JP2008500995A - タンパク質安定化法 - Google Patents

Abstract

単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法を記載する。この方法は、バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給することと、そのバルクに、静菌剤、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、抗酸化剤およびそれらの組合せからなる群から選択される賦形剤を加えることにある。単量体タンパク質はＩＦＮ−βであることが好ましい。

Description

本発明は、一般には、バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給することと、そのバルク溶液に特定の賦形剤を加えることとにより単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法に関する。

インターフェロンは、サイトカイン、すなわち、細胞間で情報を伝達し、感染を引き起こす微生物を破壊する手助けをし、結果として生じたいずれの損傷も修復することにより免疫系において重要な役割を果たす可溶性タンパク質である。インターフェロンは、感染細胞によって自然分泌され、１９５７年に最初に確認された。その名前は、ウイルス複製や生成を「妨げる（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）」という事実に由来している。

インターフェロンは、抗ウイルス活性と抗増殖活性の両方を示す。天然に存在するヒトインターフェロンは、生化学的性質と免疫学的性質に基づいて、３つの主要な種類に分けられている。インターフェロン−α（白血球）、インターフェロン−β（線維芽細胞）およびインターフェロン−γ（免疫系）。α−インターフェロンは、現在、米国やその他の国々で毛様細胞性白血病、性病疣贅、カポジ肉腫（一般に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を苦しめている癌）および慢性非Ａ型、非Ｂ型肝炎の治療用に認可されている。

さらに、インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染を受けて体内によって産生される糖タンパク質である。それらは、保護される細胞においてウイルスの増殖を抑制する。ＩＦＮは低分子量タンパク質で構成され、その作用は著しく非特異的である、すなわち、１種類のウイルスによって誘発されたＩＦＮが広範な他のウイルスに対して有効である。しかし、それらは種特異的である、すなわち、１種類の種によって誘発されたＩＦＮは同一種または近縁種の細胞において抗ウイルス活性を促進するだけである。ＩＦＮは、潜在抗腫瘍活性や抗ウイルス活性のために利用された最初のサイトカイン群であった。

３種類の主要なＩＦＮは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γと呼ばれている。このような主要な種類のＩＦＮは、最初はその起源の細胞（白血球、線維芽細胞またはＴ細胞）によって分類されていた。しかし、１種類の細胞によっていくつかのタイプが産生され得るということが明らかになった。それゆえに、現在では白血球ＩＦＮをＩＦＮ−αと呼び、線維芽細胞ＩＦＮはＩＦＮ−βであり、Ｔ細胞ＩＦＮはＩＦＮ−γである。第４のタイプのＩＦＮ、リンパ芽球ＩＦＮも存在し、このＩＦＮは、白血球ＩＦＮと線維芽細胞ＩＦＮの両方の混合物を産生すると見られている「Ｎａｍａｌｗａ」細胞系（バーキットリンパ腫由来）で産生される。

インターフェロンの単位またはインターフェロンの国際単位（国際単位にはＵまたはＩＵ）は、ウイルスによる損傷から細胞の５０％を保護するのに必要な量として定義される、ＩＦＮ活性を示す尺度として報告されている。生物活性の測定に使用できるアッセイとしては、記載されている細胞変性効果抑制試験がある（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら １９８１、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ．ら、１９８１）。インターフェロンについてのこの抗ウイルスアッセイでは、インターフェロン約１単位／ｍｌが、５０％の細胞変性効果を生じるのに必要な量である。これらの単位は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から供給されているＨｕ−ＩＦＮ−βの国際標準品に対して決定される（Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．１９８６）。

各種類のＩＦＮには、数種類の別個のタイプが含まれている。ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γは、それぞれ単一遺伝子の産物である。

ＩＦＮ−αに分類されるタンパク質は、最も多様な群であり、約１５のタイプを含む。染色体９番上にＩＦＮ−α遺伝子群があり、少なくとも２３のメンバーを含む。そのうちの１５のメンバーは活性であり、転写される。成熟ＩＦＮ−α類はグリコシル化されていない。

ＩＦＮ−α類およびＩＦＮ−βは、全て同じ長さ（１６５個または１６６個のアミノ酸）であり、類似した生物活性を有する。ＩＦＮ−γ類は１４６個のアミノ酸長であり、α種およびβ種とはあまり似ていない。ＩＦＮ−γ類だけがマクロファージを活性化することができ、またはキラーＴ細胞の成熟を誘導することができる。これらの新しいタイプの治療薬は、免疫修飾を介して認識に作用し、腫瘍に対する生物の応答に影響を与えることから、生物反応修飾剤（ＢＲＭ）と呼ばれることもある。

ヒト線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は、抗ウイルス活性を有し、新生細胞に対してナチュラルキラー細胞を刺激することもできる。このヒト線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は、ウイルスと二本鎖ＲＮＡによって誘発される約２０，０００Ｄａのポリペプチドである。組換えＤＮＡ技術によってクローニングした、線維芽細胞インターフェロンの遺伝子のヌクレオチド配列から、このタンパク質の完全アミノ酸配列が推定された（Ｄｅｒｙｎｋら１９８０）。この線維芽細胞インターフェロンは１６６個のアミノ酸長である。

Ｓｈｅｐａｒｄら（１９８１）は、その抗ウイルス活性を消滅させる、塩基８４２における突然変異（１４１位におけるＣｙｓ→Ｔｙｒ）について記載し、変異クローンはヌクレオチド１１１９〜１１２１が欠失していた。

Ｍａｒｋら（１９８４）は、塩基４６９（Ｔ）を（Ａ）で置換することにより、１７位においてＣｙｓ→Ｓｅｒのアミノ酸の変更が起こる人工突然変異を挿入した。得られたＩＦＮ−βは、「未変性の」ＩＦＮ−βと同じくらい活性があり、長期保存（−７０℃）の間安定であると報告された。

多発性硬化症（ＭＳ）のインターフェロン療法における最新の展開であるＲｅｂｉｆ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ社製−組換えヒトインターフェロン−β）は、哺乳類細胞系から産生されたインターフェロン（ＩＦＮ）−β−１ａである。推奨されるその国際一般名（ＩＮＮ）は「インターフェロンβ−１ａ」である。

あらゆるタンパク質ベースの医薬と同様に、ＩＦＮ−βを治療薬として使用する際に克服しなければならない重大な障害の１つが、薬剤製剤におけるその不安定性に起因し得る製薬上の有用性の喪失である。

薬剤製剤でのポリペプチド活性や有効性を脅かす物理的不安定性としては、変性や可溶性凝集体および不溶性凝集体の形成が挙げられ、一方、化学的不安定性としては、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化およびアミド分解が挙げられる。これらの変化のいくつかは、注目するタンパク質の薬剤活性の喪失または低下をもたらすことが分かっている。他の事例では、これらの変化の正確な影響は分かっていないが、結果として生じる分解産物は、望ましくない副作用の可能性から依然として製薬上許容されないと考えられている。

薬学的組成物におけるポリペプチドの安定化は、依然として、試行錯誤が大きな役割を果たしている分野である（Ｗａｎｇ（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８５、１２９〜１８８頁；ＷａｎｇおよびＨａｎｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４２、Ｓ３〜Ｓ２６に総説されている）。ポリペプチド薬剤製剤に、安定性を高めるために加えられる賦形剤としては、バッファー、糖、界面活性剤、アミノ酸、ポリエチレングリコールおよびポリマーが挙げられるが、これらの化学添加剤の安定化効果はタンパク質によって異なる。

現在のタンパク質製剤では、タンパク質の最終的な調製物への賦形剤の使用が行われている。しかし、これらの製剤は幾分か不安定なままである。加えて、単量体として生物学的に活性であるタンパク質、すなわち、単量体タンパク質は、ストレスを受けると（例えば、温度ストレス）重合および凝集する傾向がある。

よって、タンパク質の溶解度を高め、特に凝集やオリゴマー化に対する単量体タンパク質の安定化を増強し、そのようにしてそれらの製薬上の有用性を高める方法が必要である。

第１の態様では、本発明は、単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法であって、前記方法が、
ａ）バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給するステップと、
ｂ）前記バルクに
ｉ）静菌剤、
ｉｉ）界面活性剤、
ｉｉｉ）等張化剤、
ｉｖ）アミノ酸、
ｖ）抗酸化剤、
ｖｉ）等張化剤および抗酸化剤、
ｖｉｉ）等張化剤、抗酸化剤およびアミノ酸、
ｖｉｉｉ）アミノ酸および抗酸化剤、
ｉｘ）アミノ酸、抗酸化剤および界面活性剤、
ｘ）静菌剤および抗酸化剤、ならびに
ｘｉ）静菌剤、抗酸化剤および界面活性剤
からなる群から選択される賦形剤を加えるステップと
を含む方法を提供する。

加えて、バルクタンパク質は、本発明の第１の態様の方法の前または後のいずれかに指定の温度でインキュベートすることもできる。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって得られる、予備調製されたバルクタンパク質を提供する。

第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のタンパク質のバルクを予備調製する方法を含む、単量体タンパク質の安定性を増大および／または維持する方法を提供する。

本発明は、単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法であって、前記方法が、
ａ）バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給するステップと、
ｂ）バルクに
ｉ）静菌剤、
ｉｉ）界面活性剤、
ｉｉｉ）等張化剤、
ｉｖ）アミノ酸、
ｖ）抗酸化剤、
ｖｉ）等張化剤および抗酸化剤、
ｖｉｉ）等張化剤、抗酸化剤およびアミノ酸、
ｖｉｉｉ）アミノ酸および抗酸化剤、
ｉｘ）アミノ酸、抗酸化剤および界面活性剤、
ｘ）静菌剤および抗酸化剤、ならびに
ｘｉ）静菌剤、抗酸化剤および界面活性剤
からなる群から選択される賦形剤を加えるステップと
を含む方法を対象とする。

実際に、本出願において詳細に記載されるように、１種類以上の賦形剤をバルクタンパク質に加えることによって安定化を行う場合には、そのバルクタンパク質に１種類以上の賦形剤が加えられた瞬間からそのタンパク質を含有する製剤の最終処理、例えば、患者による最終的な取込みまで安定性が得られるということが本出願者によって見いだされた。このように、安定化は、保存段階においてだけ起こるものではなく、そのタンパク質が、処分されるまで、すなわち、保存前、保存中および保存後のその有効期間中に直面する可能性がある種々の段階を通じて起こるものである。従って、本発明の方法は、タンパク質またはタンパク質製剤がその有効期間中に受け得る種々のストレスの影響を弱めることができる。よって、安定化は製造工程においてだけでなく、輸送、保存および送達工程においても起こる。

本発明は、本発明の方法によって得られる、予備調製バルクとも呼ばれる安定化バルクも包含する。

本明細書において、用語「予備調製物」とは、バルク単量体タンパク質を含有する製剤を指す。これらの予備調製物の安定性は、凝集およびオリゴマー化の低減という点で付与されるだけでなく、他のタイプの悪影響を及ぼすプロセス、例えば、酸化、アミド分解なども含まれる。そのようなものとして、本発明はまた、単量体タンパク質の安定性に影響を及ぼすものである限り、他のいずれのタイプのプロセスも包含する。

用語「保存中」とは、調製されても、被験体にすぐに投与されない製剤または組成物を指す。もっと正確に言えば、調製後、その製剤または組成物は液体形態か、または被験体への投与に適した他の形態で保存用にパッケージングされている。

「乾燥形態」とは、凍結乾燥、噴霧乾燥または空気乾燥のいずれかにより乾燥させた製剤または組成物を意味する。薬剤製剤の単量体タンパク質または何らかの他の成分による凝集体またはオリゴマーの形成は、その単量体タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼし得、その結果、薬剤製剤の治療効力を喪失させる。さらに、単量体タンパク質を含有する薬学的組成物を注入系を用いて投与する場合には、凝集体またはオリゴマーの形成は、チューブ、メンブレンまたはポンプの閉塞のような他の問題を引き起こし得る。

用語「安定性」とは、抗ウイルス活性などのタンパク質活性および／またはタンパク質構造の相対的な時間的不変性を指し、当然、機能定義もある。用語「安定性」とは、本発明のインターフェロンの予備調製物の物理的安定性、化学的安定性およびコンホメーションの安定性（生物学的効果の維持を含む）も指す。タンパク質予備調製物の不安定性は、高次ポリマーを形成するためのタンパク質分子の化学分解もしくは凝集、脱グリコシル化、グリコシル化の修飾、酸化または本発明に含まれる単量体タンパク質の少なくとも１つの生物活性を低下させる何らかの他の構造修飾によって生じ得る。

「安定な」予備調製物とは、その中のタンパク質の、分解、修飾、凝集、生物活性の喪失などの程度が許容できるように制御され、その程度が経時的に許容されないほど大きくはならないものである。

用語「安定化（された）」とは、バルク単量体タンパク質または単量体タンパク質を含有する製剤に加えられる本明細書に開示される賦形剤の不在下で調製された単量体タンパク質または製剤と比べて、安定性の増大または／および維持を示す本発明の単量体タンパク質または単量体タンパク質を含有する製剤を指す。

本明細書において、用語「安定化すること」は、「タンパク質の凝集を低減または／およびは防止すること」および／または「タンパク質のオリゴマー化を低減または／および防止すること」および／または「凝集体の形成を低減または／防止すること」および／または「重合を低減および／または防止すること」および／または「酸化を低減および／または防止すること」および／または「ミセル形成を低減および／または防止すること」および／または「アミド分解を低減および／または防止すること」および／または「あらゆる種類のプロセスの、単量体タンパク質または単量体タンパク質を含有する製剤に対する悪影響を低減および／または防止すること」と同義的に使用される。

用語「単量体」または「単量体の」とは、単一のペプチド鎖しかもたない分子を指す。

本明細書において、用語「バルクタンパク質」または「タンパク質のバルク」または「バルク単量体タンパク質」または「単量体タンパク質のバルク」とは、製造工程の精製ステップを既に受けているが、販売用に最終的にパッケージングされ、流通される「最終剤形」（ＦＤＦ）または「薬学的組成物」を調製することができる最終製剤ステップをまだ受けていないタンパク質または単量体タンパク質の状態を指す。よって、本明細書において、組換えタンパク質のバルクとは、精製工程の終了時に得られる、最終製剤ステップを受ける前の製品であると考えられる。言い換えれば、本発明の方法は、バルク予備調製物を得ることを可能にする予備調製ステップを含み、さらなる賦形剤を加えた後、それから最終剤形または薬学的組成物が生成されると考えられる。通常、予備調製されたバルクまたは無調製バルクは、最終製剤を調製するまで保存されるが、必ずしもそうではない。バルクタンパク質を凍結状態で保存した場合、通常、解凍し、濾過した後、最終製剤ステップを受けるが、必ずしもそうではない。

タンパク質が組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ）である場合の本発明の特定の実施形態によれば、安定化用賦形剤を最終クロマトグラフィーステップの溶出液に加える。この最終クロマトグラフィーステップは、例えば、濾過ステップを受ける前か、または濾過ステップ直後のいずれかでの、本明細書では「ＳＥＣ−ＥＬ」または「ＳＥＣ−ＥＬ２」と称するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）であり得る（実施例参照）。この場合、ＳＥＣが精製手順の最終ステップに相当する。他の精製手順においては、他のクロマトグラフィー技術もしくは分離法を最終ステップに使用してもよいし、または最終精製ステップとして分離法に頼らない他の精製方法を適用してもよい。このことは、用語「バルクタンパク質」によって定義される本発明の範囲を決して限定するものではない。安定化用賦形剤を精製手順後に加える限り、どんな精製方法であっても、本発明に包含される。加えて、本発明に記載される安定化用賦形剤は、最終製剤（ＦＤＦ）にもさらに加えることができる。よって、ＦＤＦに含まれる賦形剤は、バルク予備調製物に加えられたものに相当し得るが、必ずしもそうではない。

本明細書において、「オリゴマータンパク質」または「オリゴマー」とは、２本以上のポリペプチド鎖を有するマルチサブユニットタンパク質を指す。「オリゴマータンパク質」は、そのユニットの２つ以上が同じポリペプチド鎖である場合のタンパク質を指すことがある。３つのタイプのオリゴマーは、少なくとも区別することができる。
・迅速可逆的非共有結合性小オリゴマー（二量体、三量体、四量体など）
・不可逆的非共有結合性オリゴマー
・共有結合性オリゴマー（例えば、ジスルフィド）

「多量体タンパク質」とは、いくつかのサブユニットで構成されているタンパク質を表す。「サブユニット」とは、多量体タンパク質を構成する同一または同一でないタンパク質分子の１つを指す。

「オリゴマー化」とは、より大きいか、またはより小さい分子からオリゴマーを作り出す化学プロセスを指す。「オリゴマー化」は、単量体または単量体の混合物をオリゴマーへと変換するプロセスともいわれている。用語「オリゴマー化」とは、非共有結合性または共有結合性相互作用による、個々のタンパク質分子の多量体の形成も指す。オリゴマー化は、可逆的である場合も不可逆的である場合もある。

用語「重合」とは、長いか、もしくは大きい分子を作製するために単量体の重複組合せによってポリマーを生成する化学反応または単量体もしくは単量体の混合物をポリマーへと変換するプロセスを表す。

用語「凝集」とは、主として小型種の非共有結合性接着による高分子量種の形成を指す。特にタンパク質の場合、凝集は、二次構造の非極性表面、例えば、分子内相互作用を通常形成するα−ヘリックスおよびβ−シートのものであり、タンパク質の内部に埋め込まれているものを分子間相互作用させ、かつ不溶性物質である場合もある多分子形態を形成させる変性の一形態である。用語「不溶性」と「可溶性」は、それぞれ「不可逆的」と「可逆的」と呼ばれることがある。また、凝集体は大オリゴマータンパク質会合（例えば、１０量体を上回る）と定義することもできる。「凝集体」は、非共有結合による場合には可逆的であり得る。

定義「凝集」、「凝集体」、「オリゴマー」、「多量体」、「オリゴマー化」、「多量体化」、「多量体」、「オリゴマーの」、「重合」がどんなものであろうとも、本発明は、それらの定義によって限定されるべきではない。よって、本発明の範囲は、それらの用語よって、またはそれらを取り巻くいずれの理論によっても、限定されるべきではない。重要な問題は、「凝集体」と「オリゴマー」が検出法（例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、通常、分離された識別可能なシグナルによって、例えば、分離したピーク；凝集体またはオリゴマーのいずれかに対応する各々のピークによって、互いに識別することができるということである。同じように、タンパク質の単量体形態も、正確な、特有の決まったピークに相当する。

用語「バッファー」または「生理学的に許容されるバッファー」とは、製剤中で製薬学的または獣医学的に使用しても安全であることが分かっており、かつ製剤のｐＨを製剤に望ましいｐＨ範囲に維持または調節する効果を有している化合物の溶液を指す。中酸性ｐＨにあるｐＨを中塩基性ｐＨへと調節するのに許容されるバッファーとしては、それだけには限らないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳおよびヒスチジンのような化合物が挙げられる。「ＴＲＩＳ」とは、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、その薬理学的に許容される塩をいずれも指す。好ましいバッファーとしては、生理食塩水または許容される塩を有する酢酸バッファーがある。

「等張化剤」とは、生理学的に許容され、製剤と接触している細胞膜を通る水の正味の流入量を抑えるために製剤に適した張性を付与する化合物である。グリセリンなどの化合物が既知濃度でこのような目的のために一般的に用いられている。他の適した等張化剤としては、それだけには限らないが、アミノ酸またはタンパク質（例えば、グリシンまたはアルブミン）、塩類（例えば、塩化ナトリウム）および糖類（例えば、デキストロース、マンニトール、スクロースおよびラクトース）が挙げられる。等張化剤はマンニトールであることが好ましい。

用語「抗酸化剤」とは、酸素または酸素由来のフリーラジカルが他の物質と相互作用するのを妨げる化合物を指す。抗酸化剤は、物理的および化学的安定性を高めるために製剤系に一般的に加えられる数多くある賦形剤の１つである。抗酸化剤は、酸素曝露の際またはフリーラジカルの存在下で一部の薬剤または賦形剤に起こる酸化プロセスを最小限に抑えるか、または遅延させるために加えられる。これらのプロセスは、多くの場合、光、温度、水素濃度、微量の金属または過酸化物の存在によって触媒され得る。薬物では、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、チオ尿素、メチオニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）が抗酸化剤としてよく用いられる。ＥＤＴＡナトリウムは、そうでなければ酸化反応を触媒する金属イオンをキレート化することによって、抗酸化剤の活性を増強することが分かっている。最も好ましい抗酸化剤はメチオニンである。本明細書では抗酸化剤を安定剤とも称する。

メチオニンは、その遊離塩基形態またはその塩形態のいずれかで存在し得る。メチオニンの立体異性体（すなわち、Ｌ、ＤまたはＤＬ異性体）はいずれも、メチオニンがその遊離塩基形態またはその塩形態で存在する限り、本発明の本方法または本製剤に使用できる。Ｌ−立体異性体を使用することが好ましい。メチオニンの類似体も本発明の本製剤に使用できる。用語「メチオニン類似体」とは、天然に存在するメチオニンの誘導体を指す。メチオニン類似体は、それらの遊離塩基形態またはそれらの塩形態のいずれかで本製剤に使用できる。

抗酸化剤（例えば、メチオニン）の添加による安定性の増大および／または維持は、濃度依存的に起こる。すなわち、本発明のインターフェロン−βを含有する製剤が、抗酸化剤不在下で酸化または凝集体／オリゴマーの形成を通常示す場合には、漸増濃度の抗酸化剤によってそのインターフェロン−β含有製剤の安定性が増大および／または維持される。酸化またはオリゴマー／凝集体の形成を低減するために本発明の本製剤に使用される酸化剤（例えば、メチオニン）の量は、当業者に一般的に知られる方法を用いて、必要以上に試験を行うことなく容易に決めることができる。

用語「静菌剤」とは、抗菌薬として作用させるために製剤に加えられる化合物または組成物を指す。保存される本発明のインターフェロン含有製剤は、商業的に実現可能な多目的製品であるために、防腐効果に関する法定または規制ガイドラインに対応するものであることが好ましい。静菌剤の例としては、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールが挙げられる。静菌剤はベンジルアルコールであることが好ましい。本明細書ではベンジルアルコールを安定剤とも称する。

用語「界面活性剤」とは、液体の表面張力を低下させるか、または２種類の液体間もしくは液体と固体間の界面張力を低下させる可溶性化合物を指し、表面張力は液体の表面に作用する力であり、表面積を最小化する傾向がある。界面活性剤は、低分子量の薬物やポリペプチドの送達はじめ、薬物の吸収または標的組織へのその送達を改変するために時折薬剤製剤に使用されてきた。界面活性剤はＴｗｅｅｎ ２０またはポロキサマーであることが好ましい。界面活性剤はポロキサマー１８８であることがより好ましい。界面活性剤はＴｗｅｅｎ（商標）２０であることがさらに好ましい。

用語「アミノ酸」とは、アミノ酸またはアミノ酸の組合せを指し、いずれの所与のアミノ酸もその遊離塩基形態またはその塩形態のいずれかで存在する。アミノ酸の組合せを使用する場合には、全てのアミノ酸がその遊離塩基形態で存在する場合もあり、全てがその塩形態で存在する場合もあり、または一部がその遊離塩基形態で存在し、その他のアミノ酸がその塩形態で存在する場合もある。本発明の本方法または本製剤に使用する好ましいアミノ酸としては、アルギニン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの荷電側鎖を有するものがある。アミノ酸はリジンおよびアルギニンであることがより好ましい。アミノ酸はリジンであることがさらに好ましい。特定のアミノ酸の立体異性体（すなわち、Ｌ、ＤまたはＤＬ異性体）はいずれも、またはこれらの立体異性体の組合せは、その特定のアミノ酸がその遊離塩基形態またはその塩形態で存在する限り、本発明の本方法または本製剤に使用できる。Ｌ−立体異性体を使用することが好ましい。これらの好ましいアミノ酸の類似体も本発明の本方法または本発明の製剤に使用してよい。用語「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸の誘導体を指す。適したアルギニン類似体としては、例えば、アミノグアニジンおよびＮ−モノエチルＬ−アルギニンが挙げられる。好ましいアミノ酸と同様に、アミノ酸類似体は、その遊離塩基形態またはその塩形態のいずれかで本方法または本製剤に使用される。本明細書ではアミノ酸を安定剤とも称する。

本発明の本方法または本製剤に使用されるアミノ酸は、治療効果のあるポリペプチドを種々のストレスから保護し、それによって単量体タンパク質または単量体タンパク質を含有する製剤の安定性を、単量体タンパク質の有効期間中（保存前、保存中、および保存後）増大および／または維持する。本明細書において、用語「ストレス」とは、それだけには限らないが、熱、凍結、ｐＨ、光、振動、酸化、脱水、表面、剪断、凍結／解凍、圧力、重金属、フェノール化合物、変性剤などを含む。用語ストレスとは、（単量体）タンパク質または（単量体）タンパク質を含有する製剤の安定性を調整する（すなわち、低下、維持または増大させる）いずれの因子も包含する。アミノ酸の添加による安定性の増大および／または維持は、濃度依存的に起こる。すなわち、本発明の単量体タンパク質または単量体タンパク質を含有する製剤が、アミノ酸不在下で凝集体またはオリゴマーの形成を通常示す場合には、漸増濃度のアミノ酸によって単量体タンパク質またはその単量体タンパク質を含有する製剤の安定性が増大および／または維持される。オリゴマーまたは凝集体の形成を低減し、それによって単量体タンパク質の安定性を増大し、その結果単量体タンパク質の全有効期間の間製剤の安定性を増大するために本発明の本方法または本発明の製剤に使用される特定のアミノ酸の量の決定は、注目する、いずれの特定の単量体タンパク質に対しても、当業者に一般的に知られている方法を用いて、必要以上に試験を行うことなく容易に決めることができる。

「凍結保存」とは、それまでは水性の単量体タンパク質調製物を０℃より低い温度、好ましくは、−２０℃以下、より好ましくは、−７０℃にて凍結し、維持することを指す。

「凍結／解凍サイクル」または「凍結／解凍操作」とは、タンパク質の凍結保存サンプルを使用するための公知の技術を指し、この技術では、サンプルの温度を、Ｒａｍｐｉｅを使用可能にするのに十分な時間、その水性状態を回復させるレベルまで上昇させ、その後０℃より低い温度に凍結し、好ましくは、温度−２０℃以下の温度、より好ましくは、−７０℃での凍結保存状態に戻す。

本発明の目的は、単量体タンパク質だけでなく、本発明のバルクタンパク質にさらに加えられる他の薬剤、成分または化合物の凝集プロセスおよびオリゴマー化プロセスの少なくとも両方（本発明はこれらのプロセスに限定されない）の影響を弱めることである。よって、本発明は、（例えば、オリゴマーならびに凝集体の形成を低減および／または抑制することにより）本発明のバルクに加えられ、問題のタンパク質の最終剤形または薬学的組成物に含まれる全ての化合物、薬剤（例えば、静菌剤、等張化剤）、タンパク質、界面活性剤、賦形剤に安定性を付与することができる。言い換えれば、（単量体）タンパク質にだけでなく、その（単量体）タンパク質を含有する製剤「全体」に安定性が付与される。凝集は、生物活性を損なう可能性があるだけでなく、中和抗体（ＮＡｂ）の発達を通じて注射部位反応や免疫原性をもたらす可能性もある。

本実施例は、バルク単量体タンパク質製剤に特定の賦形剤を添加することによって、凍結保存または／および反復凍結／解凍サイクル中のポリペプチド凝集体またはオリゴマーの形成が防止および／または阻害され、そのことにより単量体タンパク質製剤の安定性および溶解度が大幅に増大し得ることを明瞭に示している。さらに、本発明は、熱解離が（単量体）タンパク質または（単量体）タンパク質を含有する製剤を安定性を付与するのに効果的であることを示している。

本明細書において、用語「熱解離」とは、多量体形態のタンパク質が温度作用によって、小さい多量体形態または単量体形態に変換または解離される（例えば、指定の温度を受けたときにタンパク質の二量体が単量体に変換される）プロセスを指す。製剤中のタンパク質は、多様な多量体形態（二量体形態、三量体形態など）で存在する。よって、熱解離は、あらゆる多量体形態を小さい多量体形態または単量体形態に変換または解離するのに効果的である。本発明は、温度と多量体の解離との間に相関があることを示す。熱解離を受けた場合、製剤には、熱解離を受けなかったものと比べて、より少ない多量体形態とより多い単量体形態が含まれる。熱解離によって全ての多量体形態が単量体形態に変換されることが好ましい。温度は、固定温度にすぐに設定することができるし、または指定の温度が得られるまで徐々に上昇させることもできる。さらに、本発明は、熱解離の継続時間が（単量体）タンパク質または（単量体）タンパク質を含有する製剤を安定させるのに効果的であることを実証している。本発明は、熱解離の継続時間と化合体の解離との間に相関があることを示す。実施例では、熱解離は、主として熱解離の最初の数時間の間、継続時間が効果がなくなる時点に到達するまで効果的であることを示す。熱解離はタンパク質に特異的である。特定のタンパク質が最適な熱解離を成し遂げるのに適切な、温度や継続時間のようなパラメーターを設定することは、当業者ならば従来の技術を用いて容易に行うことができる。

当業者には、凝集、酸化、アミド分解、切断、表面吸着、表面変性、環状イムジド形成（ｃｙｃｌｉｃ ｉｍｄｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、末端切断などのような分解産物を決定する多数の分析手法が知られている。安定性を示す方法としては、それだけには限らないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）法（サンプル中または移動相中にＳＤＳ、グアニジウムＨＣｌまたは有機溶媒などの変性剤を含有または不含）、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ法、イオン交換ＨＰＬＣ法、電気泳動法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法、アフィニティークロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、還元剤によるジスルフィド還元法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、超遠心分析法、光散乱法、濁度アッセイおよびタンパク質濃度アッセイが挙げられる。構造安定性研究は、円偏光二色性、蛍光（固有の疎水性プローブ結合）、ＵＶ、ＦＴＩＲおよび／または示差走査熱量測定法によって行うことができる。よって、特定の賦形剤の、単量体タンパク質の凝集またはオリゴマー化に対する効果は、例えば、経時的な溶液中の可溶性単量体タンパク質の変化によって調べることができる。

サイズ排除ＨＰＬＣまたはゲル濾過クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーの別名でも知られるＳＥＣでは、孔径より小さな分子を保持しながら、より大きな分子を排除し、より早く溶出する多孔性マトリックスを備えたカラムが設計される。ほとんどの用途で定組成勾配が使用される。

ここで、本発明の種々の態様により本発明を説明する。

第１の態様では、本発明は、単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法であって、前記方法が、
ａ）バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給するステップと、
ｂ）バルクに
ｉ）静菌剤、
ｉｉ）界面活性剤、
ｉｉｉ）等張化剤、
ｉｖ）アミノ酸、
ｖ）抗酸化剤、
ｖｉ）等張化剤および抗酸化剤、
ｖｉｉ）等張化剤、抗酸化剤およびアミノ酸、
ｖｉｉｉ）アミノ酸および抗酸化剤、
ｉｘ）アミノ酸、抗酸化剤および界面活性剤、
ｘ）静菌剤および抗酸化剤、ならびに
ｘｉ）静菌剤、抗酸化剤および界面活性剤
からなる群から選択される賦形剤を加えるステップと
を含む方法を提供する。

賦形剤（類）またはそれらの組合せは、単量体タンパク質のバルクに加えることができるだけでなく、最終製剤（ＦＤＦ）時点でもさらに加えることができる。言い換えれば、賦形剤は、単量体タンパク質のバルクの種々の段階で、さらに製造工程の最終製剤ステップでも加えることができるが、単量体タンパク質のバルクに少なくとも１回加えることができる。単量体タンパク質はインターフェロンであることが好ましい。インターフェロンはＩＦＮ−βであることがより好ましい。ＩＦＮ−βはヒト組換えＩＦＮ−βであることがさらに好ましい。

タンパク質は、凝集またはオリゴマー化に対して安定化されることが好ましい。

静菌剤はベンジルアルコールであり、界面活性剤はＴｗｅｅｎ ２０であり、等張化剤はマンニトールであり、アミノ酸はリジンまたはアルギニンからなる群から選択され、かつ抗酸化剤はメチオニンであることが好ましい。賦形剤の好ましい組合せは以下のとおりである。
１．等張化剤がマンニトールであり、かつ抗酸化剤がメチオニンであり、
２．等張化剤がマンニトールであり、抗酸化剤がメチオニンであり、かつアミノ酸がリジンであり、
３．アミノ酸がリジンと抗酸化剤メチオニンであり、
４．アミノ酸がリジンと抗酸化剤メチオニンであり、かつ界面活性剤がＴｗｅｅｎ ２０であり、
５．静菌剤がベンジルアルコールであり、かつ抗酸化剤がメチオニンであり、または
６．静菌剤がベンジルアルコールであり、抗酸化剤がメチオニンであり、かつ界面活性剤がＴｗｅｅｎ ２０である。

加えて、バルクタンパク質は、バルク単量体タンパク質の熱解離に有利に働くよう指定の温度でインキュベートすることができる。温度範囲は２７℃〜３１℃であることが好ましい。温度は２９℃に設定することが最も好ましい。あるいは、上記の指定の温度に達するまで温度を徐々に上昇させる。インキュベーションは少なくとも３時間行われるか、または６時間〜４０時間の範囲で行われることが好ましい。インキュベーションは１５時間〜３０時間の範囲で行われるか、または１０時間、１６時間、１８．５時間または２４時間行われることがより好ましい。インキュベーションは２４時間行われることがさらに好ましい。インキュベーションは、本発明の第１の態様の予備調製段階前後に実施することができるが、これに限定されない。本発明の第１の態様に従って安定化された単量体タンパク質は、製造工程のいずれの段階においても、すなわち、最終製剤ステップでもインキュベートすることができる。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって得られる予備調製されたバルクタンパク質を提供する。

第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の、前記タンパク質のバルクの予備調製方法を含む、単量体タンパク質の安定性を増大および／または維持する方法を提供する。

ここで、本発明の好ましい実施形態により、特定の単量体タンパク質、インターフェロン、より好ましくは、ＩＦＮ−βを踏まえて、本発明を説明する。

本明細書において、「インターフェロン」または「ＩＦＮ」とは、文献においてそのようなものとして定義されるいずれの分子も含むものとし、例えば、上記の節「背景技術」で記載されるＩＦＮのいずれのタイプも含む。詳しくは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γは上記定義に含まれる。ＩＦＮ−βは本発明の好ましいＩＦＮである。本発明に従って適したＩＦＮ−βは、例えば、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ社）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ社）やＢｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）として市販されている。本発明に従って、ヒト起源のインターフェロンを使用することも好ましい。本明細書において、用語インターフェロンとは、その塩、機能的誘導体、変異体、類似体および活性断片を包含するものとする。

本明細書において、用語「インターフェロン−β（ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−β）」とは、生体液からの単離によって得られるような、または原核もしくは真核宿主細胞からＤＮＡ組換え技術によって得られるような、特にヒト起源の、線維芽細胞インターフェロン、ならびにその塩、機能的誘導体、変異体、類似体および活性断片を含むものとする。好ましくは、ＩＦＮ−βは、インターフェロンβ−１ａを意味するものとする。

本明細書において、用語「突然変異タンパク質」とは、天然ＩＦＮの１個以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されているか、または欠失しているか、あるいはＩＦＮの天然配列に１個以上のアミノ酸残基が付加されており、結果として生じる産物の活性には野生型ＩＦＮと比べて大きな変化がないＩＦＮの類似体を指す。これらの突然変異タンパク質は、公知の合成法により、および／または部位特異的突然変異誘発技術により、その結果適した他の公知の技術のいずれかによって調製される。好ましい突然変異タンパク質としては、例えば、Ｓｈｅｐａｒｄら（１９８１）やＭａｒｋら（１９８４）によって記載されているものが挙げられる。

このような突然変異タンパク質はいずれも、例えば、ＩＦＮと実質的に類似した活性、さらにはＩＦＮより優れた活性を有するのに十分なほど、ＩＦＮのアミノ酸配列と重複したアミノ酸配列を有することが好ましい。インターフェロンの生物学的機能については当業者に周知であり、また生物基準も確立されており、例えば、英国国立生物基準管理研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ｈｔｔｐ：／／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／ＮＩＢＳＣ）から入手可能である。

ＩＦＮ活性を測定するためのバイオアッセイについては記載されている。ＩＦＮアッセイは、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、１９８１により記載されているように行うことができる。よって、ルーチン試験により、所与の突然変異タンパク質がＩＦＮと実質的に類似した活性、さらにはＩＦＮより優れた活性を有しているかどうかを調べることができる。

本発明に従って使用できるＩＦＮの突然変異タンパク質、ひいては核酸コードとしては、当業者ならば、本明細書において示される教示および指針に基づき、必要以上に試験を行うことなく、日常的に得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドのような実質的に対応する配列の有限集団が挙げられる。

本発明に従って、突然変異タンパク質の好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。本発明のポリペプチドまたはタンパク質の保存的アミノ酸置換は、十分に類似した物理化学的性質を有する同義アミノ酸を１つのグループ内に含めることができ、グループのメンバー間で置換しても分子の生物学的機能は保存される。また、上記で定義される配列では、アミノ酸の挿入および欠失は、特に挿入または欠失が少数個のアミノ酸、例えば、３０個未満、好ましくは、１０個未満にしか関与せず、機能的コンホメーションに極めて重要なアミノ酸、例えば、システイン残基が除去または置換されない場合には、それらの機能を変更することなく行うことができるということは明らかである。このような欠失および／または挿入によって生じるタンパク質および突然変異タンパク質は、本発明の範囲に入る。

同義アミノ酸グループは、表Ｉに定義されるものであることが好ましい。同義アミノ酸グループは、表ＩＩに定義されるものであることがより好ましく、同義アミノ酸グループは、表ＩＩＩに定義されるものであることが最も好ましい。

本発明に用いるＩＦＮの突然変異タンパク質を得るために利用することができる、タンパク質におけるアミノ酸置換作成例としては、Ｍａｒｋらの米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらの第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの第４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらの第４，８７９，１１１号ならびにＬｅｅらの第５，０１７，６９１号に示されるようないずれの公知の方法ステップも含まれ、さらに米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）に示されるリジン置換タンパク質も含まれる。ＩＦＮ−βの具体的な突然変異タンパク質については、例えば、Ｍａｒｋら、１９８４により記載されている。

用語「融合タンパク質」とは、例えば、体液における滞留時間が長い、別のタンパク質と融合しているＩＦＮまたはその突然変異タンパク質を含むポリペプチドを指す。したがってＩＦＮは、別のタンパク質、ポリペプチドなど、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメントと融合している場合がある。

本明細書において、「機能的誘導体」とは、ＩＦＮ、ならびにそれらの突然変異タンパク質および融合タンパク質の誘導体を包含し、それらは、当分野で公知の方法によって、残基の側鎖として存在する官能基またはＮ末端基もしくはＣ末端基から調製でき、それらが依然として製薬上許容される限り、すなわち、それらがＩＦＮの活性と実質的に類似したそのタンパク質の活性を破壊せず、それを含有する組成物に毒性を付与しない限り、本発明に含まれる。これらの誘導体は、例えば、抗原部位をマスクし、体液におけるＩＦＮの滞留時間を延長できるポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの反応か、または第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイルもしくは炭素環式アロイル基）で形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分で形成された遊離ヒドロキシル基（例えば、セリルもしくはトレオニル残基のもの）のＯ−アシル誘導体が挙げられる。

本発明は、ＩＦＮまたは突然変異タンパク質および融合タンパク質の「活性画分」として、前記画分が対応するＩＦＮと比べて大きな活性の低下を示さないならば、単独か、または結合している関連分子もしくは残基（例えば、糖もしくはリン酸塩残基）とともにある、タンパク質分子のポリペプチド鎖のいずれかの断片または前駆体、あるいはタンパク質分子もしくは糖残基自体の凝集体を包含する。

本明細書において、用語「塩」とは、カルボキシル基の塩と上記タンパク質またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当分野で公知の方法によって形成することができ、それらとしては、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩または亜鉛塩など、および、例えば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成されるもののような有機塩基を含む塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸を含む塩および例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸を含む塩が例えば挙げられる。当然、このような塩はいずれも、本発明に関連するタンパク質（ＩＦＮ）の生物活性、すなわち、対応する受容体と結合し、受容体のシグナル伝達を開始する能力を保持するものでなければならない。

本発明に従って、組換えヒトＩＦＮ−βと本発明の化合物とを使用することがさらにとりわけ好ましい。

最近、特殊なインターフェロン変異体が記載された。いわゆる「コンセンサスインターフェロン」は、ＩＦＮの非自然発生変異体である（ＵＳ ６，０１３，２５３）。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の化合物を、コンセンサスインターフェロンと併用する。

本明細書において、ヒトインターフェロンコンセンサス（ＩＦＮ−ｃｏｎ）は、天然に存在するヒト白血球インターフェロンサブタイプ配列の主流であるＩＦＮ−αの一部に共通しているアミノ酸残基を主として含み、かつ、全てのサブタイプに共通しているアミノ酸が存在しない１箇所以上の位置に、その位置に主として現れるアミノ酸を含み、いかなる場合も、少なくとも１種類の天然に存在するサブタイプにおいてその位置に存在しないアミノ酸残基を含まない、非天然ポリペプチドを意味する。ＩＦＮ−ｃｏｎとしては、それだけには限らないが、米国特許第４，６９５，６２３号、第４，８９７，４７１号および第５，５４１，２９３号に開示されているＩＦＮ−ｃｏｎ１、ＩＦＮ−ｃｏｎ２およびＩＦＮ−ｃｏｎ３と呼ばれるアミノ酸配列を包含する。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記特許に記載されているように、または他の標準的な方法によって作製できる。

さらに好ましい実施形態では、融合タンパク質はＩｇ融合を含む。融合は、直接であってもよいし、または１〜３アミノ酸残基長くらい短いか、もしくはそれより長いアミノ酸残基長、例えば、１３アミノ酸残基長であり得る短いリンカーペプチドを介するものであってもよい。前記リンカーは、ＩＦＮの配列と免疫グロブリンの配列との間に導入される、例えば、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチドまたはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３−アミノ酸リンカー配列であり得る。得られた融合タンパク質は、体液における滞留時間（半減期）の延長、特定の活性の増大、発現レベルの増大または融合タンパク質の精製が容易になるなどの性質が向上し得る。

さらに好ましい実施形態では、ＩＦＮをＩｇ分子の定常領域と融合する。ＩＦＮは、例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域と融合されることが好ましい。Ｉｇ分子の他のアイソフォーム、例えば、アイソフォームＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃もしくはＩｇＧ₄、または例えば、ＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスも本発明の融合タンパク質の作製に適している。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロもしくはホモ多量体であり得る。

さらに好ましい実施形態では、機能的誘導体は、アミノ酸残基の１つ以上の側鎖として存在する、１つ以上の官能基に結合された少なくとも１つの部分を含んでなる。その部分はポリエチレン（ＰＥＧ）部分であることが好ましい。ペグ化は、公知の方法、例えば、ＷＯ９９／５５３７７に記載されているもののような既知の方法により行うことができる。

本発明は、概して、全ての種類のインターフェロンに、上記のものに、さらに、天然インターフェロン、組換えＤＮＡ技術によって作製されたインターフェロン、ならびに化学合成または修飾によって作製されたインターフェロンも含めて適用することができる。インターフェロンとは、ヒトまたはその他の適当な種の線維芽細胞、白血球、リンパ球またはその他のいずれかのインターフェロン含有組織もしくはインターフェロン産生組織由来の未精製インターフェロン、半精製インターフェロンおよび精製インターフェロンを包含することも意味する。本発明をヒト線維芽細胞インターフェロン（インターフェロン−β）に適用できることが最も好ましい。

予備調製物中のＩＦＮ−βの濃度は、１０μｇ／ｍｌあたり〜２０００μｇ／ｍｌあたりであることが好ましく、１００μｇ／ｍｌあたり〜１０００μｇ／ｍｌあたりであることがより好ましく、５００μｇ／ｍｌあたりまたは８１０μｇ／ｍｌあたりであることが最も好ましい。

バッファーは、前記組成物のｐＨを指定ｐＨ±０．５単位内に維持するのに十分な量で存在することが好ましく、この場合の指定ｐＨは約３．５〜約５．５である。ｐＨは３．８、４．２または４．７であることがより好ましい。ｐＨは４．７であることがさらに好ましい。バッファーは、濃度５ｍＭあたり〜５００ｍＭあたりで存在することが好ましい。溶液全体でのバッファーの濃度は、５ｍＭ、９．５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭあたりで変化し得る。バッファーの濃度は１０ｍＭあたりまたは５０ｍＭあたりであることが好ましくい。酢酸イオンが５０ｍＭあたりでｐＨ４．７のバッファーが特に好ましい。バッファーは好ましい対イオンがナトリウムまたはカリウムイオンである酢酸バッファーであることが好ましい。酢酸塩バッファーについては当分野で周知である。

等張化剤（例えば、マンニトール）の濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌあたり〜５００ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。等張化剤の濃度は５５ｍｇ／ｍｌあたりであることがより好ましい。等張化剤の濃度は、１５０ｍＭあたりまたは３００ｍＭあたりまたは６００ｍＭあたりであることがさらに好ましい。

界面活性剤（すなわち、Ｔｗｅｅｎ ２０）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌあたり〜１０ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。界面活性剤の濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌあたりであることがより好ましい。

抗酸化剤（例えば、メチオニン）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌあたり〜５．０ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。抗酸化剤の濃度は、０．１２ｍｇ／ｍｌあたりまたは０．２４ｍｇ／ｍｌあたりであることがより好ましい。

アミノ酸はリジンまたはアルギニンであることが好ましい。より好ましくは、アミノ酸はリジンであることがより好ましい。アミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）の濃度は、２０ｍｇ／ｍｌあたり〜２００ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。リジンの濃度は、２７ｍｇ／ｍｌあたりまたは５５ｍｇ／ｍｌあたりまたは８２ｍｇ／ｍｌあたりまたは１６４ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。アルギニンの濃度は、３２ｍｇ／ｍｌあたりまたは６３ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましくい。

静菌剤（例えば、ベンジルアルコール）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌあたり〜２００ｍｇ／ｍｌあたりであることが好ましい。静菌剤の濃度は、約５ｍｇ／ｍｌあたりまたは１０ｍｇ／ｍｌあたりであることがより好ましい。

本明細書において引用される全ての参考文献（学術論文もしくは抄録、公開もしくは非公開の米国もしくは外国特許出願、発行された米国もしくは外国特許またはその他の参考文献を含む）は、引用された参考文献において示される全てのデータ、表、図および文章を含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される参考文献で引用されている参考文献の全ての開示内容もまた参照により完全に組み込まれる。

公知の方法ステップ、従来の方法ステップ、公知の方法または従来の方法を参照することで、本発明の態様、説明または実施形態のいずれもが、関連技術において開示、教示または示唆されていると理解してはならない。

前述の具体的な実施形態の説明は、他の人も、当分野の技術（本明細書において引用される参考文献の開示内容を含む）の範囲内で知識を応用することにより、必要以上に試験を行うことなく、本発明の一般的概念を逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を種々の用途に向けて改変し、かつ／または適合させることが容易であるという本発明の一般的性質を極めて十分に示している。よって、そのような適合および改変は、本明細書において示される教示および指針に基づいて、開示された実施形態の一連の等価物という意味の範囲内であるものとする。当然のことながら、本明細書における表現または技術用語は、説明することを目的としており、限定することを目的とはしていない。よって、本明細書の技術用語または表現は、当業者により、本明細書において示される教示および指針に照らし、当業者の知識も合わせて、解釈されるべきである。

次の実施例において使用する分析手法については、実施例６に記載する。

実施例１−バルク−インターフェロン安定化に対するインキュベーション温度とインキュベーション時間の効果（熱解離）
バルクインターフェロン−βの安定に対する解凍温度、インキュベーション温度およびインキュベーション時間（継続時間）の効果を評価するために以下の試験を実施した。その目的は、製造工程中にインターフェロンオリゴマーおよび／またはインターフェロン凝集体の形成を効果的にかつ一貫して低減することであった。以下の試験は、主として、最初に解凍した後、最終的にインキュベートするか、またはさらなる製造処理のために所与温度にて所与時間保存される凍結保存バルクインターフェロン調製物（０℃より低い温度、例えば、−２０℃または−７０℃で保存された調製物）に適用される。これらの試験より得られた考察は、０℃より高い温度で保存された（例えば、２〜８℃）ために解凍段階（または温度変化）を受けていないが、他の種類のストレスを受けているかもしれない調製物にも当てはまる。本明細書において、用語「レスティング」とは、（例えば、インキュベーター、バスまたはその他の場所で）解凍された後、所与温度にて所与時間（例えば、インキュベーター、バスまたはその他の場所で）保存されている凍結調製物を指し、用語「レスティング温度」とは、解凍温度とインキュベーション温度の両方を指す。凍結調製物を直接インキュベーターに入れる場合には、用語「インキュベーション温度」または「レスティング温度」は、同義的に使用することができる。用語「レスティング時間」とは、解凍期間と指定の温度での保存期間（例えば、インキュベーション期間）の合計を指す。凍結調製物を直接インキュベーターに入れる場合には、用語「インキュベーション時間」または「レスティング時間」は、同義的に使用することができる。

１．ａ 種々の温度における小実験室規模熱解離試験
第１の試験では、室温（ＲＴ）、２５℃、２７℃または２９℃のいずれかの解凍温度、続いての２５℃、２７℃または２９℃のいずれかでの合計１６時間または２４時間のインキュベーションについての効果を試験した。この試験は、温度設定に支障をきたさず、そのようにして全手順を通じて安定を維持するように入念に計画されている。表４ならびに図１により手順を要約する。インターフェロンオリゴマーとインターフェロン凝集体のレベルは、新規ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法により測定した。この新規ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法を本明細書ではＮＥＷ ＳＥＣと称する。このＮＥＷ ＳＥＣ法では、非共有結合性オリゴマーと共有結合性オリゴマーの両方を定量的にも定性的にも検出することができる。本目的は、次のパラメーターまたは変数によってオリゴマー化および／または凝集を低減して、製剤の調製まで最小限にとどめる（損傷修復）ために、バルクインターフェロンの熱解離（ＴＤ）を最適化することであった。
１）熱解離効率へのインキュベーション温度（２５℃、２７℃および２９℃）の効果、
２）熱解離効率へのインキュベーション時間の効果、
３）インキュベーターでの解凍による解凍期間の短縮。

対照はＲＴにて１回だけ実施し、試験設定１については２回実施し、試験設定２については３回実施した。各条件では、小規模モデル（「新鮮な」バルクインターフェロン１．８ｍｌを入れたｎｕｎｃ社製２ｍｌ試験管、「挿入用試験管モデル」）を備えた２５０ｍｌ試験管１本を使用した。インキュベーターは、ウォータージャケット式かまたは空気循環式のものである。

用語解説／略語
Ａｇｇ 凝集体
ＣＯＡ 分析証明書
Ｄｉｍ 二量体
Ｄｅｇ 分解生成物
ＦＤＦ 最終剤形
Ｆ／Ｔ 凍結解凍
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ）
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ最終剤形（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ）
ＳＥ−ＨＰＬＣ サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＳＡＢ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８
Ｔｅｍｐ． 温度

１．Ｎｅｗ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法の装置と材料：
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ
ＵＶ検出器：Ｗａｔｅｒｓ社製９９６ ＰＤＡ 波長２１４ｎｍ
自動サンプル採取装置 温度設定：４℃
カラムＴｏｓｏＨａａｓ社製 ＴＳＫ Ｇ２０００ ＳＷ_XL
カラム温度：室温
移動相：５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ３．８
ＮａＣｌ ５．８４グラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ３．８バッファー２リットルに溶かして調製した。酢酸バッファーは、酢酸をＷＦＩに加え、１０Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ−３．８まで滴定することによって滅菌溶液単位で調製した。
流速：０．５ｍＬ／分
注入量：２００μＬ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク ０．３４〜０．３６ｍｇ／ｍＬ。
試薬：
酢酸、Ｍｅｒｃｋ社コードＫ３１３５８０５６
ＮａＯＨ、Ｍｅｒｃｋ社製Ｂ１９７５８２
ＮａＯＨ １０Ｍ溶液
ＷＦＩ
ＮａＣｌ、ＪＴ ＢＡＫＥＲ社コード３６２７−０７

２．手順−手順は図１に示される
１）新鮮なｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク１．８ｍｌをｎｕｎｃ社製２ｍｌ試験管に入れ、水２００ｍｌの入った２５０ｍｌ試験管内で−７０℃にて凍結した。
２）３本の試験管をＲＴにて解凍し、２５℃、２７℃および２９℃にて別々に有効なインキュベーターで（経時的に一定温度の、安定したインキュベーター）内で合計１６時間インキュベートした。解凍後と１６時間（解凍＋インキュベーション）後にＮＥＷ ＳＥＣによる試験を行うため、それらの試験管からサンプル採取した。
３）３本の試験管をＲＴにて解凍し、２５℃、２７℃および２９℃にて別々に有効なインキュベーターで合計２４時間インキュベートした。解凍後と２４時間（解凍＋インキュベーション）後にＮＥＷ ＳＥＣによる試験を行うため、それらの試験管からサンプル採取した。
４）３本の試験管を２５℃、２７℃および２９℃にて別々に解凍し、有効なインキュベーターで合計１６時間インキュベートした。解凍後と１６時間（解凍＋インキュベーション）後にＮＥＷ ＳＥＣによる試験を行うため、それらの試験管からサンプル採取した。
５）３本の試験管を２５℃、２７℃および２９℃にて別々に解凍し、有効なインキュベーターで合計１６時間インキュベートした。１６時間（解凍＋インキュベーション）後にＮＥＷ ＳＥＣによる試験を行うため、それらの試験管からサンプル採取した。−インキュベーターで解凍後のサンプル採取は行わなかった。
６）３本の試験管を２５℃、２７℃および２９℃にて別々に解凍し、インキュベーターで合計２４時間インキュベートした。２４時間（解凍＋インキュベーション）後にＮＥＷ ＳＥＣによる試験を行うため、それらの試験管からサンプル採取した。−インキュベーターで解凍後のサンプル採取は行わなかった。
７）１本の試験管をＲＴにて１６時間解凍し、２〜８℃にて最大７２時間保存した。−ＮＥＷ−ＳＥＣ用にその試験管からサンプル採取して、この試験の対照とした。
８）前記分子への効果を評価するため、選択した条件で試験を繰り返した。インキュベートしたサンプルをＮＥＷ ＳＥＣ、ＩＥＦ、ＱＵＡＮＴ−ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、バイオアッセイ、ＤＥＧ／ＯＸ ＨＰＬＣ、ＣＺＥにより試験した。結果をＲＴにて１６時間解凍し、２〜８℃にて保存した対照サンプルと比較した。

３．結果：％Ｍｏｎまたは％単量体＝ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ単量体の割合％
％Ａｇｇ＝ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ凝集体の割合％

・ＲＴでの解凍と合計１６時間のインキュベーション
挿入物の入った３×２５０ｍｌ試験管を−７０℃にて凍結し、ＲＴにて解凍した。それらの試験管を２０回ゆっくりと反転し、それらからサンプル採取し、すぐに３台のインキュベーター（２５℃、２７℃および２９℃）に合計１６時間（解凍＋インキュベーション）入れた。サンプルは、ＮＥＷ ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで２〜８℃にて保存した。結果を表５に示す。

・ＲＴでの解凍と合計２４時間のインキュベーション
挿入物の入った３×２５０ｍｌ試験管を−７０℃にて凍結し、ＲＴにて解凍した。それらの試験管を２０回ゆっくりと反転し、それらからサンプル採取し、すぐに３台のインキュベーター（２５℃、２７℃および２９℃）に合計２４時間（解凍＋インキュベーション）入れた。サンプルは、ＮＥＷ ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで２〜８℃にて保存した。結果を表６に示す。

・インキュベーターでの解凍と合計１６時間のインキュベーション
挿入物の入った３×２５０ｍｌ試験管を−７０℃にて凍結し、３台のインキュベーター（２５℃、２７℃および２９℃）内で別々に解凍した。解凍後、それらの試験管を２０回ゆっくりと反転し、合計１６時間（解凍＋インキュベーション）インキュベートした。サンプルは、ＮＥＷ ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで２〜８℃にて保存した。結果を表７に示す。

・インキュベーターでの解凍と合計２４時間のインキュベーション
挿入物の入った３×２５０ｍｌ試験管を−７０℃にて凍結し、３台のインキュベーター（２５℃、２７℃および２９℃）内で別々に解凍した。それらの試験管を２０回ゆっくりと反転し、ＮＥＷ ＳＥＣ ＨＰＬＣ用にサンプル採取し、合計２４時間（解凍＋インキュベーション）インキュベートした。サンプルは、ＮＥＷ ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで２〜８℃にて保存した。反復試験は別の日に行った−解凍後の試験管からのサンプル採取は行わなかった。結果を表８ａおよび８ｂに示す。

４．結論：
上記試験から次の事項を示すことができる。
・インキュベーション温度の上昇とインキュベーション時間の延長により熱解離効率が上昇する。
・インキュベーター内で解凍した場合、ＲＴで解凍した場合と比べて解凍時間は短縮され、その結果、単量体レベルが上昇する。
・２５℃、２７℃および２９℃にて２４時間までの解凍とインキュベーションは、以下によれば、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ分子に対して何の悪影響も及ぼさなかった。ルーチンＳＥＣ ＨＰＬＣ、Ｄｅｇ／Ｏｘ ＨＰＬＣ、ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、バイオアッセイおよびＣＺＥ。

上記試験は、事前に凍結保存したバルクインターフェロンのレスティング温度とレスティング時間を調整することにより、オリゴマー化の低減に関して有意義な結果が得られることを証明している。

調製物をどのように解凍するかには関係なく（例えば、ＲＴで解凍しても、インキュベーター内で解凍しても）、ある程度までは、レスティング温度を上げることにより、インターフェロン単量体レベルにおいて有益な結果が得られる。このように、レスティング温度とタンパク質単量体レベルとの間には相関がある；レスティング温度を２５℃〜２９℃に上げると、タンパク質単量体レベルが増加することになる。最良の結果は、バルク溶液を温度２９℃に設定した場合に得られる。バルク溶液は、インキュベーション温度２９℃にてインキュベーターに入れることが好ましい。インキュベーション温度の比較では、２５℃〜２９℃で単量体の約５〜６％増加が観察される。好ましくは、凍結調製物を直接インキュベーターに入れ、インキュベーション前にＲＴで解凍しない（そのためにインキュベーター内で解凍が起こる）ことが好ましい。また、結果から、解凍したバルクインターフェロンを１０時間インキュベートすることで、すでに、得られる単量体の割合％が９５％を超えていることも分かる。ＲＴでの解凍では、試験したインキュベーション時間は１０時間または１８．５時間いずれかであった。インキュベーターで解凍した場合に、試験したインキュベーション時間は１６時間または２４時間いずれかであった。

また、レスティング時間もオリゴマー化に影響を及ぼす因子である。レスティング条件には関係なく（例えば、ＲＴで解凍した後にインキュベートしても、直接インキュベートしても）、レスティング時間と単量体レベルとの間には相関がある；レスティング時間が長くなるほど、タンパク質単量体レベルが増加する。最良の結果は、レスティング時間２４時間の場合に得られる。レスティング時間の比較では、レスティング時間１６時間〜２４時間で単量体の約３％増加が達成される。凍結調製物のレスティング時間は２４時間であることが好ましい。より好ましくは、凍結調製物を直接、インキュベーション時間（レスティング時間）２４時間にてインキュベーターに入れる（インキュベーター内で解凍が起こる）。

２種の変数（レスティング時間とレスティング温度）を組み合わせても、単量体の約９％増加が達成される。それらの結果は、インキュベートした製剤をインキュベートしなかったものと比較した場合にさらに顕著である。調製物を解凍（インキュベートなし）直後に分析する場合には、７７．４８％Ｍｏｎが得られ、一方、凍結調製物を直接、インキュベーション温度２９℃にてインキュベーション時間２４時間インキュベートする場合には９７．９％Ｍｏｎが得られる。このように、２種の変数を最適化することにより単量体レベルに２０％の差が生じる。バルクインターフェロンは、レスティング温度２９℃、レスティング時間２４時間に設定することが好ましい。より好ましくは、前記バルクインターフェロンを直接、２９℃にてインキュベーション時間２４時間インキュベートする（インキュベーター内で解凍が起こる）（最良の結果では９７．９％Ｍｏｎが得られる）。

結論として、レスティング時間とレスティング温度、好ましくは、インキュベーション温度とインキュベーション時間は、バルクインターフェロン予備調製物または製剤の安定性の維持および／または増大に大きく貢献する重要な因子である。

１．ｂ 種々のＦ／Ｔサイクルを用いた２９℃における実験室規模熱解離試験
この研究報告では、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ製剤原料における二量体レベルおよび凝集体レベルへの、２９℃でのインキュベーションの効果を評価する。

１．手順：
ａ．ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクサンプルの分析にはＮＥＷ−ＳＥＣ法を用いた。バルクサンプルは、解凍後２９℃にて１５時間または３時間インキュベートし、それらのサンプルには表９に示すような種々のＦ／Ｔサイクルを行った。Ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ バルクを７本のｃｏｒｎｉｎｇ社製１５ｍｌ試験管に入れた（各試験管に０．９ｍｌ）。それらの試験管を−７０℃にて凍結した。また、ＩＦＮ−β−１ａバルク（事前に凍結解凍したもの）も２本のｃｏｒｎｉｎｇ社製２５０ｍｌ試験管に入れ（各試験管に２００ｍｌ）、それらの試験管を−７０℃にて凍結した。

ｂ．ＩＦＮ−β−１ａバルクをインキュベートすることのその分子への効果を評価するため、インキュベートしたバルク（１Ｆ／Ｔ後）を以下の方法により試験した。Ｄｅｇ／Ｏｘ−ＨＰＬＣ、ＩＥＦ、ＥＳ−ＭＳ、Ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ、ＣＺＥ。
ｃ．さらに、実験室規模Ｆ／Ｔ×１での熱解離速度についても行った。２５０ｍｌ試験管中のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクのアリコートを、Ｆ／Ｔ×１後に１５ｍｌ試験管に入れ、インキュベーターで２９℃にてインキュベートした。

２．結果：
１）室温にて解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク（１Ｆ／Ｔ）のインキュベーションにより、単量体レベルは８２．８％から９７．５７％へと増加し、凝集体レベルは０．７％から０．２％へと低減した（表１０参照）。２９℃にて（インキュベーター）１５時間のインキュベーションは、二量体の解離に効果がある。
２）バスで解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクのインキュベーションにより、単量体レベルは８２．８％から９６．７％へと増加したが、凝集体レベルも０．７％から１．９７％へと増加した（表１０参照）。

３）室温にて解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク（４ＦＴ）の３時間のインキュベーションにより、単量体レベルは、二量体レベルが低減したことから８２．３％から８９．５％へと増加した（表１１および図２参照）。
４）室温にて解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク（４ＦＴ）の１５時間のインキュベーションにより、単量体レベルは、二量体レベルが低減したことから８２．３％から９３．７％へと（３時間インキュベーションと比べて）さらに増加した（表１１および図２参照）。
５）バスで解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクのインキュベーションにより、単量体レベルは、二量体レベルが低減したことから８２．３％から９４．７％へと増加した（表１１および図２参照）。

６）室温にて解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクサンプル２００ｍｌのインキュベーションにより、単量体レベルは７３％から９１．２％へと増加し、凝集体レベルは３．９％から２．９％へと低減した（表１２および図３参照）。

７）インキュベートしたｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクサンプル（０．９ｍｌ，１Ｆ／Ｔ）を、ＲＴにて解凍し、４℃にて保存した対照サンプルとともに、以下の試験により分析した（表１３参照）：
Ｄｅｇ／Ｏｘ−ＨＰＬＣ−インキュベートしたサンプルでは、対照サンプル（４℃にて保存）と比べて酸化レベルの上昇は見られなかった
ＥＳ−ＭＳ −インキュベートしたサンプルでは、炭水化物レベルにおいて対照サンプルとの差は認められなかった
Ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ−濃度では大きな差は認められなかった
ＣＺＥ−同一エレクトロフェログラムプロフィールが得られた
ＩＥＦ−循環水バスで解凍したｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ Ｆバルクサンプルは、ｐＩ−７付近にさらなるバンドを示した。対照サンプルと、ＲＴにて解凍し、１５時間インキュベートしたサンプルは、特性に一致した。

室温で解凍した後の１５時間は、Ｄｅｇ／ｏｘ ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、Ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ ＣＺＥおよびＩＥＦによって判断されるように、ＩＦＮ−β−１ａ分子のパラメーターに影響しない。
８）Ｆ／Ｔ×１での熱解離速度についての結果を、表１４および図４〜６に示す。

３．結論：
１）室温にて解凍後にｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａサンプルを２９℃にて１５時間インキュベートすることにより、オリゴマー化（主として二量体）レベルが大幅に低減した。
２）バスで２９℃にて解凍後にｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａサンプルを２９℃にて１５時間インキュベートすることにより、オリゴマー化レベルが大幅に低減した。
３）使用した分析手法に基づいて、Ｄｅｇ／ｏｘ ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、Ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ ＣＺＥおよびＩＥＦによって判断されるように、ＲＴにて解凍後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクの２９℃にて１５時間のインキュベーションは、ＩＦＮ−β−１ａ分子のパラメーターに対して悪影響を及ぼさなかった。非共有結合性オリゴマーの解離に効果的であるが、全ての非共有結合性オリゴマーが解離するわけではない（２５０ｍｌ試験管では４％非共有結合性オリゴマーは解離しない）。２５０ｍｌ試験管中の％単量体は、９４％（２９℃９時間のインキュベーション）に達し、小型試験管では９７．５７％（２９℃１５時間のインキュベーション）に達する。オリゴマーは熱解離直後に平衡に達した（表および図参照）。１５ｍｌ試験管における２９℃での熱解離は１５時間後に完了する。要約すれば、本試験（１．ａおよび１．ｂ）は、特定の温度と期間（すなわち、レスティング温度とレスティング時間またはインキュベーション時間とインキュベーション温度）によって具体化される熱解離が（単量体）タンパク質またはその（単量体）タンパク質を含有する製剤の安定性の維持および／または増大に極めて重要であることを証明している。インターフェロン−βの熱解離速度からは、１ Ｆ／Ｔサイクルでの熱解離では、３時間経過しただけで９０％Ｍｏｎが得られ、その熱解離は６時間後にほぼ完了して、１５時間時点には「プラトーに達する」ことがさらに分かる。熱解離は少なくとも３時間行われることが好ましい。インターフェロン−βの熱解離期間（レスティング時間またはインキュベーション時間）を６時間〜４０時間の範囲に設定することがより好ましい。インターフェロン−βの熱解離期間を１５時間〜３０時間の範囲に設定するか、または１０時間、１６時間、１８．５時間もしくは２４時間に設定することがさらに好ましい。インターフェロン−βの熱解離期間は２４時間であることがさらに好ましい。インキュベーションまたはレスティング温度は、２７℃〜３１℃の範囲に設定することが好ましい。前記温度は２９℃であることがより好ましい。熱解離速度についての結果を１ Ｆ／Ｔ後に得たが、当業者ならば、従来の技術を用いて、数多くのＦ／Ｔサイクルを経た後（例えば、２Ｆ／Ｔ、４Ｆ／Ｔもしくは１１Ｆ／Ｔ後；または他の種類のストレスを受けた後）に、場合によっては任意のインターフェロン−β（例えば、ｒ−ｈ インターフェロン−β １ａ）または任意の単量体タンパク質の製造工程全体またはそのいずれの部分でも熱解離速度を容易に決定し得る。そのようなものとして、本発明は、特定のインキュベーション時間または期間（またはレスティング時間）に限定されるべきではない。同様に、当業者ならば、従来の技術を用いて、１回以上のＦ／Ｔサイクル後（または他の種類のストレスを受けた後）に、場合によっては任意のインターフェロン−β（例えば、ｒ−ｈ インターフェロン−β １ａ）または任意の単量体タンパク質の製造工程全体またはそのいずれの部分でも最適なインキュベーション温度（またはレスティング温度）を容易に決定できる。そのようなものとして、本発明は、特定のインキュベーション温度（またはレスティング温度）に限定されるべきではない。

実施例２：バルクインターフェロンへの賦形剤の添加によるインターフェロン−βの安定化
これらの試験は、アミノ酸、静菌剤、界面活性剤および等張化剤のような数種類の賦形剤によって示される、バルクｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａに対する、オリゴマー化および凝集という観点からの保護効果を検証するために行った。以下の研究は、バルクｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ予備調製物にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えずに行った。

１．０ 用語解説／略語
Ａｇｇ 凝集体
ＣＯＡ 分析証明書
Ｄｉｍ 二量体
Ｄｅｇ 分解生成物
ＦＤＦ 最終剤形
Ｆ／Ｔ 凍結解凍
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ）
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ最終剤形（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ）
ＳＥ−ＨＰＬＣ サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＳＡＢ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８
Ｔｅｍｐ． 温度

２．０ 序文
本研究は、安定化したバルクインターフェロン−βを提供するために、ＳＥＣ−ＥＬ画分からＦＤＦの保存までの製造段階中のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化の最小化に着目した。

ストレス（例えば、Ｆ／Ｔ）によって生じるオリゴマー化の最小化を以下により行った。
１．賦形剤および／または他の安定剤を加え、ＨＡＳを加えないで、バルクを予備調製すること。
２．予備調製したバルクにおけるオリゴマー化に対する保存温度（−２０℃、−７０℃および２〜８℃）の効果を評価すること。

予備調製したバルクサンプルをＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した。

３．０ 目的／範囲
バルク処理中のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化を最小化すること。

４．０ 装置と材料
４．１ 装置
０．２μフィルターユニットＰ／Ｎ ＭＰＧＬ０２５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製
Ｍｉｌｌｅｘ シリンジフィルター、０．２μ−Ｐ／Ｎ ＳＬＧＶ０２５ＬＳ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製
２５０ｍｌ遠心分離用円錐型試験管−Ｃｏｒｎｉｎｇ社製
１．８ｍｌ凍結用試験管−Ｎｕｎｃ社製
４．２ 材料
ａ．ＳＥＣ ｅｌ２画分
ｂ．Ｄ−マンニトール ＤＡＢ、Ｐｈ Ｅｕｒ，ＢＰ，ＵＳＰ，ＦＣＣ，Ｅ４２１（コード１．０５９８０，Ｍｅｒｃｋ社製）
ｃ．氷酢酸 １００％（コード１．０００６３、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｄ．水酸化ナトリウム １０Ｍ
ｅ．ポロキサマー１８８（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ ６８ ＤＡＣ，ＵＳＰ／ＮＦ，Ｂａｓｆ），５１６３３１５
ｆ．Ｌ−メチオニン（１．０５７０７、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｇ．ベンジルアルコール Ｐｈ Ｅｕｒ，ＢＰ，ＮＦ（コード１．００９８７、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｈ．Ｌ−アルギニン一塩酸塩（コード１．０１５４４、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｉ．Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ Ｐｈ Ｅｕｒ，ＮＦ（コード８．１７０７２、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｊ．リジン（コード１．０５７０１、Ｍｅｒｃｋ社製）
ｋ．ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ ０．４８〜０．５ｍｇ／ｍｌまたは０．０８８ｍｇ／ｍｌ
ｌ．酢酸バッファー ｐＨ３．８ ５０ｍＭまたは１０ｍＭ
安定剤：
アミノ酸：
１．アルギニン ３１．６ｍｇ／ｍｌ
２．リジン ２７．４ｍｇ／ｍｌ
３．メチオニン ０．１２ｍｇ／ｍｌ（抗酸化剤）
界面活性剤：
１．Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５ｍｇ／ｍｌ
２．ポロキサマー１８８（プルロニックアシッド（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ））０．５ｍｇ／ｍｌ
静菌剤：
１．ベンジルアルコール ５ｍｇ／ｍｌ
等張化剤：
１．マンニトール ５４．６ｍｇ／ｍｌ

５．０ 手順
本研究をＳＥＣ−ＥＬ２画分において行った。
本研究のスキーム概要を図７（図７−１及び図７−２）に示す。
種々の予備調製条件を表１５および１６に示す。

６．１ 溶液の調製
６．１．１ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８（ＳＡＢ）１リットルの調製
ＷＦＩ １０００ｍｌに氷酢酸３．００３グラムを加え、５分間混合した。
水酸化ナトリウム １０Ｍ 約０．５６ｍｌを加えて、ｐＨ−３．８に調整し、その溶液を５分間混合し、その溶液から伝導度を得るためにサンプル採取し、０．２μフィルターで濾過した。製造工程中の製剤原料の容器表面への吸着を防止するために、ポロキサマー１８８（またはプルロニック Ｆ−６８）を０．１％レベル（臨界ミセル濃度）で予備調製物に含める。それよりも濃度が高くなると製品の安定性に悪影響を及ぼす（酸化が高まる）可能性があり、それよりも濃度が低くなると吸着を制限する効果がなくなる可能性がある。

６．１．２ 次の溶液１リットルを調製した。
１．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、１０ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール
６．１．１の場合と同様に、ベンジルアルコール１０グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
２．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール
６．１．１の場合と同様に、ベンジルアルコール５グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
３．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、６３．２ｍｇ／ｍｌアルギニン
６．１．１の場合と同様に、アルギニン６３．２グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
４．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン
６．１．１の場合と同様に、アルギニン３１．６グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
５．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、５４．８ｍｇ／ｍｌリジン
６．１．１の場合と同様に、リジン５４．８グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
６．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン
６．１．１の場合と同様に、アルギニン３１．６グラムを加えた後、水酸化ナトリウムを加えた。
７．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、６００ｍＭマンニトール
ＷＦＩ ０．９２６ｋｇに氷酢酸３．００３グラムを加え、その溶液を５分間混合した。その溶液にマンニトール１００．３グラムを加え、５分間混合した。水酸化ナトリウム １０Ｍ 約０．５６ｍｌを加えて、ｐＨ−３．８に調整し、その溶液を５分間混合し、その溶液から伝導度を得るためにサンプル採取し、０．２μメンブレンで濾過した。
８．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３００ｍＭマンニトール
ＷＦＩ ０．９６６ｋｇに氷酢酸３．００３グラムを加え、５分間混合した。マンニトール５５．１グラムを加え、５分間混合した。水酸化ナトリウム １０Ｍ 約０．５６ｍｌを加えて、ｐＨ−３．８に調整し、その溶液を５分間混合し、その溶液から伝導度を得るためにサンプル採取し、０．２μフィルターで濾過した。

６．１．３ 次の溶液１リットルを調製した。
１．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムを加えた。
２．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌポロキサマー１８８
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとポロキサマー１８８ ５０グラムを加えた。
３．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとＴｗｅｅｎ ２０ ５グラムを加えた。
４．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムを加えた。
５．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌポロキサマー１８８
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとポロキサマー１８８ ５０グラムを加えた。
６．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとＴｗｅｅｎ ２０ ５グラムを加えた。
７．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムを加えた。
８．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌポロキサマー１８８
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとポロキサマー１８８ ５グラムを加えた。
９．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとＴｗｅｅｎ ２０ ５グラムを加えた。
１０．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムを加えた。
１１．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌポロキサマー１８８
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとポロキサマー１８８ ５グラムを加えた。
１２．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０
６．１．２の場合と同様に、メチオニン１２グラムとＴｗｅｅｎ ２０ ５グラムを加えた。

６．２ バルク予備調製
バルク調製と組成のスキーム概要を図７（図７−１及び図７−２）および表１５に示す。

第１段階
６．２．１ ＳＥＣ−ＥＬ １９７グラムをＳＡＢ、１０ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．２ ＳＥＣ−ＥＬ １９７グラムをＳＡＢ、６３．２ｍｇ／ｍｌアルギニンで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．３ ＳＥＣ−ＥＬ １９７グラムをＳＡＢ、６００ｍＭマンニトールで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．４ ＳＥＣ−ＥＬ １９７グラムをＳＡＢ、５４．８ｍｇ／ｍｌリジンで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．５ ＳＥＣ−ＥＬ ９２グラムをＳＡＢ ２０８グラムで希釈して、０．５ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ含有溶液を調製した。これらの溶液を、濾過後、２５０ｍｌ試験管（バルク１３０グラムを含む）２本と２ｍｌ試験管（バルク０．５ｍｌを含む）６本に分けた。
２５０ｍｌ試験管１本と２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結保存した。
２５０ｍｌ試験管１本と２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結した後、−２０℃にて保存するために第２のフリーザーに移した。
２ｍｌ試験管２本を２〜８℃にて保存した。
ＳＥＣ−ＥＬを水で希釈して、１０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８中の０．０８８ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ含有溶液６ｍｌを調製した。

第２段階
次の溶液を、濃度０．５ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａにて調製した。
６．２．６ ６．２．１で調製した溶液をＳＡＢ、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールで希釈した。
６．２．７ ６．２．２で調製した溶液をＳＡＢ、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニンで希釈した。
６．２．８ ６．２．３で調製した溶液をＳＡＢ、３００ｍＭマンニトールで希釈した。
６．２．９ ６．２．４で調製した溶液をＳＡＢ、２７．４ｍｇ／ｍｌリジンで希釈した。
６．２．１０ これらの４種類の溶液（６．２．６〜６．２．９）を、濾過後、２５０ｍｌ試験管（バルク１３０グラムを含む）４本と２ｍｌ試験管（バルク２ｍｌを含む）６本に分けた。合計−２５０ｍｌ試験管１４本と２ｍｌ試験管１８本。
これらの３種類の溶液の残量に対してさらに処理を行った（第３段階）。
６．２．１１ 各溶液の２５０ｍｌ試験管２本と２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結保存した。
各溶液の２５０ｍｌ試験管２本と２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結した後、−２０℃にて保存するために第２のフリーザーに移した。
各溶液の２ｍｌ試験管２本を２〜８℃にて保存した。

第３段階（１：１００希釈）
６．２．１２ ６．２．６で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニンで希釈した。
６．２．１３ ６．２．６で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌプルロニックで希釈した。
６．２．１４ ６．２．６で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌベンジルアルコール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈した。
６．２．１５ ６．２．７で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニンで希釈した。
６．２．１６ ６．２．７で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌプルロニックで希釈した。
６．２．１７ ６．２．７で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈した。
６．２．１８ ６．２．８で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニンで希釈した。
６．２．１９ ６．２．８で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌプルロニックで希釈した。
６．２．２０ ６．２．８で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、３００ｍＭマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈した。
６．２．２１ ６．２．９で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニンで希釈した。
６．２．２２ ６．２．９で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５０ｍｇ／ｍｌプルロニックで希釈した。
６．２．２３ ６．２．９で調製した溶液２９．７ｍｌをＳＡＢ ０．３ｍｌ、２７．４ｍｇ／ｍｌリジン、１２ｍｇ／ｍｌメチオニン、５ｍｇ／ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈した。
６．２．２４ 全ての溶液（６．２．１２〜６．２．２３）を、別々に、Ｍｉｌｌｅｘ シリンジフィルター，０．２μで濾過した。
６．２．２５ それらの溶液を２ｍｌ試験管（各溶液につき少なくとも６本の試験管）に分けた。
６．２．２６ 各溶液の２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結保存した。
各溶液の２ｍｌ試験管２本を−７０℃にて凍結した後、−２０℃にて保存するために第２のフリーザーに移した。
各溶液の２ｍｌ試験管２本を２〜８℃にて保存した。

６．３ バルク分析
各予備調製条件の、２〜８℃、−７０℃および−２０℃にて保存した２ｍｌ試験管１本を、室温にて２時間解凍した後、ＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した。−２０℃にて保存したサンプルは、−７０℃に４時間戻した後、解凍した。結果を表１７に示す。

条件１、５、９、１３および１５の、−７０℃にて保存した２５０ｍｌ試験管１本（表１参照）を、室温にて６時間解凍した後、ＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した。結果を表１８に示す。

さらに、１Ｆ／Ｔサイクル後の１５ｍｌ試験管中のサンプル（Ｆ／Ｔ×１後の２５０ｍｌ試験管のサンプルは１ｍｌ）についても熱解離研究をインキュベーション温度２９℃にて８時間実施し、ＳＥ−ＨＰＬＣにより分析した（結果については表１９参照）。

７．０ 結果

^* ２〜８℃にて３週間保存した。^** −７０℃にて凍結し、−２０℃にて１６日間保存し、−７０℃に４時間戻した。結果は二連試験の平均である。
バルクバッファーには、５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８＋異なる組合せの賦形剤（ＢＡ−ベンジルアルコール、ＭＥＴ−メチオニン、ＭＡＮ−マンニトール、ＴＷ−Ｔｗｅｅｎ ２０、ＰＯＬ−ポロキサマー）を含めた。

８．０ 考察
バルクｒ−ｈ インターフェロン−β １ａに賦形剤を加えることによって、二量体と凝集体の割合％が一貫して低減する（その結果として、単量体の割合％が一貫して増加する）。熱解離と選択した賦形剤によるｒ−ｈ インターフェロン βへの効果の比較では、賦形剤の添加によって少し高い単量体レベル（より低い二量体および凝集体レベル）を達成することができる。さらに、賦形剤により安定化した予備調製物は、熱解離（例えば、２９℃でのインキュベーション）をさらに受けると、さらに高い単量体レベルを示す。
１．２ｍｌ試験管
・４℃にて
種々の条件によって得られた％単量体の差は小さい（最大デルタ１．３％）が、マンニトールを含有するサンプルが最も高い単量体レベル（１００％）を示した。
・−７０℃にて
マンニトール＋Ｔｗｅｅｎ ２０＋メチオニンの組合せは、リジンより少し優れている。
種々の組合せにおいて、全ての安定剤で、％単量体≧９９を得ることができる。
・−７０℃にて、さらに−２０℃にて保存
リジン＋Ｔｗｅｅｎ ２０＋メチオニンの組合せで最も高い％単量体が得られる。
２．２５０ｍｌ試験管
・−７０℃にて
リジンは、オリゴマー化レベルの低減という点において、試験したそれ以外の賦形剤と比べて明らかに有利である。

実施例３：バルクインターフェロンへの賦形剤の添加によるインターフェロン−βの安定化についての速度超遠心分離、ＳＥＣおよびＤｅｇ／Ｏｘ ＨＰＬＣによる分析

１．０ 用語解説／略語
Ａｇｇ 凝集体
Ｄｉｍ 二量体
Ｄｅｇ 分解生成物
ＦＤＦ 最終剤形
Ｆ／Ｔ 凍結解凍
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ）
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ最終剤形（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ）
ＳＥ−ＨＰＬＣ サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＳＡＢ ５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８
Ｔｅｍｐ． 温度

１．０ 序文
本研究は、安定化したバルクインターフェロンを提供するために、ＳＥＣ−ＥＬ画分からＦＤＦの保存までの製造段階中のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化の最小化に着目した。

オリゴマー化の最小化を以下により行った。
１）賦形剤および／または他の安定剤を加えてバルクを予備調製した後、−７０℃にて凍結すること。
２）賦形剤および／または他の安定剤を加えてバルクを予備調製し、凍結せずに、２〜８℃にて輸送すること。
３）予備調製せずに、凍結していないｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクを２〜８℃にて輸送すること。

予備調製したバルクサンプルをＳＥ−ＨＰＬＣ Ｄｅｇ／Ｏｘ ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法により分析した。ＳＥ−ＨＰＬＣでは、共有結合性オリゴマーのみ検出される可能性があるのに対し、速度超遠心分離では、非共有結合性オリゴマーも、定量的にも定性的にも検出される。

３．０ 目的／範囲
バルク処理中のｒ−ｈ インターフェロン−β １ａのオリゴマー化を最小化すること。

４．０ 装置と材料
４．１ 装置
０．２μフィルターユニットＰ／Ｎ ＭＰＧＬ０２５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製
Ｒｅｖｃｏ社製フリーザー、−７０℃
蠕動ポンプ
２５０ｍｌ遠心分離用円錐型試験管−Ｃｏｒｎｉｎｇ社製
１．８ｍｌ凍結用試験管−Ｎｕｎｃ社製
４．２ 材料
ＳＥＣ ｅｌ２画分
Ｄ−マンニトール ＤＡＢ，Ｐｈ Ｅｕｒ，ＢＰ，ＵＳＰ，ＦＣＣ，Ｅ４２１（コード１．０５９８０，Ｍｅｒｃｋ社製）
氷酢酸１００％（コード１．０００６３，Ｍｅｒｃｋ社製）
水酸化ナトリウム １０Ｍ
Ｌ−メチオニン（１．０５７０７，Ｍｅｒｃｋ社製）
Ｌ−アルギニン一塩酸塩（コード１．０１５４４，Ｍｅｒｃｋ社製）
リジン（コード１．０５７０１，Ｍｅｒｃｋ社製）

５．０ 手順
本研究をＳＥＣ−ＥＬ２画分において行った。
本研究のスキーム概要を図８（図８−１及び図８−２）に示す。
異なる予備調製条件を表２０に示す。

６．４ 溶液の調製
実施例２に従って、溶液を調製した。
１．５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ−３．８（ＳＡＢ）の調製
実施例２参照。
２．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、６３．２ｍｇ／ｍｌアルギニン ０．５リットルの調製
ａ．ＷＦＩ ０．４８３ｋｇを秤量した。
ｂ．アルギニン３１．６グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、アルギニンを溶かした。
ｄ．酢酸１．５グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．ＰＨを測定しながら、ｐＨが３．８に達するまでＮａＯＨ １０Ｍ約０．２８ｍｌを加えた。
ｇ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｈ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。
３．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニン １リットルの調製
ａ．ＷＦＩ ０．９８６ｋｇを秤量した。
ｂ．アルギニン３１．６グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、アルギニンを溶かした。
ｄ．酢酸３．００２グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．ＰＨを測定しながら、ｐＨが３．８に達するまでＮａＯＨ １０Ｍ約０．５６ｍｌを加えた。
ｇ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｈ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。
４．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−４．１、１６４．４．ｍｇ／ｍｌリジン １リットルの調製
ａ．ＷＦＩ ０．８３５ｋｇを秤量した。
ｂ．リジン１６４．４グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、アルギニンを溶かした。
ｄ．酢酸３．００２グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．ＮａＯＨ １０Ｍ ０．５６ｍｌを加え、ｐＨは約４．１に達した。
ｇ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｈ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。
５．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−４．０、８２．２ｍｇ／ｍｌリジン １リットルの調製
ａ．ＷＦＩ ０．９２ｋｇを秤量した。
ｂ．リジン８２．２グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、リジンを溶かした。
ｄ．酢酸３．００２グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．ＮａＯＨ １０Ｍ ０．５６ｍｌを加え、ｐＨは約４．０に達した。
ｇ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｈ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。
６．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、６００ｍＭマンニトール、０．２４ｍｇ／ｍｌメチオニン １リットルの調製
ａ．ＷＦＩ ０．９２ｋｇを秤量した。
ｂ．マンニトール１１０．２８グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、マンニトールを溶かした。
ｄ．酢酸３．００２グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．メチオニン０．２４グラムを加えた。
ｇ．その溶液を５分間混合した。
ｈ．ＰＨを測定しながら、ｐＨが３．８に達するまでＮａＯＨ １０Ｍ約０．５６ｍｌを加えた。
ｉ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｊ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。
７．５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ−３．８、３００ｍＭマンニトール、０．１２ｍｇ／ｍｌメチオニン ２リットルの調製
ａ．ＷＦＩ １．９３ｋｇを秤量した。
ｂ．マンニトール１１０．２８グラムを加えた。
ｃ．その溶液を５分間混合して、マンニトールを溶かした。
ｄ．酢酸６．００６グラムを加えた。
ｅ．その溶液を５分間混合した。
ｆ．メチオニン０．２４グラムを加えた。
ｇ．その溶液を５分間混合した。
ｈ．ＰＨを測定しながら、ｐＨが３．８に達するまでＮａＯＨ １０Ｍ約１．１２ｍｌを加えた。
ｉ．その溶液から伝導度およびｐＨを得るためにサンプル採取した。
ｊ．その溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。

６．１ バルク予備調製
バルク予備調製と組成のスキーム概要を図８（図８−１及び図８−２）および表２０に示す。以下は、予備調製物の詳細な説明である。

ＳＥＣ−ＥＬをＯＤ２８０により定量し、その濃度は１．３１ｍｇ／ｍｌであった。

第１段階（異なるバッファーによるＳＥＣ−ＥＬ２の１：１ ｗ／ｗ希釈）
６．２．１ ＳＥＣ−ＥＬ １５５グラム量をＳＡＢ １５５グラム、１６４．４ｍｇ／ｍｌリジンで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．２ ＳＥＣ−ＥＬ ７８グラム量をＳＡＢ ７８グラム、６３．２ｍｇ／ｍｌアルギニンで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．３ ＳＥＣ−ＥＬ ２２０グラム量をＳＡＢ ２２０グラム、６００ｍＭマンニトール、０．２４ｍｇ／ｍｌメチオニンで１：１ ｗ／ｗ希釈した。
６．２．４ ＳＥＣ−ＥＬ １８９グラム量をＳＡＢ ３０６グラムで希釈して、０．５０−ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ含有溶液を調製した。この溶液を、濾過後、２５０ｍｌ試験管とｎｕｎｃ社製２ｍｌ試験管に分け、−７０℃または２〜８℃にて保存し、２〜８℃にて輸送する２５０ｍｌ試験管をキャップまで満たした。

第２段階（０．５０〜０．５８ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａへのバルクの最終希釈）
次の溶液を調製した（目的の濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａであった）。
６．２．５ ６．２．１で調製した溶液３１０グラムをＳＡＢ ９０グラム、８２．４ｍｇ／ｍｌリジンで希釈した。
６．２．６ ６．２．２で調製した溶液１５６グラムをＳＡＢ ４８グラム、３１．６ｍｇ／ｍｌアルギニンで希釈した。
６．２．７ ６．２．３で調製した溶液４４０グラムをＳＡＢ １３２グラム、３００ｍＭマンニトール、０．１２ｍｇ／ｍｌメチオニンで希釈した。
６．２．８ これらの３種類の溶液（６．２．５〜６．２．７）を、濾過後、２５０ｍｌ試験管と２ｍｌ試験管（２ｍｌバルクを含む）に分けた。
６．２．９ リジンとアルギニンを含有する溶液の２５０ｍｌ試験管と２ｍｌ試験管を−７０℃にて凍結保存し、マンニトールとメチオニンを含有する溶液を２〜８℃にて保存した（２５０ｍｌ試験管をキャップまで満たした）。

６．３ 予備調製したバルクの処置
−７０℃および２〜８℃にて保存したサンプルを速度超遠心分離、Ｄｅｇ／Ｏｘ ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣにより試験した。

７．０ 結果

８．０ 考察
実施例２において得られた結果は、本研究において、速度超遠心分離法とＳＥＣ法との両方によって確認される（％単量体レベルにおける差は、ＳＥＣにより共有結合性オリゴマーのみ検出され得ることによる）。さらに、ＤＥＧ／ＯＸ ＨＰＬＣにより、バルクｒ−ｈ インターフェロン β １ａへの賦形剤添加後に酸化形態のレベルが安定した状態を保つことが分かる。

実施例４：濾過段階前または濾過段階後のいずれかでの、バルクインターフェロンへの賦形剤の添加によるインターフェロン−βの安定化。

１．０ 用語解説／略語
Ａｇｇ 凝集体
ＣＯＡ 分析証明書
Ｄｉｍ 二量体
Ｄｅｇ 分解生成物
Ｄｅｇ／Ｏｘ−ＨＰＬＣ 分解生成物および酸化形態についての逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｆ／Ｔ 凍結解凍
Ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルク中のｒ−ＩＦＮ βの定量のための逆相高速液体クロマトグラフィー
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ）
ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ最終剤形（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β ＦＤＦ）
ＳＥ−ＨＰＬＣ サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
Ｔｅｍｐ． 温度

２．０ 概要
ＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いた場合、バルクの濾過前後に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行うと、３００ｍＭマンニトールを加えてＩＦＮ−β−１ａバルクを予備調製する（凍結前）ことによって、共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられることが示された。濾過前に３００ｍＭマンニトールを添加したときの効果は、オリゴマー化、特に、非共有結合性オリゴマーおよび凝集体のレベルの低減という点で２５０ｍｌ試験管（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクの所定の容器）においてより大きい。

ＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いた場合、オリゴマーは、２〜８℃にて保存した凍結していないｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクでは生じず、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクの凍結解凍中に形成されることが示された。

３．０ 序文
タンパク質凝集体は、中和抗体の産生をもたらす免疫原性反応を惹起し得ると考えられていることから、凍結解凍サイクル中のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化および凝集の最小化は、望ましい目標である。

バルク中の単量体レベルの測定に現在用いられている分析手法は、ＳＥ−ＨＰＬＣである。速度超遠心分離による予備段階の結果により、ＳＥ−ＨＰＬＣは、共有結合性オリゴマーのみ検出することができる方法であるのに対し、速度長遠心分離は、非共有結合性オリゴマーも、定量的にも定性的にも検出することができる方法であると思われる（試験２参照）。

提示した研究は、生産規模においてマンニトールを加えてバルクを予備調製することによる、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化および凝集への効果を、分析手法としてＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いて判定することを目的とした。

４．１ 目的／範囲
４．１．１ ＳＥＣ画分に非共有結合性凝集体が存在するかどうかを判定すること（濾過前と凍結前）。
４．１．２ バルクの濾過前後、凍結前に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行う場合に、３００ｍＭのマンニトールにより共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられるかどうかを判定すること。
４．１．３ バルクの濾過前、凍結前に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行う場合に、１５０ｍＭのマンニトールにより共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられるかどうかを判定すること。
４．１．４ １．８ｍｌ試験管中の非共有結合性凝集体のレベルがＦ／Ｔを行った後に２５０ｍｌ試験管中のレベルと同様であるかどうかを判定すること。

５．０ 装置と材料
５．１ 装置
１５０〜５００ｍｌ用０．２μ濾過ユニット Ｎａｌｇｅｎｅ社製。
５．２ 材料
ＳＥＣ ｅｌ２画分−８００ｍｌ。
マンニトール−Ｍｅｒｃｋ社製 Ｐ／Ｎ １．０５９８０．９０５０
５０ｍＭ酢酸バッファー ｐＨ３．８−ＩＰＬコードＳ８８ＲＤ６００
３００ｍＭマンニトール含有５０ｍＭ酢酸バッファー ｐＨ３．８（マンニトール５４．６ｇ／リットル）。
６００ｍＭマンニトール含有５０ｍＭ酢酸バッファー ｐＨ３．８（マンニトール１０９．３ｇ／リットル）。
１５０ｍＭマンニトール含有５０ｍＭ酢酸バッファー ｐＨ３．８（マンニトール２７．３ｇ／リットル）。
２５０ｍｌ遠心分離用円錐型試験管−Ｃｏｒｎｉｎｇ社 Ｐ／Ｎ ４３０７７６
１．８ｍｌ凍結用試験管−Ｎｕｎｃ社製試験管 Ｐ／Ｎ ３７５４１８

６．０ 手順
本研究を単一ＳＥＣ ｅｌ２画分において行った。
（ＯＤ２８０による濃度１．８１ｍｇ／ｍｌ）。

６．１ バルク調製
バルクを以下のように調製した。
（１）ＳＥＣ ｅｌ２画分
速度超遠心分離用に、１．８ｍｌ試験管に完全充填し、２〜８℃にて輸送した。
（２）対照
ＳＥＣ ｅｌ２ １８０ｍｌを０．２μｍフィルターで濾過し、その後、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ−３．８ ７２０ｍｌでフィルター洗浄を行った。バルクを２５０ｍｌ試験管４本（各２００ｍｌ）と１．８ｍｌ凍結用試験管１０本に分け、その後、−７０℃にて凍結した。１．８ｍｌ試験管２本は凍結しなかった。これらの２本の完全充填試験管のうち１本は、速度超遠心分離による分析まで２〜８℃にて維持した。
バルク濃度は３５０μｇ／ｍｌであった（ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣによる）。
（３）３００ｍＭマンニトール、濾過後に添加
ＳＥＣ ｅｌ２ １８０ｍｌを０．２μｍフィルターで濾過した後、そのフィルターを５０ｍＭ酢酸塩、６００ｍＭマンニトール ｐＨ−３．８ １８０ｍｌ、さらに５０ｍＭ酢酸塩、３００ｍＭマンニトール、ｐＨ−３．８ ５４０ｍｌで洗浄した。バルクを２５０ｍｌ試験管４本（各２００ｍｌ）と１．８ｍｌ凍結用試験管１０本に分け、その後、−７０℃にて凍結した。１．８ｍｌ試験管２本は凍結しなかった。これらの２本の完全充填試験管のうち１本は、速度超遠心分離による分析まで２〜８℃にて維持した。最終マンニトール濃度は３００ｍＭであった。バルク濃度は３４４μｇ／ｍｌであった（ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣによる）。
（４）１５０ｍＭマンニトール、濾過前に添加
ＳＥＣ ｅｌ２ ２００ｍｌを５０ｍＭ酢酸塩、３００ｍＭマンニトール ２００ｍｌと混合し、この混合物３８０ｍｌを０．２μｍフィルターで濾過した後、そのフィルターを５０ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭマンニトール、ｐＨ−３．８ ５７０ｍｌで洗浄した。バルクを２５０ｍｌ試験管４本（各２００ｍｌ）と１．８ｍｌ凍結用試験管１０本に分け、その後、−７０℃にて凍結した。１．８ｍｌ試験管２本は凍結しなかった。これらの２本の完全充填試験管のうち１本は、速度超遠心分離による分析まで２〜８℃にて維持した。最終マンニトール濃度は１５０ｍＭであった。バルク濃度は３４２μｇ／ｍｌであった（ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣによる）。
（５）３００ｍＭマンニトール、濾過前に添加
ＳＥＣ ｅｌ２ ２００ｍｌを５０ｍＭ酢酸塩、６００ｍＭマンニトール ２００ｍｌと混合し、この混合物３８０ｍｌを０．２μｍフィルターで濾過した後、そのフィルターを５０ｍＭ酢酸塩、３００ｍＭマンニトール ４００ｍｌで洗浄した。バルクを２５０ｍｌ試験管４本（各２００ｍｌ）と１．８ｍｌ凍結用試験管１０本に分け、その後、−７０℃にて凍結した。１．８ｍｌ試験管２本は凍結しなかった。これらの２本の完全充填試験管のうち１本は、速度超遠心分離による分析まで２〜８℃にて維持した。最終マンニトール濃度は３００ｍＭであった。バルク濃度は３４２μｇ／ｍｌであった（ｑｕａｎｔ−ＨＰＬＣによる）。

注記：ＳＥＣカラム溶離液は、並列接続される、５分おきに交互に開く４つの電子制御バルブ（ＬＣＣ５００制御装置により制御）からなるシステムを通じて１リットル容ガラス瓶４本に回収した。マンニトールを濾過前にＳＥＣ−ＥＬ２画分に加えた場合には、ＳＥＣカラムからの溶出中にＳＥＣ画分とマンニトール溶液（４）または（５）をオンラインのガラス瓶中でゆっくりと混合した。マンニトールをＳＥＣ濾過後に加えた場合（３）には、ＳＥＣ ＥＬ−２画分の後にマンニトールを加え、同じ濾過ユニットで濾過した。

６．２ 凍結解凍
２５０ｍｌ試験管の４Ｆ／Ｔサイクルを、少なくとも８時間の凍結と室温にて７時間の解凍によって行った。それらの試験管は、その後、各解凍サイクルの後に２５回反転して混合した。１．８ｍｌ試験管の４Ｆ／Ｔサイクルを、少なくとも８時間の凍結と２時間の解凍によって行った。それらの試験管は、次の凍結サイクルの前に２０回反転して混合した。各バルク条件（２〜５）で、１Ｆ／Ｔと４Ｆ／Ｔ処置から得られた凍結２５０ｍｌ試験管２本と１．８ｍｌ試験管２本を速度超遠心分離用とした。各バルク条件の２５０ｍｌ試験管と１．８ｍｌ試験管の他の２本を解凍し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより試験した。

ＳＥ−ＨＰＬＣ試験と速度超遠心分離は、２４時間＋／−２時間解凍したサンプルで行った。最初にマンニトールを溶かす。

７．０ 結果
７．１ １Ｆ／Ｔ後、ＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いた場合、３種類の全ての条件（３、４および５）において、マンニトールを加えて予備調製することには、１．８ｍｌ試験管と２５０ｍｌ試験管の両方においてオリゴマー化レベルの低減へのわずかな効果があった（対照サンプルと比べて〜０．４％高い純度）。

１Ｆ／Ｔ後、超遠心分離法を用いた場合、３種類の全ての条件（３、４および５）において、マンニトールには、１．８ｍｌ試験管と２５０ｍｌ試験管の両方においてオリゴマー化レベルへの大きな効果があった。

２５０ｍｌ試験管において（表２５）、濾過前に３００ｍＭマンニトールを加える（条件５）と、濾過後に３００ｍＭマンニトールを加える（条件３）よりもオリゴマー化の低減に良い効果をもたらした。

１．８ｍｌ試験管において（表２４）、濾過後に３００ｍＭマンニトールを加える（条件３）と、濾過前にマンニトールを加える（条件５）よりもオリゴマー化の低減に良い効果をもたらした。

７．２ ４Ｆ／Ｔサイクル後にＳＥ−ＨＰＬＣ法を用いた場合（表２６）、３種類の全ての条件（３、４および５）において、マンニトールには、１．８ｍｌ試験管においてオリゴマー化レベルへの大きな効果があった（３００ｍＭマンニトールを加えて予備調製した対照サンプルと比べて〜２．６％高い純度）。

４Ｆ／Ｔサイクル後に超遠心分離を用いた場合、３種類の全ての条件（３、４および５）において、マンニトールには、１．８ｍｌ試験管と２５０ｍｌ試験管の両方においてオリゴマー化レベルへの大きな効果があった。しかし、１．８ｍｌ試験管における効果の方が優れていた。

７．３ ＳＥ−ＨＰＬＣ法と超遠心分離法との両方を用いた場合（表２３）、２〜８℃にて保存した（凍結しない）サンプルではオリゴマー化は起こらなかった。

７．４ ＳＥ−ＨＰＬＣと超遠心分離との両方を用いた場合、２５０ｍｌ試験管においてオリゴマー化レベルは、１．８ｍｌ試験管よりもはるかに高かった。

注記：表２３〜２７中の括弧内の値は、％凝集体である。

８．０ 結論
８．１ ＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いた場合、バルクの濾過前後に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行うと、３００ｍＭマンニトールを加えてｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクを予備調製する（凍結前）ことによって、共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられる。しかし、濾過前に３００ｍＭマンニトールを添加したときの効果は、オリゴマー化、特に、非共有結合性オリゴマーおよび凝集体のレベルの低減という点で２５０ｍｌ試験管（ＩＦＮ−β−１ａバルクの所定の容器）においてより大きい。

マンニトールを加えてバルクを予備調製することの、Ｆ／Ｔ後の１．８ｍｌ試験管におけるｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化および凝集への効果は、２５０ｍｌ試験管における効果と同様である（ＳＥ−ＨＰＬＣにより試験した場合には対照サンプルと比べて純度は約０．４％高く、速度超遠心分離により試験した場合には約１３％高い）。

８．２ バルクの濾過前、凍結前に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行う場合に、マンニトールを１５０ｍＭ濃度で加えても、共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられるが、その効果は３００ｍＭの効果ほどは大きくない。

８．３ ＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いた場合、オリゴマーは、２〜８℃にて保存した、凍結していないｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクとＳＥＣ−ＥＬでは生じず、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクの凍結解凍中に形成されることが示された。

８．４ 速度超遠心分離による予備段階の結果により、ＳＥ−ＨＰＬＣは、（ＮＥＷ ＳＥＣとは対照的に）共有結合性オリゴマーのみ検出することができる方法であり、一方、速度超遠心分離は、非共有結合性オリゴマーも、定量的にも定性的にも検出することができる方法であると思われる。

Ｆ／Ｔサイクルを受けていない、４℃（または２〜８℃）にて保存したサンプルは、（％Ｍｏｎ含量率に関して）非常に安定した状態を保つ。特定の理論にとらわれるものではないが、凍結／解凍サイクルのようなストレスの分子への影響により、インターフェロン−βオリゴマーの形成が一貫して増加すると考えられる。４℃にて保存したサンプルでは、マンニトールとメチオニンの組合せ（最終的にはベンジルアルコールまたはＴｗｅｅｎ ２０が補助添加される）により最良の結果が得られ、２〜８℃にて保存したサンプルではこの組合せではオリゴマー化は起こらない。本方法では、安定剤としてマンニトールとメチオニンの組合せ（ベンジルアルコールまたはＴｗｅｅｎ ２０がさらに添加される可能性がある）を使用することが好ましい。リジンも、単独またはいずれの組合せでも使用することが好ましい賦形剤である。いくつかの賦形剤（すなわち、Ｔｗｅｅｎ ２０、ベンジルアルコールまたはリジン）は、Ｆ／Ｔサイクルによって引き起こされるストレスに対して安定化作用を示す（すなわち、これらの賦形剤は、凍結／解凍ストレスの影響を弱めることが分かっている）。製造工程で凍結／解凍サイクルを行う場合には、Ｔｗｅｅｎ ２０、ベンジルアルコールまたはリジンなどの好ましい賦形剤がバルク溶液に添加されることが好ましい。

よって、製造工程中にＦ／Ｔサイクルを行う場合には、好ましい賦形剤およびそれらの組合せも確認される。本発明において−２０℃にて保存したサンプルには、数多くのＦ／Ｔサイクルを行った（試験管を、まず−７０℃にて凍結した後、−２０℃にて１６日間保存するために第２のフリーザーに移した。その後、サンプルを−７０℃に４時間戻した後、解凍した。）。上記によれば、Ｆ／Ｔサイクルのようなストレスが生じる場合には、安定剤としてＴｗｅｅｎ ２０、ベンジルアルコールおよびリジンを使用することが好ましい。そのようなものとして、Ｔｗｅｅｎ ２０、リジンおよびベンジルアルコールは、単独またはいずれの組合せでも、いずれの保存温度（−７０℃、−２０℃または４℃）においても、Ｆ／Ｔサイクルによるストレスの存在下で、バルクインターフェロン溶液に使用することが好ましい賦形剤である。

次の組合せが特に好ましい：
１．リジンおよびベンジルアルコール、
２．リジンおよびＴｗｅｅｎ ２０、
３．リジンおよびベンジルアルコールおよびＴｗｅｅｎ ２０、ならびに
４．ベンジルアルコールおよびＴｗｅｅｎ ２０。

以下に記載する実施形態は、いずれの保存温度（−７０℃、−２０℃または４℃）で、Ｆ／Ｔサイクルによるストレスの存在下で最も好ましいものである。

リジンでは、−２０℃においてだけでなく、４℃および−７０℃においても、％Ｍｏｎおよび％Ａｇｇに関して非常によい結果が得られる。リジンは、凍結／解凍サイクルに対してインターフェロン−βを安定させることができる、試験した唯一のアミノ酸である。よって、リジンは、Ｆ／Ｔサイクルに対して最も好ましい賦形剤であり、Ｆ／Ｔストレスに対して安定化作用を示す他の２種類の賦形剤である静菌剤（例えば、ベンジルアルコール）または界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０）の必要性を回避する。そのようなものとして、リジンまたはリジンと抗酸化剤（例えば、メチオニン）の組合せを含むだけの予備調製物が考えられる。−２０℃では、実際にリジンとメチオニンの組合せによって最良の結果が得られる。より好ましくは、本発明では、リジンとメチオニンの組合せを使用する。マンニトール、メチオニンおよびＴｗｅｅｎ ２０の組合せでは単量体の割合％が高水準で得られる（９８．１２％Ｍｏｎ）。ベンジルアルコールとメチオニンの組合せでは単量体が高い割合％で得られる（〜９８％Ｍｏｎ）。よって、ベンジルアルコールとメチオニンの組合せが好ましい。この組合せにＴｗｅｅｎ ２０をさらに添加することができ、そのようにしてより高い％単量体が得られる（〜９９％）。よって、ベンジルアルコール、メチオニンおよびＴｗｅｅｎ ２０の組合せがより好ましい。

試験は、製造処理中の特定の２時点において行った。濾過前後に特定の賦形剤（例えば、マンニトール）を添加することにより、オリゴマーおよび凝集体の形成が低下および／または低減する。ＳＥ−ＨＰＬＣ法と速度超遠心分離法との両方を用いた場合、バルクの濾過前後に加え、その後、１Ｆ／Ｔおよび４Ｆ／Ｔサイクルを行うと、３００ｍＭマンニトールを加えてｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクを予備調製する（凍結前）ことによって、共有結合性オリゴマーおよび非共有結合性オリゴマーと凝集体が最小限に抑えられる。よって、本発明は、バルクタンパク質製造工程の特定の時点にのみ限定されるものではなく、バルクタンパク質予備調製物の調製および／または保存に必要な全ての段階を包含する（すなわち、安定化用賦形剤は、バルク処理中の異なる多数の段階において加えることができる）。オリゴマー化と凝集に関し、結果には大きな違いはないが、濾過前にマンニトールを添加することにより、特に、２５０ｍｌ試験管での非共有結合性オリゴマーおよび凝集体についてより良い結果が得られる。よって、マンニトールは濾過段階の前に添加することが好ましい。

最後に、上記試験により、特定の賦形剤と熱解離を組み合わせることにより、別々に採用した場合に得られる水準と比べて高い水準の単量体の割合％が得られることが分かった。このようにして、二量体および凝集体レベルに関する大幅な低減が達成される。よって、本発明では、添加賦形剤を用いた安定化バルク溶液と熱解離とを組み合わせることが好ましい。熱解離は、製造工程のいずれの段階においても実施することができ、バルク処理の特定の時点に限定されるものではない。

実施例５：ｐＨ４．７における予備調製研究
オリゴマー化および凝集体の形成についてのｐＨ範囲を評価するために、ｐＨ４．７において予備調製研究を実施した。

（１）手順：
１．約０．５ｍｇ／ｍｌの第１のバルクを、１：１混合することにより（１容量のＳＥＣ Ｅｌ２画分と１容量の５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ７．２、ＮａＯＨで滴定）ｐＨ４．７に予備調製した。
２．第２のバルクを、１：１混合することにより（１容量のＳＥＣ Ｅｌ２画分と１容量の５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ７．２（１６４．４ｍｇ／ｍｌにてリジン含有）、ＮａＯＨで滴定）、リジン８２．２ｍｇ／ｍｌ含有、ｐＨ４．７に予備調製した。
３．これらの調製物を５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ３．８中０．５ｍｇ／ｍｌの対照および８２．２ｍｇ／ｍｌリジンを含有する予備調製した対照５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ３．９中０．５ｍｇ／ｍｌと比較した。
４．１．８ｍｌ試験管において凍結解凍１サイクル後、それらのサンプルを新規ＳＥＣ ＨＰＬＣ法により試験した。

結果：

（２）結論：
・ｐＨ ４．７の予備調製物は、ｐＨ３．８の予備調製物と比べてオリゴマー化および凝集体の形成を一貫して低減する（それぞれ〜８１％Ｍｏｎに対し〜９９％Ｍｏｎと０％凝集体に対し０．６７％凝集体）。よって、本発明の方法はｐＨ４．７にて遂行することが好ましい。
・ｐＨ３．９またはｐＨ４．７いずれかの、リジンを含有する予備調製物は、オリゴマー化を低減する。ｐＨ４．７では、リジンの添加により、リジンを添加しない場合の９９．１％Ｍｏｎに対し９９．６％Ｍｏｎが得られる。ｐＨ３．８では、リジンの添加によりオリゴマー化の低減に顕著な効果があり、この場合、リジンを添加しない場合の８１．４１％Ｍｏｎに対し９９．７％Ｍｏｎが得られる。よって、リジンは、本発明の方法に添加することが好ましいアミノ酸である。
・ｐＨ４．７の予備調製物とリジンの添加を組み合わせることによって最良の結果が得られる。よって、本発明の方法は、ｐＨ４．７にて、賦形剤としてリジンを添加することによって遂行することが最も好ましい。よって、最も好ましい実施形態では、本発明の本方法では、ｐＨ４．７のバルク−インターフェロンへの好ましい賦形剤の添加と熱解離を組み合わせることができる。

実施例６−分析手法
本実施例では、使用した異なる分析手法を記載する。
サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ、Ｎｅｗ ＳＥ−ＨＰＬＣ（本明細書において「新規ＳＥ−ＨＰＬＣ」または「ＮＥＷ ＳＥＣ」とも称する）および速度超遠心分離（ＡＵＣ）を組換えヒトインターフェロン−β １ａ（ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａまたはｒ−ｈ β ＩＦＮ−１ａ）の凝集体とオリゴマーのレベルの測定に用いた。示したＮＥＷ ＳＥ−ＨＰＬＣ法およびＡＵＣ法では、共有結合性オリゴマーと非共有結合性オリゴマーの両方と、さらに凝集体も、定量的にも定性的にも検出することができる。

ａ．ＳＥ−ＨＰＬＣ−純度試験
ＩＦＮ−β−１ａバルク中の凝集体量を測定するために、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いる。

手順
試験するＩＦＮ−β−１ａバルクと対照サンプル（ＰＲＢ）の両方のサンプル１００μｌを分析する。
次の溶液を調製する。３０％ＡＣＮ（アセトニトリル）／０．２％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｈ₂Ｏ。
カラム（Ｐｒｏｇｅｌ−ＴＳＫ Ｇ２０００または同等のもの）を溶離液により流速０．５ｍｌ／分にて、少なくとも１時間平衡化する。一度、安定したベースラインが得られたら、サンプル１００μｌを注入し、定組成勾配を利用して、流速０．５ｍｌ／分にて溶出する。

カラムプロフィールを２１４ｎｍにおけるＵＶ検出により記録する。バルクサンプルについてのＩＦＮ−β−１ａ単量体の割合％をタンパク質ピークの総面積から決定する。

特性
ＩＦＮ−β−１ａバルクサンプルの主要なピークの面積（無傷分子に相当する）は、総ピーク面積の少なくとも９５％であり、凝集体は多くて１％である。

ＳＥ−ＨＰＬＣ試験に関する凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）対照サンプルについての手順
１．−７０℃のフリーザーから所望の量のｒ−ｈインターフェロン−β １ａバルク／バッチを取り出す。
２．室温にて、大型試験管（−２００ｍｌ）については６〜９時間、または小型試験管／アンプル（１〜１５ｍｌ）については２〜４時間解凍する（第１回目の凍結／解凍サイクル）。
３．上記バルクの所望の量は、１ｍｌアリコートである（大型試験管の場合）。
４．それらのアリコートを−７０℃にて少なくとも２時間凍結する。
５．段階２と段階４を３回以上繰り返す。
６．確認のため、第４回目の解凍サイクル後、少量の対照サンプルを希釈バッファーで０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する。
７．それらのアリコートは、−７０℃にて保存する必要がある。
８．対照Ｆ／Ｔアリコートを入れた試験管を室温にて２時間解凍した後、ＳＥ−ＨＰＬＣ試験でそれを使用する。

ｂ．ＮＥＷ ＳＥ−ＨＰＬＣ
凝集体総量の検出は、ＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ社）またはＢｉｏｓｕｉｔｅ（Ｗａｔｅｒｓ社）で行う；溶出は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ３．８を用い、定組成モードで０．５ｍＬ／分にて行う；波長は２１５ｎｍに設定する。実行時間は３０分である。Ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａバルクをそのまま（０．３５ｍｇ／ｍｌ）飽和状態のカラムに注入する（１回当たり０．２ｍｌ注入）。
Ｎｅｗ ＳＥ−ＨＰＬＣ法についての装置と材料：
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ
ＵＶ検出器：Ｗａｔｅｒｓ社製９９６ ＰＤＡ 波長２１４ｎｍ
自動サンプル採取装置 温度設定：４℃
カラムＴｏｓｏＨａａｓ社製 ＴＳＫ Ｇ２０００ ＳＷ_XL
カラム温度：室温
移動相：５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ３．８
ＮａＣｌ ５．８４グラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ３．８バッファー２リットルに溶かして調製した。前記酢酸バッファーは、酢酸をＷＦＩに加え、１０Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ−３．８まで滴定することによって滅菌溶液単位で調製した。
流速：０．５ｍＬ／分
溶離液：５０ｍＭ ＣＨ₃ＣＯＯＮａ−５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ３．８
活性化溶液：５０ｍＭ ＨＣｌ−５０ｍＭ ＮａＣｌ
試薬：
酢酸、Ｍｅｒｃｋ社コードＫ３１３５８０５６
ＮａＯＨ、Ｍｅｒｃｋ社製Ｂ１９７５８２
ＮａＯＨ １０Ｍ溶液
ＷＦＩ
ＮａＣｌ、ＪＴ ＢＡＫＥＲ社コード３６２７−０７

ｃ．沈降速度分析−ＡＵＣ
１．方法説明
サンプルを、光路長１２ｍｍの２チャネルのチャコール−エポンセンターピースを用いたセルに注入する。これらのセンターピースとサファイアウインドウを洗剤で洗浄した後、水に浸漬して、可能な限り表面を清浄にする。対応するプラセボを参照チャネルに注入する（この計器はデュアルビーム分光光度計のような機能を果たす）。これらの注入済みのセルをＡＮ−５０Ｔｉ分析用ローターに入れ、Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ−Ｉ分析用遠心機に設置し、２０℃に合わせる。このローターを３０００ｒｐｍに合わせ、サンプルを走査して（２８０ｎｍにて、吸光度ピーク）、セルが正しく設置されていることを確認する。その後、ローターを最終実行速度５００００ｒｐｍに合わせる。このローター速度にて１サンプル当たり５０回の走査を記録する。

Ｎ．Ｉ．Ｈ．のＰｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｃｋによって開発された、彼の解析プログラムＳＥＤＦＩＴ（バージョン８．７；Ｓｃｈｕｃｋ，Ｐ．（２０００）．Ｓｉｚｅ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌａｍｍ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８、１６０６〜１６１９頁）によって実行されるｃ（ｓ）法を用いてデータを解析する。

このアプローチでは、分解能を高めるためにデータに及ぼす拡散の影響をモデリングしながら、多くの未加工データを直接当て嵌めて、沈降係数の分布を得る。この方法は、全ての種が同じ全体的な流体力学的形状（球体に対する摩擦係数比、ｆ／ｆ₀によって定義される形状）を有するという前提に基づいて、沈降係数の各値に拡散係数を与えることによる方法である。ｆ／ｆ₀値を変化させて、各サンプルについて全体的に最もよくフィットしたデータを見つける。０．５１最大エントロピー平滑化を用いて分布を算出する。

２．分析パラメーター
−ローターのタイプ ８穴ローター
−ローター速度 ５０ｋ ｒｐｍ
−センターピース チャコール エポン
−チャネル長 １２ｍｍ
−ＡＵＣ実行中の温度 ２０℃
−検出波長 ２８０ｎｍ
−サンプル量 ４３２ｍｃｌ
−参照量 ４４２ｍｃｌ

３．装置とソフトウェア
分析用超遠心機 モデルＸＬ−Ｉ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）
ＳＥＤＦＩＴ ｖｅｒ ８．７０ｂ ソフトウェア（Ｐｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｃｋ−米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ））
Ｏｒｉｇｉｎ ｖｅｒ ６．０３ ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｌａｂ ＸＬ−Ａ／ＸＬ−Ｉ ｖｅｒ ５．０ ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）

ｄ．ＲＰ−ＨＰＬＣによるＩＦＮ−β−１ａ定量化−ＱＵＡＮＴ−ＨＰＬＣ
以下に記載する逆相法は、バルクサンプル中のＩＦＮ−β−１ａの定量化を可能にする。

タンパク質の定量化は、Ｃ４，Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ ５μｍカラム（Ｂａｋｅｒ社）で行う；波長を２１４ｎｍに設定し、溶出を、以下の移動相と勾配を用いて１ｍＬ／分にて行う。

手順
試験するＩＦＮ−β−１ａサンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ３．８で濃度５０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲に希釈する。

次の溶液を調製する。
溶離液Ａ：Ｈ₂Ｏ中０．１％ＴＦＡ（水／トリフルオロ酢酸０．１％）
溶離液Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ（アセトニトリル／トリフルオロ酢酸０．１％）
溶離液Ｃ：ＡＣＮ（アセトニトリル）

Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムをまず、溶離液Ｃで流速１．０ｍｌ／分にて３０分間、続いて５０％Ｈ₂Ｏおよび５０％ＡＣＮで１５分間洗浄する。このカラムを７０％溶離液Ａおよび３０％溶離液Ｂで、流速約１．０ｍｌ／分にて１５分間平衡化する。

一度、安定したベースラインが得られたら、ＩＦＮ−β−１ａバルクサンプル、対照サンプルおよび検量線用サンプル（ＰＲＢ，１．２４〜１９．８μｇ）を連続的に注入する。検量線用サンプル１．２４μｇの場合（このサンプルについては２０μｌを注入する）を除き、いずれの場合にも、１００μｌを注入する。流速は１．０ｍｌ／分に維持する。

以下の勾配を使用する。

実行時間＝６５分

試験サンプル中のＩＦＮ−β−１ａの量は、検量線範囲の対数回帰から算出する。

特性
ＩＦＮ−β−１ａバルクは、ＩＦＮ−β−１ａ ０．２８０〜０．５００ｍｇ／ｍｌを含有する。

ｅ．逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ−ＤＥＧ／ＯＸによる純度
以下に記載する逆相法は、無傷分子とは異なる溶出をする酸化形態のＩＦＮ−β−１ａの検出を可能にする。

酸化形態の定量化は、サーモスタットで４０℃に調温したＣ４，Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−３０４カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ社）で行う；波長を２０８ｎｍに設定し、溶出を、以下の移動相と勾配を用いて１ｍＬ／分にて行う。

次の溶液を調製する。
溶離液Ａ：６０％Ｈ₂Ｏ／４０％ＡＣＮ／０．１４％ＨＦＢＡ（水６０％／アセトニトリル４０％／ヘプタフルオロ酪酸０．１４％）
溶離液Ｂ：２０％Ｈ₂Ｏ／８０％ＡＣＮ／０．１４％ＨＦＢＡ（水２０％／アセトニトリル８０％／ヘプタフルオロ酪酸０．１４％）
溶離液Ｃ：２０％Ｈ₂Ｏ／８０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ（水２０％／アセトニトリル８０％／トリフロアセティックアシッド（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）０．１％）

Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを７０％溶離液Ａおよび３０％溶離液Ｂで流速１ｍｌ／分にて少なくとも１５分間（安定したベースラインが得られるまで）平衡化する。サンプル１２０μｌを注入する。試験するサンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．８で濃度０．２５０〜０．２８０ｍｇ／ｍｌの範囲に希釈する。

以下の勾配を使用する。

ＩＦＮ−β−１ａバルクサンプルの純度％をタンパク質ピークの総面積から算出する。

特性
ＩＦＮ−β−１ａの主要なピークの面積（無傷分子に相当する）は、総ピーク面積の少なくとも９５％である。

ｆ．細胞変性効果抑制バイオアッセイ−ＣＰＥ
生物効力（抗ウイルス活性）
ＩＦＮ−β−１ａバルクの抗ウイルス活性を細胞変性効果（ＣＰＥ）抑制バイオアッセイにより測定する。

ウイルス（水疱性口内炎ウイルス）の細胞変性効果からの、細胞（ＷＩＳＨ細胞−ヒト羊膜組織）のＩＦＮ−βによってもたらされる保護に基づく抗ウイルスアッセイにより、生物活性を測定する。

インターフェロンに関するバイオアッセイの原理は、数多くのウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）など）が細胞死を引き起こし、その細胞死は生体染色によって視覚化することができるという事実にある。

よって、細胞変性効果を利用して、インターフェロンによる細胞の保護を定量することができる。

アッセイは、細胞死の間接測定により行い、細胞死は生細胞によって取り込まれた色素テトラゾリウム塩ＭＴＴ（ジメチルチオテトラゾリウム）の量により評価する。

この方法では、保護された細胞の割合％についての自動分光光度定量と力価の統計的評価についての平行線検定３点法とを利用する。

手順
このアッセイは、マイクロタイタープレートにて行う。
ａ．細胞培養培地（ＭＥＭ／５％ＦＢＳ）５０μｌを各ウェルに加える。
ｂ．ＩＦＮ−β−１ａサンプルまたは標準溶液（６０〜１００ＩＵ ｈＩＦＮ−β／ｍｌ）１００μｌをウェルに加え、プレートの列で１：１．５希釈を３段階行う。
ｃ．ＷＩＳＨ細胞の懸濁液（０．７８〜０．８２×１０⁶細胞／ｍｌ）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ₂加湿インキュベーターで３７℃にて１８〜２０時間インキュベートする。
ｄ．細胞対照ウェル（ＭＥＭ／２．５％ＦＢＳを充填する）を除く各ウェルにＶＳＶ懸濁液を加える。
ｅ．これらのプレートを５％ＣＯ₂加湿インキュベーターで３７℃にて２４時間インキュベートする。
ｆ．倒立顕微鏡により
（１）ＶＳＶ対照列で少なくとも８０％の細胞損傷に達していることと、
（２）ＩＦＮ−β標準の存在下での保護の割合平均値が非希釈標準では８４％、１：１．５希釈物では４５％、さらに１：３希釈物では２７％の範囲にあること
とを確認した後、培養物を特異的色素ＭＴＴで染色する。
ｇ．着色強度を５９２ｎｍでの分光光度自動読み取りにより決定する。
ｈ．ＩＦＮ−β−１ａ活性を定量するために、それらのＯＤ測定値をコンピュータプログラム（Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により解析する。

特性
ＩＦＮ−β−１ａバルクは、少なくとも５０×１０⁶ＩＵ／ｍｌを含有する。

ｇ．エレクトロスプレーイオン化質量分析−ＥＳ−ＭＳによる炭水化物マッピング
Ａｓｎ−８０残基にＮ結合している、ＩＦＮ−β−１ａの炭水化物部分を、四重極質量分析計を用いた無傷分子のＥＳ−ＭＳにより解析する。

手順
本試験法は、次の段階からなる。
１）ＩＦＮ−β−１ａバルクサンプルの脱塩、
２）四重極質量分析計を用いたＩＦＮ−β−１ａの無傷グリコフォーム種のＥＳ−ＭＳによる半定量的解析。

ＥＳ−ＭＳスペクトルにより、無傷グリコフォームをそれらの推定分子量（タンパク質鎖ＭＷが２０ｋＤａである場合には２１〜２４ｋＤａの範囲）に従って同定する。

その後、グリコフォームをそれらのシアリル化レベル（非シアリル化、モノシアリル化、ジシアリル化、トリシアリル化）に従ってグループ分けし、それらの相対的％存在量をそれらの相対的ピーク高さに従って決定する。

サンプルの脱塩
ＩＦＮ−β−１ａサンプル（対照ＩＦＮ−β−１ａサンプルおよびバルク試験サンプル）約３５μｇを室温にてアセトニトリル／水／酢酸（４０／６０／１、ｖ／ｖ）での透析（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ １０装置，Ａｍｉｃｏｎ社製、または同等のもの）により脱塩する（ＩＦＮ−β−１ａ 約１５０μｇ／ｍｌ 終濃度）。

ＥＳ−ＭＳによる解析
正イオン化ＥＳ−ＭＳ解析は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＬＣＺシングル四重極質量分析計（または同等のもの）により、脱塩したサンプルを約６〜１０μｌ／分に設定した注入ポンプを用いてエレクトロスプレー源へ直接注入することによって実施する。

質量分析計をミオグロビンを用いてｍ／ｚ範囲６００〜２４００Ｄａにおいて較正し、次の設定を用いて実施する。
キャピラリー電圧：２．５〜４．０ＫＶ
コーン電圧：３６Ｖ
イオン源温度：７０〜１００℃

６００Ｄａ〜２４００Ｄａ（ミオグロビンの場合）および１１００〜２４００Ｄａ（ＩＦＮ−β−１ａの場合）を一般的な走査速度約１０秒／走査にて走査することにより質量取得を行う。多価イオンの質量スペクトル処理およびデコンボルーションは、Ｍａｓｓ Ｌｙｎｘソフトウェア（または同等のもの）を用いて行う。

ＥＳ−ＭＳ結果の解説
以下の表３４で示されるように、デコンボルーションした代表的なＥＳ−ＭＳスペクトルによって、ＭＳピーク（Ａ〜Ｆと称する）が、異なるグリコフォーム（これらのグリコフォームはシアリル化程度に従って４つの主要なグリコフォームグループに分類される）を示すことが分かった。

^*２Ａ＝二分岐複合型オリゴ糖；３Ａ＝三分岐複合型オリゴ糖；４Ａ＝四分岐複合型オリゴ糖；０Ｓ＝非シアリル化；２Ｓ＝ジシアリル化、３Ｓ＝トリシアリル化、１Ｆ＝フコシル化。

４つの主要なグリコフォームそれぞれの半定量的評価は、以下のとおりに行う。
・％非シアリル化グリコフォーム：ピークＦの高さ／総ピーク高さ×１００。
・％モノシアリル化グリコフォーム：ピークＢの高さ／総ピーク高さ×１００
・％ジシアリル化グリコフォーム：ピーク（Ａ＋Ｃ）の高さ／総ピーク高さ×１００
・％トリシアリル化グリコフォーム：ピーク（Ｄ＋Ｅ）の高さ／総ピーク高さ×１００
ここでの総ピーク高さとは、ピーク高さＡ〜Ｆの合計である。

％ＩＦＮ−β−１ａ ジシアリル化グリコフォームの算出の際、１個の末端メチオニンがないＮ末端、末端切断型（２−１６６ａａ）２Ａ２Ｓ１Ｆ ＩＦＮ−β−１ａに相当する約２２２４４Ｄａ（図ＳＰＡ−１）にある非標識のＭＳピークは考慮に入れないことに留意する。この夾雑物のレベルは独立したバルク純度リリース試験により制御される（Ｎ末端の末端切断、Ｎ−１：ＮＭＴ６％）。

特性
スペクトルは、推定ＩＦＮ−β−１ａプロフィール（％ピーク高さ）と一致する。
非シアリル化グリコフォーム：多くて５％
モノシアリル化グリコフォーム：６〜３０％
ジシアリル化グリコフォーム：５６〜８１％
トリシアリル化グリコフォーム：８〜１６％

ｈ．等電点電気泳動法−ＩＥＦ
ＩＦＮ−β−１ａアイソフォームを等電点電気泳動法により分離し、クーマシーブルー染色によって視覚化する。次いで、アイソフォームのｐＩをＰＲＢのものと比較する。グリコフォームのｐＩと範囲をデンシトメトリーにより測定する。

手順
サンプルの調製：
ＩＦＮ−β−１ａサンプルを遠心式微量濃縮装置を用いて０．７〜１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。

ゲルの調製と等電点電気泳動：
ＩＥＦ用５％アクリルアミドゲルを調製し、キャスティング後、非重合していない全てのアクリルアミドを除去するために洗浄する。その後、ゲルを両性電解質（２％最終、ｐＨ範囲３〜１０）、１０ｍＭグルタミン酸、１０ｍＭリジンおよび３％グリセロールで再構成し、水平型電気泳動装置に入れ、１５℃に冷却する。

窒素流下、二酸化炭素トラップ（０．１Ｍ ＮａＯＨ）の存在下で電力１Ｗにて６０分間ゲルを予備泳動する。

バルクＩＦＮ−β−１ａ 約３．５μｇ、シトクロムｃ ６μｇおよび適当なｐＩ標準品を液滴（５μｌ）としてゲル表面に適用する。

ＩＥＦ用ゲルを１０℃にて８０００Ｖ−時間で電気泳動する。

Ｎｅｕｈｏｆｆらのコロイド手法（Ｎｅｕｈｏｆｆ，Ｖ．，Ａｒｏｌｄ，Ｎ．，Ｔａｕｂｅ，Ｄ．，Ｅｈｒｈａｒｄｔ，Ｗ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｔ ｎａｎｏｇｒａｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０およびＲ−２５０，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９８８、９、２５５〜２６２頁）により、そのゲルを２０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡで３０〜３５分間固定した後、クーマシーブルーで染色する。

ＩＦＮ−β−１ａアイソフォームの定量化およびｐＩ判定は、自動デンシトメーター（コンピューティングデンシトメーター、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社，ＵＳＡ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ３．３プログラムと結果の統合／計算に必要な他の専用ソフトウェア付属；または同等の装置）により行う。

特性
試験サンプルに関して得られた電気泳動図は、社内標準品に関して得られたものと同様である。
１．得られた電気泳動図は、合計５〜１０バンドからなる３つの主要なバンド群（ローディングポイントにあるバンドを除く）で構成されており、標準品に関して得られたバンドパターンと一致する。
２．デンシトメトリーにより測定した５つの主要なバンドは、表３２に示されるグループの範囲に含まれるであろう。

参照文献
１．Ｄｅｒｙｎｋ Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９８０、２８５、５４２〜５４７．
２．Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ．、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．およびＰｅｓｔｋａ，Ｓ．１９８１ 「Ａ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，」 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第７８巻（Ｓ．Ｐｅｓｔｋａ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３８７〜３９４頁、
３．Ｍａｒｋ Ｄ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１（１８）５６６２〜５６６６頁（１９８４）．
４．Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．（１９８６）「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ，」 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｐｅｓｔｋａ，ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １１９、１４〜２３頁．
５．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ．およびＰｅｓｔｋａ，Ｓ．Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ １９８１、３７、７５５〜７５８頁．
６．Ｓｈｅｐａｒｄ Ｈ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９８１、２９４、５６３〜５６５頁．

小実験室規模熱解離手順。図１はバルク−インターフェロン安定化へのインキュベーション温度とインキュベーション時間の効果に関する実施例１ａの小実験室規模熱解離手順を示す図である。図１は表４を表したものである。４Ｆ／Ｔ後のバルクサンプル０．９ｍｌについてのＳＥ−ＨＰＬＣ結果。 図２は実施例１ｂの４Ｆ／Ｔサイクル後の２９℃での実験室規模熱解離の結果を示す図である。Ｙ軸は面積率％を表す。Ｘ軸は、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａの検出形態、すなわち、凝集体、二量体または単量体を表す。各検出形態の第１のカラムは対照であり、ＲＴにて２時間解凍した後、−４℃にて保存したバルク予備調製物に相当する。各検出形態の第２のカラムは、ＲＴにて２時間解凍した後、２９℃にて３時間インキュベートしたバルク−予備調製物に相当する。各検出形態の第３のカラムは、ＲＴにて２時間解凍した後、２９℃にて１５時間インキュベートしたバルク予備調製物に相当する。各検出形態の最後、すなわち第４のカラムは、バスで解凍した後、２９℃にて１５時間インキュベートした予備調製物に相当する。図２は表１１を表したものである。 ２Ｆ／Ｔ後のバルクサンプル２００ｍｌについてのＳＥ−ＨＰＬＣ結果。図３は実施例１ｂの２Ｆ／Ｔサイクル後の２９℃での実験室規模熱解離の結果を示す図である。Ｙ軸は面積率％を表す。Ｘ軸は、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａの検出形態、すなわち、凝集体、二量体または単量体を表す。各検出形態の第１のカラムは対照であり、ＲＴにて７時間解凍した後、−４℃にて保存したバルク予備調製物に相当する。各検出形態の第２のカラムは、ＲＴにて７時間解凍した後、２９℃にて１５時間インキュベートしたバルク−予備調製物に相当する。図３は表１２を表したものである。 実験室規模Ｆ／Ｔ×１での熱解離速度。経過時間に対する単量体の割合％。図４は２９℃にてインキュベートしたときの、１Ｆ／Ｔサイクル後の、経過時間に対するｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ中の単量体の割合％を示す図である。Ｙ軸は面積率％を表す。Ｘ軸は経過時間（時間）を表す。図４の結果を、表１４に示す。 実験室規模Ｆ／Ｔ×１での熱解離速度。経過時間に対する二量体の割合％。図５は２９℃にてインキュベートしたときの、１Ｆ／Ｔサイクル後の、経過時間に対するｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ中の二量体の割合％を示す図である。Ｙ軸は面積率％を表す。Ｘ軸は経過時間（時間）を表す。図５の結果を、表１４に示す。 実験室規模Ｆ／Ｔ×１での熱解離速度。経過時間に対する凝集体の割合％。図６は２９℃にてインキュベートしたときの、１Ｆ／Ｔサイクル後の、経過時間に対するｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ中の凝集体の割合％を示す図である。Ｙ軸は面積率％を表す。Ｘ軸は経過時間（時間）を表す。図６の結果を、表１４に示す。 実施例２の予備調製研究のスキーム。図７は実施例２の研究のスキームを示す図であり、この実施例２では、安定化バルクインターフェロン−βを提供するために、ＳＥＣ−ＥＬ画分から最終剤形（ＦＤＦ）の保存までの製造段階でのｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化を最小限にとどめることに着目している。このスキームについては、実施例２の第６．２節でも記載している。 図７−１に続く実施例２の予備調製研究のスキーム。 実施例３の予備調製研究のスキーム。図８は実施例３の研究のスキームを示す図であり、実施例３では、ｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａのオリゴマー化を最小限にとどめることを目的とし、バルクＩＦＮ−βの安定化後のｒ−ｈ ＩＦＮ−β １ａ単量体のレベルを測定するために２つの異なる方法、速度超遠心分離法とＳＥ−ＨＰＬＣ法とを用いている。このスキームについては、実施例３の第６．１節と第６．２節でも記載している。 図８−１に続く実施例３の予備調製研究のスキーム。

Claims (44)

1. 単量体タンパク質の安定化バルク溶液を調製する方法であって、前記方法が、
   ａ）バッファー溶液中に単量体タンパク質のバルクを供給するステップと、
   ｂ）前記バルクに
   ｉ）静菌剤、
   ｉｉ）界面活性剤、
   ｉｉｉ）等張化剤、
   ｉｖ）アミノ酸、
   ｖ）抗酸化剤、
   ｖｉ）等張化剤および抗酸化剤、
   ｖｉｉ）等張化剤、抗酸化剤およびアミノ酸、
   ｖｉｉｉ）アミノ酸および抗酸化剤、
   ｉｘ）アミノ酸、抗酸化剤および界面活性剤、
   ｘ）静菌剤および抗酸化剤、ならびに
   ｘｉ）静菌剤、抗酸化剤および界面活性剤
   からなる群から選択される賦形剤を加えるステップを含む方法。
2. 単量体タンパク質がインターフェロンである、請求項１に記載の方法。
3. インターフェロンがＩＦＮ−βである、請求項２に記載の方法。
4. ＩＦＮ−βが組換えヒトＩＦＮ−βである、請求項３に記載の方法。
5. タンパク質が凝集に対して安定化される、請求項１に記載の方法。
6. タンパク質がオリゴマー化に対して安定化される、請求項１に記載の方法。
7. 静菌剤がベンジルアルコールである、請求項１に記載の方法。
8. 界面活性剤がＴｗｅｅｎ ２０である、請求項１に記載の方法。
9. 等張化剤がマンニトールである、請求項１に記載の方法。
10. アミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項１に記載の方法。
11. 抗酸化剤がメチオニンである、請求項１に記載の方法。
12. 等張化剤がマンニトールであり、かつ抗酸化剤がメチオニンである、請求項１に記載の方法。
13. 等張化剤がマンニトールであり、抗酸化剤がメチオニンであり、かつアミノ酸がリジンである、請求項１に記載の方法。
14. アミノ酸がリジンと抗酸化剤メチオニンである、請求項１に記載の方法。
15. アミノ酸がリジンと抗酸化剤メチオニンであり、かつ界面活性剤がＴｗｅｅｎ ２０である、請求項１に記載の方法。
16. 静菌剤がベンジルアルコールであり、かつ抗酸化剤がメチオニンである、請求項１に記載の方法。
17. 静菌剤がベンジルアルコールであり、抗酸化剤がメチオニンであり、かつ界面活性剤がＴｗｅｅｎ ２０である、請求項１に記載の方法。
18. 前記バルクタンパク質を２７℃〜３１℃の温度範囲でインキュベートするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記温度が２９℃である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記インキュベーションを請求項１に記載の予備調製段階前後に実施する、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記インキュベーションを少なくとも３時間行う、請求項１８、１９または２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記インキュベーションを６時間〜４０時間の範囲の間行う、請求項１８、１９または２０のいずれかに記載の方法。
23. 前記インキュベーションを１５時間〜３０時間の範囲の間行う、請求項１８、１９または２０のいずれかに記載の方法。
24. 前記インキュベーションを１０時間、１６時間、１８．５時間または２４時間の間行う、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
25. 前記インキュベーションを２４時間の間行う、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
26. 前記ＩＦＮが３．０〜６．０のｐＨ範囲で維持される、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記ｐＨが４．７である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＩＦＮが約１０μｇ／ｍｌ〜約２０００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記ＩＦＮが約５００μｇ／ｍｌまたは約８１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記バッファーが約５ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記バッファーが約１０ｍＭまたは約５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 前記等張化剤が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 前記等張化剤が約５５ｍｇ／ｍｌまたは約１５０ｍＭまたは約３００ｍＭまたは約６００ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
35. 前記Ｔｗｅｅｎ ２０が約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
36. 前記抗酸化剤が約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記抗酸化剤が約０．１２ｍｇ／ｍｌまたは約０．２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
38. 前記アミノ酸が約２０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
39. 前記リジンが約２７ｍｇ／ｍｌまたは約５５ｍｇ／ｍｌまたは約８２ｍｇ／ｍｌまたは約１６４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
40. 前記アルギニンが約３２ｍｇ／ｍｌまたは約６３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
41. 前記静菌剤が約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
42. 前記静菌剤が約５ｍｇ／ｍｌまたは約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
43. 請求項１〜４２のいずれかの方法によって得られる、予備調製されたバルクタンパク質。
44. 請求項１〜４２のいずれかの前記タンパク質のバルクの予備調製方法を含む、単量体タンパク質の安定性を増大および／または維持する方法。

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