Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP2007524346A - ホスホキナーゼ及びその使用 - Google Patents

ホスホキナーゼ及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2007524346A
JP2007524346A JP2005513056A JP2005513056A JP2007524346A JP 2007524346 A JP2007524346 A JP 2007524346A JP 2005513056 A JP2005513056 A JP 2005513056A JP 2005513056 A JP2005513056 A JP 2005513056A JP 2007524346 A JP2007524346 A JP 2007524346A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
present
amino acid
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2005513056A
Other languages
English (en)
Inventor
サン、シャオクィング
グオ、イングリ
Original Assignee
シャンハイ ゲノミックス インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シャンハイ ゲノミックス インク filed Critical シャンハイ ゲノミックス インク
Publication of JP2007524346A publication Critical patent/JP2007524346A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は新規ホスホキナーゼ-RX50タンパク、RX50タンパクをコードするポリヌクレオチド及び組換技術でこのRX50タンパクを生産する方法を提供する。RX50タンパクはp21及びcyclin D3と相互作用し、且つp53の転写を抑制することができるので、薬物ターゲットとして新薬を選別することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は生物技術及び医学分野に関し、具体的には、抗腫瘍の機能をもつ新規ホスホキナーゼ-RX50タンパク及びRX50タンパクをコードするポリヌクレオチドに関する。また、本発明はこのポリヌクレオチドとタンパク質の製法及び用途、それにこのRX50タンパクを含有する組成物に関する。
「高品質」の薬物のターゲット遺伝子(薬物ターゲットと略称する)は新薬開発の源である。ヒトゲノム計画の完成は人類に疾病治療の有望な将来を見せたけれども、大分子タンパク質薬物を除いて、遺伝子自身は必ずしもターゲットではない。遺伝子から新薬までのチェーンにはまだ欠くことのできない部分がたくさん欠けている。中でも、遺伝子の機能の研究は分子のレベルで人類の健康と疾病の神秘を掲示し、一番重要な病原遺伝子を見つけることができるので、遺伝子はターゲットになれるかどうかを確定するための肝心な一環になっている。
海外の大手製薬会社は、遺伝子配列のデータと生物情報の分析だけで、潜在の薬物のターゲット遺伝子が大量に見つかるが、このような遺伝子は「低品質」の薬物ターゲットにすぎないことに既に気づいた。薬物開発者は数の多い低品質薬物ターゲットに対してどうするかわからなくなって、それを検証して新薬開発のために頼れる「高品質」ターゲットを選別することができる大量な遺伝子の機能の研究が切望されている。そのため、機能的ゲノム学には巨大な応用の価値と商業の将来がある。
現在、ターゲットになれる5000の遺伝子の中でも、ホスホキナーゼは高い保存性を持ち、公認の薬物選別の遺伝子ターゲットで、ホスファターゼ、プロテアーゼ及び各種の受容体は一種類のターゲットと称されている。ホスホキナーゼはATP或はGTPの位置のリン酸エステル基を基質のタンパク質のアミノ酸残基に転移し，タンパク質リン酸化に触媒作用をする。タンパク質のリン酸化と脱リン酸化はタンパク質がその功能／活性を調節する重要な方式である。例えば、MAPKと転写因子のCREB、Junなどは、リン酸化の状態で活性はあるが、非リン酸化の状態で活性はない。転写因子のIκBα等は反対で、リン酸化の状態で活性はないが、非リン酸化の状態で活性はある。
今まで発見されたホスホキナーゼの種類が多いけど、知られているヒトホスホキナーゼの種類が少ない。ホスホキナーゼは細胞分裂などの多種の生理活動と密接に関連するため、この分野では新規ホスホキナーゼの開発が切望されている。
本発明は新規ホスホキナーゼ-RX50タンパク、及びその断片、アナローグ、誘導体を提供することを目的とする。
また、本発明はこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明はこれらのタンパク質を製造する方法及びこれらのタンパク質とコード配列の用途を提供することを目的とする。
本発明の第一は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するタンパク質、或はそのキナーゼ活性を有する保存的な変異タンパク、活性断片又は活性誘導体を含有する分離されたRX50タンパクを提供する。
好ましくは、当該タンパク質は以下の群から選ばれる：
(a)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を1個又は数個(例えば1-10個、好ましくは1-8個)のアミノ酸残基の置換、欠失或は挿入により形成され、且つリン酸化の功能を有する(a)から誘導されたポリペプチド。より好ましくは、当該タンパク質はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有する。
本発明の第二は、上述のRX50タンパクをコードする分離されたポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、上述のポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 2で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。より好ましくは、当該ポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 1のポリヌクレオチド配列の1-1353位を含有する。
本発明の第三は、上述のRX50タンパクをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、及びそのベクターで転化／導入された宿主細胞或は直接に上述のポリヌクレオチドで転化／導入された宿主細胞を提供する。
本発明の第四は、以下の工程を含めるタンパク質の製造方法を提供する：
(a)発現の条件で、上述の宿主細胞を培養する；
(b)培養物からSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含有するタンパク質を分離する。
本発明の第五は、上述のRX50タンパクと特異的に結合することができる抗体を提供する。
本発明の第六は、安全有効量の上述のRX50タンパク及び薬学的に許容される担体を含有する薬物組成物を提供する。
本発明者は鋭意検討をしたところ、451のアミノ酸を含有するRX50タンパクをコードする新規ヒトホスホキナーゼRX50の全長cDNAを初めて分離した。RX50タンパクはホスホキナーゼのドメインを含有し、RX50がホスホキナーゼであることは自己リン酸化実験で確認した。これに基づき、本発明が完成された。
酵母ツーハイブリッド試験(yeast two-hybrid assay)と免疫共沈殿試験の結果から、RX50とp21の間、RX50とCyclinD3の間には確かに直接の相互作用があって、且つコートランスフェクトのp21はRX50とCyclinD3の結合を向上することができることが確認された。また、RX50とp21の異なる截断体を作って、さらにRX50とp21の40aa-60aaの間に相互作用があることが明確された。RX50はp50の転写活性及びTNFの誘導によるNF-kBの転写活性を抑制することもできる。
本発明において、用語の「ホスホキナーゼRX50」、「RX50タンパク」或は「RX50ポリペプチド」は交換して用いられてもいいが、基本的に皆RX50タンパクアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を有するポリペプチド或はタンパク質のことを示す。これらに開始メチオニンを含有するRX50タンパクも、それを含有しないものも含まれる。これらの用語にシグナルペプチドを含有するRX50タンパクも、それを含有しないものも含まれる。
ここで用いられるように、「分離された」は物質がその原始環境から分離されたこと(天然物質ならば、原始環境は天然環境のことである)を示す。例えば、生体細胞内の天然状態でのポリヌクレオチドとタンパク質は分離・純化されていないが、同じポリヌクレオチド或はタンパク質は天然状態で存在する他の物質から分離されれば、分離・純化されることになる。
ここで用いられるように、「分離されたRX50ポリペプチドタンパク」は基本的に天然の関連の他のタンパク質、リポイド、糖質或は他の物質を含まない。この分野の技術者は標準のタンパク質純化技術(特にFPLC)でRX50タンパクを分離・純化することができる。
本発明のタンパク質は組換タンパク、天然タンパク、合成タンパクでもよいが、好ましくは組換タンパクがよい。本発明のタンパク質は、天然純化の産物でもいいし、化学合成の産物でもいいし、或は組換技術により原核又は真核の宿主(例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫と哺乳動物の細胞)から生成する。組換生産方案で用いられる宿主によって、本発明のタンパク質はグリコシル化されたものでもいいし、グリコシル化されていないものでもいい。本発明のタンパク質は、開始メチオニン残基を含有してもいいし、それを含有しなくてもいい。
本発明にはさらにRX50タンパクの断片、誘導体、アナローグも含まれる。ここで用いられるように、用語の「断片」、「誘導体」と「アナローグ」は、基本的に本発明の天然RX50タンパクと同じ生物学機能或は活性を維持するタンパク質を示す。本発明のタンパク質断片、誘導体或はアナローグは以下のものでよい:(i)遺伝コドンでコードされるかどうかを問わず、1個又は数個の保存性或は非保存性のアミノ酸残基(好ましくは保存性のアミノ酸残基)が置換されたタンパク質、或は(ii)単数又は多数のアミノ酸残基に置換基があるタンパク質、或は(iii)成熟タンパクと他の化合物(例えば、タンパク質の半減期を延長する化合物、例えばポリエチレングリコール)とが融合し形成するタンパク質、或は(iv)付加のアミノ酸配列がこのタンパク質配列に融合され形成するタンパク質(例えば、先導配列、分泌配列、このタンパク質を純化するための配列、前酵素配列、或は抗原IgGの断片と形成する融合蛋白)。ここの指導により，これらの断片、誘導体とアナローグはこの分野の熟練技術者に公知の範囲にある。
本発明において、用語の「RX50タンパク」はRX50タンパク活性を持つSEQ ID NO. 2配列のタンパク質を示す。この用語にはRX50タンパクと同じ機能を持ち、SEQ ID NO. 2配列の変異形態も含まれる。これらの変異形態には以下のものが含まれる(しかし、限定されていない)：1個又は数個(通常は1-50個、好ましくは1-30個、より好ましくは1-20個、最も好ましくは1-10個)のアミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換したもの、及びC端及び/又はN端に1個又は数個(通常は20個以内、より好ましくは10個以内、さらに好ましくは5個以内)のアミノ酸残基を添加したもの、例えば、この分野中、性能上近似或いは類似のアミノ酸残基で置換されたとき、通常タンパク質の機能は変わらない。また、例えば、C端及び／又はN端に単数又は多数のアミノ酸残基を添加しても、タンパク質の機能は変わらない。この用語にはRX50タンパクの活性断片と活性誘導体も含まれる。
このタンパク質の変異形態には以下のものが含まれる：相同配列、保存性変異体、対立変異体、自然突然変異体、誘導突然変異体、高い又は低い厳格条件下でRX50DNAとのハイブリダイゼーションが可能なDNAのコードするタンパク質、及び抗RX50タンパクの抗血清により得られたポリぺプチド或いはタンパク質。本発明はさらに、例えばRX50タンパク或いはその断片を含む融合蛋白のような他のタンパク質を提供する。全長に近いタンパクの他、本発明はRX50タンパク配列の可溶性断片も含まれる。通常、その断片はRX50タンパク配列の少なくとも約10個、一般的に少なくとも約30個、好ましくは少なくとも約50個、より好ましくは少なくとも約80個、最も好ましくは少なくとも約100個の連続のアミノ酸残基を有する。
本発明はさらにRX50タンパクのアナローグを提供する。これらのアナローグと天然RX50タンパクの差異はアミノ酸配列上の差異でもいいし、配列に影響を与えない修飾の様態上の差異でもよいし、或いは両方を兼ね備えてもよい。これらのタンパク質は天然または誘導の遺伝的突然変異体を含む。誘導突然変異体は、例えば、放射線照射や変異誘発剤に露出することによるランダム突然変異、又はサイトに対する変異誘発法や他の分子生物学の技術などの各種の技術により得られる。アナローグは天然のL―アミノ酸残基と異なる (例えばD−アミノ酸)残基を有するアナローグ、及び自然で存在しないまたは合成のアミノ酸(例えばβ、γ―アミノ酸)を有するアナローグも含む。本発明のタンパク質は上述で挙げられた代表的な例に限定されないと理解されるものである。
修飾(通常一次構造が変わらない)の様態は例えばアセチル化やカーボキシル化などの生体内または生体外のタンパク質の化学的誘導の様態を含む。修飾はグリセシル化も含み、例えばタンパク質の合成と加工中或いはさらに加工する過程中のグリセシル化修飾によるタンパク質ようなものである。この修飾は、タンパク質をグリセシル化の酵素(例えば、哺乳動物のグリセシル化酵素や脱グリセシル化酵素)に露出することにより完成させることができる。修飾の様態はりん酸化アミノ酸残基(例えばりん酸化チロシン、りん酸化セリン、りん酸化スレオニン)を有する配列も含む。修飾され、そのタンパク加水分解性や溶解性が向上されたタンパク質も含まれる。
本発明において、「RX50保存性変異タンパク」はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と比べて、多くとも10個、より好ましくは多くとも8個、さらに好ましくは多くとも5個、最も好ましくは多くとも3個のアミノ酸は性質上類似或は相似のアミノ酸残基で取り替えられ、形成されるタンパク質のことを示す。望ましくはこれらの保存性変異タンパクは表１に従ってアミノ酸の取替えが行われ、得られるものである。
Figure 2007524346
 本発明のポリヌクレオチドはDNAの様態でもよいし、RNAの様態でもよい。DNAの様態は、cDNA、ゲノムDNA或は人工合成のDNAを含む。DNAは単鎖でもよいし、二重鎖でもよい。DNAはコード鎖でもよいし、非コード鎖でもよい。成熟タンパクをコードするコーディング領域の配列はSEQ ID NO:1で示されるコーディング領域の配列と同様でもよいし、縮重変異体でもよい。ここで用いられるように、「縮重変異体」は本発明において、SEQ ID NO:2を有するタンパク質をコードするが、SEQ ID NO:1で示されるコーディング領域の配列と異なるヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:2の成熟タンパクをコードするポリヌクレオチドは以下のものを含む：成熟タンパクだけをコードするコーディング配列；成熟タンパクのコーディング配列と各種の付加コーディング配列；成熟タンパクのコーディング配列(と何れかの付加コーディング配列)及び非コーディング配列。
用語の「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」にはこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドでもよいし、さらに付加コーディング配列及び／又は非コーディング配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
本発明はさらに上述のポリヌクレオチドの変異体、その本発明と同様なアミノ酸配列をコードするポリペプチド或はタンパク質の断片、アナローグと誘導体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は自然で発生する対立変異体でもよいし、非自然で発生する変異体でもよい。これらのヌクレオチドの変異体は置換変異体、欠失変異体と挿入変異体を含む。この分野で知られているように、対立変異体は一つのポリヌクレオチドの取替えの様態で、それは1個又は数個のヌクレオチドの置換、欠失或は挿入の可能性があるが、実質的にそのコードするタンパク質の機能は変わらない。
本発明はさらに上述の配列のハイブリッドで、且つ二つの配列の間に少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の相同性があるポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は厳格条件下で本発明に係るポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能なポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格条件」は以下のようなものである：(1)低いイオン強度と高い温度でのハイブリダイゼーションと溶出、例えば0.2×SSC、0.1%SDS、60℃；或は(2)ハイブリダイゼーションの時変性剤が加えられること、例えば50%(v/v) ホルムアミド、0.1%牛胎仔血清/0.1% Ficoll、42℃など；或は(3)二つの配列の間の相同性少なくとも90%以上、好ましくは95%以上の場合だけでハイブリダイゼーションが発生すること。そして、ハイブリダイゼーションが可能なポリヌクレオチドのコードするタンパク質はSEQ ID NO:2で示される成熟タンパクと同様な生物学機能と活性を有する。
本発明はさらに上述の配列とハイブリダイゼーションする核酸断片に関する。ここで用いられるように、「核酸断片」の長さは少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、より好ましくは少なくとも50個、最も好ましくは少なくとも100個以上のヌクレオチドを含む。核酸断片は核酸の増幅技術(例えばPCR)に適用し、RX50タンパクをコードするポリヌクレオチドの確定及び/又は分離が可能である。
本発明のタンパク質とポリヌクレオチドは、分離された様態で、特に均質に純化してから提供することが好ましい。
本発明のRX50ヌクレオチドの全長配列或はその断片は、通常、PCR増幅法、組換法或は人工合成の方法により得られる。PCR増幅法として、本発明で公開される関連のヌクレオチド配列、特に開放読み枠配列によってプライマーを設計し、それに市販のcDNAライブラリー、或はこの分野の技術者に知られている通常の方法に従って作成したcDNAライブラリーを鋳型として増幅し、関連の配列が得られる。RT-PCRの方法で直接に増幅し、関連の配列を獲得してもよい。配列は長い場合、通常2回或は数回のPCRを行って、その後それぞれ増幅された断片を正確な順でリンクする必要がある。
一旦関連の配列が得られれば、関連の配列は組換法で大量に得られる。これは、通常、そのクローンをベクターに入れ、さらに細胞に導入し、その後通常方法で増殖した宿主細胞から分離し、関連の配列が得られる。
また、特に配列の全長が短い場合、人工合成の方法により関連の配列を獲得してもよい。通常、多数の小さい断片を合成し、その後連接することにより関連の配列を獲得する。
現在、既に化学合成で本発明のタンパク質(或はその断片、その誘導体)をコードするDNA配列を獲得することができる。そして、そのDNA配列をこの分野で知られている各種の現有のDNA分子(或は例えばベクター)と細胞に導入してもよい。また、化学合成で変異を本発明のタンパク質配列に導入してもよい。
本発明遺伝子を獲得するには、PCR技術によるDNA/RNAの増幅方法 (Saiki, et al. Science 1985;230:1350-1354)は好ましく用いられる。特に、ライブラリーから全長のcDNAを獲得しがたい場合、RACE法(RACE-cDNA末端快速増幅法)が好ましく用いられ、PCRに適用するプライマーはここで公開される本発明の配列情報によって適当に選択し、通常の方法で合成することができる。用いられる通常の方法として、例えばゲル電気泳動により増幅されたDNA/RNA断片を分離・純化する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、及び本発明のベクター或はRX50タンパクコーディング配列で遺伝工学により製造する宿主細胞、及び組換技術で本発明に係るタンパク質を製造する方法にも関する。
通常の組換DNA技術(Science，1984；224：1431)により、本発明のポリヌクレオチド配列で組換のRX50タンパクを発現・生産することができる。一般的に、以下の工程が含まれる：
(1)本発明のRX50タンパクをコードするポリヌクレオチド(或は変異体)、或はそのポリヌクレオチドを含有する組換発現ベクターにて、適当な宿主細胞に転化或は導入する；
(2)適当な培地に宿主細胞を培養する；
(3)培地或は細胞からタンパク質を分離・純化する。
本発明において、RX50タンパクポリヌクレオチド配列は組換発現ベクターに挿入することができる。用語の「組換発現ベクター」は、この分野でよく知られている細菌プラスミッド、バクテリオファージ、酵母プラスミッド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスのような哺乳動物細胞ウイルス、或は他のベクターを示す。本発明において適用するベクターは限定されず、以下のものを含む：細菌中で発現するT7に基づく発現ベクター；哺乳動物細胞中で発現するpMSXND発現ベクターと昆虫細胞中で発現するバキュロウイルス由来のベクター。つまり、宿主内で複製し安定するものであれば、何れのプラスミッドとベクターも用いられる。発現ベクターの重要な特徴の一つは通常複製開始点、プロモーター、標識遺伝子と翻訳調節機構を含有することである。
RX50タンパクをコードするDNA配列と適当な転写／翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構成するには、この分野の技術者によく知られている方法を用いることができる。これらの方法は、体外組換DNA技術、DNA合成技術、体内組換技術などを含む。当該DNA配列は、発現ベクター中の適当なプロモーターに有効的に連接し、mRNA合成を指導することができる。これらのプロモーターの代表的な例として、以下のものがある：大腸菌のlac又はtrp
プロモーター；λファージPLプロモーター；真核プロモーターとして、CMV即刻早期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、早期と晩期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTRs、及び他の知られている遺伝子の原核又は真核細胞、或はそのウイルス中の発現を制御することができるプロモーター。発現ベクターは、翻訳開始用リボソーム結合位置と転写ターミネーターも含む。
また、発現ベクターは好ましく1個又は数個の選択的標識遺伝子を含むことにより、転化した宿主細胞を選択するための表現型性状を提供する。そんな標識遺伝子として、例えば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性及び緑色蛍光蛋白(GFP)、或は大腸菌用のテトラサイクリン又はアンピシリン耐性がある。
上述の適当なDNA配列及び適当なプロモーター或は調節配列を含有するベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞に転化することができる。
宿主細胞として、細菌細胞のような原核細胞、或は酵母細胞のような低等真核細胞、或は哺乳動物細胞のような高等真核細胞でいい。代表的な例として、大腸菌、ストレプトミセス属；ネズミチフス菌ようなの細菌細胞；酵母のような真菌細胞；植物細胞；ドロソフィラS2又はSf9のような昆虫細胞； CHO、COS、293細胞のような動物細胞等がある。
本発明のポリヌクレオチドは高等真核細胞中で発現される場合、ベクター中にエンハンサー配列が挿入されると、転写は強化される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントで、通常約10-300個の塩基対があり、プロモーターに作用し遺伝子の転写を強化する。挙げられる例として、複製開始点の晩期側の100-270個塩基対のSV40エンハンサー、複製開始点の晩期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサー等が含まれる。
この分野の普通の技術者にとって、どうやって適当なベクター、プロモーター、エンハンサーと宿主細胞を選択するかということは明らかである。
組換DNAで宿主細胞に転化するには、この分野技術者よく知られている通常の技術により行われてもいい。宿主は原核生物、例えば大腸菌である場合、DNAを吸収することができる感受態細胞は指数生長期後得られ、CaCl2法で処理するが、使用する工程はこの分野で知られている。もう一つの方法はMgCl2を使用する。必要ならば、転化はエレクトロポレーション法により行われる。宿主は真核生物である場合、以下のDNAトランスフェクションの方法が選べる：原形質体法、リン酸カルシウム共沈殿法、顕微注射のような通常の機械的方法、エレクトロポレーション法、リポソーム包装など。
得られた形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子のコードするタンパク質を発現することができる。使用する宿主細胞によって、培養に使用する培地は各種の通常の培地から選ばれる。宿主細胞の増殖に適する条件下で培養する。宿主細胞は適当な細胞密度に増殖してから、適当な方法(例えば、温度転換或は化学誘導)で選ばれたプロモーターを誘導し、細胞をもう少しの時間で培養する。
以上の方法での組換タンパクは、細胞内、細胞膜上で発現する、或は細胞外に分泌することができる。必要ならば、その物理、化学及び他の特性を利用して、各種の分離方法により組換のタンパク質を分離・純化してもいい。これらの方法はこの分野の技術者がよく知られているものである。これらの方法の例として、限定されず、以下のものが含まれる：通常の復性処理、タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、遠心、菌の浸透破壊、超音波処理、超遠心、モレキュラーシーブスクロマトグラフィ(ゲルろ過)、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高パーフォーマンス液相クロマトグラフィ(HPLC)と他の各種の液相クロマトグラフィ及びこれらの方法の組合せ。
組換のRX50タンパクは多種の用途がある。これらの用途は以下のものを含む(しかし、限定されていない)：RX50タンパク機能を促進或は阻害する抗体、タンパク質或は他のリガンドをスクリーニングするための用途。発現した組換RX50タンパクでタンパク質ライブラリーをスクリーニングすることは、治療価値のある、RX50タンパク機能を抑制或は促進することができるタンパク質分子を探すことには有用である。
一方、本発明はRX50をコードするDNAやその断片のコードするタンパク質に特異性のあるポリクローン抗体やモノクローン抗体、特にモノクローン抗体も含む。ここで、「特異性」は抗体がRX50タンパクや断片に結合することができるということを示す。好ましくは、RX50タンパクや断片のみに結合し、他の関係のない抗原分子を識別・結合しない抗体のことを示す。本発明において、抗体にはRX50タンパクと結合し抑制することができる分子も含まれるし、RX50タンパクの機能に影響を与えない抗体も含まれる。本発明には修飾された様態、或は修飾されていない様態のRX50タンパクと結合することができる抗体も含まれる。
本発明には、完全なモノクローン或いはポリクローン抗体だけではなく、例えばFab´或いは（Fab）2断片のような免疫活性のある抗体断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、遺伝工学により改造された単鎖のFv分子、例えばマウス抗体結合の特異性はあるが人由来の抗体部分が残っている抗体のようなキメラ抗体も含まれる。
本発明の抗体は本分野内で技術者に知られている各種の技術で製造することができる。例えば、純化されたRX50タンパクまたはその抗原性のある断片は動物に使用し、ポリクローン抗体を誘導することができる。同じように、RX50タンパクまたはその抗原性のある断片を発現する細胞で動物に免疫させて抗体を作ることができる。本発明の抗体はモノクローン抗体でもいい。このようなモノクローン抗体はハイブリドマ技術で製造することができる。本発明の各種類の抗体はRX50タンパクの断片または機能域を利用して、通常の免疫技術で得ることができる。これらの断片または機能域は組換技術で、或いはタンパク質合成機で製造することができる。RX50タンパクの修飾されていない様態と結合する抗体は原核細胞（例えばE. coli）で生産された遺伝子産物を用いて動物に免疫させて作ることができる；翻訳後修飾された様態と結合する抗体（例えばグリセシル化、或いはりん酸化のタンパク質やポリぺプチド）は真核細胞（例えば酵母や昆虫細胞）で生産された遺伝子産物で動物に免疫させて作ることができる。
本発明のRX50タンパクを利用して、各種の常規の選別方法で、RX50タンパクと相互作用する例えば、受容体、抑制剤、アゴニスト或いは拮抗剤などの物質を選別することができる。通常、高スループット選別に適する分子と細胞のレベルの選別モデルを建て、高スループット選別などの関連の研究を行う。大腸菌或はバキュロウイルスの発現システムを使用し、チロシンホスファターゼの活性断片クローン・発現し、組換タンパクを分離・純化し、そしてこれらの組換酵素を使用し、高スループット選別に適する分子レベルの選別モデルを建てる。大量な伝統的な生薬由来の粗製抽出物と精製化合物の選別により、有効な活性部位或は精製化合物を探求する。活性により有効な活性部位から単量体を分離する。高スループット選別により、小分子抑制剤が得られ、RX50に対する抑制効果を測定し、小分子抑制剤のRX50に対する特異性を確定する。それに、高スループット選別で得られた小分子抑制剤により、細胞レベルの抑制効果を測定する。
本発明のRX50タンパク及びその抗体、抑制剤、アゴニスト或いは拮抗剤などを治療中で使用(給与)するとき、異なる効果を提供することができる。通常、これらの物質を無毒、不活性の薬学的に許容される水性媒質の中に調製し、ここで、pH値は調製される物質の性質や治療すべき病症によって変化するが、pH値は通常約5―8で、好ましくは6―8である。調製された薬物組成物は通常の様態で給与することができ、以下のものが含まれる(しかし、限定されていない)：筋肉、腹膜内、静脈、皮下、皮内、或いは局部の投薬。
本発明はさらに安全有効量の本発明のRX50タンパクと薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含有する薬物組成物を提供する。これらの組成物はp53の転写活性を抑制することに有用である。このような担体は食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール及びその組み合わせを含む(しかし、限定されていない)。薬物製剤は給与の様態と合わせるべきである。本発明の薬物組成物は注射剤に調製することができる。例えば、生理食塩水やぶとう糖とその他の補助剤を含有する水溶液で通常の方法により調製することができる。錠剤やカプセルのような薬物組成物は通常の方法で調製することができる。薬物組成物、例えば注射剤、溶液、錠剤とカプセルは無菌条件下で製造するほうが良い。活性成分の投与量は治療有効量で、例えば、体重1kg当たり毎日約0.1ng―10mgである。また、本発明のタンパク質は他の治療薬と併用することができる。
薬物組成物を使用するとき、安全有効量のRX50タンパクを哺乳動物に使用する。ここで、この安全有効量は、体重1kg当たり通常少なくとも毎日約1μgで、且つ多数の場合は約10mg未満で、この使用量は体重1kg当たり毎日約1μg―約0.5mgであることが好ましい。もちろん、具体的な使用量は投薬の様態、患者の健康状態なども考慮すべきであるが、それは熟練の医師の指導範囲内のことである。
サンプルにRX50タンパクが存在するかどうかを検出する方法の一つは、RX50タンパクの特異性の抗体を利用して検出することである。それには、サンプルをRX50タンパクの特異性の抗体と接触させること；複合物が形成されるかどうかを観察することが含まれ、複合物が形成されると、サンプルにRX50タンパクが存在することを示す。
本発明の主な利点は：本発明のRX50は新規ホスホキナーゼで、p21及びcyclin D3との相互作用があるため、薬物ターゲットとして、小分子化合物の選別を行い、RX50に対する薬物選別モデルを建て、RX50のキナーゼ活性を調節することができる小分子化合物をみつけることができるので、現在の薬物選別の効率と目的性を向上させ、腫瘍等の多種の疾病の診断、治療に新しい道を開いていく。
以下具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は通常の条件、例えばSambrookら、モレキュラクローニング：研究室マニュアル（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）で述べた条件で、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。
RX50遺伝子の選別：
Genbank中のEST配列から合成され、立てられた何の機能注釈もない或は注釈が不完全の「新規」遺伝子cDNAライブラリーの中で、現代生物情報学のPFAM/Profileモードを使用し、ホスホキナーゼ、ホスファターゼ、プロティナーゼ、1回膜貫通型受容体に対して、優先選別を行い、ホスホキナーゼドメインを含有する新規の何の機能注釈もない遺伝子を予測し、RX50と命名した。
RX50遺伝子の獲得：
RX50遺伝子の全長を獲得するため、以下のようなプライマーを合成し、通常の方法で抽出したヒト組織総RNAを鋳型として、通常のPCR方法で増幅した。
上流プライマー: 5' ggccaatccg gccatgcacg gttactttgg ctgcaatgc 3' (SEQ ID NO:3)
下流プライマー：5' ggcctctaag gcctcagtgc ttgctgtttg atagactttt gcc 3' (SEQ ID NO:4)
このプライマー対はSfiIシャッフリングクローニングサイト、開始コドンと終止コドンを含有し、この酵素切断位置の間はRX50のコーディング配列である。
このプライマー対を利用し、PCR増幅で長さ約1.3kbのバンドが得られ、この断片を回収し、ベクターにクローンし、得られたRX50遺伝子の全長配列を測定したところ、計1356bpであった(SEQ ID NO: 1)。
RX50の配列分析とマッピング
実施例1でクローンした1356bpの配列には、RX50遺伝子の完全のコーディング領域(1-1353位目)が含まれ，451個のアミノ酸からなるRX50タンパク(SEQ ID NO: 2)がコードされる。ここで、SEQ ID NO:2における123-146位目のアミノ酸LGEGSYATVYKGKSKVNGKLVALKはATPの結合位置を構成し，117-401位目のアミノ酸はキナーゼのドメインを構成する(図1)。
RX50のEST情報によって、それをヒト染色体の7q21.13にマッピングした。ヒトRX50と相同性の比較をすると、一つの機能未知のマウスのタンパク質との相同性は91%になること(図2)を見出した。
RX50と相互作用のあるタンパク質の選別
本実施例において、clontech会社のGal4酵母ツーハイブリッドシステムにより選別を行い、RX50と相互作用のあるタンパク質を確定した。方法は以下の通り：シークエンシングで検証されたRX50遺伝子をSfiIクローニングサイトで改造された融合プラスミッドpGBKT 7ベクターにシャッフリングし、これを餌(bait)とし、順に形質転換法(transformation)と接合法(mating)により、Hela、リンパと胎児脳ライブラリーにたいして、大規模の選別が行われた。二つの方法はともにp21及びcyclinD3の陽性クローンが得られ、すなわち酵母ツーハイブリッド法でRX50と相互作用のある既知タンパク質のp21とcyclinD3が選別された。
RX50遺伝子ヌクレオチド配列から推測されたタンパク質配列から、その117-401位目のアミノ酸領域は、Cdc2関連のプロティンキナーゼの保存的ドメインを有する。酵母ツーハイブリッド法でcyclinD3が選別されたが、cyclinは特定なCDKと結合し、細胞周期を調節することがしられている。そのため、これはRX50が新しいp21の調節機制関連のCDKファミリーの一員であることを提示した。
RX50に対する特異なcyclinをさらに確定するため、さらに酵母ツーハイブリッドシステムでRX50はcyclin A, cyclin B, cyclin C, cyclin D1, cyclin D2, cyclin E1, cyclin E2, cyclin F, cyclin G, cyclin H, cyclin I, cyclin Kなどを含む他のcyclinと相互作用があるかどうかを検証した。結果から、RX50はcyclinD3だけと相互作用がある、即ちcyclinD3はRX50の特異性のサイクリンであることが明らかになった。
RX50の発現と免疫共沈殿法によるRX50とp21やcyclin D3との哺乳動物の細胞での相互関係の検証
酵母ツーハイブリッドシステム自身は偽陽性を生じる可能性があるため、免疫共沈殿技術を利用し、さらに哺乳動物の細胞でRX50とp21やcyclin D3との関係を検証した。方法は以下の通り：通常の方法でpcDNA3.1(Invitrogen会社)のマルチクローニングサイトにSfiIサイトを添加し、flag-tag、myc-tagとHA-tagをそれぞれSfiIサイトのN末端に導入し、上述のtagを持つpcDNA3.1ベクターがそれぞれ得られた。PCR増幅したRX50(実施例2)、p21とcyclin D3遺伝子をSfiIサイトにより建てられたflag-tag、myc-tagとHA-tagを持つpcDNA3.1真核発現ベクターにそれぞれクローンした。それぞれanti-flag、anti-mycとanti-HAのモノクローン抗体(Sigma会社から)を利用し、Western-blot法でRX50、p21とcyclin D3タンパクの発現状況を検出した。
結果は図３と図４に示す。図面から、Flag-RX50、myc- p21とHA-cyclin D3 タンパクの発現状況は良く、発現量が安定している。
まず、293T細胞にRX50をトランスフェクトし、24時間の培養後、細胞溶解液を加え、溶解させ、遠心分離で上澄を収集した。anti-p21抗体で免疫沈澱させた後、共沈殿物はSDS-PAGE電気泳動を経って、ニトロセルロース膜の上に電転移し、酵素標識のanti-flag抗体でタンパク質免疫ブロットハイブリダイゼイションを行い、約50kDaのところに特異的ハイブリッドバンドが見られ、このバンドはRX50発現タンパクと一致し、この沈殿バンドは発現されたRX50であることが表明された(図3に参照する)。これより、RX50と内在性のp21の間に相互作用が存在することが明らかになった。
RX50、p21とcyclin D3の関係を明らかにするため、RX50とcyclin D3を同時に293T細胞にトランスフェクトした。24時間の培養後、溶解させ、遠心分離で上澄を収集した。anti-flag抗体とGタンパク質で免疫沈澱させた後、共沈殿物はSDS-PAGE電気泳動を経って、ニトロセルロース膜の上に電転移し、酵素標識のanti-HA抗体でタンパク質免疫ブロットハイブリダイゼイションを行った。RX50とcyclin D3の間の相互結合が弱いことが見られた(図4、レーン2)。RX50、cyclin D3とp21をコートランスフェクトしたとき、p21が過度発現する場合、RX50とcyclin D3との相互結合は大幅に強くなることが見られた(レーン4)。この結果から、RX50、cyclin D3とp21の間に相互作用が存在し、トリマーが形成されることが提示された。そして、RX50とp21の間に相互作用が存在することがもう一度証明された(レーン 3)。
p21の截断体の獲得
p21の異なる截断体を獲得するため、起点がp21の20位目aa、40位目aa、60位目aa、91位目aaと89位目aaにそれぞれ対応するプライマーと対応するカルボキシ末端のプライマーにて、PCR増幅で増幅の産物が得られた。すべての増幅断片をそれぞれmyc-tagを持つpcDNA3真核発現ベクターに導入し、截断体p21-D2、 p21-D3、 p21-Cとp21-Nが得られた(図8に参照する)。
免疫共沈殿法によるRX50とp21との哺乳動物の細胞での相互作用領域の確定
RX50とp21との相互作用領域を確定するため、RX50とp21、RX50とp21-D1、RX50とp21-D2、RX50とp21-D3、RX50とp21-C、RX50とp21-Nをそれぞれともに293T細胞にトランスフェクトした。24時間の培養後、溶解させ、遠心分離で上澄を収集した。anti-myc抗体とGタンパク質で免疫沈澱させた後、共沈殿物はSDS-PAGE電気泳動を経って、ニトロセルロース膜の上に電転移し、酵素標識のanti-flag抗体でタンパク質免疫ブロットハイブリダイゼイションを行った。その結果、RX50とp21、p21-D1、p21-D2、p21-Nとの間に相互作用が存在する(図9、レーン1、2、3、6)が、RX50とp21-D3、p21-Cとの間に相互作用が存在しない(図9、泳道4、5)ことを示す。これより、p21とRX50との相互作用が発生する領域はp21の40aa-60aaの位置にあることが推測される。
また、類似の方法でRX50の截断体を構成したところ、免疫共沈殿法の結果から、RXの115-230位目がp21との相互作用領域であることが明らかになった。
RX50のリン酸化作用
本実施例において、体外自己リン酸化実験でRX50が確かにキナーゼのリン酸化機能を持つことが証明された。
まず、通常のサイトに対する変異誘発法でRX50についてSEQ ID NO:1における436、437位目のA、AをそれぞれG、Cに取り替えられ、ATP結合位置における146位目K→Aの変異型RX50(RX50mut)を獲得し、RX50及びその変異型をすべてFlag-tagを持つpcDNA3真核発現ベクターに構築し、293T細胞にトランスフェクトした。24時間の培養後、細胞を溶解させ、上澄を収集した。anti-flag抗体を持つGタンパク質で免疫沈澱させた後、半分はウェスターンブロット法でRX50の発現を検定し；他の半分はキナーゼ反応緩衝液(20 mM Tris/HCL pH=7.4, 150 mM NaCl,10 mM MnCl2, 50mM ATP,10 mM MgCl2)で平衡させ、その後10mCiγ-32P ATPを加え、30℃で30分間反応させた。等体積の2×SDS-PAGEローディング緩衝液を加え、95℃で5分間変性させた後、遠心分離し、サンプルを15% SDS-PAGE勾配ゲル電気泳動に加えた。電気泳動がおわったら、ゲルが乾燥してから、ラジオオートグラフィーでX射線写真が得られた。
その結果、RX50がキナーゼの活性を持ち、自己リン酸化が可能であることを示す。ATP結合位置が突然変異したとき、キナーゼの活性も消えた(図5)。
RX50の過度発現の関連のレポーター遺伝子に対する影響の研究
RX50及びその変異型を通常用いられる293T細胞、Jurkat細胞、Saos細胞とU2OS細胞を含む異なる哺乳動物細胞にトランスフェクトした。同時に、以下の幾つかの癌と炎症と関連するレポーター遺伝子をともにトランスフェクトした。
A. p53-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
B.NFAT-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
C. NF-kB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
D. AP1-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
トランスフェクションの24時間後、ルシフェラーゼの活性を測定した。ルシフェラーゼ法はとても感度の高い方法であるため、実験偏差が発生しやすいので、毎群の実験データは独立に三回以上繰り返して求められた平均値である。
結果から、RX50はSaos細胞中でp53の転写活性を50%以上抑制したが、この活性はRX50のATP結合位置の変異型(K146A)には見られなかったことが明らかになった(図6)。同様に、RX50の293T細胞における結果から、TNFの誘導によるNF-kBの転写活性を60%以上抑制したが、そのATP結合位置の変異型(K146A)には抑制作用はなかったことが示された(図7)。
これは、RX50は癌と炎症の発生・調節の機構と関連する可能性があることを提示する。
ウサギ抗RX50タンパク抗体の準備
体重2キロ程の雄性ニュージーランドウサギを一羽使用した。1mgの RX50タンパクサンプル(実施例5)にフロインド完全アジュバントを加え、エマルジョンに研磨し、ウサギの頸部に多所注射した。半月の飼育後、1mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、エマルジョンに研磨し、さらにウサギの頸部に多所注射した。一ヶ月後、1.5mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、同じ方法で免疫を強化した。半月後、さらに1mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、もう一度免疫を強化した。半月の飼育後、頚動脈から血を取り、4 ℃で一夜置き、2,000回で3分間遠心分離した。上層の血清はウサギ抗RX50タンパク抗体である。
ハイブリダイゼイションの結果から、抗RX50タンパク抗体はRX50タンパクと特異的に結合することができることが示された。
（検討）
Ｐ21は細胞増殖の肝要な負の調節因子で、単コピー遺伝子で、6番染色体の短腕(6P21.2)に存在し、DNAの長さは85kbで、三つの長さはそれぞれ68、450、1600bpであるエキソンを持ち、且つプロモーター領域にはP53遺伝子結合の特有配列が含まれるため、P21はP53と密接に関連する。
P53遺伝子はヒト悪性腫瘍には一番良く見られる遺伝子の変異で、17番染色体の短腕の1区4バンドに存在し、配置は二つある。野生型P53は抗癌遺伝子で、正常な場合は、変異誘発因子がDNA破壊を起こし、野生型p53がすぐ誘導され、p21の転写を活性化することにより、細胞周期をG1期に遮断し、そして増殖細胞核抗原(PCNA)と結合することにより、DNA複製を抑制し、複製の前に破壊されたDNAに修復の時間を与える；変異型p53は、DNAの破壊の後細胞周期を止める能力を失い、また、悪性転化を促進する活性がある。野生型p53欠失の腫瘍細胞はアポトーシスが不能で、腫瘍細胞の生存を維持し、化学治療と放射線治療に対する耐性も増加する。p53遺伝子の突然変異率は50%以上と高く、例えば白血病、リンパ腫瘍、肉腫、脳腫、乳癌、胃腸管癌及び肺癌などの多数のヒト癌において、通常不活性化の状態である。
P21遺伝子はP53の下流の仲介者として、P53遺伝子の部分の機能を執行し、 P21(Waf/Cip/Sid)タンパクは直接にCDK或はcyclin-CDK複合物と結合し、多種のCDK(CDK2、4、6)の活性を抑制し、細胞周期を中止させ、損傷したDNA或はDNAの複製中に起こった過ちが修復されるように、細胞に機会を与える。多種の腫瘍組織のサンプルにおいて、p21(Waf/Cip/Sid)はタンパク質の発現の降下と欠失が発生することが多い。また、P21遺伝子の多型のため，p21(Waf/Cip/Sid)にも非P53依存性経路が存在し、独立に幹細胞の分化などの生体細胞内の各種の作用に参加し、そして、例えばE2F、C/EBP-a、プロティンキナーゼPim、カルモデュリン、GADD45などの多くの細胞転写因子との相互作用が存在する。
p21とp53の密接な関係によって、さらにレポーター遺伝子システムを利用し、RX50のp53遺伝子機能に対する影響を研究した。結果から、野生型RX50遺伝子は顕著にSoas細胞中のp53遺伝子の活性を降下することができることが示された。p53遺伝子の部分の機能はp21の転写を活性化することにより実現するため、RX50とp21の結合がp53の部分の活性を抑制するかもしれない。これは、RX50はp21、p53の二つの細胞周期における肝要な負の調節因子の調節に参加するため，腫瘍などの多種の疾病の発生、発展、診療には重要な価値があるかもしれないことを提示する。
本発明はさらにRX50とCyclinD3との直接作用、及びp21の存在が顕著にRX50とCyclinD3の結合を強化することができることを証明した。サイクリン(Cyclin)は細胞周期における重要なタンパク質で、細胞周期の主な任務はそのゲノムDNAをDNAの合成期(S期)に完全に二つのコピーに複製し、その後分裂期(M期)にこの二つのコピーを正確に二つの子細胞に分配することで、G1、S、G2とM期に分けている。Cyclinは細胞周期の正常運行の調節を担当し、その調節作用はさらに細胞周期依存性キナーゼ(Cyclin dependent kinase，CDKs)、及びp21、p16などの対抗蛋白の共同作用を受け、CDKsを細胞周期のアクセレレータに例えれば、p21、p16などは細胞周期のブレーキになっている。CyclinはCDKsと複合物を形成し、CDKsのキナーゼ活性を活性化し、特定なタンパク質をリン酸化し、そしてさらにその下流のタンパク質に影響を与え、細胞周期のG1-S、G2-Mの転換の調節に参加する。しかし、DNAが損傷した場合、或はDNAの複製が間違った場合、細胞周期はp21、p16などにすぐ中断され、細胞周期はG1期に遮断され、細胞が修復されたら、細胞周期の運転がまた回復される。G1-SとG2-Mのこの二つの肝心な「関所」を失うと、もともと増殖が止まった細胞或はアポトーシスの細胞を細胞周期に入らせ、よって組織細胞の悪性増殖を起こし、多種の疾病を発病させる可能性があるが、中でも、一番厳重なのは腫瘍の発生しかない。
RX50遺伝子ヌクレオチド配列から推測されたタンパク質配列からみると、その117-401位目のアミノ酸領域にはCdc2関連プロテインキナーゼの保存的ドメインがあるが；本発明者はRX50とCyclinD3との直接作用、とp21の存在が顕著にRX50とCyclinD3の結合を強化することができることを証明した。これは人心を奮い立たせる結果である。世界で公認される研究成果によると、Cyclinは特定なCDKだけと結合し、複合物を形成してCDKのキナーゼ活性を活性化することだけで、細胞周期を調節する。Cyclinは皆特定なCDKしか結合しない。そのため、これはRX50がまだ発見されていない、p21調節機構に関するCDKファミリーの一員である可能性が高いことを提示する。CDKは細胞周期機構を調節する核心かもしれないため、新規キナーゼRX50は細胞周期増殖、アポトーシス、乃至腫瘍の発生に密接に関連する可能性がある。研究し、その作用機構を明らかにさせたら、薬物ターゲットとして、小分子化合物の選別を行い、RX50に対する薬物選別モデルを建て、RX50のキナーゼ活性を調節することができる小分子化合物をみつけることができるので、現在の薬物選別の効率と目的性を向上させ、腫瘍等の多種の疾病の診断、治療に新しい道を開いていく。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるのである。
以下の図面は本発明の具体的な実施の形態を説明するためのもので、請求の範囲で限定される本発明の範囲の限定にはならない。
RX50の配列分析の結果を示す。 RX50とマウスのタンパク質との相同性の比較を示す。 RX50と内在性のp21の間に相互作用が存在することを示す。ここで、レーンaはコントロールで、レーンbはRX50である。 RX50とcyclin D3との作用を示す。
293T細胞に1)flag-RX50;2)flag-RX50とHA-cyclinD3;3)flag-RX50とmyc-p21;4)flag-RX50、myc-p21とHA-cyclinD3をトランスフェクトする。RX50とcyclin D3との相互結合は弱い(*)が、p21が過度発現する場合、RX50とcyclin D3との相互結合は強くなる(**)。
野生型と変異型のRX50のリン酸化活性を示す。 RX50のp53の転写に対する抑制作用を示す。 RX50のTNFの誘導によるNF-kBの転写活性に対する抑制作用を示す。 構成されたp21の異なる截断体の正確な位置を示す。 RX50とp21の異なる截断体の相互作用の位置を示す。

Claims (10)

  1. SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するタンパク質、或はそのキナーゼ活性を有する保存的な変異タンパク、活性断片又は活性誘導体を含有することを特徴とする分離されたタンパク質。
  2. 当該タンパク質は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質：
    (a)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
    (b)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を1-10個のアミノ酸残基の置換、欠失或は挿入により形成され、且つリン酸化の功能を有する(a)から誘導されたポリペプチド。
  3. 請求項１に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする分離されたポリヌクレオチド。
  4. SEQ ID NO: 2で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. SEQ ID NO: 1の配列の1-1353位を含有することを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを含有することを特徴とする遺伝工学化の宿主細胞。
  8. 以下の工程を含めることを特徴とするタンパク質の製造方法：
    (a)発現の条件で、上述の宿主細胞を培養する；
    (b)培養物からSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含有するタンパク質を分離する。
  9. 請求項１に記載のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。
  10. 安全有効量の請求項１に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする薬物組成物。
JP2005513056A 2003-12-31 2003-12-31 ホスホキナーゼ及びその使用 Withdrawn JP2007524346A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2003/001164 WO2005066334A1 (fr) 2003-12-31 2003-12-31 Phosphokinase et son utilisation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007524346A true JP2007524346A (ja) 2007-08-30

Family

ID=34744496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005513056A Withdrawn JP2007524346A (ja) 2003-12-31 2003-12-31 ホスホキナーゼ及びその使用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20070020269A1 (ja)
JP (1) JP2007524346A (ja)
AU (1) AU2003296238A1 (ja)
WO (1) WO2005066334A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6900045B2 (en) * 2000-08-31 2005-05-31 Lexicon Genetics Incorporated Human kinase proteins and polynucleotides encoding the same
US6489153B1 (en) * 2001-10-31 2002-12-03 Pe Corporation (Ny) Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof
US20050216961A1 (en) * 2002-03-28 2005-09-29 Delaney Allen D Cancer associated protein kinases and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
US20070020269A1 (en) 2007-01-25
WO2005066334A1 (fr) 2005-07-21
AU2003296238A1 (en) 2005-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3193301B2 (ja) 生理活性タンパク質ｐ１６０
CA2119443C (en) Human cyclin e
CN1886500A (zh) 磷酸激酶及其应用
JP2003501038A (ja) 蛋白質キナーゼ
US6218136B1 (en) Methods of the identification of pharmaceutically active compounds
WO2001019999A1 (fr) Gene codant une nouvelle threonyl-arnt synthase, ses utilisations et procedes de preparation
CN108291248B (zh) 对atp结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体
AU2001263952B2 (en) Tumour suppressor and uses thereof
CA2506246A1 (en) Products and processes for modulating peptide-peptide binding domain interactions
JPH1093A (ja) アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする遺伝子
US6482605B1 (en) Protein tyrosine phosphatase PTP20 and related products and methods
JP2002511735A (ja) アダプター蛋白質ｆｒｓ２および関連する物質および方法
JP2007524346A (ja) ホスホキナーゼ及びその使用
JP2002516338A (ja) タンパク質チロシンホスファターゼｐｅｓｔのシグナルタンパク質への結合に干渉する、細胞移動及び／又はフォーカルアドヒージョンの阻害剤としての薬剤
JP2003527824A (ja) ポリペプチドおよび核酸をシグナリングする新規細胞
JP4419077B2 (ja) Ｃａｐ結合蛋白質
JP2002525035A (ja) 新規なリボゾームｓ６プロテインキナーゼの同定および機能的なキャラクタライゼーション
US20080026992A1 (en) Tyrosine Phosphorylation of Cdk Inhibitor Proteins of the Cip/Kip Family
WO2001060855A1 (fr) Nouvelle proteine humaine associee a la regulation du cycle cellulaire et sa sequence de codage
JP2001503633A (ja) 細胞成長調節タンパク質をコードする核酸配列及びその使用
JP4438951B2 (ja) Ａｋｔ２に結合する蛋白質
CN100543133C (zh) 磷酸激酶及其应用
CN100543134C (zh) 磷酸激酶及其应用
KR100460228B1 (ko) Ｔ세포 활성화를 매개하는 류신-지퍼 단백질, ＬＡＺｉｐ및 그의 유전자
WO2001032699A1 (fr) Nouveau polypeptide, nouvelle udp glucose-glycoproteine glucosyltransferase (« biohugtr »), et polynucleotide codant pour ce polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20070604

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070619

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20070619

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070604

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20071227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080219