JP2007526337A

JP2007526337A - Ａｌｋ７およびミオスタチン阻害剤ならびにその使用

Info

Publication number: JP2007526337A
Application number: JP2007502068A
Authority: JP
Inventors: ジョンクノッフ，; ジャスバーシーラ，
Original assignee: アクセルロンファーマインコーポレーテッド
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2007-09-13
Also published as: US7456149B2; US20090098114A1; EP3006039B1; WO2005084699A1; US20120183540A1; US20100322925A1; US20140205600A1; US9255137B2; US20060030522A1; EP3006039A1; EP1729793A1; AU2005219441A1; US20160199458A1; US7807631B2; EP1729793B1; CA2558478A1; US8637450B2

Abstract

本発明はALK7可溶性受容体ならびにGDF-8 (ミオスタチン)およびGDF-11などのある種のリガンドの機能のアンタゴニストとしてのその使用に関する。本発明のALK7可溶性受容体は、脳卒中、脊髄損傷および全ての末梢神経疾患などのニューロンの疾患または容態の治療においてGDF-8およびGDF-11のアンタゴニストとして有用である。本発明のALK7可溶性受容体は同様に、GH (成長ホルモン)等価物として、および筋肉量を増加させるのに有用である。

Description

発明の背景
ミオスタチン、または成長/分化因子8 (GDF-8)は、形質転換成長因子-β (TGF-β)スーパーファミリーに属する(McPherron et al., Nature 387: 83-90 (1997)(非特許文献１))。ヒトミオスタチン遺伝子がクローニングされており(Nestor et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14938-43 (1998)(非特許文献２))、ミオスタチン免疫反応性が1型と2型繊維の両方のヒト骨格筋で検出可能であることが報告されている。機能に関して、ミオスタチンは骨格筋の成長と発達を負に調節するのに関与している可能性がある(Nestor et al., 前記)。

ミオスタチンが筋肉の発達を負に調節するのに関与している可能性があるという最初の証拠は、ミオスタチンノックアウトマウスを用いた研究によってもたらされた(McPherron et al., Nature 387: 83-90 (1997)(非特許文献１))。ミオスタチン欠損マウスでは、それらが野生型マウスよりも顕著に大きく、骨格筋量が大幅かつ広範に増加したことを除き、それらの動物は正常に近かった。さらに、筋肉量の増加を特徴とする2品種のウシには、ミオスタチンコード配列に変異があることも突き止められた(McPherron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12457-61 (1997)(非特許文献３))。さらに、免疫反応性ミオスタチンの血清および筋肉内濃度は、健常者に比べて筋消耗を伴うHIV感染者で増加しており、除脂肪量指数と逆の相関があることに留意されたい。これらのデータは、ミオスタチンが成人における骨格筋成長の負の調節因子であり、HIV感染者の筋消耗の一因となるという仮説(Nestor et al., 前記)を支持するものである。

上記の所見を背景に、とりわけ、例えば、加齢、自己免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症およびがんなどの病状または病態の結果として筋消耗に直面する個体では、ミオスタチン活性を調節する方法が必要とされている。本発明はそのような筋消耗性疾病を抱える個体を補助するのに利用できる方法および組成物を提供し、さらにミオスタチン遺伝子発現の調節に対する洞察を提供する。

McPherron et al., Nature 387: 83-90 (1997) Nestor et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:14938-43 (1998) McPherron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12457-61 (1997)

発明の概要
本発明の1つの局面は、筋肉量をインビボで増加させる薬学的調製物を提供する。本発明の典型的な調製物には、ALK7のリガンド結合ドメインを含んだポリペプチドが含まれる。これらのいわゆる「ALK7デコイ」を利用して、被験体の筋肉または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性により、少なくとも一部は、特徴付けられる、病態の重症度を軽減させることができる。例えば、本発明の薬学的調製物を悪液質、食欲不振、DMD症候群、BMD症候群、AIDS消耗性症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部疾患および炎症性筋疾患などの、消耗疾患の重症度を抑制する、改善するまたは軽減するのに有効な量で投与することができる。薬学的調製物は、ミオスタチンを介したシグナル伝達を阻害することにより、ALK7を介したシグナル伝達を阻害することにより、またはもっと複雑な機構により作用することができる。

本発明の別の局面はミオスタチンを阻害するための薬学的調製物を提供する。本発明の典型的な調製物は、ミオスタチンとのALK7受容体の結合を阻害する形でミオスタチンに結合するミオスタチン阻害剤を含む。ミオスタチン阻害剤は、ミオスタチンの「ALK7エピトープ」(以下に定義される)に結合することが好ましい。ある種の態様では、薬学的調製物は、ALK7受容体のリガンド結合ドメイン(例えば、ミオスタチン、nodal、アクチビンABまたはアクチビンB結合ドメイン)を含んだポリペプチドである阻害剤を含む。例えば、リガンド結合ドメインは、アミノ酸残基

(SEQ ID No.2の残基26〜100)などの、SEQ ID No.2に示されるような、ヒトALK7タンパク質から得ることができる。ある種の態様では、阻害剤はALK7由来の切断型細胞外ドメインを含む。他の態様では、阻害剤はsALK7a (SEQ ID No.4)またはsALK7b (SEQ ID No.6)などの、可溶性のALK7スプライス変異体とすることができる。

同様に含まれるのは、ALK7由来の変種配列、例えば、リガンド結合活性を保持するリガンド結合ドメインである。変種配列は、阻害剤の選択性(例えば、ミオスタチン、GDF11、アクチビンまたはnodal結合に対する相対的結合)を変える、ミオスタチンまたはその他のリガンド結合に対するその他の結合特性(K_d、および/またはK_onもしくはK_off速度などの)を変える、あるいは生体内分布またはインビボでのもしくは棚上での半減期を高める手段として望ましい可能性がある。

ある種の好ましい態様では、ミオスタチン結合ドメインは、1 μMまたはそれ以下のK_d、より好ましくは100 nM、10 nMまたは場合により1 nMもしくはそれ以下のK_dでミオスタチンに結合する。

ある種の態様では、リガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメインに加えて、インビボでの安定性、インビボでの半減期、取込み/投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成および/または精製の1つまたは複数を促進する1つまたは複数のポリペプチド部分を含む、融合タンパク質の一部分である。例えば、融合タンパク質は免疫グロブリンFcドメインを含むことができる。融合タンパク質はエピトープタグ、FLAGタグ、ポリヒスチジン配列などの、またはGST融合体として精製用部分配列を含んでもよい。

ある種の態様では、リガンド結合ドメインは、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合されたアミノ酸などの、1つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含むタンパク質の一部分である。

一部には、ミオスタチンがALK7に結合するという発見に基づいて、本発明は同様に、ミオスタチンに結合しALK7受容体の結合と競合するポリペプチド親和性試薬の使用を企図する。例えば、そのような親和性試薬としては、抗体薬剤、ならびにミオスタチンに結合しミオスタチンを阻害するペプチドおよび足場ペプチドが挙げられる。本発明の典型的な抗体としては、組換え抗体およびモノクローナル抗体、ならびにその抗原結合断片に由来する構築体、例えば、V_Hドメイン、V_Lドメイン、scFv's、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂構築体、Fv'sおよびジスルフィド結合されたFv'sが挙げられる。ある種の好ましい態様では、抗体薬剤は完全にヒトの抗体もしくはヒト化キメラ抗体であり、またはその抗原結合断片である。

他の態様では、ミオスタチン阻害剤は小有機分子であり、これはミオスタチンに選択的に結合しALK7受容体の結合と競合する。この部類の好ましい阻害剤は、2500 amu未満、さらにより好ましくは2000、1000または場合により750 amu未満の分子量を有する分子である。

ある種の態様では、ミオスタチン阻害剤は、例えば、GDF11および/またはnodalに対して、ミオスタチンの結合および阻害に選択的である。例えば、ミオスタチン阻害剤は、ミオスタチン結合に対する解離定数(K_d)がGDF11および/またはnodalの結合に対するそのK_dよりも少なくとも2倍低い、さらにより好ましくは少なくとも5、10、100または場合により1000倍低いものとすることができる。結合反応速度によってであれ生体内分布によってであれ、本ミオスタチン阻害剤は同様に、ミオスタチン活性の阻害に対するEC₅₀、または特定の生理学的影響(筋成長の促進、骨密度の促進または脂肪細胞の分化誘導などの)がGDF11および/またはnodal活性の阻害に対するそのEC₅₀よりも少なくとも2倍低い、さらにより好ましくは少なくとも5、10、100または場合により1000倍低い阻害剤のような、インビボでの相対効力に基づいて選択することができる。

ある種の好ましい態様では、ミオスタチン阻害剤結合ドメインは、1 μMまたはそれ以下のK_d、より好ましくは100 nM、10 nMまたは場合により1 nMもしくはそれ以下のK_dでミオスタチンに結合する。

ある種の態様では、本阻害剤調製物はヒト患者で用いるのに適しているように調製することができる。好ましい態様では、ミオスタチン阻害剤の本調製物は、ヒト患者への投与に適するよう発熱物質を実質的に含まないと考えられる。

他の態様では、本阻害剤をヒト以外の動物、具体的にはその他の哺乳動物に用いることができる。例えば、本発明の化合物をニワトリ、シチメンチョウ、家畜動物(ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシなどのような)、伴侶動物(例えば、ネコおよびイヌ)に与えることができ、または水産養殖で実用して、成長を加速させおよびタンパク質/脂肪率を改善させてもよい。さらに例えば、本阻害剤を利用して、食肉生産用に飼育されている動物の飼料効率を促進しまたは成長を刺激し、生肉品質を改善させること、または乳牛での乳汁産生を増加させることができる。

本発明の別の局面は、本明細書に記述されるような、ミオスタチン阻害剤の薬学的調製物、およびヒト患者での筋肉組織の成長の促進に用いるためのラベルまたは使用説明書を含む包装された医薬に関する。

本発明の別の局面は、本明細書に記述されるような、ミオスタチン阻害剤の薬学的調製物、およびヒト以外の哺乳動物での筋肉組織の成長の促進に獣医が用いるためのラベルまたは使用説明書を含む包装された医薬に関する。

本発明の別の局面は、以下を含む、哺乳動物で用いるのに適した薬学的調製物を提供する: ミオスタチン上のALK7受容体結合部位またはその他のALK7リガンドに結合し、ミオスタチンまたはその他のALK7リガンドによるシグナル伝達を阻害するポリペプチド阻害剤(ALK7デコイ、抗体薬剤、ペプチドまたは足場ペプチドなどの)のコード配列と、処置哺乳動物での筋肉組織の成長の促進に有効な量のポリペプチドミオスタチン阻害剤の発現をインビボで引き起こすための転写制御配列とを含むベクター。この調製物は、処置哺乳動物の細胞によるベクターの取込みを促進する薬剤を含んでもよい。

本発明の別の局面は、本明細書に開示されるミオスタチン阻害剤の1つまたは複数の薬学的調製物を投与する段階により、インビボでミオスタチンシグナル伝達を阻害する方法に関する。本方法を利用して、ヒト患者においてまたはヒト以外の動物において筋成長を促進すること、脂肪生成分化を促進すること、および/または骨の成長もしくは石灰化を促進することができる。

ある種の態様では、本発明の治療方法を利用して、被験体の筋肉または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性により、少なくとも一部は、特徴付けられる、病態の重症度を軽減させることができる。例えば、本発明の薬学的調製物を悪液質、食欲不振、DMD症候群、BMD症候群、AIDS消耗性症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部疾患および炎症性筋疾患などの、消耗疾患の重症度を抑制する、改善するまたは軽減するのに有効な量で投与することができる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、エメリ・ドレフュシュ型筋ジストロフィー(EDMD)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHまたはFSHD) (ランドゥジー・デジュリンとしても知られる)、筋強直性ジストロフィー症(MMD) (スタイナート病としても知られる)、眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、および先天型筋ジストロフィー(CMD)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な運動ニューロン疾患としては、筋萎縮性側索硬化症(ALS) (ルーゲーリック病としても知られる)、乳児進行性脊髄性筋萎縮症(SMA、SMA1またはWH) (SMA1型、ウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られる)、中間型脊髄性筋萎縮症(SMAまたはSMA2) (SMA2型としても知られる)、若年型脊髄性筋萎縮症(SMA、SMA3またはKW) (SMA3型、クーゲルベルク・ウエランダー病としても知られる)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA) (ケネディー病およびX-連鎖性SBMAとしても知られる)、および成人脊髄性筋萎縮症(SMA)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な炎症性筋疾患としては、皮膚筋炎(PM/DM)、多発性筋炎(PM/DM)、および封入体筋炎(IBM)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な神経筋接合部疾患としては、重症筋無力症(MG)、ランバート・イートン症候群(LES)、および先天性筋無力症候群(CMS)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる内分泌異常による典型的な筋障害としては、甲状腺機能亢進性筋障害(HYPTM)および甲状腺機能低下性筋障害(HYPOTM)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な末梢神経疾患としては、シャルコー・マリー・ツース病(CMT)、デジュリーヌ・ソッタス病(DS)、およびフリードライヒ運動失調症(FA)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できるその他の典型的な筋障害としては、先天性筋強直症(MC)、先天性パラミオトニア(PC)、中心コア病(CCD)、ネマリン筋障害(NM)、筋細管筋障害(MTMまたはMM)、および周期性四肢麻痺(PP)が挙げられる。

本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な筋肉の代謝障害としては、ホスホリラーゼ欠損症(MPDまたはPYGM)、酸性マルターゼ欠損症(AMD)、ホスホフルクトキナーゼ欠損症(PFKM)、脱分枝酵素欠損症(DBD)、ミトコンドリア筋障害(MITO)、カルニチン欠損症(CD)、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症(CPT)、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症(PGK)、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症(PGAMまたはPGAMM)、乳酸脱水素酵素欠損症(LDHA)、およびミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症(MAD)が挙げられる。

本方法を利用して代謝性疾患の重症度を、例えば、肥満またはII型糖尿病の治療において抑制する、改善するまたは軽減することもできる。さらに例えば、本阻害剤調製物を利用して、被験体の体脂肪割合を低下させることができる。

他の態様では、阻害剤調製物をうっ血性心不全の治療または予防; 加齢に伴う脆弱性の軽減のため; 骨密度の増加(例えば、骨粗しょう症の治療のため)または骨折修復の加速; 発育遅延の治療、生理的小人症の治療、大手術後などのタンパク質異化反応の軽減; 慢性疾患によるタンパク質喪失の低減; 創傷治癒の加速; 火傷患者または大手術を受けた患者の回復の加速; 皮膚厚み、代謝恒常性および腎臓恒常性の維持のような方法の一部として利用することができる。本阻害剤のその他の用途としては、成長ホルモン不全の成人の治療および糖質コルチコイドの異化副作用の抑制が挙げられる。

本薬学的組成物をミオスタチンアンタゴニストとして利用して、脊髄損傷および脳卒中などのCNS損傷/疾患、ならびにPNS損傷/疾患を含む、いくつかのニューロン系の病態を治療することもできる。

本発明は同様に、上に列挙される疾患または治療適応症を治療するために有用な1つまたは複数のその他の化合物と同時に本製剤の使用を企図する。これらの組合せでは、治療薬および本発明のミオスタチン阻害剤は、独立的におよび連続的に投与されてもまたは同時投与されてもよい。骨吸収を阻害する、骨粗しょう症を予防する、骨格の骨折を減らす、骨折の治癒を促進する、骨形成を刺激するおよび骨ミネラル濃度を高める併用療法は、ビスフォスフォネートおよび本発明のミオスタチン阻害剤の組合せによって達成することができる。これらの実用性があるビスフォスフォネートは、アレンドロネート、チルドロネート、ジメチル-APD、リセドロネート、エチドロネート、YM-175、クロドロネート、パミドロネート、およびBM-210995(イバンドロネート)を含むが、これらに限定されることはない。

本阻害剤は哺乳動物のエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストと組み合わされてもよい。エストロゲンアゴニスト/アンタゴニストという用語は、エストロゲン受容体と結合し、骨代謝回転を阻害し骨量の減少を抑制する化合物のことをいう。具体的には、エストロゲンアゴニストは、哺乳動物組織中のエストロゲン受容体部位に結合すること、および1つまたは複数の組織中でエストロゲンの作用を模倣することができる化合物と本明細書において定義される。エストロゲンアンタゴニストは、哺乳動物組織中のエストロゲン受容体部位に結合すること、および1つまたは複数の組織中でエストロゲンの作用を遮断することができる化合物と本明細書において定義される。さまざまなこれらの化合物が以下に記述され参照されているが、しかし、その他のエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストが当業者に知られていると考えられる。典型的なエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストとしては、ドロロキシフェンおよび関連化合物(米国特許第5,047,431号を参照のこと)、タモキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,536,516を参照のこと)、4-ヒドロキシタモキシフェン(米国特許第4,623,660を参照のこと)、ラロキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,418,068を参照のこと)、ならびにイドキシフェンおよび関連化合物(米国特許第4,839,155を参照のこと)が挙げられる。

本阻害剤は以下の薬剤の1つまたは複数と組み合わされてもよい: リルゾールおよびトピラメートなどのグルタミン酸アンタゴニスト(部分アンタゴニストを含む); 成長ホルモン(GH)およびインスリン様成長因子1 (IGF-1)などのポリペプチド成長因子、またはキサリプロデンなどの、神経栄養因子の身体自身の産生を増加させる薬物; 抗炎症薬、例えば、セレコクシブ(セレブレックス)およびその他のCOX-2阻害剤; 抗生物質、例えば、ミノサイクリン(ミノシン、ダイナシン)またはカスパーゼ酵素を阻害するその他の薬剤; タモキシフェン(ノルバデックス)などのプロテインキナーゼC阻害剤; ならびにビタミンE、コエンザイムQ10およびクレアチンを含む、さまざまな市販の物質。

発明の詳細な説明
I. 概説
本開示は一部は、ミオスタチン(GDF-8)がALK7受容体に結合するという発見に関する。本開示はさらに、可溶性の、AKL7受容体のリガンド結合部分を哺乳動物に投与することで筋肉量の増加が起こるという発見に関する。ヒトを含むさまざまな哺乳動物において、ミオスタチンの機能喪失変異が筋肉量の増加をもたらすことは周知である。Schuelke M et al. N Engl J Med. 2004 Jun 24;350(26):2682-8. McPherron AC, Lee SJ, Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Nov 11;94(23):12457-61. Grobet L, et al. Nat Genet. 1997 Sep;17(1):71-4.したがって、可溶性ALK7はミオスタチンに結合し、ミオスタチンを介したシグナル伝達を阻害することにより、筋肉量を増加させる可能性がある。しかしながら、正確な作用機序は実質的には、もっと複雑である可能性がある。ALK7はNodal、アクチビンAB、アクチビンBおよび、本明細書に示される結果に基づいて、GDF11、つまりGDF8の密接な相同体に結合することが知られている。Tsuchida K, et al., Mol Cell Endocrinol. 2004 May 31;220(1-2):59-65. Reissmann E, et al., Genes Dev. 2001 Aug 1;15(15):2010-22. 今後の研究によって、ALK7がTGF-βファミリーのさらなるメンバーに結合することが明らかにされる可能性が高い。故に、可溶性ALK7はインビボで複数のシグナル伝達分子に結合し、それらの分子の機能を阻害することにより、筋肉量に影響を与える可能性がある。それでもなお、ALK7がミオスタチンに結合するという発見は、例えば、ミオスタチンとALK7との相互作用をインビボで選択的に妨害することによって、ミオスタチン活性を調節するのに使用できる多数の薬剤をもたらすものである。

II. 定義
本明細書で用いられる用語は一般的に、当技術分野において、本発明の文脈の中でおよび各用語が用いられる特定の文脈においてその通常の意味を有する。本発明の組成物および方法ならびにそれらの製法および使用法を記述するうえで実践者にさらなる指示を与えるため、ある種の用語が以下にまたは本明細書中の他の箇所に論じられる。用語のいかなる使用の範囲および意味も、用語が用いられる特定の文脈から明らかであると考えられる。

「約」および「およそ」は、総じて、測定の性質または精度を前提に、測定の数量に対して許容される誤差度を意味するものとする。通常、典型的な誤差度は所与の値または一連の値の20パーセント(%)以内、好ましくは10パーセント(%)以内、およびより好ましくは5パーセント(%)以内である。

あるいは、およびとりわけ生体系では、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の1桁以内、好ましくは5倍以内およびより好ましくは2倍以内である値を意味することができる。本明細書に示される数量は特に指定のない限り概算であり、「約」または「およそ」という用語は、明記されていない場合には推量されうることを意味する。

本発明の方法は配列を相互と、例えば、野生型配列を1つまたは複数の変異体/配列変種と比較する段階を含むことができる。そのような比較は通常、例えば、当技術分野において周知である配列アライメントプログラムおよび/またはアルゴリズム(例えば、数例を挙げるとBLAST、FASTAおよびMEGALIGN)を用いた、ポリマー配列のアライメントを含む。当業者は、そのようなアライメントにおいて、変異が残基の挿入または欠失を含む場合、配列アライメントはその挿入のまたは欠失の残基を含んでいないポリマー配列の中に「ギャップ」(通常はダッシュ、または「A」で表される)を導入することを容易に理解することができる。

「相同の(な)」とは、その文法形式や綴り字異形の全てにおいて、同じ種の生物におけるスーパーファミリー由来のタンパク質、および異なる種の生物由来の相同タンパク質を含めて、「共通の進化上の起源」を持つ2つのタンパク質間の関係のことをいう。このようなタンパク質(およびそのコード化核酸)は、同一性の割合という点からであれ特定の残基またはモチーフおよび保存部位の存在によってであれ、その配列類似性によって反映されるとおり、配列相同性を有する。

「配列類似性」という用語は、その文法形式の全てにおいて、共通の進化上の起源を有してもまたは有していなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間の同一または一致の度合いのことをいう。

しかしながら、一般的な用法ではおよび本出願では、「相同の(な)」という用語は「高度に」などの副詞で修飾される場合、配列類似性のことを指してもよく、共通の進化上の起源に関しても関してしなくてもよい。

核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件の下で核酸分子の一本鎖型が他の核酸(micleic acid)分子にアニールできる場合、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと)。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決める。相同な核酸に対する予備スクリーニングの場合、55℃のT_m (融解温度)に相当する、低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、5×SSC、0.1% SDS、0.25%ミルクおよびホルムアミドなし; または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5% SDS)を使用することができる。

中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件はさらに高いT_m、例えば、5×または6×SSCで、40%ホルムアミドに相当する。高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件はもっとも高いT_m、例えば、50%ホルムアミド、5×または6×SSCに相当する。SSCは0.15 M NaCl、0.015 Mクエン酸Naである。

「高度のストリンジェンシー条件」は、構造的に関連するが、構造的に異ならない核酸のハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーションの条件を包含することが当技術分野において十分に理解されている。「ストリンジェント」という用語は、高度に相補的な核酸のみのアニーリングを可能にするいくつかの代替的なハイブリダイゼーションと洗浄の条件のいずれかを記述することが当業者によって理解される専門用語である。

典型的な高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約1 M塩の中で形成されたDNA二重鎖の融解温度(T_m)よりも約20℃〜27℃低い温度に等しい。多くの等価な手順が存在しており、いくつかのよく知られている分子クローニングマニュアルには、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに適した条件が記述されており、さらには、これらの条件の下で安定であると予想されるハイブリッドの長さを計算する式が示されている(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6もしくは13.3.6; またはSambrook, et al. (1989) Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Pressの9.47〜9.57頁を参照のこと)。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能であるが、ハイブリダイゼーションには2つの核酸が相補配列を含むことが必要になる。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の度合い、当技術分野において周知の変量に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなれば、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するT_m値もそれだけ大きくなる。核酸(micleic acid)ハイブリダイゼーションの相対的安定性(より高いT_mに相当する)は、次の順番で低下する: RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100を越えるヌクレオチドのハイブリッドの場合、T_mの計算式が得られている(Sambrook et al., 前記、9.51を参照のこと)。もっと短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決める(Sambrook et al., 前記、11.8を参照のこと)。ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり; 好ましくは、少なくとも約15ヌクレオチドであり; およびより好ましくは、長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。

特に規定がなければ、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、約55℃のT_mのことをいい、上記の条件を利用する。好ましい態様では、T_mは60℃であり; より好ましい態様では、T_mは65℃である。特定の態様では、「高度のストリンジェンシー」とは、0.2×SSC中68℃での、50%ホルムアミド、4×SSC中42℃での、またはこれらの2つの条件のいずれかの下で観測されるものに等しいハイブリダイゼーションのレベルを利用可能にする条件の下での、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件のことをいう。

オリゴヌクレオチドに(例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーに)適したハイブリダイゼーション条件は、通常、オリゴヌクレオチドのいっそう低い融解温度のため、完全長の核酸(例えば、完全長のcDNA)の場合とは幾分異なる。オリゴヌクレオチドの融解温度は、含まれるオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するので、適当なハイブリダイゼーション温度は、使われるオリゴヌクレオチド分子に応じて変化すると考えられる。典型的な温度は37℃(14塩基のオリゴヌクレオチドの場合)、48℃(17塩基のオリゴヌクレオチドの場合)、55℃(20塩基のオリゴヌクレオチドの場合)および60℃(23塩基のオリゴヌクレオチドの場合)とすることができる。オリゴヌクレオチドに適した典型的なハイブリダイゼーション条件には、6×SSC、0.05%ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または等価なハイブリダイゼーションレベルを利用可能にするその他の条件が含まれる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」とは、「ペプチド結合」と呼ばれる化学結合によって共に連結されるアミノ酸の鎖を記述するよう同義的に用いられる。酵素を含め、タンパク質またはポリペプチドは、これが自然界に存在することを意味する「天然」または「野生型」であってもよく; またはそれが作出された、改変された、派生されたことを意味する、または天然タンパク質からもしくは別の変異体から何らかの方法で異なるもしくは変えられていることを意味する「変異体」、「変種」または「修飾型」であってもよい。

「ALK7エピトープ」という用語は、ALK7のミオスタチン結合ドメインが結合するミオスタチンの部分のことをいう。

「抗体」および「抗体薬剤」という用語は、本明細書において同義的に用いられており、液性反応のインビトロでのまたはインビボでの発生によって得られる免疫グロブリン分子のことをいい、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は同様に、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、異種結合抗体(例えば、二重特異性抗体)および組換え一本鎖Fv断片(scFv)などの遺伝子組換え型を含む。「抗体」という用語は同様に、抗体の抗原結合型(例えば、Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv、rIgG、および逆位IgG)を含む。ALK7エピトープと免疫学的に反応性の抗体は、インビボでまたは組換え抗体のファージもしくは類似ベクターのライブラリーの選択などの組換え方法により作出することができる。例えば、Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; およびWard, et al. (1989) Nature 341:544-546; およびVaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14:309-314を参照されたい。

「抗原結合断片」という用語は、ALK7エピトープに結合する抗体の任意の部分を含む。抗原結合断片は、例えば、CDR3領域、またはミオスタチンエピトープの親和性および特異性を保持する免疫グロブリン分子のその他の断片を含むポリペプチドとすることができる。

「特異的に結合する」とは、特定の標的分子(すなわち「結合パートナー」または「結合部分」)との、その標的分子を欠く組成物と比べた、全体または一部でのリガンドの選択的結合への言及を含む。もちろん、ある種の度合いの非特異的な相互作用が本ミオスタチン中和抗体とその他のタンパク質との間で起こりうるものと認識される。それでもなお、特異的結合はミオスタチンタンパク質の特異的認識を通じて媒介されるように、区別されることができる。通常、特異的結合は、その抗体と他のタンパク質、例えば、GDF11との間でよりもその抗体とミオスタチンタンパク質との間でずっと強い会合を引き起こす。そのような条件下での抗体によるミオスタチンとの特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性で選択された抗体が必要になる。抗体結合部位のその同族の一価抗原に対する親和定数(Kdに対立するものとしてKa)は少なくとも10⁷、通常は少なくとも10⁸、好ましくは少なくとも10⁹、より好ましくは少なくとも10¹⁰、および最も好ましくは少なくとも10¹¹ Mである。さまざまな免疫アッセイ形式がミオスタチンと特異的に反応する抗体を選択するのに適している。例えば、固相ELISA免疫アッセイは、タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を選択するのに日常的に使われている。特異的反応性を測定するのに利用できる免疫アッセイ形式および条件の記述については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。

競合的結合形成の免疫アッセイを利用して、ミオスタチンとの抗体の交差反応性を測定する、例えば、試験抗体がミオスタチン中和抗体であるかどうかを同定することができる。例えば、ミオスタチンタンパク質、またはそのALK7エピトープを固相支持体に固定化する。試験抗体を固定化抗原とのALK7の結合と競合するアッセイに加える。固定化したミオスタチン抗原とのALK7の結合と競合する試験抗体の能力を比較する。

同様に、競合的結合形成の免疫アッセイを利用して、交差反応性の測定を行う、例えば、ミオスタチン中和抗体の特異性を測定することができる。例えば、ミオスタチンタンパク質、またはそのミオスタチンエピトープを固相支持体に固定化する。GDF11またはミオスタチンと配列相同性を有する他のタンパク質などの、その他のタンパク質由来のエピトープをアッセイに加えて、固定化抗原との潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合させる。固定化したミオスタチン抗原との潜在的なミオスタチン中和抗体の結合と競合する試験ペプチドの能力を比較する。標準的な計算を用いて、その他の抗原に対する潜在的なミオスタチン中和抗体の交差反応性の割合を計算する。ある種の好ましい態様では、本ミオスタチン中和抗体は、GDF11と10%未満の交差反応性を有する。

III. 典型的なミオスタチン阻害剤
A. ALK7デコイ
ある種の態様では、本開示はnodal結合ドメイン、アクチビンABもしくはB結合ドメイン、GDF11結合ドメインまたは、好ましくは、ミオスタチン結合ドメインなどのALK7受容体のリガンド結合ドメインを含んだポリペプチドであるTGF-βを介した事象の阻害剤を提供する。ミオスタチン結合活性はインビボにおいて、とりわけ筋肉量を増加させるうえで望ましい効果を有する可能性が高いALK7の部分および変種を同定する際の特に有用なガイドになるものと予想されるが、その他のALK7リガンドに対する結合活性も望ましいALK7の部分および変種を同定する際に有用とできることも予想される。完全長のヒトALK7タンパク質SEQ ID No.2は、493アミノ酸を有し、アクチビン受容体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、GSドメインおよびセリン/スレオニンキナーゼドメインを含め、TGFβ I型受容体の特徴の全てを示す。ヒトALK7タンパク質の好ましい断片は、例えば、SEQ ID No.2のMet-1からLeu-114の細胞外ドメインおよびミオスタチンに結合しそれを中和する能力を保持するその断片などの、膜貫通ドメインを欠いたものである。例えば、ミオスタチン結合ドメインは、アミノ酸残基

(SEQ ID No.2の残基26〜100)などの、ヒトALK7タンパク質の活性な受容体結合ドメインから得ることができる。他の態様では、阻害剤はsALK7a (SEQ ID No.4)またはsALK7b (SEQ ID No.6)などの、可溶性のALK7スプライス変異体とすることができる。sALK7アイソフォームをコードする転写産物は、sALK7aおよびsALK7bにおいてそれぞれ、第IIIエキソンまたは第IIIと第IVの両エキソンを欠くことで完全長の転写産物とは異なっている。

同様に含まれるのは、ALK7由来の変種配列、例えば、ミオスタチン、またはその他のリガンド、結合活性を保持するミオスタチンまたはその他のリガンド結合ドメインである。変種配列は、阻害剤の選択性(例えば、GDF11またはnodal結合に対する)を変える、ミオスタチンに対するその他の結合特性(K_d、および/またはK_onもしくはK_off速度などの)を変える、あるいは生体内分布またはインビボでのもしくは棚上での半減期を高める手段として望ましい可能性がある。

ある種の他のALK7配列が以下に列挙されており、本阻害剤はそれらのタンパク質から同様に得ることができる。これらの配列はインターネット上で利用できる公共データベースから検索される。その他の種、とりわけ哺乳動物のそのタンパク質のさらなる相同体は、PCR、低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション、標的の種のALK7相同体と交差反応する抗体を用いた発現ラリブラリーのAbによるスクリーニングなどのような、標準的な分子生物学プロトコルによって容易に得ることができる。

例えば、DNAStar社のMegaAlign (前記)などのソフトウェアを用いた配列アライメントは、タンパク質ファミリーの公知メンバーにおいて最も保存された領域を同定することができる。その後、そのような最も保存された領域を網羅する縮重オリゴ、および標的生物由来の鋳型DNAを用いて、PCRを行うことができる。好ましい態様では、そのような保存領域は、キナーゼドメインおよび/またはリガンド結合ドメインを含む。

これらの同一の保存領域を利用して、中等度から低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(定義の項を参照のこと)で核酸ライブラリーをスクリーニングするプローブを作出することができる。

ALK7 (完全長および可溶型)
各種のALK7受容体がクローニングされており、その配列が公共データベースに寄託されている。下記表は、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のnrデータベースのBLAST検索においてヒトALK7配列を問い合わせ配列として用い、公共データベースで見つけられたALK7配列を列挙している。

^＊ヒトクエリー配列に対する同一性が90%未満の相同体は列挙されていない。

ある種の態様では、有効なALK7ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号26〜100の配列に少なくとも90%同一である、および任意でその配列に少なくとも95%、97%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。そのような変種は少なくとも1つのALK7リガンド、特にミオスタチンに対する結合活性を保持することが好ましい。任意で、ALK7ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号26〜100の配列に対する同一性が100%に満たない、がその配列に対する同一性が95%、97%または99%を超えるアミノ酸配列を含んでもよい。そのような変種は少なくとも1つのALK7リガンド、特にミオスタチンに対する結合活性を保持することが好ましい。

B. 抗体薬剤
本ミオスタチン阻害剤は、抗体の結合がALK7タンパク質の結合と競合的(半競合的を含め)でありうるような、ALK7の結合部位と重複するエピトープ(例えば、「ALK7エピトープ」)と免疫反応性である抗体の形で作出されてもよい。

競合的結合形成の免疫アッセイを利用して、ALK7との他の抗体の交差反応性を測定することができる。例えば、ミオスタチンタンパク質、またはALK7に結合するその一部分を固相支持体に固定化する。試験抗体をアッセイに加える。固定化したミオスタチン抗原とのALK7の結合と競合する試験抗体の能力を比較する。

同様に、競合的結合形成の免疫アッセイを利用して、交差反応性の測定を行う、例えば、ミオスタチンに対する抗体の特異性を測定することができる。例えば、ミオスタチンタンパク質を固相支持体に固定化する。nodalおよびGDF-11のような他の関連タンパク質などの、その他のタンパク質由来のエピトープをアッセイに加える。固定化したミオスタチンとの試験抗体の結合と競合する試験ペプチドまたはタンパク質の能力を比較する。その他の抗原、例えば、nodalまたはGDF-11に対する抗体の交差反応性の割合を計算する。ある種の好ましい態様では、本抗体は、nodalまたはGDF-11と10%未満の交差反応性を有する。

例えばミオスタチン中和抗体の作出は、ALK7エピトープに基づくペプチドを用い、標準的な方法によって抗ミオスタチン抗血清または抗ミオスタチンモノクローナル抗体を作製できることに留意されたい。ペプチドの免疫原性形態(例えば、抗体反応を惹起できる抗原断片)を用いて、マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、担体への結合または当技術分野において周知の他の技術が含まれる。例えば、ALK7エピトープを含むミオスタチンタンパク質のペプチジル部分をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫付与の経過は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニターすることができる。免疫原を抗原とした標準的なELISAまたはその他の免疫アッセイを利用して、抗体のレベルを評価することができる。

ミオスタチン抗原を用いた免疫付与の後、抗ミオスタチン抗血清を得ることができおよび、必要に応じて、ポリクローナルミオスタチン中和抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫動物から回収し、標準的な体細胞融合手順によりミエローマ細胞などの不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当技術分野において周知であり、例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72)のように、ハイブリドーマ技術(もとはKohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497によって開発された)、およびヒトモノクローナル抗体を産生させるEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)を含む。ミオスタチンと特異的に反応する抗体の産生があるかどうかハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。例えば、組合せ突然変異誘発およびファージディスプレイによって作出された合成抗体は、免疫付与によって作出された抗体の等価物である。

標識抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。1つの態様では、標識抗体は精製された標識抗体である。「抗体」という用語は、例えば、天然に存在する抗体と天然に存在しない抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにその断片を含む。さらに、「抗体」という用語は、キメラ抗体および完全合成抗体、ならびにその断片を含む。例えば、検出可能なマーカーは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素および酵素補因子からなる群より選択されてもよい。抗体を標識する方法は当技術分野において周知である。

ALK7エピトープに対するイディオタイプを含む抗体断片は、公知の技術により作出することができる。例えば、そのような断片としては、抗体分子のペプシン消化によって作出されるF(ab')₂断片およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することで作出できるFab断片を挙げることができるが、これらに限定されることはない。

当業者であれば、本発明が、抗原を認識する免疫グロブリン断片の使用も含むことを理解すると考えられる。そのような免疫グロブリン断片としては、例えば、Fab'、F(ab')₂、FvもしくはFab断片、またはその他の、抗原を認識する免疫グロブリン断片が挙げられる。そのような免疫グロブリン断片は、例えば、タンパク質分解酵素消化により、例えば、ペプシンもしくはパパイン消化、還元的アルキル化、または組換え技術により調製することができる。免疫グロブリン断片を調製するための材料と方法は、当業者に周知である。

さらに、免疫グロブリンは一本鎖抗体(「SCA」)であってもよい。これらは可変軽鎖(「V[L]」)と可変重鎖(「V[H]」)ドメインがペプチド架橋によりまたはジスルフィド結合により連結された一本鎖Fv断片(「scFv」)で構成されることができる。同様に、免疫グロブリンは抗原結合活性を保有する単一のV[H]ドメイン(dAbs)で構成されてもよい。例えば、Winter and Milstein, (1991) Nature 349:295; およびGlockshaber et al., (1990) Biochemistry 29:1362を参照されたい。

例えば、組合せ突然変異誘発およびファージディスプレイによって作出された合成抗体は、免疫付与によって作出された抗体の等価物である。

本発明の別の局面は、例えば、10^-5 Mまたはそれ以下、およびより好ましくは10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 Mまたはそれ以下のKdで、ミオスタチンのALK7エピトープに結合する抗原結合断片を含むポリペプチドを産生する細胞を提供する。好ましい態様では、ポリペプチドは抗体またはその断片である。

C. 小分子アンタゴニスト
他の態様では、ミオスタチン阻害剤は、ミオスタチンに選択的に結合しALK7受容体の結合と競合する小有機分子である。

ミオスタチンに結合し、ALK7とのその生成的結合を阻害する、例えば、ALK7を介したシグナル伝達を阻止する治療薬のスクリーニング方法が数多く存在する。

さまざまなアッセイ形式は十分に事足りており、本開示に照らして、本明細書に明記されていないものはそれでもなお当業者により理解されると考えられる。ALK7を介したミオスタチン活性の阻害剤として作用するその能力があるかどうか試験される薬剤は、例えば、細菌、酵母、植物またはその他の生物(例えば、天然物)により作出されても、化学的に作出されても(例えば、ペプチド模倣体を含む、小分子)、または組換え的に作出されてもよい。本発明により企図される試験薬剤としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖類、ホルモンおよび核酸分子(アンチセンスまたはRNAi核酸分子などの)が挙げられる。好ましい態様では、試験薬剤は、約2,500ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。

試験薬剤は単一で、別個の実体として提供されてもよく、またはコンビナトリアルケミストリーによって作製されるような、もっと複雑度の高いライブラリーで提供されてもよい。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよびその他の部類の有機化合物を含むことができる。試験系への試験化合物の提示は、とりわけ初期のスクリーニング段階においては、単離された形であっても化合物の混合物としてであってもよい。

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、所与の時間で調査される化合物の数を最大限にするため、ハイスループットアッセイが望ましい。精製したまたは半精製したタンパク質で誘導されうるような、無細胞系で行われるアッセイは、それらを迅速な開発や試験化合物によって媒介される分子標的の変化の比較的容易な検出を可能とするよう作出できるという点で「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞毒性および/または生体利用効率の効果は、通常、インビトロ系では無視され、その代わりにミオスタチンとALK7との間の結合親和性の変化として明らかとされる分子標的に対する薬剤の効果に主にアッセイの焦点が当てられることがある。

単に例証するため、本発明の典型的なスクリーニングアッセイでは、関心対象の化合物を、ALK7を通常結合できる単離し精製したミオスタチンポリペプチドと接触させる。次いで、化合物とミオスタチンポリペプチドの混合物に、ALK7ポリペプチドを含有する組成物を加える。ミオスタチン複合体の検出および定量化は、ミオスタチンとALK7ポリペプチドとの間の複合体形成を阻害する際の化合物の効力を判定する手段になる。化合物の効力は、各種濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することで評価することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較用のベースラインを得ることもできる。対照アッセイでは、単離し精製したALK7を、ミオスタチンポリペプチドを含有する組成物に加え、ミオスタチン複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量化する。一般に、反応物質が混合されうる順番は、変えられてもよく、および同時に混合されてもよいことが理解されよう。さらに、精製タンパク質の代わりに、細胞抽出物および細胞溶解物を利用して、適当な無細胞アッセイ系を与えてもよい。

ミオスタチンとALK7ポリペプチドおよび標的ポリペプチドとの間の複合体形成は、さまざまな技術により検出されてもよい。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、放射能(例えば、³²P、³⁵S、¹⁴Cまたは³H)標識された、蛍光(例えば、FITC)標識された、もしくは酵素標識されたミオスタチンもしくはALK7ポリペプチドなどの検出可能に標識されたタンパク質を用いて、免疫アッセイにより、またはクロマトグラフ検出により定量化することができる。

ある種の態様では、ミオスタチンまたはALK7ポリペプチドのいずれかを固定化して、それらのタンパク質の一方または両方の複合体未形成型からのタンパク質複合体の分離を容易にすること、およびアッセイの自動化に適応させることが望ましいと考えられる。候補薬剤の存在下および非存在下での、ミオスタチンとのALK7ポリペプチドの結合は、反応物質を含有するのに適した任意の容器の中で行うことができる。例としてはマイクロプレート、試験管および微量遠心管が挙げられる。1つの態様では、タンパク質を基材に結合可能にするドメインを付加する融合タンパク質を供与することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/ミオスタチン(GST/ミオスタチン)融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)またはグルタチオンで誘導体化されたマイクロタイタープレート上に吸着させることができ、これを次にALK7ポリペプチド、例えば、³⁵S標識ALK7ポリペプチド、および試験化合物と合わせて、少しばかりストリンジェントな条件が望ましいかもしれないが、この混合物を複合体形成につながる条件の下で、例えば、塩およびpHに関する生理学的条件でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、結合していないALK7ポリペプチドを除去し、基材に固定化された放射能標識を直接的に(例えば、ビーズをシンチラント中に入れる)、またはその後タンパク質複合体を解離させてから上清中で測定する。または、複合体を基材から解離し、SDS-PAGEにより分離し、ビーズ画分に含まれているALK7ポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術によってゲルから定量化することができる。

タンパク質を基材上に固定化するその他の技術も本アッセイ用に利用することができる。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して、ミオスタチンまたはALK7ポリペプチドのいずれかを固定化することができる。例えば、当技術分野において周知の技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン化ミオスタチン分子をビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製することができ、ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルの中に固定化することができる。または、ミオスタチンと反応するがALK7結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、抗体結合によってミオスタチンをウェルの中に捕捉することができる。上記のとおり、ALK7ポリペプチドと試験化合物の調製物をプレートのミオスタチン提示ウェルの中でインキュベートし、ウェル中に捕捉されたタンパク質複合体の量を定量化することができる。そのような複合体を検出する典型的な方法は、GSTで固定化された複合体について前述したものに加えて、ALK7ポリペプチドと反応する抗体、またはミオスタチンタンパク質と反応しALK7ポリペプチドとの結合で競合する抗体を用いた複合体の免疫検出; およびALK7ポリペプチドと結び付いた酵素活性の検出に依る酵素結合アッセイを含む。後者の場合には、酵素をALK7ポリペプチドと化学的に結合してもALK7ポリペプチドとの融合タンパク質として供与してもよい。例えば、ALK7ポリペプチドを西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋しても西洋ワサビペルオキシダーゼと遺伝学的に融合してもよく、複合体中に捕捉されたALK7ポリペプチドの量をその酵素の発色性基質、例えば、3,3'-ジアミノ-ベンジジン(benzadine)テトラハイドロクロライドまたは4-クロロ-1-ナフトールを用いて評価してもよい。同様に、ALK7ポリペプチドとグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含んだ融合タンパク質を供与してもよく、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンを用いてGST活性を検出することにより複合体形成を定量化してもよい(Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130)。

別の態様では、蛍光偏光アッセイを本発明の方法で利用する。例えば、ALK7ポリペプチドをフルオレセインまたはオレゴングリーンなどの小分子フルオロフォアに結合する。タグ付きALK7ポリペプチドのミオスタチンとの結合は、ALK7ポリペプチドの移動度の減少を引き起こし、したがってフルオロフォアからの放射光の偏光を増加させると考えられる。この技術はそれにより、試験薬剤の存在下または非存在下でのミオスタチンとALK7ポリペプチドとの間の相互作用の度合いを、直接的にまたは間接的に、測定することを可能にする。

別の特定の態様では、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)アッセイを本発明の方法で利用する。これらのアッセイでは、短波長側のタグの発光スペクトルが長波長側のタグの励起スペクトルと重複する蛍光タグを付けた2種類の種を利用する。結合が引き起こす2分子の近接近により、短波長のタグが励起されると長波長のタグの非放射性励起が可能になる。

さらに、光導波路(PCT公開WO 96/26432および米国特許第5,677,196号)、表面プラズモン共鳴(SPR)、表面電荷センサおよび表面力センサに基づくものなどのその他の検出方法が本発明の多くの態様と適合する。

さらに、ALK7とのミオスタチンの結合を妨害または増強する薬剤を同定するため、本ポリペプチドを利用して「ツーハイブリッドアッセイ」としても知られる相互作用トラップアッセイをもたらすことができる。例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; およびIwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696)を参照されたい。特定の態様では、本発明は、ミオスタチンとALK7ポリペプチドとの間の相互作用を解離する化合物(例えば、小分子またはペプチド)を同定する逆ツーハイブリッド系の使用を企図する。例えば、Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; および米国特許第5,525,490号; 同第5,955,280号; 同第5,965,368号を参照されたい。

IV. 典型的な治療的用途
本ALK7可溶性受容体および各種のミオスタチン阻害剤をいくつかの治療設定で利用して、ミオスタチンの存在から生じるまたはその存在によって悪化するいくつかの疾患を治療することができる。

ある種の態様では、本阻害剤を筋ジストロフィーに対する治療の一部として利用する。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋および場合によっては心筋や呼吸筋の漸進的な弱体化および劣化により特徴付けられる筋変性疾患の群のことをいう。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化から始まる進行性の筋消耗および筋衰弱により特徴付けられる遺伝性疾患である。筋肉が時間とともに変性するにつれて、個人の筋力は低下する。本ミオスタチンを含む処方計画で治療できる典型的な筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、エメリ・ドレフュシュ型筋ジストロフィー(EDMD)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHまたはFSHD) (ランドゥジー・デジュリンとしても知られる)、筋強直性ジストロフィー症(MMD) (スタイナート病としても知られる)、眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、先天型筋ジストロフィー(CMD)が挙げられる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、1860年代にフランス人神経学者のGuillaume Benjamin Amand Duchenneによって最初に報告された。ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)は、1950年代にこのDMDの変種について最初に報告した、ドイツ人医師Peter Emil Beckerにちなんで名前が付けられた。DMDは男性において最も頻度の高い遺伝性疾患の1つであり、少年3,500人のうち1人に影響を与えている。X染色体の短腕に位置しているジストロフィン遺伝子が破壊されると、DMDが起こる。男性にはX染色体が1コピーしかないので、それらにはジストロフィン遺伝子が1コピーしかない。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は収縮と弛緩のサイクルの間に容易に損傷を受ける。疾患の初期には筋肉が再生により補われるが、その後は筋前駆細胞が持続的な損傷に対応することができず、非機能的な線維脂肪性組織が正常な筋肉に取って代わる。

DMDでは、少年は早ければ3歳で筋衰弱の徴候を示し始める。この疾患は骨格筋または随意筋、腕、脚および胴体のそれらの筋肉を徐々に弱体化させる。10代前半までにまた場合によってはそれよりも早く、少年の心筋や呼吸筋も影響を受けることがある。BMDはDMDのもっと軽症型のものである。その発症は、通常、10代または成人早期であり、その経過はDMDのものよりも遅く、はるかに予測し難い。(DMDおよびBMDは、ほぼ例外なく少年に影響を与えるが、まれに少女に影響を与えることがある。

1980年代まで、どの種類の筋ジストロフィーの原因についてもほとんど知られていなかった。1986年に、ジストロフィン遺伝子の欠損がDMDの原因と同定された。BMDは同一遺伝子中の異なる変異から生じる。BMD患者は若干のジストロフィンを有するが、その量が不十分であるかまたはその質が不良であるかのいずれかである。若干のジストロフィンを有するので、BMD患者の筋肉はDMD患者の筋肉と同じくらい悪くまたは早く変性することから守られる。

最近の研究から、ミオスタチンの機能をインビボで遮断することまたは取り除くことは、DMDおよびBMD患者において少なくともある種の症状を効果的に治療できることが証明されている(Bogdanovich et al., 前記; Wagner et al., 前記)。すなわち、本ALK7可溶性受容体はDMDおよびBMD患者においてミオスタチンの機能をインビボで遮断する代替的手段を構成する。

同様に、本ALK7可溶性受容体は、筋成長を必要とするその他の疾患状態において筋肉量を増加させる効果的な手段を提供する。例えば、Gonzalez-Cadavidら(前記)は、ミオスタチンの発現がヒトでの除脂肪量と逆の相関があることやミオスタチン遺伝子の発現増加がAIDS消耗性症候群の患者での体重減少と関連することを報告している。AIDS患者においてミオスタチンの機能を阻害することで、AIDSの少なくともある種の症状を、完全に取り除くとはいかないまでも軽減し、したがってAIDS患者の生活の質をかなり向上させることができる。

ミオスタチン機能の喪失は栄養摂取の減退なしでの脂肪消失とも関係しているので(Zimmers et al., 前記; McPherron and Lee, 前記)、本ALK7可溶性受容体をさらに肥満およびII型糖尿病の進行を遅らせるまたは抑制するための治療薬として使用することができる。

がん性の食欲不振-悪液質症候群は、がんの最も衰弱性のおよび致死性の側面の1つである。がん性の食欲不振-悪液質症候群における進行性の体重減少は、多くの種類のがんに共通の特徴であり、生活の質の不良や化学療法に対する反応不良にのみならず、体重減少のない同等の腫瘍を患う患者で認められるよりも短い生存期間にも関与している。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗、心理的苦痛、ならびにより低い生活の質に付随して、悪液質はがんと宿主との間の複雑な相互関係から生じる。これはがん患者に最も多い死因の1つであり、死亡時の80%に存在している。これはタンパク質、糖質および脂肪代謝に影響を及ぼす代謝混乱の複雑な例である。腫瘍は直接的なおよび間接的な異常の両方をもたらし、結果的に食欲不振や体重減少を引き起こす。現在、この過程を制御するまたは逆転させる治療は存在していない。

がん性の食欲不振-悪液質症候群は、サイトカイン産生、脂質運搬因子およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変化に影響を与える。食欲不振はよく見られるが、食物摂取の低下のみでは、がん患者で見られる身体組成の変化を説明することはできず、栄養摂取の増加ではこの消耗症候群を逆転させることはできない。発症前の体重の5パーセントを超える無意識的な体重減少が6ヶ月間内に起こる場合には、がん患者に悪液質を疑うべきである。

成体マウスにおけるミオスタチンの全身性の過剰発現が、ヒト悪液質症候群で見られるものに類似の著しい筋肉および脂肪消失を誘発させることが認められているので(Zimmers et al., 前記)、薬学的組成物としての本ALK可溶性受容体を、筋成長が望まれる、悪液質症候群の症状を抑制する、治療する、または軽減するミオスタチンアンタゴニスト/遮断薬として有利に使用することができる。

ある種の態様では、本ミオスタチン阻害剤、具体的にはALK7由来のデコイを利用して、神経変性を伴う疾患の宿主の症状を抑制する、治療するまたは軽減するために有利に使用できる薬学的組成物を形成させることができる。特定の理論により束縛されることを望むわけではないが、本ALK7受容体は、野生型ALK7受容体によって媒介される阻害性フィードバック機構に拮抗し、したがって新たな神経の成長と分化を可能にすることができる。薬学的組成物としての本ALK可溶性受容体を、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病などを含め、神経変性を伴う疾患の症状を抑制する、治療するまたは軽減するために有利に使用することができる。

アルツハイマー病(AD)は慢性の、治療不能な、止めようのない中枢神経系(CNS)疾患であり、これは徐々に起こり、結果的に記憶喪失、異常行動、人格変化および思考力の低下を引き起こす。これらの喪失は、特定タイプの脳細胞の死やその間の連結の損壊に関係している。

ADは逆に幼児期発現と報告されている。ほとんどのAD患者では、症状は60歳以降に現れる。最も初期の症状としては、近時記憶の喪失、誤った判断および性格の変化が挙げられる。疾患の後期には、AD患者は自分の手を洗うような簡単な仕事のやり方を忘れることが多い。最終的にはAD患者は推論能力の全てを喪失し、その日常の介護を他人に依存するようになる。最後に、この病気は患者が寝たきりになり、典型的には合併症を発症するほど衰弱させるようになる。AD患者は発病開始より8年〜20年のうちに、肺炎で死亡することが最も多い。

パーキンソン病(PD)は慢性の、治療不能な、止めようのないCNS疾患であり、これは徐々に起こり、結果的に制御不能な身体の動き、硬直、震えおよび歩行困難を引き起こす。これらの運動器系の問題は、ドーパミン、つまり筋活動を制御するのに役立つ化学物質を産生する脳領域中の脳細胞の死に関係している。

ほとんどのPD患者では、症状は50歳以降に現れる。PDの初期症状は、四肢に影響を与える、特に手または唇の顕著な震えである。その後のPDの特徴的症状は動きの堅さまたは遅さ、引きずり歩行、猫背の姿勢およびバランスの損失である。記憶喪失、認知症、うつ病、情緒的変異、嚥下障害、異常発語、性的機能不全、ならびに膀胱および腸の問題などの広範囲にわたる二次的症状が存在する。これらの症状はフォークを握ることまたは新聞を読むことなどの、日常活動を妨害し始めると考えられる。最後に、PD患者は、それらが寝たきりになるほど極度に足腰が立たなくなる。PD患者は、通常、肺炎で死亡する。

筋萎縮性側索硬化症(ALS; ルーゲーリック病; 運動ニューロン疾患)は慢性の、治療不能な、止めようのないCNS疾患であり、これは運動ニューロン、つまり脳を骨格筋につなぐCNSの成分を攻撃する。ALSでは、運動ニューロンが変質して、最終的には死んでしまい、患者の脳は普通、十分に機能的なおよび機敏なままであるが、動けという命令が決して筋肉に到達しない。

ALSになるほとんどの者は40歳から70歳の間である。弱くなる最初の運動ニューロンは、腕または脚に至るものである。ALSを抱える人々は歩行困難になることがあり、物を落とす、倒れる、その発話が不明瞭になる、抑え切れずに笑うまたは泣くことがある。最終的には手足の筋肉は不使用から萎縮し始める。この筋衰弱は体を衰弱させるようになり、その者は車椅子を必要にするかまたはベッドから出て働けなくなると考えられる。ほとんどのALS患者は、発病開始より3年〜5年のうちに、呼吸不全でまたは肺炎のような人工呼吸器関連の合併症で死亡する。

これらの神経系の疾患の原因は、大部分は不明のままである。それらは異なる疾患と従来定義されているが、基本的な過程が明らかに酷似しており、通例、単なる偶然と予想されるよりもはるかに大きな重複症状を示す。現在の疾患定義では重複の問題を適切に取り扱うことができず、神経変性障害の新しい分類が求められている。

ハンチントン病(HD)は、脳の特定の領域におけるニューロンの遺伝学的にプログラムされた変性から生じる別の神経変性疾患である。この変性は制御不良の動作、知能の喪失および情緒障害を引き起こす。HDは、野生型遺伝子中の優性突然変異を通じて親から子に受け継がれる、家族性疾患である。HDの初期症状のなかには気分変動、うつ病、短気、または運転、新たな物事の学習、事実の記憶もしくは決断の支障がある。疾患が進行するにつれて、知力を要する職務に集中することはますます困難になり、患者は自らの摂食および嚥下が困難になることがある。疾患の進行の速度や発症年齢は人によって異なる。

テイ・サックス病およびサンドホフ病は、リソゾームβ-ヘキソサミニダーゼの欠失によって引き起こされる糖脂質蓄積症である(Gravel et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease中, Scriver et al (編)., McGraw-Hill, New York, 2839〜2879頁, 1995)。どちらの疾病においても、β-ヘキソサミニダーゼに対するG_M2ガングリオシドおよび関連の糖脂質基質が神経系に蓄積し、急性の神経変性を引き起こす。一番の重症型では、症状の発現は乳児期初期に始まる。その後、急激な神経変性の経過が起こり、罹患した乳児は運動機能障害、発作、視力喪失および難聴を示す。通常、2歳〜5歳までに死亡する。アポトーシス機構を通じたニューロンの欠損が実証されている(Huang et al., Hum. Mol. Genet. 6: 1879-1885, 1997)。

アポトーシスが免疫系においてAIDS発病の一因となることは周知である。しかしながら、HIV-1は神経系の疾患も誘発する。Shiら(J Clin. Invest. 98: 1979-1990, 1996)は、インビトロモデルでおよびAIDS患者由来の脳組織でHIV-1感染により誘発される中枢神経系(CNS)のアポトーシスを調査し、初代脳培養物のHIV-1感染がインビトロにおいてニューロンおよびアストロサイトでアポトーシスを誘発させることを見出した。ニューロンおよびアストロサイトのアポトーシスは同様に、5人中5人のHIV-1認知症患者および5人中4人の非認知症患者を含め、11人中10人のAIDS患者由来の脳組織で検出された。

ニューロンの欠損は同様に、ヒトでのクロイツフェルト・ヤコブ病、ウシでのBSE (狂牛病)、ヒツジおよびヤギでのスクレピー病、ならびにネコでの猫海綿状脳症(FSE)などの、プリオン病の顕著な特色である。

本ALK7可溶性受容体は同様に、以下に記述されるものなどの、各種のPNS障害の症状を抑制する、治療するおよび軽減するのに有用である。PNSはCNSに至るまたはCNSから分岐する神経からなる。末梢神経は感覚機能、運動機能および自律機能を含め、体内の多様な機能を担う。個体が末梢神経障害を抱えている場合、PNSの神経が損傷を受けている。神経損傷は疾患、肉体的負傷、中毒または栄養失調などの、いくつかの原因から生じうる。これらの病因は求心性または遠心性神経のいずれかに影響を及ぼす可能性がある。損傷の原因に応じて、神経細胞の軸索、その保護ミエリン鞘、またはその両者が傷つけられるかまたは破壊される可能性がある。

末梢神経障害という用語は、脳の外側の神経および脊髄-末梢神経が損傷を受けている広範な障害を包含する。末梢神経障害は同様に、末梢神経炎と称されることもあり、または多くの神経が関与する場合、多発性神経障害もしくは多発性神経炎という用語が使われることもある。

末梢神経障害は広範囲に及ぶ障害であり、多くの根本的な原因が存在する。これらの原因のなかには糖尿病のような、よく見られるものもあれば、アクリルアミド中毒およびある種の遺伝性障害のような、極めて稀なものもある。末梢神経障害の世界的に見て最も一般的な原因は、ハンセン病である。ハンセン病は、感染者の末梢神経を攻撃するハンセン菌(Mycobacterium leprae)によって引き起こされる。世界保健機関によって集められた統計データによれば、世界的に見て推定115万人がハンセン病を抱えている。

糖尿病が末梢神経障害の最もよく知られた原因である米国では、ハンセン病は極めて稀である。米国および欧州では1700万を超える人々が糖尿病関連の多発性神経障害を抱えると推定されている。多くの神経障害は特発性であり、つまり原因が分かっていない。米国では遺伝性末梢神経障害のうち最も一般的なのは、およそ125,000人に影響を及ぼしているシャルコー・マリー・ツース病である。

よく知られている末梢神経障害の別のものはギラン・バレー症候群であり、これはサイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV)などのウイルス性疾患、またはカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)およびライム病を含む細菌感染症に伴う合併症から生じる。全世界的な発生率は毎年、100,000人当たりおよそ1.7症例である。末梢神経障害のその他周知の原因としては、慢性アルコール依存症、水痘帯状疱疹ウイルス感染症、ボツリヌス中毒症および灰白髄炎が挙げられる。末梢神経障害は一次症状として発現することがあり、またはその障害は別の疾患に起因することもある。例えば、末梢神経障害はアミロイド神経障害、ある種のがんまたは遺伝性神経疾患のような疾患の唯一の症状である。そのような疾患は末梢神経系(PNS)および中枢神経系(CNS)、ならびにその他の体内組織に影響を及ぼす可能性がある。

本ALK7可溶性受容体で治療可能なその他のPNS疾患としては腕神経叢神経障害(頸部および第一胸根部(first thoracic roots)、神経幹、索(cords)ならびに腕神経叢の末梢神経成分の疾患。臨床症状としては局所疼痛、知覚障害; 筋力低下、および上肢の感覚低下が挙げられる。これらの障害は、分娩外傷を含む外傷; 胸郭出口症候群; 新生物、神経炎、放射線治療; およびその他の病状と関連付けられる。Adams et al., Principles of Neurology, 第6版、1351〜2頁を参照のこと); 糖尿病性神経障害(糖尿病と関連付けられる末梢の、自律神経系のおよび頭部の神経障害。これらの病状は通常、神経に血液を供給する微小血管(神経の脈管)に関わる糖尿病性微小血管障害から生じる。糖尿病性神経障害と関連付けられる比較的よく見られる病状としては、第三神経麻痺; 単神経障害; 多発性単神経障害; 糖尿病性筋萎縮症; 有痛性多発性神経障害; 自律神経障害; および胸腹部神経障害が挙げられる。Adams et al., Principles of Neurology, 第6版、1325頁を参照のこと); 単神経障害(孤立した、またはびまん性末梢神経機能障害の証拠と不釣り合いな、単一の末梢神経に関わる疾患または外傷。多発性単神経障害とは、複数の孤立した神経損傷によって特徴付けられる病状のことをいう。単神経障害は虚血; 外傷; 圧迫; 結合組織系障害; 蓄積外傷疾患; およびその他の病状を含めて、多様な原因から生じる可能性がある); 神経痛(末梢または脳神経の方向または分布に沿って起こる激痛またはうずく痛み); 末梢神経系新生物(末梢神経組織から生じる新生物。これには神経線維腫; 神経鞘腫; 顆粒細胞腫; および悪性末梢神経鞘腫瘍が含まれる。DeVita Jr et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 第5版、1750〜1頁を参照のこと); 神経圧迫症候群(内因または外因からの神経または神経根の機械的圧縮。これらは、例えば、ミエリン鞘機能障害、または軸索消失によって、神経インパルスに対する伝導ブロックを引き起こす可能性がある。神経および髄鞘損傷は虚血; 炎症; または直接の機械的影響によって引き起こされることもある); 神経炎(末梢または脳神経の炎症を指し示す一般用語。臨床症状としては、疼痛; 知覚障害; 不全麻痺; または感覚過敏(hyperthesia)を挙げることができる); 多発性神経障害(複数の末梢神経の疾患。さまざまな形態が、影響を受ける神経の種類(例えば、感覚神経、運動神経または自律神経)により、神経損傷の分布(例えば、末梢部対基部)により、主に影響を受けている神経成分(例えば、脱髄性対軸索)により、病因により、または遺伝型式により分類される)が挙げられる。

V. 典型的な製剤
本組成物は単独で、またはその他の化合物/薬学的組成物との同時併用療法の一部として使われてもよい。

本方法で用いる可溶性ALK7受容体治療薬は、水、緩衝生理食塩水、多価アルコール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび同様のもの)またはその適当な混合物などの、生物学的に許容される媒体を用いて投与のため好都合に製剤化されてもよい。選択の培地中での活性成分の最適濃度は、医薬化学者に周知の手順により、実験的に決めることができる。本明細書で用いられる「生物学的に許容される媒体」とは、薬学的調製物の所望とされる投与経路に適しうるありとあらゆる溶媒、分散媒および同様のものを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤がリン酸化ペプチド治療薬の活性に適合しない場合を除き、本発明の薬学的調製物中でのその使用が企図される。適当な媒介物および他のタンパク質を含むその製剤が、例えば、書籍「Remington's Pharmaceutical Sciences」 (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA 1985)に記述されている。これらの媒介物は注射可能な「デポ製剤」を含む。

本発明の薬学的製剤は同様に、例えば、家畜(ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびウマなど)または家庭内の動物、例えば、ネコおよびイヌの治療用の、動物用組成物、例えば、家畜への使用に適したALK7可溶性受容体治療薬の薬学的調製物を含むことができる。

本発明の方法は同様に、再充電可能なまたは生分解可能な装置により提供されてもよい。タンパク性生物薬剤を含む、薬物の送達制御のため、ここ数年、さまざまな徐放性ポリマー装置が開発され、インビボで試験されている。生分解性と非生分解性の両ポリマーを含め、さまざまな生体適合性ポリマー(ヒドロゲルを含む)を利用して、特定の標的部位での治療薬の持続放出に向けたインプラントを形成させることができる。

本発明による薬学的組成物は単回用量としてまたは複数回用量で投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は個々の治療薬としてまたは他の治療薬との併用で投与されてもよい。本発明の治療は従来の治療法と組み合わされてもよく、これらは連続的にまたは同時に施されてもよい。本発明の薬学的組成物は、可溶性ALK7を標的の細胞/組織/臓器に到達可能にする任意の手段により投与されてもよい。いくつかの態様では、投与経路には経口投与、膀胱内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、標的細胞が存在する臓器の血液供給液への局所投与または細胞への直接投与からなる群より選択されるものが含まれる。静脈内投与が好ましい投与方法である。これは注入ポンプを用いて達成されてもよい。

本明細書で用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与方法のことを意味し、静脈内の、筋肉内の、動脈内の、髄内の、嚢内の、眼窩内の、心臓内の、皮内の、腹腔内の、経気管の、皮下の、表皮下の、関節内の、被膜下の、くも膜下の、脊髄内のおよび胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されるわけではない。

本明細書で用いられる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」という語句は、化合物、薬物またはその他の材料が患者の身体に入る、すなわち、代謝およびその他の類似の過程に供されるような、中枢神経系への直接投与以外のその投与、例えば、皮下投与のことを意味する。

これらの化合物は治療のためヒトおよびその他の動物に任意の適当な投与経路により、例えば、経口に、膀胱内に、例えば、噴霧によるなど経鼻的に、経直腸的に、経膣内に、非経口的に、槽内におよび散剤、軟膏またはドロップによるなど局所的に、例えば、口腔におよび舌下に投与されてもよい。

選択の投与経路にかかわらず、適当な水和形態で使用できる本発明の化合物、および/または本発明の薬学的組成物は、以下に記述されるような薬学的に許容される投与剤形にまたは当業者に知られるその他の従来法により製剤化される。

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有害であることなしに、特定の患者、組成物および投与方法に対して所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変えられてもよい。

選択された投与量レベルは、利用される本発明の特定の化合物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排出速度、治療の期間、利用される特定のリン酸化ペプチド治療薬と併用されるその他の薬物、化合物および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、調子、全般的健康状態および前病歴、ならびに医学分野において周知の類似の要因を含め、さまざまな要因に依存すると考えられる。

当技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に判断し処方することができる。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物の中に使われる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルから始めて、所望の効果が達成されるまでその投与量を徐々に増加させていくことができよう。

総じて、本発明の化合物の適当な日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物のその量であると考えられる。そのような有効な用量は一般に、上記の要因に依存すると考えられる。概して、患者に対する本発明の化合物の静脈内の、脳室内のおよび皮下の用量は、1日につき体重1キログラム当たり約0.0001 mgから約100 mgに及ぶと考えられる。

必要に応じて、活性化合物の有効な日用量は、1日を通して適切な間隔で別々に投与される2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上の副用量として、任意で、投与単位剤形として投与されてもよい。

「治療(処置)」という用語は、予防、療法および療養も包含するよう意図される。

この治療を受ける患者は、霊長類、具体的にはヒト、およびその他ヒト以外の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ、ならびに家禽および一般のペットを含めて、その必要性がある任意の動物である。

本発明の化合物は、それ自体としてまたは薬学的に許容される担体との併用で投与されてもよく、同様にペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよびグリコペプチドなどの他の抗菌薬と併せて投与されてもよい。併用療法は、すなわち最初に投与されるものの治療効果が、その後のものが投与される際に完全には消失していないような形での活性化合物の連続の、同時のおよび個別の投与を含む。

ある種の剤形との組合せで、本ALK7受容体を有効な可溶性薬剤とすることができる。リン酸化ペプチドを、可溶性を促進する第2のペプチドと共に融合タンパク質として供与することができる。例えば、本発明のALK7受容体を、可溶性および/または血清中安定性を促進できる免疫グロブリンのヒンジまたはFc部分の全部または断片を有する融合ポリペプチドの一部分として供与することができる。

本発明は同様に、本明細書に記述される本ALK7可溶性受容体のペプチド模倣体の配列を企図する。

概して、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験室手順は、分子の、生化学の、微生物学のおよび組換えDNAの技術を含む。そのような技術は参考文献の中で十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」Sambrook et al., (1989); 「Current Protocols in Molecular Biology」第I〜III巻 Ausubel, R. M (編). (1994); Ausubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning」, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al.,「Recombinant DNA」, Scientific American Books, New York; Birren et al. (編)「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」, 第1〜4巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許第4,666,828号; 同第4,683,202号; 同第4,801,531号; 同第5,192,659号および同第5,272,057号に記載の方法論; 「Cell Biology: A Laboratory Handbook」, 第I〜III巻 Cellis, J. E. (編), (1994); 「Current Protocols in Immunology」第I〜III巻 Coligan J. E. (編), (1994); Stites et al. (編),「Basic and Clinical Immunology」(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (編), 「Selected Methods in Cellular Immunology」, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい; 利用可能な免疫アッセイは特許および科学文献の中で十分に説明されており、例えば、米国特許第3,791,932号; 同第3,839,153号; 同第3,850,752号; 同第3,850,578号; 同第3,853,987号; 同第3,867,517号; 同第3,879,262号; 同第3,901,654号; 同第3,935,074号; 同第3,984,533号; 同第3,996,345号; 同第4,034,074号; 同第4,098,876号; 同第4,879,219号; 同第5,011,771号および同第5,281,521号; 「Oligonucleotide Synthesis」Gait, M. J.(編), (1984); 「Nucleic Acid Hybridization」Hames, B. D. , and Higgins S. J.(編), (1985); 「Transcription and Translation」Hames, B. D., and Higgins S. J.(編), (1984); 「Animal Cell Culture」Freshney, R. I.(編), (1986); 「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press, (1986); 「A Practical Guide to Molecular Cloning」Perbal, B., (1984)および「Methods in Enzymology」第1〜317巻, Academic Press; 「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」, Academic Press, San Diego, Calif. (1990); Marshak et al., 「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」CSHL Press (1996); これらの全てが本明細書に十分に記載されているかのごとく参照により本明細書に組み入れられる。その他一般の参考文献は本書面を通じて付与される。その中の手順は当技術分野において周知であるものと思われ、読者の利便性のために付与される。その中に含まれる全ての情報は参照により本明細書に組み入れられる。

実施例
実施例1: ALK7のGDF8への結合
一連の実験を行って、GDF8がALK7に結合する可能性を詳しく調べた。ALK7-Fcキメラ(5 μg/ml)を4℃で一晩プレート上にコーティングした。これを室温で2時間〜3時間BSAを用いてブロッキングした。0.05% Tween20を加えたPBSを用いてプレートを洗浄した。その後、リガンド(GDF8またはBMP3)を各ウェルに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン・アルカリホスファターゼと複合体形成されたビオチン化二次抗体を用いて結合を検出した。代表的な実験からの試料データを図1に示す。データからALK7がGDF8に結合すること、しかしBMP3には有意に結合しないことが示される。

実施例2: 可溶性ALK7の投与による筋肉量のインビボでの増加
雄性CB-17 SCID系マウス(6週齢; 体重20 kg〜25 kg)に腹腔内(IP)注射によりALK7-Fc (表1中の用量)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)対照のいずれかを投与した。各動物に計5回の注射を施し、全てのマウスに対し試験第0、4、8、15および22日目に行った。個々の動物の体重を1週間に1度とった。中毒および病的状態の徴候がないかマウスを毎日モニターした。マウスは全て試験または対照物品投与の開始から28日後に安楽死させた。マウスを二酸化炭素吸入により安楽死させて、腓腹筋、大腿直筋(大腿四頭筋)および横隔膜筋を解剖し秤量した。Excelを用いてデータを解析した。

（表１）研究処置群

結果を図2〜4に示す。図2は腓腹筋の結果を示す。図3は大腿四頭筋の結果を示す。図4は横隔膜筋の結果を示す。いずれの場合にも、3 mg/kgの投与量は対照に比べて筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらし、腓腹筋および横隔膜筋の場合は、さらに低い1 mg/kgの投与量でも筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらした。

等価物
当業者であれば日常程度の実験により、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識すると考えられ、または確認することができると考えられる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲により包含されるよう意図される。

ALK7はGDF8に結合するが陰性対照BMP3に結合しないことを証明する試料結合アッセイの結果を示す。 28日の期間後のALK7-Fc融合タンパク質の各種投与量で処置したマウスにおける筋肉量の増加を示す。図2は腓腹筋の結果を示す。3 mg/kgの投与量は対照に比べて筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらし、腓腹筋および横隔膜筋の場合は、さらに低い1 mg/kgの投与量でも筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらした。 28日の期間後のALK7-Fc融合タンパク質の各種投与量で処置したマウスにおける筋肉量の増加を示す。図3は大腿四頭筋の結果を示す。3 mg/kgの投与量は対照に比べて筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらし、腓腹筋および横隔膜筋の場合は、さらに低い1 mg/kgの投与量でも筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらした。 28日の期間後のALK7-Fc融合タンパク質の各種投与量で処置したマウスにおける筋肉量の増加を示す。図4は横隔膜筋の結果を示す。3 mg/kgの投与量は対照に比べて筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらし、腓腹筋および横隔膜筋の場合は、さらに低い1 mg/kgの投与量でも筋肉量の統計学的に有意な増加をもたらした。

Claims

ミオスタチンへのALK7受容体の結合を阻害する形でミオスタチンに結合するミオスタチン阻害剤を含む、ミオスタチンを阻害するための薬学的調製物であって、哺乳動物への投与に適するよう発熱物質を実質的に含まない調製物。
ALK7受容体のリガンド結合ドメインを含むポリペプチドを含む、哺乳動物での筋肉組織の成長を促進するための薬学的調製物であって、哺乳動物への投与に適するよう発熱物質を実質的に含まない調製物。
ミオスタチン阻害剤がALK7受容体のミオスタチン結合ドメインを含むポリペプチドである、請求項1記載の調製物。
ALK7受容体ドメインのドメインがSEQ ID No.2由来のアミノ酸配列、またはミオスタチン結合活性を保持するその変種配列を有する、請求項2または3記載の調製物。
ミオスタチン結合ドメインがアミノ酸残基

(SEQ ID No.2の残基26〜100)、またはミオスタチン結合活性を保持するその変種配列を含む、請求項4記載の調製物。
ミオスタチン阻害剤が可溶性ALK7受容体である、請求項1記載の調製物。
可溶性ALK7受容体がSEQ ID No 4または6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項6記載の調製物。
ミオスタチン結合ドメインが1 μMまたはそれ以下のK_dでミオスタチンに結合する、請求項3記載の調製物。
ポリペプチドが、ミオスタチン結合ドメインに加えて、インビボでの安定性、インビボでの半減期、取込み/投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成および/または精製の1つまたは複数を促進する1つまたは複数のポリペプチド部分を含む、融合タンパク質である、請求項3記載の調製物。
融合タンパク質が免疫グロブリンFcドメインを含む、請求項9記載の調製物。
融合タンパク質がエピトープタグ、FLAGタグ、ポリヒスチジン配列、およびGST融合体より選択される精製用配列を含む、請求項9記載の調製物。
ポリペプチドがグリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、脂質部分に結合されたアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合されたアミノ酸より選択される1つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む、請求項3記載の調製物。
ミオスタチン阻害剤が、GDF11の結合に対するそのK_dよりも少なくとも2倍低いミオスタチン結合に対する解離定数(K_d)を有する、請求項3記載の調製物。
ミオスタチン阻害剤が、ミオスタチンに選択的に結合しALK7受容体の結合と競合するポリペプチド親和性試薬である、請求項1記載の調製物。
親和性試薬が抗体薬剤である、請求項14記載の調製物。
抗体薬剤が組換え抗体、モノクローナル抗体、V_Hドメイン、V_Lドメイン、scFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂、Fvまたはジスルフィド結合されたFvである、請求項15記載の調製物。
抗体薬剤が完全ヒト抗体もしくはヒト化キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、請求項16記載の調製物。
親和性試薬が、ミオスタチンに選択的に結合しALK7受容体の結合と競合するペプチドまたは足場ペプチドである、請求項14記載の調製物。
ミオスタチン阻害剤が、ミオスタチンに選択的に結合しALK7受容体の結合と競合する小有機分子である、請求項1記載の調製物。
以下を含む、哺乳動物における使用に適した薬学的調製物: ミオスタチン上のALK7受容体結合部位に結合し、ミオスタチンによるシグナル伝達を阻害するポリペプチドミオスタチン阻害剤のコード配列と、該哺乳動物での筋肉組織の成長の促進に有効な量のポリペプチドミオスタチン阻害剤の発現をインビボで引き起こすための転写制御配列とを含むベクター; および薬学的に許容される担体。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物、およびヒト患者での筋肉組織の成長の促進に用いるためのラベルを含む、包装された医薬。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物、およびヒト以外の哺乳動物での筋肉組織の成長の促進に獣医が用いるためのラベルを含む、包装された医薬。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物を投与する段階を含む、動物の筋肉細胞または脂肪組織細胞においてミオスタチンシグナル伝達を阻害するための方法。
薬学的調製物が被験体の筋肉または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性により、少なくとも一部は、特徴付けられる、病態の重症度を軽減させるのに有効な量で投与される、請求項23記載の方法。
薬学的調製物が消耗疾患の重症度を抑制する、改善するまたは軽減するのに有効な量で投与される、請求項23記載の方法。
消耗疾患が悪液質、食欲不振、DMD症候群、BMD症候群、AIDS消耗性症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
薬学的調製物が代謝性疾患の重症度を抑制する、改善するまたは軽減するのに有効な量で投与される、請求項23記載の方法。
代謝性疾患が肥満およびII型糖尿病からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物を投与する段階を含む、動物において脂肪生成分化を誘導するための方法。
被験体において体脂肪割合を低下させるために使われる、請求項29記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物を投与する段階を含む、動物において筋肉組織の成長を促進する方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、うっ血性心不全を治療または予防するための方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量をその必要性がある患者に投与する段階を含む、加齢に伴う脆弱性を軽減するための方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、被験体において骨密度を増加するまたは骨折修復を加速するための方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、被験体においてタンパク質異化反応を軽減するための方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において筋ジストロフィーの重症度を治療または軽減するための方法。
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(BMD)、エメリ・ドレフュシュ型筋ジストロフィー(EDMD)、肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHまたはFSHD) (ランドゥジー・デジュリンとしても知られる)、筋強直性ジストロフィー症(MMD) (スタイナート病としても知られる)、眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、先天型筋ジストロフィー(CMD)、先天性筋強直症(MC)、先天性パラミオトニア(PC)、中心コア病(CCD)、ネマリン筋障害(NM)、筋細管筋障害(MTMまたはMM)、および周期性四肢麻痺(PP)からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において運動ニューロン疾患の重症度を治療または軽減するための方法。
運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS) (ルーゲーリック病としても知られる)、乳児進行性脊髄性筋萎縮症(SMA、SMA1またはWH) (SMA1型、ウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られる)、中間型脊髄性筋萎縮症(SMAまたはSMA2) (SMA2型としても知られる)、若年型脊髄性筋萎縮症(SMA、SMA3またはKW) (SMA3型、クーゲルベルク・ウエランダー病としても知られる)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA) (ケネディー病およびX-連鎖性SBMAとしても知られる)、および成人脊髄性筋萎縮症(SMA)からなる群より選択される、請求項38記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において炎症性筋疾患の重症度を治療または軽減するための方法。
炎症性筋疾患が皮膚筋炎(PM/DM)、多発性筋炎(PM/DM)、および封入体筋炎(IBM)からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において神経筋接合部疾患の重症度を治療または軽減するための方法。
神経筋接合部疾患が重症筋無力症(MG)、ランバート・イートン症候群(LES)、および先天性筋無力症候群(CMS)からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において内分泌異常による筋障害の重症度を治療または軽減するための方法。
内分泌異常による筋障害が甲状腺機能亢進性筋障害(HYPTM)および甲状腺機能低下性筋障害(HYPOTM)からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において末梢神経疾患の重症度を治療または軽減するための方法。
末梢神経疾患がシャルコー・マリー・ツース病(CMT)、デジュリーヌ・ソッタス病(DS)、およびフリードライヒ運動失調症(FA)からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
請求項1、2または20いずれか一項記載の薬学的調製物の有効量を投与する段階を含む、患者において代謝障害の重症度を治療または軽減するための方法。
代謝障害がホスホリラーゼ欠損症(MPDまたはPYGM)、酸性マルターゼ欠損症(AMD)、ホスホフルクトキナーゼ欠損症(PFKM)、脱分枝酵素欠損症(DBD)、ミトコンドリア筋障害(MITO)、カルニチン欠損症(CD)、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症(CPT)、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症(PGK)、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症(PGAMまたはPGAMM)、乳酸脱水素酵素欠損症(LDHA)、およびミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症(MAD)からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
ALK7の細胞外ドメイン由来のリガンド結合ドメインを含む可溶性ポリペプチドを用いて被験体を治療する段階を含む、被験体の筋肉または脂肪組織の異常な量、発達または代謝活性により、少なくとも一部は、特徴付けられる病態の重症度を軽減するための方法。
骨吸収を阻害する、骨形成を刺激する、骨ミネラル濃度を高めることからなる群より選択される1つまたは複数のその他の化合物の同時投与を含む、請求項23〜49いずれか一項記載の方法。
ビスフォスフォネートの同時投与を含む、請求項23〜49いずれか一項記載の方法。
グルタメートアンタゴニスト、ポリペプチド成長因子、神経栄養因子の産生を増加させる薬物、抗炎症薬、カスパーゼ阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、ビタミンE、コエンザイムQ10およびクレアチンからなる群より選択される1つまたは複数のその他の化合物の同時投与を含む、請求項23〜49いずれか一項記載の方法。