JP2007524346A - ホスホキナーゼ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
今まで発見されたホスホキナーゼの種類が多いけど、知られているヒトホスホキナーゼの種類が少ない。ホスホキナーゼは細胞分裂などの多種の生理活動と密接に関連するため、この分野では新規ホスホキナーゼの開発が切望されている。
また、本発明はこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
(a)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を1個又は数個(例えば1-10個、好ましくは1-8個)のアミノ酸残基の置換、欠失或は挿入により形成され、且つリン酸化の功能を有する(a)から誘導されたポリペプチド。より好ましくは、当該タンパク質はSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、上述のポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 2で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。より好ましくは、当該ポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 1のポリヌクレオチド配列の1-1353位を含有する。
(a)発現の条件で、上述の宿主細胞を培養する;
(b)培養物からSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含有するタンパク質を分離する。
本発明の第六は、安全有効量の上述のRX50タンパク及び薬学的に許容される担体を含有する薬物組成物を提供する。
本発明のRX50ヌクレオチドの全長配列或はその断片は、通常、PCR増幅法、組換法或は人工合成の方法により得られる。PCR増幅法として、本発明で公開される関連のヌクレオチド配列、特に開放読み枠配列によってプライマーを設計し、それに市販のcDNAライブラリー、或はこの分野の技術者に知られている通常の方法に従って作成したcDNAライブラリーを鋳型として増幅し、関連の配列が得られる。RT-PCRの方法で直接に増幅し、関連の配列を獲得してもよい。配列は長い場合、通常2回或は数回のPCRを行って、その後それぞれ増幅された断片を正確な順でリンクする必要がある。
現在、既に化学合成で本発明のタンパク質(或はその断片、その誘導体)をコードするDNA配列を獲得することができる。そして、そのDNA配列をこの分野で知られている各種の現有のDNA分子(或は例えばベクター)と細胞に導入してもよい。また、化学合成で変異を本発明のタンパク質配列に導入してもよい。
(1)本発明のRX50タンパクをコードするポリヌクレオチド(或は変異体)、或はそのポリヌクレオチドを含有する組換発現ベクターにて、適当な宿主細胞に転化或は導入する;
(2)適当な培地に宿主細胞を培養する;
(3)培地或は細胞からタンパク質を分離・純化する。
プロモーター;λファージPLプロモーター;真核プロモーターとして、CMV即刻早期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、早期と晩期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTRs、及び他の知られている遺伝子の原核又は真核細胞、或はそのウイルス中の発現を制御することができるプロモーター。発現ベクターは、翻訳開始用リボソーム結合位置と転写ターミネーターも含む。
宿主細胞として、細菌細胞のような原核細胞、或は酵母細胞のような低等真核細胞、或は哺乳動物細胞のような高等真核細胞でいい。代表的な例として、大腸菌、ストレプトミセス属;ネズミチフス菌ようなの細菌細胞;酵母のような真菌細胞;植物細胞;ドロソフィラS2又はSf9のような昆虫細胞; CHO、COS、293細胞のような動物細胞等がある。
組換DNAで宿主細胞に転化するには、この分野技術者よく知られている通常の技術により行われてもいい。宿主は原核生物、例えば大腸菌である場合、DNAを吸収することができる感受態細胞は指数生長期後得られ、CaCl2法で処理するが、使用する工程はこの分野で知られている。もう一つの方法はMgCl2を使用する。必要ならば、転化はエレクトロポレーション法により行われる。宿主は真核生物である場合、以下のDNAトランスフェクションの方法が選べる:原形質体法、リン酸カルシウム共沈殿法、顕微注射のような通常の機械的方法、エレクトロポレーション法、リポソーム包装など。
Genbank中のEST配列から合成され、立てられた何の機能注釈もない或は注釈が不完全の「新規」遺伝子cDNAライブラリーの中で、現代生物情報学のPFAM/Profileモードを使用し、ホスホキナーゼ、ホスファターゼ、プロティナーゼ、1回膜貫通型受容体に対して、優先選別を行い、ホスホキナーゼドメインを含有する新規の何の機能注釈もない遺伝子を予測し、RX50と命名した。
RX50遺伝子の全長を獲得するため、以下のようなプライマーを合成し、通常の方法で抽出したヒト組織総RNAを鋳型として、通常のPCR方法で増幅した。
下流プライマー:5' ggcctctaag gcctcagtgc ttgctgtttg atagactttt gcc 3' (SEQ ID NO:4)
このプライマー対はSfiIシャッフリングクローニングサイト、開始コドンと終止コドンを含有し、この酵素切断位置の間はRX50のコーディング配列である。
実施例1でクローンした1356bpの配列には、RX50遺伝子の完全のコーディング領域(1-1353位目)が含まれ,451個のアミノ酸からなるRX50タンパク(SEQ ID NO: 2)がコードされる。ここで、SEQ ID NO:2における123-146位目のアミノ酸LGEGSYATVYKGKSKVNGKLVALKはATPの結合位置を構成し,117-401位目のアミノ酸はキナーゼのドメインを構成する(図1)。
本実施例において、clontech会社のGal4酵母ツーハイブリッドシステムにより選別を行い、RX50と相互作用のあるタンパク質を確定した。方法は以下の通り:シークエンシングで検証されたRX50遺伝子をSfiIクローニングサイトで改造された融合プラスミッドpGBKT 7ベクターにシャッフリングし、これを餌(bait)とし、順に形質転換法(transformation)と接合法(mating)により、Hela、リンパと胎児脳ライブラリーにたいして、大規模の選別が行われた。二つの方法はともにp21及びcyclinD3の陽性クローンが得られ、すなわち酵母ツーハイブリッド法でRX50と相互作用のある既知タンパク質のp21とcyclinD3が選別された。
酵母ツーハイブリッドシステム自身は偽陽性を生じる可能性があるため、免疫共沈殿技術を利用し、さらに哺乳動物の細胞でRX50とp21やcyclin D3との関係を検証した。方法は以下の通り:通常の方法でpcDNA3.1(Invitrogen会社)のマルチクローニングサイトにSfiIサイトを添加し、flag-tag、myc-tagとHA-tagをそれぞれSfiIサイトのN末端に導入し、上述のtagを持つpcDNA3.1ベクターがそれぞれ得られた。PCR増幅したRX50(実施例2)、p21とcyclin D3遺伝子をSfiIサイトにより建てられたflag-tag、myc-tagとHA-tagを持つpcDNA3.1真核発現ベクターにそれぞれクローンした。それぞれanti-flag、anti-mycとanti-HAのモノクローン抗体(Sigma会社から)を利用し、Western-blot法でRX50、p21とcyclin D3タンパクの発現状況を検出した。
まず、293T細胞にRX50をトランスフェクトし、24時間の培養後、細胞溶解液を加え、溶解させ、遠心分離で上澄を収集した。anti-p21抗体で免疫沈澱させた後、共沈殿物はSDS-PAGE電気泳動を経って、ニトロセルロース膜の上に電転移し、酵素標識のanti-flag抗体でタンパク質免疫ブロットハイブリダイゼイションを行い、約50kDaのところに特異的ハイブリッドバンドが見られ、このバンドはRX50発現タンパクと一致し、この沈殿バンドは発現されたRX50であることが表明された(図3に参照する)。これより、RX50と内在性のp21の間に相互作用が存在することが明らかになった。
p21の異なる截断体を獲得するため、起点がp21の20位目aa、40位目aa、60位目aa、91位目aaと89位目aaにそれぞれ対応するプライマーと対応するカルボキシ末端のプライマーにて、PCR増幅で増幅の産物が得られた。すべての増幅断片をそれぞれmyc-tagを持つpcDNA3真核発現ベクターに導入し、截断体p21-D2、 p21-D3、 p21-Cとp21-Nが得られた(図8に参照する)。
RX50とp21との相互作用領域を確定するため、RX50とp21、RX50とp21-D1、RX50とp21-D2、RX50とp21-D3、RX50とp21-C、RX50とp21-Nをそれぞれともに293T細胞にトランスフェクトした。24時間の培養後、溶解させ、遠心分離で上澄を収集した。anti-myc抗体とGタンパク質で免疫沈澱させた後、共沈殿物はSDS-PAGE電気泳動を経って、ニトロセルロース膜の上に電転移し、酵素標識のanti-flag抗体でタンパク質免疫ブロットハイブリダイゼイションを行った。その結果、RX50とp21、p21-D1、p21-D2、p21-Nとの間に相互作用が存在する(図9、レーン1、2、3、6)が、RX50とp21-D3、p21-Cとの間に相互作用が存在しない(図9、泳道4、5)ことを示す。これより、p21とRX50との相互作用が発生する領域はp21の40aa-60aaの位置にあることが推測される。
本実施例において、体外自己リン酸化実験でRX50が確かにキナーゼのリン酸化機能を持つことが証明された。
RX50及びその変異型を通常用いられる293T細胞、Jurkat細胞、Saos細胞とU2OS細胞を含む異なる哺乳動物細胞にトランスフェクトした。同時に、以下の幾つかの癌と炎症と関連するレポーター遺伝子をともにトランスフェクトした。
B.NFAT-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
C. NF-kB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
D. AP1-ルシフェラーゼレポーター遺伝子
トランスフェクションの24時間後、ルシフェラーゼの活性を測定した。ルシフェラーゼ法はとても感度の高い方法であるため、実験偏差が発生しやすいので、毎群の実験データは独立に三回以上繰り返して求められた平均値である。
体重2キロ程の雄性ニュージーランドウサギを一羽使用した。1mgの RX50タンパクサンプル(実施例5)にフロインド完全アジュバントを加え、エマルジョンに研磨し、ウサギの頸部に多所注射した。半月の飼育後、1mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、エマルジョンに研磨し、さらにウサギの頸部に多所注射した。一ヶ月後、1.5mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、同じ方法で免疫を強化した。半月後、さらに1mgの RX50タンパクサンプルにフロインド不完全アジュバントを加え、もう一度免疫を強化した。半月の飼育後、頚動脈から血を取り、4 ℃で一夜置き、2,000回で3分間遠心分離した。上層の血清はウサギ抗RX50タンパク抗体である。
(検討)
P21は細胞増殖の肝要な負の調節因子で、単コピー遺伝子で、6番染色体の短腕(6P21.2)に存在し、DNAの長さは85kbで、三つの長さはそれぞれ68、450、1600bpであるエキソンを持ち、且つプロモーター領域にはP53遺伝子結合の特有配列が含まれるため、P21はP53と密接に関連する。
Claims (10)
- SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するタンパク質、或はそのキナーゼ活性を有する保存的な変異タンパク、活性断片又は活性誘導体を含有することを特徴とする分離されたタンパク質。
- 当該タンパク質は以下の群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質:
(a)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を1-10個のアミノ酸残基の置換、欠失或は挿入により形成され、且つリン酸化の功能を有する(a)から誘導されたポリペプチド。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする分離されたポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO: 2で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO: 1の配列の1-1353位を含有することを特徴とする請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含有することを特徴とする遺伝工学化の宿主細胞。
- 以下の工程を含めることを特徴とするタンパク質の製造方法:
(a)発現の条件で、上述の宿主細胞を培養する;
(b)培養物からSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含有するタンパク質を分離する。 - 請求項1に記載のタンパク質と特異的に結合することができる抗体。
- 安全有効量の請求項1に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする薬物組成物。
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