JP2007061080A - 電気泳動によるデオキシリボ核酸特定部位の１塩基変異検出法 - Google Patents

Abstract

【課題】 デオキシリボ核酸中の１塩基変異をポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で検出するには温度制御が必要で装置が大きくなるという問題があった。
【解決手段】 二重鎖ＤＮＡの中途から１本鎖のループを形成させるために欠失を導入した１本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応終了後の反応液にハイブリダイゼーション・プローブとして添加し、熱融解、アニール、ポリメラーゼ伸長反応を１回実施する。欠失のある１本鎖ＤＮＡとハイブリダイズして１本鎖ループを形成したハイブリッド分子は非変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で正規の二重鎖ＤＮＡと比較して大幅に移動度を低下させる。ループ形成に用いる１本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション・プローブを１塩基変異が予想される箇所に欠失部が隣接するように設計し、１塩基変異をループ長の変化による移動度の差としてミニゲルによる室温のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で検出する。
【選択図】 図１

Description

本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中の特定部位での１塩基置換を検出するため、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ループが出る形状のハイブリッド分子を形成させ、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動におけるその移動度の変化を利用する方法に関する。

がんの診断において特定遺伝子中の変異の有無を知ることはますます重要になっている。また薬剤感受性と特定遺伝子多型との相関による薬害リスク候補者の選別、原因遺伝子のわかった遺伝性疾患の変異遺伝子保有者の検出、法医学における個体識別法としてＤＮＡ中の変異または多型による１塩基置換の有無を確定すること（ＤＮＡ鑑定）の重要性はすでによく認識されている。ＤＮＡ中の１塩基置換を検出する従来の簡易法として、ＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で増幅し、その産物が熱融解後の冷却過程で１本鎖ＤＮＡ分子内の部分的塩基対合により形成する一定の分子形状を利用し、１塩基変異を有する分子を１本鎖ＤＮＡの形状変化による電気泳動での移動度の差として分離識別するエス・エス・シー・ピー（ＳＳＣＰ）法がある。

ＳＳＣＰ法における電気泳動装置は、１本鎖ＤＮＡの分子形状を維持するために電気泳動中の温度を一定に保つことが重要であり、そのために循環式定温装置などで非変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動装置のゲル板に循環式定温装置からの水が流れるパイプを密着させることにより電気泳動中に発生する熱を放散させる必要があった。

Ｏｒｉｔａ，Ｍ．他 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５，８７４−８７９（１９８９） ＡＴＴＯ社 科学機器総合カタログ、２００４−２００５年版、ｐ１２

現在広く利用されているＳＳＣＰ法では一本鎖ＤＮＡの分子形状を維持させるため、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動中の温度を一定に保持する必要があり、また分子形状の１塩基置換による形状差を検出するために大型電気泳動装置を必要とするため、装置全体の構成が複雑であった。

本発明はＳＳＣＰ法とは異なる原理に基づき、温度制御をしない小型ゲルで、簡便に１塩基変異の検出を実現する。

本発明は３から６０塩基の範囲の欠失を内部に持つ１本鎖ＤＮＡと欠失のない相補性１本鎖ＤＮＡの間に形成されるハイブリッド分子が２本鎖に加え１本鎖のループを有するため、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で１本鎖ループ形状のない正規の２本鎖ＤＮＡに比し電気泳動度の大幅な低下が起こることを原理として利用する。

図２により１本鎖ループを持つハイブリッドＤＮＡの概念図をしめす。Ｓで示した１本鎖ＤＮＡに対し、ＤＳは欠失をＳの内部に持つ１本鎖ＤＮＡ、ＬＣはその欠失のないＳに対する相補性１本鎖ＤＮＡ、ＬはＤＳにおいて欠失する領域Ｄと相補なＬＣ内の部分、ＤＳ鎖とＬＣ鎖が相補性領域でハイブリッド分子Ｈを形成したとき、相補性対合の相手がない領域Ｌは１本鎖ループとなる。このような１本鎮ループを有するＤＮＡハイブリッド分子Ｈを、以後、ループ・ハイブリッドと呼称する。

本発明は、検出しようとする１塩基変異部位に隣接して上記の１本鎖ループを形成させ、１塩基変異による塩基間の対合不整により１本鎖ループ長が２塩基分増加することを変異検出に利用する。１本鎖ループを形成させるために必要なオリゴＤＮＡを以下ループ・ハイブリダイゼーション・プローブまたはＬＨプローブと呼ぶ。

ＬＨプローブに必要な条件を図３によって説明する。ＬＨプローブＰとハイブリダイズしてループを形成する１本鎖ＤＮＡをＬＳで表す。ＬＨプローブＰは、１本鎖ループ形成領域の上流Ａと下流Ｂにそれぞれ２０塩基以上あり、特にＡは５’側でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用したオリゴＤＮＡプライマーの配列を含むようにする。ＬＨプローブＰの３′側は相補鎖ＬＳとハイブリダイズしたあと、Ｃで示す不足部分は次項に説明するＬＨサイクルでポリメラーゼ伸張反応による鋳型合成を受け、図２のループ・ハイブリッドＨの形の分子になる。Ｃで示すＬＨプローブＰの不足部分はＬＨプローブがＰＣＲプライマー対の片方とハイブリダイズしないよう２０塩基以上であることが必要である。

図４により、１本鎖ループに隣接した部位での１塩基変異によるループの形状の変化について説明する。２つのループ・ハイブリッド分子ＰＳ−ＮＳとＰＳ−ＭＳはＭＢで示された１塩基においてのみ異なる。ハイブリッド分子の下線部Ｌは１本鎖ループを形成する部分であり、対応する配列の破線部は欠失を意味する。コロン（：）により相補性塩基対を示す。１塩基変異ＭＢがあると、ループ・ハイブリッド分子ＰＳ−ＭＳでは、塩基対がＭＢで不整合となり、その結果ループの長さが１塩基分増加し、また、相手の相補鎖に１塩基の余りが生ずる結果ループの長さが２塩基分増加する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅したＤＮＡに対してループ・ハイブリッド分子を形成させる手段を以下に示す。ポリメラーゼ連鎖反応終了後、ＬＨプローブを最終濃度５００ｎＭとなるようにポリメラーゼ連鎖反応液に加え、ＤＮＡの熱変性（９４℃、２分）、ＤＮＡ分子会合反応（５５℃、３０秒）、残存ポリメラーゼによる鋳型伸張反応（６８℃、４分）をこの順に一度のみ行う。添加したＬＨプローブの濃度はポリメラーゼ連鎖反応に用いたプライマーの初期濃度２００ｎＭの２．５倍とした。この一連の操作を以下、ループ・ハイブリッド・サイクルまたはＬＨサイクルと呼ぶ。

ＬＨサイクルの前段階となるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において反応に用いた鋳型ＤＮＡの変異検出部で変異がヘテロにある場合、そのＰＣＲ反応の正規の産物である２重鎖ＤＮＡ、およびＤＮＡ鎖間の分子会合反応で生じるヘテロ２重鎖ＤＮＡが形成される。ＬＨサイクルを実行すると、これらが熱変性で乖離し、ＬＨプローブとそれに対し相補性を有する１本鎖が分子会合、鋳型伸張反応を経て、ループ・ハイブリッドを形成する。ＬＨプローブと会合した１本鎖ＤＮＡが野生型であるか変異型であるかによって、２種のループ・ハイブリッドが形成され、変異型ループ・ハイブリッドでは変異による１塩基の不整対合の結果、ループに２塩基分の長さの増加がある。ループ・ハイブリッドに関与しなかったＰＣＲ産物由来の１本鎖ＤＮＡは、残存するＰＣＲ反応用プライマーとハイブリダイズし、残存ポリメラーゼによる鋳型伸張反応を経て、正規２重鎖ＤＮＡを生成するか、または、相補ＤＮＡ鎖間でホモないしヘテロ２重鎖を形成する。ループ・ハイブリッドを形成しないＬＨプローブは１本鎖で残る。

図１により、ＬＨサイクル生成物の典型的な電気泳動像と変異型ループ・ハイブリッドの検出を説明する。ポリメラーゼ連鎖反応後、ＬＨサイクルを実行し、その反応生成物を１０％非変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分離する。＋極から−極への電気泳動後、二重鎖ＤＮＡに対し結合特異性のある蛍光試薬（エチジウム・ブロミドまたはサイバー・グリーンＩ）を用いてゲルを染色し、紫外線（２５４，３１２ｎＭ）照射より得られた電気泳動像を写真撮影するかまたはイメージ・スキャナーで取り込む。１本鎖ループを有するループ・ハイブリッド分子は正規の２本鎖ＤＮＡより低速で泳動されるため、正規２重鎖ＤＮＡのバンドＲから大きく遅れた位置のバンドＬＨとして泳動される。これらをループ・ハイブリッド・バンドまたはＬＨバンドと呼ぶ。ホモ接合型では、ＬＨバンドはレーン１または３で示すような１本のＬＨバンドとして検出され、ヘテロ接合型ではレーン１と３のＬＨバンドを重ねたレーン２のＬＨバンドが検出される。変異型のＬＨバンドがレーン１と３のどちらの位置に対応するかは、正常サンプルまたは塩基配列が既知の対照サンプルとの比較による。

本発明ではＤＮＡ中の１塩基変異をループ・ハイブリッド分子のループ長の変化に変換し、ループ・ハイブリッド分子の泳動度の差として１塩基変異の検出を可能とする。ループ・ハイブリッド分子の電気泳動度は正規２重鎖ＤＮＡの泳動度と大きく異なり、１塩基変異によるループ形状の変化がループ・ハイブリッド分子の電気泳動度に反映され、野生型ＬＨバンドとは識別可能な位置に変異型ＬＨバンドがシフトする。このような塩基変異によるＬＨバンドの移動差の検出は泳動距離が６ｃｍの１０％ポリアクリルアミド・ゲルにより室温下１時間以内の電気泳動で達成できる。

本発明の実施形態を以下の実施例において説明する。

図５により、ＥＧＦＲ遺伝子エクソン２０の１塩基多型（ＳＮＰ、米国生物情報センターＮＣＢＩのＳＮＰデータ・ベース識別番号ｒｓ１０２５１９７７）の検出について説明する。遺伝子検索に関する同意書の得られた正常ヒト・ゲノムＤＮＡの５０ｎｇをプライマー（配列番号１と２）によりＴａｑポリメラーゼ連鎖反応３０サイクル（インヴィトロジェン社、アキュプライムＴａｑ）で増幅する。反応終了後、ＬＨプローブ（配列番号３）を最終濃度５００ｎＭで添加し、ＬＨサイクルを１回行う。その反応生成物にゲル・ローディング・バッファーを添加し、非変性１０％ポリアクリルアミド・ゲルで電気泳動する。ポリアクリルアミド・ゲルは７ｃｍｘ７ｃｍのコンパクトゲル（アトー社、コンパクトゲルＣ１０Ｌ）を用い、トリス・グリシン緩衝液（３７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２８８ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎ）を泳動緩衝液として小型電気泳動装置（アトー社、ＡＥ−７３００コンパクトＰＡＧＥ）により室温で泳動した。泳動後、サイバー・グリーンＩ（タカラバイオ社、Ｆ０５１３）で１０分間染色し、水洗後、レーザー・イメージング・スキャナー（アマシャム社、ＳＴＯＲＭ８６０）を用い励起波長４５０ｎｍ、検出フィルター５２０ＬＰで検出した。電気泳動後検出されたＬＨバンド像を図５に示す。１５６塩基対の正規２重鎖ＤＮＡに対し、ＬＨバンドはサイズ・マーカー５００ｂｐと６００ｂｐの間に位置した。レーン１，７はＡ／Ｇヘテロ接合型、レーン２，３，５，６はＧ／Ｇホモ接合型、レーン４はＡ／Ａホモ接合型のＬＨバンドを示す。レーン１，７のヘテロ接合型はＧ／Ｇホモ接合型とＡ／Ａホモ接合型のＬＨバンドが重なった状態に対応する。

図６によって、がん遺伝子ＮＲＡＳのコドン６１（ＣＡＡ）での点突然変異による遺伝子変異の検出を実施例について説明する。ヒト濾胞性甲状腺がんの組織から抽出したＤＮＡを特異プライマー（配列番号４と５）を用いＴａｑポリメラーゼ連鎖反応３０サイクル（インヴィトロジェン社、アキュプライム）により増幅した。反応終了後、ＬＨプローブ（配列番号６）を最終濃度５００ｎＭで添加し、ＬＨサイクルを１回行った。反応生成物の電気泳動とＬＨバンドの検出は前項と同様に行い、その結果の電気泳動像を示す。レーン１−５はＣＡＡがＣＧＡに変異した症例群に対する電気泳動像、レーン６はＣＡＡからＡＡＡへ変異した症例に対する電気泳動像、レーン７−１１は変異のない症例群の電気泳動像を示す。Ｒで示す正規二重鎖ＤＮＡ１４９ｂｐの移動度に対し、ＬＨバンドは野生型バンドと変異型バンド共にサイズ・マーカーＭの４００ｂｐの付近に留まった。ＣＡＡからＣＧＡへの変異によるＬＨバンドとＣＡＡからＡＡＡへの変異によるＬＨバンドは野生型ＬＨバンドと明瞭に区別できる位置に移動しヘテロの変異体を区別できた。

図７によって、がん遺伝子ＫＲＡＳのコドン１２（ＧＧＴ）での点突然変異による遺伝子変異の検出について実施例を説明する。膵臓がん培養細胞株ＭｉａＰａＣａ−２はＫＲＡＳ遺伝子コドン１２にＧＧＴからＴＧＴへの変異があり正常ＫＲＡＳ遺伝子は失われている。膵臓がん培養細胞株ＰＡＮＣ１のＫＲＡＳ遺伝子コドン１２は正常型とＧＧＴからＧＡＴへの変異型の両者が存在する（Ａｏｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．ＭｏｌＣａｒｃｉｎｏｇ．２０，２５１−２５８，１９９７）。これらのがん培養細胞株から抽出したＤＮＡ、および正常ヒト・ゲノムＤＮＡ（ライフ・テクノロジー社）を鋳型とし、プライマー（配列番号７と８）を用いてポリメラーゼ連鎖反応３０サイクル（インヴィトロジェン社、アキュプライム）により増幅した。反応終了後、ＬＨプローブ（配列番号９）を最終濃度５００ｎＭで添加し、ＬＨサイクルを１回行った。反応生成物の電気泳動とＬＨバンドの検出は前項と同様に行い、結果の電気泳動像を示した。レーン１はＭｉａＰａＣａ−２、レーン２はＰＡＮＣ１、レーン３は正常ヒト・ゲノムＤＮＡの電気泳動像を示す。１６５ｂｐの正規２重鎖ＤＮＡ泳動バンドＲに比べ、ＬＨバンドはサイズ・マーカーＭの４００から６００ｂｐの泳動位置で移動し、変異型ＬＨバンドはレーン３の野生型ＬＨバンドと明瞭に識別できた。変異型ＬＨバンドの位置は変異塩基の種類によって異なった。

図８によって、甲状腺乳頭上皮がん細胞におけるＢＲＡＦ遺伝子エクソン１５のコドン５９９におけるＧＴＧからＧＡＧへの点突然変異の検出について説明する。甲状腺乳頭上皮がんから抽出したＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号１０と１１）を用いてポリメラーゼ連鎖反応３０サイクル（インヴィトロジェン社、アキュプライム）により増幅した。反応終了後、ＬＨプローブ（配列番号１２）を最終濃度５００ｎＭで添加し、ＬＨサイクルを１回行った。反応生成物の電気泳動とＬＨバンドの検出は前項と同様に行い、結果の電気泳動像を示した。レーン１−５はＢＲＡＦのコドン５９９に変異がヘテロにある症例、レーン６−７は正常ＢＲＡＦの症例を示す。１６１ｂｐの正規２重鎖ＤＮＡ泳動バンドＲに比べ、ＬＨバンドはサイズ・マーカーＭの４００から５００ｂｐの泳動位置付近で移動し、変異型ＬＨバンドは野生型ＬＨバンドと明瞭に識別できた。

図９によって、肺腺がん細胞のＥＧＦＲ遺伝子コドン８５８における点突然変異によるＣＴＧからＣＧＧへの遺伝子変異の検出について説明する。肺腺がんから抽出したＤＮＡを鋳型とし、プライマー対（配列番号１３と１４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応３０サイクル（インヴィトロジェン社、アキュプライム）により増幅した。反応終了後、ＬＨプローブ（配列番号１５）を最終濃度５００ｎＭで添加し、ＬＨサイクルを１回行った。反応生成物の電気泳動とＬＨバンドの検出は前項と同様に行い、結果の電気泳動像を示した。レーン１と２は変異型ＥＧＦＲ遺伝子をヘテロに持つ症例、レーン３と４は正常ＥＧＦＲの症例を示す。１６１ｂｐの正規２重鎖ＤＮＡ泳動バンドＲに比べ、ＬＨバンドはサイズ・マーカーの６００から７００ｂｐの泳動位置で移動し、レーン１，２での変異型ＬＨバンドは野生型ＬＨバンドと明瞭に識別できた。

動植物の育種での応用として、育種個体の遺伝解析のために１塩基多型（ＳＮＰ）の識別方法として使用することができる。また、特定の遺伝病の原因遺伝子の１塩基変異を検出し、その変異型遺伝子保有者の特定に使用することが出来る。さらに、複数遺伝子の１塩基多型により個人に由来するＤＮＡを用いその個人を特定する手段として使用できる。

ループ・ハイブリッドＤＮＡ分子のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による１塩基変異検出の模式図 ループ・ハイブリッドＤＮＡ分子の形成に関わる１本鎖ＤＮＡの概念図 ループ・ハイブリッドを形成したＬＨプローブの概念図 ループ形成位置と変異検出塩基の位置の関係を示す塩基配列の１例 ＥＧＦＲ遺伝子エクソン２０における１塩基多型の検出を示す電気泳動写真。レーン１，７はＡ／Ｇのヘテロ接合型の例、レーン２，３，５，６はＧ型、４はＡ型のホモ接合型の例。 ＮＲＡＳ遺伝子コドン６１における点突然変異検出を示す電気泳動写真。レーン１−５はＣＡＡからＣＧＡへ、６はＣＡＡからＡＡＡへの変異をヘテロに持つ例、レーン７−１１は正常型の例。Ｍは２００−５００ｂｐのラダー・マーカー。 ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２における点突然変異の検出を示す電気泳動写真。レーン１はホモ型変異の１例、レーン２はヘテロ型変異の１例、レーン３は正常型、Ｍは２００−６００ｂｐのラダー・マーカー。 ＢＲＡＦ遺伝子コドン５９９における点突然変異の検出を示す電気泳動写真。レーン１−５はヘテロに変異型を持つ例、６−９は正常型の例。Ｍは２００−５００ｂｐのラダー・マーカー ＥＧＦＲ遺伝子コドン８５８における点突然変異の検出を示す電気泳動写真。レーン１，２はヘテロに変異型を持つ例、レーン３，４は正常型の例。Ｍは２００−７００ｂｐのラダー・マーカー

符号の説明

ＬＨ ループ・ハイブリッド分子
Ｒ ＰＣＲで産生される正規２重鎖ＤＮＡ
Ｓ １本鎖ＤＮＡ断片を表す線分
Ｄ 欠失に対応する領域
ＤＳ Ｄを欠失した１本鎖ＤＮＡを表す線分
ＬＣ ハイブリッド分子形成によりループを形成した１本鎖ＤＮＡ
Ｈ ループ・ハイブリッド分子の形状模型
ＳＣ ハイブリッド分子を形成する前のＳと相補的かつＬＣと同一の１本鎖ＤＮＡ
Ｌ １本鎖ＤＮＡ中のハイブリッド分子を形成後にループを形成する領域
Ｐ ＬＨプローブを表す線分
ＬＳ ＬＨプローブとループ・ハイブリッドを形成する１本鎖ＤＮＡを表す線分
Ａ ＬＨプローブ内のループ形成部に対して５’側の領域
Ｂ ＬＨプローブ内のループ形成部に対して３’側の領域
Ｃ ＬＨプローブがループ・ハイブリッドを形成した後、ポリメラーゼ伸長合成反応によって合成される領域
ＰＳ ＬＨプローブのループ・ハイブリッド形成に関わる配列の１例
ＮＳ ＬＨプローブとハイブリダイズしループを形成する１本鎖ＤＮＡの配列の１例
ＭＳ ＬＨプローブとハイブリダイズしループを形成する１本鎖ＤＮＡの配列に変異がある場合の１例
ＭＢ １塩基変異のある部位
： 相補性塩基対

Claims (2)

1. ポリメラーゼ連鎖反応後の反応液に１本鎖オリゴＤＮＡを添加し、ハイブリダイゼーションにより特異的１本鎖ループを形成したＤＮＡハイブリッド分子を生成する技術。
2. ２本鎖ＤＮＡから１本鎖ループが出た形状のハイブリッド分子をポリアクリルアミドのミニゲルで電気泳動し、このハイブリッド分子のポリアクリルアミド・ゲル中での移動度が正規の２本鎖ＤＮＡ分子に比べ大幅に低下し、また、１本鎖ループ構造の変化に対応して変動することを利用する１塩基変異検出法。

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