JP2006513714A - アデノウイルス血清型２４ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルス - Google Patents
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Abstract
アデノウイルス血清型はそれらの天然指向性において異なる。アデノウイルスの種々の血清型は、少なくともそれらのキャプシドタンパク質（例えば、ペントンベースおよびヘキソンタンパク質）、細胞結合をもたらすタンパク質（例えば、ファイバータンパク質）およびアデノウイルスの複製に関与するタンパク質において異なることが判明している。指向性およびキャプシドタンパク質における血清型間のこの相違は、キャプシドタンパク質の修飾によりアデノウイルス指向性を改変することを目的とした多くの研究努力につながっている。本発明は、キャプシドタンパク質の修飾のそのような要件を回避するものであり、本発明は、希有アデノウイルス血清型である血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルス、および該代替的組換えアデノウイルスの製造方法を提供する。また、外因性遺伝子の運搬および発現のために組換えアデノウイルスを使用する手段を提供する。
Description
本発明は、アデノウイルス血清型２４ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルスに関する。
アデノウイルスは、いくつかの鳥類および哺乳類宿主において同定されている非外包性正二十面体ウイルスである（Ｈｏｍｅら，１９５９ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：８４−８６；Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９０ Ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，ｐｐｓ．１６７９−１７２１）。最初のヒトアデノウイルス（Ａｄ）は１００年以上前に分離された。それ以来、種々の哺乳類種に感染する１００を超える異なるアデノウイルス血清型が分離されており、それらのうちの５１個はヒト由来である（Ｓｔｒａｕｓ，１９８４，Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編，ｐｐｓ．４５１−４９８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９８８ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：８０４−８１３；ＳｃｈｎｕｒおよびＤｏｎｄｅｒｏ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６：７９−８３；Ｊｏｎｇら，ｌ９９９ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５）。ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量比および腫瘍原性を含む多数の生化学的、化学的、免疫学的および構造的基準に基づき、ヒト血清型は６つの亜属（Ａ〜Ｆ）に分類されている（Ｓｔｒａｕｓ，前掲；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前掲）。
アデノウイルスゲノムは非常に詳細に特徴づけられている。それは約３６，０００塩基対の直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子よりなり、いくつかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、同様に位置した特異的機能を有するアデノウイルスゲノムの全体的な体制においては或る程度の全般的保存性が認められる。
アデノウイルスは外因性遺伝子の運搬のための非常に魅力的な標的である。アデノウイルスの生物学は非常に詳細に理解されている。アデノウイルスが免疫適格性個体における重篤なヒト病理に関連していることは見出されていない。該ウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞内に非常に効率的に導入し、多種多様な細胞に感染しうる。さらに、該ウイルスは、高いウイルス力価で大量に生産されうる。また、該ウイルスは、ウイルスゲノムの必須初期領域１（Ｅ１）の欠失により、複製欠損型にされうる（Ｂｒｏｄｙら，１９９４ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１）。
複製欠損型アデノウイルスベクターはワクチン用および遺伝子治療用の遺伝子導入ベクターとして広範に使用されている。これらのベクターは、Ｅ１遺伝子産物をトランスで付与する細胞系内で増殖する。該ベクターが、同じ又は非常に類似した血清型からのものである場合、トランスでの必須Ｅ１遺伝子産物の相補は非常に有効である。例えば、Ｅ１欠失Ｃ群血清型（Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６）は、Ａｄ５ Ｅ１領域を含有し発現する２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞内で良く増殖する。しかし、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞内のＡｄ５ Ｅ１配列はＣ群以外のすべての血清型の複製を完全に相補するわけではない。これは恐らく、Ａｄ５（Ｃ群）Ｅ１Ｂ ５５Ｋ遺伝子産物が非Ｃ群血清型のＥ４遺伝子産物と機能的に相互作用し得ないからであろう。該相互作用は同一血清群のメンバーにおいては保存されているが、亜群間では良く保存されていることは見出されていない。別の非Ｃ群血清型の組換えアデノウイルスを成功裏かつ効率的にレスキューするためには、関心のある血清型のＥ１領域を発現する細胞系を作製しなければならないであろう。あるいは、入手可能なＡｄ５Ｅ１発現細胞系を修飾して、Ａｄ５Ｅ１の他にＡｄ５Ｅ４（またはＯｒｆ６）を発現させることが可能であろう。これらの追加的な、時には面倒でやる気を失わせるような作業は、組換え非Ｃ群アデノウイルスベクターの製造の障害となった。
Ａｄ５ Ｅ１発現細胞系（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６または２９３）における別の血清型の増殖およびレスキューのための効率的な手段は、係属中の米国仮特許出願（２００２年８月２２日付け出願の第６０／４０５，１８２号）に開示されている。この方法は、決定的に重要なＥ４領域を、増殖させるアデノウイルス内に取り込ませることを含む。その決定的に重要なＥ４領域は、相補する細胞系のＥ１遺伝子産物（特に、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ領域）のものと同じ又は非常に類似した血清型のウイルスに固有のものであり、少なくとも、Ｅ４ Ｏｒｆ６をコードする核酸を含む。
現在のところ、Ｃ亜群からの２つの良く特徴づけられたアデノウイルス血清型であるＡｄ５およびＡｄ２が、もっとも広く使用されている遺伝子運搬用ベクターである。一般集団における中和抗体が、同じ血清型での初回投与または再投与を制限しうるため、遺伝子導入用ベクターとしての代替的Ａｄ血清型を開発することが必要とされている。中和抗体の保有率は血清型によって様々でありうる。Ａｄ５のような幾つかの血清型に対する中和抗体が一般的であり、他の血清型に対する抗体は比較的稀である。さらに、血清型が異なれば、それが有する指向性も異なり、したがって、代替的血清型がワクチンまたは遺伝子治療に用いられた場合には、より優れた免疫応答が惹起されうる。
アデノウイルス血清型２４（Ｄ亜群アデノウイルス）は１９６０年に最初に分離され（Ｓ．Ｄ．Ｂｅｌｌら，１９６０ Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｈｙｇ．９：５２３）、１９６３年に、認められた参考株として確立された（Ｈ．Ｇ．Ｐｅｒｅｉｒａら，１９６３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０：６１３）。参考ウマ抗血清において決定された４６個の他のヒトアデノウイルスに対するその抗原関連性が考察されている（Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９９１ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２１：１７９−１９７）。Ａｄ２４ヘキソンの部分配列（２８３８ｂｐのうちの１０９１）がＴａｋｅｕｃｈｉら，１９９９ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３３９２−３３９４に開示されており、Ｇｅｎ Ｂａｎｋに寄託されている（アクセッション番号ＡＢ０２３５５３）。Ａｄ２４のウイルス付随ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡ）の配列ならびに前末端（ｐｒｅ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）タンパク質および５２／５５Ｋタンパク質の部分配列（５２１ｂｐ）がＭａ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６０５−６６１７およびＧｅｎ Ｂａｎｋ（アクセッション番号ＨＡＵ５２５４４）に開示されている。
ワクチンおよび遺伝子治療の分野は、代替的アデノウイルス血清型、特に、ヒト集団においては十分に示されていないＡｄ２４のような血清型に関する更なる知見から大きな利益を得るであろう。特に関心が持たれるのは、代替的アデノウイルス血清型に基づく組換えアデノウイルスベクター、およびそのような組換えアデノウイルスベクターの入手手段である。当技術分野におけるこの要求は、アデノウイルス血清型２４に基づく組換えアデノウイルスベクターに関する本出願の開示により満たされる。
発明の概要
本発明は、希有（ｒａｒｅ）アデノウイルス血清型である血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクター、および該代替的血清型に基づく組換えアデノウイルスの製造方法に関する。また、外因性遺伝子の運搬および発現のために組換えアデノウイルスを使用する手段を提供する。したがって、本発明は、それぞれのトランスジーンの有効な発現を促進する調節配列に機能しうる形で連結された１以上のトランスジーンを含む血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを含む。そのような組換えアデノウイルス血清型２４ベクターの、宿主への投与は、単独での投与であるか或いは組合せ法および／または初回−追加抗原刺激法であるかには無関係に、取り込まれたトランスジーンの効率的な発現をもたらし、投与された特定の抗原（例えば、ＨＩＶ）を特異的に認識する免疫応答を効果的に誘導する。さらに、該組換えウイルスは、より頻繁にヒト集団において見出されるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ５およびＡｄ２）に対する既存免疫を逃れるはずである。したがって、開示されている方法は、関心のある特定の抗原（例えば、ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するための改良手段を提供するものである。したがって、得られる免疫応答は、未感染個体には予防上の利点をもたらし、および／または、感染個体においてはウイルス負荷レベルを減少させて感染の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらすはずである。
本発明は、希有（ｒａｒｅ）アデノウイルス血清型である血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクター、および該代替的血清型に基づく組換えアデノウイルスの製造方法に関する。また、外因性遺伝子の運搬および発現のために組換えアデノウイルスを使用する手段を提供する。したがって、本発明は、それぞれのトランスジーンの有効な発現を促進する調節配列に機能しうる形で連結された１以上のトランスジーンを含む血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを含む。そのような組換えアデノウイルス血清型２４ベクターの、宿主への投与は、単独での投与であるか或いは組合せ法および／または初回−追加抗原刺激法であるかには無関係に、取り込まれたトランスジーンの効率的な発現をもたらし、投与された特定の抗原（例えば、ＨＩＶ）を特異的に認識する免疫応答を効果的に誘導する。さらに、該組換えウイルスは、より頻繁にヒト集団において見出されるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ５およびＡｄ２）に対する既存免疫を逃れるはずである。したがって、開示されている方法は、関心のある特定の抗原（例えば、ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するための改良手段を提供するものである。したがって、得られる免疫応答は、未感染個体には予防上の利点をもたらし、および／または、感染個体においてはウイルス負荷レベルを減少させて感染の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらすはずである。
発明の詳細な説明
希有アデノウイルス血清型は、より一般に用いられるアデノウイルス血清型（例えば、アデノウイルス血清型２および５）と比較して固有の利点を有する。なぜなら、それによる外因性遺伝子の効率的な標的部位運搬および発現は既存免疫によっては制限されないと考えられるからである。また、異なるアデノウイルス血清型は、異なるキャプシド構造を有するため、異なる指向性を示し、したがって、異なる組織を標的化する可能性をもたらし、それがワクチンまたは遺伝子治療に用いられた場合には、おそらく、より優れた免疫応答の惹起をもたらすであろう。しかし、これらの希有アデノウイルス血清型は、複製欠損型にされると、現在入手可能なアデノウイルス増殖細胞系における増殖およびレスキューが困難となりうる。
希有アデノウイルス血清型は、より一般に用いられるアデノウイルス血清型（例えば、アデノウイルス血清型２および５）と比較して固有の利点を有する。なぜなら、それによる外因性遺伝子の効率的な標的部位運搬および発現は既存免疫によっては制限されないと考えられるからである。また、異なるアデノウイルス血清型は、異なるキャプシド構造を有するため、異なる指向性を示し、したがって、異なる組織を標的化する可能性をもたらし、それがワクチンまたは遺伝子治療に用いられた場合には、おそらく、より優れた免疫応答の惹起をもたらすであろう。しかし、これらの希有アデノウイルス血清型は、複製欠損型にされると、現在入手可能なアデノウイルス増殖細胞系における増殖およびレスキューが困難となりうる。
本出願人は、最近、１つのそのような希有複製欠損型代替的血清型であるアデノウイルス血清型２４（亜群Ｄアデノウイルス）をレスキューし増殖させることに成功した。本出願人は、本明細書中に、外因性トランスジーンの運搬および発現において該アデノウイルスが有効に機能することを示す。
したがって、本発明は、遺伝子治療またはワクチン接種プロトコールにおける使用に適した血清型２４の組換えアデノウイルスベクターに関する。野生型アデノウイルス血清型２４の核酸配列（配列番号１）が図５Ａ〜５Ｊに示されているが、当業者に理解されるとおり、アデノウイルス血清型２４の任意の機能的ホモログまたは異なる株を本発明の方法において使用することが可能である。アデノウイルス血清型は、ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量比および腫瘍原性を含む当技術分野において認識されている多数の生物学的、化学的、免疫学的および構造的基準により区別されている（Ｓｔｒａｕｓ，前掲；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前掲）。与えられた血清型は、ウイルスＤＮＡの制限マッピング、ウイルスＤＮＡの移動度、電気泳動後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のビリオンポリペプチドの移動度の分析、血清型を定める配列を含有する特にキャプシド遺伝子（例えば、ヘキソン）からの既知配列との配列情報の比較、およびＡＴＣＣから入手可能な特定の血清型に関する参考血清との配列の比較を含む多数の方法により同定されうる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，１９８０ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３５４：１６−４２において考察されている。制限マッピングによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１０：１９１−２２０において考察されている。Ａｄ２４に関する参考血清はＡＴＣＣから入手可能である（ＡＴＣＣ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏｓ．ＶＲ−１１０２ＡＳ／ＲＢおよびＶＲ−１１０２ＰＩ／ＲＢ）。アデノウイルス血清型２４（亜群Ｄアデノウイルス）は１９６０年に最初に分離され（Ｓ．Ｄ．Ｂｅｌｌら，１９６０ Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｈｙｇ．９：５２３）、１９６３年に、認められた参考株として確立された（Ｈ．Ｇ．Ｐｅｒｅｉｒａら，１９６３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０：６１３）。参考ウマ抗血清において決定された４６個の他のヒトアデノウイルスに対するその抗原関連性が当技術分野において考察されている（Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９９１ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２１：１７９−１９７）。
本発明のアデノウイルス血清型２４ベクターは、少なくとも部分的にＥ１において欠失しており、Ｅ１活性を欠き（または実質的に欠き）、意図される宿主において該ベクターは複製不能となる。好ましくは、Ｅ１領域は完全に欠失または不活性化している。該アデノウイルスはＥ３および他の初期領域における追加的な欠失を含有しうるが、Ｅ２および／またはＥ４が欠失している場合には、組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを作製するためにはＥ２および／またはＥ４相補細胞系を要するかもしれない。
本発明の方法で有用なアデノウイルスベクターは、Ｈｉｔｔら，１９９７“Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３７−２０６（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に概説されているような良く知られた技術を用いて構築することができる。関心のある特定のアデノウイルスに相同な配列を含む、関心のある異種核酸を含有するプラスミドまたはシャトルベクターを作製することが多い。ついで、相同組換えが生じて該ウイルス核酸内への該異種核酸の取り込みが生じる宿主細胞内に、クローン化ウイルスＤＮＡを含有するウイルスＤＮＡまたは第２プラスミドおよびシャトルベクターをコトランスフェクトする。好ましいシャトルベクターおよびクローン化ウイルスゲノムはアデノウイルス部分およびプラスミド部分を含有する。複製欠損型ベクターの構築において使用するシャトルベクターでは、アデノウイルス部分は、典型的には、非機能的な又は欠失したＥ１およびＥ３領域、ならびに簡便な制限部位に隣接した遺伝子発現カセットを含有する。シャトルベクターのプラスミド部分は、典型的には、原核生物プロモーターの転写制御下で抗生物質耐性マーカーを含有する。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および他の薬学的に許容される耐性マーカーを使用することが可能である。原核生物における発酵による該核酸の高レベルの産生を補助するためには、シャトルベクターが原核生物複製起点を含有し高コピー数であるのが好都合である。多数の商業的に入手可能な原核生物クローニングベクターがこれらの利点をもたらす。非必須ＤＮＡ配列は、好ましくは除去されている。また、該ベクターは真核細胞内で複製不能であることが好ましい。これは、核酸ワクチン配列が被投与者のゲノム内に組込まれるリスクを最小限にする。該核酸の発現を特定の組織型に限定するのが望ましい場合には、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用することが可能である。
シャトルベクターおよび野生型アデノウイルス２４ウイルスＤＮＡ（Ａｄ２４バックボーンベクター）の相同組換えはアデノウイルスプレプラスミド（例えば、ｐＡｄ２４ΔＥｌ、ｐＡｄ２４ΔＥｌＡｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６を参照されたい）の生成を引き起こす。線状化後、該プレプラスミドはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞または代替的Ｅ１相補性細胞系において複製しうる。ウイルスの複製が完了したら、感染細胞および培地を回収することが可能である。
十分な量のアデノウイルスを産生させるためには、一般には、パッケージング細胞が必要である。パッケージング細胞は、関心のある特定のアデノウイルスの産生に必要な要素を含有すべきである。パッケージング細胞およびベクターは、組換えにより複製可能ウイルスを与えうる重複要素を含有しないのが好ましい。組換えＡｄ２４ Ｅ１欠失ベクターの増殖に適した細胞の具体例はアデノウイルス２４または他のＤ群血清型の初期領域１（Ｅ１）を発現する。あるいは、同じ血清型に由来するがＡｄ２４以外の亜群に由来するアデノウイルスＥ１およびＥ４領域（特に、Ｅ４オープンリーディングフレーム６（「ＯＲＦ６」））（例えば、Ａｄ５ Ｅ１およびＥ４）を発現する増殖細胞系を使用することが可能である。例えば、Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９４６−８９５１および米国特許第５，８４９，５６１号を参照されたい。また、Ａｄ２４からのＥ１Ｂを、異なる亜群の血清型からの（１）Ｅ１Ａまたは（２）Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに加えて発現する細胞系を使用することが可能であろう。２００２年８月２２日付け出願の同時係属米国仮特許出願第６０／４０５，１８２号には、代替的アデノウイルス血清型の効率的な増殖およびレスキューのための方法が開示されている。該方法は、Ｅ１遺伝子産物（特に、相補性細胞系により発現されるＥ１Ｂ）のものと同じ又は非常に類似した血清型のＥ４領域（またはＥ４ ＯＲＦ６を含むその一部）をアデノウイルスベクターのゲノム内に取り込ませることに基づくものである。実施例１〜４は、Ａｄ５Ｅ４領域の取り込みおよびＰＥＲ．Ｃ６細胞（この細胞はＡｄ５Ｅ１を発現する）におけるその増殖によるそのような方法の実施可能性を示している。野生型アデノウイルス血清型５配列は公知であり、当技術分野において記載されている（参照により本明細書に組み入れるＣｈｒｏｂｏｏｚｅｋら，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１８６：２８０を参照されたい）。Ｅ４領域またはＯＲＦ６含有部分の配置は決定的に重要なことではない。実施例１〜４を参照されたい。決定的に重要な工程は、プロモーターが供給されること、または該遺伝子が効果的に配置されて、それが、該ベクターに固有のプロモーター（例えば、Ｅ４プロモーター）を外す（ｒｕｎ ｏｆｆ）ことのいずれかを確認する工程である。該ベクターの天然Ｅ４領域は置換され、欠失し又は無傷で残されうる。したがって、この方法は、本発明のアデノウイルスベクターの増殖およびレスキューにおける使用に適している。
典型的には、増殖細胞は、網膜または腎臓に由来するヒト細胞であるが、適当なＥ１および／またはＥ４領域を発現しうる任意の細胞系を本発明で使用することが可能である。胚性細胞、例えば羊膜細胞は、Ｅ１相補性細胞系の作製に特に適していることが示されている。いくつかの細胞系が入手可能である。これらには、ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、９１１、２９３およびＥ１ Ａ５４９が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターをアデノウイルスＥ１相補性細胞内にトランスフェクトし、ウイルス粒子を産生させることを含んでなる、アデノウイルスＥ１相補性細胞系における血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスの製造方法を含む。このようにして産生されたウイルス粒子は本発明のもう１つの態様を構成する。本発明の組換え複製欠損型アデノウイルス血清型２４ベクターを含む宿主細胞は本発明の更にもう１つの態様を構成し、細胞の集団として定義される宿主細胞はトランスジェニクヒトを含まない。本発明の方法に従い回収された組換え複製欠損型アデノウイルスも本発明に含まれる。この回収物質を精製し、製剤化し、宿主への投与まで保存することが可能である。
より一般に使用されるアデノウイルス血清型の投与または再投与を個体の免疫応答が有効に妨げる場合に特に、本発明のアデノウイルスベクターは、所望のタンパク質の発現の実施に非常に好適である。したがって、本発明の特定の実施形態は、関心のある異種核酸を含む血清型２４の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターである。関心のある核酸は、遺伝子、または遺伝子の機能的部分でありうる。該核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡであることが可能であり、二本鎖または一本鎖であることが可能であり、発現カセットの形態で存在することが可能である。該核酸は、Ｅ１と平行（５’から３’へ転写される）または逆平行（ベクターバックボーンに対して３’から５’方向へ転写される）の配向に挿入されうる。該核酸は、所望の宿主（例えば、哺乳類宿主）内での発現のためにコドンが最適化されうる。該異種核酸は発現カセットの形態でありうる。遺伝子発現カセットは、典型的には、（ａ）関心のあるタンパク質または抗原をコードする核酸、（ｂ）該タンパク質をコードする核酸に機能しうる形で連結された異種プロモーター、および（ｃ）転写終結シグナルを含有する。
特定の実施形態においては、該異種プロモーターは真核生物ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。本発明での使用に適したプロモーターの一例は、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６）。本発明で使用されうるプロモーターの更なる例としては、強力免疫グロブリンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβアクチンプロモーターが挙げられるが、意図される宿主内で発現を引き起こしうる任意のプロモーターが本発明の方法において使用されうると当業者に認識されうる。該プロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能配列を含みうる。転写および発現の調節の可能性をもたらすこれらのような配列は、遺伝子転写の抑制が望まれる場合に有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含むことが可能であり、その具体例としては、ウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）または以下のとおりに定められる５０ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）が挙げられる：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴ−ＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号２）。リーダーまたはシグナルペプチドをトランスジーン内に含有させることも可能である。特定の実施形態においては、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質ｔＰＡに由来する。
関心のある異種核酸は、免疫原性および／または治療用タンパク質をコードする遺伝子（またはその機能的対応物）である。好ましい治療用タンパク質としては、投与後に個々の宿主において何らかの測定可能な治療利益をもたらすものが挙げられる。好ましい免疫原性タンパク質は、個体において免疫応答を惹起しうる任意のタンパク質である。出願人は非ヒト霊長類（アカゲザル）における代表的な免疫原性タンパク質（ＨＩＶ ｇａｇ）の運搬を本明細書中に例示しているが、治療用または免疫原性タンパク質をコードする任意の遺伝子を、本明細書に開示されている方法において使用することが可能である。アデノウイルス血清型２４ベクターは有意なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが判明した（図６）。さらに、該結果は、開示されているベクターでの免疫化がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方を惹起しうることを示した（図７）。また、１０∧１１ｖｐの用量の該ベクターの投与に応答して、検出可能なレベルの循環抗ｇａｇ抗体が生成した（図８）。
したがって、本発明の１つの態様は、ＨＩＶトランスジーンを保持するアデノウイルス血清型２４に基づくベクターに関する。これらの実施形態においては、任意のＨＩＶ抗原をコードする核酸を使用することが可能である（それらの具体例には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｇｐｌ６０、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｔａｔおよびｒｅｖならびに前記遺伝子の誘導体が含まれる）。本明細書に例示されている実施形態は、コドン最適化ｐ５５ｇａｇ抗原をコードする核酸を使用する（図１２を参照されたい（配列番号３））。コドン最適化ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子は、それぞれ１９９７年８月２８日付け公開（ＷＯ ９７／３１１１５）および１９９７年１２月２４日付け公開のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子は、２０００年１２月２１日付け出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号および同様に２０００年１２月２１日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１ ｎｅｆ遺伝子は、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２に開示されている。
ＨＩＶ−１遺伝子を含む組換え複製欠損型Ａｄ２４ベクターのこの特定の実施形態においては、該遺伝子はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１に由来しうる（参照により本明細書に組み入れるＭｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ：１９９５，ＩＩＡ３−ＩＩＡ１９）。この遺伝子はクレードＢ（北米／欧州）配列のコンセンサスアミノ酸配列に酷似している。ＨＩＶ遺伝子配列は種々のクレードのＨＩＶ−１に基づくことが可能であり、その具体例としては、クレードＢおよびＣが挙げられる。多数のＨＩＶ株の遺伝子の配列がＧｅｎＢａｎｋから公に入手可能であり、ＨＩＶの一次（ｐｒｉｍａｒｙ）野外分離体は、これらの株を入手可能にするようＱｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に委託しているＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、株は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ），Ｇｅｎｅｖａ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからも入手可能である。特異的ＨＩＶ抗原またはその免疫学的に関連した部分もしくは修飾体をコードする適当なヌクレオチド配列を選択することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本明細書中で定義されるとおり、「免疫学的に関連」は、（１）ウイルス抗原に関しては、該タンパク質が、投与されると、該ウイルスの増殖および／または広がりを遅延させるのに及び／又は個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な個体内における測定可能な免疫応答を惹起しうること、または（２）ヌクレオチド配列に関しては、該配列が、前記の能力を有するタンパク質をコードしうることを意味する。
本発明は、本発明の組換えアデノウイルス血清型２４ベクターを個体に投与することを含んでなる、（１）個体において治療応答をもたらすための、および（２）免疫応答（細胞性免疫応答を含む）を生成させるための方法を含む。本発明の１つの態様は、関心のある抗原を発現する組換えアデノウイルス血清型２４ビヒクルを投与することを含んでなる、１以上の抗原（細菌、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）またはその他（例えば、癌））に対する増強された免疫応答を生成させるための方法である。より頻繁に現れるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ２およびＡｄ５）に対する既存免疫が、与えられた宿主において存在する場合に特に、この方法における組換えＡｄ２４ベクターの投与は細胞性免疫応答の改善をもたらす。この改善されたワクチン投与方法の効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（または発生率）（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス／細菌／外来因子のレベルの減少（すなわち、治療的用途）にあるはずである。ＨＩＶ適応症に関しては、この改善されたワクチン投与方法の効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス負荷のレベルの減少によるＨＩＶ−１感染の無症候期の延長（すなわち、治療的用途）にあるはずである。該組換えＡｄ２４ベクターの投与、細胞内運搬および発現は宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起する。
したがって、本発明は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、細菌または他の因子に対する暴露後の感染の確立を妨げるための有効な免疫予防をもたらすための、あるいは感染後治療用ワクチンとして、有益な長期的結果を伴って、より低いウイルス／細菌／その他の負荷の確立をもたらすための感染軽減のための、組換えＡｄ２４ウイルスベクター（または、本明細書中ではワクチンと称されるその免疫原性組成物）の投与に関する方法に関する。
本発明の組換えアデノウイルス血清型２４ベクターは、単独で又は初回／追加抗原刺激投与計画の一部として投与することが可能である。まず、初回用量の少なくとも１つの抗原（例えば、ＨＩＶ抗原）を組換えアデノウイルスベクターで運搬する。この用量は免疫応答を有効に初回刺激して、後に循環免疫系において該抗原が同一のものと確認されると、該免疫応答は該宿主内の該抗原を直ちに認識し応答しうる。該初回用量の投与の後、該抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含有する組換えアデノウイルスベクターを含む追加用量の投与を行う。混合様式の初回および追加接種法は、既存の抗ベクター免疫が存在する場合には特に、増強された免疫応答をもたらすであろう。初回−追加投与は、典型的には、（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより）少なくとも１回、対象を初回抗原刺激し、所定の長さの時間を経過させ、ついで（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などにより）追加抗原刺激することを含む。通常、複数の初回抗原刺激、典型的には１〜４回の初回抗原刺激を行うが、より多数の初回抗原刺激を行うことが可能である。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月〜１年と様々となりうるが、当業者に認識されるとおり他の時間枠を用いることも可能である。
本発明の組換え複製欠損型アデノウイルス血清型２４ベクターにより運搬される関心のある単一のタンパク質または抗原に加えて、２以上のタンパク質または抗原を別々のビヒクルまたは同一のビヒクルにより運搬することが可能である。複数の遺伝子／機能的等価体を適当なシャトルプラスミド内に連結して、複数のオープンリーディングフレームを含む前アデノウイルスプラスミドを作製することが可能である。複数の遺伝子／機能的等価体に関するオープンリーディングフレームは、異なるプロモーターおよび転写終結配列に機能しうる形で連結されうる。他の実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、単一プロモーターに機能しうる形で連結されることが可能であり、該オープンリーーディングフレームは、内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ；ＷＯ ９５／２４４８５に開示されている）、または複数のオープンリーディングフレームの転写を単一プロモーターから外す（ｒｕｎ ｏｆｆ）適当な代替物に、機能しうる形で連結されうる。ある実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、段階的（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）ＰＣＲ、または２つのオープンリーディングフレームを互いに融合させるために適当な代替法により、互いに融合されうる。しかし、該ウイルスビヒクルの有効なパッケージング限界には適切に配慮しなければならない。例えば、アデノウイルスは野生型Ａｄ５配列の約１０５％のクローニング容量上限を示すことが判明している。
初回−追加法は種々のアデノウイルス血清型を使用しうる。そのようなプロトコールの一例として、第１血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む初回用量を投与し、ついで、第２および異なる血清型の組換えアデノウイルスベクターを含む追加用量を投与することが挙げられるであろう。例えば、実施例１１ならびに図１８、１９および２０を参照されたい。それらにおいては、第０、４および２６週に、４匹のマカクのコホートに３用量の、Ａｄ５またはＡｄ６に基づくＨＩＶ ｇａｇ保持ベクターを投与した。第５６週に、ＨＩＶ ｇａｇを保持する本発明のＡｄ２４に基づくベクターを含む追加用量を運搬した。Ａｄ２４に基づくベクターの投与は、追加抗原刺激の時点のレベルと比較して、Ｔ細胞応答における約１３〜４７倍の増強をもたらした。もう１つの実施形態においては、初回用量は、異なるタンパク質／抗原をコードする遺伝子をそれぞれが含む別々のアデノウイルスビヒクルの混合物を含みうる。そのような場合、追加用量も、別々のタンパク質／抗原をコードする遺伝子をそれぞれが含む複数のベクターの混合物を含むであろう。ただし、該追加投与においては、初回用量において運搬されたのと同じ又は類似した組合せの抗原をコードする遺伝的物質を含む組換えウイルスベクターが投与される。これらの複数の遺伝子／ベクターの投与法を更に組合せることが可能である。さらに、特異的抗原とは異なる複数の成分を含む組合せ法を行うことも、本発明の範囲内である。
本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物（ワクチン組成物を含む）は本発明の重要な態様である。これらの組成物は、予防または治療場面において、哺乳類宿主、好ましくはヒト宿主に投与されうる。可能な宿主／ワクチンには、霊長類ならびに特にヒトおよび非ヒト霊長類が含まれ、商業的または家畜獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳類が含まれる、これらに限定されるものではない。組換えアデノウイルス血清型２４ベクターを含む組成物は、単独で又は他のウイルスもしくは非ウイルスに基づくＤＮＡ／タンパク質ワクチンと組合せて投与されうる。それらは、より広範な治療計画の一部としても投与されうる。本発明は、開示されている組換えアデノウイルス血清型２４ベクターが他の療法、例えばＨＡＡＲＴ療法（組換えＨＩＶベクターの場合）と組合せて投与される場合も含む。
該組換えウイルスベクターを含む組成物は、バッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートのような生理的に許容される成分を含有しうる。ある実施形態においては、該製剤は、２．５〜１０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー、好ましくは約５ｍＭ ＴＲＩＳバッファー；２５〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ ＮａＣｌ；２．５〜１０％ スクロース、好ましくは約５％ スクロース；０．０１〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２；および０．００１％〜０．０１％ ポリソルベート８０（植物由来）を含有する。ｐＨは、約７．０〜９．０、好ましくは約８．０であるべきである。当業者は、他の通常のワクチン賦形剤も該製剤中で使用しうると理解するであろう。特定の実施形態においては、該製剤は、５ｍＭ ＴＲＩＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％ スクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ ポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有する。これは、ガラス表面へのウイルスの吸着の可能性を最小限に抑えＡｄ５およびＡｄ６の安定性にとって最適に近いｐＨおよび二価陽イオン組成を有する。それは、筋肉注射の際に組織刺激を引き起こさない。それは、好ましくは、使用まで凍結される。
ワクチン受容者に導入されるワクチン組成物中のアデノウイルス粒子の量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度ならびに発現遺伝子産物の免疫原性に左右されるであろう。一般には、１×１０７〜１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１×１０１１粒子の免疫学的または予防的に有効な用量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）および他の投与様式、例えば腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。本発明のワクチン組成物の非経口的導入と同時またはその後のインターロイキン１２タンパク質の非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段の投与も有利である。
以下の非限定的な実施例は本発明の実施を更に詳しく例示するために記載されている。
ｐＡｄ２４ΔＥ１の構築およびレスキュー
Ｅ１−Ａｄ２４ベクター（代表的なＤ群血清型）がＡｄ５／Ｃ群Ｅ１相補性細胞系において増殖しうるかどうかを確認するために、Ｅ１−Ａｄ２４に基づく前アデノウイルスプラスミドを構築した。ベクター構築の開始時には、Ａｄ２４の完全配列は未知であったため、本発明者らはＡｄ２４とＡｄ１７との間のいくらかの配列相同性を利用した。細菌プラスミドとしてＡｄ２４を回収するために用いた一般的方法は図１に例示されており、後記で説明される。精製野生型Ａｄ２４ウイルスＤＮＡおよびＡｄ１７ ＩＴＲカセットと称される第２ＤＮＡ断片でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによる該ウイルスゲノムの環化を引き起こした。ＩＴＲカセットは、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ１７ゲノムの右（ｂｐ３４４６９〜３５０９８）および左（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）末端からの配列（図１５Ａ〜１５Ｊを参照されたい）を含有する。ＩＴＲカセットは、Ａｄ１７のＥ１配列の欠失（ｂｐ４１５〜３３７２）を含有し、該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する。ＩＴＲカセット中のＡｄ１７配列は精製Ａｄ２４ウイルスＤＮＡに対する相同性の領域を与え、ここで組換えが生じうる。ＩＴＲカセットは、消化によりプラスミド配列からＡｄ２４ゲノムを遊離するよう、ウイルスＩＴＲの末端に位置する唯一の制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有することが示された。制限分析により潜在的クローンをスクリーニングし、１つのクローンをｐＡｄ２４ΔＥ１として選択した。ｐＡｄ２４ΔＥ１は、ｂｐ４〜４１４にＡｄ１７配列を、ｂｐ３３７３〜４５８０にＡｄ２４を、ｂｐ４５８８〜３４５２９にＡｄ２４を、そしてｂｐ３４４６９〜３５０９８にＡｄ１７を含有する（ｂｐ番号は、Ａｄ１７およびＡｄ２４のどちらに関しても、野生型配列に基づく）。ｐＡｄ２４ΔＥ１は、Ａｄ２４の血清型特異性を構成するすべてのＡｄ２４ビリオン構造タンパク質のコード配列を含有する。このアプローチは、Ａｄ１７に対して十分な相同性を有するプラスミド形態に任意のＤ群血清型を環化するために用いることが可能である。
Ｅ１−Ａｄ２４ベクター（代表的なＤ群血清型）がＡｄ５／Ｃ群Ｅ１相補性細胞系において増殖しうるかどうかを確認するために、Ｅ１−Ａｄ２４に基づく前アデノウイルスプラスミドを構築した。ベクター構築の開始時には、Ａｄ２４の完全配列は未知であったため、本発明者らはＡｄ２４とＡｄ１７との間のいくらかの配列相同性を利用した。細菌プラスミドとしてＡｄ２４を回収するために用いた一般的方法は図１に例示されており、後記で説明される。精製野生型Ａｄ２４ウイルスＤＮＡおよびＡｄ１７ ＩＴＲカセットと称される第２ＤＮＡ断片でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによる該ウイルスゲノムの環化を引き起こした。ＩＴＲカセットは、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ１７ゲノムの右（ｂｐ３４４６９〜３５０９８）および左（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）末端からの配列（図１５Ａ〜１５Ｊを参照されたい）を含有する。ＩＴＲカセットは、Ａｄ１７のＥ１配列の欠失（ｂｐ４１５〜３３７２）を含有し、該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する。ＩＴＲカセット中のＡｄ１７配列は精製Ａｄ２４ウイルスＤＮＡに対する相同性の領域を与え、ここで組換えが生じうる。ＩＴＲカセットは、消化によりプラスミド配列からＡｄ２４ゲノムを遊離するよう、ウイルスＩＴＲの末端に位置する唯一の制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有することが示された。制限分析により潜在的クローンをスクリーニングし、１つのクローンをｐＡｄ２４ΔＥ１として選択した。ｐＡｄ２４ΔＥ１は、ｂｐ４〜４１４にＡｄ１７配列を、ｂｐ３３７３〜４５８０にＡｄ２４を、ｂｐ４５８８〜３４５２９にＡｄ２４を、そしてｂｐ３４４６９〜３５０９８にＡｄ１７を含有する（ｂｐ番号は、Ａｄ１７およびＡｄ２４のどちらに関しても、野生型配列に基づく）。ｐＡｄ２４ΔＥ１は、Ａｄ２４の血清型特異性を構成するすべてのＡｄ２４ビリオン構造タンパク質のコード配列を含有する。このアプローチは、Ａｄ１７に対して十分な相同性を有するプラスミド形態に任意のＤ群血清型を環化するために用いることが可能である。
前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１がＣ群Ｅ１相補性細胞系においてウイルス内にレスキューされ増殖しうるかどうかを確認するために、該プラスミドをＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いて６ｃｍディッシュ内の２９３細胞内にトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化は該プラスミド配列から該ウイルスゲノムを遊離して、２９３細胞内への進入後にウイルス複製を引き起こした。ウイルスの複製および増幅が生じていることを示すウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生は非常に遅かった。複数回の試みの後、Ａｄ２４ΔＥ１をレスキューし増幅するのに成功したが、該ウイルスは、類似のＡｄ５に基づくベクターより低い力価まで増幅したに過ぎず、増幅のためには、より多くの継代を要した。該ウイルスの遺伝的構造を確認するために、プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついでウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで処理して、該制限断片をＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。ついで該末端標識制限断片をゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。該消化産物を、（標識前にＰｍｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）前プラスミドからの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏にレスキューされたことを示している。
Ａｄ２４のＥ１領域内へのＡｄ５ Ｏｒｆ６の挿入
Ａｄ２４ゲノム内へのＡｄ５ Ｅ４ Ｏｒｆ６の挿入が、Ｃ群Ｅ１相補性細胞系における、より効率的な増殖を可能にするかどうかを確認するために、Ｅ１領域内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を含有する、Ａｄ２４に基づく前アデノウイルスプラスミドを構築した。ｐＡｄ２４ΔＥ１のＥ１領域内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を導入するために、細菌組換えを利用した。ＨＣＭＶプロモーターおよびｐＡに隣接するＡｄ５ Ｏｒｆ６コード領域よりなるＡｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンをＡｄ１７シャトルベクター（Ａｄ１７ ＩＴＲカセットの前駆体）内のＥ１欠失内にクローニングした。Ａｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンをＥ１逆平行配向でｂｐ４１４と３３７３との間にクローニングした。Ａｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ１７配列に隣接するトランスジーンよりなるＤＮＡ断片（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）を得、アガロースゲル上の電気泳動の後で該断片を精製した。シャトルベクター断片およびｐＡｄ２４ΔＥ１（これはＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによりｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた（図２）。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンを前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
Ａｄ２４ゲノム内へのＡｄ５ Ｅ４ Ｏｒｆ６の挿入が、Ｃ群Ｅ１相補性細胞系における、より効率的な増殖を可能にするかどうかを確認するために、Ｅ１領域内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を含有する、Ａｄ２４に基づく前アデノウイルスプラスミドを構築した。ｐＡｄ２４ΔＥ１のＥ１領域内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を導入するために、細菌組換えを利用した。ＨＣＭＶプロモーターおよびｐＡに隣接するＡｄ５ Ｏｒｆ６コード領域よりなるＡｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンをＡｄ１７シャトルベクター（Ａｄ１７ ＩＴＲカセットの前駆体）内のＥ１欠失内にクローニングした。Ａｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンをＥ１逆平行配向でｂｐ４１４と３３７３との間にクローニングした。Ａｄ５ Ｏｒｆ６トランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ１７配列に隣接するトランスジーンよりなるＤＮＡ断片（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）を得、アガロースゲル上の電気泳動の後で該断片を精製した。シャトルベクター断片およびｐＡｄ２４ΔＥ１（これはＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによりｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた（図２）。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンを前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６がＡｄ５／Ｃ群Ｅ１相補性細胞系においてウイルス内にレスキューされ増殖しうるかどうかを確認するために、ｐＡｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６をＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いて６ｃｍディッシュ内の２９３細胞内にトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化は該プラスミド配列から該ウイルスゲノムを遊離して、２９３細胞内への進入後にウイルス複製を引き起こした。完全なウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）がトランスフェクションの約７〜１０日後に観察されたら、該感染細胞および培地を３回、凍結／解凍し、細胞残渣をペレット化した。該ウイルスを２９３細胞内で更に２回継代して増幅し、ついで、ＣｓＣｌ密度勾配上の超遠心分離により、最終的な感染から精製した。該ウイルスの遺伝的構造を確認するために、プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついでウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで処理して、該制限断片をＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。ついで該末端標識制限断片をゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。該消化産物を、（標識前にＰｍｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）前プラスミドからの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏にレスキューされたことを示している。
Ａｄ２４のＥ４領域内へのＡｄ５ Ｏｒｆ６の挿入
Ａｄ５／Ｃ群相補性細胞系において増殖が生じうるよう、代替的血清型のゲノム内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を含有させるための方法を改良するために、２つの追加的な方法を開発した。第１の方法においては、全代替的血清型Ｅ４領域（Ｅ４プロモーターを含まない）を欠失させ、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換した。第２の方法においては、代替的血清型Ｏｒｆ６遺伝子のみを欠失させ、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換した。それらの２つの方法により得られたＥ４領域の配置を図３に図示する。これらの方法のそれぞれについて、所望の前アデノウイルスプラスミドを細菌組換えにより作製した。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉおよび適切に構築されたＡｄ２４Ｅ４シャトルプラスミドでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、所望のＡｄ２４に基づく前Ａｄプラスミドを与えた。Ａｄ２４前Ａｄプラスミド内のＥ４領域が細菌組換えにより容易に修飾されうるよう、ｐＡｄ２４ΔＥ１の誘導体であるｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉを構築した。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７ＩはＡｄ２４ ｂｐ３２３７３〜ｂｐ３３３２８のＥ４領域内に欠失を含有し、該欠失の位置に唯一のＢｓｔＺ１７Ｉ部位が位置する。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉの完全配列はｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０のＡｄ１７配列、ｂｐ４５８８〜３２３７２および３３３２９〜３４５２９のＡｄ２４、ならびにｂｐ３４４６９〜３５０９８のＡｄ１７よりなる（ｂｐ番号は、Ａｄ１７およびＡｄ２４のどちらに関しても、野生型配列に基づく）。
Ａｄ５／Ｃ群相補性細胞系において増殖が生じうるよう、代替的血清型のゲノム内にＡｄ５ Ｏｒｆ６を含有させるための方法を改良するために、２つの追加的な方法を開発した。第１の方法においては、全代替的血清型Ｅ４領域（Ｅ４プロモーターを含まない）を欠失させ、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換した。第２の方法においては、代替的血清型Ｏｒｆ６遺伝子のみを欠失させ、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換した。それらの２つの方法により得られたＥ４領域の配置を図３に図示する。これらの方法のそれぞれについて、所望の前アデノウイルスプラスミドを細菌組換えにより作製した。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉおよび適切に構築されたＡｄ２４Ｅ４シャトルプラスミドでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、所望のＡｄ２４に基づく前Ａｄプラスミドを与えた。Ａｄ２４前Ａｄプラスミド内のＥ４領域が細菌組換えにより容易に修飾されうるよう、ｐＡｄ２４ΔＥ１の誘導体であるｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉを構築した。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７ＩはＡｄ２４ ｂｐ３２３７３〜ｂｐ３３３２８のＥ４領域内に欠失を含有し、該欠失の位置に唯一のＢｓｔＺ１７Ｉ部位が位置する。ｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉの完全配列はｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０のＡｄ１７配列、ｂｐ４５８８〜３２３７２および３３３２９〜３４５２９のＡｄ２４、ならびにｂｐ３４４６９〜３５０９８のＡｄ１７よりなる（ｂｐ番号は、Ａｄ１７およびＡｄ２４のどちらに関しても、野生型配列に基づく）。
ｐＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（Ｅ１欠失、およびＡｄ５ Ｏｒｆ６で置換されたＥ４の欠失を含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミド）を構築するために、ｐＡｄ２４ΔＥ１をＰｍｅＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、Ｅ４領域を表す制限断片（ｂｐ３１５５９〜ｂｐ３５１６４）をｐＮＥＢ１９３内にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４Ｅ４を得ることにより、Ａｄ２４Ｅ４シャトルプラスミドを構築した。ついでｐＮＥＢＡｄ２４Ｅ４をＡｃｃＩおよびＥｃｏＮＩで消化してＥ４コード配列を除去し、ＢｓｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位（下線部）を含有するように設計されたオリゴ（５’ＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴ（配列番号１０）；５’ＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＧＡＧ（配列番号１１））に連結して、ｐＮＥＢＡｄ２４ΔＥ４を得た。ついでｐＮＥＢＡｄ２４ΔＥ４をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ａｄ５ Ｏｒｆ６遺伝子（これはＰＣＲ増幅された）に連結してｐＮＥＢＡｄ２４ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を得た。Ａｄ５ Ｏｒｆ６遺伝子を増幅するために使用したＰＣＲプライマー（５’ＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＧ（配列番号１２）；５’ＧＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧ（配列番号１３））は、ｐＮＥＢＡｄ２４ＤＥ４断片との連結のためのＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位（前記下線部）を含有するように設計した。最終工程で、ｐＮＥＢＡｄ２４ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６Ｅ４シャトルプラスミドをＰｖｕＩおよびＰｍｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により制限断片をサイズ分画し、Ａｄ２４配列に隣接するＡｄ５Ｏｒｆ６を含有する所望の断片をゲル精製した。Ｅ４シャトル断片およびｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉ（これはＢｓｔＺ１７Ｉでの消化によりＥ４領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによりｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンを前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６（Ｅ１欠失、およびＡｄ５ Ｏｒｆ６で置換されたＥ４ Ｏｒｆ６の欠失を含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミド）を構築するために、Ａｄ２４ Ｏｒｆ６遺伝子がＡｄ５ Ｏｒｆ６により置換されたＡｄ２４Ｅ４シャトルプラスミドを構築した。これを行うために、Ａｄ２４ゲノムのｂｐ３２１２６〜ｂｐ３３４４２に相当するＥｃｏＲＩ制限断片（Ｅ４ Ｏｒｆ６コード領域を含む）をｐＮＥＢ１９３内のＥｃｏＲＩ部位内にサブクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４Ｏｒｆ６を得た。ｐＮＥＢＡｄ２４Ｏｒｆ６内のＥ４ Ｏｒｆ６遺伝子を欠失させ、それをＡｄ５ Ｏｒｆ６で置換するために、ｐＮＥＢＡｄ２４Ｏｒｆ６をＳｔｙＩで消化し、クレノウで処理して末端を平滑化し、ついでＥａｇＩで消化した。ついで所望のｐＮＥＢＡｄ２４Ｏｒｆ６断片を、Ａｄ５ ｂｐ３３１９３〜ｂｐ２４１２５のＡｄ５ Ｏｒｆ６遺伝子に相当するＰＣＲ産物に連結して、ｐＮＥＢＡｄ２４ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６を得た。Ａｄ５ Ｏｒｆ６断片を作製するために使用したＰＣＲプライマー（５’ＣＧＡＧＡＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＧ（配列番号１４）；５’ＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧ（配列番号１５））は、ｐＮＥＢＡｄ２４Ｏｒｆ６断片との連結のためのＥａｇＩおよびＳｍａＩ部位（前記下線部）を含有するように設計した。最終工程で、ｐＮＥＢＡｄ２４ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により制限断片をサイズ分画し、Ａｄ２４配列に隣接するＡｄ５Ｏｒｆ６を含有する所望の断片をゲル精製した。ＥｃｏＲＩ断片およびｐＡｄ２４ΔＯｒｆ６ＢｓｔＺ１７Ｉ（これはＢｓｔＺ１７Ｉでの消化によりＥ４領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えによりｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンを前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６のウイルス内へのレスキュー
前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６がＣ群Ｅ１相補性細胞系においてウイルス内にレスキューされ増殖しうるかどうかを確認するために、該プラスミドをそれぞれＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を用いてＴ−２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞内にトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化は該プラスミド配列から該ウイルスゲノムを遊離して、細胞進入後にウイルス複製を引き起こした。ウイルスの複製および増幅が生じていることを示すウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が両方の構築物で観察された。トランスフェクションの約７〜１０日後に完全なＣＰＥが認められたら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。約１ｍｌの該細胞ライセートを使用して、Ｔ−２２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞に８０〜９０％のコンフルエンスで感染させた。ＣＰＥが生じたら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。ついで清澄化細胞ライセートを使用して、２層のＮＵＮＣ細胞ファクトリー（ｆａｃｔｏｒｙ）のＰＥＲ．Ｃ６細胞に感染させた。完全なＣＰＥの後、該ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配上の超遠心分離により精製した。レスキューされたウイルスの遺伝的構造を確認するために、プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついでウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで処理して、該制限断片をＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。ついで該末端標識制限断片をゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。該消化産物を、それが由来する（標識前にＰｍｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）対応する前アデノウイルスプラスミドの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏にレスキューされたことを示している。
前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６がＣ群Ｅ１相補性細胞系においてウイルス内にレスキューされ増殖しうるかどうかを確認するために、該プラスミドをそれぞれＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を用いてＴ−２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞内にトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化は該プラスミド配列から該ウイルスゲノムを遊離して、細胞進入後にウイルス複製を引き起こした。ウイルスの複製および増幅が生じていることを示すウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が両方の構築物で観察された。トランスフェクションの約７〜１０日後に完全なＣＰＥが認められたら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。約１ｍｌの該細胞ライセートを使用して、Ｔ−２２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞に８０〜９０％のコンフルエンスで感染させた。ＣＰＥが生じたら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。ついで清澄化細胞ライセートを使用して、２層のＮＵＮＣ細胞ファクトリー（ｆａｃｔｏｒｙ）のＰＥＲ．Ｃ６細胞に感染させた。完全なＣＰＥの後、該ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配上の超遠心分離により精製した。レスキューされたウイルスの遺伝的構造を確認するために、プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついでウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで処理して、該制限断片をＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。ついで該末端標識制限断片をゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。該消化産物を、それが由来する（標識前にＰｍｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）対応する前アデノウイルスプラスミドの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏にレスキューされたことを示している。
Ａｄ２４に基づくベクターの増殖動力学の比較
Ａｄ２４ΔＥ１、Ａｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６、Ａｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の増殖動力学を比較するために、１工程増殖曲線を作製した（図４）。６０ｍｍディッシュ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞にＡｄ２４ΔＥ１、Ａｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６、Ａｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６を１ｖｐ／細胞で感染させた。ついで細胞および培地を種々の感染後時点で回収し、３回、凍結解凍し、遠心分離により清澄化した。サンプル内に存在するウイルスの量を定量的ＰＣＲにより測定した。それを図４に示す。この研究は、Ａｄ２５Ｏｒｆ６を含むＡｄ２４ベクターが、Ａｄ２４ΔＥ１と比較して、ＰＥＲ．Ｃ６細胞において、顕著な増殖上の利点を有することを示している。Ｅ１相補性細胞系がＡｄ２４ Ｅ１領域を発現する場合または同じ血清型のＥ１およびＥ４領域を発現する場合（例えば、Ａｄ５ Ｅ１／Ｅ４発現細胞系）には、本発明は、異種Ｏｒｆ６領域を伴わない組換えＡｄ２４ベクターで実施することが可能である。
Ａｄ２４ΔＥ１、Ａｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６、Ａｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の増殖動力学を比較するために、１工程増殖曲線を作製した（図４）。６０ｍｍディッシュ内のＰＥＲ．Ｃ６細胞にＡｄ２４ΔＥ１、Ａｄ２４ΔＥ１Ａｄ５Ｏｒｆ６、Ａｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６を１ｖｐ／細胞で感染させた。ついで細胞および培地を種々の感染後時点で回収し、３回、凍結解凍し、遠心分離により清澄化した。サンプル内に存在するウイルスの量を定量的ＰＣＲにより測定した。それを図４に示す。この研究は、Ａｄ２５Ｏｒｆ６を含むＡｄ２４ベクターが、Ａｄ２４ΔＥ１と比較して、ＰＥＲ．Ｃ６細胞において、顕著な増殖上の利点を有することを示している。Ｅ１相補性細胞系がＡｄ２４ Ｅ１領域を発現する場合または同じ血清型のＥ１およびＥ４領域を発現する場合（例えば、Ａｄ５ Ｅ１／Ｅ４発現細胞系）には、本発明は、異種Ｏｒｆ６領域を伴わない組換えＡｄ２４ベクターで実施することが可能である。
ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６内への発現カセットの挿入
ｇａｇまたはＳＥＡＰ発現カセット（それぞれ図１３および１４を参照されたい）を前記Ａｄ２４前アデノウイルスプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）のＥ１領域内に導入するために、細菌組換えを利用した。１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１；１５２６ｂｐ）遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなるｇａｇ発現カセットを、Ａｄ１７シャトルプラスミドｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＡＢＳＡｄ１７ＨＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを得た。ＩＴＲカセットは、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ１７ゲノムの右（ｂｐ３４４６９〜３５０９８）および左（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）末端からの配列（図１５Ａ〜１５Ｊを参照されたい）を含有する。ＩＴＲカセットは、Ａｄ１７のＥ１配列の欠失（ｂｐ４１５〜３３７２）を含有し、該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する。ｇａｇ発現カセットは、ＥｃｏＲＩ消化により、予め構築されたシャトルプラスミドから得た。該消化後、所望の断片をゲル精製し、クレノウで処理して平滑末端を得、ｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＳｗａＩ部位内にクローニングした。このクローニング工程は、Ｅ１平行配向でｂｐ４１４〜３３７３のＥ１欠失内にクローニングされるｇａｇ発現カセットを与えた。ｇａｇトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ１７ ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０に隣接するｇａｇ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製した。該シャトルベクター断片とＡｄ２４前Ａｄプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）の１つとでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、対応するＡｄ２４ ｇａｇ含有前アデノウイルスプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングした。
ｇａｇまたはＳＥＡＰ発現カセット（それぞれ図１３および１４を参照されたい）を前記Ａｄ２４前アデノウイルスプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）のＥ１領域内に導入するために、細菌組換えを利用した。１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１；１５２６ｂｐ）遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなるｇａｇ発現カセットを、Ａｄ１７シャトルプラスミドｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＡＢＳＡｄ１７ＨＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを得た。ＩＴＲカセットは、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ１７ゲノムの右（ｂｐ３４４６９〜３５０９８）および左（ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０）末端からの配列（図１５Ａ〜１５Ｊを参照されたい）を含有する。ＩＴＲカセットは、Ａｄ１７のＥ１配列の欠失（ｂｐ４１５〜３３７２）を含有し、該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する。ｇａｇ発現カセットは、ＥｃｏＲＩ消化により、予め構築されたシャトルプラスミドから得た。該消化後、所望の断片をゲル精製し、クレノウで処理して平滑末端を得、ｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＳｗａＩ部位内にクローニングした。このクローニング工程は、Ｅ１平行配向でｂｐ４１４〜３３７３のＥ１欠失内にクローニングされるｇａｇ発現カセットを与えた。ｇａｇトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ１７ ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０に隣接するｇａｇ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製した。該シャトルベクター断片とＡｄ２４前Ａｄプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）の１つとでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、対応するＡｄ２４ ｇａｇ含有前アデノウイルスプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングした。
同様の方法を用いて、ＳＥＡＰ発現カセットを含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミドを作製した。この場合、１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなるＳＥＡＰ発現カセットを、Ａｄ１７シャトルプラスミドｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＡＢＳＡｄ１７ＨＣＭＶＳＥＡＰＢＧＨを得た。ＳＥＡＰ発現カセットは、ＥｃｏＲＩ消化により、予め構築されたシャトルプラスミドから得た。該消化後、所望の断片をゲル精製し、クレノウで処理して平滑末端を得、ｐＡＢＳＡｄ１７−３内のＳｗａＩ部位内にクローニングした。ＳＥＡＰトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ１７ ｂｐ４〜４１４およびｂｐ３３７３〜４５８０に隣接するＳＥＡＰ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製した。該シャトルベクター断片とＡｄ２４前Ａｄプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）の１つとでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、対応するＡｄ２４ ＳＥＡＰ含有前アデノウイルスプラスミド（ｐＡｄ２４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６）を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングした。前記のとおり、ＣｓＣｌ精製ストックを得るために、すべての前Ａｄプラスミドをウイルス内にレスキューし、増殖させた。
インビボ免疫原性
Ａ．免疫化
３〜６匹の動物のコホートに、第０週および第４週に、以下の構築物のいずれかの筋肉内注射を行った：（１）１０∧１１ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｌ ｇａｇ、（２）１０∧１０ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶ１ ｇａｇ、（３）１０∧１１ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、（４）１０∧１０ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、または（５）１０∧１０ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６。アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべての場合において、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該サルを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。該免疫化計画中のいくつかの時点（典型的には４週間隔）で集めた血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ａ．免疫化
３〜６匹の動物のコホートに、第０週および第４週に、以下の構築物のいずれかの筋肉内注射を行った：（１）１０∧１１ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶｌ ｇａｇ、（２）１０∧１０ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶ１ ｇａｇ、（３）１０∧１１ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、（４）１０∧１０ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、または（５）１０∧１０ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６。アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべての場合において、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該サルを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。該免疫化計画中のいくつかの時点（典型的には４週間隔）で集めた血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、いくつかの修飾を伴う既に記載されているプロトコール（Ａｌｌｅｎら，２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９；Ｃａｓｉｍｉｒｏら，２００２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１８５−９４）に従い行った。抗原特異的刺激のために、１０−ａａの重複を伴う全ＨＩＶ−１ ｇａｇ配列を含む２０−ａａペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）からペプチドプールを調製した。各ウェルに、５０μＬの２〜４×１０５個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、８０フェムトリットル（「ｆＬ」）に設定された下方（ｌｏｗｅｒ）サイズカットオフを有するＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２粒子分析装置を使用して、該細胞を計数した。５０μＬの培地または該ｇａｇペプチドプール（８μｇ／ｍＬ濃度／ペプチド）を該ＰＢＭＣに加えた。該サンプルを３７℃、５％ ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。相応してスポットを展開し、特製イメージャー、およびＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）に基づく自動計数サブルーチーンを使用して、該プレートを加工した。該計数を１０６細胞投入に対して正規化した。
アカゲザルに対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、いくつかの修飾を伴う既に記載されているプロトコール（Ａｌｌｅｎら，２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９；Ｃａｓｉｍｉｒｏら，２００２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１８５−９４）に従い行った。抗原特異的刺激のために、１０−ａａの重複を伴う全ＨＩＶ−１ ｇａｇ配列を含む２０−ａａペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）からペプチドプールを調製した。各ウェルに、５０μＬの２〜４×１０５個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、８０フェムトリットル（「ｆＬ」）に設定された下方（ｌｏｗｅｒ）サイズカットオフを有するＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ２粒子分析装置を使用して、該細胞を計数した。５０μＬの培地または該ｇａｇペプチドプール（８μｇ／ｍＬ濃度／ペプチド）を該ＰＢＭＣに加えた。該サンプルを３７℃、５％ ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。相応してスポットを展開し、特製イメージャー、およびＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）に基づく自動計数サブルーチーンを使用して、該プレートを加工した。該計数を１０６細胞投入に対して正規化した。
Ｃ．細胞内サイトカイン染色
完全ＲＰＭＩ培地（１７×１００ｍｍ丸底ポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）中）内の１ｍｌの２×１０６ ＰＢＭＣ／ｍｌに、抗ｈＣＤ２８（クローンＬ２９３、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ｈＣＤ４９ｄ（クローンＬ２５、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。ｇａｇ特異的刺激のために、１０μＬの該ペプチドプール（０．４ｍｇ／ｍＬ／ペプチド）を加えた。該チューブを３７℃で１時間インキュベートし、ついで２０μＬの５ｍｇ／ｍｌ ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。該細胞を３７℃、５％ ＣＯ２、湿度９０％で１６時間インキュベートした。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％ ＦＢＳを各チューブに加え、該細胞を１２００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。該細胞をＰＢＳ／２％ ＦＢＳに再懸濁させ、いくつかの蛍光タグ付きｍＡｂ：２０μＬ／チューブ 抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ、クローンＦＮ−１８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；２０μＬ 抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、クローンＳＫ１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；および２０μＬ 抗ｈＣＤ４−ＰＥ、クローンＳＫ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、表面マーカーに関して染色した（３０分間、４℃）。この段階からのサンプルの取扱いは暗所で行った。該細胞を洗浄し、７５０μＬの１×ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍバッファー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中、室温で１０分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、ＰＢＳ／２％ ＦＢＳに再懸濁させ、０．１μｇのＦＩＴＣ抗ｈＩＦＮγ、クローンＭＤ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を加えた。３０分間のインキュベーションの後、該細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置の全４色チャンネルを使用して、サンプルを分析した。該データを分析するために、低側および前方散乱（ｌｏｗ ｓｉｄｅ−ａｎｄ ｆｏｒｗａｒｄ−ｓｃａｔｔｅｒ）リンパ球集団をまずゲーティング（ｇａｔｅ）した。サイトカイン陽性事象に関する一般的な蛍光カットオフを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の集団に対して並びにサンプルの模擬およびｇａｇペプチド反応チューブに対して用いた。
完全ＲＰＭＩ培地（１７×１００ｍｍ丸底ポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）中）内の１ｍｌの２×１０６ ＰＢＭＣ／ｍｌに、抗ｈＣＤ２８（クローンＬ２９３、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ｈＣＤ４９ｄ（クローンＬ２５、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。ｇａｇ特異的刺激のために、１０μＬの該ペプチドプール（０．４ｍｇ／ｍＬ／ペプチド）を加えた。該チューブを３７℃で１時間インキュベートし、ついで２０μＬの５ｍｇ／ｍｌ ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。該細胞を３７℃、５％ ＣＯ２、湿度９０％で１６時間インキュベートした。４ｍＬの冷ＰＢＳ／２％ ＦＢＳを各チューブに加え、該細胞を１２００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。該細胞をＰＢＳ／２％ ＦＢＳに再懸濁させ、いくつかの蛍光タグ付きｍＡｂ：２０μＬ／チューブ 抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ、クローンＦＮ−１８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；２０μＬ 抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、クローンＳＫ１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；および２０μＬ 抗ｈＣＤ４−ＰＥ、クローンＳＫ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、表面マーカーに関して染色した（３０分間、４℃）。この段階からのサンプルの取扱いは暗所で行った。該細胞を洗浄し、７５０μＬの１×ＦＡＣＳ Ｐｅｒｍバッファー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中、室温で１０分間インキュベートした。該細胞をペレット化し、ＰＢＳ／２％ ＦＢＳに再懸濁させ、０．１μｇのＦＩＴＣ抗ｈＩＦＮγ、クローンＭＤ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を加えた。３０分間のインキュベーションの後、該細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置の全４色チャンネルを使用して、サンプルを分析した。該データを分析するために、低側および前方散乱（ｌｏｗ ｓｉｄｅ−ａｎｄ ｆｏｒｗａｒｄ−ｓｃａｔｔｅｒ）リンパ球集団をまずゲーティング（ｇａｔｅ）した。サイトカイン陽性事象に関する一般的な蛍光カットオフを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の集団に対して並びにサンプルの模擬およびｇａｇペプチド反応チューブに対して用いた。
Ｄ．抗ｐ２４ ＥＬＩＳＡ
Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｓｓａｙキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）の試薬を使用する修飾された競合抗ｐ２４アッセイを開発した。簡潔に説明すると、２５０μＬの血清サンプル、２０μＬのＬｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒおよび１５μＬのｐ２４抗原（９．３７５ｐｇ）（Ｃｏｕｌｔｅｒキットのもの）を加えた。混合後、２００μＬの各サンプルを、Ｃｏｕｌｔｅｒキットのマウス抗ｐ２４ ｍＡｂでコートされたウェルに加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。ついで該ウェルを洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒキットの２００μＬのＢｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ポリクローナル抗ｐ２４−ビオチン）を各ウェルに加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｋｉｔに記載されているとおりにストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質を使用して、検出を行った。ＯＤ４５０ｎｍ値を記録した。ＨＩＶ血清陽性個体からの血清の系列２倍希釈物を用いて、７点標準曲線を作成した。該アッセイの下方（ｌｏｗｅｒ）カットオフは、血清陽性ヒト血清の希釈度により定められる１０ミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）で任意に設定される。このカットオフは、希釈剤対照のみ及び非陽性アナライトで得られるものに対応する最大結合対照シグナルの６５％に相当する。
Ｃｏｕｌｔｅｒ ｐ２４ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｓｓａｙキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）の試薬を使用する修飾された競合抗ｐ２４アッセイを開発した。簡潔に説明すると、２５０μＬの血清サンプル、２０μＬのＬｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒおよび１５μＬのｐ２４抗原（９．３７５ｐｇ）（Ｃｏｕｌｔｅｒキットのもの）を加えた。混合後、２００μＬの各サンプルを、Ｃｏｕｌｔｅｒキットのマウス抗ｐ２４ ｍＡｂでコートされたウェルに加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。ついで該ウェルを洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒキットの２００μＬのＢｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ポリクローナル抗ｐ２４−ビオチン）を各ウェルに加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｋｉｔに記載されているとおりにストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質を使用して、検出を行った。ＯＤ４５０ｎｍ値を記録した。ＨＩＶ血清陽性個体からの血清の系列２倍希釈物を用いて、７点標準曲線を作成した。該アッセイの下方（ｌｏｗｅｒ）カットオフは、血清陽性ヒト血清の希釈度により定められる１０ミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）で任意に設定される。このカットオフは、希釈剤対照のみ及び非陽性アナライトで得られるものに対応する最大結合対照シグナルの６５％に相当する。
Ｅ．結果
一定の４週間隔で集めたＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析した（図６）。Ａｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の両方は、非ヒト霊長類において有意なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが可能であった。１０∧１１ｖｐ用量レベルでは、Ａｄ２４誘導性応答はＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶ１ ｇａｇの場合の２〜３倍以内であった。また、どちらのＡｄ２４ベクターも、１０∧１０ｖｐで、検出可能なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが可能であったが、それは、同じ用量のＭＲＫａｄ５ｇａｇを使用した場合に観察されたものより低かった。
一定の４週間隔で集めたＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析した（図６）。Ａｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の両方は、非ヒト霊長類において有意なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが可能であった。１０∧１１ｖｐ用量レベルでは、Ａｄ２４誘導性応答はＭＲＫＡｄ５−ＨＩＶ１ ｇａｇの場合の２〜３倍以内であった。また、どちらのＡｄ２４ベクターも、１０∧１０ｖｐで、検出可能なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが可能であったが、それは、同じ用量のＭＲＫａｄ５ｇａｇを使用した場合に観察されたものより低かった。
第１２週にワクチン被接種者から集めたＰＢＭＣを、初回免疫後の細胞内ＩＦＮγ染色に関して分析した。該アッセイ結果は末梢血中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報を提供した（図７）。該結果は、該初回−追加免疫アプローチがＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方をアカゲザルにおいて惹起しうることを示した。
Ｆ．体液性免疫応答
Ａｄ２４に基づくワクチンベクターは、合理的に高い用量レベルで、検出可能なレベルの循環抗ｇａｇ抗体を生成することが可能であった（図８）。１０∧１０ｖｐ以下では、検出可能な力価は観察されなかったが、このことは用量依存的応答の存在を示唆している。
Ａｄ２４に基づくワクチンベクターは、合理的に高い用量レベルで、検出可能なレベルの循環抗ｇａｇ抗体を生成することが可能であった（図８）。１０∧１０ｖｐ以下では、検出可能な力価は観察されなかったが、このことは用量依存的応答の存在を示唆している。
インビボでのトランスジーンの発現
Ａ．免疫化
５匹のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスのコホートに以下のベクターの１つの１回の筋肉内注射を行った：（１）１０∧１０ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、（２）１０∧１０ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、（３）１０∧１０ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ＳＥＡＰ、および（４）１０∧９ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ＳＥＡＰ。雌マウスは４〜１０週齢であった。各ワクチンの全用量を０．１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該ベクターを該動物のそれぞれの四頭筋に、５０μＬ／四頭筋（ｑｕａｄ）の容量で、０．３ｍＬ ２８Ｇ１／２インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して投与した。霊長類の場合には、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該サルを麻酔し（ケタミン／キシラジン混合物）、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで２つの筋肉部位に筋肉内投与した。血液サンプルを一定間隔で集め、アッセイ日まで凍結保存した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ａ．免疫化
５匹のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスのコホートに以下のベクターの１つの１回の筋肉内注射を行った：（１）１０∧１０ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、（２）１０∧１０ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、（３）１０∧１０ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ＳＥＡＰ、および（４）１０∧９ｖｐ ＭＲＫＡｄ５ＳＥＡＰ。雌マウスは４〜１０週齢であった。各ワクチンの全用量を０．１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該ベクターを該動物のそれぞれの四頭筋に、５０μＬ／四頭筋（ｑｕａｄ）の容量で、０．３ｍＬ ２８Ｇ１／２インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して投与した。霊長類の場合には、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該サルを麻酔し（ケタミン／キシラジン混合物）、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで２つの筋肉部位に筋肉内投与した。血液サンプルを一定間隔で集め、アッセイ日まで凍結保存した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ｂ．ＳＥＡＰアッセイ
ＴＲＯＰＩＸホスファ−光化学発光キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して、循環ＳＥＡＰレベルに関して血清サンプルを分析した。各血清の二重の５μＬアリコートを、９６ウェル白色ＤＹＮＥＸプレート中、４５μＬのキット供給希釈バッファーと混合した。１０％ ナイーブサル血清中のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（カタログ番号Ｍ５９０５，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の系列希釈溶液を標準曲線の作成に使用した。サンプル中の内因性ＳＥＡＰ活性を、該ウェルを６５℃で３０分間加熱することにより不活性化した。サンプル中の酵素ＳＥＡＰ活性を、該キットに記載されている方法に従い測定した。ＤＹＮＥＸルミノメーターを使用して、化学発光読取値（単位は相対光単位）を記録した。ｌｏｇ−ｌｏｇ回帰分析を用いて、ＲＬＵ読取値はｎｇ／ｍＬ ＳＥＡＰに変換される。
ＴＲＯＰＩＸホスファ−光化学発光キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して、循環ＳＥＡＰレベルに関して血清サンプルを分析した。各血清の二重の５μＬアリコートを、９６ウェル白色ＤＹＮＥＸプレート中、４５μＬのキット供給希釈バッファーと混合した。１０％ ナイーブサル血清中のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（カタログ番号Ｍ５９０５，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の系列希釈溶液を標準曲線の作成に使用した。サンプル中の内因性ＳＥＡＰ活性を、該ウェルを６５℃で３０分間加熱することにより不活性化した。サンプル中の酵素ＳＥＡＰ活性を、該キットに記載されている方法に従い測定した。ＤＹＮＥＸルミノメーターを使用して、化学発光読取値（単位は相対光単位）を記録した。ｌｏｇ−ｌｏｇ回帰分析を用いて、ＲＬＵ読取値はｎｇ／ｍＬ ＳＥＡＰに変換される。
Ｃ．げっ歯類における結果
該注射前および後の血清サンプルを循環ＳＥＡＰ活性に関して分析した。結果を図９に示す。結果は、（１）両方のＡｄ２４構築物がすべて、比較しうるレベルまで、ＳＥＡＰトランスジーンをインビボで発現しうること、および（２）該Ａｄ２４ベクターを使用して達成された発現のレベルが、１０倍低い用量のＡｄ５の場合と比較しうることを示している。血清中のＳＥＡＰのレベルは第２日以降に劇的に低下し、第１２日までにバックグラウンドレベルに達した。
該注射前および後の血清サンプルを循環ＳＥＡＰ活性に関して分析した。結果を図９に示す。結果は、（１）両方のＡｄ２４構築物がすべて、比較しうるレベルまで、ＳＥＡＰトランスジーンをインビボで発現しうること、および（２）該Ａｄ２４ベクターを使用して達成された発現のレベルが、１０倍低い用量のＡｄ５の場合と比較しうることを示している。血清中のＳＥＡＰのレベルは第２日以降に劇的に低下し、第１２日までにバックグラウンドレベルに達した。
Ｄ．霊長類における結果
３匹のアカゲザルのコホートに以下のベクターの１つの１回の筋肉内注射を行った：（１）１０∧１１ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＳＥＡＰ、（２）１０∧９ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＳＥＡＰ、（３）１０∧１１ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、または（４）１０∧１１ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６。雌マウスは４〜１０週齢であった。該注射前および後の血清サンプルを循環ＳＥＡＰ活性に関して分析した。結果を図１０に示す。
３匹のアカゲザルのコホートに以下のベクターの１つの１回の筋肉内注射を行った：（１）１０∧１１ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＳＥＡＰ、（２）１０∧９ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ＳＥＡＰ、（３）１０∧１１ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６、または（４）１０∧１１ｖｐ Ａｄ２４ΔＥｌＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６。雌マウスは４〜１０週齢であった。該注射前および後の血清サンプルを循環ＳＥＡＰ活性に関して分析した。結果を図１０に示す。
結果は、アデノウイルス血清型２４により産生されたＳＥＡＰ産物のピークレベルが、１０∧１１ｖｐの同じ高用量レベルで、ＭＲＫＡｄ５の場合より低いが、ＭＲＫＡｄ５の場合の３倍以内であったことを示している（図１０）。アデノウイルス血清型２４で観察されたレベルは、一般には、１０∧９ｖｐのＭＲＫＡｄ５を使用して観察されたものより５０倍高い。血清中のＳＥＡＰのレベルは第１０日以降に劇的に低下し、早くも第１５日にはバックグラウンド付近であった。これらの観察は、アデノウイルス血清型２４が、霊長類における筋肉内投与後に、トランスジーンの発現を非常に効率的にもたらすことを強く示している。
ｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の構築
ｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（全体的にＡｄ２４配列から構成され、Ｅ１欠失と、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換されたＥ４欠失とを含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミド）を構築するために、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ２４ゲノムの右（ｂｐ３１９７８〜３２２６４およびｂｐ３４７１３〜３５１６４）および左（ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９）末端からの配列を含有するＡｄ２４ ＩＴＲカセットを構築した。これらの４つのセグメントは、ＰＣＲにより作製し、ｐＮＥＢ１９３内に連続的にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４−４を得た。つぎに、Ａｄ５ Ｏｒｆ６オープンリーディングフレーム（Ａｄ５ ｂｐ３１１９２〜ｂｐ３４０７８）をＰＣＲにより作製し、Ａｄ２４ ｂｐ３２２６４と３４７１３との間にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４Ｅ−Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＩＴＲカセット）を得た。ＰＮＥＢ１９３は、細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、および該ＰＣＲ産物が導入されるマルチクローニング部位を含有する一般に使用されている商業的に入手可能なクローニングプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃ Ｎ３０５１Ｓ）である。該ＩＴＲカセットは、Ａｄ２４ ｂｐ４５１〜３３６３のＥ１配列の欠失（該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する）およびＡｄ２４ ｂｐ３２２６５〜３４７１２のＥ４欠失（この欠失内にはＡｄ５ Ｏｒｆ６がＥ４平行配向で導入されている）を含有する。この構築物においては、Ａｄ５ Ｏｒｆ６発現はＡｄ２４ Ｅ４プロモーターにより駆動される。該ＩＴＲカセット内のＡｄ２４配列（ｂｐ３１９７８〜３２２６４およびｂｐ３４６４〜３７９９）は精製Ａｄ２４ウイルスＤＮＡに対する相同領域を与え、ＢＪ５１８３細菌内への共形質転換後、この領域内で細菌組換えが生じうる（図１１）。また、該ＩＴＲカセットは、消化によりプラスミド配列から組換えＡｄ２４ゲノムが遊離されるよう、該ウイルスＩＴＲの末端に位置する唯一の制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有するように設計した。潜在的なクローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンをｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６は、ｂｐ３２２６４とｂｐ３４７１３との間にクローニングされたＡｄ５Ｏｒｆ６と共に、ｂｐ４〜４５０、ｂｐ３３６４〜ｂｐ３２２６４およびｂｐ３４７１３〜ｂｐ３５１６４のＡｄ２４配列を含有すべきである。前記におけるｂｐの番号付けは、Ａｄ２４およびＡｄ５のどちらに関しても、野生型配列に基づく。
ｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（全体的にＡｄ２４配列から構成され、Ｅ１欠失と、Ａｄ５ Ｏｒｆ６で置換されたＥ４欠失とを含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミド）を構築するために、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ２４ゲノムの右（ｂｐ３１９７８〜３２２６４およびｂｐ３４７１３〜３５１６４）および左（ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９）末端からの配列を含有するＡｄ２４ ＩＴＲカセットを構築した。これらの４つのセグメントは、ＰＣＲにより作製し、ｐＮＥＢ１９３内に連続的にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４−４を得た。つぎに、Ａｄ５ Ｏｒｆ６オープンリーディングフレーム（Ａｄ５ ｂｐ３１１９２〜ｂｐ３４０７８）をＰＣＲにより作製し、Ａｄ２４ ｂｐ３２２６４と３４７１３との間にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２４Ｅ−Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＩＴＲカセット）を得た。ＰＮＥＢ１９３は、細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、および該ＰＣＲ産物が導入されるマルチクローニング部位を含有する一般に使用されている商業的に入手可能なクローニングプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ＃ Ｎ３０５１Ｓ）である。該ＩＴＲカセットは、Ａｄ２４ ｂｐ４５１〜３３６３のＥ１配列の欠失（該欠失部分には唯一のＳｗａＩ部位が位置する）およびＡｄ２４ ｂｐ３２２６５〜３４７１２のＥ４欠失（この欠失内にはＡｄ５ Ｏｒｆ６がＥ４平行配向で導入されている）を含有する。この構築物においては、Ａｄ５ Ｏｒｆ６発現はＡｄ２４ Ｅ４プロモーターにより駆動される。該ＩＴＲカセット内のＡｄ２４配列（ｂｐ３１９７８〜３２２６４およびｂｐ３４６４〜３７９９）は精製Ａｄ２４ウイルスＤＮＡに対する相同領域を与え、ＢＪ５１８３細菌内への共形質転換後、この領域内で細菌組換えが生じうる（図１１）。また、該ＩＴＲカセットは、消化によりプラスミド配列から組換えＡｄ２４ゲノムが遊離されるよう、該ウイルスＩＴＲの末端に位置する唯一の制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有するように設計した。潜在的なクローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンをｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥｌΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６は、ｂｐ３２２６４とｂｐ３４７１３との間にクローニングされたＡｄ５Ｏｒｆ６と共に、ｂｐ４〜４５０、ｂｐ３３６４〜ｂｐ３２２６４およびｂｐ３４７１３〜ｂｐ３５１６４のＡｄ２４配列を含有すべきである。前記におけるｂｐの番号付けは、Ａｄ２４およびＡｄ５のどちらに関しても、野生型配列に基づく。
ｐＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６内へのＨＩＶ−１ ｇａｇおよびＳＥＡＰトランスジーンの挿入
ｇａｇまたはＳＥＡＰ発現カセットをｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のＥ１領域内に導入するために、細菌組換えを利用する。ＨＩＶ−１ ｇａｇ発現カセットは以下のものよりなる：１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１；１５２６ｂｐ）遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列。これをＡｄ２４シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ２４−２（前記Ａｄ２４ ＩＴＲカセットの前駆体）内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＮＥＢＡｄ２４ＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを得る。ｐＮＥＢＡｄ２４−２は、Ｅ１欠失を定める、該ゲノムの左末端からのＡｄ２４配列（ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９）を含有する。ｇａｇ発現カセットは、予め構築されたプラスミドから得られ、ｂｐ４５０〜３３６４のＥ１欠失内にＥ１平行配向でクローニングされる。ｇａｇトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ２４ ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９に隣接するｇａｇ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製する。該シャトルベクター断片およびｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、Ａｄ２４ ｇａｇ含有前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えるはずである。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングする。
ｇａｇまたはＳＥＡＰ発現カセットをｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のＥ１領域内に導入するために、細菌組換えを利用する。ＨＩＶ−１ ｇａｇ発現カセットは以下のものよりなる：１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１；１５２６ｂｐ）遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列。これをＡｄ２４シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ２４−２（前記Ａｄ２４ ＩＴＲカセットの前駆体）内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＮＥＢＡｄ２４ＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを得る。ｐＮＥＢＡｄ２４−２は、Ｅ１欠失を定める、該ゲノムの左末端からのＡｄ２４配列（ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９）を含有する。ｇａｇ発現カセットは、予め構築されたプラスミドから得られ、ｂｐ４５０〜３３６４のＥ１欠失内にＥ１平行配向でクローニングされる。ｇａｇトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ２４ ｂｐ４〜４５０およびｂｐ３３６４〜３７９９に隣接するｇａｇ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製する。該シャトルベクター断片およびｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）でのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、Ａｄ２４ ｇａｇ含有前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えるはずである。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングする。
同様の方法を用いて、ＳＥＡＰ発現カセットを含有するＡｄ２４前Ａｄプラスミドを作製する。この場合、ＳＥＡＰ発現カセットは、１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなる。これを、Ａｄ２４シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ２４−２内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＮＥＢＡｄ２４ＣＭＶＳＥＡＰＢＧＨｐＡを得る。ついで、ｇａｇトランスジーンに関して前記されているとおりに、該トランスジーンをｐＭＲＫＡｄ２４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６内に組換える。
インビボ免疫原性
Ａ．免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべての場合において、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該マカクを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。該免疫化計画中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ａ．免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべての場合において、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該マカクを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内投与した。該免疫化計画中のいくつかの時点で集めた血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。すべての動物の世話および扱いは、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌに記載されている原則に従いＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている基準に従い行った。
Ｂ．Ｔ細胞応答
異種追加刺激抗原としてのＡｄ２４ワクチンベクター
まず、４匹のアカゲザルのコホートを１０７または１０９ ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ｇａｇ（図１６Ａ〜１６ＡＸを参照されたい）またはＭＲＫＡｄ６−ｇａｇ（図１７Ａ〜１７Ｎを参照されたい）の３回の投与（第０、４、２６週）で免疫した。第５６週に、１０１１ｖｐのＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の追加抗原刺激ワクチンを該動物に投与した。ナイーブ動物の別のコホートには、１回量の該追加抗原刺激ワクチンを投与した。該研究の経過中に集めたＰＢＭＣのＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を図１８に示す。Ａｄ２４ ＨＩＶベクターは、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の既存プールを増幅するために使用可能であることが明らかである。追加抗原刺激前のレベルから、追加抗原刺激の４週間後に測定したレベルへの、ｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルの増加は、該ナイーブ動物において同じ追加抗原刺激ワクチンにより誘導されたレベルより一貫して大きかった。異種ＭＲＫＡｄ５／ＭＲＫＡｄ６−Ａｄ２４追加抗原刺激計画のワクチン被接種動物からのＰＢＭＣを、初回免疫後の細胞内ＩＦＮγ染色に関して分析した（第６０週）。該アッセイ結果は末梢血中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報を提供した（図１９）。該結果は、異種初回−追加免疫アプローチがＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方をアカゲザルにおいて惹起しうることを示した。
異種追加刺激抗原としてのＡｄ２４ワクチンベクター
まず、４匹のアカゲザルのコホートを１０７または１０９ ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ｇａｇ（図１６Ａ〜１６ＡＸを参照されたい）またはＭＲＫＡｄ６−ｇａｇ（図１７Ａ〜１７Ｎを参照されたい）の３回の投与（第０、４、２６週）で免疫した。第５６週に、１０１１ｖｐのＡｄ２４ΔＥ１ｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の追加抗原刺激ワクチンを該動物に投与した。ナイーブ動物の別のコホートには、１回量の該追加抗原刺激ワクチンを投与した。該研究の経過中に集めたＰＢＭＣのＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を図１８に示す。Ａｄ２４ ＨＩＶベクターは、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の既存プールを増幅するために使用可能であることが明らかである。追加抗原刺激前のレベルから、追加抗原刺激の４週間後に測定したレベルへの、ｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルの増加は、該ナイーブ動物において同じ追加抗原刺激ワクチンにより誘導されたレベルより一貫して大きかった。異種ＭＲＫＡｄ５／ＭＲＫＡｄ６−Ａｄ２４追加抗原刺激計画のワクチン被接種動物からのＰＢＭＣを、初回免疫後の細胞内ＩＦＮγ染色に関して分析した（第６０週）。該アッセイ結果は末梢血中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ｇａｇ特異的Ｔ細胞の相対量に関する情報を提供した（図１９）。該結果は、異種初回−追加免疫アプローチがＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方をアカゲザルにおいて惹起しうることを示した。
異種初回刺激抗原としてのＡｄ２４ワクチンベクター
別の研究において、まず、３匹のアカゲザルのコホートを１０１１ ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の２回の投与（第０および４週）で免疫し、第２４週に１０７ ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ｇａｇで追加抗原刺激した。ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇのこの低い用量は、対象における該ベクターに対する既存中和免疫の効果を模擬するために選択される。ナイーブ動物の別のコホートには１回量の１０７ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇを投与した。該研究の経過中に集めたＰＢＭＣのＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を図２０に示す。
別の研究において、まず、３匹のアカゲザルのコホートを１０１１ ｖｐのＡｄ２４ΔＥｌｇａｇΔＯｒｆ６Ａｄ５Ｏｒｆ６の２回の投与（第０および４週）で免疫し、第２４週に１０７ ｖｐのＭＲＫＡｄ５−ｇａｇで追加抗原刺激した。ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇのこの低い用量は、対象における該ベクターに対する既存中和免疫の効果を模擬するために選択される。ナイーブ動物の別のコホートには１回量の１０７ ｖｐ ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇを投与した。該研究の経過中に集めたＰＢＭＣのＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を図２０に示す。
Ａｄ２４に基づくワクチンは、マカクにおけるＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答に対して有効に初回抗原刺激することが可能であった。低用量のＭＲＫＡｄ５−ｇａｇでの追加抗原刺激はｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルにおける有意な増加をもたらした。３匹中２匹の動物における増加は、同じ低い用量のＭＲＫＡｄ５−ｇａｇでのナイーブ動物の処理の後に典型的に観察されるレベルを上回った。
Claims (39)
- 少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクター。
- 請求項１記載の組換えアデノウイルスベクターを含んでなる細胞の集団。
- （ａ）請求項１記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞の集団内にトランスフェクトし、
（ｂ）生じた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。 - 請求項３記載の製造方法により回収された、精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
- 請求項４記載の精製された組換えアデノウイルス粒子を含んでなる組成物。
- 生理的に許容される担体を含む、請求項５記載の組成物。
- 異種核酸を含んでなる、少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクター。
- 請求項７記載の組換えアデノウイルスベクターを含んでなる細胞の集団。
- （ａ）請求項７記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞の集団内にトランスフェクトし、
（ｂ）生じた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。 - 該ベクターが、
（ａ）タンパク質をコードする核酸、
（ｂ）該タンパク質をコードする核酸に機能しうる形で連結された異種プロモーター、および
（ｃ）転写終結配列
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項７記載の組換えベクター。 - 遺伝子発現カセットがＥ１領域内に挿入されている、請求項１０記載の組換えベクター。
- 異種核酸が、ヒト宿主における発現に関して最適化されたコドンを含む、請求項７記載の組換えベクター。
- Ｅ１欠失内に異種核酸を含む、請求項７記載の組換えベクター。
- 少なくとも部分的にＥ３において欠失している、請求項７記載の組換えベクター。
- 請求項９記載の製造方法により回収された、精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
- 請求項９記載の精製された組換えアデノウイルス粒子を含んでなる組成物。
- 生理的に許容される担体を含む、請求項１６記載の組成物。
- 異種核酸の投与の前または後に、請求項１６記載の組成物を、同じ又は異なるベクターで投与することを含んでなる、該異種核酸の運搬および発現を行うための方法。
- 該組成物の投与の前または後に、異なる血清型のアデノウイルスで異種核酸を投与する、請求項１８記載の方法。
- 異種核酸がＨＩＶ抗原をコードする、請求項１６記載の組成物。
- 請求項２０記載の組成物を個体に投与することを含んでなる、該個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させるための方法。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｇａｇまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２１記載の組成物。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｎｅｆまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２１記載の組成物。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｐｏｌまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２１記載の組成物。
- ＨＩＶ−１遺伝子を含んでなる、少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクター。
- 請求項２５記載の組換えアデノウイルスベクターを含んでなる細胞の集団。
- （ａ）請求項２５記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞の集団内にトランスフェクトし、
（ｂ）生じた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。 - 請求項２７記載の製造方法により回収された、精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
- 請求項２８記載の精製された組換えアデノウイルス粒子を含んでなる組成物。
- 生理的に許容される担体を含む、請求項２９記載の組成物。
- ＨＩＶ−１遺伝子の投与の前または後に、請求項３０記載の組成物を、同じ又は異なるベクターで投与することを含んでなる、ＨＩＶ−１遺伝子の運搬および発現を行うための方法。
- 該組成物の投与の前または後に、異なる血清型のアデノウイルスでＨＩＶ−１遺伝子を投与する、請求項３１記載の方法。
- 請求項２９記載の組成物を個体に投与することを含んでなる、該個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させるための方法。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｇａｇまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２９記載の組成物。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｎｅｆまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２９記載の組成物。
- ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ ｐｏｌまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項２９記載の組成物。
- （ａ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型５の組換えアデノウイルスベクターを哺乳類宿主に接種し、ついで
（ｂ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクターを含む追加抗原を該哺乳類宿主に接種する工程を含んでなる、ＨＩＶ−１ ｇａｇに対する増強された免疫応答を哺乳類宿主において誘導するための方法。 - （ａ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型６の組換えアデノウイルスベクターを哺乳類宿主に接種し、ついで
（ｂ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクターを含む追加抗原を該哺乳類宿主に接種する工程を含んでなる、ＨＩＶ−１ ｇａｇに対する増強された免疫応答を哺乳類宿主において誘導するための方法。 - （ａ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２４の組換えアデノウイルスベクターを哺乳類宿主に接種し、ついで
（ｂ）ＨＩＶ−１ ｇａｇ抗原またはその免疫学的に関連した修飾体をコードする遺伝子を含み少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型５の組換えアデノウイルスベクターを含む追加抗原を該哺乳類宿主に接種する工程を含んでなる、ＨＩＶ−１ ｇａｇに対する増強された免疫応答を哺乳類宿主において誘導するための方法。
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