２．５×１０⁷ｍｌ ＣＭの濃度に調整する。蛍光色素放出ＡＤＣＣ：ＡＤＣＣ測定法の背後にある前提は、ＣＤ２０またはＣＤ４０の抗原提示標的細胞に結合する抗体（それぞれラジ（Ｒａｊｉ）細胞株またはＢＣＬｌ−３Ｂ３細胞）は、標的細胞が、エフェクター細胞上でＦｃγレセプターに結合するのを促進する。これは、次に、抗原を提示する標的細胞の溶解を促進して、定量可能な内部蛍光色素を放出させる。標的細胞を⁵¹Ｃｒ標識する代わりにアラマーブルー蛍光を用いる。５０μｌのＣＤ２０提示ラジ細胞懸濁液（１×１０⁴細胞）を、５０μｌ量の抗ＪＣ−ＩｇＧ ｍＡｂ（さまざまな濃度）、および上記した通りに単離した５０μｌ量のＰＢＭＣエフェクター細胞と、９６ウェル組織培養プレート内で混合し（エフェクター細胞対標的細胞の比率は１００：１、５０：１、２５：１、および１２．５：１とし得る）、３７温度および５％ ＣＯ₂内で４時間インキュベートして、ラジ細胞またはＢＣＬ１−３Ｂ３細胞の溶解を促進する。５０μｌのアラマーブルーを加え、さらに５時間インキュベートを続けて、色素が取り込まれ代謝されて蛍光状態となることができるようにする。プレートを振とう器上で室温まで冷却し、５３０ｎｍで励起、５９０ｎｍで消光してフルオロメーターで読み取る。ｍＡｂ濃度およびサンプル濃度に対してプロットした相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）を、対照用抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）を用いて標準曲線からコンピュータ計算する。重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）を用いたインビボＡＤＣＣ（Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133）：インビボでのＡＤＣＣ活性は、ヘテロ接合遺伝子型（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ）およびホモ接合遺伝子型（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶおよびＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ）を含む健常ドナーに由来するヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を移植されたマウスモデルを用いて測定することができる。このモデル系を用いて、主なＮ−グリカンをもつＩｇが、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）またはその他の対照用抗体と比較してＡＤＣＣ活性が促進されたかを測定する。このインビボＡＤＣＣ測定に関する詳細かつ十全なプロトコールは、ニワ（Niwa）ら、２００４年、前掲に記載されている。
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ＪＣ−ＩｇＧ１軽鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に相当するヌクレオチド配列をコードする（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＃ＡＦ０１３５７６）。
配列番号２は、ＪＣ−ＩｇＧ１重鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に相当するヌクレオチド配列をコードする（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＃ＡＦ０１３５７７）。
配列番号３から１４は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域をＰＣＲ合成するために使用した１２の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号１５から２６は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖のＦａｂ断片をＰＣＲ合成するために使用した１２の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号２７から３８は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖のＦｃ断片をＰＣＲ合成するために使用した１２の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号３９は、Ｆｃ断片の３’末端に対応する３’Ｋｐｎ１プライマーをコードする。
配列番号４０は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４１は、本発明において使用されたトロンビン切断のためのヌクレオチド配列をコードする。

ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造を有するＩｇＧの概略図。 ＹＡＳ３０９で発現され（実施例２に記載）、培養培地からプロテインＡカラム（レーン１）およびフェニルセファロースカラム（レーン２）で精製された（実施例３）ＪＣ−ＩｇＧのクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（タンパク質３．０μｇ／レーン。） ＹＡＳ３０９で発現され、β−ガラクトシダーゼで処理されたＪＣ−ＩｇＧの、８９．７モル％ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。 ＦｃγＲＩＩＩｂとＪＣ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂとのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｇ０＝ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン）。 ＦｃγＲＩＩＩａ−LＦとＪＣ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂとのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（Ｇ０＝ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン） ＦｃγＲＩＩｂとＪＣ−ＩｇＧおよびＲｉｔｕｘｉｍａｂとのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（Ｇ０＝ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂ Ｎ−グリカン）。

Claims (23)

1. 各イムノグロブリンが、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含む複数のイムノグロブリンを含む組成物であって、それによって、前記組成物が、主なＮ−グリカンが本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物。
2. 前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセントよりも多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセントよりも多くが、本質的にＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂グリカン構造が、複数のＮ−グリカンの２番目に最も主要なグリカン構造よりも約５０モルパーセントよりも多い量で存在する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記イムノグロブリンが、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに対し低下した結合アフィニティーを示す、請求項１に記載の組成物。
6. 前記イムノグロブリンが、ＦｃγＲＩＩＩレセプターに対し上昇した結合アフィニティーを示す、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ＦｃγＲＩＩＩレセプターがＦｃγＲＩＩＩａレセプターである、請求項７に記載の組成物。
8. 前記ＦｃγＲＩＩＩレセプターがＦｃγＲＩＩＩｂレセプターである、請求項７に記載の組成物。
9. 前記イムノグロブリンが、上昇した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す、請求項１に記載の組成物。
10. 前記イムノグロブリンが本質的にはフコースを含まない、請求項１に記載の組成物。
11. 前記イムノグロブリンがフコースを含まない、請求項１に記載の組成物。
12. 前記イムノグロブリンが、成長因子であるＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなるグループから選択される抗原に結合する、請求項１に記載の組成物。
13. 前記イムノグロブリンが、ＩｇＧ１領域、ＩｇＧ２領域、ＩｇＧ３領域、およびＩｇＧ４領域からなるグループから選択されるＦｃ領域を含む、請求項１に記載の組成物。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
15. 前記イムノグロブリンが本質的にはフコースを含まない、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記イムノグロブリンがフコースを含まない、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 前記イムノグロブリンが、成長因子であるＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなるグループから選択される抗原に結合する、請求項１４に記載の医薬組成物。
18. 前記イムノグロブリンが、ＩｇＧ１領域、ＩｇＧ２領域、ＩｇＧ３領域、およびＩｇＧ４領域からなるグループから選択されるＦｃ領域を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
19. 請求項１に記載の組成物を含むキット。
20. イムノグロブリンまたはその断片をコードする外来遺伝子を含む真核宿主細胞であって、前記イムノグロブリンまたはその断片を発現して、各イムノグロブリンが、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含む複数のイムノグロブリンを含み、それによって、主なＮ−グリカンが本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物を産生するように操作または選択された真核宿主細胞。
21. 宿主細胞が下等真核生物宿主細胞である、請求項２０載の宿主細胞。
22. 各イムノグロブリンが、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含む複数のイムノグロブリンを含み、それによって、主なＮ−グリカンが本質的に少なくとも７５モルパーセントのＧｌｃＮＡｃ₂Ｍａｎ₃ＧｌｃＮＡｃ₂からなる複数のＮ−グリカンを含む組成物を真核生物宿主において産生させる方法。
23. 宿主細胞が下等真核生物宿主細胞である、請求項２２記載の方法。

Images