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JP2007289191A - Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof - Google Patents

Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening antigen-specific CTLs, or the like. <P>SOLUTION: The method for screening the antigen-specific CTLs is characterized by administering a test substance to a transgenic mouse into which a gene containing a nucleotide sequence is introduced, and then assaying and evaluating whether CTLs specific for the test substance are induced. The nucleotide sequence is selected from DNA nucleotides encoding specific amino acid sequences and the nucleotide of a DNA which hybridizes under conditions stringent to the complementary chain of one of the above-mentioned nucleotide sequences and whose expression product can bind to a HLA-A24-binding antigen peptide to induce the CTLs. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明はHLA−A24発現トランスジェニック動物及びその利用に関する。さらに詳しくは、本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激により細胞傷害性T細胞(以下、CTL)が誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により選択されたPSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド、あるいは、当該トランスジェニックマウスの製造に有用な組換えDNA構築物およびその利用などに関する。   The present invention relates to an HLA-A24-expressing transgenic animal and use thereof. More specifically, the present invention relates to an HLA-A24 transgenic transgenic animal characterized in that cytotoxic T cells (hereinafter, CTL) are induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation, Method for screening tumor or viral infection treatment or prevention agent used, PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide selected by the screening method, or recombinant DNA construct useful for the production of the transgenic mouse And its use.

生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性T細胞(以下CTLと呼ぶ)が重要な働きをしている。CTLは、癌やウイルス等に由来する抗原タンパク質のペプチド断片と細胞表面のMHCクラスI分子(ヒトの場合はHLAと呼ばれる)により形成された複合体をT細胞レセプターを介して認識して、癌細胞やウイルス感染細胞等を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生して免疫系を活性化する。MHCクラスI分子と複合体を形成するペプチド断片は抗原ペプチドと呼ばれ、通常8から11アミノ酸程度の長さである。MHCクラスI分子の細胞外ドメインは、α1、α2、およびα3領域より構成され、このうちα1およびα2領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α3領域はCTL表面に発現する補助レセプターCD8分子との結合に関与する。   Cellular immunity, particularly cytotoxic T cells (hereinafter referred to as CTL), plays an important role in eliminating cancer cells, virus-infected cells, and the like by living bodies. CTL recognizes a complex formed by a peptide fragment of an antigenic protein derived from cancer or virus and a cell surface MHC class I molecule (referred to as HLA in humans) via a T cell receptor. It specifically injures cells and virus-infected cells and produces various cytokines to activate the immune system. Peptide fragments that form complexes with MHC class I molecules are called antigenic peptides and are usually about 8 to 11 amino acids long. The extracellular domain of MHC class I molecules is composed of α1, α2, and α3 regions, of which α1 and α2 regions are involved in the formation of antigen peptide containing grooves, and the α3 region is a co-receptor CD8 expressed on the CTL surface. Involved in binding to molecules.

CTLが認識する腫瘍抗原タンパク質としては、非特許文献1のtable 1に記載のものが代表例として挙げられる。具体的にはメラノサイト組織特異的タンパク質であるgp100(非特許文献2)、MART-1(非特許文献3)、およびチロシナーゼ(非特許文献4)などのメラノソーム抗原が挙げられ、またメラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、HER-2/neu(非特許文献5)、CEA(非特許文献6)、およびPSA(非特許文献7)などの腫瘍マーカー、あるいは扁平上皮癌由来のSART-1(非特許文献8)やサイクロフィリンB(非特許文献9)などが挙げられる。   Examples of tumor antigen proteins recognized by CTL include those described in Table 1 of Non-Patent Document 1. Specific examples include melanocyte antigens such as gp100 (non-patent document 2), MART-1 (non-patent document 3), and tyrosinase (non-patent document 4), which are melanocyte tissue-specific proteins, and tumors other than melanoma. Antigen proteins include tumor markers such as HER-2 / neu (Non-patent document 5), CEA (Non-patent document 6), and PSA (Non-patent document 7), or SART-1 (Non-patent document) derived from squamous cell carcinoma Reference 8) and cyclophilin B (Non-patent Reference 9) can be mentioned.

これらの腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド及びこれらをコードするDNA、さらにはウイルス由来の抗原タンパク質や抗原ペプチドを投与して、生体内の特異的なT細胞を増強させる、いわゆるワクチン療法は、癌やウイルス感染症等の治療や予防において有用であると考えられている。実際、メラノーマ、肺癌、頭頚部癌などで過剰に発現する腫瘍抗原タンパク質MAGE-3由来の抗原ペプチドを用いた臨床結果からも、腫瘍排除におけるワクチン療法の重要性が示唆されている(非特許文献10)。   The so-called vaccine therapy in which these tumor antigen proteins, tumor antigen peptides and DNAs encoding these, as well as virus-derived antigen proteins and antigen peptides are administered to enhance specific T cells in the living body, are cancer and It is considered useful in the treatment and prevention of viral infections and the like. In fact, the clinical results using an antigenic peptide derived from the tumor antigen protein MAGE-3, which is overexpressed in melanoma, lung cancer, head and neck cancer, etc., suggest the importance of vaccine therapy in tumor elimination (Non-patent literature). 10).

前記ワクチン療法剤の開発においてイン・ビボにおける有用性を評価するためには、実験動物として一般に使用される純系マウスは使用できず、HLAを発現するトランスジェニック動物(以下、ヒトモデル動物と称する場合もある)を用いる必要がある。すなわち、当該ワクチン療法剤に由来するヒト抗原ペプチドは、HLAに提示されることにより特異的免疫応答を誘導することが可能となるものであるが、当該HLAはヒトに特異的なMHCクラスI分子であるため、HLAを有さない非ヒト実験動物をヒト治療用ワクチン療法剤のイン・ビボ評価に使用することは出来ない。従って、前記のようにワクチン療法剤の有用性の評価には、HLAを発現するトランスジェニック動物(ヒトモデル動物)が必須である。   In order to evaluate the usefulness in vivo in the development of the vaccine therapeutic agent, a pure strain mouse generally used as an experimental animal cannot be used, and a transgenic animal that expresses HLA (hereinafter referred to as a human model animal) It is necessary to use That is, the human antigenic peptide derived from the vaccine therapy agent is capable of inducing a specific immune response when presented to HLA, but the HLA is a human-specific MHC class I molecule. Therefore, non-human laboratory animals that do not have HLA cannot be used for in vivo evaluation of vaccine therapeutics for human treatment. Therefore, as described above, transgenic animals (human model animals) that express HLA are essential for evaluating the usefulness of vaccine therapeutic agents.

ところでトランスジェニック動物の作製に関しては、種々の基本書により技術的には理解されているものの、所望の機能を有するトランスジェニック動物(ヒトモデル動物)を得ることは容易ではない。すなわち、導入遺伝子の発現が弱い、若しくは全く発現しない、あるいは発現していてもモデル動物としての所望の機能を有していない等、目的のモデル動物が得られないケースも多く、そのためヒトモデル動物の作製および/または樹立は未だ予測不能の技術であると考えられている。   By the way, regarding the production of a transgenic animal, although technically understood by various basic books, it is not easy to obtain a transgenic animal (human model animal) having a desired function. That is, there are many cases where the target model animal cannot be obtained, for example, the transgene is weakly expressed or not expressed at all, or it does not have the desired function as a model animal. The production and / or establishment of is still considered an unpredictable technique.

HLAのヒトモデル動物に関しては、HLAと抗原ペプチドとの複合体をヒトモデル動物のCTLが有効に認識できるように、モデル動物がマウスの場合には、HLAのα3領域をマウスMHCクラスI分子の同領域に置換したキメラHLA分子の遺伝子を導入したヒトモデルマウスが好ましいとされている。しかしながら、当該キメラHLA遺伝子導入ヒトモデル動物の成功例は極めて少なく、HLA-A2.1に関するヒトモデル動物(非特許文献11;HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスと呼ばれる, 非特許文献12)、およびHLA-A11に関するヒトモデル動物(非特許文献13;HLA-A11/Kbトランスジェニックマウスと呼ばれる)の2例が報告されているにすぎない。そこではトランスジェニックマウスのワクチン療法剤投与によるCTL誘導の有無が、ヒトの場合と高く相関していることが明らかにされており、トランスジェニックマウスのヒトモデル動物としての有用性が示されている。 In the case of a human model animal of HLA, when the model animal is a mouse so that the CTL of the human model animal can effectively recognize the complex of HLA and the antigenic peptide, the α3 region of HLA is the mouse MHC class I molecule. A human model mouse into which a gene of a chimeric HLA molecule substituted in the same region is introduced is preferred. However, there are very few successful examples of the chimeric HLA gene-introduced human model animals, and human model animals related to HLA-A2.1 (Non-patent Document 11; called HLA-A2.1 / Kb transgenic mouse, Non-patent Document 12) ), And only two cases of human model animals related to HLA-A11 (Non-patent Document 13; referred to as HLA-A11 / Kb transgenic mice) have been reported. There, it has been clarified that the presence or absence of CTL induction by administration of a vaccine therapeutic agent in a transgenic mouse is highly correlated with that in humans, and the utility of the transgenic mouse as a human model animal has been demonstrated. .

前記HLA-A2.1及びHLA-A11は欧米人に多いHLAハプロタイプであるが、これらのHLAと異なりアジア人に多いHLAハプロタイプ、すなわち約60%の日本人を含む多数のアジア人に共通のHLAハプロタイプとしては、HLA−A24が良く知られている。当該HLA−A24に関して、前述のようなキメラHLA遺伝子導入ヒトモデル動物が樹立されれば、アジア人に広く適用可能なHLA−A24拘束性ワクチン療法剤のイン・ビボ評価が可能となるため、当該領域の医薬品開発に多大な貢献をもたらすものと考えられる。しかしながら、当該HLA−A24に関するヒトモデル動物は未だ報告されておらず、そのため当該モデル動物の樹立が望まれている状況にあった。そのようなモデル動物は、ワクチン療法剤の評価のみならず、スクリーニングにも有用である。   The HLA-A2.1 and HLA-A11 are HLA haplotypes common in Europeans and Americans, but unlike these HLAs, HLA haplotypes common in Asians, that is, HLA common to many Asians including about 60% of Japanese. As a haplotype, HLA-A24 is well known. Regarding the HLA-A24, if a chimeric HLA gene-introduced human model animal as described above is established, in vivo evaluation of an HLA-A24-restricted vaccine therapeutic agent that can be widely applied to Asians is possible. This is considered to make a great contribution to drug development in the field. However, a human model animal related to the HLA-A24 has not yet been reported, and therefore, the establishment of the model animal was desired. Such a model animal is useful not only for evaluation of vaccine therapeutic agents but also for screening.

ところで腫瘍抗原タンパク質PSAは、正常な前立腺上皮細胞においても特異的に発現する糖タンパク質で、血中半減期は2〜3日である。癌化に伴い発現量が増強して腫瘍抗原タンパク質となることから、癌の診断マーカーとして利用されている(患者血清中のPSA値を測定)。前立腺癌は欧米諸国では発生率、死亡率ともに男性悪性腫瘍の第1〜3位を占め、また近年、我が国においても増加傾向が認められている。前立腺癌はアンドロゲン感受性癌であることより、アンドロゲン除去を目的とした治療法(内分泌療法)が施行されている。しかし、前立腺癌は治療開始時には内分泌療法に反応して制癌されていても、5年後には半数以上の症例が再燃癌、すなわちアンドロゲン不応性癌へと移行する。このアンドロゲン依存性喪失は前立腺癌の内分泌治療における大きな障害になっている。このため、PSA由来の抗原ペプチドを用いたワクチン療法の開発が望まれている。   By the way, tumor antigen protein PSA is a glycoprotein that is specifically expressed in normal prostate epithelial cells, and has a blood half-life of 2 to 3 days. It is used as a diagnostic marker for cancer because the expression level is enhanced with canceration and becomes a tumor antigen protein (measurement of PSA value in patient serum). Prostate cancer occupies the first to third ranks of male malignancies in both Western countries in terms of incidence and mortality, and in recent years, an increasing trend has been recognized in Japan. Since prostate cancer is an androgen-sensitive cancer, treatment (endocrine therapy) for the purpose of androgen removal has been performed. However, even if prostate cancer is controlled in response to endocrine therapy at the start of treatment, more than half of cases will transition to relapsed cancer, that is, androgen-refractory cancer, after 5 years. This androgen-dependent loss has become a major obstacle in endocrine treatment of prostate cancer. For this reason, development of vaccine therapy using an antigen peptide derived from PSA is desired.

PSAに関して、最近、HLA-A2タイプの抗原ペプチド領域が同定された(非特許文献14)。しかしながら HLA−A24(HLA−A2402)タイプに拘束性の抗原ペプチド領域の存在に関しては、これまで何ら報告されていない。ちなみにMHCクラスI分子には多くのサブタイプが存在し、結合できるペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのサブタイプについて規則性(結合モチーフ)が存在することが知られている。前記HLA−A24タイプの結合モチーフは、2番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである。しかしながら、当該結合モチーフより同定したペプチドが免疫原性を有するとは限らない。即ち、抗原ペプチドは腫瘍抗原タンパク質が細胞内でプロセシングされることにより生成されるため、in vivoでプロセシングにより生成されないペプチド領域は抗原ペプチドになり得ない。更に、結合モチーフに基づいて同定した腫瘍抗原タンパク質上のアミノ酸領域がペプチドとして細胞内で生成されても、そのような腫瘍抗原タンパク質は本来生体に存在する物質であるため、アナジーとなっている場合がある。以上のように、抗原ペプチドの同定は目的のHLAタイプに対する結合モチーフによる予測のみでは不十分であり、この観点からも、前記HLA−A24拘束性の抗原ペプチドを評価できるヒトモデル動物の樹立が望まれている状況にあった。   Regarding PSA, an HLA-A2 type antigen peptide region was recently identified (Non-patent Document 14). However, there has been no report on the presence of the antigen peptide region restricted to the HLA-A24 (HLA-A2402) type. Incidentally, there are many subtypes in MHC class I molecules, and it is known that there are regularities (binding motifs) for each subtype in the amino acid sequences of peptides that can be bound. In the HLA-A24 type binding motif, the second amino acid is tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine. However, peptides identified from the binding motif are not necessarily immunogenic. That is, since an antigen peptide is produced by processing a tumor antigen protein in a cell, a peptide region that is not produced by processing in vivo cannot be an antigen peptide. Furthermore, even if the amino acid region on the tumor antigen protein identified based on the binding motif is generated in the cell as a peptide, such tumor antigen protein is inherently present in the living body, so it is an anergy There is. As described above, it is not sufficient to identify the antigenic peptide by using only the binding motif for the target HLA type. From this viewpoint, it is hoped that a human model animal that can evaluate the HLA-A24-restricted antigenic peptide will be established. It was in a rare situation.

Immunity, vol.10:281, 1999Immunity, vol.10: 281, 1999 J.Exp.Med., 179:1005, 1994J.Exp.Med., 179: 1005, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994 J. Exp. Med., 178: 489, 1993J. Exp. Med., 178: 489, 1993 J.Exp.Med., 181:2109, 1995J.Exp.Med., 181: 2109, 1995 J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995J. Natl. Cancer. Inst., 87: 982, 1995 J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997J. Natl. Cancer. Inst., 89: 293, 1997 )J. Exp. Med., 187: 277, 1998) J. Exp. Med., 187: 277, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1903, 1991Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1903, 1991 Int. J. Cancer, 80: 219,1999Int. J. Cancer, 80: 219,1999 Eur.J.Immunol., 26:97, 1996Eur.J.Immunol., 26:97, 1996 J.Exp. Med., 185: 2034, 1997J. Exp. Med., 185: 2034, 1997 J. Immunol., 159:4753, 1997J. Immunol., 159: 4753, 1997 J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997J. Natl. Cancer. Inst., 89: 293, 1997

本発明は、抗原タンパク質や抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とする、HLA−A24のヒトモデル動物を初めて提供すること、及び当該ヒトモデル動物を用いて新規なHLA−A24拘束性抗原ペプチドを同定することなどを目的とする。具体的には、本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりCTLが誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、あるいは当該スクリーニング方法により選択されたPSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドなどを提供することなどを目的とする。   The present invention provides for the first time a human model animal of HLA-A24 that enables in vivo evaluation of antigen proteins and antigen peptides, and a novel HLA-A24-restricted antigen peptide using the human model animal. The purpose is to identify. Specifically, the present invention relates to an HLA-A24 transgenic transgenic animal characterized in that CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation, tumors and viral infections using the transgenic animal. The object is to provide a method for screening a therapeutic or prophylactic agent, or a PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide selected by the screening method.

本発明者らは、HLA−A24拘束性の抗原タンパクや抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とするために、HLA−A24を発現するトランスジェニック動物(ヒトモデル動物)の作製につき鋭意検討した。   In order to enable in vivo evaluation of HLA-A24-restricted antigen proteins and antigen peptides, the present inventors have intensively studied the production of transgenic animals (human model animals) that express HLA-A24.

本発明者らの意図するトランスジェニックマウスの作製において参考となり得たのは、前述の2例の報告のうちHLA-A2.1のケース(Eur. J. Immunol., 26 :97 (1996))の1例のみであった。しかしながら、この文献に記載の方法は、本発明の目的を達成するには不適切であった。即ち、前述のごとく、HLAのヒトモデル動物の作製にあたり、HLAのα3領域をマウスMHCクラスI分子(H-2Kbなど)の同領域に置換したキメラHLA分子の遺伝子を導入する方法が知られているが、適切なキメラ遺伝子を得るには、HLA分子上にH-2Kb分子との連結に適した制限酵素部位が必要である。しかし、HLA−A24遺伝子の場合、HLA-A2.1遺伝子と異なり、HLA−A24遺伝子のα1及びα2領域とマウスMHC(H-2Kb)のα3領域とをゲノム上で連結するための適当な制限酵素部位が存在しないので、人工的に適切な制限酵素部位を構築する必要があった。さらに、このような人工配列を含むキメラHLA−A24のゲノムDNAを個体へ導入した際に、正常にスプライシングされて目的のキメラHLA−A24分子を発現するか否かは全く予測できない状況にあった。また、作製されたトランスジェニック動物が正常にキメラHLA−A24分子を発現し、所望のCTL誘導能を有するヒトモデル動物となり得るか否かについても不明であった。加えて、マウスH-2Kbのイントロン3領域(HLA−A24遺伝子との連結領域)の大半は遺伝子配列が明らかにされておらず、入手が容易でないという状況にあった。 The case of HLA-A2.1 (Eur. J. Immunol., 26:97 (1996)) of the reports of the above-mentioned two cases can be helpful in the generation of the transgenic mice intended by the present inventors. There was only one case. However, the method described in this document is inappropriate for achieving the object of the present invention. That is, as described above, when generation of human model animal of HLA, a method of introducing a gene of chimeric HLA molecule and α3 regions were substituted in the same region of the mouse MHC class I molecules (such as H-2K b) of HLA-known and which, but for proper chimeric gene, it is necessary restriction enzyme sites suitable for coupling with H-2K b molecules on HLA molecule. However, in the case of the HLA-A24 gene, unlike the HLA-A2.1 gene, the α1 and α2 regions of the HLA-A24 gene and the α3 region of mouse MHC (H-2K b ) are appropriately linked on the genome. Since there was no restriction enzyme site, it was necessary to artificially construct an appropriate restriction enzyme site. Furthermore, when the genomic DNA of chimeric HLA-A24 containing such an artificial sequence was introduced into an individual, it was completely unpredictable whether or not the target chimeric HLA-A24 molecule was expressed by normal splicing. . It was also unclear whether or not the produced transgenic animal can normally express a chimeric HLA-A24 molecule and become a human model animal having a desired CTL inducing ability. In addition, most of the intron 3 region of mouse H-2K b (connecting region between HLA-A24 gene) has not been revealed gene sequence, was in situation obtained is not easy.

このような状況の中、本発明者らは、HLA−A24(HLA−A2402)遺伝子およびマウスH-2Kb遺伝子の、キメラ分子作製に必要な領域をクローニングし、人工的に作製した制限酵素部位を介して両配列を連結し、キメラHLA遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)を作製することに成功した。そして、当該キメラ遺伝子をC57BL/6マウス系統由来の受精卵へマイクロインジェクトすることにより、HLA−A2402/Kbトランスジェニックマウスの作製を試みた。800個以上の受精卵を対象にマイクロインジェクションを施行した結果、8ラインのトランスジェニックマウスが作出され、そのうち、わずかに1つのライン(04-1ライン)のみが、ホモ型で本発明のHLA−A24遺伝子(キメラ遺伝子)を有するトランスジェニックマウスとして発生した。当該04-1ライン系統のマウスに対して、既知のHLA−A24拘束性抗原ペプチドによる刺激を行った結果、良好なCTL誘導活性が認められ、本発明の目的にかなうHLA−A24トランスジェニックマウスであることが明らかとなった。 Under these circumstances, the present inventors have, HLA-A24 (HLA-A2402 ) gene and the murine H-2K b gene, the region necessary for chimeric molecules produced by cloning, artificially fabricated restriction enzyme sites Both sequences were ligated via, and a chimeric HLA gene (HLA-A2402 / Kb gene) was successfully produced. The chimeric gene was microinjected into a fertilized egg derived from the C57BL / 6 mouse strain, thereby attempting to produce an HLA-A2402 / Kb transgenic mouse. As a result of performing microinjection on 800 or more fertilized eggs, 8 lines of transgenic mice were produced, of which only one line (04-1 line) was homozygous and HLA- It was generated as a transgenic mouse having the A24 gene (chimeric gene). As a result of stimulation with the known HLA-A24-restricted antigen peptide to the 04-1 line strain of mice, good CTL-inducing activity was observed, and HLA-A24 transgenic mice that meet the purpose of the present invention It became clear that there was.

さらに本発明者は、この樹立されたトランスジェニックマウスを用いることにより、イン・ビボで抗原性を有するPSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定することにも成功した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
Furthermore, the present inventor succeeded in identifying a PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide having antigenicity in vivo by using the established transgenic mouse.
The present invention has been completed based on the above findings.

即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
(1)HLA−A24拘束性の抗原刺激により、CTLが誘導されることを特徴とする、HLA−A24遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(2)HLA−A24遺伝子をホモで有することを特徴とする、前記(1)に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(3)HLA−A24遺伝子が、HLA−A24遺伝子のα1及びα2領域とマウスMHCクラスI遺伝子のα3領域を含有するキメラ遺伝子である、前記(1)又は(2)に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(4)HLA−A24遺伝子がHLA−A2402遺伝子である、前記(1)〜(3)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(5)HLA−A24遺伝子が配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するものである、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(6)HLA−A24遺伝子が配列番号:2に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(7)HLA−A24遺伝子が配列番号:1に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(8)HLA−A24遺伝子が、前記(5)〜(7)のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有するものである、前記(1)〜(4)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(9)非ヒト哺乳動物がマウスである、前記(1)〜(8)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(10)マウスがC57BL/6系統のマウスである、前記(9)記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
(11)前記(1)〜(10)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法、
(12)前記(1)〜(10)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
(13)被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価するための標的細胞として、前記(1)〜(10)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているHLA−A24遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞を用いることを特徴とする、前記(11)又は(12)記載のスクリーニング方法、
(14)前記(3)〜(10)のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているHLA−A24遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞、
(15)前記(14)記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法、
(16)前記(14)記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
(17)配列番号:1に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA、
(18)配列番号:2に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA、
(19)配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA、
(20)前記(17)〜(19)のいずれかに記載のDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、単離されたDNA、
(21)配列番号:3に記載のアミノ酸配列の第25位〜第114位をコードするヌクレオチド配列、第115位〜第206位をコードするヌクレオチド配列、及び第207位〜第298位をコードするヌクレオチド配列を含有する、前記(20)に記載の単離されたDNA、
(22)配列番号:2に記載のヌクレオチド配列の第72位〜第339位、第342位〜第615位、及び第618位〜第891位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、前記(20)に記載の単離されたDNA、
(23)前記(17)〜(22)のいずれかに記載のDNAを含有する発現ベクター、
(24)前記(23)に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、
(25)前記(24)に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法、
(26)前記(24)に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
(27)前記(11)〜(13)のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、PSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
(28)配列番号:15に記載のアミノ酸配列よりなる、前記(27)に記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
(29)配列番号:17に記載のアミノ酸配列よりなる、前記(28)に記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
(30)前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、CTLの誘導剤、
(31)前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするDNA、
(32)前記(31)に記載のDNAを含有する組換えDNA、
(33)前記(32)に記載の組換えDNAを発現させて得られるポリペプチド、
(34)前記(32)に記載の組換えDNAまたは前記(33)記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、CTLの誘導剤、
(35)HLA−A24抗原と前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体が提示された抗原提示細胞、
(36)前記(35)に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤、
(37)HLA−A24抗原と前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識するCTL、
(38)前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、前記(32)に記載の組換えDNA、前記(33)に記載のポリペプチド、前記(35)に記載の抗原提示細胞、あるいは前記(37)に記載のCTLを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤、並びに
(39)前記(27)〜(29)のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) HLA-A24 transgenic transgenic non-human mammal, characterized in that CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation,
(2) The transgenic non-human mammal according to (1) above, which has a HLA-A24 gene in homology,
(3) The transgenic non-human according to (1) or (2) above, wherein the HLA-A24 gene is a chimeric gene containing the α1 and α2 regions of the HLA-A24 gene and the α3 region of the mouse MHC class I gene. Mammals,
(4) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (3), wherein the HLA-A24 gene is an HLA-A2402 gene,
(5) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (4) above, wherein the HLA-A24 gene contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(6) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (4) above, wherein the HLA-A24 gene contains the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(7) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (4) above, wherein the HLA-A24 gene contains the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(8) The HLA-A24 gene is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of the nucleotide sequence according to any one of (5) to (7) above, and the expression product of the DNA is The transgenic non-human mammal according to any one of the above (1) to (4), which binds to an HLA-A24-restricted antigen peptide and has a CTL inducing ability;
(9) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (8), wherein the non-human mammal is a mouse,
(10) The transgenic non-human mammal according to (9), wherein the mouse is a C57BL / 6 strain mouse,
(11) Measuring or evaluating whether a test substance is administered to the transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (10), and whether or not CTL specific to the test substance is induced A screening method for an antigen-specific CTL inducer,
(12) Administering a test substance to the transgenic non-human mammal according to any of (1) to (10) above, and measuring / evaluating whether or not CTL specific to the test substance is induced A screening method for a therapeutic or prophylactic agent for tumor or viral infection,
(13) The transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (10) possessed as a target cell for measuring / evaluating whether or not CTL specific to a test substance has been induced. A screening method according to (11) or (12) above, wherein a transformed cell into which the HLA-A24 gene is introduced and expressed is used,
(14) A transformed cell into which the HLA-A24 gene possessed by the transgenic non-human mammal according to any one of (3) to (10) is introduced and expressed,
(15) A screening method for an antigen-specific CTL inducer, characterized by using the transformed cell according to (14),
(16) A method for screening a therapeutic or prophylactic agent for tumor or virus infection, characterized by using the transformed cell according to (14) above,
(17) an isolated DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(18) an isolated DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(19) an isolated DNA containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(20) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the DNA according to any one of (17) to (19), and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen peptide An isolated DNA having the ability to induce CTL by binding to
(21) A nucleotide sequence encoding positions 25 to 114, a nucleotide sequence encoding positions 115 to 206, and positions 207 to 298 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. The isolated DNA according to (20) above, comprising a nucleotide sequence;
(22) containing a polynucleotide having a sequence represented by positions 72 to 339, positions 342 to 615, and positions 618 to 891 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2; Isolated DNA according to (20),
(23) an expression vector containing the DNA according to any one of (17) to (22),
(24) A transformed cell transformed with the expression vector according to (23),
(25) A method for screening an antigen-specific CTL inducer, characterized by using the transformed cell according to (24) above,
(26) A method for screening a therapeutic or prophylactic agent for tumor or virus infection, characterized by using the transformed cell according to (24) above,
(27) A PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide obtained by the screening method according to any one of (11) to (13) above, or a derivative thereof having functionally equivalent properties,
(28) The tumor antigen peptide according to (27), comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, or a derivative thereof having functionally equivalent properties,
(29) The tumor antigen peptide derivative according to (28), comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17;
(30) A CTL inducer containing the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any of (27) to (29) as an active ingredient,
(31) DNA encoding the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any of (27) to (29),
(32) a recombinant DNA containing the DNA according to (31),
(33) a polypeptide obtained by expressing the recombinant DNA according to (32),
(34) A CTL inducer comprising the recombinant DNA according to (32) or the polypeptide according to (33) as an active ingredient,
(35) an antigen-presenting cell on which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any of (27) to (29) is presented,
(36) A CTL inducer comprising the antigen-presenting cell according to (35) as an active ingredient,
(37) CTL that recognizes a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide or derivative thereof according to any of (27) to (29),
(38) The tumor antigen peptide or derivative thereof according to any one of (27) to (29), the recombinant DNA according to (32), the polypeptide according to (33), and the (35) The antigen-presenting cell according to claim 1, or a therapeutic or prophylactic agent for a tumor comprising the CTL according to (37) as an active ingredient, and (39) the tumor according to any of (27) to (29) A diagnostic agent for tumors comprising an antigenic peptide or a derivative thereof.

本発明により、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりCTLが誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び当該スクリーニング方法により選択されたPSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドが提供される。   According to the present invention, an HLA-A24 gene-introduced transgenic animal characterized in that CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation, and a therapeutic or preventive agent for tumors and viral infections using the transgenic animal. A screening method and a PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide selected by the screening method are provided.

本発明は、HLA−A24発現トランスジェニック動物を初めて提供するものである。具体的には本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりCTLが誘導されることを特徴とする、HLA−A24遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するものである。
本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用に関する。
さらに本発明は、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成に有用なDNA構築物(例、キメラ遺伝子)、該キメラ遺伝子で形質転換された宿主細胞およびそれらの利用等に関する。
The present invention provides for the first time an HLA-A24-expressing transgenic animal. Specifically, the present invention provides an HLA-A24 transgenic transgenic non-human mammal, characterized in that CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation.
The present invention also relates to the use of the transgenic non-human mammal.
Furthermore, the present invention relates to a DNA construct (eg, a chimeric gene) useful for the production of the transgenic non-human mammal, a host cell transformed with the chimeric gene, use thereof and the like.

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するために導入されるHLA−A24遺伝子としては、HLA−A2402遺伝子やHLA−A2403遺伝子などの亜種(J. Immunother., 23:282, 2000)を挙げることができる。しかし、HLA−A24保有者の大半がHLA−A2402遺伝子を保有しているため、多くの患者に適応可能なワクチン療法剤をイン・ビボ評価できるトランスジェニック動物を作製するという観点から、HLA−A2402遺伝子を用いることが好ましい。ここでHLA−A2402遺伝子はGenBank Acc. No. M64740として登録されており、またHLA−A2403遺伝子は Acc. No. M64741として登録されている。これらの配列に基き適当なPCRプライマーを作製し、ヒト腫瘍細胞等の種々の細胞株由来のゲノムDNAやmRNAを鋳型として前記プライマーを用いたPCR反応を行うことにより、所望のHLA−A24遺伝子をクローニングすることができる。   Examples of the HLA-A24 gene introduced to produce the transgenic non-human mammal of the present invention include subspecies such as the HLA-A2402 gene and the HLA-A2403 gene (J. Immunother., 23: 282, 2000). Can be mentioned. However, since the majority of HLA-A24 holders carry the HLA-A2402 gene, HLA-A2402 has been developed from the viewpoint of creating a transgenic animal that can be evaluated in vivo for vaccine therapies that can be applied to many patients. It is preferable to use a gene. Here, the HLA-A2402 gene is registered as GenBank Acc. No. M64740, and the HLA-A2403 gene is registered as Acc. No. M64741. Appropriate PCR primers are prepared based on these sequences, and PCR is performed using the primers using genomic DNA and mRNA derived from various cell lines such as human tumor cells as a template to obtain the desired HLA-A24 gene. Can be cloned.

また導入するHLA−A24遺伝子としては、天然のHLA−A24遺伝子(ゲノム及びcDNA)であってもよいが、当該HLA−A24遺伝子のα3領域が、導入対象動物の対応α3領域に置換されているキメラHLA−A24遺伝子を用いることが好ましい。   The HLA-A24 gene to be introduced may be a natural HLA-A24 gene (genome and cDNA), but the α3 region of the HLA-A24 gene is replaced with the corresponding α3 region of the animal to be introduced. It is preferable to use a chimeric HLA-A24 gene.

HLA分子の細胞外ドメインは、α1、α2、及びα3領域より構成されており、α1及びα2領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α3領域はCTL表面に発現する補助レセプター:CD8分子との結合に関与している。そして、HLAモデル動物のCTLがHLAと抗原ペプチドとの複合体を有効に認識するためには、該動物が、HLAのα3領域を導入対象動物のMHCの同領域に置換したキメラHLA分子を発現していることが好ましいと考えられている(Eur. J. Immunol., 26: 97, 1996、J. Immunol., 159:4753,1997)。従って前述のように、HLA−A24遺伝子のα3領域が導入対象動物の対応α3領域に置換されていることが好ましい。このようなキメラHLA−A24遺伝子も、発現してHLA−A24としての機能を保持する限り、本発明における「HLA−A24遺伝子」の範疇に含まれる。   The extracellular domain of the HLA molecule is composed of α1, α2, and α3 regions, the α1 and α2 regions are involved in the formation of the antigen peptide containing groove, and the α3 region is a co-receptor expressed on the CTL surface: CD8 molecule Is involved in the binding. In order for the CTL of the HLA model animal to effectively recognize the complex of HLA and the antigen peptide, the animal expresses a chimeric HLA molecule in which the α3 region of HLA is replaced with the same region of the MHC of the introduced animal. It is thought that it is preferable (Eur. J. Immunol., 26: 97, 1996, J. Immunol., 159: 4753, 1997). Therefore, as described above, it is preferable that the α3 region of the HLA-A24 gene is replaced with the corresponding α3 region of the animal to be introduced. Such a chimeric HLA-A24 gene is also included in the category of “HLA-A24 gene” in the present invention as long as it is expressed and retains the function as HLA-A24.

なお、本発明の目的から、当該キメラHLA−A24遺伝子において、抗原ペプチドの収容溝の形成に関与しているα1及びα2領域は、少なくともHLA−A24遺伝子由来である必要がある。一方、α3領域は前述のように導入対象動物のMHCの同領域に置換されていることが好ましく、さらにα3領域のみならず、α3領域以降の領域が導入対象動物のMHCの同領域に置換されているキメラHLA−A24遺伝子が、より好ましい。   For the purpose of the present invention, in the chimeric HLA-A24 gene, the α1 and α2 regions involved in the formation of the antigen peptide containing groove need to be derived from at least the HLA-A24 gene. On the other hand, the α3 region is preferably replaced with the same region of the MHC of the introduction target animal as described above, and not only the α3 region but also the region after the α3 region is replaced with the same region of the MHC of the introduction target animal. The chimeric HLA-A24 gene is more preferred.

例えば、導入対象動物がマウスの場合、ヒトHLAに対応するマウスMHCは、MHCクラスIであるH−2(H−2Kbなど)に相当する(Immunogenetics., 41:178, 1995)。従って、マウスに導入するHLA−A24遺伝子の好適な例として、HLA−A2402遺伝子のα1及びα2領域とマウスH−2Kb遺伝子のα3領域とを含有する、キメラHLA−A2402遺伝子が挙げられる。 For example, when introducing the subject animal is a mouse, the mouse MHC corresponding to human HLA corresponds to H-2 is a MHC class I (including H-2K b) (Immunogenetics, 41:. 178, 1995). Accordingly, suitable examples of HLA-A24 gene introduced into mouse, containing the α3 region of α1 and α2 region and mouse H-2K b gene of HLA-A2402 gene include chimeric HLA-A2402 gene.

このように、本明細書中、本発明に関して「HLA−A24遺伝子」という語句は、HLA−A24遺伝子に属する種々の亜種を包含し、さらに、そのようなHLA−A24遺伝子を構成するα1、α2およびα3領域(ドメイン)の全てを含む天然のHLA−A24遺伝子のみならず、これら3つの領域のうち少なくともα1およびα2領域を含むDNA構築物をも包含する意味で用いる。ここに、DNA構築物としては、HLA−A24由来のα1、α2領域と、マウス等の任意の哺乳動物由来のα3領域からなるキメラ遺伝子が挙げられる。   Thus, in the present specification, the phrase “HLA-A24 gene” in the context of the present invention encompasses various subspecies belonging to the HLA-A24 gene, and further, α1, which constitutes such an HLA-A24 gene, The term is used to encompass not only the natural HLA-A24 gene containing all of the α2 and α3 regions (domains) but also a DNA construct containing at least the α1 and α2 regions among these three regions. Here, examples of the DNA construct include a chimeric gene comprising α1, α2 regions derived from HLA-A24 and an α3 region derived from any mammal such as a mouse.

本発明に有用なキメラHLA−A2402遺伝子の具体例として、以下のものが列挙される。
(1)配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するDNA。
(2)配列番号:2に記載のcDNAのヌクレオチド配列を含有するDNA。
(3)配列番号:1に記載のゲノムDNAのヌクレオチド配列を含有するDNA。
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに記載のDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能(即ち、CTL誘導活性)を有するようなDNA。
Specific examples of the chimeric HLA-A2402 gene useful in the present invention include the following.
(1) DNA containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
(2) DNA containing the nucleotide sequence of the cDNA set forth in SEQ ID NO: 2.
(3) DNA containing the nucleotide sequence of the genomic DNA described in SEQ ID NO: 1.
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the DNA according to any one of (1) to (3) above, and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen peptide DNA that binds to CTL and has CTL inducing ability (ie, CTL inducing activity).

ここで(4)のDNAは、前記(1)〜(3)のDNAと類似の構造を有するDNA(例えば1〜数個のアミノ酸の改変等を含むDNA)を指すものである。具体的には、例えば、ホルムアミド濃度:45%(v/v)、塩濃度:5×SSPE、温度:42℃程度の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度:2×SSPE、温度:42℃程度の条件下で洗浄するといったストリンジェントな条件下で、前記(1)〜(3)のいずれかに記載のDNAの相補鎖とハイブリダイズし、かつ前記活性を有するDNAが挙げられる(活性測定法については後述する)。また、前記(1)〜(3)のDNAによりコードされるアミノ酸配列において1〜複数個(好ましくは、1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数個)のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードするDNAであって、かつ前記活性を有するDNAが挙げられる。さらには、前記(1)〜(3)のDNAによりコードされるアミノ酸配列のいずれかと約50%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する配列をコードするDNAであって、かつ前記活性を有するDNAが挙げられる。   Here, the DNA of (4) refers to a DNA having a structure similar to that of the DNAs of (1) to (3) (for example, DNA containing 1 to several amino acid modifications). Specifically, for example, formamide concentration: 45% (v / v), salt concentration: 5 × SSPE, temperature: hybridization at about 42 ° C., salt concentration: 2 × SSPE, temperature: about 42 ° C. DNA that hybridizes with the complementary strand of the DNA according to any one of (1) to (3) and has the activity under stringent conditions such as washing under the above conditions (activity measurement method) Will be described later). In addition, one to plural (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to several) amino acids in the amino acid sequence encoded by the DNA of (1) to (3) above. A DNA encoding an amino acid sequence in which a residue is substituted, deleted and / or added, and having the above activity. Furthermore, it is about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with any one of the amino acid sequences encoded by the DNAs of (1) to (3). Most preferred is a DNA encoding a sequence having a homology of about 95% or more and having the above activity.

より具体的には、配列番号:3に記載のアミノ酸配列の第25位〜第114位(α1領域)をコードするヌクレオチド配列、第115位〜第206位(α2領域)をコードするヌクレオチド配列、及び第207位〜第298位(α3領域)をコードするヌクレオチド配列を含有し、かつ前記活性を有するDNAが挙げられる。さらに、配列番号:2に記載のヌクレオチド配列の第72位〜第339位(α1領域)、第342位〜第615位(α2領域)、及び第618位〜第891位(α3領域)を含有し、かつ前記活性を有するDNAが挙げられる。   More specifically, a nucleotide sequence encoding positions 25 to 114 (α1 region) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, nucleotide sequence encoding positions 115 to 206 (α2 region), And a DNA containing a nucleotide sequence encoding positions 207 to 298 (α3 region) and having the above-mentioned activity. Furthermore, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 contains positions 72 to 339 (α1 region), positions 342 to 615 (α2 region), and positions 618 to 891 (α3 region). And DNA having the above activity.

以下、本発明のHLA−A24遺伝子作製法の具体例として、当該キメラHLA−A2402遺伝子作製法の一例を記述するが、これらは本発明を制限するものではない。   Hereinafter, as a specific example of the method for producing the HLA-A24 gene of the present invention, an example of the method for producing the chimeric HLA-A2402 gene will be described, but these do not limit the present invention.

まず、キメラHLA−A2402遺伝子を作製するために、ヒトHLA−A2402のゲノムDNA(GenBank Acc.No.L47206)の配列情報を基に、α1及びα2領域を含む必要領域(プロモーター、エキソン1〜3、及びイントロン1〜3)をクローニングする。その際、マウスH−2Kb遺伝子との連結を可能とするために、イントロン3中に適当な制限酵素認識部位を構築することが望ましい。そのような制限部位としては制限酵素Bgl II部位が好ましい。当該Bgl II部位は、クローニングに用いる下流プライマー中にBgl II部位が生じるような改変を施しておき、この下流プライマーを用いてPCR反応を行うことにより、構築することができる。具体的には配列番号:5に記載のプライマーを用いることにより、当該改変を施すことができる。 First, in order to produce a chimeric HLA-A2402 gene, a necessary region (promoter, exon 1 to 3) containing α1 and α2 regions based on the sequence information of genomic DNA of human HLA-A2402 (GenBank Acc. No. L47206). And introns 1-3). At that time, in order to enable the connection between the murine H-2K b gene, it is desirable to construct the appropriate restriction enzyme recognition site in intron 3. Such a restriction site is preferably a restriction enzyme BglII site. The Bgl II site can be constructed by modifying the downstream primer used for cloning so that a Bgl II site is generated and performing a PCR reaction using this downstream primer. Specifically, the modification can be performed by using the primer described in SEQ ID NO: 5.

なお前記クローニングは、例えばヒト腫瘍細胞株由来のゲノムDNAを鋳型とし、前述のような適当なPCRプライマーを用いてPCR反応を行うことなどにより実施することができる。当該PCRは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い容易に行うことができ、また現在ではPCRキット等も多数市販されている。   The cloning can be carried out, for example, by performing a PCR reaction using genomic DNA derived from a human tumor cell line as a template and using appropriate PCR primers as described above. The PCR can be easily performed according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and many PCR kits are currently commercially available.

他方、マウスH−2KbのゲノムDNAの配列情報(GenBank Acc. No. v00746, v00747)を基に、例えばマウス腫瘍細胞株由来のゲノムDNAを鋳型として、前記と同じくPCR反応により、α3以降の領域(エキソン4〜8、及びイントロン3〜7)をクローニングする。なお、前記 GenBank登録配列は不完全であり、HLA−A2402遺伝子との連結に必要なイントロン3領域の大半が登録されていないので、まず当該未登録領域をクローニングして配列決定する必要がある。ここで、H−2Kb遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在しているため、正しいH−2Kb遺伝子をクローニングするには適切なプライマーを用いてクローニングする必要がある。好ましいプライマーとして、例えば、実施例2記載の各種プライマー(配列番号:6〜配列番号:9)を挙げることができる。 On the other hand, based on the sequence information of genomic DNA of the mouse H-2K b (GenBank Acc. No. v00746, v00747), for example, a genomic DNA derived from mouse tumor cell lines as a template, the same PCR reaction with the, .alpha.3 subsequent The region (exons 4-8 and introns 3-7) is cloned. Since the GenBank registration sequence is incomplete and most of the intron 3 region necessary for ligation with the HLA-A2402 gene has not been registered, it is necessary to first clone and sequence the unregistered region. Since the gene high H-2K b gene homologous pseudo gene and homology to exist, it is necessary to cloned using appropriate primers for cloning the correct H-2K b gene. Examples of preferable primers include various primers (SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9) described in Example 2.

以上のようにして得られたHLA−A2402ゲノム断片及びマウスH−2Kbゲノム断片を連結して、所望のキメラ遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)を構築する。その際、前記のようにHLA−A2402遺伝子のイントロン3中にBgl II部位を構築した場合は、当該Bgl II部位とマウスH−2Kb遺伝子のイントロン3中のBam HI部位とで両遺伝子を連結することが好ましい。このようにして、本発明のキメラHLA−A2402遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)を作製することができる。 By connecting the HLA-A2402 genomic fragment and mouse H-2K b genomic fragment obtained as described above, to build a desired chimeric gene (HLA-A2402 / K b gene). At that time, the When building a Bgl II site to the intron 3 of HLA-A2402 gene as, connecting both genes at the Bam HI site in intron 3 of the Bgl II site and the murine H-2K b gene It is preferable to do. In this way, the chimeric HLA-A2402 gene (HLA-A2402 / Kb gene) of the present invention can be prepared.

なお、作製されたキメラHLA−A2402遺伝子に対して1〜複数個のアミノ酸の改変を施す手法も当業者に周知であり、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に従い行うことができる。
次に、前記で作製されたHLA−A24遺伝子の受精卵への導入及びトランスジェニック動物の作製につき記述する。
A technique for modifying one to a plurality of amino acids to the produced chimeric HLA-A2402 gene is also well known to those skilled in the art. For example, a basic technique such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), etc. Can be done according to the letter.
Next, introduction of the HLA-A24 gene prepared above into a fertilized egg and production of a transgenic animal will be described.

まず、前記で作製されたHLA−A24遺伝子を含有するプラスミドからHLA−A24遺伝子部分を切り出し、この断片を常法により受精卵に導入できる程度に精製する。なお、HLA−A2402/Kb遺伝子が前述のように HLA−A2402遺伝子の本来のプロモーター領域を保有している場合は、切り出したHLA−A24遺伝子断片をそのまま用いて受精卵に導入することが可能であるが、このような本来のプロモーターを有していない場合は、発現に必要な外来性プロモーターを付加する必要がある。当該プロモーターとしては、βアクチンプロモーター、メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。さらに、より発現量を上げるためにエンハンサーを付加することも可能であり、当該エンハンサーとしてはCMVエンハンサー、SV40エンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー等が挙げられる。 First, the HLA-A24 gene part is excised from the plasmid containing the HLA-A24 gene prepared above and purified to such an extent that this fragment can be introduced into a fertilized egg by a conventional method. If the HLA-A2402 / Kb gene has the original promoter region of the HLA-A2402 gene as described above, it can be introduced into a fertilized egg using the excised HLA-A24 gene fragment as it is. However, if it does not have such an original promoter, it is necessary to add an exogenous promoter necessary for expression. Examples of the promoter include β-actin promoter and metallothionein promoter. Furthermore, an enhancer can be added to increase the expression level. Examples of the enhancer include CMV enhancer, SV40 enhancer, and immunoglobulin enhancer.

次に、精製されたHLA−A24遺伝子を対象動物の受精卵へ導入する。ここで対象動物としてはマウス、ラット、ウサギ等を具体的に例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さなどからしてマウス、ラット等のげっ歯目動物が好ましく、特にマウスが好ましい。中でもC57BL/6系統のマウスを用いることがより好ましい。すなわちC57BL/6系統マウスはクラスI分子としてH−2Kbを発現しており、HLA−A24と同様な結合モチーフを有するH−2Kdを発現していないため、当該トランスジェニックマウスにHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスIにより細胞表面に提示されることがなく、交差反応が起こらないという利点を有する。 Next, the purified HLA-A24 gene is introduced into the fertilized egg of the subject animal. Here, specific examples of target animals include mice, rats, rabbits and the like, but rodents such as mice, rats and the like are preferable from the viewpoint of creation, breeding, ease of use, and the like. preferable. Among them, it is more preferable to use C57BL / 6 strain mice. That C57BL / 6 mouse strain is expressed H-2K b as class I molecules, because it does not express H-2K d having the same binding motif with HLA-A24, HLA-A24 to the transgenic mice Even when a restricted antigen peptide is administered, it is not presented on the cell surface by endogenous mouse class I, and has the advantage that no cross-reaction occurs.

以下、マウスを例にとりトランスジェニックマウスの作製につき説明する。
マウス受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等により導入することができる。導入後、得られた卵細胞を培養し、仮親マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから本発明のHLA−A24遺伝子を含有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。当該トランスジェニックマウスの選択は、例えばマウスの尾DNA調製物を鋳型として、導入したHLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR法等により、行うことができる。
Hereinafter, the production of a transgenic mouse will be described taking a mouse as an example.
The method for introducing a gene into a mouse fertilized egg is not particularly limited, and the gene can be introduced by a microinjection method, an electroporation method, or the like. After the introduction, the obtained egg cells are cultured, transplanted to the oviduct of the temporary parent mouse, then the transplanted animal is bred, and by selecting the pup mouse containing the HLA-A24 gene of the present invention from the born mouse, Transgenic mice can be created. The selection of the transgenic mouse can be performed by, for example, a PCR method using a primer specific to the introduced HLA-A24 gene using a mouse tail DNA preparation as a template.

作出されたトランスジェニックマウスのラインが、導入されたHLA−A24遺伝子を細胞表面に発現しているか否かは、例えばトランスジェニックマウスより摘出した脾臓より脾細胞を回収し、当該脾細胞をフローサイトメトリー法により解析することにより、調べることができる。このようにして得られた本発明のトランスジェニックマウスは、導入HLA−A24遺伝子をホモで有していることが望ましい。   Whether the generated transgenic mouse line expresses the introduced HLA-A24 gene on the cell surface is determined by, for example, collecting splenocytes from the spleen extracted from the transgenic mice, It can be examined by analyzing by a measurement method. The thus obtained transgenic mouse of the present invention preferably has the introduced HLA-A24 gene in homology.

なお、以上のようなトランスジェニック動物は、例えば新遺伝子工学ハンドブック,269−276,羊土社(1996)や、マウス胚の操作マニュアル,近代出版(1989)などの基本書を参考にして創製することができる。例えば、マウスゲノムのH−2Kb遺伝子座にキメラHLA−A24遺伝子としてのDNA構築物を組み込むことを目的として、マウス胚性幹細胞中に導入し、そのようにして製造された組み換え幹細胞を選択し、次いで、マウス胚盤胞中に導入してキメラ胚を得る。これを偽妊娠マウス中に移植し子孫を得、その子孫をスクリーニングして、導入キメラ遺伝子の対立遺伝子を含むヘテロ接合マウスを同定する。次いで、これらのマウスを交雑させて、HLA−A24拘束性抗原刺激により、CTLが誘導されることにより特徴付けられる表現型を有するホモ接合トランスジェニックマウスを得ることができる。 The above transgenic animals are created with reference to basic books such as the New Genetic Engineering Handbook, 269-276, Yodosha (1996), the mouse embryo operation manual, Modern Publishing (1989), etc. be able to. For example, for the purpose of incorporating the DNA construct as chimeric HLA-A24 gene H-2K b gene locus of the mouse genome, introduced into mouse embryonic stem cells, select the way recombinant stem cells prepared by, It is then introduced into a mouse blastocyst to obtain a chimeric embryo. This is transplanted into pseudopregnant mice to obtain offspring, which are screened to identify heterozygous mice containing alleles of the introduced chimeric gene. These mice can then be crossed to yield homozygous transgenic mice having a phenotype characterized by induction of CTLs by HLA-A24 restricted antigen stimulation.

本発明のトランスジェニック動物がヒトモデル動物として使用できるか否か、すなわちHLA−A24拘束性の抗原刺激により特異的CTLが誘導されるか否かは、当業者に周知のあらゆる手法を用いて調べることが可能であるが、以下に代表的な一例を記載する。   Whether or not the transgenic animal of the present invention can be used as a human model animal, that is, whether or not specific CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation, is investigated using any technique known to those skilled in the art. A typical example is described below.

まず、既知のHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを、常法により不完全フロイントアジュバントと混合し、water-in-oilエマルションを作製する。当該エマルションでトランスジェニックマウスを免疫する。免疫部位としてはマウス尾部や背の皮下、腹腔内および足蹠などが好ましい。数日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を回収・調製する。ここで脾細胞を用いる理由は、樹状細胞などの抗原提示細胞は脾細胞に含まれているためであるが、脾細胞に限定されるものではない。   First, a known HLA-A24-restricted antigen peptide is mixed with incomplete Freund's adjuvant by a conventional method to prepare a water-in-oil emulsion. Transgenic mice are immunized with the emulsion. As the immunization site, the mouse tail, the subcutaneous part of the back, the intraperitoneal cavity and the footpad are preferred. Several days later, the spleen is removed, and splenocytes are collected and prepared by a conventional method. The reason why spleen cells are used is that antigen-presenting cells such as dendritic cells are contained in spleen cells, but are not limited to spleen cells.

次に当該脾細胞を溶血処理し、X線照射した後、前記抗原ペプチドをパルスする。その際、非照射・非ペプチドパルスの脾細胞を同時に加えて37℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。   Next, the splenocytes are hemolyzed and irradiated with X-rays, and then the antigenic peptide is pulsed. At that time, non-irradiated and non-peptide-pulsed spleen cells are added simultaneously and re-stimulated at 37 ° C. Stimulate for several days and use this as the test sample for evaluation.

他方、前記被験試料をアッセイするための標的細胞を作製する。当該標的細胞としては、細胞表面にHLA−A24が発現している細胞であれば、如何なる細胞であっても用いることが可能であり、天然にHLA−A24を発現している細胞、及びHLA−A24遺伝子を導入して作製された形質転換細胞のいずれをも用いることができる。   On the other hand, target cells are prepared for assaying the test sample. Any cell can be used as the target cell as long as HLA-A24 is expressed on the cell surface, and cells that naturally express HLA-A24, and HLA- Any of the transformed cells produced by introducing the A24 gene can be used.

ここで天然にHLA−A24を発現している細胞としては、本発明のトランスジェニック動物から単離・精製されたリンパ球や、天然にHLA−A24を発現しているRERF-LC-AI細胞(理研細胞バンク RCB0444)などが挙げられる。   Here, the cells that naturally express HLA-A24 include lymphocytes isolated and purified from the transgenic animal of the present invention, and RERF-LC-AI cells that naturally express HLA-A24 ( RIKEN Cell Bank RCB0444).

また、HLA−A24遺伝子を導入して作製された形質転換細胞としては、以下のものが挙げられる。   Moreover, the following are mentioned as a transformed cell produced by introducing the HLA-A24 gene.

まず、細胞へ導入するHLA−A24遺伝子としては、天然型のHLA−A24遺伝子であっても、また前述のようなキメラHLA−A24遺伝子であっても良いが、評価対象であるトランスジェニック動物のCTLが認識し易いように、当該トランスジェニック動物が保有しているHLA−A24遺伝子と同じ遺伝子を細胞に導入することが好ましい。すなわち、トランスジェニック動物がキメラHLA−A2402遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)を保有している場合、当該トランスジェニック動物の評価に用いる標的細胞においても、HLA−A2402/Kb遺伝子を導入することが好ましい。 First, the HLA-A24 gene to be introduced into the cell may be a natural HLA-A24 gene or a chimeric HLA-A24 gene as described above. It is preferable to introduce the same gene as the HLA-A24 gene possessed by the transgenic animal into the cells so that the CTL can be easily recognized. That is, when the transgenic animal has a chimeric HLA-A2402 gene (HLA-A2402 / Kb gene), the HLA-A2402 / Kb gene is also introduced into the target cells used for the evaluation of the transgenic animal. It is preferable.

当該導入用のHLA−A24遺伝子は、cDNAの形態であってもゲノムDNAの形態であっても良い。またトランスジェニック動物自身から当該HLA−A24遺伝子を単離しても、それ以外の細胞等から単離しても良い。   The HLA-A24 gene for introduction may be in the form of cDNA or genomic DNA. In addition, the HLA-A24 gene may be isolated from the transgenic animal itself or from other cells.

例えば導入用遺伝子としてHLA−A24のcDNAを用いる場合、トランスジェニック動物から単離されたmRNAを鋳型として、HLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR反応を行うことにより、目的のcDNAを得ることができる。また、導入用遺伝子としてHLA−A24のゲノムDNAを用いる場合は、天然にHLA−A24を発現しているRERF-LC-AI細胞(理研細胞バンク RCB0444)より単離されたゲノムDNAを鋳型として、HLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR反応を行うことにより、目的のゲノムDNAを得ることができる。さらに、前記でトランスジェニック動物への導入用に作製されたHLA−A24遺伝子(キメラHLA−A24遺伝子等)も使用することができる。   For example, when HLA-A24 cDNA is used as a transgene, the target cDNA is obtained by performing a PCR reaction using mRNA isolated from the transgenic animal as a template and using a primer specific for the HLA-A24 gene. be able to. Moreover, when using genomic DNA of HLA-A24 as a gene for transduction, genomic DNA isolated from RERF-LC-AI cells (RIKEN cell bank RCB0444) that naturally express HLA-A24 is used as a template. The target genomic DNA can be obtained by performing a PCR reaction using primers specific to the HLA-A24 gene. Furthermore, the HLA-A24 gene (such as a chimeric HLA-A24 gene) prepared for introduction into a transgenic animal as described above can also be used.

当該導入されるcDNAやゲノムDNAの具体例としては、前述の(1)〜(4)のDNA、すなわち、配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するcDNAや、配列番号:2に記載のヌクレオチド配列を含有するcDNA、あるいは配列番号:1に記載のヌクレオチド配列を含有するゲノムDNAなどが挙げられる。   Specific examples of the introduced cDNA and genomic DNA include the DNAs described in (1) to (4) above, that is, a cDNA containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: : CDNA containing the nucleotide sequence set forth in 2: or genomic DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

得られたcDNAやゲノムDNAは、pcDNA3.1、pcDNA3.1誘導体、pRc/RSV、pRc/CMV、pEF誘導体、pREP9誘導体(インビトロジェン)、pIRESneo(クロンテック)等の市販の発現ベクターに組み込むことにより、所望のHLA−A24を発現する組換え発現ベクターを作製することができる。   The resulting cDNA or genomic DNA is incorporated into a commercially available expression vector such as pcDNA3.1, pcDNA3.1 derivative, pRc / RSV, pRc / CMV, pEF derivative, pREP9 derivative (Invitrogen), pIRESneo (Clontech), A recombinant expression vector expressing the desired HLA-A24 can be produced.

宿主細胞としては、ヒトリンパ球細胞であるJurkat細胞(ATCC T1B-152)、T2細胞(ATCC CRL-1992)や、マウスリンパ球細胞であるEL4細胞(ATCC T1B-39)、RMA-S細胞(Nature.,346,476-80(1990))、K562細胞(ATCC CCL-243)、C1R細胞(ATCC CRL-2369)などが挙げられる。当該宿主細胞へのHLA−A24遺伝子含有発現ベクターの導入法としては、例えば遺伝子導入装置を用いる方法、リン酸カルシウム法(J.Virol.,52,456-467(1973))、LT−1(Panvera社)を用いる方法、遺伝子導入用リピッド(Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL社)を用いる方法等が挙げられる。その後、選択培地にて生存する細胞を培養することにより、導入遺伝子が安定に発現する宿主細胞を樹立することができる。   Host cells include human lymphocyte cells, Jurkat cells (ATCC T1B-152), T2 cells (ATCC CRL-1992), mouse lymphocyte cells, EL4 cells (ATCC T1B-39), RMA-S cells (Nature , 346, 476-80 (1990)), K562 cells (ATCC CCL-243), C1R cells (ATCC CRL-2369) and the like. Examples of the method for introducing the HLA-A24 gene-containing expression vector into the host cell include a method using a gene transfer device, a calcium phosphate method (J. Virol., 52, 456-467 (1973)), and LT-1 (Panvera). And a method of using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL). Thereafter, by culturing cells that survive in the selective medium, host cells in which the transgene is stably expressed can be established.

以上のようにして樹立された標的細胞は、当業者に周知の手法により前記トランスジェニック動物の評価(トランスジェニック動物由来の被験試料の評価)に用いられる。具体的には、例えば抗原刺激により誘導されたCTLが標的細胞に反応して産生する種々のサイトカイン(例えばIFN−γ)の量を、例えばELISA法などによって測定する手法や、標的細胞の傷害活性を測定する51Crリリースアッセイ(Int.J.Cancer,58:317(1994))などが挙げられる。 The target cells established as described above are used for evaluation of the transgenic animal (evaluation of a test sample derived from the transgenic animal) by a technique well known to those skilled in the art. Specifically, for example, a method for measuring the amount of various cytokines (for example, IFN-γ) produced in response to target cells by CTL induced by antigen stimulation, for example, an ELISA method, or the cytotoxic activity of target cells 51 Cr release assay (Int. J. Cancer, 58: 317 (1994)) and the like.

ここで51Crリリースアッセイとは、前記標的細胞を51Crラベルし、対象となる抗原ペプチドをパルスして、前記トランスジェニック動物由来の被験試料(脾細胞)を添加し、標的細胞がCTLにより傷害を受けて遊離された51Crの量を測定する手法である。このようなアッセイによって抗原特異的なCTLの誘導が認められれば、当該トランスジェニック動物はHLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなる。 Here, the 51 Cr release assay means that the target cells are labeled with 51 Cr, the target antigen peptide is pulsed, the test sample (spleen cells) derived from the transgenic animal is added, and the target cells are damaged by CTL. This is a method for measuring the amount of 51 Cr released upon receiving. If induction of antigen-specific CTL is confirmed by such an assay, it is clear that the transgenic animal is a human model animal that can evaluate HLA-A24-restricted tumor antigen protein and tumor antigen peptide. Become.

以上のようにして作製された本発明のトランスジェニック動物は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりCTLが誘導されるものである。従って、被験物質がイン・ビボで抗原特異的CTL誘導能(誘導活性)を有するか否かの評価に使用することができる。すなわち、本発明は、本発明のトランスジェニック動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法を提供する。   The transgenic animal of the present invention produced as described above is one in which CTL is induced by HLA-A24-restricted antigen stimulation. Therefore, it can be used to evaluate whether a test substance has antigen-specific CTL inducing ability (inducing activity) in vivo. That is, the present invention provides an antigen-specific CTL induction, comprising administering a test substance to the transgenic animal of the present invention, and measuring / evaluating whether or not CTL specific to the test substance is induced. An agent screening method is provided.

当該スクリーニング方法に供される被験物質としては、イン・ビトロ試験で特異的CTL誘導能を有することが明らかにされている抗原タンパクやそれに由来する抗原ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドDNAが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、活性未知のタンパク質やペプチドあるいはそれらをコードするプラスミドDNAなども含まれる。   Examples of test substances to be used in the screening method include antigen proteins that have been shown to have specific CTL inducing ability in in vitro tests, antigen peptides derived therefrom, or plasmid DNAs that encode them. However, it is not limited to these, and includes proteins and peptides whose activity is unknown or plasmid DNA encoding them.

具体的には、例えばMAGE(Science ,254:1643,1991)、gp100(J.Exp.Med.,179:1005,1994)、MART−1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515 ,1994)、チロシナーゼ(J.Exp.Med.,178:489 ,1993)、HER2/neu(J.Exp.Med.,181:2109,1995)、CEA(J.Natl.Cancer.Inst. ,87:982,1995)、PSA(J. Natl. Cancer. Inst. ,89:293,1997)、SART−1(J. Exp. Med., vol. 187, p277−288, 1998 、国際公開第97/46676号パンフレット) 、サイクロフィリンB(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 88: 1903, 1991)、SART−3(国際公開第00/12701号パンフレット)、ART−1(国際公開第00/32770号パンフレット)等の腫瘍抗原タンパク質及びその部分ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドDNAが挙げられる。さらに、HIV、HCV、HBV、インフルエンザウイルス、HPV、HTLV、EBV等のウイルス本体、ウイルス由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドや、結核菌等の細菌由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドが挙げられる。   Specifically, for example, MAGE (Science, 254: 1643, 1991), gp100 (J. Exp. Med., 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515) , 1994), tyrosinase (J. Exp. Med., 178: 489, 1993), HER2 / neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995), CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87) : 982, 1995), PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89: 293, 1997), SART-1 (J. Exp. Med., Vol. 187, p277-288, 1998, International Publication No. 97 / 46676 pamphlet), cyclophilin B (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 1903, 1991), SART-3 (International Publication No. 00/12701 pamphlet), ART-1 (International Publication No. 00/32770) No. pamphlet) and other tumor antigen proteins and partial peptides thereof, or plasmid DNAs encoding them. Furthermore, virus bodies such as HIV, HCV, HBV, influenza virus, HPV, HTLV and EBV, antigen proteins derived from viruses and antigen peptides thereof, and antigen proteins derived from bacteria such as Mycobacterium tuberculosis and antigen peptides thereof can be mentioned.

このような被験物質のトランスジェニック動物への投与により、被験物質特異的なHLA−A24拘束性のCTLが誘導されたか否かの測定・評価は、前記トランスジェニック動物の評価方法と同様にして行うことができる。   Measurement / evaluation of whether or not a test substance-specific HLA-A24-restricted CTL is induced by administration of such a test substance to a transgenic animal is carried out in the same manner as in the transgenic animal evaluation method. be able to.

すなわち一例を以下に記載すると、まず、本発明のトランスジェニック動物を被験物質で免疫し、脾臓を摘出して脾細胞を回収する。当該脾細胞を溶血処理し、X線照射した後、被験物質をパルスする。その際、非照射・非パルスの脾細胞を同時に加えて37℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。   That is, an example is described below. First, the transgenic animal of the present invention is immunized with a test substance, and the spleen is removed and spleen cells are collected. The splenocytes are hemolyzed and irradiated with X-rays, and then the test substance is pulsed. At that time, non-irradiated and non-pulsed spleen cells are added simultaneously and re-stimulated at 37 ° C. Stimulate for several days and use this as the test sample for evaluation.

他方、前述のようなアッセイ用の標的細胞を51Crでラベルし、被験物質の抗原ペプチドをパルスした後、前記被験試料(脾細胞)を添加する。被験試料の添加によって、抗原特異的なCTLの誘導が認められた場合は、当該被験物質はイン・ビボで抗原特異的CTL誘導能を有する物質であることが明らかとなる。このようにして選択されたCTLの誘導剤は、腫瘍やウイルス感染症の治療剤及び/又は予防剤として用いることができる。 On the other hand, the target cells for assay as described above are labeled with 51 Cr, and the antigen peptide of the test substance is pulsed, and then the test sample (spleen cells) is added. When antigen-specific CTL induction is observed upon addition of the test sample, it becomes clear that the test substance is an in vivo antigen-specific CTL inducing ability. The CTL inducer thus selected can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for tumors and viral infections.

なお、前述の標的細胞は、トランスジェニック動物の評価や、トランスジェニック動物に投与した被験物質の評価に用いられるのみならず、HLA−A24抗原特異的なCTLが誘導されるか否かを評価する必要のある如何なる被験物質の評価においても、使用することができる。   The target cells described above are used not only for evaluation of transgenic animals and test substances administered to the transgenic animals, but also for evaluating whether HLA-A24 antigen-specific CTLs are induced. It can be used in the assessment of any test substance that is needed.

本発明はまた、本発明のトランスジェニック動物を用いた前記スクリーニングにより得られた、PSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド、及び機能的に同等の特性を有するその誘導体を包含するものである。ここでPSAとは、Biochem. Biophys. Res. Commun. 160(2), 903−910(1989)及び GenBank Acc No. M26663において開示されたアミノ酸配列を有する腫瘍抗原タンパク質である。   The present invention also includes a PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide obtained by the above-described screening using the transgenic animal of the present invention, and derivatives having functionally equivalent properties. . Here, PSA is a tumor antigen protein having the amino acid sequence disclosed in Biochem. Biophys. Res. Commun. 160 (2), 903-910 (1989) and GenBank Acc No. M26663.

HLA抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性(モチーフ)があり、HLA−A24抗原の場合、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちのN末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている(Immunogenetics, 41: 178, 1995、J. Immunol., 152: p3913,1994、J. Immunol., 155: 4307,1994)。PSAのアミノ酸配列からこのような結合モチーフ構造を有するペプチド部分を選択し、選択されたペプチドを本発明のトランスジェニック動物に供することにより、イン・ビボで効果を有するHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定し、得ることができる。   The sequence of the antigen peptide presented by binding to the HLA antigen has regularity (motif). In the case of the HLA-A24 antigen, the second amino acid from the N-terminal of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids is phenylalanine, Tyrosine, methionine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is known to be phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (Immunogenetics, 41: 178, 1995, J. Immunol., 152: p3913, 1994, J. Immunol., 155: 4307, 1994). An HLA-A24-restricted tumor antigen peptide having an effect in vivo by selecting a peptide portion having such a binding motif structure from the amino acid sequence of PSA and subjecting the selected peptide to the transgenic animal of the present invention Can be identified and obtained.

当該腫瘍抗原ペプチドとしては、具体的には配列番号:15に記載のアミノ酸配列よりなる腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。   Specific examples of the tumor antigen peptide include a tumor antigen peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.

本発明の腫瘍抗原ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献(ペプタイド・シンセシス(Peptide Synthesis ),Interscience,New York,1966;ザ・プロテインズ(The Proteins),Vol 2 ,Academic Press Inc. ,New York,1976;ペプチド合成,丸善(株),1975;ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株),1985;医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成,広川書店,1991)などに記載されている方法が挙げられる。   The tumor antigen peptide of the present invention can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry. As a synthesis method, literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen (stock) ), 1975; Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Drug Development Continued, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991).

前記において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」(以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある)とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列の1または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつHLA−A24抗原と結合してCTLにより認識されるという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものをいう。   In the above, “a derivative having functionally equivalent properties to a tumor antigen peptide” (hereinafter sometimes abbreviated as a tumor antigen peptide derivative) means one or several amino acid residues of the amino acid sequence of the tumor antigen peptide of the present invention. It is a modified substance having a modified group, and has a characteristic as a tumor antigen peptide that binds to the HLA-A24 antigen and is recognized by CTL.

ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び/又は付加(ペプチドのN末端、C末端へのアミノ酸の付加も含む)を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り任意である。
前述の如く、HLA抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性(モチーフ)があり、HLA−A24抗原の場合、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちのN末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている(Immunogenetics, 41: 178,1995、J. Immunol., 152: p3913, 1994、J. Immunol., 155:4307,1994)。より好ましくは、当該モチーフは、N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンである。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も許容される可能性がある。
Here, “modification” of an amino acid residue means substitution, deletion, and / or addition of an amino acid residue (including addition of an amino acid to the N-terminus and C-terminus of a peptide). Substituent substitution is mentioned. In the modification related to amino acid residue substitution, the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as the activity as a tumor antigen peptide is maintained.
As described above, the sequence of the antigen peptide presented by binding to the HLA antigen has regularity (motif). In the case of the HLA-A24 antigen, the second peptide from the N-terminus of the peptide consisting of 8 to 11 amino acids. It is known that the amino acid is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan and the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (Immunogenetics, 41: 178,1995, J. Immunol., 152: p3913, 1994, J. Immunol., 155: 4307, 1994). More preferably, in the motif, the second amino acid from the N-terminus is phenylalanine, tyrosine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine or tryptophan. In addition, amino acid residues having properties similar to the amino acids that can be taken on the motif may be allowed.

従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の具体例としては、第2位および/またはC末端のアミノ酸を前記モチーフ上置換が可能なアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。ペプチドの長さは、HLA−A24抗原に結合して提示されるという観点から、8〜11アミノ酸程度が好ましい。   Therefore, as a specific example of the tumor antigen peptide derivative of the present invention, the amino acid at the 2nd position and / or the C terminal is substituted with an amino acid capable of substitution on the motif, and the tumor antigen peptide has activity as a tumor antigen peptide Derivatives. The length of the peptide is preferably about 8 to 11 amino acids from the viewpoint that it is presented by binding to the HLA-A24 antigen.

具体的には、配列番号:15に記載のアミノ酸配列の第2位のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかに置換し、および/またはC末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンのいずれかに置換したアミノ酸配列(配列番号:17)からなり、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。   Specifically, the amino acid at the second position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is substituted with any of phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and / or the C-terminal amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine or tryptophan. Another example is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) substituted with either methionine and having activity as a tumor antigen peptide.

本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと同様に、候補となるペプチドを前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを本発明のトランスジェニック動物に供して前記のHLA−A24拘束性CTL誘導活性に関して試験することにより、腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有するか否かを同定することができる。   Similar to the tumor antigen peptide of the present invention, the tumor antigen peptide derivative of the present invention is prepared by synthesizing a candidate peptide based on the peptide synthesis method, which is used for the transgenic animal of the present invention and the above-mentioned HLA-A24 restriction. By testing for sex CTL-inducing activity, it can be identified whether it has functionally equivalent properties as the tumor antigen peptide.

本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の実施例にも記載のようにCTLの誘導能を有するものであり、誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を発揮することができる。従って本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。本発明は、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の治療剤または予防剤を提供する。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤をHLA−A24陽性かつPSA陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA−A24抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が効果的に提示され、提示されたHLA−A24抗原複合体特異的CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。PSAは前立腺癌において高頻度に発現しているので、本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、特に前立腺癌に対して有効に使用される。   The tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof has an ability to induce CTL as described in Examples below, and the induced CTL has an antitumor effect through cytotoxicity and lymphokine production. Can be demonstrated. Therefore, the tumor antigen peptide or derivative thereof of the present invention can be used as an active ingredient of a therapeutic or prophylactic agent for tumors. The present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for tumors containing a tumor antigen peptide or a derivative thereof as an active ingredient. When the therapeutic or prophylactic agent for tumor of the present invention is administered to an HLA-A24 positive and PSA positive patient, the tumor antigen peptide or its derivative is effectively presented on the HLA-A24 antigen of the antigen-presenting cell, and the presented HLA -A24 antigen complex-specific CTL can proliferate and destroy tumor cells, thus allowing treatment or prevention of tumors. Since PSA is frequently expressed in prostate cancer, the therapeutic or preventive agent for tumors of the present invention is particularly effective for prostate cancer.

本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献(Clin. Microbiol.Rev., 7:277−289, 1994)に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。   The therapeutic or preventive agent for tumors of the present invention can be administered together with an adjuvant so that cellular immunity is effectively established, or can be administered in a particulate dosage form. As the adjuvant, those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied. In addition, a liposome preparation, a particulate preparation bound to beads having a diameter of several μm, a preparation bound to lipid, and the like are also conceivable. As the administration method, intradermal administration, subcutaneous administration, intravenous injection and the like can be considered. The dosage of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 1000 mg. More preferably, the dose is 0.1 mg to 10 mg, which is preferably administered once every several days to several months.

本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするDNAをも提供するものである。本発明のDNAは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列に基き、当業者であれば容易に合成することができる。本発明のDNAの好適な例としては、配列番号:15に記載のアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。   The present invention also provides a DNA encoding the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. The DNA of the present invention can be easily synthesized by those skilled in the art based on the amino acid sequence of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. Preferable examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.

このような本発明のDNAは、本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を製造する際に有効に用いられる。さらに以下に述べるように、本発明のDNAはCTLの誘導(腫瘍の治療又は予防)においても有効に用いることができる。   Such DNA of the present invention is effectively used in producing the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. Furthermore, as described below, the DNA of the present invention can also be used effectively in CTL induction (treatment or prevention of tumors).

すなわち近年、複数のCTLエピトープを連結させた、いわゆる"ポリトープ"をコードするDNAを、DNAワクチンに利用する手法が用いられている(例えば Journal of Immunology, 160,p1717,1998などを参照のこと)。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするDNAを少なくとも1種または2種以上連結させることにより、また場合によっては他の腫瘍抗原ペプチドをコードするDNAも連結させることにより作製されたDNA(以下、当該連結されたDNAを「組換えDNA」と称する)を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤(腫瘍の治療剤または予防剤)の有効成分とすることができる。また、前記の組換えDNAを治療剤または予防剤として用いるのみならず、当該組換えDNAを宿主細胞内で発現させて得られたポリペプチドも、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。   That is, in recent years, a technique of using DNA encoding a so-called “polytope” in which a plurality of CTL epitopes are linked to a DNA vaccine has been used (see, for example, Journal of Immunology, 160, p1717, 1998). . Accordingly, DNA prepared by linking at least one or more of the DNA encoding the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, and, in some cases, by linking DNA encoding another tumor antigen peptide. (Hereinafter, the ligated DNA is referred to as “recombinant DNA”) can be used as an active ingredient of a CTL inducer (tumor therapeutic or preventive agent) by incorporating it into an appropriate expression vector. In addition to using the above-mentioned recombinant DNA as a therapeutic or prophylactic agent, a polypeptide obtained by expressing the recombinant DNA in a host cell is also used as an active ingredient of a tumor therapeutic or prophylactic agent. be able to.

ここで「組換えDNA」は、DNA合成および通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い容易に作製することができる。また、この組換えDNAの発現ベクターへの組み込みも、前記基本書等に従い行うことができる。   Here, the “recombinant DNA” can be easily prepared according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) based on DNA synthesis and general genetic engineering techniques. In addition, this recombinant DNA can be incorporated into an expression vector in accordance with the above-mentioned basic manual.

作製された本発明の組換えDNAが、HLA−A24抗原と結合してCTLにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。   Whether the produced recombinant DNA of the present invention binds to the HLA-A24 antigen to produce a tumor antigen peptide that can be recognized by CTL can also be evaluated using the transgenic animal of the present invention.

本発明の組換えDNAを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。   When the recombinant DNA of the present invention is applied as a therapeutic or prophylactic agent for tumors, the following method can be used.

すなわち、本発明の組換えDNAを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法(日経サイエンス, 1994年4月号, 20−45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等)のいずれの方法も適用することができる。   That is, methods for introducing the recombinant DNA of the present invention into cells include viral vector methods and other methods (Nikkei Science, April 1994, pages 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23 -48 (1994), experimental medicine extra number, 12 (15), (1994), and cited references thereof, etc.) can be applied.

ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスに本発明のDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。   As a method using a viral vector, for example, the DNA of the present invention is incorporated into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a pox virus, a poliovirus, a simbis virus, or the like, and introduced. A method is mentioned. Of these, methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。   Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.

本発明の組換えDNAを実際に医薬として作用させるには、当該DNAを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でDNAを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある(日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等)。in vivo法がより好ましい。   In order for the recombinant DNA of the present invention to actually act as a medicine, an in vivo method in which the DNA is directly introduced into the body, and certain cells from human beings are collected and introduced into the cells outside the body. There is an ex vivo method to return it to the body (Nikkei Science, April 1994, 20-45 pages, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15), (1994) , And references cited therein). In vivo methods are more preferred.

in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の組換えDNAを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の組換えDNAを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。    When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a solution, but is generally an injection containing the recombinant DNA of the present invention, which is an active ingredient, and is used as necessary. May be added. Moreover, in the liposome or membrane fusion liposome (Sendai virus (HVJ) -liposome etc.) containing the recombinant DNA of the present invention, it should be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated freezing agent. Can do.

製剤中の本発明の組換えDNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の組換えDNAを、数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。   The content of the recombinant DNA of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 100 mg, preferably 0.001 mg to 10 mg of the present invention. Recombinant DNA is preferably administered once every few days to several months.

以上のような本発明の組換えDNAの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該組換えDNAに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明の組換えDNAは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。   By administering the recombinant DNA of the present invention as described above to a tumor patient, the polypeptide corresponding to the recombinant DNA is highly expressed in the antigen-presenting cells. Thereafter, individual tumor antigen peptides generated by intracellular degradation bind to HLA antigens to form a complex, and the complex is displayed at a high density on the surface of the antigen-presenting cell. Grows efficiently in the body and destroys tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved. The recombinant DNA of the present invention is particularly effective for treating or preventing prostate cancer.

また、前記組換えDNAを発現させることにより得られる「ポリペプチド」は、前記組換えDNAを適当な発現ベクター(例えばpSV−SPORT1など)に組み込みこんで作製された発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。また、当該ポリペプチドがHLA−A24抗原と結合してCTLにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。   The “polypeptide” obtained by expressing the recombinant DNA is obtained by introducing an expression plasmid prepared by incorporating the recombinant DNA into an appropriate expression vector (for example, pSV-SPORT1) into a host cell. Thus, a transformant is obtained, and the transformant can be expressed and produced by culturing the transformant in an appropriate medium. Examples of host cells include prokaryotes such as E. coli, unicellular eukaryotes such as yeast, and multicellular eukaryote cells such as insects and animals. Examples of methods for introducing genes into host cells include the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, and the electric pulse method. The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Whether the polypeptide binds to the HLA-A24 antigen to produce a tumor antigen peptide that can be recognized by CTL can also be evaluated using the transgenic animal of the present invention.

本発明のポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。本発明のポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明のポリペプチドは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。   When the polypeptide of the present invention is applied as a therapeutic or prophylactic agent for tumors, it can be administered by the same administration form, administration method and dosage as those of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. When the polypeptide of the present invention is administered to a tumor patient, it is taken up into antigen-presenting cells, and then each tumor antigen peptide generated by intracellular degradation binds to an HLA antigen to form a complex. The body is presented at high density on the surface of antigen-presenting cells, and CTLs specific for this complex grow efficiently in the body and destroy tumor cells. As described above, treatment or prevention of a tumor is achieved. The polypeptide of the present invention is particularly effective for treating or preventing prostate cancer.

本発明はまた、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞をも提供する。   The present invention also provides an antigen-presenting cell in which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof is presented.

後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により強い細胞傷害活性が認められたが、これは、トランスジェニック動物のリンパ節に本発明のペプチドとHLA−A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するCTLが誘導された結果に他ならない。このような、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法(DC療法)において有効に用いられる。   In the examples described later, strong cytotoxic activity was observed by stimulation with the peptide of the present invention. This was due to the antigen presenting the complex of the peptide of the present invention and the HLA-A24 antigen in the lymph node of the transgenic animal. Presenting cells are present, and this is none other than the result of inducing CTLs that specifically recognize the antigen-presenting cells. Such antigen-presenting cells in which a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof is presented are effectively used in cell therapy (DC therapy) as described below.

細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を体外でパルスして、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示可能なHLA−A24抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。   Antigen-presenting cells used in cell therapy are obtained by isolating cells having antigen-presenting ability from tumor patients, and pulsing the cells with the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof outside the body to produce HLA-A24 antigen and the present invention. It is produced by presenting a complex with a tumor antigen peptide or a derivative thereof on the cell surface. Here, the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell expressing the HLA-A24 antigen capable of presenting the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof on the cell surface. Dendritic cells that are said to be high are preferred.

また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、前記のようなペプチドの形態のみならず、本発明の組換えDNAまたはそのRNAの形態であっても、本発明のポリペプチドの形態であっても良い。   In addition, not only the peptide form as described above but also the recombinant DNA of the present invention or its RNA form may be pulsed to the cells having the antigen-presenting ability. Form may be sufficient.

本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明のポリペプチドを体外でパルスしてHLA−A24抗原と前記ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる(Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998、J. Immunol.,158: p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999)。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。   The antigen-presenting cell of the present invention is isolated from, for example, a cell having antigen-presenting ability from a tumor patient, and the cell is pulsed with the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, or the polypeptide of the present invention in vitro to produce HLA-A24. It is obtained by preparing a complex of an antigen and the peptide or a derivative thereof (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999). When using dendritic cells, for example, lymphocytes are isolated from the peripheral blood of tumor patients by Ficoll method, then non-adherent cells are removed, and adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to form dendritic cells. The antigen-presenting cell of the present invention can be prepared by inducing cells, culturing the dendritic cell with the tumor antigen peptide or polypeptide of the present invention, and pulsing.

また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の組換えDNAを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、 Cancer Res.,56:p5672,1996や J. Immunol., 161: p5607,1998などを参考にして行うことができる。また、DNAのみならずRNAの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、J. Exp. Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。   In addition, when preparing the antigen-presenting cell of the present invention by introducing the recombinant DNA of the present invention into a cell having the antigen-presenting ability, Cancer Res., 56: p5672,1996 and J. Immunol., 161: p5607,1998 can be used as a reference. Further, antigen-presenting cells can be similarly prepared not only in the form of DNA but also in the form of RNA. In this case, J. Exp. Med., 184: p465, 1996 can be used as a reference.

本発明は、前記抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤(腫瘍の治療剤)をも提供するものである。該治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。   The present invention also provides a CTL inducer (tumor therapeutic agent) containing the antigen-presenting cell as an active ingredient. The therapeutic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, etc. in order to stably maintain the antigen-presenting cells. Examples of the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. The dosage is exemplified by the dosage described in the literature.

前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、HLA−A24陽性かつPSA陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。本発明の抗原提示細胞は、特に前立腺癌の治療に有効である。   By returning the therapeutic agent to the body of the patient, specific CTL is efficiently induced in the body of the HLA-A24 positive and PSA positive patient, and the tumor can be treated. The antigen-presenting cell of the present invention is particularly effective for treating prostate cancer.

本発明はさらに、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体との複合体を認識するCTLをも提供する。本発明のCTLは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。   The present invention further provides a CTL that recognizes a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof. The CTL of the present invention is effectively used in the following adoptive immunotherapy.

すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤T細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている(J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159、1994)。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドTRP−2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている(J. Exp. Med.,185: 453, 1997)。これは、抗原提示細胞のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明の組換えDNAやポリペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。   That is, in melanoma, a therapeutic effect has been observed in adoptive immunotherapy in which a patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large amounts outside the body and then returned to the patient (J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159, 1994). In mouse melanoma, splenocytes were stimulated in vitro with tumor antigen peptide TRP-2, CTL specific for the tumor antigen peptide was propagated, and the CTL was administered to melanoma transplanted mice to suppress metastasis. Is recognized (J. Exp. Med., 185: 453, 1997). This is based on the result of in vitro growth of CTL that specifically recognizes a complex of an antigen-presenting cell HLA antigen and a tumor antigen peptide. Therefore, the tumor-specific CTL is increased by stimulating a patient's peripheral blood lymphocytes in vitro using the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof, or the recombinant DNA or polypeptide of the present invention. Therapies that return the patient to the patient are considered useful.

さらに本発明は、本発明のCTLを有効成分として含有する腫瘍の治療剤も提供する。該治療剤は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。   The present invention further provides a therapeutic agent for tumors containing the CTL of the present invention as an active ingredient. The therapeutic agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture medium, etc. in order to maintain CTL stably. Examples of the administration method include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. Moreover, as a dosage, the dosage of the said literature description is illustrated.

前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、HLA−A24陽性かつPSA陽性の患者の体内でCTLによる腫瘍細胞の傷害作用が効率的に促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のCTLは、特に前立腺癌の治療に有効である。   By returning the therapeutic agent to the body of the patient, the cytotoxic effect of the tumor cells by CTL is efficiently promoted in the body of the HLA-A24 positive and PSA positive patient, and the tumor is treated by destroying the tumor cells. be able to. The CTL of the present invention is particularly effective for the treatment of prostate cancer.

本発明の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料(例えば血液、腫瘍組織など)中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、RIA、ELISA、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。本発明の診断薬は、特に前立腺癌の診断において有効に用いられる。   The tumor antigen peptide and derivatives thereof of the present invention can also be used as an active ingredient of a diagnostic agent for diagnosing a tumor. That is, the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof itself is used as a diagnostic agent, and early detection of a tumor is detected by detecting the presence of an antibody in a sample (eg, blood, tumor tissue, etc.) obtained from a patient suspected of having a tumor. It is possible to diagnose recurrence and metastasis. Moreover, it can utilize also for selection of the tumor patient who can apply the medicine which uses the tumor antigen peptide of this invention, etc. as an active ingredient. Specifically, the diagnosis can be performed by using an immunoblot method, RIA, ELISA, fluorescence or luminescence measurement method or the like. The diagnostic agent of the present invention is effectively used particularly in the diagnosis of prostate cancer.

さらに近年、抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を用いて抗原特異的CTLを検出する新しい検出方法が確立された(Science,274:p94,1996)。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とHLA抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的CTLを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。   In recent years, a new detection method for detecting antigen-specific CTLs using a complex of an antigen peptide and an HLA antigen has been established (Science, 274: p94, 1996). Early detection, recurrence, and metastasis of a tumor can be diagnosed by using the complex of the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof and the HLA antigen for the detection method and detecting the tumor antigen-specific CTL. Further, it can be used for selection of a tumor patient to whom a medicine containing the tumor antigen peptide or the like of the present invention as an active ingredient can be applied, and determination of a therapeutic effect by the medicine. That is, the present invention also provides a tumor diagnostic agent containing the tumor antigen peptide of the present invention or a derivative thereof as part of an active ingredient.

具体的には、文献(Science,274:p94,1996)に記載の方法に従って蛍光標識したHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の4量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
Specifically, a tetramer of a complex of a fluorescently labeled HLA antigen and a tumor antigen peptide was prepared according to the method described in the literature (Science, 274: p94, 1996), and this was used to suspect a tumor. The above-mentioned diagnosis can be carried out by quantifying antigen peptide-specific CTL in peripheral blood lymphocytes using a flow cytometer.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.

HLA−A2402ゲノムDNA断片のクローニング
(1)HLA−A2402ゲノムDNA断片のクローニング
ヒトHLA−A2402ゲノムDNAをPCRクローニングするため、ヒト腫瘍細胞株RERF-LC-AI細胞(理研細胞バンク RCB0444)を培養し、Genomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham社製)を用い、添付のプロトコールに従い、ヒトゲノムDNAを精製した。次に、キメラHLA遺伝子の構築に必要なHLA−A2402ゲノムDNA配列についてGenBankデータベースにより調べたところ、Accession番号.Z72422が該当するものであったが、プロモーター領域(270bp)が登録されていないことが判明した。当該トランスジェニックマウスの作製には、プロモーター、エキソン1〜3、およびイントロン1〜3を必要とする。そこで、プロモーターを含むHLA−A2402ゲノムDNAのPCRクローニングにあたり、日本人に多いHLA−A2601のプロモーターのヌクレオチド配列(Accession番号.AB005048)を参考にHLA26−1F(5'-CCC AAG CTT ACT CTC TGG CAC CAA ACT CCA TGG GAT-3’, 36mer、配列番号:4)を上流プライマーとし、またイントロン3に含まれるヌクレオチド配列の一部を改変したもの、すなわちAccession番号.Z72422の5’末より1282番目をGからAに改変したA24−Bgl II 30(5’-CGG GAG ATC TAC AGG CGA TCA GGT AGG CGC-3’, 30mer、配列番号:5)を下流プライマーとして用いた。
Cloning of HLA-A2402 genomic DNA fragment (1) Cloning of HLA-A2402 genomic DNA fragment In order to PCR clone human HLA-A2402 genomic DNA, a human tumor cell line RERF-LC-AI cell (RIKEN cell bank RCB0444) was cultured. Human genomic DNA was purified using Genomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham) according to the attached protocol. Next, when the HLA-A2402 genomic DNA sequence necessary for the construction of the chimeric HLA gene was examined using the GenBank database, the Accession No. Although Z72422 was applicable, it was found that the promoter region (270 bp) was not registered. The production of the transgenic mouse requires a promoter, exons 1 to 3 and introns 1 to 3. Therefore, in PCR cloning of HLA-A2402 genomic DNA containing a promoter, HLA26-1F (5'-CCC AAG CTT ACT CTC TGG CAC with reference to the nucleotide sequence of HLA-A2601 promoter (Accession No. CAA ACT CCA TGG GAT-3 ′, 36mer, SEQ ID NO: 4) is used as an upstream primer, and a part of the nucleotide sequence contained in intron 3 is modified, that is, Accession No. A24-Bgl II 30 (5'-CGG GAG ATC TAC AGG CGA TCA GGT AGG CGC-3 ', 30mer, SEQ ID NO: 5) modified from G to A at the 1282nd position from the 5' end of Z72422 is used as a downstream primer. It was.

ここで、当該ヌクレオチド改変の理由は以下の通りである。すなわち、トランスジェニックマウスにおいて発現するキメラHLAが、エキソン1から3までをHLA−A2402、エキソン4から8までをH−2Kbによって構成されることを目的としており、このようなキメラHLAを作製するために、HLA−A2402ゲノムDNA上流よりイントロン3にコードされる制限酵素Bam HI部位までとH−2KbゲノムDNAのイントロン3より下流とを連結するため、HLA−A2402のイントロン3に人為的に制限酵素Bgl II部位を構築する必要があったからである。 Here, the reason for the nucleotide modification is as follows. That is, a chimeric HLA expressed in transgenic mice, the HLA-A2402 from exon 1 to 3, aims at a being constituted by H-2K b exons 4 to 8, to produce such a chimeric HLA for, for connecting the downstream intron 3 of HLA-A2402 genomic DNA restriction enzyme Bam until HI site and H-2K b genomic DNA upstream from the intron-encoded 3, artificially intron 3 of HLA-A2402 This is because it was necessary to construct a restriction enzyme Bgl II site.

次に、3’→5’のエキソヌクレアーゼ活性の高いNative Pfu DNA Polymerase(Stratagene社製)を用い、添付のプロトコールに従い、上記プライマーペアを用いてHLA−A2402ゲノムDNA断片のPCRクローニングを行った。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、66℃1分、および72℃4分を35サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後4℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Hind IIIおよびBam HI切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109(東洋紡社製)に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン(50μg/ml)含有LB寒天培地(1%バクトトリプトン、0.5%イーストエキストラクト、1%NaCl、2%寒天)で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。   Next, PCR cloning of the HLA-A2402 genomic DNA fragment was performed using the above primer pair using Native Pfu DNA Polymerase (Stratagene) with high 3 'to 5' exonuclease activity according to the attached protocol. After heat treatment at 95 ° C. for 45 seconds, PCR was repeated 35 cycles of 95 ° C. for 45 seconds, 66 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes, then reacted at 72 ° C. for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C. The amplified gene fragment was ligated to the restriction enzyme Hind III and Bam HI cleavage sites of the phagemid vector pBluescript to obtain a recombinant plasmid. This recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) by the heat shock method at 42 ° C., and LB agar medium containing ampicillin (50 μg / ml) coated with X-Gal and IPTG (1% bactotryptone, 0.5% yeast) A white Escherichia coli colony into which the recombinant plasmid had been introduced was identified with an extract (1% NaCl, 2% agar), and a transformant was selected.

(2)HLA−A2402プロモーター領域のヌクレオチド配列の決定
上記で得られた形質転換体の4個について、3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法(F.M.Ausubelら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.)により精製した。次に、ABI PRISMTM 377DNAシークエンシングシステム(PEバイオチステムズ社製)によりヌクレオチド配列を解析した。シーケンス解析用サンプルは、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PEバイオシステムズ社製)を用いて、添付プロトコールに従い、各クローンのシーケンスを解析した。その結果、すべてのクローンについてプロモーター領域を比較すると完全に一致していたことより、GenBankデータベースに登録されていないHLA−A2402のプロモーター領域のヌクレオチド配列が決定された。また、Accession番号.Z72422のヌクレオチド配列と各クローンを比較したところ、PCR変異はみられない正常な1個のクローンが存在していた。
(2) Determination of the nucleotide sequence of the HLA-A2402 promoter region After culturing overnight in 3 ml of ampicillin-containing LB medium for the four transformants obtained above, plasmid clones included in each transformant were It was purified by an alkali dissolution method (FM Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.). Next, the nucleotide sequence was analyzed by ABI PRISM 377 DNA sequencing system (manufactured by PE Biosystems). As a sequence analysis sample, the sequence of each clone was analyzed using the ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (manufactured by PE Biosystems) according to the attached protocol. As a result, when all the clones were compared in terms of the promoter region, the nucleotide sequence of the promoter region of HLA-A2402 that was not registered in the GenBank database was determined. Also, Accession number. When the nucleotide sequence of Z72422 was compared with each clone, there was one normal clone with no PCR mutation.

H−2K b ゲノムDNA断片のクローニング
(1)H−2KbゲノムDNA断片のクローニング
マウス腫瘍細胞株EL4細胞(ATCC T1B−39)を培養してマウスゲノムDNAを精製し、PCRクローニングに用いた。DNAの精製方法は、長鎖DNAの増幅に適するTaKaRa LA Taq TM(宝酒造社株式会社製)を用い、添付のプロトコールに従い実施した。次に、キメラHLA遺伝子の構築に必要なH−2Kb遺伝子配列についてGenBankデータベースにより調べたところ、2つに分断されて登録されていた。すなわち、Accession番号.v00746およびv00747である。v00746ではイントロン3の一部迄のH−2Kb上流をコードする1594bp領域が、一方、v00747ではイントロン7の一部迄のH−2Kb下流をコードする1837bp領域が登録されていた。v00746およびv00747により2つに分断されて登録されているイントロン3には制限酵素Bam HI部位が存在していなかったことにより、データベースに登録されているH−2Kb遺伝子は不完全長と推測された。
Cloning of H-2K b genomic DNA fragment (1) Cloning of H-2K b genomic DNA fragment Mouse tumor cell line EL4 cells (ATCC T1B-39) were cultured to purify mouse genomic DNA, and used for PCR cloning. The DNA purification method was carried out using TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) suitable for amplification of long-chain DNA according to the attached protocol. Then, it was examined by GenBank database for H-2K b gene sequences necessary for the construction of chimeric HLA gene, was registered is divided into two. That is, Accession number. v00746 and v00747. In v00746, the 1594 bp region encoding the H-2K b upstream to a part of intron 3 was registered, while in v00747, the 1837 bp region encoding the H-2K b downstream to a part of intron 7 was registered. By the v00746 and v00747 by intron 3 which is registered is divided into two by restriction enzyme Bam HI site is not present, H-2K b gene registered in the database are estimated to incomplete length It was.

H−2Kb遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在している(Cell., 25:683, 1981)。そこで、当該相同遺伝子と相同性が低く且つv00746のエキソン3にコードされるH−2KB F3(5’-CGC AGG CTC TCA CAC TAT TCA GGT GAT CTC-3’, 30mer、配列番号:6)を上流プライマーとし、また v00747の末端に制限酵素Eco RI部位を付加したH−2KB 3R(5’-CGG AAT TCC GAG TCT CTG ATC TTT AGC CCT GGG GGC TC-3’, 38mer、配列番号:7)を下流プライマーとして、TaKaRa LA Taq TM(宝酒造社株式会社製)を用いて添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムDNAを鋳型にPCR反応を実施した。当該PCRは、98℃10秒および66℃4分25サイクル繰り返したのち、68℃で10分反応させ、その後4℃に冷却した。 The H-2K b gene gene highly homologous false genes and homology exists (Cell, 25:. 683, 1981). Therefore, H-2KB F3 (5′-CGC AGG CTC TCA CAC TAT TCA GGT GAT CTC-3 ′, 30mer, SEQ ID NO: 6), which has low homology with the homologous gene and is encoded by exon 3 of v00746, is upstream. Downstream of H-2KB 3R (5'-CGG AAT TCC GAG TCT CTG ATC TTT AGC CCT GGG GGC TC-3 ', 38mer, SEQ ID NO: 7) with the restriction enzyme Eco RI site added to the end of v00747 as a primer A PCR reaction was performed using TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a primer and the purified mouse genomic DNA as a template according to the attached protocol. The PCR was repeated at 98 ° C. for 10 seconds and 66 ° C. for 4 minutes and 25 cycles, then reacted at 68 ° C. for 10 minutes, and then cooled to 4 ° C.

増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Kpn IおよびEco RI切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109(東洋紡社製)に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体3個を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含する組み換えプラスミドクローンを精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。3つの当該クローンのヌクレオチド配列とv00747のヌクレオチド配列を比較したところ、2クローンでそれぞれ別々に1ヶ所のPCR変異が、他方1クローンで3ヶ所のPCR変異がみられた。また、3クローン間では共通しているがv00747と異なるヌクレオチドが5ヶ所みられた。これらヌクレオチドはイントロン6と3’非翻訳領域に相当する領域にあった。更に、未登録のイントロン3領域においては、3クローン間で異なるPCR変異したヌクレオチドが1ヶ所みられた。これより、未登録領域のヌクレオチド配列部分を決定することができなかったため、3’→5’のエキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼを用いて未登録のイントロン3領域について再度クローニングを行い、ヌクレオチド配列の決定を行った。   The amplified gene fragment was ligated to the restriction enzyme Kpn I and Eco RI cleavage sites of the phagemid vector pBluescript by ligation to obtain a recombinant plasmid. This recombinant plasmid was introduced into E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) by a heat shock method at 42 ° C., and white E. coli colonies into which the recombinant plasmid was introduced were discriminated on an ampicillin-containing LB agar medium coated with X-Gal and IPTG. A transformant was selected. After three transformants were cultured overnight in 3 ml of LB medium containing ampicillin, recombinant plasmid clones included in each transformant were purified, and the sequence was analyzed. The method was performed as described above. When the nucleotide sequences of the three clones were compared with the nucleotide sequence of v00747, two clones showed one PCR mutation separately, and the other one showed three PCR mutations. In addition, 5 nucleotides different from v00747 were found in common among the 3 clones. These nucleotides were in the region corresponding to intron 6 and the 3 'untranslated region. Furthermore, in the unregistered intron 3 region, one nucleotide having a PCR mutation different among 3 clones was found. As a result, the nucleotide sequence portion of the unregistered region could not be determined. Therefore, the unregistered intron 3 region was cloned again using a polymerase having a high 3 '→ 5' exonuclease activity to determine the nucleotide sequence. Went.

(2)H−2Kbイントロン3のヌクレオチド配列の決定
未登録領域のヌクレオチド配列を決定するため、Native Pfu DNA Polymerase(Stratagene社製)を用い、添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムDNAを鋳型に未登録のイントロン3を含む領域についてPCRクローニングした。ここでは、v00746に登録されているH−2kb F5(5’-AGG ACT TGG ACT CTG AGA GGC AGG GTC TT-3’, 29mer、配列番号:8)を上流プライマーとして用い、またv00747に登録されているH-2kb 5R(5’-CAT AGT CCC CTC CTT TTC CAC CTG TGA GAA-3’, 30mer、配列番号:9)を下流プライマーとして用いた。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、68℃1分、および72℃4分を25サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後4℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Bam HIおよびBgl II切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109(東洋紡社製)に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体の5個について3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製し、ヌクレオチド配列を解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、解析したクローン間のイントロン3領域について比較すると、すべてのクローンで完全に一致していた。これよりイントロン3領域のヌクレオチド配列を決定することができた。未登録領域の制限酵素Bam HI部位よりv00747までは、463bpであることも判明した。
(2) Determination of the nucleotide sequence of H-2K b intron 3 To determine the nucleotide sequence of the unregistered region, use Native Pfu DNA Polymerase (Stratagene) and follow the attached protocol using the purified mouse genomic DNA as a template. PCR cloning was performed on the region containing unregistered intron 3. Here, H-2kb F5 (5′-AGG ACT TGG ACT CTG AGA GGC AGG GTC TT-3 ′, 29mer, SEQ ID NO: 8) registered in v00746 is used as an upstream primer, and also registered in v00747. H-2kb 5R (5′-CAT AGT CCC CTC CTT TTC CAC CTG TGA GAA-3 ′, 30mer, SEQ ID NO: 9) was used as a downstream primer. PCR was heat-treated at 95 ° C. for 45 seconds, followed by 25 cycles of 95 ° C. for 45 seconds, 68 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes. The amplified gene fragment was ligated to the restriction enzyme BamHI and BglII cleavage sites of the phagemid vector pBluescript to obtain a recombinant plasmid. This recombinant plasmid was introduced into E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) by a heat shock method at 42 ° C., and white E. coli colonies into which the recombinant plasmid was introduced were discriminated on an ampicillin-containing LB agar medium coated with X-Gal and IPTG. A transformant was selected. Five of these transformants were cultured overnight in 3 ml of ampicillin-containing LB medium, and then a plasmid clone included in each transformant was purified and the nucleotide sequence was analyzed. The method was performed as described above. As a result, when the intron 3 region between the analyzed clones was compared, all the clones were in perfect agreement. From this, the nucleotide sequence of the intron 3 region could be determined. It was also found that the region from the restriction enzyme Bam HI site in the unregistered region to v00747 was 463 bp.

(3)H−2KbゲノムDNAの構築
前記(2)で未登録領域のヌクレオチド配列が決定されたことにより、目的とするキメラHLA遺伝子の構築に必要なH−2KbゲノムDNAの全ヌクレオチド配列が決定された。その結果、前記(1)で得られた2種類のクローン、すなわち5’末端側にPCR変異の無い1つのクローン(H−2Kb#26)、及び3’末端側にPCR変異の無い1つクローン(H−2Kb#20)を組み合わせることにより、目的とするH−2KbゲノムDNAが構築できることが明らかとなった。そこで、これらクローンを制限酵素消化で切断したのち、PCR変異の無いそれぞれの領域を互いに組み合わせることにより、PCR変異の無いH−2KbゲノムDNAを構築した。構築方法の模式図を図1に示す。
(3) H-2K b genomic DNA of construct the by the nucleotide sequence of the unregistered region determined in (2), the entire nucleotide sequence of the H-2K b genomic DNA necessary for the construction of chimeric HLA gene of interest Was decided. As a result, the two types of clones obtained in the above (1), that is, one clone having no PCR mutation at the 5 ′ end (H-2K b # 26) and one having no PCR mutation at the 3 ′ end are shown. It became clear that the target H-2K b genomic DNA can be constructed by combining clones (H-2K b # 20). Therefore, after cutting these clones by restriction enzyme digestion, by combining the respective area without PCR mutagenesis together, it was constructed without H-2K b genomic DNA of PCR mutations. A schematic diagram of the construction method is shown in FIG.

両クローンを制限酵素Bgl II部位およびEco RI部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109(東洋紡社製)に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。3個の形質転換体を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法により精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、すべての形質転換体がPCR変異の無いH−2KbゲノムDNAをコードするプラスミドを含有することが明らかとなった。
なお、ここで得られたH−2KbゲノムDNAのヌクレオチド配列は、後述する配列番号:1に記載のヌクレオチド配列の第1551位以降の配列に相当するものである。
Both clones were cut at the restriction enzyme Bgl II site and Eco RI site and ligated by ligation to obtain a recombinant plasmid. This recombinant plasmid was introduced into E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) by a heat shock method at 42 ° C., and white E. coli colonies into which the recombinant plasmid was introduced were discriminated from ampicillin-containing LB agar medium coated with X-Gal and IPTG. A transformant was selected. After three transformants were cultured overnight in 3 ml of LB medium containing ampicillin, plasmid clones included in each transformant were purified by the alkaline lysis method, and the sequence was analyzed. The method was performed as described above. As a result, it was revealed that all transformants contained a plasmid encoding H-2K b genomic DNA without PCR mutation.
Incidentally, the nucleotide sequence of the H-2K b genomic DNA obtained here include the corresponding SEQ ID NO: corresponds to the first 1551 of subsequent sequences of nucleotide sequence set forth in 1.

キメラゲノムDNA(HLA−A2402/K b DNA)の構築
上記実施例1で得られたHLA−A2402ゲノムDNAを含有するプラスミド(HLA−A2402#1)を制限酵素Bgl II部位で切断し、また上記実施例2で得られたH−2KbのゲノムDNAを含有するプラスミド(H−2Kb#20/26)を制限酵素Bam HI部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。構築方法の模式図を図2に示す。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109(東洋紡社製)に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。10個の形質転換体を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製してシーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、3個の形質転換体が目的のキメラ遺伝子(HLA−A2402/Kb DNA、単にA2402/Kb DNAと略することもある)を有するプラスミドを含有することが明らかとなった。構築されたHLA−A2402/Kbのゲノム配列を配列番号:1に記載する。
Construction of chimeric genomic DNA (HLA-A2402 / K b DNA) The plasmid (HLA-A2402 # 1) containing HLA-A2402 genomic DNA obtained in Example 1 above was cleaved at the restriction enzyme BglII site, and cutting the plasmid (H-2K b # 20/ 26) containing genomic DNA of H-2K b obtained in example 2 with restriction enzyme Bam HI site to give the recombinant plasmid linked by ligation. A schematic diagram of the construction method is shown in FIG. This recombinant plasmid was introduced into E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) by a heat shock method at 42 ° C., and white E. coli colonies into which the recombinant plasmid was introduced were discriminated on an ampicillin-containing LB agar medium coated with X-Gal and IPTG. A transformant was selected. Ten transformants were cultured overnight in 3 ml of LB medium containing ampicillin, and then the plasmid clones included in each transformant were purified and sequenced. The method was performed as described above. As a result, it was revealed that the three transformants contained a plasmid having the target chimeric gene (HLA-A2402 / K b DNA, sometimes simply abbreviated as A2402 / K b DNA). The genomic sequence of the constructed HLA-A2402 / Kb is set forth in SEQ ID NO: 1.

キメラゲノムDNAのスプライシング解析
マウス腫瘍細胞株EL4細胞へ、遺伝子導入装置(島津製作所製)を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラHLA遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)をトランスフェクトした。2日後、トランスフェクトしたEL4細胞およびコントロールとして遺伝子導入していないEL4細胞より、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて添付のプロトコールに従って、トータルRNAを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム(GIBCO BRL社製)を用いて、添付プロトコールに従い、当該RNAの一部を鋳型にOligo(dT)12-18により逆転写反応を行いcDNAを合成した。更に、当該cDNAの一部を鋳型にNative Pfu DNA Polymerase(Stratagene社製)を用い、添付のプロトコールに従い、キメラ遺伝子を特異的にPCR増幅した。
このとき、上流プライマーとしてHLA−A2402遺伝子のエキソン1にコードされ且つH−2Kb遺伝子と相同性の低いChimera−F2(5’-CGA ACC CTC GTC CTG CTA CTC TC-3’, 23mer、配列番号:10)を、一方の下流プライマーとしてH−2Kb遺伝子のエキソン8にコードされ且つHLA−A2402遺伝子と相同性が低いChimera-R2(5’-AGC ATA GTC CCC TCC TTT TCC AC-3’, 23mer、配列番号:11)を用い、PCRは95℃45秒を熱処理した後、95℃45秒、53℃1分、および72℃2分を40サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後4℃に冷却した。
その結果、トランスフェクトしたEL4細胞においてのみ特異的に約1.1kbp遺伝子断片が増幅したことより、導入したキメラゲノムDNAはマウス細胞内で転写されたこと、すなわちHLAプロモーターが機能し、予想した部位でスプライシングされたmRNAが発現していることが予想された。次に、前記PCRの増幅断片をシークエンス解析した結果、予想通りのHLA−A2402/KbをコードするcDNAのヌクレオチド配列が決定された。当該HLA−A2402/KbのcDNAのヌクレオチド配列を配列番号:2に、またそのアミノ酸配列を配列番号:3に記載する。さらに、配列番号:1に記載のHLA−A2402/Kbのゲノム配列と配列番号:2に記載のcDNA配列とを並列に配して相互の位置関係を、図3A〜図3Pに示す。図中、上段は配列番号:1に記載のHLA−A2402/Kb ゲノム配列、下段は配列番号:2に記載のHLA−A2402/Kb cDNA配列を表している。
図3における配列相互の関係は以下の通りである。

Figure 2007289191
Splicing analysis of chimeric genomic DNA The mouse chimeric tumor cell line EL4 cells were transfected with the constructed chimeric HLA gene (HLA-A2402 / Kb gene) using a gene transfer device (manufactured by Shimadzu Corporation) according to the attached protocol. Two days later, total RNA was purified from the transfected EL4 cells and the EL4 cells into which no gene was introduced as a control, using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. Next, using a superscript choice system (manufactured by GIBCO BRL), according to the attached protocol, a reverse transcription reaction was performed with Oligo (dT) 12-18 using a part of the RNA as a template to synthesize cDNA. Furthermore, using the partial cDNA as a template, Native Pfu DNA Polymerase (Stratagene) was used, and the chimeric gene was specifically PCR amplified according to the attached protocol.
At this time, and is encoded in exon 1 of the HLA-A2402 gene as upstream primer H-2K b gene low homology Chimera-F2 (5'-CGA ACC CTC GTC CTG CTA CTC TC-3 ', 23mer, SEQ ID NO: : 10) as one downstream primer, Chimera-R2 (5′-AGC ATA GTC CCC TCC TTT TCC AC-3 ′, encoded by exon 8 of the H-2K b gene and having low homology with the HLA-A2402 gene, PCR was performed by heat treatment at 95 ° C for 45 seconds, followed by 40 cycles of 95 ° C for 45 seconds, 53 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes, followed by reaction at 72 ° C for 10 minutes. Then, it was cooled to 4 ° C.
As a result, the approximately 1.1 kbp gene fragment was specifically amplified only in the transfected EL4 cells, indicating that the introduced chimeric genomic DNA was transcribed in the mouse cells, that is, the HLA promoter functioned, and at the expected site. It was predicted that spliced mRNA was expressed. Next, as a result of sequence analysis of the amplified fragment of the PCR, the nucleotide sequence of cDNA encoding HLA-A2402 / Kb as determined was determined. The nucleotide sequence of the HLA-A2402 / Kb cDNA is described in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence thereof is described in SEQ ID NO: 3. Furthermore, the positional relationship between the genomic sequence of HLA-A2402 / Kb described in SEQ ID NO: 1 and the cDNA sequence described in SEQ ID NO: 2 is shown in FIGS. 3A to 3P. In the figure, the upper part represents the HLA-A2402 / Kb genomic sequence described in SEQ ID NO: 1, and the lower part represents the HLA-A2402 / Kb cDNA sequence described in SEQ ID NO: 2.
The relationship between the arrangements in FIG. 3 is as follows.
Figure 2007289191

マイクロインジェクション用DNA溶液の製造
構築したキメラHLA遺伝子をコードするプラスミド11μgを制限酵素Hind IIIとEco RI、更にベクターのみを切断する制限酵素Dra Iで消化した。1% SeaKem GTG(ニッポンジーン社製)ゲルで電気泳動したのち、キメラゲノムDNAを含有するゲル片を回収した。その後、Prep-A-Gene purificationキット(バイオ・ラッド社製)を用い、添付プロトコールに従い、導入遺伝子を精製し、1/10 TEバッファー(10mM Tris pH 8、0.1mM EDTA pH 8)に溶解することにより、マイクロインジェクション用DNA溶液を製造した。
Production of DNA solution for microinjection 11 μg of the plasmid encoding the constructed chimeric HLA gene was digested with restriction enzymes Hind III and Eco RI, and further with restriction enzyme Dra I which cleaves only the vector. After electrophoresis on a 1% SeaKem GTG (Nippon Gene) gel, the gel piece containing the chimeric genomic DNA was recovered. Then, using the Prep-A-Gene purification kit (Bio-Rad), purify the transgene according to the attached protocol and dissolve in 1/10 TE buffer (10 mM Tris pH 8, 0.1 mM EDTA pH 8). Thus, a DNA solution for microinjection was produced.

マウス受精卵への導入とトランスジェニックマウスの同定
C57BL/6系統マウス由来の受精卵を対象に構築したキメラ遺伝子のインジェクションを施行した。
C57BL/6系統マウス由来の受精卵を用いた理由は、C57BL/6系統マウスはクラスI分子としてH−2b系統を発現しており、HLA−A2402と同様な結合モチーフを有するH−2Kdを発現していないことによるものである。すなわち、当該C57BL/6系統のトランスジェニックマウスにHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスIによって当該ペプチドが細胞表面に提示されず、交差反応が起こらないという利点を有する。
Introduction into mouse fertilized eggs and identification of transgenic mice
Injection of a chimeric gene constructed for fertilized eggs derived from C57BL / 6 strain mice was performed.
The reason for using fertilized eggs derived from C57BL / 6 strain mice is that C57BL / 6 strain mice express H-2b strain as a class I molecule, and have H-2K d having the same binding motif as HLA-A2402. This is because it is not expressed. That is, even when an HLA-A24-restricted antigen peptide is administered to the C57BL / 6 strain of transgenic mice, the peptide is not presented on the cell surface by endogenous mouse class I, and no cross-reaction occurs. Have

第1回目のインジェクションでは、81個の受精卵を対象に施行し、4匹のレシピエントマウスに移植したが産出されなかった。第2回目のインジェクションでは、50個の受精卵を対象に施行し、2匹のレシピエントマウスに移植することにより4匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。第3回目のインジェクションでは101個の受精卵を対象に施行し、4匹のレシピエントマウスに移植することにより11匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。   In the first injection, 81 fertilized eggs were administered to the subjects and transplanted to 4 recipient mice, but they were not produced. In the second injection, 50 fertilized eggs were administered to the subjects, and 4 were produced by transplanting into 2 recipient mice, but all died before weaning. In the third injection, 101 fertilized eggs were administered to the subjects, and 11 were produced by transplanting into 4 recipient mice, but all died before weaning.

第4回目のインジェクションでは、168個の受精卵を対象に施行し、6匹のレシピエントマウスに移植することにより22匹が産出され、19匹が離乳した。その中の4匹、すなわち01-4、04-2、05-1、および05-6がトランスジェニックマウスとして同定されたが、01-4は奇形のため交配不可能で、05-6は離乳後まもなく死亡した。第5回目のインジェクションでは、221個の受精卵を対象に施行し、8匹のレシピエントマウスに移植することにより14匹が産出され、6匹が離乳した。その中の3匹、すなわち04-1、04-5、および04-6がトランスジェニックマウスとして同定された。第6回目のインジェクションでは、225個の受精卵を対象に施行し、8匹のレシピエントマウスに移植することにより13匹が産出され、9匹が離乳した。その中の3匹、すなわち10-5、14-1、および15-2がトランスジェニックマウスとして同定された。   In the fourth injection, 168 fertilized eggs were administered to the subjects, 22 were produced by transplanting into 6 recipient mice, and 19 were weaned. Four of them, 01-4, 04-2, 05-1, and 05-6, were identified as transgenic mice, but 01-4 was not mated due to malformation, and 05-6 was weaned Died shortly after. In the fifth injection, 221 fertilized eggs were administered to the subjects, 14 were produced by transplanting into 8 recipient mice, and 6 were weaned. Three of them, 04-1, 04-5, and 04-6, were identified as transgenic mice. In the sixth injection, 225 fertilized eggs were administered to the subjects, 13 were produced by transplanting into 8 recipient mice, and 9 were weaned. Three of them, namely 10-5, 14-1, and 15-2, were identified as transgenic mice.

ここでトランスジェニックマウスの同定は、HLA−A2402遺伝子のクローニングで使用したプライマー、すなわちHLA26-1F(配列番号:4)およびA24-Bgl II 30(配列番号:5)を用いて尾DNA調整物を鋳型にTaKaRa LA Taq TM(宝酒造社株式会社製)を用い、添付のプロトコールに従ってPCRを行い、1%アガロースゲル電気泳動を行い、1.5kbpの大きさのDNAバンドがみられるマウスを選別することにより行った。 Here, the identification of the transgenic mouse was carried out by using the primers used in the cloning of the HLA-A2402 gene, that is, the tail DNA preparation using HLA26-1F (SEQ ID NO: 4) and A24-Bgl II 30 (SEQ ID NO: 5). By using TaKaRa LA Taq TM (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a template, PCR is performed according to the attached protocol, 1% agarose gel electrophoresis is performed, and a mouse with a DNA band of 1.5 kbp is selected. went.

トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子産物の発現
実施例6で作出された8ライン、すなわち04-2、05-1、04-1、04-5、04-6、10-5、14-1、および15-2由来のトランスジェニックマウスより、J.E.Coliganlら編、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.の記載に従い脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。トランスジェニックマウス脾細胞における導入遺伝子由来のタンパク質であるHLA−A2402/Kbの細胞表面発現は、フローサイトメトリー法により解析した。このとき、C57BL/6系統マウスより調整した脾細胞をコントロールとして用いた。具体的には、5×106個の脾細胞をモノクローナルなFITC標識抗HLA抗体B9.12.1(Immunotech社製)で染色した。また、モノクローナルなFITC標識抗H-2Kb抗体AF6-88.5(Pharmingen社製)で内因性のマウスクラスIを染色した。
その結果、5ライン、すなわち04-1、04-5、10-5、14-1、および15-2でHLAクラスI特異的な発現がみられ、このうち04-1ラインのみが、繁殖能を有するラインであることが明らかとなった。一方、他の3ライン、すなわち04-6、04-2、および05-1ラインではHLAクラスI特異的な発現はみられなかった。以上により、8ラインのトランスジェニックマウスが作出されたが、クラスIの発現様式であり且つホモ化を達成したのは04-1ラインのみであった。
Expression of the transgene product in transgenic mice The eight lines generated in Example 6, ie, 04-2, 05-1, 04-1, 04-5, 04-6, 10-5, 14-1, and 15 The spleen was excised from the transgenic mouse derived from -2 according to the description of JEColiganl et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons, Inc., and the spleen cells were collected. Cell surface expression of HLA-A2402 / Kb , which is a transgene-derived protein in transgenic mouse spleen cells, was analyzed by flow cytometry. At this time, splenocytes prepared from C57BL / 6 strain mice were used as controls. Specifically, 5 × 10 6 splenocytes were stained with monoclonal FITC-labeled anti-HLA antibody B9.12.1 (manufactured by Immunotech). The stained endogenous mouse class I monoclonal FITC-labeled anti-H-2K b antibodies AF6-88.5 (Pharmingen Co.).
As a result, HLA class I-specific expression was observed in 5 lines, that is, 04-1, 04-5, 10-5, 14-1, and 15-2. It was revealed that the line had On the other hand, HLA class I specific expression was not observed in the other three lines, ie, the 04-6, 04-2, and 05-1 lines. By the above, 8 lines of transgenic mice were produced, but only the 04-1 line was the class I expression mode and achieved homogenization.

HLA−A2402を発現する形質転換細胞の樹立
前記で作製されたトランスジェニックマウスにおけるCTL誘導能の評価のために、HLA−A2402/Kbを安定に発現する形質転換細胞、Jurkat-A2402/Kb細胞を樹立した。
(1)発現ベクターの構築
Tgマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い、添付のプロトコールに従って、トータルRNAを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム(GIBCO BRL社製)を用いて、添付プロトコールに従い、当該RNAの一部を鋳型にOligo(dT)12-18により逆転写反応を行いcDNAを合成した。更に、当該cDNAの一部を鋳型にLA-PCRキット(宝酒造社製)を用い、添付のプロトコールに従った。このとき、上流プライマーとしてchi.PF1(5’-CCC AAG CTT CGC CGA GGA TGG CCG TCA TGG CGC CCC GAA-3’、配列番号:12)を、一方の下流プライマーとしてchi.PR1(5’-CCG GAA TTC TGT CTT CAC GCT AGA GAA TGA GGG TCA TGA AC-3’、配列番号:13)を用いた。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、60℃1分、および68℃2分を25サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後4℃に冷却した。PCR増幅遺伝子を発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen社製)に導入することにより、HLA−A2402/Kbをコードする発現ベクターを構築した。
Establishment of transformed cells expressing HLA-A2402 For the evaluation of CTL inducibility in the transgenic mice prepared above, a transformed cell stably expressing HLA-A2402 / Kb , Jurkat-A2402 / Kb Cells were established.
(1) Construction of expression vector
Spleens were removed from Tg mice and spleen cells were prepared. Total RNA was purified using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. Next, using a superscript choice system (manufactured by GIBCO BRL), according to the attached protocol, a reverse transcription reaction was performed with Oligo (dT) 12-18 using a part of the RNA as a template to synthesize cDNA. Further, an LA-PCR kit (Takara Shuzo) was used with a part of the cDNA as a template, and the attached protocol was followed. At this time, chi.PF1 (5′-CCG) was used as an upstream primer, chi.PF1 (5′-CCC AAG CTT CGC CGA GGA TGG CCG TCA TGG CGC CCC GAA-3 ′, SEQ ID NO: 12) as one downstream primer. GAA TTC TGT CTT CAC GCT AGA GAA TGA GGG TCA TGA AC-3 ′, SEQ ID NO: 13) was used. PCR was heat-treated at 95 ° C. for 45 seconds, followed by 25 cycles of 95 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 1 minute, and 68 ° C. for 2 minutes. An expression vector encoding HLA-A2402 / Kb was constructed by introducing the PCR amplified gene into the expression vector pcDNA3.1 (+) (manufactured by Invitrogen).

(2)Jurkat細胞への導入
10ugの上記ベクターを制限酵素Pvu Iで消化することにより、直線化した。次に、Jurkat細胞(ATCC T1B-152)5×106個について、遺伝子導入装置(GIBCO BRL社製)を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラHLA遺伝子をトランスフェクトした。96穴プレートに0.5cell/wellで播種し、0.6mg/mlのGeneticin含有培地で培養した。その結果、6穴中(6クローン)にて細胞の増殖が確認された(A-2、A-4、A-6、A-9、A-10、A-11)。これらの中で、A-10において導入遺伝子の発現が最も高かったことより、当クローンをJurkat-A2402/Kb細胞として樹立した。
(2) Introduction into Jurkat cells
Ten ug of the vector was linearized by digestion with the restriction enzyme PvuI. Next, 5 × 10 6 Jurkat cells (ATCC T1B-152) were transfected with the constructed chimeric HLA gene using a gene transfer apparatus (GIBCO BRL) according to the attached protocol. A 96-well plate was seeded at 0.5 cell / well and cultured in a 0.6 mg / ml Geneticin-containing medium. As a result, cell proliferation was confirmed in 6 holes (6 clones) (A-2, A-4, A-6, A-9, A-10, A-11). Among these, this clone was established as Jurkat-A2402 / K b cells because the transgene expression was highest in A-10.

トランスジェニックマウスにおけるCTL誘導能試験
ヒト癌抗原HER-2/neuは乳癌、卵巣癌、および肺癌で過剰発現していることで知られ、当該抗原由来ペプチドによってHLA−A24陽性健常人末梢血から特異的CTLを誘導できることが、イン・ビトロ試験により明らかにされている(Int.J.Cancer., 87:553, 2000)。
CTL Inducibility Test in Transgenic Mice Human cancer antigen HER-2 / neu is known to be overexpressed in breast cancer, ovarian cancer, and lung cancer, and specific from HLA-A24 positive healthy peripheral blood by the antigen-derived peptide It has been shown by in vitro tests that inducible CTL can be induced (Int. J. Cancer., 87: 553, 2000).

そこで、当該ヒト癌抗原由来のHLA−A24拘束性ペプチドHER-2/neu780-788(配列番号:14)を、破傷風毒素由来のマウスMHCクラスIIのI-Ab拘束性ヘルパーペプチド(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、ヒトの場合と同様に特異的CTLを誘導し得るか調べた。すなわち、DMSOによりHER-2/neu780-788を40mg/mlに、またヘルパーペプチドを20mg/mlに調整し、生理食塩水で2mg/ml及び1mg/mlに希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量の不完全フロイントアジュバント(和光純薬株式会社製)と混合することによりwater-in-oilエマルションを作製した。200μlの当該薬剤をトランスジェニックマウス(04-1ライン)の尾の皮下に免疫した。実験開始7日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ACKバッファー(0.15M NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA,pH7.2-7.4)にて溶血処理した脾細胞の一部をX線照射(2,000 rad)した後、前記ペプチドを100μg/mlで1時間パルスして0.7×106個/wellで24穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの7×106個/wellの脾細胞を同時に加えて37℃下で再刺激を施行した(ペプチド終濃度1μg/ml)。培養液には、RPMI1640培地に10%FCS、10mM HEPES、20mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM MEM非必須アミノ酸、1%MEMビタミン、55μM 2-メルカプトエタノールを含む培養液(CTM培養液)を10ml用い、6日間イン・ビトロ刺激した。 Therefore, the HLA-A24-restricted peptide HER-2 / neu 780-788 (SEQ ID NO: 14) derived from the human cancer antigen was used together with the mouse MHC class II IA b- restricted helper peptide (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) derived from tetanus toxin. Transgenic mice were immunized and examined to be able to induce specific CTLs as in humans. That is, HER-2 / neu 780-788 was adjusted to 40 mg / ml by DMSO and helper peptide was adjusted to 20 mg / ml, and diluted to 2 mg / ml and 1 mg / ml with physiological saline. Next, a water-in-oil emulsion was prepared by mixing with an equal amount of incomplete Freund's adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) using a glass syringe. 200 μl of the drug was immunized subcutaneously in the tail of transgenic mice (line 04-1). Seven days after the start of the experiment, the spleen was removed and scraped with a frosted portion of a slide glass to collect and prepare spleen cells. A portion of the splenocytes treated with ACK buffer (0.15M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 , 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4) was irradiated with X-rays (2,000 rad), and then the peptide was 100 μg / ml And then seeded in a 24-well plate at 0.7 × 10 6 cells / well. At this time, 7 × 10 6 spleen cells of non-irradiated / non-peptide pulses were simultaneously added and restimulation was performed at 37 ° C. (final peptide concentration 1 μg / ml). Culture medium containing 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM MEM non-essential amino acid, 1% MEM vitamin, 55 μM 2-mercaptoethanol in RPMI1640 medium (CTM culture medium) Was stimulated in vitro for 6 days.

他方、実施例8で作製したJurkat-A2402/Kb細胞を 3.7MBq/106個で51Crラベル後、前記ペプチドを100μg/mlで1時間パルスした。(ラベル時間2時間、ラベル開始1時間後にペプチドを終濃度100μg/ml添加)。また、ペプチド非パルスの細胞をコントロール標的細胞として調製した。 On the other hand, Jurkat-A2402 / Kb cells prepared in Example 8 were labeled with 51 MB by 3.7 MBq / 10 6 cells, and then the peptide was pulsed at 100 μg / ml for 1 hour. (The labeling time was 2 hours, and the peptide was added at a final concentration of 100 μg / ml 1 hour after the start of labeling) In addition, non-peptide-pulsed cells were prepared as control target cells.

当該Jurkat-A2402/Kbを標的細胞とし、先に調製されたトランスジェニックマウス脾細胞調製物を添加して、CTLの誘導能を51Crリリースアッセイ(J. Immunol., 159: 4753, 1997)により測定した。結果を図4に示す。結果として、HER-2/neu780-788で刺激することにより、特異的なCTLの誘導が認められた。
さらに、前記HER-2/neu780-788と同様にHLA−A24拘束性癌抗原ペプチドであることが知られているMAGE-3195-203(配列番号:18)、CEA652-660(配列番号:19)、及びCEA268-277(配列番号:20)を用いて、前記と同様のCTL誘導能試験を行った。結果を図5〜図7に示す。結果として、これら既知のHLA−A24拘束性癌抗原ペプチドで刺激することにより、特異的なCTLの誘導が認められた。
以上の結果から、本発明のHLA−A24トランスジェニックマウスは、HLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなった。
Using the Jurkat-A2402 / Kb as a target cell, the previously prepared transgenic mouse spleen cell preparation was added, and the CTL inducibility was determined by 51 Cr release assay (J. Immunol., 159: 4753, 1997) It was measured by. The results are shown in FIG. As a result, specific induction of CTL was observed by stimulation with HER-2 / neu 780-788 .
Furthermore, as with the HER-2 / neu 780-788 , MAGE-3 195-203 (SEQ ID NO: 18) and CEA 652-660 (SEQ ID NO: 18), which are known to be HLA-A24-restricted cancer antigen peptides. : 19) and CEA 268-277 (SEQ ID NO: 20), the same CTL inducing ability test as described above was performed. The results are shown in FIGS. As a result, specific induction of CTL was observed by stimulation with these known HLA-A24-restricted cancer antigen peptides.
From the above results, it was revealed that the HLA-A24 transgenic mouse of the present invention is a human model animal that can evaluate HLA-A24-restricted tumor antigen proteins and tumor antigen peptides.

癌抗原PSA由来ペプチドによるCTL誘導
本発明のHLA−A24トランスジェニックマウスを用いてHLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドをin vivoで評価できることが明らかとなったため、当該マウスを用いて、腫瘍抗原ペプチドとして未同定のペプチドの評価を行った。実験にはヒト癌抗原PSA由来のペプチドを用いた。なおPSA由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド領域に関しては、これまで何ら報告されていない。
CTL induction by cancer antigen PSA-derived peptide Since it became clear that HLA-A24-restricted tumor antigen protein and tumor antigen peptide can be evaluated in vivo using the HLA-A24 transgenic mouse of the present invention, An unidentified peptide was evaluated as a tumor antigen peptide. In the experiment, a peptide derived from human cancer antigen PSA was used. In addition, nothing has been reported so far regarding the PSA-derived HLA-A24-restricted tumor antigen peptide region.

まず、PSAタンパク質のアミノ酸配列中のヒトHLA−A24結合モチーフ(第2位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン)に一致する配列を検索し、9アミノ酸あるいは10アミノ酸よりなる2種の配列(PSA152-160:配列番号:15、PSA248-257:配列番号:16)を同定した。なお、PSA152-160はPSAアミノ酸配列の上の第152-160位、PSA248-257は第248-257位の部分に該当するものである。 First, it matches the human HLA-A24 binding motif (the second amino acid is tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan, and the C-terminal amino acid is phenylalanine, tryptophan, leucine, isoleucine or methionine) in the amino acid sequence of the PSA protein. The sequence was searched, and two types of sequences consisting of 9 amino acids or 10 amino acids (PSA 152-160 : SEQ ID NO: 15, PSA 248-257 : SEQ ID NO: 16) were identified. PSA 152-160 corresponds to the position 152-160 above the PSA amino acid sequence, and PSA 248-257 corresponds to the position 248-257.

PSA152-160またはPSA248-257の腫瘍抗原性について、実施例7で作製した04-1ライン由来HLA−A2402/Kbトランスジェニックマウスを利用することにより解析した。PSA152-160またはPSA248-257を破傷風毒素由来のマウスMHCクラスIIのI-Ab拘束性ヘルパーペプチド(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、実施例9と同様の手法によりCTLの誘導能を測定した。図8にPSA152-160によるCTL誘導結果を、また図9にPSA248-257によるCTL誘導結果を示す。結果として、PSA152-160において特異的なCTLの誘導がみられたが、PSA248-257では特異的なCTLの誘導はみられなかった。これより、PSA152-160はイン・ビボで腫瘍抗原性を有すること、すなわちHLA−A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドであることが明らかになった。また、上記の結果は、HLA−A24タイプの結合モチーフを有するペプチドが必ずしもin vivoで免疫原性を有するとは限らず、本発明方法が、活性なペプチドの同定に有用であることを示している。 The tumor antigenicity of PSA 152-160 or PSA 248-257 was analyzed by using the HLA-A2402 / Kb transgenic mouse derived from the 04-1 line prepared in Example 7. PSA 152-160 or PSA 248-257 was immunized with the mouse MHC class II IA b- restricted helper peptide (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) derived from tetanus toxin, and the ability to induce CTL was obtained in the same manner as in Example 9. It was measured. The CTL induction results by PSA 152-160 in FIG. 8, also shows the CTL induction results by PSA 248-257 in FIG. As a result, although the induction of specific CTL was seen in PSA 152-160, induction of PSA 248-257 In specific CTL were observed. This revealed that PSA 152-160 has tumor antigenicity in vivo, that is, it is a tumor antigen peptide restricted by HLA-A24. In addition, the above results indicate that peptides having an HLA-A24 type binding motif are not necessarily immunogenic in vivo, and that the method of the present invention is useful for identification of active peptides. Yes.

配列表フリーテキスト
配列番号:1に記載のヌクレオチド配列の第1位から第1550位までの領域はヒト由来であり、第1551位から第3587位までの領域はマウス由来である。
配列番号:2に記載のヌクレオチド配列の第1位から第618位までの領域はヒト由来であり、第619位から第1119位までの領域はマウス由来である。
配列番号:3に記載のアミノ酸配列の第1位から第206位までの領域はヒト由来であり、第207位から第372位までの領域はマウス由来である。
配列番号:4に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:5に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:6に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:7に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:8に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:9に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:10に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:11に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:12に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:13に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号:17に記載のアミノ酸配列の第2番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第9番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
The region from the 1st position to the 1550th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is derived from human, and the region from the 1551th position to the 3587th position is derived from a mouse.
The region from position 1 to position 618 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is derived from human, and the region from position 619 to position 1119 is derived from mouse.
The region from the 1st position to the 206th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is derived from human, and the region from the 207th position to the 372nd position is derived from a mouse.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 10 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is a PCR primer.
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 is a PCR primer.
The second amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and the ninth amino acid is phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.

本発明のキメラ遺伝子(HLA−A2402/Kb遺伝子)の作製に用いたH-2KbゲノムDNAの構築方法を示す模式図である。It is a schematic view showing a construction method of the H-2K b genomic DNA used in the production of chimeric gene (HLA-A2402 / K b gene) of the present invention. 本発明のキメラ遺伝子であるHLA−A2402/Kb遺伝子の構築方法を示す模式図である。HLA−A2402ゲノムDNAを含有するプラスミド(HLA−A2402#1)を制限酵素Bgl II部位で切断し、これにH-2KbのゲノムDNAを含有するプラスミド(H-2Kb#20/26)を制限酵素Bam HI部位で切断して切り出したBamHIフラグメントをライゲーションにより連結して組み換えプラスミドHLA−A2402/Kbを構築した。なお、non-A2402/Kbは、Bgl II切断プラスミドプラスミド(HLA−A2402#1)に、H-2Kb#20/26のBamHIフラグメントが逆向きに連結されて生じたプラスミドである。It is a schematic diagram which shows the construction method of HLA-A2402 / Kb gene which is a chimeric gene of this invention. A plasmid containing HLA-A2402 genomic DNA (HLA-A2402 # 1) was cleaved at the restriction enzyme Bgl II site, and a plasmid containing H-2K b genomic DNA (H-2K b # 20/26) was cut into the plasmid. Recombinant plasmid HLA-A2402 / Kb was constructed by ligating BamHI fragments excised by cutting at the restriction enzyme BamHI site by ligation. Incidentally, non-A2402 / K b is the Bgl II cleavage plasmid plasmid (HLA-A2402 # 1), BamHI fragment of H-2K b # 20/26 is a plasmid resulting coupled reversed. 図3A〜図3Pは、配列番号:1に記載のHLA−A2402/Kb ゲノム配列と配列番号:2に記載のHLA−A2402/Kb cDNA配列の位置関係を示した図である。3A to 3P are diagrams showing the positional relationship between the HLA-A2402 / Kb genomic sequence described in SEQ ID NO: 1 and the HLA-A2402 / Kb cDNA sequence described in SEQ ID NO: 2. HLA-24拘束性のヒト癌抗原HER−2/neu由来の抗原ペプチド(HER2/neu780-788)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTLが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。実験には、抗原ペプチドHER2/neu780-788で免疫したHLA−A24発現トランスジェニックマウスの脾細胞を該ペプチドでパルスして得たマウス脾細胞調製物を試料として用いた。標的細胞として、本発明のキメラ遺伝子HLA−A2402/Kbによる形質転換細胞Jurkat−A2402/Kb細胞を51Crで標識し、上記ペプチドでパルスしたもの(pep+)を用いた。また、コントロールとしてペプチド非パルス標的細胞(pep-)を用いた。HLA-24-restricted human cancer antigen HER-2 / neu-derived antigenic peptide (HER2 / neu 780-788 ) is used to immunize the HLA-A24-expressing transgenic mice of the present invention, and to induce specific CTLs. It is the shown graph. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, pep + shows the results using peptide-pulsed target cells, and pep- shows the results using peptide non-pulsed cells. In the experiment, a mouse spleen cell preparation obtained by pulsing spleen cells of HLA-A24-expressing transgenic mice immunized with the antigen peptide HER2 / neu 780-788 with the peptide was used as a sample. As a target cell, a Jurkat-A2402 / Kb cell transformed with the chimeric gene HLA-A2402 / Kb of the present invention labeled with 51 Cr and pulsed with the above peptide (pep + ) was used. In addition, peptide non-pulsed target cells (pep ) were used as controls. HLA−A24拘束性の癌抗原MAGE−3由来の抗原ペプチド(MAGE−3195-203)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTLが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。 試料及び標的細胞の調製法は図4に関して記載した方法と同様である。Graph showing that HLA-A24-expressing transgenic mice of the present invention were immunized with an antigen peptide derived from HLA-A24-restricted cancer antigen MAGE-3 (MAGE-3 195-203 ), and that specific CTLs were induced It is. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, the white bars show the results using peptide-pulsed target cells, and the black bars show the results using peptide non-pulsed cells. Sample and target cell preparation is similar to that described for FIG. HLA−A24拘束性の癌抗原CEA由来の抗原ペプチド(CEA652-660)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTLが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。 試料及び標的細胞の調製法は図4に関して記載した方法と同様である。It is the graph which immunized the HLA-A24 expression transgenic mouse of this invention with the antigen peptide (CEA 652-660 ) derived from the cancer antigen CEA restricted to HLA-A24 and induced specific CTL. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, the white bars show the results using peptide-pulsed target cells, and the black bars show the results using peptide non-pulsed cells. Sample and target cell preparation is similar to that described for FIG. HLA−A24拘束性の癌抗原CEA由来の抗原ペプチド(CEA268-277)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTLが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。 試料及び標的細胞の調製法は図4に関して記載した方法と同様である。It is the graph which showed that the HLA-A24 expression transgenic mouse of this invention was immunized with the antigen peptide ( CEA268-277 ) derived from the HLA-A24 restriction | limiting cancer antigen CEA, and specific CTL was induced | guided | derived. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, the white bars show the results using peptide-pulsed target cells, and the black bars show the results using peptide non-pulsed cells. Sample and target cell preparation is similar to that described for FIG. ヒト癌抗原PSAタンパク質から、ヒトHLA−A24結合モチーフ情報に基づいて得たPSA由来の抗原ペプチド(PSA152-160)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTLが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。 試料及び標的細胞の調製法は図4に関して記載した方法と同様である。HLA-A24-expressing transgenic mice of the present invention are immunized with a PSA-derived antigenic peptide (PSA 152-160 ) obtained from human cancer antigen PSA protein based on human HLA-A24 binding motif information, and specific CTLs are induced It is the graph which showed having been done. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, pep + shows the results using peptide-pulsed target cells, and pep- shows the results using peptide non-pulsed cells. Sample and target cell preparation is similar to that described for FIG. ヒト癌抗原PSAタンパク質から、ヒトHLA−A24結合モチーフ情報に基づいて得たPSA由来の抗原ペプチド(PSA248-257)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫しても特異的CTLが誘導されなかったことを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性(% Specific Lysis)を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。 試料及び標的細胞の調製法は図4に関して記載した方法と同様である。Even when immunizing the HLA-A24-expressing transgenic mouse of the present invention with a PSA-derived antigenic peptide (PSA 248-257 ) obtained from the human cancer antigen PSA protein based on the human HLA-A24 binding motif information, specific CTLs can be obtained. It is the graph which showed that it was not induced | guided | derived. In the figure, the vertical axis indicates cytotoxic activity (% Specific Lysis), and the horizontal axis indicates the name of each transgenic mouse. In the figure, pep + shows the results using peptide-pulsed target cells, and pep- shows the results using peptide non-pulsed cells. Sample and target cell preparation is similar to that described for FIG.

Claims (15)

以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法:
(a) 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(b) 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列、
(c) 配列番号:1に記載のヌクレオチド配列、
(d) 前記(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、当該DNAのヌクレオチド配列。
A test substance is administered to a transgenic mouse introduced with a gene containing any one of the following nucleotide sequences (a) to (d), and whether or not CTL specific to the test substance is induced is measured. A screening method for an antigen-specific CTL inducer, characterized by comprising:
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(B) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleotide sequence according to any of (a) to (c), and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen A nucleotide sequence of the DNA which binds to a peptide and has a CTL inducing ability.
以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法:
(a) 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(b) 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列、
(c) 配列番号:1に記載のヌクレオチド配列、
(d) 前記(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、当該DNAのヌクレオチド配列。
A test substance is administered to a transgenic mouse introduced with a gene containing any one of the following nucleotide sequences (a) to (d), and whether or not CTL specific to the test substance is induced is measured. A screening method for a therapeutic or prophylactic agent for tumor or viral infection, characterized by comprising:
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(B) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleotide sequence according to any of (a) to (c), and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen A nucleotide sequence of the DNA which binds to a peptide and has a CTL inducing ability.
以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスから単離された細胞に被験物質を添加し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法:
(a) 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(b) 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列、
(c) 配列番号:1に記載のヌクレオチド配列、
(d) 前記(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、当該DNAのヌクレオチド配列。
A test substance is added to cells isolated from a transgenic mouse into which a gene containing a nucleotide sequence of any of the following (a) to (d) is introduced, and CTL specific for the test substance is induced. A method for screening an antigen-specific CTL inducer, characterized by measuring or evaluating whether or not:
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(B) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleotide sequence according to any of (a) to (c), and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen A nucleotide sequence of the DNA which binds to a peptide and has a CTL inducing ability.
以下の(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスから単離された細胞に被験物質を添加し、当該被験物質に特異的なCTLが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法:
(a) 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(b) 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列、
(c) 配列番号:1に記載のヌクレオチド配列、
(d) 前記(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、当該DNAのヌクレオチド配列。
A test substance is added to cells isolated from a transgenic mouse into which a gene containing a nucleotide sequence of any of the following (a) to (d) is introduced, and CTL specific for the test substance is induced. A method for screening a therapeutic or prophylactic agent for tumors or viral infections, comprising measuring or evaluating whether or not:
(A) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
(B) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the nucleotide sequence according to any of (a) to (c), and the expression product of the DNA is an HLA-A24-restricted antigen A nucleotide sequence of the DNA which binds to a peptide and has a CTL inducing ability.
マウスがC57BL/6系統のマウスである、請求項1〜4のいずれかに記載のスクリーニング方法。   The screening method according to any one of claims 1 to 4, wherein the mouse is a C57BL / 6 strain mouse. 配列番号:1に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA。   An isolated DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA。   An isolated DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 配列番号:3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたDNA。   An isolated DNA containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. 請求項6〜8のいずれかに記載のDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ当該DNAの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してCTL誘導能を有する、単離されたDNA。   A DNA that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the DNA according to any one of claims 6 to 8, and an expression product of the DNA binds to an HLA-A24-restricted antigen peptide to induce CTL An isolated DNA having the ability. 配列番号:3に記載のアミノ酸配列の第25位〜第114位をコードするヌクレオチド配列、第115位〜第206位をコードするヌクレオチド配列、及び第207位〜第298位をコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項9に記載の単離されたDNA。   A nucleotide sequence encoding positions 25 to 114, a nucleotide sequence encoding positions 115 to 206, and a nucleotide sequence encoding positions 207 to 298 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. 10. The isolated DNA of claim 9, containing. 配列番号:2に記載のヌクレオチド配列の第72位〜第339位、第342位〜第615位、及び第618位〜第891位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、請求項9に記載の単離されたDNA。   The polynucleotide according to claim 9, comprising a polynucleotide having the sequence shown at positions 72 to 339, 342 to 615, and 618 to 891 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The isolated DNA described. 請求項6〜11のいずれかに記載のDNAを含有する発現ベクター。   An expression vector containing the DNA according to any one of claims 6 to 11. 請求項12に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞。   A transformed cell transformed with the expression vector according to claim 12. 請求項13に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なCTL誘導剤のスクリーニング方法。   A method for screening an antigen-specific CTL inducer, characterized by using the transformed cell according to claim 13. 請求項13に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。   A method for screening a therapeutic or prophylactic agent for tumor or viral infection, characterized by using the transformed cell according to claim 13.
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