JP2008542366A - Ｆｚｄ８モジュレーターを同定する方法および変形性関節症を処置するためのそのようなモジュレーターの使用 - Google Patents

Abstract

受容体Fzd8の機能を調節する薬剤を同定するための方法およびキットが提供される。したがって、本発明は、Wnt−Fzd8シグナリングのモジュレーターとして役立つ薬剤を同定するための利用可能な方法を提供する。また、変形性関節症を処置するための同定した薬剤の治療的使用が提供される。

Description

技術分野
本発明は、受容体Fzd8が、正常組織と比較して変形性関節症で、特異的に、異所的に、および/または高度に発現しているという発見に関する。したがって、本発明は、一般に、軟骨細胞および軟骨関連疾患、とりわけ、変形性関節症(OA)の処置において、Fzd8アンタゴニストを使用する方法に関する。本発明はまた、受容体Fzd8のリガンドとしての、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3を含むWntポリペプチドの同定、および、変形性関節症での軟骨細胞(cartilage chondrocyte)表現型の制御におけるWnt−Fzd8シグナリングの役割に関する。

発明の背景
変形性関節症(OA)は、西洋社会で身体障害の主要な原因である、退行変性関節疾患である。それは、関節軟骨細胞、軟骨下骨、滑液、滑膜および関節周囲の構造、特に筋肉における進行的な異常により特徴づけられる。正確な原因はまだはっきりしていないが、おそらく、軟骨細胞の異常が疾患発症の原因である。

変形性関節症の環境危険因子は関連する関節に依存しているが、外傷、栄養因子(ビタミンC、DおよびEの低食事摂取)、肥満ならびに特定の職業的活動および他の活動を含む。また、遺伝的因子が変形性関節症の重要な原因であることも明らかである。

現在、変形性関節症は、医薬および非医薬的な方法の組合せで処置されている。医薬的な方法はNSAIDの投与を含むが、処置に使用される多くの薬剤が、関連する望まない副作用を有する。したがって、処置レジメンを改良する必要がある。

Wntタンパク質は、細胞分化、細胞−細胞相互作用を制御し、発生および疾患で重要な役割を果たす高度に保存された分泌型シグナリング分子のファミリーを形成する(今日まで19個のメンバーが既知である)。Wntタンパク質は、胚のパターニングならびに組織および細胞型の産生から細胞移動、極性、軸索ガイダンスおよびシナプス形成の制御まで、発生の多くの段階を制御する(Willert, K., Brown, JD., Danenberg, E., Duncan, AW., Weissman, IL., Reya, T., Yates, JR., Nusse, R., (2003) Wnt proteins are lipid modified and can act as stem cell growth factors (Nature, 423, 409−414)。細胞レベルで、それらは細胞分化および増殖に関与する。

アフリカツメガエルでは、アフリカツメガエルWnt8により誘導されるアフリカツメガエル二次軸の阻害によりアッセイしたとき、可溶性Fzd8 CRDが明らかなWntシグナリングのアンタゴニスト活性を有することが示された(Deardoff M. et al (1998) Development 125; 2687)。

Wntは、細胞表面受容体のFrizzled(Fzd)ファミリーに結合する疎水性脂質修飾タンパク質である。Fzdは、リガンド結合で役割を果たすと考えられるN末端システインリッチドメイン(CRD)により特徴づけられた、7回膜貫通型受容体のファミリーを形成する(今日まで10個のメンバーが既知である)。

古典的Wntシグナリング経路では、Wntは、Fzd受容体からβ−カテニンを介してシグナルを伝え(標準経路)、TCF/LEF応答遺伝子の活性化または阻害を生じる(Nusse, R. (1999), Wnt Targets :Repression and activation, TIG 15(1), 1−3)。

さらに、分泌型Wntは、SFRP(分泌型Fzd関連ペプチド)ファミリーのメンバーに結合する。SFRPは、Fzd受容体のCRDリガンド結合ドメインに相同性を有する分泌型タンパク質であり、細胞外Wntインヒビターとして機能すると考えられる。

ショウジョウバエで観察された個々のWntおよびFzd変異体表現型間での1:1相関の欠如は、Wnt/Fzd系におけるあるレベルの余剰を示し得る。2002年にNusseにより行われた、ショウジョウバエでWntおよびFzdの結合を見る研究は、下記のペアを示した: Wnt1とFzd2、Wnt4とFzd1およびFzd2。Wnt8は試験されたが、その研究ではどのFzdとも高い親和性を持って結合しなかった(Chi−hwa Wu and Roel Nusse (2002) Ligand Receptor Interactions in the Wnt Signaling Pathway in Drosophila J. Biol. Chem. 277: 41762−41769)。

インビトロ固相結合アッセイは、アフリカツメガエルWnt8タンパク質がマウスFzd8のCRDドメイン(CRD−IgG融合)に、〜9nMの親和性で結合できることを証明し(Hsieh, J. C., Rattner, A., Smallwood, P. M. and Nathans, J. (1999). Biochemical characterization of Wnt−frizzled interactions using a soluble, biologically active vertebrate Wnt protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,3546−3551)、ゼブラフィッシュWnt8bおよびゼブラフィッシュFzd8aを、ゼブラフィッシュ胚で外生的に発現させたとき、機能的に相互作用することが示された(Kim, S.H. Jimann Shin, Hae−Chul Park, Sang-Yeob Yeo, Sung-Kook Hong, Sangtae Han, Myungchull Rhee, Cheol−Hee Kim, Ajay B. Chitnis and Tae−Lin Huh^. (2002). Specification of an anterior neuroectoderm patterning by Frizzled8a−mediated Wnt8b signalling during late gastrulation in zebrafish. Development, 129(19): 4443−4455)。

しかしながら、今日まで、ヒトFzd8と特定のWntリガンドのはっきりした関連は示されていない。

発明の要約
本発明者らは、本発明により、Fzd8が変形性関節症の発症および進行において重要な役割を果たすことを決定した。また、彼らは、Fzd8がWnt8aの受容体であることを決定した。

Wnt8aで刺激した初代関節軟骨細胞(articular cartilage chondrocytes)は、通常は、軟骨内骨化の過程と関連した変化である、休止状態からより肥大性の状態への表現型の変化に関連する遺伝子の発現を調節することにより応答する。

軟骨内骨化は、軟骨スキャホールドモデルのリモデリング後の石灰化骨の形成であり、発生の間における長骨成長の正常な過程である。軟骨細胞表現型変化は、この過程の間に起こり、コラーゲンXのようなマトリックスタンパク質を発現および分泌する成熟した肥大軟骨細胞の蓄積を生じ、その結果、石灰化細胞外マトリックスおよび最終的には新骨の形成を生じる。さらなる軟骨内骨化が望まれない正常な十分に成長した関節軟骨では、軟骨細胞分化は負に制御される。しかしながら、変形性関節症では、この制御は明らかに失われ、非石灰化関節軟骨および骨の間のインターフェースで見られる深部石灰化軟骨が深部軟骨中に拡大し広がり、覆っている軟骨マトリックスの機械的特性を危うくする。したがって、Wnt/Fzd8経路は、関節軟骨細胞分化および肥大を刺激し、より石灰化した深部細胞外マトリックスを生じ、最終的には、軟骨統合の欠損、軟骨浸食および変形性関節症の間に観察される関節腔狭窄に貢献する役割を果たす。したがって、本発明は、変形性関節症を処置するために該活性を調節する薬剤を用いて、この経路を標的とすることに関する。本発明はまた、変形性関節症の処置のためのWnt＼Fzd8経路のアンタゴニストの使用に関する。この経路を標的にすることにより軟骨細胞分化を減少または阻害することによって、石灰化軟骨の形成が減少し、したがって、変形性関節症の進行が遅延するか停止すると考えられている。

したがって、第1の局面では、本発明は、軟骨細胞でのFzd8経路を阻害する方法を提供し、ここで、該方法は、軟骨細胞を、軟骨細胞分化および/または肥大(hypertropy)の減少または阻害を生じる、Wnt/Fzd8経路アンタゴニストを接触させることを含む。ある態様では、アンタゴニストは、軟骨細胞上のFzd8に結合するFzd8アンタゴニストである。好ましくは、Fzd8アンタゴニストは、Fzd8に結合する抗体である。他の態様では、Fzd8リガンドのアンタゴニスト、例えば、Fzd8のWntリガンド(例えば、Wnt8a)に結合する抗体を使用し得る。他の局面では、アンタゴニストは、Fzd8のWntリガンドに結合するFzd8のCRDドメインであり、それにより、Fzd8に結合するWntリガンドのレベルを妨害するか、または減少させる。

他の局面では、本発明は、変形性関節症を有するほ乳類を治療的に処置する方法を提供し、ここで、該方法は、該ほ乳類に、治療上有効量のFzd8アンタゴニストを投与することを含み、それにより、変形性関節症の有効的な治療的処置を生じる。好ましくは、Fzd8アンタゴニストは抗体であり、より好ましくは、Fzd8のCRDドメインに結合する抗体である。

本発明はまた、ヒトFzd8受容体の天然のリガンドとしての、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3を含むWntポリペプチドの同定に関する。本発明は、Fzd8受容体の活性を調節する薬剤に関するスクリーニングアッセイをもとにして、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3を含むWntポリペプチドとFzd8ポリペプチド間の相互作用の使用を包含する。さらに、Wnt/Fzd8相互作用、特に、Fzd8とWnt8aの相互作用が、変形性関節症の発症に関連していることを証明している。したがって、本発明はまた、Wnt/Fzd8相互作用に基づく診断アッセイならびに診断およびスクリーニングアッセイを行うためのキットを包含する。

したがって、ある局面では、本発明は、Fzd8の機能を調節する薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、
a) Fzd8ポリペプチドを、Wntポリペプチドと、該Wntポリペプチドが該Fzd8ポリペプチドと結合可能な条件のもとで、候補モジュレーターの存在下または非存在下で接触させること;および、
b) 該Fzd8ポリペプチドの該Wntポリペプチドへの結合を測定すること(ここで、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較して該候補モジュレーターの存在下での結合の減少が、該候補モジュレーターをFzd8の機能を調節する薬剤として同定する)を含む。

本明細書で使用するとき“Fzd8ポリペプチド”なる用語は、EMBL受託番号AX367099で示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、それらに対して少なくとも70%、および、好ましくは、80%、90%、95%、もしくは、より高いアミノ酸相同性を有するポリペプチド、ならびに、Fzd8機能または活性を有する、例えば、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3ポリペプチドのようなWntポリペプチドに結合するポリペプチド、または、その機能的断片のことを言う。“Fzd8ポリペプチド”はまた、短形、変異型、誘導体およびポリペプチドの活性断片のことを言い、ここで、該形および断片は、Fzd8活性を保持する。ある態様では、該断片はFzd8のWnt結合サイトを含む。

“Fzd8の機能”または“Fzd8活性”により、Fzd8結合活性、ならびに、特に、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3のようなリガンドWntに結合する能力を意味する。2つのタンパク質間の結合活性は、当業者に既知の多くの技術により検出し得る。“Fzd8の機能”はまた、Fzd8シグナリング活性のことを言う。

本明細書で使用するとき“Wntポリペプチド”なる用語は、Wntファミリータンパク質に特有のアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを言う。したがって、例えば、“Wntポリペプチド”は、Wnt8a、Wnt8bおよびWnt3ポリペプチドを含む。“Wnt8aポリペプチド”は、例えば、EMBL受託番号AB057725で示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、それらに対して少なくとも70%、および、好ましくは、80%、90%、95%、もしくは、より高いアミノ酸相同性を有するポリペプチド、ならびに、Fzd8ポリペプチドに結合するポリペプチドのようなWnt8a活性を有するポリペプチド、または、その機能的断片のことを言う。“Wntポリペプチド”はまた、短形およびポリペプチドの活性断片のことを言い、ここで、該形および断片はWnt活性を保持する。

“Wnt活性”または機能により、Wntリガンド活性、および、特に、Fzd8に結合するその能力を意味する。

結合を検出するための方法は、例えば、Biacore ABから利用できるセンサーを用いた表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光偏光測定、電気化学発光および化学発光、バイオセンサーアッセイなどを含む。

WntおよびFzdに関する結合アッセイは、この参考文献に詳述してあり、そこでは、Wnt8が、9nMの親和性を持ってFzd8のCRDドメインに結合できる(Hsieh, J. C., Rattner, A., Smallwood, P. M. and Nathans, J. (1999) Biochemical characterization of Wnt-frizzled interactions using a soluble, biologically active vertebrate Wnt protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3546−3551)。

本発明の他の局面では、Fzd8の機能を調節する薬剤を同定する方法を提供しており、該方法は、
a) Fzd8ポリペプチドを、Wntポリペプチドと、該Wntポリペプチドが該Fzd8ポリペプチドと結合可能な条件のもとで、候補モジュレーターの存在下または非存在下で接触させること;および、
b) 該Wntポリペプチドに対する該Fzd8ポリペプチドのシグナリング活性を測定すること(ここで、該候補モジュレーターの非存在下での活性と比較して該候補モジュレーターの存在下での活性の変化が、該候補モジュレーターをFzd8の機能を調節する薬剤として同定する)を含む。

本明細書で記載したとおり、Fzd8シグナリング活性を測定するためのある適当な方法は、β−カテニンの蓄積、核トランスロケーションまたはリン酸化状態を測定することである。測定は、他の適当な方法が当業者に既知ではあるが、例えば、免疫蛍光のような技術を用いて為し得る。Fzd8シグナリング活性を測定するための他の適当な方法は、β−カテニンにより仲介される遺伝子発現を含む下流のシグナリングイベントを測定することを含む。本明細書で記載したとおり、β−カテニンは、TCF/LEF転写アクチベーター/リプレッサーのファミリーを介した遺伝子発現を調節する。したがって、活性はまた、次のTCF/LEF転写活性を検出することにより測定し得る。発現が調節される遺伝子は、Col α1(II)、Col α1(IX)、Col α1(XI)、SOX9、アグリカン、Col α1(X)、フィブリン、骨マトリックスGLAタンパク質、コンドロモジュリンおよびVEGFを含む。

他の適当なアッセイは、Fzd8応答因子がレポーター構築体に結合している、レポーター遺伝子アッセイを含む。適当なレポーター遺伝子構築体は、当業者に既知である。

ある態様では、機能を調節する薬剤は、該候補薬剤の非存在下、EC₅₀がWntにより誘導される量の少なくとも50%であれば、検出される。

同様に、本発明の他の局面では、Wntの機能または活性を調節する薬剤を同定する方法を提供し、該方法は、
a) Fzd8ポリペプチドを、Wntポリペプチドと、該Wntポリペプチドが該Fzd8ポリペプチドと結合可能な条件のもとで、候補モジュレーターの存在下または非存在下で接触させること;および、
b) 該Fzd8ポリペプチドの該Wntポリペプチドへの結合を測定すること(ここで、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較して該候補モジュレーターの存在下での結合の減少が、該候補モジュレーターをWntの機能または活性を調節する薬剤として同定する)を含む。

好ましくは、該方法で使用するポリペプチドは、Wnt3、Wnt8aまたはWnt8bから選択される。

本発明の任意の局面における好ましい態様では、該方法またはアッセイは、膜アッセイである。

適当には、本発明のこの局面に従った方法は、全細胞アッセイのような細胞アッセイである。そのような細胞アッセイは、好ましくは、Wnt8aの存在下、細胞株中にFzd8を発現し、該細胞を候補モジュレーターと接触させ、そして、β−カテニン蓄積、核トランスロケーションまたはリン酸化状態を測定する工程を含む。ある態様では、該全細胞アッセイは、細胞または細胞株にFzd8およびWnt8aを共トランスフェクションすることを含み得る。

適当には、本発明に従った方法は、スクリーニングアッセイとして提供し得る。スクリーニングは、例えば、インビトロ、すなわち細胞培養で、および/またはインビボであり得る。生物学的スクリーニングアッセイは、好ましくは、活性ベースの応答モデル、結合アッセイ(いかによく化合物が結合するかを測定する)、ならびに細菌、酵母および動物細胞株(細胞中の化合物の生物学的効果を測定する)を中心とする。適当なアッセイは、本明細書に記載している。アッセイは、多くのモジュレーターを、望む活性を有する化合物またはモジュレーターを同定するために試験し得る、大容量ハイスループットスクリーニング(HTS)のために自動化し得る。

現在のスクリーニング技術は、Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes. New York, NY, Marcel Dekker, (2001)により編集された、Handbook of Drug Screeningに記載されている。

本発明の任意の局面のある態様では、Fzd8またはWntポリペプチドは、検出可能に標識され得る(すなわち、該ポリペプチドは、容易に検出可能な官能基(標識)を内蔵する構造的修飾を有する)。検出可能な標識は、とりわけ、蛍光化合物、同位体化合物、ビオチン、酵素、抗血清またはモノクローナル抗体が利用できるタンパク質を含む。

本明細書で使用するとき“候補モジュレーター”なる用語は、非限定的に、天然であるか否かは問わず、任意の適当な起源から取得し得るか、または産生し得る化合物を含む。

本発明の他の局面では、上記局面の何れかに従った方法を用いて、Wntポリペプチドの機能または活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。

候補モジュレーターまたは化合物を、ペプチドおよび他の化合物、例えば、小有機分子およびとりわけ新規リード化合物を含み得る化合物ライブラリーから設計または取得し得る。一例として、候補モジュレーター化合物は、天然物、生物学的巨大分子、または、細菌、微生物、または動物(とりわけ、ほ乳類)細胞もしくは組織のような生物学的材料からの抽出物、有機もしくは無機分子、合成候補モジュレーター、準合成候補化合物、構造的もしくは機能的模倣剤、ペプチド、ペプチド模倣剤、誘導体化候補化合物、全タンパク質から切断したペプチド、または合成的に合成したペプチド(例えば、ペプチド合成機を用いるか、または組み換え技術またはその組合せ、組み換え候補モジュレーター、天然または非天然候補化合物、融合タンパク質またはその同等体および変異体、誘導体またはその組合せによる)であり得る。他の候補モジュレーター化合物は、抗体、アプタマー、およびsiRNAまたはアンチセンス化合物を含む、核酸分子を含み得る。候補化合物は、既知Fzd8またはWntポリペプチドの阻害剤のようなFzd8またはWntのモジュレーターである化合物でさえあり得て、いくつかの方法、例えば、組み換えDNA技術または化学合成技術により修飾されている。

典型的には、候補化合物は、組み換えDNA技術および/または化学合成技術により製造される。

Fzd8またはWntポリペプチド、とりわけ、Wnt8aまたはWnt8bポリペプチドと相互作用が可能な候補化合物が単離されると、さらなる工程は、候補化合物を選択および/または修飾する、および/または既存化合物を修飾し得て、その結果、それらは、Fzd8またはWntポリペプチドを調節できる。

ある局面では、Fzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターは、他の化合物の開発のためのモデル(例えば、鋳型)として作用し得る。

さらなる局面は、1個またはそれ以上のモデル系(例えば、生物学的モデル、疾患モデル、またはFzd8阻害モデル)で、本発明のアッセイおよび方法により同定した候補化合物またはFzd8もしくはWntポリペプチドモジュレーターの使用に関する。そのようなモデルは、研究目的および特定の候補化合物の生物学的、物理化学的、薬理学的および/または薬物動態活性の詳細をさらに明らかにするために使用し得る。例示として、本発明の候補化合物またはFzd8もしくはWntポリペプチドモジュレーターを、Fzd8シグナリングが特に重要であることが知られている生物学的モデルまたは系で使用し得る。

他の局面では、本発明に従った方法を使用して同定した薬剤を提供する。

本発明の他の局面は、ある工程に関し、該工程は:
(a)本発明に従った方法、または本発明に従ったアッセイを行うこと;
(b)1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターを同定すること;および、
(c)大量の該1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターを製造することを含む。
好ましくは、該Wntポリペプチドモジュレーターは、Wnt8aまたはWnt8bのモジュレーターである。

本発明のさらなる局面は、ある工程に関し、該工程は:
(a)本発明に従った方法、または本発明に従ったアッセイを行うこと;
(b)1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターを同定すること;および、
(c)該1個またはそれ以上の同定したFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターを含む医薬組成物を製造することを含む。
好ましくは、該Wntポリペプチドモジュレーターは、Wnt8aまたはWnt8bのモジュレーターである。

さらなる局面は、ある工程に関し、該工程は:
(a)本発明に従った方法、または本発明に従ったアッセイを行うこと;
(b)1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドモジュレーターを同定すること;
(c)該1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドモジュレーターを修飾すること、および、
(d)所望により、該1個またはそれ以上のFzd8またはWntポリペプチドモジュレーターを含む医薬組成物を製造することを含む。
好ましくは、該Wntポリペプチドモジュレーターは、Wnt8aまたはWnt8bのモジュレーターである。

本発明の他の局面では、医薬としての使用のためのFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターを提供する。

好ましくは、医薬としてのモジュレーター使用は、Wnt8aまたはWnt8bのモジュレーターである。

適当な、モジュレーターまたは候補化合物は、Fzd8またはWnt、とりわけ、Wnt8aまたはWnt8bの遺伝子発現を下方調節できるモジュレーターを含む。遺伝子発現の下方調節は、siRNA分子のような化合物の投与を介して達成できる。Fzd8発現の下方調節のための適当なsiRNA分子は、本明細書に記載している。

他のモジュレーターは、抗体、アプタマー、アンチセンスまたはsiRNA分子などを含む。

また本発明のさらなる局面では、OAの処置での使用のための医薬の製造における、Fzd8またはWntポリペプチド、とりわけ、Wnt8aまたはWnt8bポリペプチドのモジュレーターの使用を提供する。

適当には、該モジュレーターは、本発明に従った任意の方法で同定した化合物である。

本明細書で同定したとおり、ヒトsFRP3(FrzB)ポリペプチドの過剰発現は、Wntポリペプチドに応答するFzd8シグナリング活性を妨害し得る。したがって、本発明の他の局面では、医薬としての使用のために、sFRP3(FrzB)ポリペプチド、またはその機能的断片もしくは誘導体を含む組成物を提供する。

本発明の他の局面では、OAの処置での使用のための医薬の製造において、ヒトFzd8のシステインリッチドメイン、またはその機能的断片もしくは誘導体を含む組成物を提供する。システインリッチドメインは、ヒトFzd8の120アミノ酸のN末端保存ドメインであり、10個の非変異型システインを含む(EMBL受託番号AB043703)。

本発明の他の局面では、Fzd8シグナリングの異常調節により特徴づけられる疾患を診断する方法を提供し、試料中のFzd8発現を検出し、該発現を正常組織中の発現と比較することを含む。

本明細書に記載したとおり、Fzd8発現は、変形性関節症軟骨で上方調節される。したがって、本発明の他の局面では、正常組織と比較して試料組織でFzd8発現を検出することを介して、OAを診断する方法を提供する。

適当には、Fzd8発現の検出は、PCR、インサイチュハイブリダイゼーションまたは免疫化学のような技術を介して行い得るが、他の技術は当業者に既知である。

他の局面では、Fzd8活性を修飾する薬剤をスクリーニングするためのキットを提供する。

またさらなる局面では、診断用キットを提供する。

表および図の簡単な説明
表1.Fzd8、Wnt8a、COL9A1、COL11A1、COLX、BGLAP、VEGFおよびFzd7(Assay on Demand、ABI)およびGAPDH(以前に開発されたプライマー/プローブ混合物)ためのプライマーおよびプローブを、Applied Biosystemsから予め製剤された20×混合物として取得した。

表2.変形性関節症軟骨細胞におけるWnt8a過剰発現の影響。軟骨細胞を、アデノウイルス(Adv):Adv−Wnt8aまたはAdv−RFP(コントロール)で感染させ、Wnt8a特異的遺伝子発現変化を、42日までの間隔で、定量的RT−PCRを用いてモニターした。Wnt8a制御遺伝子変化は、コントロール(Adv−RFP)感染細胞の遺伝子発現レベルと比較して、誘導された倍率誘導(上方調節遺伝子)または減少した倍率(下方調節遺伝子)として示される。

図の説明
図1.正常なヒト組織およびヒト関節軟骨におけるヒトFzd8定量的RT−PCR。Fzd8発現は18S RNAで標準化した。

図2.正常(死後)および変形性関節症関節軟骨におけるヒトFzd8定量的RT−PCR。試料は、内側ならびに側部大腿骨顆および脛骨プラトー由来のRNAを含む。Fzd8発現は、18S RNAで標準化した。

図3.Fzd8免疫組織化学。ヒトFzd8を、Fzd8免疫化ペプチドの非存在下(上)または存在下(下)で、ウサギ抗ヒトFzd8ポリクローナル抗体を用いて、ヒトOA関節軟骨において検出した。ある例では、軟骨細胞の中間部/深部(Mid/Deep zone)が、強く、特異的なFzd8反応性を示すことを証明した(DAB発色)。像は、中間部像の10×倍率(左)または20×倍率(右)である。SZ=表面部。MZ=中間部。

図4.正常ヒト組織(上)およびヒト関節軟骨/骨サブコンパートメント(下)でのヒトWnt8a定量的RT−PCR。Wnt発現を18s RNAで標準化した。接頭語OA＝変形性関節症関節軟骨、接頭語PM＝死後関節軟骨(コントロール)。上部パネル接尾語:LFC＝側部大腿顆;MFC＝内側大腿顆、LTP＝側部脛骨プラトー、MTP＝内側脛骨プラトー、B＝肋軟骨下骨、syn＝滑膜。Comp＝種々のヒト組織セットからのコントロールRNA。下部パネル接尾語:♯＝関節軟骨試料数、MDM＝単球由来マクロファージ、MDMIFNg＝IFN−γ刺激単球由来マクロファージ、MDM NS/LPS＝LPS刺激単球由来マクロファージ。Comp＝種々のヒト組織セットからのコントロールRNA。

図5.示したMOIでコントロール(RFP)またはWnt8aアデノウイルスによる感染後の、CHOK1およびFzd8−CHOK1(Fzd8を安定的に発現している)β−カテニンウエスタンブロット。ビメンチンウエスタンブロッティングを、タンパク質ローディングのためのコントロールで使用した。

図6.β−カテニン核トランスロケーション。a) CHOK1−Fzd8 β−カテニンの免疫蛍光イメージング。細胞を、LiCl(30mM)、Adv−Wnt8a(MOI 1000:1)で24時間刺激した。b) Arrayscan (Cellomics)核トランスロケーションソフトウェアを用いて定量した、CHOK1−Fzd8 β−カテニン核染色。6個の複製CHOK1−Fzd8ウェルを、24時間、未処理またはLiCl(30mM)で刺激、Adv−Wnt8a (MOI 1000:1)で感染、またはコントロールAdv−RFP (MOI 1000:1)で感染させた。

図7.Fzd8:CHOK1細胞に、示した量のWnt8aまたはSFRP3をコードしたpCDNA3を単独でトランスフェクションするか、またはpCDNA3−Wnt8aおよびpCDNA3−SFRP3を共トランスフェクションした。β−カテニン蓄積を(同等のタンパク質をそれぞれのレーンにロードしている)、示したとおり、24時間または48時間後検出した。

図8.コントロール(RFP)またはWnt8aアデノウイルスによる感染後72時間での、初代OA関節軟骨細胞β−カテニンウエスタンブロット。ビメンチンウエスタンブロッティングを、タンパク質ローディングおよび標準化データのためのコントロールで使用した。a) SDS−PAGEおよびECLウエスタンブロット後のβ−カテニンおよびビメンチン検出; b)ビメンチンでの標準化後のβ−カテニンタンパク質レベルの定量。

図9.Wnt8a誘導軟骨細胞遺伝子発現変化は、Fzd8により仲介される。初代軟骨細胞にAtufect lipid (Atugen)を用いて、25nM−100nM siRNAをトランスフェクションし、トランスフェクションの48時間後、Adv−Wnt8aを感染させた(MOI＝500:1)。遺伝子発現における影響を、トランスフェクションの72時間後、定量的PCRによりモニターした。試料データ:Wnt8a抑制SOX9発現。トランスフェクションの72時間後のSOX9 mRNAレベルをGAPDH mRNAに対して標準化した。Wnt8aはSOX9 mRNAを減少させ、これは、Fzd8をFzd8 siRNAによりノックダウンしたときレスキューされた(52%の効果)。コントロールsiRNA＝無関係のsiRNA二本鎖。Fzd8 siRNA＝Fzd8特異的siRNA二本鎖。データは、25nMで使用したsiRNA二本鎖を用いて提供された。

図10.TOPFlashまたはFOPFlashを発現しているCHOK1細胞およびFzd8:CHOK1細胞を、5−40ng Wnt3aで処理した。TCF/LEFレポーター遺伝子活性を、ウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化したホタルルシフェラーゼ活性として測定した。

図11.TOPFlashを発現しているFzd8 CHOK1細胞を、0−10 μg/mlのFzd8 CRD Fc融合タンパク質で前吸着して、Wnt3aで処理した。TCF/LEFレポーター遺伝子活性を、ホタルルシフェラーゼ活性として測定した。

詳細な説明
他に定義がなければ、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者により通常理解されるようなものと同じ意味を有する(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学)。標準的な技術を、分子、遺伝および生化学法のために使用する。一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley ＆ Sons, Inc.;およびGuthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.)、およびGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109−128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)を参照のこと。これらの文献は、引用により本明細書の一部とする。

FZD8のWntポリペプチドへの結合を調節する薬剤の同定のためのアッセイ
Fzd8の活性を調節する薬剤は、受容体のWntポリペプチドとの相互作用を利用した多くの方法で同定し得る。例えば、細分した細胞構成要素として、培養細胞でインビトロまたはインビボでのFzd8/Wntポリペプチド結合を再構築する能力は、該結合を妨害する薬剤の同定のための標的を提供する。結合の妨害に基づくアッセイは、本明細書で記載したとおりの起源の範囲から、候補モジュレーターを同定し得る。

Fzd8/Wntポリペプチド結合のモジュレーターは、次いで、受容体を介した下流のシグナリングを測定する結合アッセイまたは機能的アッセイを用いてスクリーニングし得る。結合アッセイおよび機能的アッセイの両方を、Wntポリペプチドを用いて評価する。

Fzd8機能を調節する薬剤を同定するために、より直接に、Fzd8/Wntポリペプチド相互作用を使用する他の方法は、候補薬剤または候補モジュレーターにより誘導されるFzd8下流のシグナリングの変化を測定する。これらの機能的アッセイは、単離した細胞膜フラクションまたは表面に受容体を発現している細胞で行い得る。

当業者は、容易に、既知の配列から設計したプライマーまたはプローブを用いて、基本的PCRおよび分子クローニング技術を介して、該タンパク質をコードしたmRNAを含む試料からポリペプチド配列を増幅し得る。

組み換えポリペプチドの発現は、当業者に既知である。当業者は、容易に、原核または真核細胞での本発明に従った有用なFzd8/Wntポリペプチドの発現のために、ベクターおよび発現コントロール配列を選択し得る。

Fzd8は、結合またはシグナリング機能を有するために、細胞膜または合成リポソームのような界面活性剤と結合していなければならない。細胞膜フラクションを調製するための方法は、当業者に既知であり、例えば、Hubbard ＆ Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461−479により報告された方法であり、引用により本明細書の一部とする。Fzd8を含む膜を調製するために、そのような技術を、Fzd8を内因的または組み換え的に発現している細胞に適用するだけでよい。あるいは、無膜Fzd8は、ポリペプチドの清浄液の希釈により、膜調製物の中に組み込み得る(例えば、Salamon et al. , 1996, Biophys. J. 71: 283−294を参照のこと(それは、引用により本明細書の一部とする))。

Frizzled−8 CRDは、Dann et al Nature 412 (2001) 86−90に記載された方法と同様に、システインリッチドメインを多くの既知真核細胞発現ベクターの任意の1つの中にクローン化し、多くの既知真核細胞株の任意の1つでタンパク質を発現させることにより、可溶性タンパク質として産生し得る。可溶性システインリッチドメインを、アミノ酸1からおよそ151−173までのタンパク質をコードした遺伝子をクローン化することにより産生し得る。当業者に既知のC末端融合、例えば、6ヒスチジンまたは免疫グロブリンFcドメインを、精製を促進するために加え得る(例えば、妨害(アンタゴニスト)抗体を作製するためにCRDを使用するより前に)。

Fzd8と同様に、Wntポリヌクレオチドは、増幅プライマーまたはプローブの起源として既知の配列を用いて、標準的なPCRおよび分子クローニング技術を介してクローン化し得る。同様に、クローン化Wntポリペプチドは、当業者に既知のとおり、原核または真核細胞で発現し得る。非限定的な例として、Wnt8aを発現するためのアデノウイルスベクターを本明細書に記載している。

さらに、ある特定のアッセイまたは技術を望むならば、本発明に従った有用なWntポリペプチドは、機能タンパク質またはタグ化タンパク質として産生し得る。例えば、完全長Wntポリペプチドまたはその断片(すなわち、少なくとも、10アミノ酸、好ましくは、少なくとも、20アミノ酸またはそれ以上(完全長Wntポリペプチドより1アミノ酸少ない数まで))は、Wntポリペプチドの精製または検出を促進するために、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)、FLAGタグ、Mycタグ、または6×−Hisペプチドに融合し得る。タグ化または融合タンパク質の産生のための方法およびベクターは、そのような融合またはタグ化タンパク質を単離および検出する方法と同様に、当業者に既知である。

Wntポリペプチドおよび特定の切断型は、また、当業者に既知のとおり、化学合成により製造し得る。

組み換えWntポリペプチドは、精製型で使用し得る。あるいは、Wnt形質転換細胞からの条件培地を使用し得る。本発明に従った特定の結合または機能的アッセイで必要なWntの量は、アッセイに依存して変わるが、一般には、アッセイにつき、標識Wnt 1 nMに対して1 pM、非標識Wnt 1 μMに対して10 pMを使用する。

Wntポリペプチドは、結合の検出を促進するために標識し得る。標識は、合成の間における培地中の放射性標識アミノ酸、蛍光標識などの組み込みを介し得る。

リガンド結合アッセイは、Fzd8を発現している細胞、そのような細胞からの膜抽出物、またはFzd8を含む固定化脂質膜を、標識したWntポリペプチドおよび候補化合物に曝すアッセイを含む。インキュベーション後、反応混合物を、標識したWntポリペプチドのFzd8受容体への特異的結合に関して測定する。

結合アッセイは、Wntの置換が、候補モジュレーター化合物の存在下または非存在下で測定される置換(displacement)アッセイを含み得る。結合を検出するための他の方法は、例えば、Biacore ABから利用できるセンサーを用いた表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光偏光測定、電気化学発光および化学発光、バイオセンサーアッセイなどを含む。

FZD8シグナリング活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ
Fzd8活性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイは、Fzd8を発現している細胞を、Wntポリペプチドの存在下、候補モジュレーター化合物存在下または非存在下でインキュベートし、Fzd8のシグナリング活性を測定することを含み得る。

Fzd8によるシグナリングは、本明細書に記載したような方法を用いて、β−カテニンの蓄積、核トランスロケーションまたはリン酸化状態を測定することにより測定し得る。

Fzd8シグナリング活性はまた、本明細書に記載したとおり、TCF/LEFレポーター活性および下流の遺伝子発現を測定することにより測定し得る。遺伝子発現を測定するための方法は、PCRまたはマイクロアレイ技術のようなmRNA発現を検出するための技術を含む。遺伝子発現はまた、タンパク質発現を検出することにより測定し得る。

細胞アッセイ
細胞アッセイは、本発明で使用するヌクレオチド配列、例えば、Fzd8またはWntポリペプチドをコードしたヌクレオチド配列を含む、細胞または細胞株を作製することにより行い得る。

そのような細胞は、ベクター、例えば、クローニングベクター中に含まれたヌクレオチド配列でトランスフォームまたはトランスフェクションし得る。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の複製および/または発現のために、ベクター中に保持される。細胞は、該ベクターに適合するように選択され、例えば、原核細胞(例えば、細菌)、微生物、酵母または植物細胞であり得る。

トランスフェクションは、興味ある配列を含むウイルスベクターの導入を介して達成し得る。例えば、本明細書に記載したとおりの、アデノウイルスベクターである。

好ましい態様では、宿主細胞は、CHO−K1細胞、HEK293細胞または軟骨細胞のようなほ乳類細胞である。

動物モデル
変形性関節症(OA)は、軟骨破壊、軟骨下骨硬化および骨増殖症により特徴づけられる慢性関節疾患である。ラット膝関節半月板切除は、肥大(hypertrophy)生物学的影響を測定するのに適当な疾患モデルであり、この場合には、骨棘形成エンドポイントは、大きさおよび硬化の程度の両方を測定する。

潜在的な候補薬剤である化合物または抗体は、次いで、阻害剤がOA発症の軟骨保護剤効果を有することを確認するために、ダンキンハートレイモルモット自然発生OAモデルで試験される。疾患工程に不可欠な特性は、軟骨下リモデリングおよび石灰化軟骨ゾーン(Zone of Calcified Cartilage)(ZCC)重複を含み、そのような変化は、このモデルで測定し得る。

ポジティブな結果は、変形性関節症の減少、すなわち、軟骨退化の減少であり得る。しかしながら、効果の大きさまたは絶対的な測定は重要ではないが、効果の減少は、コントロール(ビヒクル)および処理(p<0.05)間で、統計的に有意である必要がある。

モジュレーター
本明細書で使用する“調節すること”または“調節する”なる用語は、Fzd8またはWntポリペプチド活性を、妨害、抑制、阻害、軽減、回復、増大、増加または影響することを言う。適当なFzd8活性は、Fzd8シグナリング活性である。

“モジュレーター”なる用語は、単一の物または物の組合せのことを言い得る。

モジュレーターは、該Fzd8または該Wntポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。

本明細書で使用するとき“アゴニスト”なる用語は、Fzd8またはWntと相互作用でき(例えば、結合)、増加または修飾した生物学的応答を生じる、任意の物を意味する。適当には、アゴニストは、タンパク質リガンド、ペプチド、ケモカイン、ケモアトラクタント、脂質誘導体またはサイトカインであり得る。例えば、Fzd8の天然リガンドの1つであるWnt8aは、Fzd8のアゴニストである。

本明細書で使用するとき“アンタゴニスト”なる用語は、Fzd8またはWntと相互作用でき(例えば、結合)、アゴニストに対する減少した生物学的応答を生じる任意の物を意味する。例えば、受容体に対するアゴニストの結合を減少させることによる。

好ましくは、本発明のモジュレーターは、Fzd8のアンタゴニストであり、リガンド結合およびFzd8の活性を減少させるようにFzd8を調節する。好ましくは、アンタゴニストは、Fzd8に結合する抗体であり、本明細書では、また、“Fzd8のアンタゴニスト抗体”または“Fzd8アンタゴニスト抗体”と呼ぶ。他の態様では、Fzd8モジュレーターは、Fzd8の活性を増加するようにFzd8を調節する、アクチベーターまたはFzd8のアゴニストである。

モジュレーターは有機化合物または他の化学物質であり得る。モジュレーターは、天然または人工を問わず、任意の適当な起源から取得または産生され得る、化合物であり得る。モジュレーターは、アミノ酸分子、ポリペプチドまたはその化学物質誘導体、またはその組合せであり得る。モジュレーターは、センスもしくはアンチセンス分子またはsiRNA分子であり得る、ポリヌクレオチド分子でさえあり得る。

モジュレーターは、ペプチドおよび他の化合物、例えば、小有機分子を含む、化合物のライブラリーから設計または取得し得る。

一例として、モジュレーターは、天然物、生物学的巨大分子、または、細菌、微生物、または動物(とりわけ、ほ乳類)細胞もしくは組織のような生物学的材料からの抽出物、有機もしくは無機分子、合成剤、準合成剤、構造的もしくは機能的模倣剤、ペプチド、ペプチド模倣剤、誘導体化剤、全タンパク質から切断したペプチド、または合成的に合成したペプチド(例えば、一例として、ペプチド合成機を用いるか、または組み換え技術またはその組合せ、組み換え剤、抗体、天然または非天然剤、融合タンパク質またはその同等体および変異体、誘導体またはその組合せによる)であり得る。

典型的には、モジュレーターは有機化合物である。典型的には、有機化合物は2個またはそれ以上のヒドロカルビル基を含む。ここで、“ヒドロカルビル基”なる用語は、少なくともCおよびHを含む基を意味し、所望により、1個またはそれ以上の他の適当な置換基を含み得る。そのような置換基の例は、ハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環状基などを含み得る。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組合せは、環状基を形成し得る。ヒドロカルビル基が2個以上のCを含むならば、それらの炭素は、必ずしもお互いに結合することを必要としない。例えば、少なくとも炭素の2個が、適当な元素または基を介して結合し得る。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含み得る。適当なヘテロ原子は、当業者に明らかであり、例えば、硫黄、窒素および酸素を含む。いくつかの適用のために、好ましくは、モジュレーターは、少なくとも1個の環状基を含む。環状基は多環式基であり得て、例えば、非縮合多環式基であり得る。いくつかの適用のために、モジュレーターは、他のヒドロカルビル基に結合した、少なくとも1個の該環状基を含む。

モジュレーターは、ハロ基、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモもしくはヨード基、または1個またはそれ以上のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキレンおよびアルケニレン基(それぞれ、分枝または非分枝であり得る)を含み得る。

好ましくは、本発明のモジュレーターは、当業者に既知の化学合成技術により製造し得る。

モジュレーターは、1個またはそれ以上の他の薬学的活性剤との組合せで使用し得る。活性剤の組合せを投与するとき、次いで、それらは、同時に、分離してまたは連続して投与し得る。

ある態様において、モジュレーターは、ヒトFzd8のシステインリッチドメイン(CRD)、またはその機能的断片もしくは誘導体である。システインリッチドメインは、ヒトFzd8の120アミノ酸のN末端保存ドメインを含み、10個の非変異型システインを含む(EMBL受託番号AB043703を参照のこと)。

ある態様において、モジュレーターは、抗体、好ましくは、Fzd8またはFzd8のWntリガンド、例えば、Wnt8aに結合する抗体である。好ましい態様において、抗体は、Fzd8アンタゴニスト抗体である。

抗体
“抗体”なる用語は、最も広い意味で使用され、特に、例えば、単一モノクローナル抗体(アンタゴニスト、結合および/または中和抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗FZD8ポリペプチド抗体、および望む生物学的または免疫学的活性を示す限り抗体の断片(下記を参照)を包含する。
本発明の方法で使用される抗体は、該天然環境の構成要素から単離および分離および/または回収したものである。該天然環境の不純物要素は、抗体に関する治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。好ましい態様では、抗体は、(1)Lowry法で決定したとおり、抗体重量が95%以上、および最も好ましくは、重量が99%以上まで、(2)回転カップシークエネーター(spinning cup sequenator)の使用によりN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を取得するのに十分な程度まで、(3) 例えば、クマシーブルーまたは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でのSDS−PAGEのようなゲル電気泳動による均一性まで精製される。

基本的な4鎖抗体ユニットは、2個の同一の軽(L)鎖および2個の同一の重(H)鎖からなる、ヘテロ四量体糖タンパク質である(IgM抗体は、J鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドと共に、5個の基本ヘテロ四量体ユニットからなり、したがって、10個の抗原結合サイトを含み、一方で、分泌型IgA抗体は、J鎖と共に、2−5個の基本4鎖ユニットからなる多価集合体を形成するために重合し得る)。IgGの場合には、4鎖ユニットは、一般に、約150,000ダルトンである。各L鎖は、1個の共有ジスルフィド結合によりH鎖に結合しており、一方で、2個のH鎖は、H鎖イソタイプに依存して、1個またはそれ以上のジスルフィド結合でお互いに結合している。各H鎖およびL鎖はまた、規則的に、間隙を介した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各H鎖は、N末端に可変領域(VH)、それに続く、3個の定常ドメイン(CH)(αおよびγ鎖のそれぞれのために)、および4個のCHドメイン(μおよびεイソタイプのために)を有する。各L鎖は、N末端に可変領域(VL)、それに続く、定常ドメイン(CL)をその反対の端に有する。VLはVHと並んでおり、CLは重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)と並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間のインターフェースを形成すると考えられている。一緒になったVHおよびVLの対は、単一抗原結合サイトを形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性に関しては、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton ＆ Lange, Norwalk, Conn., 1994, 第6章、71頁を参照のこと。

脊椎動物種からのL鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパーおよびラムダと呼ばれる2つのはっきりと異なった型のうちの1つに割り当て得る。重鎖(CH)定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスまたはイソタイプに割り当て得る。免疫グロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つのクラスがあり、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖を有する。γおよびαクラスは、さらに、CH配列および機能における相対的に微小な差異に基づいて、サブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、下記のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を発現する。

“可変”なる用語は、可変ドメインのある部分で、抗体間の配列が大幅に異なる事実のことを言う。Vドメインは抗原結合を仲介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの110アミノ酸に渡って、均一に分布していない。それどころか、V領域は、各々9−12アミノ酸長である“超可変領域”と呼ばれる極端に可変的な短領域と区別された、15−30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主にβ−シート構造を採用した4つのFRを含み、3つの超可変領域に結合し、β−シート構造に結合したループを形成するか、ある場合には、β−シート構造の部分を形成する。各鎖の超可変領域は、FRにより近接して結合し、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合サイトを形成するのに貢献する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと)。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与していないが、抗体依存性細胞毒性(ADCC)における抗体の関与のような、さまざまなエフェクター機能を示す。

本明細書で使用するとき“超可変領域”なる用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基のことを言う。超可変領域は、一般に、“相補性決定領域”または“CDR”からのアミノ酸残基(例えば、VLで約24-34残基(L1)、50-56残基(L2)および89-97残基(L3)、および、VHで1-35残基(H1)、50-65残基(H2)および95-102残基(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))および/または“超可変ループ”からのアミノ酸残基(例えば、VLで26-32残基(L1)、50-52残基(L2)および91-96残基(L3)、および、VHでは26-32残基(H1)、53-55残基(H2)および96-101残基(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901−917 (1987))を含む。

ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数の皮下(sc)または腹腔内(ip)投与により動物で作製する。それは、関連する抗原を、免疫した種での免疫原性のあるタンパク質へ結合するのに役立ち得る(とりわけ、合成ペプチドを使用するとき)。例えば、抗原は、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイル、スルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介して結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介して)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2またはR1N＝C＝NR(ここで、RおよびR1は、異なるアルキル基である)を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に結合し得る。

動物を、例えば、100 μgまたは5 μgのタンパク質または複合体(それぞれ、ウサギまたはマウスのために)を3倍量のフロイント完全アジュバントと結合し、該溶液を複数の部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性複合体(immunogenic conjugates)、または誘導体に対して免疫する。1ヶ月後、動物を、複数部位への皮下注射により、もともとのペプチドまたはフロイント完全アジュバントの複合体の量の□から1/10で追加免疫する。7日から14日後、動物を採血し、血清を抗体力価のためにアッセイする。動物を、力価がプラトーになるまで追加免疫する。複合体はまた、タンパク質融合として組み換え細胞培養において製造され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を高めるために適当に使用される。

本明細書で使用するとき“モノクローナル抗体”なる用語は、実質的に均一な抗体集団から取得した抗体、すなわち、少量で存在し得る起こり得る天然型突然変異を除いて同一な集団を含む、各々の抗体のことを言う。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一の抗原性サイトに対して向けられる。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対して向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の抗体に汚染されずに合成し得るという点で有利である。修飾語“モノクローナル”は、何らかの特定の方法により抗体の製造が必要であると見なしてはならない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体は、最初、Kohler et al., Nature, 256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法により製造し得る。望む特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離したとき、クローンを限定希釈法によりサブクローン化し、標準的な方法により成長させ得る(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59−103 (Academic Press, 1986))。この目的のための適当な培養培地は、例えば、D−MEMまたはRPMI−1640培地を含む。さらには、ハイブリドーマ細胞は、例えば、細胞をマウスに腹腔内注入することにより、動物での腹水腫瘍としてインビボで増殖させ得る。

サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、適当には、慣用的な抗体精製手法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAまたはプロテインGセファロースを用いて)、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより、培養培地、腹水液、または血清から分離される。

モノクローナル抗体をコードしたDNAは、慣用的な方法を用いて(例えば、特異的に、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードした遺伝子に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)、容易に、単離および配列決定できる。ハイブリドーマ細胞をそのようなDNAの好ましい起源として使用する。単離したのち、DNAを発現ベクター中に組み込み、次いで、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または、あるいは、抗体タンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクションし、組み換え宿主細胞中の合成モノクローナル抗体を取得し得る。抗体をコードしたDNAの細菌での組み換え発現に関する総説は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256−262 (1993)およびPlueckthun, Immunol. Revs. 130:151−188 (1992)を含み、また、米国特許第4,816,567号を参照のこと。抗体断片を含む“モノクローナル抗体”は、また、例えば、McCafferty et al., Nature, 348:552−554 (1990) Clackson et al., Nature, 352:624−628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581−597 (1991)に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離し得る。次の出版物は、鎖シャッフリング(chain shuffling)(Marks et al., Bio/Technology, 10:779−783 (1992))ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組合せ感染およびインビボ組み換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265−2266 (1993))による、高親和性(nM 範囲(range))ヒト抗体の産生を記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的な抗体ハイブリドーマ技術の代替となり得るものである。

本明細書では、モノクローナル抗体は、それらが、望む生物学的活性を示す限り、一部の重鎖および/または軽鎖が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一であるか、または類似しており、一方で、鎖の残りが、他の種由来の抗体または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体およびそのような抗体の断片の相当する配列と同一であるか、または類似している“キメラ”抗体を含む(米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855 (1984)を参照のこと)。本明細書で関心のあるキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿など)由来の可変ドメイン抗原結合配列、およびヒト定常領域配列を含む“霊長類化(primatized)”抗体を含む。

“インタクト”抗体は、抗原結合サイトならびにCLならびに少なくとも重鎖定常ドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)、またはそのアミノ酸変異型であり得て、好ましくは、インタクト抗体は、1個又はそれ以上のエフェクター機能を有する。

“抗体断片”は、抗体の部分、好ましくは、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片;ダイアボディ;直線(linear)抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057−1062[1995]を参照のこと);一本鎖抗体分子;ならびに抗体断片から形成した多特異的抗体を含む。

抗体のパパイン消化は、“Fab”と呼ばれる2個の同一な抗原結合断片、および、命名が容易に結晶化する能力を反映している、残存“Fc”断片を産生する。Fab断片は、H鎖の可変領域ドメイン(VH)および1個の重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)を伴う、全L鎖からなる。各Fab断片は、抗原結合の観点では一価であり、すなわち、単一抗原結合サイトを有する。抗体のペプシン処理は、おおよそ、二価抗原結合活性を有し、また、架橋結合抗原を可能にする2個のジスルフィド結合Fab断片に相当する、単一ラージF(ab')2断片を産生する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの1個またはそれ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端において、さらなる残基を有しないことによりFab断片と異なる。Fab'−SHは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を有するFab'に関する表記である。F(ab')2抗体断片は、もともとは、それらの間にヒンジシステインを有する一組のFab'断片として産生した。抗体断片の他の化学結合がまた、既知である。

Fc断片は、ジスルフィドにより結合した両H鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列により決定され、その領域はまた、ある細胞型で見られるFc受容体(FcR)により認識される部分である。

“Fv”は、完全な抗原認識および結合サイトを含む、最少の抗体断片である。この断片は、密接に、非共有的に結合した、1個の重鎖および1個の軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら2個のドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に貢献し、抗体に抗原結合特異性を与える、6個の超可変ループを生じる(H鎖およびL鎖から各3ループ)。しかしながら、全体の結合サイトよりも低い親和性ではあり得るが、天然に、カメリド(Camelid)(または、ある抗原に特異的な3個のみのCDRを含む半分のFv)を生じるカメリドVHHドメインのような単一可変ドメインでさえ、抗原を認識し結合する能力を有する。

“sFv”または“scFv”と略される“一本鎖Fv”はまた、一本鎖ポリペプチド中に結合したVHおよびVL抗体ドメインを含む、抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはさらに、sFvが抗原結合のための望む構造を形成するのを可能にする、VHおよびVLドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。sFvの総説に関しては、下記のPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994); Borrebaeck 1995を参照のこと。

“diabodies”なる用語は、sFv断片(前段落を参照のこと)を、VHおよびVLドメイン間で短いリンカー(約5−10残基)と共に構築することにより製造し、その結果、Vドメインの鎖内対ではなく鎖間対が達成され、二価断片、すなわち、2個の抗原結合サイトを有する断片を生じる、小抗体断片のことを言う。二重特異性diabodiesは、2個の抗体のVHおよびVLドメインが異なったポリペプチド鎖に存在する、2個の“交差”sFV断片のヘテロ二量体である。Diabodiesは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444−6448 (1993)に、より十分に記載されている。

本発明の抗体はさらに、“ヒト化”抗体またはヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合配列)である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、非ヒト種(ドナー抗体)、例えば、望む特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのCDRからの残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント(recipient)抗体)を含む。ある例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または取り込まれた(imported)CDRもしくはフレームワーク配列で発見されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも1個および典型的には2個の可変ドメインの全体を含み、ここで、CDR領域の全体または実質的に全体が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に相当し、そしてFR領域の全体または実質的に全体がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体は、最適にはまた、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的には、ヒト免疫グロブリンのFcを含む[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323−329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。

非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業者に既知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト起源からその中に導入された、1個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、“インポート(import)”残基と呼ばれ、典型的には、“インポート”可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の相当する配列に置換することによる、Winterおよび同僚(co−workers)の方法[Jones et al., Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann et al. , Nature 332:323−327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534−1536 (1988)]に従って行い得る。したがって、そのような“ヒト化”抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、実質的に、インタクトヒト可変ドメイン以下のものが、非ヒト種からの相当する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのCDR残基および可能性のあるいくつかのFR残基が、齧歯類抗体の類似サイトからの残基により置換されているヒト抗体である。

ヒト化抗体の作製において使用するヒト可変ドメイン(軽鎖および重鎖の両方)の選択は、抗体をヒトの治療において使用することを意図するとき、抗原性およびHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を減らすのに非常に重要である。いわゆる“best−fit”法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類のVドメイン配列に最も近いヒトVドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク領域(FR)を、ヒト化抗体のために受け入れた(Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループにおけるすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用し得る(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993))。

さらに重要なのは、抗原に対する高い結合親和性および他の有益な生物学的特性を保持したまま、抗体をヒト化することである。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列およびさまざまな概念的ヒト化産物を解析する工程により製造する。三次元免疫グロブリンモデルは、通常、利用可能であり、当業者に既知である。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元コンホメーション構造を例証し、示す、コンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検討は、候補免疫グロブリン配列の機能において、残基のあり得る役割の解析(すなわち、候補免疫グロブリンの、その抗原に結合する能力に影響する残基の解析)を可能にする。このようにして、FR残基をレシピエントおよびインポート配列から選択および結合し得て、その結果、望む抗体特性、例えば、標的抗原に対する増加した親和性を達成する。一般には、超可変領域残基は、直接、および、最も本質的に、抗原結合への影響に関与している。

ヒト化抗FZD8ポリペプチド抗体のさまざまな形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、Fabのような抗体断片であり得て、所望により、免疫抱合体を作製するために、1個またはそれ以上の細胞毒性剤と結合する。あるいは、ヒト化抗体は、インタクトIgG1抗体のようなインタクト抗体であり得る。

ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を作製し得る。例えば、現在では、免疫付与で、内在性の免疫グロブリンの産生なしに十分なレパートリーのヒト抗体を産生することが可能なトランスジェニック動物(例えば、マウス)を産生することができる。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(J H)遺伝子のホモ接合性欠損が、完全な内在性抗体産生の阻害を生じることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原投与に対するヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362:255−258 (1993); Bruggemann et al. , Year in Immuno. 7:33 (1993); 米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号、米国特許第5,591,669号(すべてGenPharm); 米国特許第5,545,807号;およびWO 97/17852を参照のこと。

好ましくは、ファージディスプレイ技術(McCafferty et al., Nature 348:552−553 [1990])は、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロで、ヒト抗体および抗体断片を産生するのに使用し得る。この技術に従って、抗体Vドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナー被覆タンパク質遺伝子、例えば、M13またはfd中、インフレームにクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片として現れた。繊維状粒子は、ファージゲノムの1本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択はまた、それらの特性を表す抗体をコードした遺伝子の選択を生じる。したがって、ファージは、B細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564−571(1993)でレビューされた、様々な形式で行い得る。V遺伝子断片のいくつかの起源は、ファージディスプレイのために使用し得る。Clackson et al.は、非免疫マウスの脾臓由来であるV遺伝子の小さく無作為なコンビナトリアルライブラリーから、様々な種類の抗オキサゾロン抗体を単離した(Nature, 352:624−628 (1991))。非免疫ヒトドナーからのV遺伝子のレパートリーを構築し、様々な抗原(自己抗原を含む)に対する抗体をMarks et al.により記載された技術(J. Mol. Biol. 222:581−597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12:725−734 (1993))に従って、基本的に単離し得る。また、米国特許第5,565,332号および第5,573,905号を参照のこと。
上記記載したとおり、ヒト抗体はまた、インビトロ活性化B細胞で作製し得る(米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照のこと)。

本明細書に記載したとおり、Fzd8またはそのWntリガンド、例えば、Wnt8aのアンタゴニスト抗体である抗体は、とりわけ、本発明の実施に有用である。(ヒトFzd8に対する)Fzd8アンタゴニスト抗体は、とりわけ、変形性関節症の処置に有用であり、好ましくは、これらは、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。抗体を作製するための適当な手順は当業者に既知であり、多くのこれらの方法は、本明細書に引用している。好ましくは、N末端1−120アミノ酸を含むヒトFzd8のCRD(システインリッチドメイン)ドメインを(本明細書に記載したとおり)、Fzd8アンタゴニスト抗体を作製するために使用する。CRDドメインを、例えば、Dann et al Nature 412 (2001) 86−90に記載したことに類似した方法で産生し得る。好ましくは、治療的適用のために、ファージディスプレイをヒトFzd8アンタゴニスト抗体の作製のために使用する。

医薬組成物
本発明の他の局面は、Fzd8もしくはWntモジュレーターまたは本発明の候補化合物および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤もしくはアジュバントまたはその任意の組合せを含む、医薬組成物に関する。Fzd8もしくはWntモジュレーターまたは候補化合物(それらの薬学的に許容される塩、エステルおよび薬学的に許容される溶媒和物を含む)が、単独で投与され得るとしても、それらは一般に、とりわけ、ヒト治療のために、医薬的担体、賦形剤または希釈剤と混合して投与される。医薬組成物は、ヒトおよび獣医学における、ヒトまたは動物使用のためであり得る。ある態様において、本発明は変形性関節症を処置するための医薬組成物に関し、Fzd8アンタゴニスト抗体の有効量および薬学的に許容されるビヒクル、担体または賦形剤を含む。

本明細書に記載した医薬組成物のさまざまな異なる形態に関するそのような適当な賦形剤の例は、A WadeおよびPJ Wellerにより編集された“Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2^nd Edition, (1994)に見ることができる。

治療的使用のための許容される担体または希釈剤は、医薬分野で既知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。

適当な担体の例は、ラクトン、スターチ、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどを含む。適当な希釈剤の例は、エタノール、グリセロールおよび水を含む。

医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図する投与経路および標準的な医薬慣習に関連して選択され得る。医薬組成物は、またさらに、担体、賦形剤または希釈剤として任意の適当な結合剤(複数もある)、滑剤(複数もある)、懸濁剤(複数もある)、コーティング剤(複数もある)、溶解剤(複数もある)を含み得る。

適当な結合剤の例は、スターチ、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、フリー−フローラクトース、ベータ−ラクトース、コーンシロップのような天然糖、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールを含む。

適当な滑剤の例は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。

保存剤、安定剤、染色剤および香味剤さえ、医薬組成物中に提供され得る。保存剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤も、また、使用し得る。

塩/エステル
本発明のモジュレーターまたは候補化合物は、塩またはエステル、特に、薬学的に許容される塩またはエステルとして存在し得る。

本発明のモジュレーターまたは候補化合物の薬学的に許容される塩は、適当な酸付加塩またはそれらの塩基性塩を含む。適当な医薬塩の総説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1 19 (1977)に見ることができる。塩は、例えば、鉱酸のような強無機酸、例えば、硫酸、リン酸またはハロゲン化水素酸;非置換または置換(例えば、ハロゲンによる)である1から4個の炭素原子のアルカンカルボン酸のような強有機カルボン酸、例えば、酢酸;飽和または不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸;ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸;アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸;安息香酸;または非置換または置換(例えば、ハロゲンによる)である(C₁−C₄)−アルキル−またはアリール−スルホン酸のような有機スルホン酸、例えば、メタン−またはp−トルエンスルホン酸で形成される。
エステルは、エステル化される官能基に依存して、有機酸またはアルコール/水酸化物を用いて形成される。有機酸は、非置換または置換(例えば、ハロゲンによる)である1から12個の炭素原子のアルカンカルボン酸のような強有機カルボン酸、例えば、酢酸;飽和または不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸またはテトラフタル酸;ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸;アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸;安息香酸;または非置換または置換(例えば、ハロゲンによる)である(C₁−C₄)−アルキル−またはアリール−スルホン酸のような有機スルホン酸、例えば、メタン−またはp−トルエンスルホン酸を含む。適当な水酸化物は、無機水酸化物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムを含む。アルコールは、非置換または置換(例えば、ハロゲンによる)され得る、1−12炭素原子のアルカンアルコールを含む。

治療的使用
本発明の方法に従って単離したものを含むFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターは、医薬としての活性を有し、Fzd8の過剰なまたは無秩序な活性により悪化するか、または引き起こされる、ヒトおよび非ヒト動物における状態/疾患の処置(治療または予防)で使用され得る。適当な該疾患は、ベータカテニンシグナリングにより特徴づけられるそれらの疾患を含む。さらに、該疾患は、組織石灰化または鉱化、例えば、アテローム性動脈硬化症により特徴づけられる疾患を含み得る。

そのような状態/疾患の例は、OAならびに骨および関節の他の疾患、例えば、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症(強直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびライター症候群を含む)、ベーチェット病、シェーグレン症候群および全身性硬化症、痛風および骨粗鬆症を含む。
他の疾患は、癌および関連疾患を含む。特に、そのようなモジュレーターは、抗血管新生処置として使用し得る。

したがって、本発明に従って単離した化合物、または薬学的に許容される塩またはその溶媒和物を治療において使用する。

本明細書の内容において“治療”なる用語は、また、それとは反対の特別な指示がなければ、“予防”を含む。“治療の”および“治療的な”なる用語は、それに従って、解釈されるべきである。

したがって、本発明のさらなる局面は、Fzd8関連疾患、とりわけ変形性関節症を処置する方法に関し、該方法は、それを必要とする対象に、本発明に従って単離した化合物を投与することを含む。好ましくは、化合物は、Fzd8アンタゴニスト抗体、例えば、Fzd8 CRDに結合する抗体である。ある態様では、本発明は変形性関節症を処置する方法を含み、ヒトまたは動物の患者に有効量のFzd8アンタゴニスト抗体を投与することを含む。

本発明のさらなる局面は、Fzd8関連疾患を処置するための医薬の製造における、Fzd8またはWntモジュレーターまたは本発明に従った候補化合物の使用に関する。好ましくは、モジュレーターは、Fzd8アンタゴニスト抗体、より好ましくは、Fzd8のシステインリッチドメインに結合する抗体である。他の態様では、モジュレーターは、Fzd8のシステインリッチドメインを含む。好ましくは、Fzd8関連疾患は変形性関節症(OA)である。

本発明のさらなる局面は、変形性関節症(OA)の処置での使用のための医薬の製造における、ヒトFzd8のシステインリッチドメインを含む組成物の使用に関する。他の態様では、組成物は、Fzd8アンタゴニスト抗体を含む。他の態様では、組成物は、Fzd8のシステインリッチドメインに結合する、Fzd8アンタゴニスト抗体を含む。

他の局面では、本発明は、変形性関節症(OA)を有する動物を処置する方法に関し、ここで、該方法は、ほ乳類に治療上有効量のFzd8アンタゴニストを投与することを含み、それにより、OAの有効な治療的処置を生じる。好ましくは、Fzd8アンタゴニストは抗体であり、より好ましくは、Fzd8のシステインリッチドメインに結合する抗体である。

本明細書で使用するとき“医薬の製造”なる句は、さらなる治療剤のためのスクリーニングプログラムにおける使用またはそのような医薬の任意の製造工程における使用に加えて、医薬として直接の化合物の使用を含む。

本明細書で使用するとき、WntまたはFzd8アンタゴニストの“有効量”なる句は、特定の規定目的を実行するのに十分な量である。

“治療上有効量”なる用語は、対象の疾患または障害を処置するのに有効なWntまたはFzd8アンタゴニストの量のことを言う。変形性関節症の場合には、アンタゴニストの治療上有効量は、変形性関節症の進行を減らすか停止し得る;および/または、ある程度まで、変形性関節症と関連した1個またはそれ以上の兆候を緩和する。

また他の局面は、細胞中のFzd8を選択的に阻害する方法に関し、該細胞を、本発明に従って単離した化合物の量と接触させ、その結果、Fzd8が該細胞で選択的に阻害されることを含む。好ましくは、化合物はFzd8アンタゴニスト抗体であり、より好ましくは、Fzd8のシステインリッチドメインに結合する抗体である。好ましくは、該細胞は、軟骨細胞である。

投与
本発明の医薬組成物は、経口、関節内、経腸、膣内、非経腸、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、経鼻、口腔または舌下の投与経路で適用し得る。

容易な投与のために、組成物を全身に送達できることが好ましい。アンタゴニスト抗体のために、これは、例えば、皮下または静脈経路による。しかしながら、変形性関節症の処置では、アンタゴニスト抗体を、局所的な疾患部位への送達、例えば、関節内投与で送達することが好ましい。

経口投与のために、特定の使用は、圧縮錠剤、ピル、錠剤、ゲル(gellules)、ドロップ、およびカプセルからなる。好ましくは、これらの組成物は、用量あたり活性成分の1−250 mg、より好ましくは、10−100 mgを含む。

他の投与形態は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、経皮、腹腔内または筋肉内に注射し得て、滅菌済みまたは滅菌可能溶液から調製する溶液またはエマルジョンを含む。本発明の医薬組成物はまた、座薬、ペッサリー、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液または散布剤の形態であり得る。

経皮投与の他の手段は、皮膚パッチの使用による。例えば、ポリエチレングリコールの水性エマルジョンまたは液体パラフィンからなるクリームの中に、活性成分を組み込み得る。活性成分はまた、重量が1から10%の間の濃度で、白ろうまたは白色軟パラフィン基剤からなる軟膏中に、必要に応じた安定剤および保存剤と共に組み込み得る。

注射可能形態は、用量あたり活性成分の10−1000 mgの間、好ましくは、10−250 mgの間を含み得る。

組成物は、単位用量形、すなわち、単位用量、または単位用量の複数もしくはサブユニットを含む分離部分の形態で製剤し得る。

用量
当業者は、容易に、過度の実験なしに、対象へ投与するインスタント(instant)組成物の1つの適当な用量を決定することができる。典型的には、医師は、個々の患者にとって最も適当な実際の用量を決定し、それは、使用する特定の化合物の活性、代謝的安定性および該化合物の作用の長さ、年齢、体重、全体的な健康、性、食事、投与の形態および時間、排泄速度、薬剤組合せ、特定の状態の重篤度、および個々の受けている治療を含む様々な要因に依存している。本明細書に開示した用量は、平均的なケースの例である。当然のことながらより高いまたはより低い用量範囲が有益である個々の例が存在し得、そのようなものは、本発明の範囲内にある。

必要に応じて、薬剤は、0.01から30 mg/kg体重、例えば、0.1から10 mg/kg、より好ましくは、0.1から1 mg/kg体重の用量で投与し得る。

典型的な態様では、10から50 mg/日の1回以上の用量を、悪性腫瘍の処置のために患者に投与する。

Fzd8発現を検出することによる診断法
診断アッセイは、組織試料中のFzd8および/またはWntポリペプチド、遺伝子もしくはmRNAの量を測定し得る。これらのポリペプチドのどちらか一方または両方をコードしたmRNAの量を測定するアッセイは、また、この分類に適合する(fit)。アッセイはまた、受容体またはリガンドの質を評価し得る。例えば、個体が、Fzd8および/またはWntのどちらか一方、または両方の変異体または変異型を発現しているか否かを決定するアッセイは、診断的に使用し得る。さらに、Fzd8および/またはWntポリペプチドの1個またはそれ以上の活性を測定するアッセイは、診断的に使用し得る。

キット
本発明は、Fzd8またはWnt活性のモジュレーターをスクリーニングするために使用するキット、および、Fzd8またはWntシグナリングの異常調節により特徴づけられる疾患または障害の診断に使用するキットを提供する。本発明に従った有用なキットは、単離Fzd8ポリペプチド(膜または細胞結合Fzd8ポリペプチド、例えば、単離膜上、Fzd8を発現している細胞、または、SPRチップ上を含む)および単離Wntポリペプチドを含み得る。

キットはまた、Fzd8に特異的な抗体、とりわけ、Fzd8のアンタゴニスト、および/またはWntポリペプチドの抗体を含む。

あるいは、またさらには、キットは、Fzd8ポリペプチドを発現するように形質転換した細胞および/またはWntポリペプチドを発現するように形質転換した細胞を含む。さらなる態様では、本発明に従ったキットは、Fzd8ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドおよび/またはWntポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを含み得る。またさらなる態様では、本発明に従ったキットは、下記に記載したとおり、Fzd8またはWntポリペプチドの増幅に使用する、特異的プライマーを含み得る。本発明に記載したあらゆるキットは、記載の品目または品目とそのパッケージング材の組み合わせを含む。キットはまた、使用のための指示書を含む。

本発明を、ここでさらに、実施例により記載しており、それは、本発明を実施しようとする当業者を援助するのに役立つことを意図しており、決して、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

実施例1
材料および方法
プラスミド
Wnt8aおよび8bの完全長cDNA配列(それぞれ、EMBL受託番号AB057725およびAB073637)を、胎児脳RNAからRT−PCRによりクローン化した。完全長ヒトFzd8配列(EMBL受託番号AB043703)を、BACクローンRP11−425A6 (Invitrogen)(EMBL受託番号HSBA425A6)PCR断片でクローン化した。完全長sFRP3 cDNA(EMBL受託番号U24163)を、軟骨RNAからRT-PCRによりクローン化した。すべての場合で、cDNAは、PCRによりクローニングサイトを導入し、ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)のマルチクローニングサイトへの挿入を可能にすることによってクローン化した。

抗体および組み換えタンパク質
ポリクローナルアフィニティ精製抗Fzd8抗体は、ヒトFzd8一次アミノ酸配列に由来する19量体ペプチドで免疫したウサギで作製した。ヤギ抗ヒト/マウス/ラットβ−カテニン親和性精製ポリクローナルAbを、R＆D systemsから取得した。ヤギ抗ヒト/マウス/ラットビメンチンポリクローナルIgGを、Santa Cruzから取得した。マウスモノクローナル抗ヤギ/ヒツジIgG−ペルオキシダーゼおよびヤギ抗ウサギIgG(全分子)ペルオキシダーゼ抗体を、Sigmaから購入した。最後に、Alexa Fluor(登録商標)488ウサギ抗ヤギIgGを、Molecular Probesから取得した。

細胞培養
CHOK1-Fzd8細胞株を、Fzd8−pcDNA3.1の安定的トランスフェクションにより作製し、10% FCS、2mM L−グルタミン、200Uペニシリン(200μg/ml)、ストレプトマイシン(1mg/ml)およびゲネチシン(1mg/ml)を補充したダルベッコ修飾イーグル培地(Sigma) [DMEM培養培地]で維持した。初代軟骨細胞を、人工膝関節置換術を受けている変形性関節症軟骨の患者から単離した。軟骨を、加湿インキュベーターにおいて37%で24時間維持し、コラゲナーゼ(2mg/ml)で消化した。細胞を2回洗浄し、次いで、滅菌細胞ろ過器(100μm)に通した。回収した細胞を、DMEM培養培地で再懸濁した。

トランスフェクション
Fzd8およびGAPDHに対して向けられたsiRNA二本鎖(SMART duplexes)は、Dharmaconにより提供され、Atufect lipid (Atugen)を用いて、初代軟骨細胞にトランスフェクションした。Fzd8 mRNAのノックダウンは、定量的RT−PCRにより、トランスフェクション後72時間で測定した。

RNA単離
変形性関節症軟骨を、承諾済み(consented)全膝関節置換試料または承諾済み死後取得膝関節軟骨から入手した。軟骨を即座に凍結させ、Glen Creston Spex millを用いて、液体窒素下に置く。製造プロトコールに従い、標準的なTRIzol抽出法(Invitrogen)を用いて、RNAを軟骨基質から抽出した。RNAを、Qiagen RNeasy minicolumn (Qiagen)を用いて精製し、DNaseで処理した。RNAを、RNA Nano6000 chipと共にAgilent Bioanalyser 2100を用いて定量した。

定量的PCR
TaqManリアルタイム定量的ポリメラーゼ鎖反応(PCR)アッセイを、製造プロトコール(Applied Biosystems)にしたがって、ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemで行った。使用したTaqMan RT−PCRアッセイプライマーおよびプローブは、表1に記載している。
表１

25ngのRNAを、関連のあるフォアード/リバースプライマー、蛍光プローブおよびTaqman Quantitect Probe Master−MixおよびRT enzyme mix (Qiagen)と共に混合した。試料を、最初の逆転写反応のために、50℃で30分間、次いで95℃で15分間インキュベートし、その後、95℃で15秒間および60℃で1分間、40サイクルインキュベートした。標的RNAの相対的な定量を、SDS v1.9 softwareを用いて、Taqmanにより行った。

Applied Biosystems Low Density Arrays(Taqman Microfluidics)を用いたTaqman RT−PCRは、ABI Prism 7900で行った。Adv-Wnt8aを用いた初代軟骨細胞の感染後の転写的影響を、一連のプライマー/プローブセット(Applied Biosystems Assays on Demand)に対して測定した。各試験RNA試料を、1ng/μlの濃度でQuantitect probe RT-PCR mastermix (Qiagen)に添加し、製造者の指示に従ってカードに適用した。ワンステップRT−PCRを、最初、50℃で30分、94.5℃で15分の逆転写反応を行い、次いで、97℃で30秒および59.7℃で1分を35サイクル行った。データ解析を、Applied Biosystems SDS 2.1 softwareを用いて行い、転写変化を、コントロールウイルス感染試料に対する倍率変化(2^−ΔΔCt)として表した。

ウエスタンブロット
全タンパク質を、1:100希釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含むRIPA緩衝液(0.15 M NaCl、0.05 M Tris−HCl pH 7.4、1mM EDTA、1% v/v Triton X100、0.1% w/v SDS、1%デオキシコール酸塩)を用いて、細胞株または初代軟骨細胞から単離した。試料を、β−メルカプトエタノールと共にSDS試料緩衝液で希釈し、15μgのタンパク質をMES SDSランニングバッファー中、4−12% Bis-Trisゲルに載せ、200vで30分間流した。セミドライシステムを用いて、試料をPVDFに移した。膜を、5% marvel/PBSで1時間ブロックした。抗Fzd8一次抗体を1:100で適用し、β−カテニン一次抗体を1:3000で適用し、ビメンチン一次抗体を1:500で適用した。二次抗体を1% marvel/PBS中、1:10000で使用した。ブロットは、製造者プロトコールに従い、Amersham ECL試薬を用いて現像した。

アデノウイルス(Adv)感染
Wnt8aアデノウイルス(Adv-Wnt8a)および赤色蛍光タンパク質を発現するコントロールウイルス(Adv-RFP)を、遺伝子送達のために使用した。完全長Wnt8aをコードした複製欠損アデノウイルス(Ad5 c20)およびRFP(コントロール)は、Galapagos Genomics (2301 CA Leiden, The Netherlands)により作製された。単離後、2回継代した初代軟骨細胞に、アデノウイルスを多数の感染(200:1および500:1)で6時間、導入した。感染後、24時間から8週の間に、RNAを単離するために細胞を収集した。

免疫組織化学
5 mm軟骨生検をヒトOAおよびPMドナーから取得し、包埋剤(Raymond Lamb)で素早く凍結し、−80℃で貯蔵した。7 μm切片を切り取り、Superfrost＋slides (VWR)上に載せた。切片を冷アセトンで固定し(10分)、洗浄し(TBS 0.05% Tween 20)、ヒアルロニダーゼで処理した(PBS中0.5 mg/mlヒアルロニダーゼ、Sigma、20分、室温)。切片を洗浄し、ペルオキシダーゼを3% H₂O₂ (Aldrich)、メタノールでブロックした(30分)。切片を洗浄し、タンパク質を20%ヒツジ血清でブロックした(Dako、TBS 0.05% Tween 20 1% BSA中、60分、室温)。ウサギ抗Fzd8(1:50)を、切片に添加する(一晩、4℃)前に、単独またはFzd−8ペプチドと共にプレインキュベートした(PBS中0.65 mg/ml、1:50、30分)。切片を洗浄し(TBS 0.05% Tween 20)、次いで、ビオチン化ヒツジ抗ウサギ抗体でインキュベートした(Serotec、1:200、30分、室温)。切片を洗浄し(TBS 0.05% Tween 20)、製造者の指示に従い、ストレプトアビジンABC−HRPでインキュベートし(Dako、30分、室温)、洗浄し(TBS 0.05% Tween 20)、DAB色素を用いて現像した(Dako、5分)。切片を、Gills IIヘマトキシリン(Pioneer Research Chemicals、PRC/13/1)を用いて対比染色し、キシレンで脱水し、搭載(mounted)した。

免疫蛍光(アレイスキャン)
細胞を3.7% ホルムアルデヒドで固定し、PBS/0.05% Triton X100で透過した。β−カテニン一次抗体を1:100で適用し、蛍光結合二次抗体を、0.5μg/mlでヘキスト核染色と共に、1:400で適用した。細胞をArrayscan HCS sytem (Cellomics)を用いて視覚化し、核染色を製造者のソフトウェアを用いて定量化した。

結果
Fzd8の発現は、主に、軟骨に制限され、変形性関節症軟骨で上方調節される
定量的RT−PCRを、ヒト組織の範囲内でのFzd8の発現を確立するために行った。Fzd8は、高レベルで軟骨に存在し、低いか、またはごく少量のレベルで体の他の組織に存在する、限定的発現プロファイルを有することが分かった(図1)。(人工膝関節置換術を受けた患者から取得した)9つの変形性関節症軟骨試料および死後に取られた正常な軟骨のパネルでのFzd8 mRNAの発現レベルの解析は、変形性関節症軟骨における高められたFzd8の発現を表した(図2)。

変形性関節症軟骨および正常な軟骨でのFzd8受容体発現の局在は、免疫組織化学を用いて確立し、Fzd8は、軟骨の十分な厚さにわたって、軟骨細胞に発現していることが分かった(いくつかの試料で中間から深部にかけて高レベルの発現を有する)(図3)。

Wnt8aは、正常な軟骨および変形性関節症軟骨で発現している。

定量的RT−PCRを、死後に取られた変形性関節症の関節からの組織および正常な関節を含む、ヒト組織の範囲内でのWnt8aの発現を確立するために行った。最も高いWnt8aの発現は、精巣で見られた(発現はまた、脳および正常軟骨および変形性関節症軟骨で見られ、低いレベルの発現は、骨、滑膜および半月板軟骨で見られた)(図4)。

ヒトWnt8aおよびヒトWnt8bは、ヒトFzd8と細胞株中に共トランスフェクションしたときのみ、β−カテニン蓄積および核トランスロケーションを仲介できる。
Fzd8が、Wnt8aまたはヒトWnt8bの受容体であることを確立するために、我々は、CHOK1細胞株にWnt8aおよびFzd8の共トランスフェクションを行い、β−カテニン蓄積を測定した。

ヒトFzd8を安定的に発現しているCHOK1細胞株またはCHOK1細胞に、ヒトWnt8aまたはWnt8bコンストラクトを、一時的にトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクションの48時間後に融解し、β−カテニンをウエスタンブロットにより測定した(図5)。CHOK1細胞では、β−カテニン蓄積に関するWnt8aの影響はなかったが、Wnt8aをFzd8:CHOK1細胞にトランスフェクションしたとき、β−カテニンは蓄積した。β−カテニンレベルは、それぞれの細胞型でコントロールRFPにより修飾されなかった。さらに、β−カテニンの核トランスロケーションは(β−カテニン免疫蛍光で測定したとおり)、Wnt8aを発現するアデノウイルスにより感染したFzd8:CHOK1細胞で誘導されたが、コントロールウイルスで感染した細胞では誘導されなかった(図6)。

Wnt8aに依存したβ−カテニン蓄積は、ヒトsFRP3 (FrzB)の過剰発現により妨害される
sFRP3 (FrzB)は、Fzd8のシステインリッチドメインと相同性を有し、Wntシグナリングの内在性アンタゴニストである。Wnt8aおよびsFRP3のFzd8:CHOK1細胞株への共トランスフェクションを、β−カテニン蓄積に関してモニターした。Fzd8:CHOK1細胞中のWnt8a仲介β−カテニン蓄積は、sFRP3の過剰発現により妨害された(図7)。

ヒトOA軟骨細胞におけるヒトWnt8aの内在性発現は、増加したβ−カテニン蓄積および遺伝子発現の調節を生じる
OA関節軟骨細胞を、Wnt8A (Adv−Wnt8a)をコードしたアデノウイルスまたはコントロール(Adv−RFP)アデノウイルスでトランスフェクションした。β−カテニンは、トランスフェクションの72時間後に蓄積することが分かった(ウエスタンブロットにより測定したとおり)。コントロールウイルスは、β−カテニン蓄積に関して効果を有さなかった(図8)。

β−カテニンは、転写因子アクチベーター/リプレッサーのTCF/LEFファミリーを介した遺伝子発現を仲介することが知られている。変形性関節症軟骨細胞におけるβ−カテニンを介したWnt8aシグナリングの影響を調べるために、Wnt8aをAdv−Wnt8a感染により過剰発現させ、遺伝子発現変化のパネルを定量的RT−PCRによりモニターした。変えられた遺伝子発現を8週に渡って調べ、変えられた軟骨細胞表現型を示した。Wnt8aは、軟骨細胞遺伝子[Colα1(II)、Colα1(IX)、Colα1(XI)、SOX9、アグリカン]を抑制し、軟骨内骨化および硬化に関連する遺伝子[Colα1(X)、フィブリンおよび骨マトリックスGLAタンパク質]の発現を誘導した。さらに、抗血管新生遺伝子コンドロモジュリンは下方調節され、一方で、プロ血管新生遺伝子VEGFはWnt8aの過剰発現により上方調節された[表2]。
表2

Fzd8 mRNAを標的としたsiRNAは、ヒトOA軟骨細胞におけるWnt8a仲介遺伝子発現の影響を妨害できる
初代軟骨細胞を、Fzd8 siRNAのトランスフェクション後、Wnt8aで刺激した(Adv−Wnt8a感染)。Fzd8に対するsiRNAは、定量的PCRにより決定したとおり、Fzd8 mRNA発現を75−85%までノックダウンしたが、軟骨細胞(cartilage chondrocytes)で発現している他のFzd受容体、すなわち、Fzd1、Fzd5およびFzd7のノックダウンに関しては、最小限の影響しか示さなかった。データは、Fzd8 siRNAが、Wnt8aに制御される遺伝子変化を妨害することを示している[例えば、Fzd8 siRNAは、Wnt8aにより仲介される52%までのSOX9の減少を妨害する、図9]。

これらのデータは、変形性関節症における軟骨細胞の制御でのWnt8aの役割と一致している。我々の広い発現解析に基づいて、Fzd8は、相対的に制限された発現プロファイルを示すが、関節軟骨細胞で高く発現し、発現はさらに変形性関節症軟骨で増加する。組み換え細胞株および初代軟骨細胞実験で証明されたとおり、Fzd8はWnt8aの受容体であり、β−カテニンの安定化を誘導し、核での遺伝子発現を制御する。Wnt8aで刺激した初代関節軟骨細胞は、休止状態からより肥大した状態への表現型の変化、すなわち、通常は、軟骨内骨化の過程と関連した変化と関連する遺伝子発現を調節することにより応答する。

軟骨内骨化は、軟骨スキャホールドモデルのリモデリング後の石灰化骨の形成であり、発生の間の長骨成長の正常な過程である。軟骨細胞表現型変化はこの過程の間に起こり、コラーゲンXのようなマトリックスタンパク質を発現および分泌する、成熟した肥大軟骨細胞の蓄積を生じ、その結果、石灰化細胞外マトリックスおよび最終的には新骨の形成を生じる。さらなる軟骨内骨化が望まれない正常に十分に成長した関節軟骨では、軟骨細胞分化は負に制御される。しかしながら、変形性関節症では、この制御は明らかに失われ、非石灰化関節軟骨および骨の間のインターフェースで見られる深部石灰化軟骨が深部軟骨中に拡大し広がり、覆っている軟骨マトリックスの機械的特性を危うくする。したがって、我々のデータは、関節軟骨細胞肥大を刺激し、より石灰化した深部細胞外マトリックスを生じ、最終的には、軟骨統合の欠損、軟骨浸食および変形性関節症の間に観察される関節腔狭窄に貢献することに対するWnt/Fzd8経路の役割を示している。

実施例2
材料および方法
TCF/LEFレポーターアッセイ
Fzd8を安定的に発現している細胞に、ホタルルシフェラーゼTCFレポータープラスミド[Topflash]および標準化コントロールとして、構成的に発現するウミシイタケルシフェラーゼをトランスフェクションした。コントロール細胞に、TCF結合サイトが突然変異しているレポータープラスミド[Fopflash]を、ネガティブコントロールとしてトランスフェクションした(upstateから利用可能なレポータープラスミド)。細胞を、トランスフェクションの24時間後、10−50NN Wnt3aタンパク質(R＆D systems)で刺激した。ルシフェラーゼ活性を、Wnt3Aで処理した24時間後に決定した。細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイキットを用いて、製造プロトコール(Promega corp)に従い、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。

結果
TCF/LEFレポーターアッセイを用いたFzd8活性のためのスクリーニング
Fzd8をスクリーニングするための方法を確立するために、我々は、組み換えWnt3aタンパク質と共にFzd8およびTCFレポータープラスミドを、安定的に発現している細胞を処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。

CHOK1細胞およびヒトFzd8を安定的に発現しているCHOK1細胞に、ホタルルシフェラーゼTCFレポータープラスミドおよび標準化コントロールとして、構成的に発現するウミシイタケルシフェラーゼを用いて、一時的にトランスフェクションした。細胞を24時間後にWnt3aで処理し、ルシフェラーゼ活性をさらに24時間後に測定した。CHOK1細胞では、ルシフェラーゼ活性に関して、Wnt3aの影響はほとんどなかったが、20ng Wnt3aをFzd8:CHOK1細胞に適用したとき、ルシフェラーゼ活性は10.4倍に増加した。ルシフェラーゼ活性は、TCF結合サイトが変異したレポータープラスミドでトランスフェクションした細胞型では増加しなかった。すべての結果を、ウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化した(図10)。

実施例3
商業的に利用可能なFzd8 CRD抗体があるが(R＆D Systems)、検出にのみ適用可能で、中和(妨害または拮抗的な)活性を有しない。

したがって、抗体法が、例えば、Fzd8アンタゴニスト抗体を用いることによりWnt/Fzd8シグナリングを妨害する(拮抗する)ことを証明するために、Fzd8 CRDドメインがリガンド結合および受容体の活性化に重要であることを証明した。

この実験で、我々はFzd8 CRDを用いて、Fzd8受容体を介したWnt3aの結合およびシグナリングを妨害し、β−カテニンレポーターへの影響を見た。β−カテニンレポーターを、OA病態と相関のあるβ−カテニン蓄積のための代理として使用した。この実験は、Fzd8 CRDが、確かにWnt3a仲介効果を妨害することを示し、それが、可溶性Fzd8 CRDドメインに対する抗体を作製することにより、Fzd8アンタゴニスト(妨害)抗体をスクリーニングおよび同定するのに適していることを証明した。

材料および方法
ポリクローナル親和性精製抗Fzd8抗体を、ヒトFzd8一次アミノ酸配列由来の19量体ペプチドで免疫したウサギで作製した。ヤギ抗ヒト/マウス/ラットβ−カテニン親和性精製ポリクローナルAbを、R＆D systemsから取得した。ヤギ抗ヒト/マウス/ラットビメンチンポリクローナルIgGを、Santa Cruzから取得した。マウスモノクローナル抗ヤギ/ヒツジIgG−ペルオキシダーゼおよびヤギ抗ウサギIgG(全分子)ペルオキシダーゼ抗体を、Sigmaから購入した。組み換えWnt3aおよびマウスFzd8 CRD Fc融合を、R＆D systemsから取得した。最後に、Alexa Fluor(登録商標)488ウサギ抗ヤギIgGを、Molecular Probesから取得した。

結果
Fzd8 CRDは、Fzd8/β−カテニン応答のWnt3a仲介活性化に影響する
我々は、組み換えWnt3aタンパク質と共にFzd8およびTCFレポータープラスミドを安定的に発現している細胞を処理し、Fzd8 CRD Fc融合の濃度を増加させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。細胞をFzd CRDを用いて前吸着(preadsorbed)したのちWnt3aで処理し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Wnt3aに応答したルシフェラーゼ活性の増加は、ND50が0.027μg/mlで、R＆D可溶性mFzd8 CRDにより阻害し得る(図11)。

正常なヒト組織およびヒト関節軟骨におけるヒトFzd8定量的RT−PCR。Fzd8発現は18S RNAで標準化した。 正常(死後)および変形性関節症関節軟骨におけるヒトFzd8定量的RT−PCR。試料は、内側ならびに側部大腿骨顆および脛骨プラトー由来のRNAを含む。Fzd8発現は、18S RNAで標準化した。 Fzd8免疫組織化学。ヒトFzd8を、Fzd8免疫化ペプチドの非存在下(上)または存在下(下)で、ウサギ抗ヒトFzd8ポリクローナル抗体を用いて、ヒトOA関節軟骨において検出した。ある例では、軟骨細胞の中間部/深部(Mid/Deep zone)が、強く、特異的なFzd8反応性を示すことを証明した(DAB発色)。像は、中間部像の10×倍率(左)または20×倍率(右)である。SZ=表面部。MZ=中間部。 正常ヒト組織(上)およびヒト関節軟骨/骨サブコンパートメント(下)でのヒトWnt8a定量的RT−PCR。Wnt発現を18s RNAで標準化した。接頭語OA＝変形性関節症関節軟骨、接頭語PM＝死後関節軟骨(コントロール)。上部パネル接尾語:LFC＝側部大腿顆;MFC＝内側大腿顆、LTP＝側部脛骨プラトー、MTP＝内側脛骨プラトー、B＝肋軟骨下骨、syn＝滑膜。Comp＝種々のヒト組織セットからのコントロールRNA。下部パネル接尾語:♯＝関節軟骨試料数、MDM＝単球由来マクロファージ、MDMIFNg＝IFN−γ刺激単球由来マクロファージ、MDM NS/LPS＝LPS刺激単球由来マクロファージ。Comp＝種々のヒト組織セットからのコントロールRNA。 示したMOIでコントロール(RFP)またはWnt8aアデノウイルスによる感染後の、CHOK1およびFzd8−CHOK1(Fzd8を安定的に発現している)β−カテニンウエスタンブロット。ビメンチンウエスタンブロッティングを、タンパク質ローディングのためのコントロールで使用した。 β−カテニン核トランスロケーション。a) CHOK1−Fzd8 β−カテニンの免疫蛍光イメージング。細胞を、LiCl(30mM)、Adv−Wnt8a(MOI 1000:1)で24時間刺激した。b) Arrayscan (Cellomics)核トランスロケーションソフトウェアを用いて定量した、CHOK1−Fzd8 β−カテニン核染色。6個の複製CHOK1−Fzd8ウェルを、24時間、未処理またはLiCl(30mM)で刺激、Adv−Wnt8a (MOI 1000:1)で感染、またはコントロールAdv−RFP (MOI 1000:1)で感染させた。 Fzd8:CHOK1細胞に、示した量のWnt8aまたはSFRP3をコードしたpCDNA3を単独でトランスフェクションするか、またはpCDNA3−Wnt8aおよびpCDNA3−SFRP3を共トランスフェクションした。β−カテニン蓄積を(同等のタンパク質をそれぞれのレーンにロードしている)、示したとおり、24時間または48時間後検出した。 コントロール(RFP)またはWnt8aアデノウイルスによる感染後72時間での、初代OA関節軟骨細胞β−カテニンウエスタンブロット。ビメンチンウエスタンブロッティングを、タンパク質ローディングおよび標準化データのためのコントロールで使用した。a) SDS−PAGEおよびECLウエスタンブロット後のβ−カテニンおよびビメンチン検出; b)ビメンチンでの標準化後のβ−カテニンタンパク質レベルの定量。 Wnt8a誘導軟骨細胞遺伝子発現変化は、Fzd8により仲介される。初代軟骨細胞にAtufect lipid (Atugen)を用いて、25nM−100nM siRNAをトランスフェクションし、トランスフェクションの48時間後、Adv−Wnt8aを感染させた(MOI＝500:1)。遺伝子発現における影響を、トランスフェクションの72時間後、定量的PCRによりモニターした。試料データ:Wnt8a抑制SOX9発現。トランスフェクションの72時間後のSOX9 mRNAレベルをGAPDH mRNAに対して標準化した。Wnt8aはSOX9 mRNAを減少させ、これは、Fzd8をFzd8 siRNAによりノックダウンしたときレスキューされた(52%の効果)。コントロールsiRNA＝無関係のsiRNA二本鎖。Fzd8 siRNA＝Fzd8特異的siRNA二本鎖。データは、25nMで使用したsiRNA二本鎖を用いて提供された。 TOPFlashまたはFOPFlashを発現しているCHOK1細胞およびFzd8:CHOK1細胞を、5−40ng Wnt3aで処理した。TCF/LEFレポーター遺伝子活性を、ウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化したホタルルシフェラーゼ活性として測定した。 TOPFlashを発現しているFzd8 CHOK1細胞を、0−10 μg/mlのFzd8 CRD Fc融合タンパク質で前吸着して、Wnt3aで処理した。TCF/LEFレポーター遺伝子活性を、ホタルルシフェラーゼ活性として測定した。

Claims (22)

1. Fzd8の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、
   a) Fzd8ポリペプチドを、Wntポリペプチドと、該Wntポリペプチドが該Fzd8ポリペプチドと結合可能な条件のもとで、候補モジュレーターの存在下または非存在下で接触させること;および、
   b) 該Fzd8ポリペプチドの該Wntポリペプチドへの結合を測定すること(ここで、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較して該候補モジュレーターの存在下での結合の減少が、該候補モジュレーターをFzd8の機能を調節する薬剤として同定する)、
   を含む、方法。
2. Fzd8の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、
   a) Fzd8ポリペプチドを、Wntポリペプチドと、該Wntポリペプチドが該Fzd8ポリペプチドと結合可能な条件のもとで、候補モジュレーターの存在下または非存在下で接触させること;および、
   b) 該Wntポリペプチドに対する該Fzd8ポリペプチドのシグナリング活性を測定すること(ここで、該候補モジュレーターの非存在下での活性と比較して該候補モジュレーターの存在下での活性の変化が、該候補モジュレーターをFzd8の機能を調節する薬剤として同定する)、
   を含む、方法。
3. Fzd8シグナリング活性が、β−カテニンの蓄積、核トランスロケーションまたはリン酸化状態を測定することにより測定される、請求項２に記載の方法。
4. 該方法が細胞アッセイである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 該細胞アッセイが、細胞または細胞株にFzd8およびWntを共トランスフェクションすることを含む、請求項４に記載の方法。
6. 医薬としての使用のためのFzd8またはWntポリペプチドのモジュレーター。
7. モジュレーターがFzd8アンタゴニスト抗体である、請求項６に記載のモジュレーター。
8. アンタゴニスト抗体がFzd8のシステインリッチドメインに結合する、請求項７に記載のモジュレーター。
9. 変形性関節症(OA)の処置での使用のための医薬の製造における、Fzd8またはWntポリペプチドのモジュレーターの使用。
10. モジュレーターがFzd8アンタゴニスト抗体である、請求項９に記載の使用。
11. 該抗体がFzd8のシステインリッチドメインに結合する、請求項１０に記載の使用。
12. OAの処置での使用のための医薬の製造における、sFRP3 (FrzB)を含む組成物の使用。
13. OAの処置での使用のための医薬の製造における、ヒトFzd8のシステインリッチドメインを含む組成物の使用。
14. OAの処置での使用のための医薬の製造における、Fzd8アンタゴニスト抗体を含む組成物の使用。
15. OAの処置での使用のための医薬の製造における、Fzd8アンタゴニスト抗体の使用。
16. Fzd8シグナリングの異常調節により特徴づけられる疾患を診断する方法であって、試料中のFzd8発現を検出し、該発現を正常組織中の発現と比較する工程を含む、方法。
17. 試料組織中のFzd8発現を検出し、正常組織と比較することを介して、OAを診断する方法。
18. Fzd8活性を修飾する薬剤をスクリーニングするためのキット。
19. 試料中のFzd8発現を検出する手段を含む、OAの診断のためのキット。
20. OAを有するほ乳類を処置する方法であって、該ほ乳類に、治療上有効量のFzd8アンタゴニストを投与することを含む、方法。
21. Fzd8アンタゴニストが抗体である、請求項２０に記載の方法。
22. 該抗体がFzd8のシステインリッチドメインに結合する、請求項２１に記載の方法。

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