JP2007077036A - New compound selectively increasing fluorescence intensity at target part and composition for image diagnosis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的部位で選択的に蛍光強度が強くなる新規化合物および該化合物を含む画像診断用組成物に関するものである。 The present invention relates to a novel compound that selectively increases fluorescence intensity at a target site and a diagnostic imaging composition containing the compound.
癌組織等の位置、大きさを正確に把握することは、適確な治療を行う上で不可欠である。しかし、現行の診断法は、臓器の大きさや形といった形態的情報に頼っており、早期にかつ正確な診断を遂行するためには、これまでの手法と全く異なる概念を用いた癌検出法が必要である。 Accurately grasping the position and size of a cancer tissue or the like is indispensable for appropriate treatment. However, current diagnostic methods rely on morphological information such as organ size and shape, and in order to perform early and accurate diagnosis, cancer detection methods that use completely different concepts from previous methods are needed. is necessary.
癌組織における癌細胞は、非常に増殖旺盛であるため、癌細胞の増殖により固形組織化が進むと必要な血管新生が追いつかず、低酸素状態の細胞が顕著に増加することが知られている。 It is known that cancer cells in cancer tissue are very proliferative, and that when the solid organization progresses due to the growth of cancer cells, the necessary angiogenesis cannot catch up and the number of hypoxic cells increases markedly. .
このような低酸素状態の細胞を利用することより、癌細胞等をイメージングすることが試みられている。これまで、動物実験や細胞実験における低酸素領域検出のために、ニトロイミダゾール系化合物等の低酸素マーカーを用いて、イメージングして、低酸素マーカーの分布を観測するといった手法が行われてきた（例えば非特許文献１、２参照）。
しかしながら、上記従来の構成では、癌細胞をイメージングする際に、患部の切除を行わなければならないという問題を生じる。 However, the conventional configuration causes a problem that the affected part must be excised when imaging cancer cells.
具体的には、上記低酸素マーカーによる癌細胞のイメージングは、低酸素領域の細胞を着色することにより行うため、イメージングした低酸素領域の細胞を観察するためには患部の切除を行う必要がある。患部の切除には高度な技術が要求されるため、癌細胞のイメージングを簡便に行うことが望まれている。 Specifically, imaging of cancer cells with the above-mentioned hypoxic marker is performed by coloring the cells in the hypoxic region. Therefore, in order to observe the cells in the hypoxic region, it is necessary to excise the affected area. . Since advanced techniques are required for excision of the affected area, it is desired to simply perform imaging of cancer cells.
また、上記低酸素マーカーによる癌細胞のイメージングでは、上記低酸素マーカーの検出感度が低いため、画像のイメージング能力が低いという問題があった。 In addition, imaging of cancer cells with the above-described hypoxic marker has a problem in that the imaging ability of images is low because the detection sensitivity of the hypoxic marker is low.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、患部の切除を行うことなく、高感度のイメージングを行うために、目的とする部位で選択的に蛍光発光させることができる化合物を実現することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to selectively emit fluorescence at a target site in order to perform high-sensitivity imaging without excision of the affected area. It is to realize a compound capable of
本発明に係る化合物は、上記課題を解決するために、複数の蛍光性分子骨格を含む機能部位と、該蛍光性分子骨格の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含むことを特徴としている。 In order to solve the above-described problems, the compound according to the present invention is characterized by including a functional site containing a plurality of fluorescent molecular skeletons and a suppressing site that suppresses the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton.
上記の構成によれば、本発明に係る化合物は、１分子中に複数の蛍光性分子骨格と該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含む構造を有しているため、蛍光性分子骨格由来の蛍光強度は、抑制部位によって弱められている。よって、例えば、上記化合物の抑制部位を、目的とする部位の環境下で選択的に遊離する構成にすれば、蛍光性分子骨格が抑制部位から離れることにより、蛍光性分子骨格部分は本来有している強い蛍光を発することができる。従って、目的とする部位で選択的に蛍光発光させることができるという効果を奏する。 According to the above configuration, the compound according to the present invention has a structure including a plurality of fluorescent molecular skeletons and a suppression site that suppresses fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton in one molecule. The fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton is weakened by the suppression site. Therefore, for example, if the suppression site of the compound is configured to be selectively released under the environment of the target site, the fluorescent molecular skeleton part inherently exists by separating the fluorescent molecular skeleton from the suppression site. Can emit strong fluorescence. Therefore, there is an effect that fluorescence can be selectively emitted at a target site.
本発明に係る化合物は、上記課題を解決するために、蛍光性分子骨格と該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する消光性分子骨格とを含む機能部位と、該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含むことを特徴としている。 In order to solve the above problems, the compound according to the present invention comprises a functional site comprising a fluorescent molecular skeleton and a quenching molecular skeleton that suppresses the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton, and a derivative derived from the fluorescent molecular skeleton. And a suppression site that suppresses the fluorescence intensity.
上記の構成によれば、本発明に係る化合物は、１分子の中に、蛍光性分子骨格と該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する消光性分子骨格と、該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含む構造を有しているため、蛍光性分子骨格由来の蛍光強度は、抑制部位及び消光性分子骨格部分によって弱められている。よって、例えば、上記化合物の抑制部位及び消光性分子骨格部分を、目的とする部位の環境下で選択的に遊離する構成にすれば、蛍光性分子骨格部分が抑制部位及び消光性分子骨格部分から離れることにより、蛍光性分子骨格部分は本来有している強い蛍光を発することができる。従って、目的とする部位で選択的に蛍光発光させることができるという効果を奏する。 According to the above configuration, the compound according to the present invention includes, in one molecule, a fluorescent molecular skeleton, a quenching molecular skeleton that suppresses the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton, and the fluorescent molecular skeleton. Since it has a structure including a suppression site that suppresses the fluorescence intensity, the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton is weakened by the suppression site and the quenching molecular skeleton. Therefore, for example, if the inhibitory site and quenching molecular skeleton portion of the above compound are selectively released under the environment of the target site, the fluorescent molecular skeleton portion is separated from the inhibitory site and the quenching molecular skeleton portion. By separating, the fluorescent molecular skeleton part can emit strong fluorescence originally possessed. Therefore, there is an effect that fluorescence can be selectively emitted at a target site.
さらには、上記化合物における蛍光性分子骨格は、抑制部位及び消光性分子骨格によって蛍光強度を弱められている。このため、上記化合物の上記抑制部位及び上記消光性分子骨格が遊離する前の蛍光強度を、より自由に調整することができる。これにより、上記分子の遊離前の蛍光強度をより弱めることで、バックグランドの蛍光強度を弱めることができる。従って、上記抑制部位及び上記消光性分子骨格の遊離前後における蛍光性分子骨格由来の蛍光強度差をより大きくすることができるという効果を奏する。 Furthermore, the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton in the compound is weakened by the suppression site and the quenching molecular skeleton. For this reason, the fluorescence intensity before the said suppression site | part of the said compound and the said quenching | quenching molecule | numerator skeleton can be adjusted more freely. Thereby, the background fluorescence intensity can be weakened by further weakening the fluorescence intensity before the release of the molecule. Therefore, there is an effect that the fluorescence intensity difference derived from the fluorescent molecular skeleton before and after the release of the suppression site and the quenching molecular skeleton can be further increased.
本発明に係る化合物では、上記抑制部位は、還元性環境下で遊離することにより、上記蛍光性分子骨格由来の蛍光強度が強くなる性質を備えているものであることが好ましい。 In the compound according to the present invention, the inhibitory site is preferably provided with a property that the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton is increased by being liberated in a reducing environment.
上記構成によれば、上記抑制部位が還元性環境下で遊離するため、生体内において低酸素状態にある組織または細胞、還元性酵素の存在する組織または細胞等に対して選択的に蛍光性分子骨格部分を発光させることができる。低酸素状態にある組織または細胞の具体例としては、癌組織、癌細胞、虚血部位等が挙げられる。このため、癌組織、癌細胞、虚血部等に対して選択的に蛍光を発させることができる。よって、低酸素状態の部位に対する画像診断用組成物として利用することができるという更なる効果を奏する。 According to the above configuration, since the suppression site is released in a reducing environment, the fluorescent molecule is selectively selected for a tissue or cell in a hypoxic state in a living body, a tissue or a cell in which a reducing enzyme exists, and the like. The skeleton portion can emit light. Specific examples of tissues or cells in a hypoxic state include cancer tissues, cancer cells, ischemic sites and the like. For this reason, fluorescence can be selectively emitted to cancer tissues, cancer cells, ischemic sites, and the like. Therefore, it has the further effect that it can utilize as a composition for image diagnosis with respect to the site | part of a hypoxic state.
また、本発明に係る化合物では、さらに、上記蛍光分子骨格と上記抑制部位とを連結するリンカー部位を含み、上記リンカー部位は、上記抑制部位の遊離に引き続いて遊離する性質を備えていることが好ましい。 In addition, the compound according to the present invention further includes a linker site that links the fluorescent molecular skeleton to the suppression site, and the linker site has a property of being released following the release of the suppression site. preferable.
上記構成によれば、上記リンカー部位の組成を調整することで、上記化合物の溶解性を調整することができる。また、上記リンカー部位は、上記抑制部位の遊離に引き続き遊離する性質を有するため、標的部位において蛍光性分子骨格部分の発光強度が低減されない。よって、蛍光性分子骨格部分の発光強度に影響を与えることなく、自由に化合物の溶解性等の設計することができるというさらなる効果を奏する。 According to the said structure, the solubility of the said compound can be adjusted by adjusting the composition of the said linker site | part. Further, since the linker site has a property of being released following the release of the suppression site, the emission intensity of the fluorescent molecular skeleton portion is not reduced at the target site. Therefore, there is an additional effect that the solubility of the compound can be freely designed without affecting the emission intensity of the fluorescent molecular skeleton portion.
また、本発明に係る化合物では、上記抑制部位は、キノン化合物骨格またはニトロ化合物骨格を有していることが好ましい。 In the compound according to the present invention, the suppression site preferably has a quinone compound skeleton or a nitro compound skeleton.
キノン化合物骨格のジカルボニル基またはニトロ化合物骨格におけるニトロ基は、親電子性置換基である。また、低酸素状態にある組織等において、上記骨格を有する化合物を還元する酵素が広く知られている。このため、上記構成によれば、上記抑制部位を低酸素状態にある組織等で容易に還元させることができるという更なる効果を奏する。 The dicarbonyl group of the quinone compound skeleton or the nitro group in the nitro compound skeleton is an electrophilic substituent. In addition, enzymes that reduce compounds having the above skeleton in tissues or the like in a hypoxic state are widely known. For this reason, according to the said structure, there exists the further effect that the said suppression site | part can be easily reduce | restored with the structure | tissue etc. which are in a hypoxic state.
また、本発明に係る化合物では、上記蛍光性分子骨格は、クマリン化合物骨格、フルオレセイン骨格、テキサスレッド骨格、量子ドットから選ばれる少なくとも１つの分子骨格であることが好ましい。 In the compound according to the present invention, the fluorescent molecular skeleton is preferably at least one molecular skeleton selected from a coumarin compound skeleton, a fluorescein skeleton, a Texas red skeleton, and a quantum dot.
クマリン化合物骨格、フルオレセイン骨格、テキサスレッド骨格及び量子ドットは、蛍光強度が強い分子骨格である。これにより、標的部位において、蛍光性分子骨格の発光強度をより強くすることができるというさらなる効果を奏する。 The coumarin compound skeleton, the fluorescein skeleton, the Texas red skeleton, and the quantum dots are molecular skeletons with high fluorescence intensity. Thereby, there is an additional effect that the emission intensity of the fluorescent molecular skeleton can be further increased at the target site.
また、本発明に係る化合物では、上記化合物が一般式（１） In the compound according to the present invention, the compound is represented by the general formula (1).
（式中、ＹはＯまたはＮＲ１２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、または炭素数１〜８までのアルキル基、炭素数１〜８までのアルコキシ基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、または炭素数１〜８までのアルキル基である。）
で表される構造を有していることが好ましい。
(In the formula, Y is O or NR 12 , and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and 1 to 8 carbon atoms. An alkoxy group, an amino group-containing group, an amino acid-containing group, a peptide-containing group, a protein-containing group, a hydroxyl group-containing group, a nucleic acid-containing group, an organic acid-containing group, and a polymer-containing group, R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.)
It preferably has a structure represented by
本発明に係る画像診断用組成物は、上記課題を解決するために、上記本発明に係る化合物を含むことを特徴としている。 The composition for diagnostic imaging according to the present invention is characterized by containing the compound according to the present invention in order to solve the above problems.
上記の構成によれば、例えば、上記化合物の抑制部位を目標部位で選択的に遊離する分子骨格にすることで、上記化合物が目標部位に到達すると、上記化合物における蛍光性分子骨格部分が上記抑制部位から離れ、蛍光性分子骨格部分は本来有している強い蛍光を発することができる。上記蛍光性分子骨格部分は目標部位で強い蛍光を発するため、体外から蛍光を検出することにより画像のイメージングを行うことができる。また、上記化合物は、蛍光強度および蛍光波長を自由に設計することができるため、検出感度を高め、さらに蛍光波長を自在に設定することができる。従って、患部の切除を行うことなく、高感度のイメージングを行うことができる非侵襲性の画像診断用組成物を提供することができるという効果を奏する。 According to said structure, when the said compound reaches | attains a target site | part by making the suppression site | part of the said compound selectively the target site | part, for example, when the said compound reaches | attains a target site | part, the fluorescent molecular skeleton part in the said compound will suppress the said part. Apart from the site, the fluorescent molecular skeleton part can emit strong fluorescence inherently. Since the fluorescent molecular skeleton emits strong fluorescence at the target site, images can be imaged by detecting fluorescence from outside the body. Moreover, since the said compound can design a fluorescence intensity and a fluorescence wavelength freely, it can raise detection sensitivity and can also set a fluorescence wavelength freely. Therefore, there is an effect that it is possible to provide a non-invasive diagnostic imaging composition capable of performing high-sensitivity imaging without removing the affected part.
本発明に係る化合物は、複数の蛍光性分子骨格を含む機能部位と、当該蛍光性分子骨格の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含む構造を有している。このため、目的とする部位で選択的に蛍光発光させることができるという効果を奏する。 The compound according to the present invention has a structure including a functional site containing a plurality of fluorescent molecular skeletons and a suppressing site that suppresses the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton. For this reason, there is an effect that fluorescence can be selectively emitted at a target site.
また、本発明に係る化合物は、蛍光性分子骨格と該蛍光性分子骨格の蛍光強度を抑制する消光性分子骨格とを含む機能部位と、該蛍光性分子骨格の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含む構造を有している。このため、目的とする部位で選択的に蛍光発光させることができるという効果を奏する。さらには、上記抑制部位及び上記消光性分子骨格の遊離前後における蛍光性分子骨格由来の蛍光強度差をより大きくすることができるという効果を奏する。 In addition, the compound according to the present invention includes a functional site including a fluorescent molecular skeleton and a quenching molecular skeleton that suppresses the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton, and a suppression site that suppresses the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton. It has the structure containing. For this reason, there is an effect that fluorescence can be selectively emitted at a target site. Furthermore, there is an effect that the fluorescence intensity difference derived from the fluorescent molecular skeleton before and after the release of the suppression site and the quenching molecular skeleton can be further increased.
また、本発明に係る画像診断用組成物は、上記化合物を含むことを特徴としている。これにより、患部の切除を行うことなく、高感度のイメージングを行うことができる画像診断用組成物を提供することができるという効果を奏する。 The diagnostic imaging composition according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned compound. Thereby, there exists an effect that the composition for image diagnosis which can perform highly sensitive imaging, without excising the affected part can be provided.
本発明の実施の一形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明は本実施の形態に限定されるものではない。 An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this embodiment.
本発明に係る化合物は、複数の蛍光性分子骨格を含む機能部位と該蛍光分子骨格由来の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含む。 The compound according to the present invention includes a functional site containing a plurality of fluorescent molecular skeletons and a suppressing site that suppresses the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton.
上記抑制部位は、標的部位で選択的に遊離または分解されるものであることが好ましい。標的部位で抑制部位が離れることにより、蛍光性分子骨格部分はそれまで抑制されていた本来有する強度の蛍光を発光することが可能となる。 The suppression site is preferably one that is selectively released or decomposed at the target site. When the suppression site is separated from the target site, the fluorescent molecular skeleton part can emit fluorescence having the intensity originally suppressed.
また、本発明に係る化合物は、さらに、上記機能部位と上記抑制部位とを連結するリンカー部位を含んでいていることが好ましい。 In addition, the compound according to the present invention preferably further contains a linker site that links the functional site and the inhibitory site.
これにより、リンカー部位の組成を調整することで、上記化合物の親水性を調整することができる。さらには、リンカー部位は、上記抑制部位の遊離に引き続いて遊離する性質を有することから、上記蛍光部位の遊離効率を自在に調整することができる。 Thereby, the hydrophilic property of the said compound can be adjusted by adjusting the composition of a linker part. Furthermore, since the linker site has a property of releasing following the release of the suppression site, the release efficiency of the fluorescent site can be freely adjusted.
本発明に係る化合物においては、上記抑制部位は還元性環境下で遊離するものであることが好ましく、還元性条件下で還元酸素または電離放射線の作用により遊離するものがより好ましい。還元性環境下とは、例えば、生体内において低酸素状態にある組織または細胞、還元性酵素の存在する組織または細胞、等を挙げることができる。低酸素状態にある組織または細胞の具体例としては、癌組織、癌細胞、虚血部位等を挙げることができる。 In the compound according to the present invention, the inhibitory site is preferably liberated in a reducing environment, and more preferably liberated by the action of reducing oxygen or ionizing radiation under reducing conditions. Examples of the reducing environment include tissues or cells that are hypoxic in a living body, tissues or cells in which a reducing enzyme is present, and the like. Specific examples of tissues or cells in a hypoxic state include cancer tissues, cancer cells, ischemic sites and the like.
より具体的には、上記抑制部位は、キノン化合物骨格またはニトロ化合物骨格を有していることが好ましい。これらの分子骨格が有するジカルボニル基またはニトロ基は親電子性置換基であり、これらを還元可能な酵素が広く知られているからである。 More specifically, the suppression site preferably has a quinone compound skeleton or a nitro compound skeleton. This is because the dicarbonyl group or nitro group of these molecular skeletons is an electrophilic substituent, and enzymes capable of reducing them are widely known.
キノン化合物骨格としては、下記一般式群（２） As the quinone compound skeleton, the following general formula group (2)
（式中、ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ７またはＰＲ８であり、ＹはＲ９、ＮＨ２、ＮＨＲ１０または求核性置換基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８のアルキル基である。ＰＲ８は、リン酸基を示す。また、式中、conjugate to functional partは、この部分がリンカー部位または機能部位に結合することを表す。）
に示される構造を有する分子骨格を挙げることができる。これらの中で、インドールキノン骨格（ＩＱ）は、低酸素状態に応答しうる置換基であるという理由で特に好ましい。
(Wherein X is O, S, NR 7 or PR 8 ; Y is R 9 , NH 2 , NHR 10 or a nucleophilic substituent; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 and R 9 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, PR 8 represents a phosphate group, and in the formula, the conjugate to functional part is Represents that this moiety binds to a linker site or functional site.)
And a molecular skeleton having the structure shown in FIG. Among these, the indolequinone skeleton (IQ) is particularly preferable because it is a substituent that can respond to a low oxygen state.
ニトロ化合物骨格としては、下記一般式群（３） As the nitro compound skeleton, the following general formula group (3)
（式中、ＸはＯ、ＳまたはＮＲ４であり、ＹはＮまたはＣＲ５であり、ＺはＯ、ＳまたはＮＲ６であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８までのアルキル基、炭素数１〜８までのアルコキシ基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、炭素数１〜８のアルキル基である。式中、conjugate to functional partは、この部分がリンカー部位を介して機能部位に結合することを表す。）
に示される構造を有する分子骨格、または下記一般式群（３）
Wherein X is O, S or NR 4 , Y is N or CR 5 , Z is O, S or NR 6 , and R 1 , R 2 and R 3 are each independently H or alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, amino group-containing group, amino acid-containing group, peptide-containing group, protein-containing group, hydroxyl-containing group, nucleic acid-containing group, organic acid-containing R 4 , R 5 , and R 6 are each independently an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, wherein the conjugate to functional part is connected via a linker moiety. Represents binding to a functional site.)
A molecular skeleton having a structure represented by the following general formula group (3)
（式中、ＸはＯ、ＳまたはＮＲ３であり、Ｙ１はＨ、ＮＯ２、ＮＲ４、炭素数１〜８のアルキル基または炭素数１〜８のアルコキシ基であり、Ｙ２はＨ、ＮＯ２、ＮＨ２またはＮＲ５であり、Ｙ３はＣＨ２またはＮＲ６であり、Ｒ１、Ｒ６は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８までのアルキル基、炭素数１〜８までのアルコキシ基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して炭素数１〜８のアルキル基である。式中、conjugate to functional partは、この部分がリンカー部位を介して機能部位に結合することを表す。）
に示される構造を有する分子骨格を挙げることができる。これらの中で、ニトロベンジル骨格、ニトロフラン骨格は、該分子骨格中のニトロ基を還元することが可能である酵素が広く知られているため特に好ましい。
(Wherein X is O, S or NR 3 , Y 1 is H, NO 2 , NR 4 , an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, and Y 2 is H , NO 2 , NH 2 or NR 5 , Y 3 is CH 2 or NR 6 , R 1 and R 6 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, 1 carbon atom R 2 , R 3 and R are alkoxy groups, amino group-containing groups, amino acid-containing groups, peptide-containing groups, protein-containing groups, hydroxyl group-containing groups, nucleic acid-containing groups, organic acid-containing groups, and polymer-containing groups. 4 and R 5 are each independently an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, wherein “conjugate to functional part” means that this part is bonded to the functional site via a linker site.
And a molecular skeleton having the structure shown in FIG. Among these, a nitrobenzyl skeleton and a nitrofuran skeleton are particularly preferable because an enzyme capable of reducing a nitro group in the molecular skeleton is widely known.
本発明に係る化合物の機能部位は、複数の蛍光性分子骨格を含んでいる。上記化合物では、同じ種類の蛍光性分子骨格を複数含む構成であってもよいし、異なった種類の蛍光性分子骨格を含む構成であってもよい。同じ種類の蛍光性分子骨格を複数含む構成とすることで、上記化合物の１分子当たりの蛍光強度をより高くすることができ、上記化合物を画像診断組成物に適用すれば、より高感度のイメージングを行うことができる。 The functional site of the compound according to the present invention includes a plurality of fluorescent molecular skeletons. The above-mentioned compound may have a configuration including a plurality of the same type of fluorescent molecular skeletons, or may include a configuration including different types of fluorescent molecular skeletons. By including a plurality of fluorescent molecular skeletons of the same type, the fluorescence intensity per molecule of the compound can be increased, and if the compound is applied to an image diagnostic composition, more sensitive imaging can be performed. It can be performed.
また、上記化合物における蛍光性分子骨格を、異なる種類のものを含む構成にすることで、上記抑制部位の遊離後における蛍光性分子骨格の蛍光の波長分布を任意に変化させることができる。 Moreover, the fluorescence wavelength distribution of the fluorescent molecular skeleton after the release of the suppression site can be arbitrarily changed by configuring the fluorescent molecular skeleton in the compound to include different types.
上記蛍光分子が発する蛍光の波長は、生体膜透過性が高いことが好ましく、３００ｎｍ〜８００ｎｍが好ましく、より好ましくは６００ｎｍ〜８００ｎｍである。 The wavelength of the fluorescence emitted from the fluorescent molecule is preferably high in biological membrane permeability, preferably 300 nm to 800 nm, more preferably 600 nm to 800 nm.
また、本発明に係る化合物の機能部位は、蛍光性分子骨格と消光性分子骨格とを含む構成であってもよい。上記化合物内に消光性分子骨格を含有する構成とすることで、上記化合物は、１分子の中に、蛍光性分子骨格と該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する消光性分子骨格と、該蛍光性分子骨格由来の蛍光強度を抑制する抑制部位とを含んだ構造となる。上記構成では、上記化合物における蛍光性分子骨格は、抑制部位及び消光性分子骨格部分によって蛍光強度を弱められている。このため、上記化合物の上記抑制部位及び上記消光性分子骨格が遊離する前の蛍光強度を、より自由に調整することができる。これにより、上記分子の遊離前の蛍光強度をより弱めることで、バックグランドの蛍光強度を弱めることができる。従って、上記抑制部位及び上記消光性分子骨格部分の遊離前後における蛍光性分子骨格由来の蛍光強度差をより大きくすることができ、上記化合物を画像診断組成物に適用すれば、より高感度のイメージングを行うことができる。 In addition, the functional site of the compound according to the present invention may have a configuration including a fluorescent molecular skeleton and a quenching molecular skeleton. By comprising a quenching molecular skeleton in the compound, the compound contains a fluorescent molecular skeleton and a quenching molecular skeleton that suppresses fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton in one molecule, The structure includes a suppression site that suppresses the fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton. In the above configuration, the fluorescence intensity of the fluorescent molecular skeleton in the compound is weakened by the suppression site and the quenching molecular skeleton. For this reason, the fluorescence intensity before the said suppression site | part of the said compound and the said quenching | quenching molecule | numerator skeleton can be adjusted more freely. Thereby, the background fluorescence intensity can be weakened by further weakening the fluorescence intensity before the release of the molecule. Therefore, the difference in fluorescence intensity derived from the fluorescent molecular skeleton before and after the release of the suppression site and the quenching molecular skeleton can be increased, and if the compound is applied to an image diagnostic composition, more sensitive imaging can be performed. It can be performed.
さらには、本発明に係る化合物における機能部位に、Ｆ１８、Ｃ１１等の放射性同位元素を含有させることにより、またはＧｄイオン−キレート錯体等の磁性分子骨格を含有させることにより、標的部位をＰＥＴやＭＲＩ等の診断機器で検出することができる構成とすることができる。 Furthermore, the functional site in the compound according to the present invention contains a radioisotope such as F 18 or C 11 or a magnetic molecular skeleton such as a Gd ion-chelate complex, so that the target site is PET. It is possible to adopt a configuration that can be detected by a diagnostic device such as MRI.
上記蛍光性分子骨格としては、クマリン、フルオレセイン、テキサスレッド等の有機化合物、量子ドット等の無機化合物等の蛍光強度が高い分子の分子骨格が挙げられる。また上記蛍光性分子骨格を１分子内に複数個含むポリマー、デンドリマー等の構造のものが挙げられる。 Examples of the fluorescent molecular skeleton include molecular skeletons of molecules having high fluorescence intensity, such as organic compounds such as coumarin, fluorescein and Texas Red, and inorganic compounds such as quantum dots. Moreover, the thing of structures, such as a polymer and dendrimer which contain two or more said fluorescent molecular frame | skeletons in 1 molecule, is mentioned.
また、上記消光性分子骨格としては、ダブシル等の有機化合物、金粒子等の無機化合物等の分子の分子骨格が挙げられる。 Examples of the quenching molecular skeleton include molecular skeletons of molecules such as organic compounds such as dabsyl and inorganic compounds such as gold particles.
リンカー部位としては、抑制部位が遊離した後に、自発的に機能部位から遊離するものであることが好ましい。このようなリンカー部位としては、５員環または６員環を形成することができる構造を有するリンカー部位を挙げることができるが、これに限定されない。また、リンカー部位が遊離しなくても、抑制部位が遊離することで機能部位は機能を回復するが、リンカー部位が遊離することにより、機能部位は本来有する機能を完全に発現することができる。 The linker site is preferably one that spontaneously releases from the functional site after the suppression site is released. Examples of such a linker moiety include, but are not limited to, a linker moiety having a structure capable of forming a 5-membered ring or a 6-membered ring. Moreover, even if the linker site is not released, the functional site recovers the function by releasing the inhibitory site, but the functional site can fully express the inherent function by releasing the linker site.
上記リンカー部位は、より具体的には一般式（５） More specifically, the linker moiety is represented by the general formula (5).
（式中、ＸはＯまたはＮＲ３であり、ＹはＯ、ＳまたはＮＲ４であり、ＺはＯまたはＮＲ５であり、ＷはＯまたはＮＲ６であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８のアルキル基である。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８までのアルキル基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。また、式中、Functional partは機能部位を表し、Bioreductive unitsは抑制部位を表す。）
に示される化合物群の構造のいずれかであることが好ましい。
Wherein X is O or NR 3 , Y is O, S or NR 4 , Z is O or NR 5 , W is O or NR 6 , and R 1 and R 2 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms or an amino group-containing group. , Amino acid-containing group, peptide-containing group, protein-containing group, hydroxyl group-containing group, nucleic acid-containing group, organic acid-containing group, polymer-containing group, where Functional part represents a functional site and Bioreductive units represents a suppression site. Represents.)
It is preferable that it is either of the structure of the compound group shown by these.
また、一般式（６） Further, the general formula (6)
（式中、ＸはＯまたはＮＲ８であり、ＹはＯまたはＮＲ９であり、ＺはＯまたはＮＲ１０であり、ＷはＯまたはＮＲ１１であり、ＥはＯまたはＮＲ１２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８までのアルキル基である。Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、または炭素数１〜８までのアルキル基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。また、式中、functional partは機能部位を表し、Bioreductive unitsは抑制部位を表す。）
に示される化合物群の構造のいずれかであることが好ましい。
(Wherein X is O or NR 8 ; Y is O or NR 9 ; Z is O or NR 10 ; W is O or NR 11 ; E is O or NR 12 ; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 9 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an amino group-containing group, an amino acid-containing group, a peptide-containing group, a protein-containing group, a hydroxyl-containing group, a nucleic acid-containing group, organic (It is an acid-containing group or a polymer-containing group. In the formula, functional part represents a functional site, and Bioreductive units represents a suppression site.)
It is preferable that it is either of the structure of the compound group shown by these.
また、一般式（７） Further, the general formula (7)
（式中、ＸはＯまたはＮＲ７であり、ＹはＯまたはＮＲ８であり、ＺはＯまたはＮＲ９であり、ＷはＯまたはＮＲ１０であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈまたは炭素数１〜８までのアルキル基である。Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３または炭素数２〜８のアルキル基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基構造である。）
に示される化合物の構造であることが好ましい。
(Wherein X is O or NR 7 , Y is O or NR 8 , Z is O or NR 9 , W is O or NR 10 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 8 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and R 7 , R 9 , and R 10 are each independently H, CH 3. Or an alkyl group having 2 to 8 carbon atoms, an amino group-containing group, an amino acid-containing group, a peptide-containing group, a protein-containing group, a hydroxyl group-containing group, a nucleic acid-containing group, an organic acid-containing group, or a polymer-containing group structure.
It is preferable that it is a structure of the compound shown by these.
上記構造のリンカー部位とすることにより、水溶性を向上させることができると共に、抑制部位遊離後に自発的に遊離させることができる。 By using a linker site having the above structure, water solubility can be improved and it can be released spontaneously after the suppression site is released.
本実施の形態に係る化合物としては、例えば、一般式（１） Examples of the compound according to the present embodiment include the general formula (1)
（式中、ＹはＯまたはＮＲ１２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、または炭素数１〜８までのアルキル基、炭素数１〜８までのアルコキシ基、アミノ基含有基、アミノ酸含有基、ペプチド含有基、タンパク質含有基、水酸基含有基、核酸含有基、有機酸含有基、ポリマー含有基である。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、または炭素数１〜８までのアルキル基である。）
の構造を有する化合物が挙げられる。
(In the formula, Y is O or NR 12 , and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and 1 to 8 carbon atoms. An alkoxy group, an amino group-containing group, an amino acid-containing group, a peptide-containing group, a protein-containing group, a hydroxyl group-containing group, a nucleic acid-containing group, an organic acid-containing group, and a polymer-containing group, R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are each independently H or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.)
The compound which has the structure of these is mentioned.
上記一般式群（２）における求核性置換基としては、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基等が挙げられ、より好ましくはメトキシ基である。 As a nucleophilic substituent in the said General formula group (2), a C1-C8 alkyl group, a C1-C8 alkoxy group, etc. are mentioned, More preferably, it is a methoxy group.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）におけるアミノ基含有基としては、炭素数１〜８のアミノアルキル基等が挙げられ、より好ましくはＣＨ２ＮＨ２である。 Examples of the amino group-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) include an aminoalkyl group having 1 to 8 carbon atoms. More preferably, it is CH 2 NH 2 .
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）における水酸基含有基としては、炭素数１〜８のヒドロキシアルキル基等が挙げられ、より好ましくはＣＨ２ＯＨである。 Examples of the hydroxyl group-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) include a hydroxyalkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and the like. More preferably, it is CH 2 OH.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）におけるアミノ酸含有基としては、リジン残基、アルギニン残基等が挙げられ、より好ましくはリジン残基である。 Examples of the amino acid-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) include lysine residues and arginine residues. Is a lysine residue.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）におけるペプチド含有基としては、残基数１〜２０のオリゴペプチド基等が挙げられ、より好ましくは残基数５程度の腫瘍特異的に結合するオリゴペプチドである。 Examples of the peptide-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) include oligopeptide groups having 1 to 20 residues. More preferably, it is an oligopeptide having a number of residues of about 5 that specifically binds to a tumor.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）におけるタンパク質含有基としては、酵素、抗体等を含有する置換基が挙げられ、より好ましくはｍＡｂと呼ばれる腫瘍特異的に結合する抗体を含有する置換基である。 Examples of the protein-containing group in General Formula Group (3), General Formula Group (4), and General Formulas (1) and (5) to (7) include substituents containing enzymes, antibodies, and the like. A substituent containing an antibody specifically binding to a tumor called mAb is preferred.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）における核酸含有基としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ等を含有する置換基が挙げられ、より好ましくは２０塩基程度から成る一本鎖ＤＮＡを含有する置換基である。 Examples of the nucleic acid-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) include a substituent containing DNA or RNA. Preferably, it is a substituent containing a single-stranded DNA consisting of about 20 bases.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）における有機酸含有基としては、炭素数１〜８のアルキルカルボン酸を含有する置換基等が挙げられ、より好ましくはＣＨ２ＣＯＯＨである。 The organic acid-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7) is a substituent containing an alkyl carboxylic acid having 1 to 8 carbon atoms. group and the like, more preferably CH 2 COOH.
上記一般式群（３）、一般式群（４）、及び一般式（１）及び（５）〜（７）におけるポリマー含有基としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、シクロデキストリン等のポリマー構造を有する置換基が挙げられ、より好ましくはシクロデキストリン構造を有する置換基である。 As the polymer-containing group in the general formula group (3), the general formula group (4), and the general formulas (1) and (5) to (7), a substitution having a polymer structure such as polyethylene glycol, dextran, and cyclodextrin. Group, and more preferably a substituent having a cyclodextrin structure.
一般式（１）に示す化合物としては、例えば、式（８） Examples of the compound represented by the general formula (1) include the formula (8).
に示す構造の化合物（以下、ＩＱ−Ｃｏｕと記す）が挙げられる。 And a compound having the structure shown below (hereinafter referred to as IQ-Cou).
上記のような分子内にインドールキノンの分子骨格及びクマリンの分子骨格を有している化合物は、英国研究者により報告されている（S. A. Everett, E. Swann, M. A. Nayor, M. R. L. Stratford, K. B. Patel, N. Tian, R. G. Newman, B. Vojnovic, C. J. Moody, P. Wardman, Biochemical Pharmacology, 2002, 63, 1629-1639）。しかしながら、上記化合物は、低酸素領域で活性化されるプロドラッグとしての利用を目的として開発されており、本発明のような癌診断用酸素センサーとしての利用については実験が行われていない。このため、上記化合物では、癌診断用酸素センサーにようなイメージングツールとして実際に利用することができるかは不明である。 Compounds having an indolequinone molecular skeleton and a coumarin molecular skeleton in the molecule as described above have been reported by British researchers (SA Everett, E. Swann, MA Nayor, MRL Stratford, KB Patel, N. Tian, RG Newman, B. Vojnovic, CJ Moody, P. Wardman, Biochemical Pharmacology, 2002, 63, 1629-1639). However, the above compound has been developed for the purpose of use as a prodrug activated in the hypoxic region, and no experiment has been conducted on its use as an oxygen sensor for cancer diagnosis as in the present invention. For this reason, it is unclear whether the above compound can actually be used as an imaging tool such as an oxygen sensor for cancer diagnosis.
また、上記化合物では、分子内に蛍光性分子骨格であるクマリンを１つのみ含む構造を有している。これに対して、本発明に係る化合物は、機能部位として複数の蛍光性分子骨格または、蛍光性分子骨格及び消光性分子骨格を含む構造を有している。このため、機能部位の複数の分子を変化させることにより、蛍光強度を強くしたり、蛍光の波長分布を任意のものにしたりすることができる。また、消光性分子骨格と組み合わせることにより、バックグラウンドの蛍光ピークを大きく抑制することができるため、より感度の高い診断を行うことができる等多様な機能を発現可能にしている。 The above compound has a structure containing only one coumarin, which is a fluorescent molecular skeleton, in the molecule. On the other hand, the compound according to the present invention has a structure including a plurality of fluorescent molecular skeletons or a fluorescent molecular skeleton and a quenching molecular skeleton as functional sites. For this reason, the fluorescence intensity can be increased or the wavelength distribution of fluorescence can be made arbitrary by changing a plurality of molecules at the functional site. In addition, by combining with a quenching molecular skeleton, the background fluorescence peak can be greatly suppressed, so that various functions such as a more sensitive diagnosis can be realized.
以下、化合物ＩＱ−Ｃｏｕを用いて、低酸素状態における上記化合物の作用について説明する。 Hereinafter, the action of the above compound in a low oxygen state will be described using the compound IQ-Cou.
下記式（９） Following formula (9)
に示すように、ＩＱ−Ｃｏｕにおける抑制部位であるインドールキノン（ＩＱ）は、Cytochrome-Ｐ450等の還元酵素により還元されて遊離する。そしてフリーとなったリンカー部位の末端が自発的に５員環を形成し、クマリン（Ｃｏｕ）から遊離する。その結果、クマリン（Ｃｏｕ）が、本来有する強い蛍光特性を発現することが可能となる。 As shown in FIG. 2, indolequinone (IQ), which is a repressing site in IQ-Cou, is reduced and released by a reductase such as Cytochrome-P450. The free end of the linker site spontaneously forms a 5-membered ring and is released from coumarin (Cou). As a result, it is possible for coumarin (Cou) to express the strong fluorescence characteristics that it originally has.
このように、上記化合物は、低酸素条件でのみ反応が進行する一電子還元反応を利用するため、正確に低酸素細胞を識別することができる。 Thus, since the above compound utilizes a one-electron reduction reaction in which the reaction proceeds only under low oxygen conditions, it is possible to accurately identify hypoxic cells.
以下に、本発明に係る化合物の利用形態について説明する。 Below, the utilization form of the compound which concerns on this invention is demonstrated.
本発明は、上述の本発明に係る化合物を含む画像診断用組成物を提供する。本発明に係る組成物は、経口、非経口（例えば筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射または埋込み）、経鼻、経膣、経直腸、経舌下または局所のいずれかの経路で動物に投与することができる。本発明に係る組成物の場合、非経口的に注射することが好ましい。有効成分としての本発明に係る化合物の含有量は、診断対象の体重および状態、および選択される特定の投与経路に応じて、適宜選択すればよい。 The present invention provides a diagnostic imaging composition comprising the above-described compound according to the present invention. The composition according to the present invention can be administered orally, parenterally (for example, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection or implantation), nasal, vaginal, rectal, sublingual or topical. The animals can be administered by route. In the case of the composition according to the present invention, it is preferably injected parenterally. The content of the compound according to the present invention as an active ingredient may be appropriately selected depending on the body weight and condition of the diagnosis target and the specific administration route selected.
上記本発明に係る化合物は、上記投与経路のいずれかにより、単独で、あるいは、薬剤学的に許容することのできる担体または希釈剤との組み合わせで、投与することができ、投与は、単回または複数回投与で実施することができる。より具体的には、本発明の組成物は、幅広い種々の剤形で投与することができる。 The compound according to the present invention can be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent according to any of the above administration routes. Or it can carry out by multiple administration. More specifically, the compositions of the present invention can be administered in a wide variety of dosage forms.
経口投与用の固体剤形は、例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒などであってよい。そのような固体剤形では、上記本発明に係る化合物を、少なくとも１種の医薬的に受容しうる不活性担体または希釈剤（スクロース、ラクトースまたはデンプンなど）と混合する。また、このような不活性担体または希釈剤の他に別の物質（例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤）を含んでいてもよい。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含んでいてもよい。錠剤および丸剤はさらに、腸溶性コーティングを用いて調製することもできる。 Solid dosage forms for oral administration can be, for example, capsules, tablets, pills, powders, granules, and the like. In such solid dosage forms, the compounds according to the invention are mixed with at least one pharmaceutically acceptable inert carrier or diluent (such as sucrose, lactose or starch). In addition to such an inert carrier or diluent, another substance (for example, a lubricant such as magnesium stearate) may be contained. In the case of capsules, tablets and pills, the dosage forms may contain buffering agents. Tablets and pills can additionally be prepared with enteric coatings.
経口投与用の液状剤形は、薬剤学的に受容しうる乳濁液、溶液、懸濁液およびシロップなどであり、これらにより形成したエリキシル剤は当分野で一般的に用いられる不活性希釈剤（水など）を含有する。組成物は、このような不活性希釈剤の他に湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などを含んでいてもよい。 Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions and syrups, and elixirs formed thereby are inert diluents commonly used in the art. (Such as water). The composition may contain a wetting agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance and the like in addition to such an inert diluent.
非経口投与用の製剤は、滅菌した水性もしくは非水性の溶液、懸濁液または乳濁液を含んでいてもよい。非水性溶媒または賦形剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油およびトウモロコシ油など）、ゼラチン、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）を含む。このような剤形はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などを含んでいてもよい。これらの製剤は、例えば、細菌を保持するフィルターを通す濾過、組成物と殺菌剤の混合、組成物へのＸ線照射、または組成物の加熱により、滅菌することができる。これらはまた、使用する直前に無菌水またはいくつかの他の無菌注射剤に溶解することができる、無菌固体組成物の形状で製造することもできる。 Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. Examples of non-aqueous solvents or excipients include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils (such as olive oil and corn oil), gelatin, and injectable organic esters (such as ethyl oleate). Such dosage forms may also contain preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents and the like. These formulations can be sterilized, for example, by filtration through a filter that retains bacteria, mixing the composition with a bactericidal agent, irradiating the composition with X-rays, or heating the composition. They can also be manufactured in the form of sterile solid compositions which can be dissolved in sterile water or some other sterile injectable just before use.
薬剤学的に許容できる担体は当業者には周知であり、例えば、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ．１９９１）に十分に記載されている。薬剤学的に受容できる担体には、塩（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）、および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））が含まれる。 Pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art and are well described, for example, in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Merck Pub. Co., NJ 1991). Pharmaceutically acceptable carriers include salts (eg, inorganic acid salts (eg, hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate, etc.) and organic acid salts (eg, acetate, propionic acid). Salt, malonate, benzoate, etc.)).
本発明に係る組成物は、キットの形態で提供することができる。キットには、本発明に係る化合物を含む組成物（本発明に係る組成物）のみではなく、これとは異なる成分を含む組成物が含まれていてもよい。キットに２種類以上の組成物が含まれる場合には、これらは別個の容器（例えば、分割されたボトルなど）に入れてもよく、分割されていない単独の容器に入れてもよい。一般に、キットには、使用説明書が含まれる。キットの形態は、別個の成分が好ましくは異なる剤形（例えば経口および非経口）で投与され、異なる投与量で投与され、または、処方する医師が当該組み合わせの各成分の滴定を所望する場合などに特に有利である。 The composition according to the present invention can be provided in the form of a kit. The kit may contain not only a composition containing the compound according to the present invention (a composition according to the present invention) but also a composition containing a component different from this. If the kit contains more than one composition, these may be placed in separate containers (eg, divided bottles, etc.) or in a single undivided container. Generally, the kit includes instructions for use. The kit form is such that separate components are preferably administered in different dosage forms (eg, oral and parenteral), administered at different dosages, or where the prescribing physician desires a titration of each component of the combination, etc. Is particularly advantageous.
本発明に係る化合物の被検体への投与は、上述の組成物の使用形態に準じればよい。 Administration of the compound according to the present invention to a subject may be in accordance with the use form of the composition described above.
上述のように、本発明に係る化合物は標的部位に選択的に送達されるため、例えば、癌病巣部位や虚血性疾患部位の検出に好適に用いることができる。また、例えばＣＰＴのように抗癌作用を有すると共にそれ自身が蛍光を発する化合物を、本発明に係る化合物の機能部位に用いれば、癌標的療法と癌病巣の画像診断を同時に実施することが可能となる。 As described above, since the compound according to the present invention is selectively delivered to a target site, it can be suitably used for detecting, for example, a cancer lesion site or an ischemic disease site. In addition, if a compound that has anticancer activity and emits fluorescence itself, such as CPT, is used as a functional site of the compound according to the present invention, it is possible to simultaneously perform cancer target therapy and image diagnosis of a cancer lesion. It becomes.
本発明に係る化合物の被検体への投与は、上述の組成物の使用形態に準じればよく、シグナルの検出には、シンチレーションカウンター、蛍光分光光度計などの公知の検出器を用いることができる。 Administration of the compound according to the present invention to the subject may be performed in accordance with the use form of the composition described above, and a known detector such as a scintillation counter or a fluorescence spectrophotometer can be used for signal detection. .
なお本発明は上述した各実施形態および以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and the following examples, and various modifications can be made within the scope shown in the claims, and technical means disclosed in different embodiments are appropriately used. Embodiments obtained in combination are also included in the technical scope of the present invention.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
最初に、以下の実施例で用いた測定装置及び実験材料について記載する。 First, the measurement apparatus and experimental materials used in the following examples will be described.
〔測定装置〕
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、JOEL JMN-AL-300（300MHz）を使用した。化学シフト値は、残存溶媒ピークを基準として、ｐｐｍで記載した。ピークの多重度は、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、ダブル−ダブレット（ｄｄ）。ブロードシングレット（ｂｒｓ）又はマルチプレット（ｍ）と記載した。
〔measuring device〕
JOEL JMN-AL-300 (300 MHz) was used for the measurement of 1 H-NMR spectrum. The chemical shift value was described in ppm based on the residual solvent peak. Peak multiplicity is singlet (s), doublet (d), triplet (t), double-doublet (dd). It was described as broad singlet (brs) or multiplet (m).
ＦＡＢＭＳ（fast atom bombardment mass spectrometry）には、JMS-SX102A質量分析計（ＪＯＥＬ社製）を用い、グリセロールまたは３−ニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）をマトリクスとした。 For FABMS (fast atom bombardment mass spectrometry), a JMS-SX102A mass spectrometer (manufactured by JOEL) was used, and glycerol or 3-nitrobenzyl alcohol (NBA) was used as a matrix.
Ｘ線照射には、Radioflex-350（理学社製）を使用した。 For X-ray irradiation, Radioflex-350 (manufactured by Rigaku Corporation) was used.
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）には、Shimadzu HPLCシステム（SPD-10A UV-VIS検出器, CT0-10Aカラムオーブン, LC-10ASポンプ２基, C-R6Aクロマトパック）を使用した。サンプル溶液を注入するカラムは、逆相カラム（Interstil（登録商標） ODS-3 column, 4.6Φ×150 mm、GL Science 社製）を用いた。溶媒は、溶液Ａとしてアセトニトリル、溶液Ｂとして０．１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ５）含有アセトニトリル溶液を用い、最初に２０分間溶媒Ｂを８８．９％の濃度で流し、次に８８．９％から１６．７％へ７０分かけてリニアグラジエントさせるように溶媒プログラムを設定した。 Shimadzu HPLC system (SPD-10A UV-VIS detector, CT0-10A column oven, two LC-10AS pumps, C-R6A chromatopack) was used for high performance liquid chromatography (HPLC). As a column for injecting the sample solution, a reverse phase column (Interstil (registered trademark) ODS-3 column, 4.6Φ × 150 mm, manufactured by GL Science) was used. As the solvent, acetonitrile as the solution A and acetonitrile solution containing 0.1 M TEAA buffer (pH 5) as the solution B were used. First, the solvent B was allowed to flow at a concentration of 88.9% for 20 minutes, and then from 88.9% to 16%. The solvent program was set to linear gradient over 7 minutes to 7%.
蛍光スペクトルには、SHIMADZU RF-5300PC spectrofluorophotometer（島津社製）を用いた。測定は、３００ｎｍを励起し、室温で行った。また、UV-33 glassfilter（東芝ガラス社製）を検出器側に使用して、３００ｎｍの励起波長由来のピークを除去した。 For the fluorescence spectrum, SHIMADZU RF-5300PC spectrofluorophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation) was used. The measurement was performed at room temperature with excitation at 300 nm. In addition, UV-33 glassfilter (manufactured by Toshiba Glass Co., Ltd.) was used on the detector side to remove a peak derived from an excitation wavelength of 300 nm.
細胞の画像測定には、IX71-IMAGE（オリンパス社製）の蛍光顕微鏡を用い、３３０ｎｍを励起することによって行った。 The image measurement of the cells was performed by exciting 330 nm using a fluorescent microscope of IX71-IMAGE (manufactured by Olympus).
〔実験材料〕
クマリン−３−カルボン酸（化合物１）はAldrich社から購入した。ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼは、和光純薬社を介してOxford Biomedical Researchから入手した。β−ＮＡＤＰＨ補酵素は、和光純薬社を介してOriental Yeast社から入手した。Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、２−メルカプトエタノール及びＨａｎｋの平衡塩類溶液は、ナカライテスク社から入手した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ナカライテスク社を介してＩＣＮ Biomedical社から入手した。ＭＣＦ−７細胞は、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターから入手した。ＭＣＦ−７細胞は、乳腺ガン由来の細胞であり、一電子還元酵素のcytochrome-P450を過剰に発現することが知られている。その他の試薬は、アルドリッチ社、和光純薬社またはナカライテスク社から購入した。これら購入した試薬は、精製せずに使用した。
[Experimental material]
Coumarin-3-carboxylic acid (Compound 1) was purchased from Aldrich. NADPH-P450 reductase was obtained from Oxford Biomedical Research through Wako Pure Chemical Industries. β-NADPH coenzyme was obtained from Oriental Yeast through Wako Pure Chemical Industries. L-glutamine-containing RPMI-1640 medium, 2-mercaptoethanol and Hank's balanced salt solution were obtained from Nacalai Tesque. Fetal bovine serum (FBS) was obtained from ICN Biomedical via Nacalai Tesque. MCF-7 cells were obtained from Tohoku University Institute of Aging Medicine, Medical Cell Resource Center. MCF-7 cells are cells derived from breast cancer and are known to overexpress cytochrome-P450, a one-electron reductase. Other reagents were purchased from Aldrich, Wako Pure Chemicals or Nacalai Tesque. These purchased reagents were used without purification.
〔実施例１：ＩＱ−Ｃｏｕの合成〕
ＩＱ−Ｃｏｕの合成は、式（１０）および式（１１）
[Example 1: Synthesis of IQ-Cou]
The synthesis of IQ-Cou has the formula (10) and formula (11)
に示す合成経路で行った。以下に、各反応について説明する。尚、全ての反応は、特に記載がない限り、蒸留した溶媒を使用して、乾燥窒素雰囲気下で行った。また、薄層クロマトグラフィには、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０Ｆ２５４（メルク社製）のＴＬＣ板を用い、カラムクロマトグラフィには、Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００（和光純薬社製）を用いた。 The synthesis route shown in FIG. Below, each reaction is demonstrated. All reactions were carried out under a dry nitrogen atmosphere using distilled solvent unless otherwise specified. In addition, Silicagel 60F 254 (Merck) TLC plate was used for thin layer chromatography, and Wakogel C-300 (Wako Pure Chemical Industries) was used for column chromatography.
（１）化合物２の合成
化合物１（５１０ｍｇ、２．６８ｍｍｏｌ）を、窒素ガス下で塩化チオニル（５ｍＬ、６８ｍｍｏｌ）に溶解した。この溶液を１００℃で２．５時間攪拌することにより反応を行った。反応は、ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で観察しながら行った。反応後、反応混合物を濃縮して、塩化チオニルを除去した。粗精製物にトルエン（１ｍＬ）を加え、減圧濃縮した。この操作を３回繰り返すことにより、残存する塩化チオニルを完全に除去した。得られたカーキ色の固体である化合物２の粗精製物は、化合物４の合成にすぐに使用した。
(1) Synthesis of Compound 2 Compound 1 (510 mg, 2.68 mmol) was dissolved in thionyl chloride (5 mL, 68 mmol) under nitrogen gas. The solution was reacted by stirring at 100 ° C. for 2.5 hours. The reaction was performed while observing with TLC (chloroform: methanol = 10: 1). After the reaction, the reaction mixture was concentrated to remove thionyl chloride. Toluene (1 mL) was added to the crude product and concentrated under reduced pressure. By repeating this operation three times, the remaining thionyl chloride was completely removed. The obtained crude purified product of Compound 2 as a khaki-colored solid was immediately used for the synthesis of Compound 4.
（２）化合物３の合成
化合物３の合成は、Ｓｈａｍｉｓらの文献（M.Shamis, H. N Lode, D. Shabat, J. Am. Chem. Soc. , 2004, 126, 1726-1731）に記載の方法を参考にして行った。具体的には、[２−［［［２，６−ビス［［［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル］オキシ］メチル］−４−メチルフェノキシ］カルボニル］メチルアミノ］エチル]メチル−，１，１−ジメチルエチルエステルを出発原料として、酢酸酸性条件下、ＴＢＤＳ(tert−butyl−dimethyl silyl)基を除去することにより化合物３を合成した。
(2) Synthesis of Compound 3 The synthesis of Compound 3 is described in the literature of Shamis et al. (M. Shamis, H. N Lode, D. Shabat, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 1726-1731). The method was used as a reference. Specifically, [2-[[[2,6-bis [[[(1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl] oxy] methyl] -4-methylphenoxy] carbonyl] methylamino] ethyl] methyl-, Compound 3 was synthesized by removing TBDS (tert-butyl-dimethyl silyl) group under acidic conditions of acetic acid using 1,1-dimethylethyl ester as a starting material.
（３）化合物４の合成
化合物２（２５４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２ｍＬ）溶液を、化合物３のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を、０℃で１５分間攪拌し、室温で３時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で観察した。飽和炭酸水素ナトリウムで水溶液で希釈後、クロロホルムで混合物を抽出し、抽出物を食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムにより、有機層を乾燥し、ろ過を行い、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、３３％ヘキサン／酢酸エチル）によって、粗精製物を精製し、茶色油状の化合物４を得た。
(3) Synthesis of Compound 4 A solution of compound 2 (254 mg, 0.66 mmol) in dichloromethane (2 mL) was added to a solution of compound 3 in dichloromethane (3 mL). The mixture was stirred at 0 ° C. for 15 minutes and at room temperature for 3 hours. The reaction was observed by TLC (hexane: ethyl acetate = 1: 2). After diluting with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, the mixture was extracted with chloroform, and the extract was washed with brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by column chromatography (SiO2, 33% hexane / ethyl acetate) to obtain Compound 4 as a brown oil.
化合物４について１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）を測定した。その結果、δ８．４９及び８．４６（ｓ，２Ｈ），７．５７−７．４９（ｍ，４Ｈ），７．２９−７．１７（ｍ，６Ｈ），５．２２（ｓ，４Ｈ），３．５４−３．２３（ｍ，４Ｈ），３．０８、２．８３及び２．６７（Ｓ，６Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），１．３２及び１．２９（Ｓ，９Ｈ）であった。尚、アミド基を軸とした回転が制限されるため、幾つかのピークの組は、多重度が倍になっている。 For compound 4, a 1 H-NMR spectrum (300 MHz, CDCl 3 ) was measured. As a result, δ 8.49 and 8.46 (s, 2H), 7.57-7.49 (m, 4H), 7.29-7.17 (m, 6H), 5.22 (s, 4H) , 3.54-3.23 (m, 4H), 3.08, 2.83 and 2.67 (S, 6H), 2.28 (s, 3H), 1.32 and 1.29 (S, 9H). Since the rotation around the amide group is restricted, the multiplicity of some peak pairs is doubled.
また、ＦＡＢＭＳ(ＮＢＡ／ＣＨＣｌ３)の測定結果は、ｍ／ｚ７２７〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕であり、ＨＲＭＳによるＣ３９Ｈ３９Ｎ２Ｏ１２〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕の測定値は７２７．２５０５であった。尚、化合物４の分子質量の計算値は、７２７．２４９８である。 The measurement result of FABMS (NBA / CHCl 3 ) is m / z 727 [(M + H) + ], and the measurement value of C 39 H 39 N 2 O 12 [(M + H) + ] by HRMS is 727.2505. there were. Incidentally, the calculated value of the molecular mass of Compound 4 is 727.2498.
（４）化合物６の合成
化合物６の合成は、Ｚｈａｎｇらの文献（Z. Zhang, K. Tanabe, H. Hatta, S. Nishimoto, Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1905-1910）に記載の方法を参考にして行った。具体的には、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシメチル−５−メトキシインドールキノンを出発原料として、塩基性条件下、４−ニトロフェニルクロロホルマートを反応させることにより化合物６を合成した。
(4) Synthesis of Compound 6 The synthesis of Compound 6 is described in Zhang et al. (Z. Zhang, K. Tanabe, H. Hatta, S. Nishimoto, Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1905-1910). The description was made with reference to the method described. Specifically, Compound 6 was synthesized by reacting 4-nitrophenyl chloroformate under basic conditions using 1,2-dimethyl-3-hydroxymethyl-5-methoxyindolequinone as a starting material.
（５）ＩＱ−Ｃｏｕの合成
化合物４（１５５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を、０．５Ｍ ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（２ｍＬ）によって、Ｂｏｃ（ter-butoxy carbonyl）基を除去することにより脱保護して、化合物５を得た。減圧により、過剰量の酸を除去し、残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。化合物６のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を上記混合物に加え、室温で８時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：４）で観察した。飽和炭酸水素ナトリウムで水溶液で希釈後、酢酸エチルで混合物を抽出し、抽出物を食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムにより、有機層を乾燥し、ろ過を行い、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、最初１６．７％酢酸エチル／ヘキサンで溶出させ、酢酸エチル濃度を上げていき、最後には１００％酢酸エチルで溶出させる）によって、粗精製物を精製し、オレンジ色の油体としてＩＱ−Ｃｏｕ（収量：７２．１ｍｇ，０．０８１ｍｍｏｌ，収率：３９％）を得た。
(5) Synthesis of IQ-Cou Compound 4 (155 mg, 0.21 mmol) was deprotected by removing the Boc (ter-butoxy carbonyl) group with 0.5 M HCl / MeOH (2 mL) to give compound 5 Got. Excess acid was removed by vacuum and the residue was dissolved in DMF (1 mL). Compound 6 in DMF (1 mL) was added to the above mixture and stirred at room temperature for 8 hours. The reaction was observed by TLC (hexane: ethyl acetate = 1: 4). After diluting with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, the mixture was extracted with ethyl acetate, and the extract was washed with brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by column chromatography (SiO 2 , eluting first with 16.7% ethyl acetate / hexanes, increasing the ethyl acetate concentration, and finally with 100% ethyl acetate). IQ-Cou (yield: 72.1 mg, 0.081 mmol, yield: 39%) was obtained as an oil body.
ＩＱ−Ｃｏｕについて１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）を測定した。その結果、δ８．５４及び８．５０（ｓ，２Ｈ），７．５９−７．５２（ｍ，４Ｈ），７．３１−７．１９（ｍ，６Ｈ），５．５２−５．３９（ｍ，１Ｈ），５．２３−５．０４（ｍ，６Ｈ），３．８０−３．６６（ｍ，６Ｈ），３．５８−２．７５（ｍ，１０Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．２５及び２．２０（ｓ，３Ｈ）であった。尚、アミド基を軸とした回転が制限されるため、幾つかのピークの組は、多重度が倍になっている。 A 1 H-NMR spectrum (300 MHz, CDCl 3 ) was measured for IQ-Cou. As a result, δ 8.54 and 8.50 (s, 2H), 7.59-7.52 (m, 4H), 7.31-7.19 (m, 6H), 5.52-5.39 ( m, 1H), 5.23-5.04 (m, 6H), 3.80-3.66 (m, 6H), 3.58-2.75 (m, 10H), 2.31 (s, 3H), 2.25 and 2.20 (s, 3H). Since the rotation around the amide group is restricted, the multiplicity of some peak pairs is doubled.
また、ＦＡＢＭＳ(ＮＢＡ／ＣＨＣｌ３)の測定結果は、ｍ／ｚ８８８〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕であり、ＨＲＭＳによるＣ４７Ｈ４２Ｎ３Ｏ１５〔（Ｍ＋Ｈ）＋〕の測定値は８８８．２６０４であった。尚、ＩＱ−Ｃｏｕの分子質量の計算値は、８８８．２６１０である。 In addition, the measurement result of FABMS (NBA / CHCl 3 ) is m / z 888 [(M + H) + ], and the measurement value of C 47 H 42 N 3 O 15 [(M + H) + ] by HRMS is 888.2604. there were. In addition, the calculated value of the molecular mass of IQ-Cou is 888.2610.
〔実施例２：蛍光スペクトルの測定〕
化合物１（Ｃｏｕ）、化合物４（Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｏｕ）、ＩＱ−Ｃｏｕそれぞれを、アセトニトリルに１０μＭとなるように溶解した。上記それぞれの溶液の蛍光スペクトルを測定した。その結果を図１に示す。
[Example 2: Measurement of fluorescence spectrum]
Compound 1 (Cou), Compound 4 (Linker-Cou), and IQ-Cou were each dissolved in acetonitrile so as to be 10 μM. The fluorescence spectrum of each of the above solutions was measured. The result is shown in FIG.
図１は、本実施の形態に係るＣｏｕ、Ｌｉｎｋｅｒ−Ｃｏｕ及びＩＱ−Ｃｏｕの蛍光スペクトルを示すグラフである。 FIG. 1 is a graph showing fluorescence spectra of Cou, Linker-Cou and IQ-Cou according to the present embodiment.
図１に示すように、クマリン単体であるＣｏｕは、非常に強い蛍光を示したのに対して、クマリンにＩＱを分子内に導入したＩＱ−Ｃｏｕの蛍光強度は著しく減少した。また、Ｃｏｕとリンカー部位のみからなるＬｉｎｋｅｒ−Ｃｏｕは、Ｃｏｕと比較して蛍光強度が約２／３となっているが、ＩＱ−Ｃｏｕと比較して強い蛍光を示した。このことから、ＩＱ−ＣｏｕにおけるＣｏｕの蛍光発光は、ＩＱによる分子内消光作用によって著しく抑制されていることがわかる。 As shown in FIG. 1, Couu, which is a single coumarin, showed very strong fluorescence, whereas the fluorescence intensity of IQ-Cou in which IQ was introduced into the molecule was significantly reduced. In addition, Linker-Cou, which is composed only of Cou and a linker site, has a fluorescence intensity of about 2/3 as compared with Cou, but showed stronger fluorescence than IQ-Cou. This shows that the fluorescence emission of Cou in IQ-Cou is remarkably suppressed by the intramolecular quenching action of IQ.
〔実施例３：Ｘ線照射〕
ＩＱ−Ｃｏｕ（５０μＭ）を含む、２０％の２−メチル−プロパノールを含有する超純水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）溶液に対して、室温で３０分間アルゴンバブリングを行うことにより、上記溶液を低酸素状態とした。上記溶液を密栓したガラスアンプルに入れ、室温下でＸ線源（４．０Ｇｙ／ｍｉｎ）により上記溶液にＸ線を照射した。一定時間毎に上記溶液の一部をサンプリングして、蛍光スペクトル測定を行った。また、その時、サンプルの容量に対して３３％の容量のＨＰＬＣ分析用超純水を加えて、サンプルを希釈した。好気性条件として、アルゴンを飽和させないコントロール溶液を、同様にＸ線照射及び分析を行った。その結果を図２に示す。
[Example 3: X-ray irradiation]
An ultrapure water (Milli Q) solution containing 20% 2-methyl-propanol containing IQ-Cou (50 μM) is subjected to argon bubbling at room temperature for 30 minutes to bring the solution into a low oxygen state. did. The solution was put into a sealed glass ampule, and the solution was irradiated with X-rays at room temperature with an X-ray source (4.0 Gy / min). A part of the solution was sampled at regular intervals to measure the fluorescence spectrum. At that time, the sample was diluted by adding HPLC analysis ultrapure water having a volume of 33% with respect to the volume of the sample. As an aerobic condition, a control solution which does not saturate argon was similarly subjected to X-ray irradiation and analysis. The result is shown in FIG.
図２は、本実施の形態に係るＩＱ−ＣｏｕのＸ線照射による濃度変化を示すグラフである。 FIG. 2 is a graph showing a change in density due to X-ray irradiation of IQ-Cou according to the present embodiment.
図２に示すように、好気性状態におけるＩＱ−Ｃｏｕの濃度は、Ｘ線照射ではＩＱ−Ｃｏｕが還元され難いため、時間の経過と共にほとんど変化しなかった。好気性状態におけるＣｏｕの濃度もまた、連結していた抑制部位及びリンカー部位がＩＱ−Ｃｏｕから遊離していないため、時間と共にほとんど変化しなかった。 As shown in FIG. 2, the concentration of IQ-Cou in the aerobic state hardly changed over time because IQ-Cou was hardly reduced by X-ray irradiation. The concentration of Cou in the aerobic state also changed little with time because the linked inhibitory and linker sites were not released from IQ-Cou.
それに対して、低酸素状態におけるＩＱ−Ｃｏｕの濃度は、Ｘ線照射により急速にＩＱ−Ｃｏｕが還元されるため、時間の経過と共に減少した。これに伴って、Ｃｏｕの濃度は、連結していた抑制部位及びリンカー部位がＩＱ−Ｃｏｕから遊離するため、時間の経過と共に増加した。 In contrast, the IQ-Cou concentration in the hypoxic state decreased with time because IQ-Cou was rapidly reduced by X-ray irradiation. Along with this, the concentration of Cou increased with the passage of time because the linked inhibitory site and linker site were released from IQ-Cou.
〔実施例４：ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼによるＩＱ−Ｃｏｕの生物学的還元活性化〕
低酸素状態とするため、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼ（１０．６μｇ／ｍＬ）とβ−ＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）の２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して、アルゴンバブリングを行い、３７℃で１０分間インキュベートした。上記溶液に対して、ＩＱ−Ｃｏｕ（最終的な濃度：５００μＭ）を加え、３７℃でインキュベートした。一定時間毎に上記溶液の一部をサンプリングして、サンプルの容量に対して１０％の容量のＨＰＬＣ分析用超純水／アセトニトリル（１：１）を加えて、サンプルを希釈した。好気性条件として、アルゴンを飽和させないコントロール溶液を、同様にインキュベート及び分析を行った。その結果を図３に示す。
[Example 4: Biological reduction activation of IQ-Cou by NADPH-P450 reductase]
In order to achieve hypoxia, argon bubbling was performed on NADPH-P450 reductase (10.6 μg / mL) and β-NADPH (2 mM) 25 mM phosphate buffer (pH 7.4) and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. did. IQ-Cou (final concentration: 500 μM) was added to the above solution and incubated at 37 ° C. A part of the solution was sampled at regular intervals, and the sample was diluted by adding 10% volume of ultrapure water for HPLC analysis / acetonitrile (1: 1) to the volume of the sample. As aerobic conditions, a control solution that does not saturate argon was similarly incubated and analyzed. The result is shown in FIG.
図３は、本実施の形態に係るＩＱ−Ｃｏｕの還元酵素存在下における濃度変化を示すグラフである。 FIG. 3 is a graph showing changes in the concentration of IQ-Cou according to the present embodiment in the presence of a reductase.
図３に示すように、好気性状態におけるＩＱ−Ｃｏｕの濃度は、還元酵素存在下ではＩＱ−Ｃｏｕが還元され難いため、時間の経過と共にほとんど変化しなかった。好気性状態におけるＣｏｕの濃度もまた、連結していた抑制部位及びリンカー部位がＩＱ−Ｃｏｕから遊離していないため、時間と共にほとんど変化しなかった。 As shown in FIG. 3, the concentration of IQ-Cou in the aerobic state hardly changed over time because IQ-Cou was hardly reduced in the presence of reductase. The concentration of Cou in the aerobic state also changed little with time because the linked inhibitory and linker sites were not released from IQ-Cou.
それに対して、低酸素状態におけるＩＱ−Ｃｏｕの濃度は、還元酵素により急速にＩＱ−Ｃｏｕが還元されるため、時間の経過と共に減少した。これに伴って、Ｃｏｕの濃度は、連結していた抑制部位及びリンカー部位がＩＱ−Ｃｏｕから遊離するため、時間の経過と共に増加した。 In contrast, the concentration of IQ-Cou in the hypoxic state decreased with time because IQ-Cou was rapidly reduced by the reductase. Along with this, the concentration of Cou increased with the passage of time because the linked inhibitory site and linker site were released from IQ-Cou.
〔実施例５：細胞培養〕
ＭＣＦ−７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。古い培地を取り除き、Ｈａｎｋの平衡塩類溶液で洗浄した後、ＭＣＦ−７細胞をＩＱ−Ｃｏｕ（５μＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０によって、低酸素状態（９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２）及び好気性状態（９５％空気＋５％ＣＯ２）それぞれで、３７℃で２時間培養した。培地を取り除き、Ｈａｎｋの平衡塩類溶液で洗浄した後、細胞について蛍光顕微鏡により撮像した。コントロールの細胞は、ＩＱ−Ｃｏｕが存在しない条件で、同様に培養及び撮像を行った。その結果を図４に示す。
[Example 5: Cell culture]
MCF-7 cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. After removing the old medium and washing with Hank's balanced salt solution, MCF-7 cells were hypoxic (95% N 2 + 5% CO 2 ) and aerobic (95%) with RPMI 1640 containing IQ-Cou (5 μM). % Air + 5% CO 2 ) at 37 ° C. for 2 hours. After removing the medium and washing with Hank's balanced salt solution, the cells were imaged with a fluorescence microscope. Control cells were cultured and imaged in the same manner in the absence of IQ-Cou. The result is shown in FIG.
図４は、ＩＱ−Ｃｏｕと共に培養したＭＣＦ−７細胞の画像を示す図面である。図４（ａ）はＩＱ−Ｃｏｕ不在の培地により低酸素状態で培養した場合の図面である。また、図４（ｂ）はＩＱ−Ｃｏｕ不在の培地により好気性状態で培養した場合の図面である。また、図４（ｃ）はＩＱ−Ｃｏｕを含む培地により低酸素状態で培養した場合の図面である。また、図４（ｄ）はＩＱ−Ｃｏｕを含む培地により好気性状態で培養した場合の図面である。 FIG. 4 is a drawing showing images of MCF-7 cells cultured with IQ-Cou. FIG. 4 (a) is a drawing in the case of culturing in a hypoxic state using a medium without IQ-Cou. FIG. 4 (b) is a drawing in the case of culturing in an aerobic state using a medium without IQ-Cou. FIG. 4 (c) is a drawing in the case of culturing in a low oxygen state using a medium containing IQ-Cou. FIG. 4 (d) is a drawing when the cells are cultured in an aerobic state using a medium containing IQ-Cou.
図４（ａ）（ｂ）に示すように、ＩＱ−Ｃｏｕを投与していない細胞は、蛍光発光をほとんど示さなかった。また、図３（ｄ）に示すように、ＩＱ−Ｃｏｕを投与しているが、好気性条件で培養した細胞も蛍光発光をほとんど示さなかった。 As shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b), cells to which IQ-Cou was not administered showed little fluorescence. In addition, as shown in FIG. 3 (d), IQ-Cou was administered, but cells cultured under aerobic conditions showed almost no fluorescence.
これに対し、図４（ｃ）に示すように、ＩＱ−Ｃｏｕを投与して、低酸素条件下で培養した場合にのみ、非常に明るい蛍光が観察された。この結果は、ＩＱ−Ｃｏｕが細胞内還元酵素のcytochrome-P450により、低酸素条件下で選択的に還元され、蛍光性のＣｏｕが遊離したことを強く支持するものである。 On the other hand, as shown in FIG. 4 (c), very bright fluorescence was observed only when IQ-Cou was administered and cultured under hypoxic conditions. This result strongly supports that IQ-Cou was selectively reduced by cytochrome-P450, an intracellular reductase, under hypoxic conditions, and that fluorescent Cou was released.
以上のことより、本発明に係る化合物の抑制部位を目標部位で選択的に遊離する分子にすることで、上記化合物が目標部位に到達すると、上記化合物における蛍光性分子骨格部分が上記抑制部位から離れ、蛍光性分子骨格部分は本来有している強い蛍光を発することができる。上記蛍光性分子骨格部分は目標部位で強い蛍光を発するため、体外から蛍光を検出することにより画像のイメージングを行うことができる。また、上記化合物は、蛍光強度を自由に設計することができるため、検出感度を高めることができる。従って、患部の切除を行うことなく、高感度のイメージングを行うことができる画像診断用組成物を提供することができる。 From the above, by making the inhibitory site of the compound according to the present invention a molecule that is selectively released at the target site, when the compound reaches the target site, the fluorescent molecular skeleton in the compound is separated from the inhibitory site. The fluorescent molecular skeleton part can emit strong fluorescence inherently away. Since the fluorescent molecular skeleton emits strong fluorescence at the target site, images can be imaged by detecting fluorescence from outside the body. Moreover, since the said compound can design fluorescence intensity freely, it can raise detection sensitivity. Therefore, it is possible to provide a diagnostic imaging composition capable of performing high-sensitivity imaging without excision of the affected area.
本発明は、標的部位で選択的に蛍光強度が強くなる新規化合物および該化合物を含む癌診断用酸素センサー等の画像診断用組成物を提供するものであり、医薬品産業の分野に好適に利用することができる。 The present invention provides a novel compound whose fluorescence intensity is selectively enhanced at a target site and a composition for image diagnosis such as an oxygen sensor for cancer diagnosis containing the compound, and is suitably used in the field of the pharmaceutical industry. be able to.
Claims (8)
上記リンカー部位は、上記抑制部位の遊離に引き続いて遊離する性質を備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。 Furthermore, it includes a linker site that links the functional site and the inhibitory site,
The compound according to claim 1 or 2, wherein the linker site has a property of being released following the release of the suppression site.
で表される構造を有していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。 The compound is represented by the general formula (1)
The compound according to claim 1, which has a structure represented by:
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