JP2008512123A - Method and kit for isolating sperm cells - Google Patents
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Abstract
精子細胞を水性試料から分離するための方法及び精子細胞を水性試料から分離するためのキットが開示される。
【選択図】なしDisclosed are a method for separating sperm cells from an aqueous sample and a kit for separating sperm cells from an aqueous sample.
[Selection figure] None
Description
（序説）
法医学的試料から得られる遺伝物質は、性的暴行の犯人を確認するために又は罪のない容疑者を解放するために用いることができる。法医学的試料から分離した精子細胞から得られる精製されたDNAは、続いての遺伝子同一性試験において用いることができる。精子細胞DNAの遺伝子プロファイルは、既知の容疑者のそれと又は多数の有罪となった重罪犯人についての遺伝情報を有するデータベースと比較することができる。
性的暴行の場合においては、膣又は直腸をぬぐった綿棒又は精液のついた衣服が裁判分析のために犠牲者から得られる。精子細胞が試料に存在する場合には、精子細胞からDNAを分離するとともに遺伝子同一性試験に用いることができる。しかしながら、性的暴行の被害者から得られる膣をぬぐった綿棒は、典型的には、比較的少ない精子細胞と犠牲者由来の多数の上皮細胞とを含有する。結果として、精子細胞が試料中の他の細胞から最初に分離され、法医学的試料から精製されたDNAは上皮細胞DNAによる圧倒的夾雑を受けやすい。上皮細胞DNAによる夾雑は、試料からのDNA遺伝子プロファイルと容疑者又はデータベースの一人のそれとの間の一致を確立する能力を妨害する。それ故、DNA分離と分析の前に法医学的試料において他の細胞から精子細胞を分離することが望ましい。
法医学的試料において他の細胞から精子細胞を分離するために現在用いられている技術は、時間がかかると共に手間がかかり、現在処理されてない試料が滞っている。この滞っていることから、容疑者が確認されない限り、幾つかの管轄区域には試料の処理に対する方策がある。結論として、多くの処理されていない試料は最終的に捨てられ、試料に含まれる遺伝情報は決して全国的なデータベースと比較されず、それに入れられもせず、性犯罪常習者を確認し且つ逮捕する法的処置能力が低下する。
精子細胞は、典型的には、非還元条件下にプロテイナーゼＫと清浄剤で処理することにより上皮細胞を選択的に溶解させることによって、上皮細胞を含有する法医学的試料から分離される(Gill et al. 1985)。上皮細胞溶解後、無傷の精子細胞は遠心分離によって沈降し、溶解した上皮細胞からのDNAを含有する上清が除去される。可溶性上皮細胞DNAによる夾雑を最少にするために、可溶性上皮細胞DNAを除去する試みにおいて精子ペレットは水性緩衝液(aqueous buffer)で反復洗浄することに供される。この方法は、しばしば精子細胞の損失が生じる。
(Introduction)
Genetic material obtained from forensic samples can be used to identify perpetrators of sexual assault or to release innocent suspects. Purified DNA obtained from sperm cells isolated from forensic samples can be used in subsequent genetic identity tests. The genetic profile of sperm cell DNA can be compared to that of a known suspect or to a database having genetic information about a number of guilty felony criminals.
In the case of sexual assault, a swab or semeny clothing that wipes the vagina or rectum is obtained from the victim for court analysis. When sperm cells are present in the sample, DNA can be isolated from the sperm cells and used for genetic identity testing. However, vagina swabs obtained from victims of sexual assault typically contain relatively few sperm cells and a large number of epithelial cells from the victim. As a result, sperm cells are first isolated from other cells in the sample, and DNA purified from forensic samples is subject to overwhelming contamination by epithelial cell DNA. Contamination with epithelial cell DNA interferes with the ability to establish a match between the DNA gene profile from the sample and that of the suspect or one of the databases. It is therefore desirable to separate sperm cells from other cells in forensic samples prior to DNA separation and analysis.
The techniques currently used to separate sperm cells from other cells in forensic samples are time consuming and laborious, and currently unprocessed samples are stagnant. Because of this stagnation, some jurisdictions have strategies for sample processing unless a suspect is identified. In conclusion, many unprocessed samples are eventually discarded, and the genetic information contained in the samples is never compared to or entered into a national database, confirming and arresting sex crime addicts Legal capacity is reduced.
Sperm cells are typically separated from forensic samples containing epithelial cells by selectively lysing the epithelial cells by treatment with proteinase K and detergent under non-reducing conditions (Gill et al. al. 1985). After lysis of the epithelial cells, intact sperm cells are sedimented by centrifugation and the supernatant containing the DNA from the lysed epithelial cells is removed. To minimize contamination with soluble epithelial cell DNA, sperm pellets are subjected to repeated washing with an aqueous buffer in an attempt to remove soluble epithelial cell DNA. This method often results in loss of sperm cells.
精子細胞は、固体支持体(例えば、常磁性粒子)に取付けられた精子細胞特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体に精子細胞を選択的に結合することによって精子と上皮細胞双方を含有する試料から分離されてきた。細胞を固定化抗体に結合した後、支持体は結合していない細胞を除去するために洗浄される。この方法は、多量の抗体を必要とするので、相対的に費用がかかる。更にまた、精子細胞が洗浄工程の間に失われ、収量の低下が生じる。精子細胞が相対的にpＨの膣において構造的な変化を受けることから、多くの精子特異的抗体が全ての精液含有試料からの精子に結合するというわけではない。更に、ある種の個体において精子細胞表面抗原が変化又は突然変異することから抗体が効率的に結合することができず、精子細胞収量が不充分になってしまう。
精子細胞は、試料をサイズ選択的な膜にろ過させることによって細胞サイズの差に基づき上皮細胞から分離することができる。この方法は、精子細胞が上皮細胞の間で捕捉される傾向があり、精子細胞が膜を通過するにはあまりに大きい凝集塊を形成し、且つ膜が詰まる傾向があり、最終的に上皮細胞又は上皮細胞DNAによって夾雑された低収量の精子細胞を生じてしまうことから、問題がある。
他の方法においては、精子細胞は、最初に上皮細胞を選択的に溶解させ、その溶解物をろ過して可溶性上皮細胞DNAと無傷の精子細胞の分離を行うことによって、分離される。しかしながら、その方法は、膜が詰まること、精子細胞収量が少ないこと、上皮細胞DNAによる精子細胞の夾雑を含む不利な点が欠点である。
生殖医学の分野においては、費用がかかり、時間がかかり、且つ法医学的試料(例えば、綿棒又は衣服)から精子細胞と上皮細胞をどのように効果的に回収するかを言及していないことから、有効ではあるが法医学関連においては実用的でないセルソータを用いて新しい精液から精子細胞が分離されてきた。
従って、法医学的試料において上皮細胞から精子細胞を分離する簡易化された方法が本技術分野において求められている。
Sperm cells are separated from samples containing both sperm and epithelial cells by selectively binding sperm cells to a sperm cell-specific polyclonal or monoclonal antibody attached to a solid support (e.g., paramagnetic particles). It has been. After binding the cells to the immobilized antibody, the support is washed to remove unbound cells. This method is relatively expensive because it requires large amounts of antibody. Furthermore, sperm cells are lost during the washing process, resulting in a decrease in yield. Because sperm cells undergo structural changes in the relative pH vagina, many sperm-specific antibodies do not bind to sperm from all semen-containing samples. Furthermore, since sperm cell surface antigens change or mutate in certain individuals, antibodies cannot bind efficiently, resulting in insufficient sperm cell yield.
Sperm cells can be separated from epithelial cells based on cell size differences by filtering the sample through a size selective membrane. This method tends to cause sperm cells to be trapped between epithelial cells, sperm cells to form too large agglomerates to pass through the membrane, and tend to clog the membrane, eventually resulting in epithelial cells or This is problematic because it results in low yield sperm cells contaminated with epithelial cell DNA.
In other methods, sperm cells are separated by first selectively lysing the epithelial cells and filtering the lysate to separate soluble epithelial cell DNA from intact sperm cells. However, the method has disadvantages including membrane clogging, low sperm cell yield and sperm cell contamination by epithelial cell DNA.
In the field of reproductive medicine, it is expensive, time consuming, and does not mention how to effectively recover sperm cells and epithelial cells from forensic samples (e.g. cotton swabs or clothes), Sperm cells have been isolated from new semen using a cell sorter that is effective but not practical in the forensic field.
Accordingly, there is a need in the art for a simplified method of separating sperm cells from epithelial cells in forensic samples.
（発明の概要）
一態様においては、本発明は、水性試料(aqueous sample)から精子細胞を分離するための方法を提供する。水性試料を、約1.00g/cm3を超える密度を有し且つ前記試料中の精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい密度を有する非水性液(non-aqueous liquid)と接触させる。接触させた試料に水層、非水層及び精子細胞ペレットを形成するのに充分な時間、力を施す。
別の態様においては、本発明は、水性試料から精子細胞を単離するためのキットを提供する。本発明のキットには、約1.00g/cm3を超える密度を有し且つ試料において精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい密度を有する非水性液が含まれる。任意に、キットには、水性溶媒、プロテアーゼ、カオトロピック剤又は精子細胞を分離するためのプロトコールが含まれてもよい。
(Summary of Invention)
In one aspect, the present invention provides a method for separating sperm cells from an aqueous sample. Contacting an aqueous sample with a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3 and having a density small enough to pellet at least some of the sperm cells in the sample . A force is applied to the contacted sample for a time sufficient to form an aqueous layer, a non-aqueous layer, and a sperm cell pellet.
In another aspect, the present invention provides a kit for isolating sperm cells from an aqueous sample. The kit of the present invention includes a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3 and having a density small enough to pellet at least some of the sperm cells in the sample. Optionally, the kit may include an aqueous solvent, a protease, a chaotropic agent or a protocol for separating sperm cells.
（発明の詳細な説明）
性的暴行の被害者から得られる法医学的試料は、典型的には、多数の上皮細胞と、存在する場合には、比較的少ない精子を含有する。遺伝子同一性試験において続いて用いられる精子細胞からDNAを得るために、結果の解釈を妨害又は複雑にすることがある水溶性材料から精子細胞、特にDNAを単離することが必要である。例えば、溶解した上皮細胞由来のDNAは、水溶液に可溶性である。
簡潔に言うと、本発明の方法は、精子細胞及び水溶液に可溶な材料を含む水性試料を、水の密度より大きいが精子細胞の密度より小さい密度を有する非水性液と接触させること、並びに、精子細胞をペレット化することを含む。適切には、精子細胞は遠心分離によってペレット化される。水溶性物質(例えば、DNA)は、水相に残り、非水相によってペレット化した精子細胞から物理的に分離される。本明細書に用いられる“精子細胞”には、無傷の精子細胞又は本質的に無傷の精子細胞と、鞭毛又は“尾部”を失った精子細胞とが含まれ得る。精子細胞は、細胞を変化させる環境条件、機械的せん断又は化学処理(例えば、プロテイナーゼＫ又は他の物質への曝露)に曝され得るが、このような細胞、特にそれらの核を保持する細胞は、本発明の範囲内に含まれる。
性的暴行の被害者からの法医学的試料は、典型的には、固体支持体、例えば、綿棒又は布(例えば、精液のついた衣服から切り取ったもの)に集められる。綿棒又は布は、試験管のような容器又は他の適切な容器に移されて、溶解緩衝液のような水溶液と接触させられ得る。実施例に記載されているように、水性緩衝液と精子細胞の回収は、固体支持体と水性緩衝液を、液体試料を通過させることを可能にする一方で固体支持体の通過を効果的に防止する機械的障壁を備えた第2容器に移し、遠心分離して、水性試料を回収することによって容易にすることができる。前記第2容器は非水性液を保持し、その結果、固体支持体からの水性試料の除去と非水性液による精子細胞の沈降化が単一の遠心分離で達成された。あるいは、非水性液による処理は同じ容器において行うことができ、固体支持体を除去する前か後のいずれかで水性試料を非水性液と接触させることによって、固体支持体を溶解緩衝液で処理してもよい。非水性液を添加した後に、容器は、遠心分離の前に固体支持体が入れられる機械的障壁を、任意に取り付けられてもよい。別のアプローチにおいては、水性試料中の精子細胞は、前記試料を非水性液と接触させる前に、遠心分離によってペレット化されてもよい。非水性液を添加すると、ペレットから水性試料が浮き、精子細胞ペレットと水性試料中の可溶性DNAとの間に障壁(即ち、非水層)が形成する。後者のアプローチは、ペレット化した精子細胞と可溶性DNAとの間の物理的分離を可能にし得るが、遠心分離の前に水性試料を非水性液と接触させる他のアプローチよりも、細胞残渣から精子細胞ペレットを効果的には分離しない。
(Detailed description of the invention)
Forensic samples obtained from victims of sexual assault typically contain a large number of epithelial cells and, if present, relatively few sperm. In order to obtain DNA from sperm cells that are subsequently used in genetic identity tests, it is necessary to isolate sperm cells, particularly DNA, from water-soluble materials that may interfere with or complicate the interpretation of the results. For example, lysed epithelial cell-derived DNA is soluble in aqueous solutions.
Briefly, the method of the present invention comprises contacting an aqueous sample comprising sperm cells and an aqueous soluble material with a non-aqueous liquid having a density greater than the density of water but less than the density of sperm cells, and Pelleting sperm cells. Suitably, sperm cells are pelleted by centrifugation. Water soluble material (eg, DNA) remains in the aqueous phase and is physically separated from sperm cells pelleted by the non-aqueous phase. As used herein, “sperm cells” can include intact or essentially intact sperm cells and sperm cells that have lost flagella or “tail”. Sperm cells can be exposed to environmental conditions that alter the cells, mechanical shear or chemical treatment (e.g., exposure to proteinase K or other substances), but such cells, particularly those that retain their nuclei, Are included within the scope of the present invention.
Forensic samples from victims of sexual assault are typically collected on a solid support, such as a cotton swab or cloth (eg, cut from semen clothing). The swab or cloth can be transferred to a container such as a test tube or other suitable container and contacted with an aqueous solution such as a lysis buffer. As described in the examples, the recovery of aqueous buffer and sperm cells effectively allows the solid support and aqueous buffer to pass through the liquid sample while effectively passing the solid support through. It can be facilitated by transferring to a second container with a mechanical barrier to prevent and centrifuging to recover the aqueous sample. The second container retained a non-aqueous liquid, so that removal of the aqueous sample from the solid support and sedimentation of sperm cells with the non-aqueous liquid was accomplished with a single centrifugation. Alternatively, the treatment with the non-aqueous liquid can be performed in the same container, and the solid support is treated with the lysis buffer by contacting the aqueous sample with the non-aqueous liquid either before or after removing the solid support. May be. After adding the non-aqueous liquid, the container may optionally be fitted with a mechanical barrier in which the solid support is placed prior to centrifugation. In another approach, sperm cells in an aqueous sample may be pelleted by centrifugation prior to contacting the sample with a non-aqueous liquid. When a non-aqueous liquid is added, the aqueous sample floats from the pellet and a barrier (ie, a non-aqueous layer) is formed between the sperm cell pellet and the soluble DNA in the aqueous sample. The latter approach may allow physical separation between pelleted sperm cells and soluble DNA, but from other approaches that contact aqueous samples with non-aqueous liquids prior to centrifugation, from sperm from cell debris. Does not effectively separate cell pellets.
溶解緩衝液は、適切には、プロテイナーゼＫと、サルコシル(Sarkosyl)又はSDSとを含む。任意に、溶解緩衝液は、水相の可視化を高めるのに適するいずれかの水溶性色素(例えば、FD & C イエロー)を含むことができる。材料は、上皮細胞の溶解を可能にするが精子細胞の溶解を促進しない条件下、適切な量のプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ(270μg/ml)で処理される。精子細胞は、曝されるタンパク質が相対的に多数のジスルフィド結合を含むことから、プロテアーゼに対し相対的に抵抗性である。それ故、還元条件は、還元剤の存在は、ジスルフィド結合を破壊し、プロテアーゼで処理された精子細胞の溶解を増大させることから、差次的溶解には適さない。
プロテアーゼと清浄剤で処理した後、溶解した上皮細胞と無傷の精子細胞とを含有する溶解物を、非水性液と接触させる。適切な非水性液には、水の密度より大きいが精子細胞の密度より小さい密度を有するいずれもの非水性液が含まれ、適切には1.00g/cm3を超える密度を有し且つ精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい密度を有するあらゆる非水性液が含まれてもよい。下記の実施例に示されるように、1.29g/cm3未満の密度を有する非水性液は、続くDNAの分離、増幅及び分析のために精子細胞を回収できることがわかった。しかしながら、密度が精子細胞の少なくとも一部をペレット化できるように充分小さいことを条件として、1.29g/cm3を超える密度を有する非水性液が本発明の方法で用いることができることが構想される。本発明の方法に従って精子細胞を分離するために非水性液の適合性を評価することは、充分に当業者の能力の範囲内である。非水性液は、適切には、所望でない精子細胞の溶解を防止するように非カオトロピックである。非水性液は、好ましくは水における溶解性が相対的に低いものである。水における溶解性が低い非水性液を用いると、典型的には、より良い相分離と、上皮細胞DNAのような水溶性材料による精子細胞ペレットの夾雑の減少とが付与される。
非水性液であるジエチルグルタラート(“DEG”)、ジメチルグルタラート(“DMG”)及び1-クロロ-2-メチル-2-プロパノールを評価して、単独で又は組み合わせて用いた場合、本発明の実施において有効であることがわかった。任意に、非水性液の密度は、異なる密度を有する2つ以上の非水性液を所望の密度を得るのに有効な割合で組み合わせて用いることにより調整することができる。2つ以上の非水性液を用いる場合、それらの液体は、適切には、実質的に均一な密度の液体混合物を形成するように、実質的には相互に混和性である。
The lysis buffer suitably comprises proteinase K and Sarkosyl or SDS. Optionally, the lysis buffer can include any water-soluble dye (eg, FD & C yellow) suitable for enhancing the visualization of the aqueous phase. The material is treated with an appropriate amount of protease, eg, proteinase K (270 μg / ml) under conditions that allow lysis of epithelial cells but do not promote sperm cell lysis. Sperm cells are relatively resistant to proteases because the exposed protein contains a relatively large number of disulfide bonds. Therefore, reducing conditions are not suitable for differential lysis because the presence of a reducing agent breaks disulfide bonds and increases lysis of sperm cells treated with protease.
After treatment with protease and detergent, a lysate containing lysed epithelial cells and intact sperm cells is contacted with a non-aqueous liquid. Suitable non-aqueous fluids include any non-aqueous fluid having a density greater than that of water but less than that of sperm cells, suitably having a density greater than 1.00 g / cm 3 and of sperm cells Any non-aqueous liquid having a density small enough to pellet at least a portion may be included. As shown in the examples below, it was found that a non-aqueous liquid having a density of less than 1.29 g / cm 3 can recover sperm cells for subsequent DNA separation, amplification and analysis. However, it is envisioned that non-aqueous liquids having a density greater than 1.29 g / cm 3 can be used in the method of the present invention, provided that the density is small enough to pellet at least some of the sperm cells. . It is well within the ability of one skilled in the art to assess the suitability of non-aqueous fluids to separate sperm cells according to the methods of the present invention. The non-aqueous liquid is suitably non-chaotropic to prevent unwanted sperm cell lysis. The non-aqueous liquid preferably has a relatively low solubility in water. Using non-aqueous liquids with low solubility in water typically provides better phase separation and reduced contamination of sperm cell pellets with water soluble materials such as epithelial cell DNA.
When non-aqueous liquids diethyl glutarate (“DEG”), dimethyl glutarate (“DMG”) and 1-chloro-2-methyl-2-propanol were evaluated and used alone or in combination, the present invention It was found to be effective in the implementation of Optionally, the density of the non-aqueous liquid can be adjusted by using two or more non-aqueous liquids having different densities in combination in proportions effective to obtain the desired density. When two or more non-aqueous liquids are used, the liquids are suitably substantially miscible with each other so as to form a liquid mixture of substantially uniform density.
約1.02g/cm3の密度を有するDEG、約1.058g/cm3の密度を有する1-クロロ-2-メチル-2-プロパノール、及び1.09g/cm3の密度を有するDMGの各々を唯一の非水性液として用いた場合に、可溶性の上皮細胞DNAから精子細胞の許容できる分離ができた。DEGは、1.02g/cm3〜1.09g/cm3の非水溶液体混合中間物を得るのに有効な割合でDMGと組み合わせて用いることができる。下記の実施例において、DEGとDMGを約50:50の割合で含む混合液体を用いて約1.055g/cm3の密度を有する非水性液を得て、精子細胞ペレットと水溶性の上皮細胞DNAとの間の分離が有効にできることがわかった。更に、DEGとDMGから約100:0〜約0:100のDEG:DMGの割合で調製される混合液体は、本発明の実施に有効であることがわかった。本発明者らは、種々の割合のDEG及びDMGの有効性を評価し、本発明の方法を用いて許容しうる純度で充分な量の精子細胞を得るのに100:0、50:50、40:60、30:70、20:80、0:100のDEG:DMGの割合が有効であることがわかった。
更に、本発明者らは、DMGをクロロホルムと組み合わせて用いて種々の密度の混合非水性液を得ることができることを見出した。DMGとクロロホルムとの混合液体は、1.29g/cm3以下の密度で精子細胞を分離するのに有効である。DMG:クロロホルムを95:5の割合で含有し約1.108g/cm3の密度を有する混合液体を用いると、精子細胞収量は、DMG単独で得られる精子細胞収量に匹敵した。DMG:クロロホルムを75:25の割合で含有し1.189g/cm3の密度を有する混合液体は、DMG単独より精子細胞収量が低かった。DMG:クロロホルムを50:50の割合で含有し1.29g/cm3の密度を有する混合液体は、低くはあるが検出可能なレベルの精子細胞を得た。言い換えれば、試験した1.29g/cm3以下の密度を有する非水性液の組み合わせは、増幅及び遺伝子同一性試験を可能にするのに充分な収量と純度で精子細胞DNAを得るのに有効であった。具体的には、クロロホルムは、適切な密度を有する混合非水性液を得るのに適した割合を選ぶことによって、DEG又は1-クロロ-2-メチル-2-プロパノールと共に用いて精子細胞を単離できることが構想される。
DEG having a density of about 1.02 g / cm 3, respectively only the DMG having a density of about 1.058 g / cm 3 1-chloro-2-methyl-2-propanol, and a density of 1.09 g / cm 3 When used as a non-aqueous solution, acceptable separation of sperm cells from soluble epithelial cell DNA was achieved. DEG can be used in combination with DMG valid proportions to obtain a non-aqueous material mixture intermediary of 1.02g / cm 3 ~1.09g / cm 3 . In the following examples, a non-aqueous liquid having a density of about 1.055 g / cm 3 is obtained using a mixed liquid containing DEG and DMG in a ratio of about 50:50, and a sperm cell pellet and water-soluble epithelial cell DNA are obtained. It was found that the separation between and could be effective. Furthermore, liquid mixtures prepared from DEG and DMG in a ratio of DEG: DMG of about 100: 0 to about 0: 100 have been found to be effective in the practice of the present invention. We have evaluated the effectiveness of various ratios of DEG and DMG, and 100: 0, 50:50, to obtain a sufficient amount of sperm cells with acceptable purity using the method of the present invention. A ratio of DEG: DMG of 40:60, 30:70, 20:80, 0: 100 was found to be effective.
Furthermore, the present inventors have found that mixed non-aqueous liquids of various densities can be obtained using DMG in combination with chloroform. A mixed liquid of DMG and chloroform is effective for separating sperm cells at a density of 1.29 g / cm 3 or less. Using a mixed liquid containing DMG: chloroform in a ratio of 95: 5 and having a density of about 1.108 g / cm 3 , the sperm cell yield was comparable to that obtained with DMG alone. A mixed liquid containing DMG: chloroform in a ratio of 75:25 and having a density of 1.189 g / cm 3 had a lower sperm cell yield than DMG alone. A mixed liquid containing DMG: chloroform in a ratio of 50:50 and having a density of 1.29 g / cm 3 gave low but detectable levels of sperm cells. In other words, the tested non-aqueous liquid combination with a density of 1.29 g / cm 3 or less was effective in obtaining sperm cell DNA in sufficient yield and purity to allow amplification and gene identity testing. It was. Specifically, chloroform is used with DEG or 1-chloro-2-methyl-2-propanol to isolate sperm cells by choosing a suitable ratio to obtain a mixed non-aqueous liquid with the appropriate density. It is envisioned that it can be done.
当業者が理解するように、DMGがDEGに対し相対的に低い割合を有する混合非水性液は比較的高い密度を有し、DMGがDEGに対し相対的に高い割合を有する混合非水系液体は比較的低い密度を有する。比較的低い密度を有する非水性液は多数の精子細胞を回収することができるが、比較的高い密度を有する非水性液は、未溶解の上皮細胞と細胞残渣との夾雑が少ない少数の精子細胞を回収することができることが予想される。それ故、用途によっては、種々の非水性液の割合を、多数の精子細胞の回収又はより高純度の少数の精子細胞の回収に効果を挙げるように調整することができる。
溶解した上皮細胞を含む水性試料を非水性液と接触させた後に、前記試料は、水相と非水相の分離と精子細胞のペレット化とを引き起こすのに有効な時間、力を施される。好ましくは、前記試料を遠心分離することによって、前記試料に力が施される。任意に、固体支持体から細胞及び溶液の除去を可能にするため、回転バスケットを遠心分離工程で使用することができる。
水に可溶性である上皮細胞DNAは水層に見られ、捕捉した上皮細胞DNAをも含有し得る不溶性の上皮細胞残渣は、非水性液の密度によって、水層と非水層との間の界面で見られる。上皮細胞DNAと細胞残渣は水層と界面領域とを除去することによって除去され、その除去はピペット操作を含むあらゆる適切な手段によって達成することができる。水相に存在する上皮細胞DNAは、遺伝子同一性試験の対照物として用いて、試料の供給源を確認することができる。水相の回収後、少量の水溶液が非水相の表面又はその近くに、また、容器壁上に残る場合がある。精子細胞ペレットを破壊せずに、前記水溶液及び上皮細胞DNAの除去を高めるために、任意に、最初に水又は適切な水溶液を非水相に重層し、次に水相を除去することによって、残留水溶液を除去してもよい。水は非水性液と混合しないため、溶液を遠心分離して水層と非水層とを分離する必要がない。
As those skilled in the art will appreciate, mixed non-aqueous liquids where DMG has a relatively low proportion of DEG have a relatively high density, and mixed non-aqueous liquids where DMG has a relatively high proportion of DEG are Has a relatively low density. A non-aqueous liquid having a relatively low density can recover a large number of sperm cells, whereas a non-aqueous liquid having a relatively high density has a small number of sperm cells with less contamination between undissolved epithelial cells and cell debris. Can be recovered. Thus, depending on the application, the proportion of the various non-aqueous liquids can be adjusted to be effective for the recovery of a large number of sperm cells or a smaller number of higher purity sperm cells.
After contacting an aqueous sample containing lysed epithelial cells with a non-aqueous liquid, the sample is subjected to a force for a time effective to cause separation of the aqueous and non-aqueous phases and sperm cell pelleting. . Preferably, force is applied to the sample by centrifuging the sample. Optionally, a rotating basket can be used in the centrifugation step to allow removal of cells and solutions from the solid support.
Epithelial cell DNA that is soluble in water is found in the aqueous layer, and insoluble epithelial cell debris that may also contain captured epithelial cell DNA depends on the density of the non-aqueous fluid and the interface between the aqueous layer Seen in Epithelial cell DNA and cell debris are removed by removing the aqueous layer and the interfacial region, which can be achieved by any suitable means including pipetting. Epithelial cell DNA present in the aqueous phase can be used as a control for genetic identity testing to confirm the source of the sample. After recovery of the aqueous phase, a small amount of aqueous solution may remain on or near the surface of the non-aqueous phase and on the vessel wall. To enhance the removal of the aqueous solution and epithelial cell DNA without destroying the sperm cell pellet, optionally by first overlaying the non-aqueous phase with water or a suitable aqueous solution, and then removing the aqueous phase, The residual aqueous solution may be removed. Since water does not mix with non-aqueous liquids, it is not necessary to centrifuge the solution to separate the aqueous and non-aqueous layers.
水相の除去に続いて、カオトロピック剤及び還元剤を含有する溶解緩衝液を非水性液に添加しボルテックスミキサーで混合して、実質的に均一な混合物を形成することができる。実施例2に示すように、チオシアン酸グアニジン(GTC)及びジチオトレイトール(DTT)を含有する溶解緩衝液を非水相及び精子細胞ペレットと混合して、精子細胞を溶解する。実施例2は、更に、その後、精子細胞溶解物にDNAを結合することができる樹脂を添加して、他の細胞材料からDNAを精製することができることを示している。
或はまた、実施例3に記載されるように、水層と非水層双方を除去して、精子細胞ペレットを残すことができ、存在する精子細胞は、細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(1% w/v)やDTTのような清浄剤を含む水溶液と接触させることによって溶解し、続いてフェノール:クロロホルムで抽出することができる。
具体的には、水相の除去に続いて、精子細胞ペレット及び非水相をフェノール:クロロホルム及び清浄剤(例えば、SDS又はサルコシル)を含有する水溶液で抽出して、精子細胞DNAを遊離できることが構想される。
実施例に記載されるように、本発明の方法は、膣又は子宮頸部をぬぐった綿棒のような法医学的試料の中に含有する上皮細胞から精子細胞を分離するのに有効であることがわかった。本方法は、他の供給源から精子細胞を分離するのに有効であることが構想され、前記供給源としては、布のような精液を含有する他の固体支持体が挙げられる。本発明の方法は、精子細胞と、夾雑している赤血球又は白血球又は有核非精子細胞に由来するDNAとを含有する試料での使用に適していることが予想されるのは合理的なことである。
本発明の方法は、細胞をそれらの差次的密度に基づいて分離するのに一般的な応用性を有すること、又は選択的な溶解後、水性溶媒に可溶性の材料から他の細胞型の単離を容易にすることが予想される。本方法は、種々の細胞下の細胞小器官を分離するのに適し得ることも構想される。
以下の非限定的実施例は、純粋に具体的な説明のためのものである。
Following removal of the aqueous phase, a lysis buffer containing a chaotropic agent and a reducing agent can be added to the non-aqueous liquid and mixed with a vortex mixer to form a substantially uniform mixture. As shown in Example 2, lysis buffer containing guanidine thiocyanate (GTC) and dithiothreitol (DTT) is mixed with the non-aqueous phase and sperm cell pellet to lyse sperm cells. Example 2 further shows that DNA can then be purified from other cell materials by adding a resin capable of binding DNA to the sperm cell lysate.
Alternatively, as described in Example 3, both the aqueous and non-aqueous layers can be removed, leaving a sperm cell pellet, where the existing sperm cells can be identified as sodium dodecyl sulfate (SDS). It can be dissolved by contact with an aqueous solution containing a detergent such as (1% w / v) or DTT, followed by extraction with phenol: chloroform.
Specifically, following removal of the aqueous phase, the sperm cell pellet and non-aqueous phase can be extracted with an aqueous solution containing phenol: chloroform and a detergent (e.g., SDS or sarkosyl) to release sperm cell DNA. Conceived.
As described in the Examples, the method of the present invention may be effective in separating sperm cells from epithelial cells contained in forensic samples such as swabs that have wiped the vagina or cervix. all right. The method is envisioned to be effective in separating sperm cells from other sources, which include other solid supports containing semen such as cloth. It is reasonable that the method of the invention is expected to be suitable for use with samples containing sperm cells and DNA derived from contaminating red or white blood cells or nucleated non-sperm cells. It is.
The method of the present invention has general applicability in separating cells based on their differential density, or, after selective lysis, from other materials soluble in aqueous solvents to other cell types. It is expected to facilitate separation. It is also envisioned that the method may be suitable for separating various subcellular organelles.
The following non-limiting examples are purely illustrative.
（実施例1：上皮細胞を含有する試料から精子細胞の分離）
精子細胞の単離を評価するのに用いる試料としては、添加された精液を含有する新しい口腔用綿棒、添加された精液を含有する新しい又は4年前の膣の試料、4年前の性交11時間後の膣の試料が含まれた。試料を含有する固体支持体(例えば、綿棒)を微小遠心管に入れた。各試料に50mM NaCl、10mMトリス、pH 8.0、10mM EDTA、0.2％ SDS、FD&C黄色色素、及び270μg/mlのプロテイナーゼＫを含有する0.5mlアリコートの消化溶液を添加した。試料を含有する管を30秒間ボルテックスし、56℃で1時間インキュベートした。ジエチルグルタラートとジメチルグルタラートとを100:0、50:50、40:60、30:70、20:80、0:100のDEG:DMGの割合で混合して、混合非水性液を形成した。50:50の割合は、約1.055g/cm3の密度を有する液体を形成した。DEG:DMGを100:0、50:50、40:60、30:70、20:80、又は0:100の割合で含む100μlアリコートの非水性液を、回転バスケットを備えた清浄な微小遠心管へ移した。インキュベーション後、プロテイナーゼＫ消化反応物と固体支持体を回転バスケットへ移した。回転バスケットと微小遠心管を微小遠心機に入れ、14,000rpm(10,000×g)で10分間遠心分離した。黄色の水相及び水相と非水相との間の境界の近くのあらゆる細胞残渣を、ピペット操作によって除去した。100μlアリコートの水を非水相上に重層し、約30秒間放置した後、ピペットで水相を除去した。
更に、非水溶液としてジメチルグルタラートとクロロホルムとを特定の割合で用いて精子細胞を分離した。ジメチルグルタラートとクロロホルムを95:5、75:25、50:50のジメチルグルタラート:クロロホルムの割合で混合した。50:50混合液の密度は、1.290であった。
(Example 1: Separation of sperm cells from a sample containing epithelial cells)
Samples used to assess sperm cell isolation include new oral swabs containing added semen, new or 4 year old vaginal samples containing added semen, 4 years old intercourse 11 Vaginal samples after time were included. A solid support (eg, a cotton swab) containing the sample was placed in a microcentrifuge tube. To each sample was added a 0.5 ml aliquot of digestion solution containing 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.2% SDS, FD & C yellow dye, and 270 μg / ml proteinase K. The tube containing the sample was vortexed for 30 seconds and incubated at 56 ° C. for 1 hour. Diethyl glutarate and dimethyl glutarate were mixed at a ratio of DEG: DMG of 100: 0, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 0: 100 to form a mixed non-aqueous liquid. . A 50:50 ratio formed a liquid having a density of about 1.055 g / cm 3 . A clean microcentrifuge tube equipped with a rotating basket of 100 μl aliquots of non-aqueous liquid containing DEG: DMG at a ratio of 100: 0, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, or 0: 100 Moved to. Following incubation, the proteinase K digestion reaction and the solid support were transferred to a rotating basket. The rotating basket and microcentrifuge tube were placed in a microcentrifuge and centrifuged at 14,000 rpm (10,000 × g) for 10 minutes. Any cell debris near the yellow aqueous phase and the boundary between the aqueous and non-aqueous phases was removed by pipetting. A 100 μl aliquot of water was layered over the non-aqueous phase and allowed to stand for about 30 seconds before removing the aqueous phase with a pipette.
Furthermore, sperm cells were separated using dimethyl glutarate and chloroform at a specific ratio as a non-aqueous solution. Dimethyl glutarate and chloroform were mixed at a ratio of 95: 5, 75:25, 50:50 dimethyl glutarate: chloroform. The density of the 50:50 mixture was 1.290.
（実施例2：カオトロピック塩及び還元条件を用いた精子細胞又は溶解した上皮細胞からDNAの単離）
DNA IQTM 系(Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州 Cat. No. DC6701)に示される成分を用いてPromega Technical Bulletin TB296に記載されるDNA単離法に従って、実施例1の精子細胞ペレットからDNAを単離した。4.5Mチオシアン酸グアニジン(GTC)と10mMジチオトレイトール(DTT) とを含有するDNA IQTM 溶解緩衝液の200μlアリコートを、非水性液と精子細胞ペレットを含有する微量遠心チューブに添加し、ボルテックスして、簡単に精子細胞ペレットを破壊し且つ非水相と溶解緩衝液の均一な混合物を形成した。
その溶液にDNA IQTM 樹脂の7μlアリコートを添加し、高速で3秒間ボルテックスすることによって混合し、室温で5分間インキュベートした。その混合液を高速で2秒間ボルテックスし、チューブを磁気スタンドに入れ、常磁性樹脂がチューブの側面に引きつけられた後、溶解緩衝液と非水性液の均一な混合液を除去し捨てた。粒子を、100μの該アリコートのDNA IQTM洗浄緩衝液をで3回洗浄した。粒子を40μlのDNA IQTM 溶離緩衝液と接触させ、高速で2秒間ボルテックスし、65℃でインキュベートした。65℃でインキュベートした直後に、チューブを高速で2秒間ボルテックスし、磁気スタンドに入れ、溶出液を清浄な容器へ移した。
前項で記載したように、溶解した精子細胞からDNAを単離した同様の方法で上皮細胞DNAを単離した。
(Example 2: Isolation of DNA from sperm cells or lysed epithelial cells using chaotropic salts and reducing conditions)
DNA IQ TM system (Promega Corp., Madison, WI Cat. No. DC6701) according to DNA isolation method described in Promega Technical Bulletin TB296 using the components shown in the DNA from the sperm cell pellet Example 1 Isolated. 4.5M guanidine thiocyanate and (GTC) the 200μl aliquot of the DNA IQ TM lysis buffer containing a 10mM dithiothreitol (DTT), was added to a microcentrifuge tube containing a non-aqueous liquid and sperm cell pellet, vortexed The sperm cell pellet was easily broken and a uniform mixture of non-aqueous phase and lysis buffer was formed.
A 7 μl aliquot of DNA IQ ™ resin was added to the solution, mixed by vortexing at high speed for 3 seconds, and incubated at room temperature for 5 minutes. The mixture was vortexed at high speed for 2 seconds, the tube was placed in a magnetic stand, and after the paramagnetic resin was attracted to the side of the tube, the uniform mixture of lysis buffer and non-aqueous solution was removed and discarded. The particles were washed 3 times with 100 μl of the aliquot of DNA IQ ™ wash buffer. The particles were contacted with 40 μl of DNA IQ ™ elution buffer, vortexed at high speed for 2 seconds and incubated at 65 ° C. Immediately after incubation at 65 ° C., the tube was vortexed at high speed for 2 seconds, placed on a magnetic stand, and the eluate was transferred to a clean container.
As described in the previous section, epithelial cell DNA was isolated in the same manner as DNA was isolated from lysed sperm cells.
（実施例3：清浄剤及びフェノール:クロロホルム抽出を用いた精子細胞からDNAの分離）
実施例1の精子細胞ペレットから、最初に非水性液を除去して固まった精子細胞ペレットが残ることによってDNAを分離した。10mMトリス、pH 8.0、1mM EDTA、10mM DTT、及び1％SDSを含有する300μl溶液を精子細胞ペレットに添加し、チューブをボルテックスして、精子細胞を溶解させると共にDNAを溶解した。等容積のフェノール:クロロホルム(1:1、v/v)を添加し且つボルテックスして、タンパク質を変性させた。DNA含有水溶液を除去し、Microcon(登録商標)装置において濃縮し、10mMトリス、pH 8.0、0.1mM EDTを含有する200μlの緩衝液で洗浄し、更にまたMicrocon(登録商標)装置において約40μlまで濃縮した。精製されたDNAを清浄な容器へ移した。
(Example 3: Separation of DNA from sperm cells using detergent and phenol: chloroform extraction)
DNA was separated from the sperm cell pellet of Example 1 by first removing the non-aqueous liquid and leaving a solidified sperm cell pellet. A 300 μl solution containing 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, and 1% SDS was added to the sperm cell pellet, and the tube was vortexed to lyse the sperm cells and lyse the DNA. An equal volume of phenol: chloroform (1: 1, v / v) was added and vortexed to denature the protein. Remove DNA-containing aqueous solution, concentrate in Microcon® instrument, wash with 200 μl buffer containing 10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDT, and also concentrate to approximately 40 μl in Microcon® instrument did. The purified DNA was transferred to a clean container.
（実施例4：多重増幅後の精子細胞DNAの確認）
実施例2又は実施例3に従って、分離された精子細胞又は溶解した上皮細胞からDNAを回収した後、PowerPlex(登録商標)16(Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、Cat. # DC6530)を用いてDNAを増幅した。その後、ABI Prism(登録商標)310ジェネティックアナライザを用いて増幅されたDNAを分析した。
代表的結果を、図1に示される電気泳動図に示す。図1に関して、精子細胞を含有する膣をぬぐった綿棒から実施例1及び実施例2に記載した通りに精子細胞又は上皮細胞からDNAを分離し、室温で4年間保存した。上皮細胞溶解物又は精子細胞溶解物からDNA IQTM 系によってDNAを精製した後、DNA(1/400th の上皮細胞部分と1/80th の精子部分)をPowerPlex(登録商標)16を用いて増幅し、増幅産物をABI Prism(登録商標)310ジェネティックアナライザを用いて分析した。図1の電気泳動図は、フルオレセインチャネルの増幅産物を示し(図1A)、JOEチャネルの増幅産物を示し(図1B)、TMRチャネルの増幅産物を示し(図1C)ている。この結果を、16の遺伝子座の各々が更に容易に同定できるように色素カラーに従って分け、精子細胞DNAから得られた結果を、上皮細胞DNAから得られる結果のすぐ上に示す。
図1からわかるように、本方法は、精子細胞DNAにおいて非常に低レベルの夾雑上皮細胞DNAによって明示されるように、上皮細胞から精子細胞の分離を提供する。ごくわずかな精子細胞DNAが上皮細胞DNA画分に見られ、これは、室温で長期的に貯蔵した間の精子細胞溶解によるものと思われる。
(Example 4: Confirmation of sperm cell DNA after multiplex amplification)
After recovering DNA from isolated sperm cells or lysed epithelial cells according to Example 2 or Example 3, using PowerPlex® 16 (Promega Corp., Madison, Wis., Cat. # DC6530) DNA was amplified. The amplified DNA was then analyzed using an ABI Prism® 310 genetic analyzer.
Representative results are shown in the electropherogram shown in FIG. With reference to FIG. 1, DNA was isolated from sperm cells or epithelial cells as described in Examples 1 and 2 from a vagina swab containing sperm cells and stored at room temperature for 4 years. After purification of the DNA by DNA IQ TM system from epithelial cell lysates or sperm cell lysate, the DNA (epithelial cell parts and 1/80 th sperm portion of 1/400 th) using the PowerPlex (R) 16 Amplification and amplification products were analyzed using an ABI Prism® 310 genetic analyzer. The electropherogram of FIG. 1 shows the fluorescein channel amplification product (FIG. 1A), the JOE channel amplification product (FIG. 1B), and the TMR channel amplification product (FIG. 1C). The results are divided according to the dye color so that each of the 16 loci can be more easily identified, and the results obtained from sperm cell DNA are shown immediately above the results obtained from epithelial cell DNA.
As can be seen from FIG. 1, the method provides for the separation of sperm cells from epithelial cells, as evidenced by very low levels of contaminating epithelial cell DNA in sperm cell DNA. Very little sperm cell DNA is seen in the epithelial cell DNA fraction, which is likely due to sperm cell lysis during prolonged storage at room temperature.
Claims (28)
(a) 水性試料を約1.00g/cm3より大きい密度を有する非水性液と接触させる工程であって、前記非水性液の密度が前記試料中の精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい前記工程；及び
(b) 接触させた試料に、充分な時間、力を施して、水層、非水層及び精子ペレットを形成する工程；
を含む、前記方法。 A method for separating sperm cells from an aqueous sample, comprising:
(a) contacting the aqueous sample with a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3 , wherein the density of the non-aqueous liquid pellets at least some of the sperm cells in the sample. Said process sufficiently small to
(b) applying a force to the contacted sample for a sufficient time to form an aqueous layer, a non-aqueous layer and a sperm pellet;
Said method.
を更に含む、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising (c) removing the aqueous layer.
を更に含む、請求項16記載の方法。 17. The method of claim 16, further comprising the step of (d) contacting the non-aqueous layer and sperm pellet with a chaotropic agent.
(e)工程(d)の非水層及び精子細胞ペレットを、フェノール:クロロホルムと接触させる工程
を更に含む、請求項17記載の方法。 The chaotropic agent contains a detergent,
18. The method of claim 17, further comprising the step of (e) contacting the non-aqueous layer and sperm cell pellet of step (d) with phenol: chloroform.
を更に含む、請求項16記載の方法。 17. The method of claim 16, further comprising (d) removing the non-aqueous layer.
を更に含む、請求項20記載の方法。 21. The method of claim 20, further comprising the step of (e) contacting the cell pellet of step (d) with an aqueous detergent and phenol: chloroform.
a) 水性試料を約1.00g/cm3より大きい密度を有する非水性液と接触させる工程であって、前記非水性液の密度が前記試料中の精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい前記工程;
b) 接触させた試料を遠心分離して、水層、非水層及び精子細胞ペレットを形成する工程;
c) 水層を除去する工程;
d) 非水層及び精子細胞ペレットを、カオトロピック剤及び還元剤を含む溶解緩衝液と接触させる工程; 及び
(e) 工程(d)の接触させた精子細胞ペレットからDNAを単離する工程
を含む、前記方法。 A method for isolating DNA from sperm cells in an aqueous sample containing lysed epithelial cells comprising:
a) contacting an aqueous sample with a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3 , wherein the density of the non-aqueous liquid is used to pellet at least some of the sperm cells in the sample. Said process small enough;
b) centrifuging the contacted sample to form an aqueous layer, a non-aqueous layer and a sperm cell pellet;
c) removing the aqueous layer;
d) contacting the non-aqueous layer and the sperm cell pellet with a lysis buffer comprising a chaotropic agent and a reducing agent; and
(e) The method comprising the step of isolating DNA from the contacted sperm cell pellet of step (d).
a) 水性試料を約1.00g/cm3より大きい密度を有する非水性液と接触させる工程であって、前記非水性液の密度が前記試料中の精子細胞の少なくとも一部をペレット化するのに充分小さい前記工程;
b) 接触させた試料を遠心分離して、水層、非水層及び精子細胞ペレットを形成する工程;
c) 水層及び非水層を除去する工程;
d) 精子細胞ペレットを、清浄剤及びフェノール:クロロホルムを含む水溶液と接触させる工程; 及び
(e) 工程(d)の接触させた精子細胞ペレットからDNAを単離する工程
を含む、前記方法。 A method for isolating DNA from sperm cells in an aqueous sample containing lysed epithelial cells comprising:
a) contacting an aqueous sample with a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3 , wherein the density of the non-aqueous liquid is used to pellet at least some of the sperm cells in the sample. Said process small enough;
b) centrifuging the contacted sample to form an aqueous layer, a non-aqueous layer and a sperm cell pellet;
c) removing the aqueous and non-aqueous layers;
d) contacting the sperm cell pellet with a detergent and an aqueous solution containing phenol: chloroform; and
(e) The method comprising the step of isolating DNA from the contacted sperm cell pellet of step (d).
約1.00g/cm3より大きい密度を有する非水性液であって、非水性液の密度が試料における精子細胞の少なくとも一部を沈降させるのに充分小さい前記非水性液を含む、前記キット。 A kit for isolating sperm cells from a sample containing sperm cells,
The kit comprising a non-aqueous liquid having a density greater than about 1.00 g / cm 3, wherein the density of the non-aqueous liquid is sufficiently small to precipitate at least some of the sperm cells in the sample.
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