JP2006095516A - Surface-modified filler for liquid chromatography and manufacturing method for the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤及びその製造方法に関する。さらに詳しく言えば、試料中に共存するタンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質を充填剤表面に吸着することなく糖、脂質のような水溶性巨大分子量物質をゲルフィルトレーションクロマトグラフィーにより分離または測定するのに適した巨大細孔を有する表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、及びそれを用いた分析用カラムに関する。 The present invention relates to a liquid chromatography filler having a modified surface and a method for producing the same. More specifically, gel filtration of water-soluble macromolecular substances such as sugars and lipids without adsorbing water-soluble substances having hydrophobic sites in the molecules such as proteins coexisting in the sample on the surface of the filler. The present invention relates to a packing material for liquid chromatography whose surface has a large pore suitable for separation or measurement by chromatography, a method for producing the same, and an analytical column using the same.
水溶性高分子の平均分子量測定には、従来、希薄高分子溶液の粘性測定から求める粘度平均分子量、光散乱、超遠心法から求める重量平均分子量が用いられてきた。一方、分子量分布測定にはその迅速さと簡便さからゲルフィルトレーションクロマトグラフィーが広く用いられている。 For measuring the average molecular weight of a water-soluble polymer, conventionally, the viscosity average molecular weight obtained from the viscosity measurement of a diluted polymer solution, the weight average molecular weight obtained from light scattering and ultracentrifugation have been used. On the other hand, gel filtration chromatography is widely used for molecular weight distribution measurement because of its speed and simplicity.
水溶性高分子の分子量分布測定に使用されるゲルフィルトレーションクロマトグラフィー用充填カラムとして、例えば、（メタ）アクリル酸エステル単量体を架橋重合した充填剤が充填されたカラムであるTSK-GEL PWXLシリーズ（東ソー（株）製）またはShodex OHpak SB-800 HQシリーズ（昭和電工（株）製）等がある。しかし、例えば粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような水溶性巨大高分子物質の分子量分布測定ではTSK-GEL PWXLシリーズの中でもっとも排除限界分子量の大きいTSK-GEL G6000PWXLカラムを用いても、排除限界に達していると推定されている（日本分析化学会第４９年会講演要旨集１５頁２Ａ１１「高分子ヒアルロン酸のＳＥＣ測定」（資生堂掛川工場）小野昭則等：非特許文献１）。一方、Shodex OHpak SB-800 HQシリーズの中でもっとも排除限界分子量の大きいShodex OHpak SB-806 HQでも粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸はその排除限界分子量に達している（第６回高分子分析討論会１０７〜１０８頁III−１０（昭光通商・Shodexサービスセンター）中村雅英等「水溶性超高分子用カラムを用いたＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析」：非特許文献２）。この様に（メタ）アクリル酸エステル単量体を架橋重合した充填剤が充填されたカラムでは、粘度平均分子量が３００万以上の巨大な分子量（分子量分布を考慮すると最大分子量は４００〜５００万に達する。）を有する試料を排除限界分子量に達することなく分析できるカラムが存在しないため正確な分子量分布測定は困難となっている。 As a packed column for gel filtration chromatography used to measure the molecular weight distribution of water-soluble polymers, for example, TSK-GEL is a column packed with a filler obtained by crosslinking and polymerizing a (meth) acrylate monomer. There are PW XL series (made by Tosoh Corporation) or Shodex OHpak SB-800 HQ series (made by Showa Denko Corporation). However, for the molecular weight distribution measurement of water-soluble macromolecular substances such as hyaluronic acid with a viscosity average molecular weight of 3 million or more, the TSK-GEL G6000PW XL column with the largest exclusion limit molecular weight in the TSK-GEL PW XL series is used. However, it is presumed that the exclusion limit has been reached (Abstracts of the 49th Annual Meeting of the Analytical Society of Japan, page 15 2A11 “SEC measurement of high molecular hyaluronic acid” (Shiseido Kakegawa Factory) Akinori Ono et al. 1). On the other hand, even with Shodex OHpak SB-806 HQ, which has the largest exclusion limit molecular weight in the Shodex OHpak SB-800 HQ series, hyaluronic acid having a viscosity average molecular weight of 3 million or more has reached its exclusion limit molecular weight (6th Polymer Analysis debate 107-108 pages III-10 (Shoko Tsusho / Shodex service center) Masahide Nakamura et al., “SEC-MALS analysis using a column for water-soluble ultrapolymers”: Non-patent document 2). In this way, in a column packed with a filler obtained by crosslinking polymerization of a (meth) acrylate monomer, a huge molecular weight having a viscosity average molecular weight of 3 million or more (in consideration of molecular weight distribution, the maximum molecular weight is 4 to 5 million) It is difficult to accurately measure the molecular weight distribution because there is no column that can analyze a sample having a high molecular weight) without reaching the exclusion limit molecular weight.
こうした背景の中、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような巨大高分子物質の分子量分布をゲルフィルトレーションクロマトグラフィーにより迅速かつ簡便に測定できる充填剤が要望されていた。そこで、（メタ）アクリル酸エステル系以外の水溶性高分子用ゲルフィルトレーションクロマトグラフィー用充填カラムとして、Shodex SUGAR KSシリーズ（昭和電工（株）製）のようなポリスチレンをスルホン化し、親水化した充填剤を充填したカラムがある。そして、その中で最も排除限界分子量の大きいShodex SUGAR KS-807は、排除限界分子量に達することなく前記ヒアルロン酸を分析できることが報告されている（２００３年薬学会第１２３年会３７頁２８（Ｐ１）Ｉ−２７６（電気化学工業・昭光通商・昭和電工）大出桂等，「カラムスイッチングによる生体液中のヒアルロン酸分析」：非特許文献３）。
しかし、ポリスチレンをスルホン化し親水化した充填剤を充填したカラムは試料中に共存する、タンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質を充填剤表面に吸着するという欠点を有していた。
In such a background, there has been a demand for a filler that can quickly and easily measure the molecular weight distribution of a macromolecular substance such as hyaluronic acid having a viscosity average molecular weight of 3 million or more by gel filtration chromatography. So, as a packed column for gel filtration chromatography for water-soluble polymers other than (meth) acrylic acid esters, polystyrene like Shodex SUGAR KS series (Showa Denko Co., Ltd.) was sulfonated to make it hydrophilic. There is a column packed with packing material. Among them, Shodex SUGAR KS-807 having the largest exclusion limit molecular weight has been reported to be able to analyze the hyaluronic acid without reaching the exclusion limit molecular weight (2003 Pharmaceutical Society 123rd Group, page 37, page 28 (P1)). ) I-276 (Electrochemical Industry, Shoko Tsusho, Showa Denko) Oide Katsura et al., “Analysis of hyaluronic acid in biological fluids by column switching”: Non-Patent Document 3).
However, columns packed with polystyrene sulfonated and hydrophilized fillers have the disadvantage of adsorbing water-soluble substances such as proteins that have hydrophobic sites in the molecule, such as proteins, to the surface of the filler. It was.
従って、本発明の課題は、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような水溶性巨大分子試料の分子量及び分子量分布を排除限界分子量に達することなく分析でき、かつ、同一試料中にタンパク質のような分子内に疎水性部位を有する水溶性物質が存在していても当該水溶性巨大分子が充填剤表面に吸着されることのない充填剤及びそのような充填剤の製造方法を提供することにある。 Therefore, the problem of the present invention is that the molecular weight and molecular weight distribution of a water-soluble macromolecular sample such as hyaluronic acid having a viscosity average molecular weight of 3 million or more can be analyzed without reaching the exclusion limit molecular weight, and the protein in the same sample can be analyzed. To provide a filler in which the water-soluble macromolecule is not adsorbed on the surface of the filler even if such a water-soluble substance having a hydrophobic site is present in the molecule, and a method for producing such a filler It is in.
本発明者らは、鋭意検討を続けた結果、特定の方法を用い担体表面を親水性高分子で被覆し、当該親水性高分子の表面を架橋することによって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problem can be solved by coating the surface of the carrier with a hydrophilic polymer using a specific method and crosslinking the surface of the hydrophilic polymer. The invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、その充填剤を用いたカラムに関する。
１．極性基を有する担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後水分を除去し担体表面に該水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を前記水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面で水溶性高分子を架橋することにより得られる、表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
２．水溶性高分子が分子内に水酸基を有する前記１に記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
３．水溶性高分子が多糖である前記１または２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
４．水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである前記３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
５．担体表面を被覆している水溶性高分子が架橋剤により架橋されている前記１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
６．架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである前記５記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
７．担体が合成高分子系担体であり、分子内に極性基を有する前記１記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
８．担体が合成高分子系担体であり、分子内に有する極性基がスルホ基である前記７記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
９．担体がスルホン化ポリスチレンである前記１、７または８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１０．担体が直径１００〜５０００ｎｍの細孔を有する前記１、７乃至９のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１１．担体の質量平均粒子径が１０〜１００μｍである前記１、７乃至１０のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤。
１２．担体を水溶性高分子溶液中に懸濁させた後、水分を除去し担体表面に水溶性高分子を被覆させた後、表面が水溶性高分子で被覆された担体を水溶性高分子が溶解しない溶媒中に懸濁させ、担体表面の該水溶性高分子を架橋することを特徴とする表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１３．表面改質に用いる水溶性高分子が分子内に水酸基を有するものである前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１４．表面改質に用いる水溶性高分子が多糖である前記１２または１３記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１５．表面改質に用いる水溶性高分子の多糖がヒドロキシエチルセルロースである前記１４記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１６．表面改質に用いる水溶性高分子を架橋剤により架橋する前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１７．架橋剤がエチレングリコールジグリシジルエーテルである前記１６記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１８．表面改質される担体が分子内に極性基を有する合成高分子系担体である前記１２記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
１９．分子内に極性基を有する合成高分子系担体の極性基がスルホ基である前記１８記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２０．合成高分子系担体が分子内に有するスルホ基が修飾剤で修飾されている前記１９記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２１．スルホ基を修飾する修飾剤がグリシドールである前記２０記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
２２．前記１乃至１１のいずれかに記載の表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラム。
That is, the present invention relates to the following surface-modified liquid chromatography packing material, a method for producing the same, and a column using the packing material.
1. After suspending a carrier having a polar group in a water-soluble polymer solution, water is removed and the surface of the carrier is coated with the water-soluble polymer, and then the carrier whose surface is coated with the water-soluble polymer is dissolved in the water-soluble polymer. A surface-modified liquid chromatography packing material obtained by suspending a water-soluble polymer in a solvent in which the soluble polymer is not dissolved and crosslinking the water-soluble polymer on the surface of the carrier.
2. 2. The packing material for liquid chromatography according to 1 above, wherein the water-soluble polymer has a hydroxyl group in the molecule.
3. 3. The packing material for liquid chromatography according to 1 or 2, wherein the water-soluble polymer is a polysaccharide.
4). 4. The liquid chromatographic packing material having a modified surface as described in 3 above, wherein the polysaccharide of the water-soluble polymer is hydroxyethyl cellulose.
5. 2. The packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 1 above, wherein the water-soluble polymer coating the surface of the carrier is crosslinked with a crosslinking agent.
6). 6. The filler for liquid chromatography having a modified surface as described in 5 above, wherein the crosslinking agent is ethylene glycol diglycidyl ether.
7). 2. The packing material for liquid chromatography according to 1 above, wherein the carrier is a synthetic polymer carrier and has a polar group in the molecule.
8). 8. The packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 7 above, wherein the carrier is a synthetic polymer carrier, and the polar group in the molecule is a sulfo group.
9. 9. The packing material for liquid chromatography having a modified surface according to 1, 7, or 8, wherein the carrier is sulfonated polystyrene.
10. 10. The surface-modified packing material for liquid chromatography as described in any one of 1 to 7 above, wherein the carrier has pores having a diameter of 100 to 5000 nm.
11. 11. The packing material for liquid chromatography having a modified surface according to any one of the above items 1, 7 to 10, wherein the carrier has a mass average particle diameter of 10 to 100 μm.
12 After suspending the carrier in the water-soluble polymer solution, the water is removed and the surface of the carrier is coated with the water-soluble polymer, and then the water-soluble polymer is dissolved in the carrier whose surface is coated with the water-soluble polymer. A method for producing a surface-modified packing material for liquid chromatography, which comprises suspending in a non-solvent solvent and crosslinking the water-soluble polymer on the surface of the carrier.
13. 13. The method for producing a filler for liquid chromatography having a modified surface as described in 12 above, wherein the water-soluble polymer used for the surface modification has a hydroxyl group in the molecule.
14 14. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface according to the above 12 or 13, wherein the water-soluble polymer used for the surface modification is a polysaccharide.
15. 15. The method for producing a filler for liquid chromatography having a modified surface as described in 14 above, wherein the polysaccharide of the water-soluble polymer used for the surface modification is hydroxyethyl cellulose.
16. 13. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 12 above, wherein a water-soluble polymer used for surface modification is crosslinked with a crosslinking agent.
17. 17. The method for producing a filler for liquid chromatography having a modified surface as described in 16 above, wherein the crosslinking agent is ethylene glycol diglycidyl ether.
18. 13. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 12 above, wherein the carrier whose surface is modified is a synthetic polymer carrier having a polar group in the molecule.
19. 19. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 18 above, wherein the polar group of the synthetic polymer carrier having a polar group in the molecule is a sulfo group.
20. 20. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 19 above, wherein the sulfo group in the molecule of the synthetic polymer carrier is modified with a modifying agent.
21. 21. The method for producing a packing material for liquid chromatography having a modified surface as described in 20 above, wherein the modifying agent for modifying the sulfo group is glycidol.
22. 12. A column for liquid chromatography, which is packed with the liquid chromatography filler having a modified surface according to any one of 1 to 11 above.
本発明によれば、比較的容易な方法を用いて表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤を製造することができ、この液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて、試料中に共存するアルブミンのようなタンパク質を吸着することなく、粘度平均分子量が３００万以上のヒアルロン酸のような巨大高分子物質の分子量分布を排除限界分子量に達することなく分析できる。 According to the present invention, a packing material for liquid chromatography whose surface is modified by using a relatively easy method can be produced. By using this packing material for liquid chromatography, albumin coexisting in a sample can be produced. The molecular weight distribution of a macromolecular substance such as hyaluronic acid having a viscosity average molecular weight of 3 million or more can be analyzed without reaching the exclusion limit molecular weight without adsorbing such a protein.
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
本発明における表面が改質された液体クロマトグラフィー用充填剤は、水溶性高分子を極性基を有する担体の表面に被覆させ表面が改質された充填剤である。
担体は極性基を持つものであれば特に限定されるものではない。例を挙げれば、合成高分子系担体、例えばポリビニルアルコール系ゲル、ポリ（メタ）アクリル酸系ゲル、ポリＮ−ビニルカルボン酸アミド系ゲル、スルホ基、四級アンモニウム基、三級アミノ基、二級アミノ基、一級アミノ基のようなイオン交換樹が導入されたポリスチレン系ゲルが用いられる。これらの中でも多孔性、強度の点でイオン交換基が導入されたポリスチレン系ゲルが好ましく、さらには入手のしやすさの点でスルホ基を導入されたスルホン化ポリスチレンゲルがより好ましい。
The surface-modified filler for liquid chromatography in the present invention is a filler whose surface has been modified by coating the surface of a carrier having a polar group with a water-soluble polymer.
The carrier is not particularly limited as long as it has a polar group. Examples include synthetic polymer carriers such as polyvinyl alcohol gels, poly (meth) acrylic acid gels, poly N-vinylcarboxylic acid amide gels, sulfo groups, quaternary ammonium groups, tertiary amino groups, A polystyrene gel into which an ion exchange tree such as a primary amino group or a primary amino group is introduced is used. Among these, a polystyrene gel in which an ion exchange group is introduced is preferable in terms of porosity and strength, and a sulfonated polystyrene gel in which a sulfo group is introduced is more preferable in terms of availability.
また、担体は多孔性であることが好ましく、その粒子をカラムに充填しテトラヒドロフランを溶離液に用いたとき分子量1610万の標準ポリスチレン（東洋曹達（株）製）が排除限界に達することなく溶出され、ポリスチレンによる推定排除限界分子量が約２億程度であることが望ましい。これらのポリスチレンの大きさ（直径）はIstvan Hal asz and Korn el Martin. Pore Sizes of Solids. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 17. 901-908 (1978)により定義された式で計算すれば分子量1610万の標準ポリスチレンは約1100ｎｍ、分子量が約２億程度は約4900ｎｍとなる。従って、本発明において使用される被表面改質充填剤は直径１００〜5000ｎｍの細孔を有する多孔性粒子がより好ましい。
担体の質量平均粒子径は１０〜１００μｍが好ましい。質量平均分子量はコールターカウンター（登録商標）で測定できる。
The carrier is preferably porous, and when the particles are packed in a column and tetrahydrofuran is used as the eluent, standard polystyrene (made by Toyo Soda Co., Ltd.) with a molecular weight of 16.1 million is eluted without reaching the exclusion limit. It is desirable that the estimated exclusion limit molecular weight by polystyrene is about 200 million. The size (diameter) of these polystyrenes can be calculated using the formula defined by Istvan Hal asz and Korn el Martin. Pore Sizes of Solids. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 17. 901-908 (1978). Standard polystyrene with a molecular weight of 16.1 million is about 1100 nm, and a molecular weight of about 200 million is about 4900 nm. Therefore, the surface-modified filler used in the present invention is more preferably porous particles having pores having a diameter of 100 to 5000 nm.
The mass average particle diameter of the carrier is preferably 10 to 100 μm. The mass average molecular weight can be measured with a Coulter Counter (registered trademark).
本発明で好ましく用いられるスルホ基を導入されたスルホン化ポリスチレンゲル担体は、その親水性を増大する目的でスルホ基を表面修飾剤で修飾してもよい。この時用いられる修飾剤はスルホ基と反応し親水性を増大するようなものであれば特に限定されないが、例えばソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリシドールを挙げることができ、さらに操作性さらに入手のしやすさの点で、グリシドールが好ましい。 In the sulfonated polystyrene gel carrier introduced with a sulfo group preferably used in the present invention, the sulfo group may be modified with a surface modifier for the purpose of increasing the hydrophilicity. The modifier used at this time is not particularly limited as long as it reacts with a sulfo group to increase hydrophilicity, and examples thereof include sorbitol polyglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, and glycidol. In view of operability and availability, glycidol is preferable.
親水性増大の目的で使用される修飾剤の使用量は、充填剤が持つ細孔径に影響を与えない範囲であれば特に制限されない。本発明においては、修飾剤は担体に対して0.5〜２質量倍、好ましくは１〜1.5質量倍使用される。 The amount of the modifier used for the purpose of increasing hydrophilicity is not particularly limited as long as it does not affect the pore diameter of the filler. In the present invention, the modifier is used in an amount of 0.5 to 2 times, preferably 1 to 1.5 times the weight of the carrier.
スルホ基を表面修飾剤で修飾する際、反応促進のため触媒を適時用いることができる。触媒としては、塩酸、硫酸のような無機酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ類、トリエチルベンジルアンモニウムクロライドやテトラメチルアンモニウムクロライドのような四級アンモニウム塩類、ベンジルジメチルアミンやトリブチルアミンのような三級アミン類、２−メチル−４−エチルイミダゾールや２−メチルイミダゾールのようなイミダゾール化合物さらには三フッ化ホウ素、ホウフッ化亜鉛、塩化スズのようなルイス酸を挙げることができ、反応効率の点からルイス酸が好ましく、反応の制御の点からホウフッ化亜鉛が特に好ましい。 When the sulfo group is modified with a surface modifier, a catalyst can be used as appropriate to promote the reaction. Catalysts include inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, alkalis such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, quaternary ammonium salts such as triethylbenzylammonium chloride and tetramethylammonium chloride, benzyldimethylamine and tributylamine. Tertiary amines such as, imidazole compounds such as 2-methyl-4-ethylimidazole and 2-methylimidazole, and Lewis acids such as boron trifluoride, zinc borofluoride, tin chloride, and the like. Lewis acid is preferable from the viewpoint of efficiency, and zinc borofluoride is particularly preferable from the viewpoint of reaction control.
担体の表面改質に使用される水溶性高分子は水に溶解する性質を持つものであれば特に限定されない。例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキサイドのような合成水溶性高分子、ゼラチン、カゼインのような動物性水溶性高分子、デキストラン、プルラン、セルロースのような多糖及びその誘導体が挙げられる。水溶性高分子はその親水性の強さから水酸基を持つものか好ましく、特に多糖からなるセルロース誘導体は誘導体の種類の多さから選択の範囲が広く好ましい、中でも、溶解性、入手のしやすさなどからヒドロキシエチルセルロースが特に好ましい。 The water-soluble polymer used for the surface modification of the carrier is not particularly limited as long as it has a property of being dissolved in water. For example, synthetic water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polyacrylic acid, polyethylene oxide, animal water-soluble polymers such as gelatin and casein, polysaccharides such as dextran, pullulan and cellulose and the like Derivatives. The water-soluble polymer preferably has a hydroxyl group due to its hydrophilic strength. In particular, a cellulose derivative composed of a polysaccharide has a wide range of choices due to the variety of derivatives. Among them, the solubility and availability are particularly high. From the above, hydroxyethyl cellulose is particularly preferable.
表面改質のため担体の表面に水溶性高分子を被覆する方法は、特に制限されるものではない。水溶性高分子を溶解した溶液に担体を入れ、その表面に水溶性高分子を吸着させた後、ろ過等により水分を取り除く方法が考えられるが、操作が煩雑となりさらに再現性にも影響を与えることとなる。従って、担体を水溶性高分子溶液に懸濁させ、エバポレーターのような装置を用いて減圧下で水分を留去する方法が、簡便で再現性も高く好ましい。水分留去を速やかに行うためには３０〜２００ｈｐａの圧力が好ましく、留去時間の短縮と減圧による沸騰を勘案すると５０〜１００ｈｐａの圧力がより好ましい。減圧下での水分留去を速やかに行うために加温することが好ましいが、減圧下極端に高温にすると沸騰し担体が飛び散り収率が低下するので好ましくない。加温するとき温度は７０℃以下が好ましく、３０〜５０℃の範囲での加温がより好ましい。 The method for coating the surface of the carrier with the water-soluble polymer for surface modification is not particularly limited. Although a method of removing the moisture by filtering after putting the carrier in the solution in which the water-soluble polymer is dissolved and adsorbing the water-soluble polymer on the surface is considered, the operation becomes complicated and the reproducibility is also affected. It will be. Therefore, a method in which a carrier is suspended in a water-soluble polymer solution and water is distilled off under reduced pressure using an apparatus such as an evaporator is simple and highly reproducible. A pressure of 30 to 200 hpa is preferable in order to quickly perform water distillation, and a pressure of 50 to 100 hpa is more preferable in consideration of shortening of the distillation time and boiling due to reduced pressure. Heating is preferably performed in order to quickly remove water under reduced pressure, but it is not preferable to raise the temperature extremely under reduced pressure because it boils and the carrier scatters and yield decreases. When heating, the temperature is preferably 70 ° C. or lower, and more preferably 30 to 50 ° C.
表面改質のため被覆される水溶性高分子の量には特に制限はないが、担体の持つ多孔性に影響を与えることなく、表面が改質される量で決められる。好ましくは表面改質される担体に対し0.0005〜0.5質量倍、より好ましくは0.002〜0.2質量倍である。 The amount of the water-soluble polymer to be coated for the surface modification is not particularly limited, but is determined by the amount by which the surface is modified without affecting the porosity of the carrier. The amount is preferably 0.0005 to 0.5 times by mass, more preferably 0.002 to 0.2 times by mass with respect to the surface-modified carrier.
本発明の充填剤において、担体を被覆した水溶性高分子を溶解しない溶媒中に分散させて架橋するのに使用される溶媒は、当該水溶性高分子を溶解するものでなければ特に限定されない。溶解性は使用する水溶性高分子の重合度、分子量分布によって変化するので、水溶性高分子を実質的に溶解しない溶媒を選択する。ここで水溶性高分子を実質的に溶解しない溶媒とは、水溶性高分子の被覆された担体を溶媒に浸した後の質量変化で水溶性高分子の溶媒への溶解度を測定したとき水溶性高分子の質量減少が浸漬前の５０％以下のもの、好ましくは質量減少が２５％以下のもの、より好ましくは５％以下のものが望ましい。具体例としては、トルエン、キシレン、エチルベンゼンのような芳香族化合物、ジオキサン、ジメチルホルムアミドのような極性有機溶媒を挙げることができる。これらの中でも、取り扱いの容易さの点から極性有機溶媒が好ましく、反応操作性からジオキサンがより好ましい。 In the filler of the present invention, the solvent used for crosslinking by dispersing in a solvent that does not dissolve the water-soluble polymer coated with the carrier is not particularly limited as long as it does not dissolve the water-soluble polymer. Since the solubility varies depending on the polymerization degree and molecular weight distribution of the water-soluble polymer to be used, a solvent that does not substantially dissolve the water-soluble polymer is selected. Here, the solvent that does not substantially dissolve the water-soluble polymer is water-soluble when the solubility of the water-soluble polymer in the solvent is measured by mass change after the carrier coated with the water-soluble polymer is immersed in the solvent. It is desirable that the polymer has a mass reduction of 50% or less before immersion, preferably a mass reduction of 25% or less, more preferably 5% or less. Specific examples include aromatic compounds such as toluene, xylene and ethylbenzene, and polar organic solvents such as dioxane and dimethylformamide. Among these, a polar organic solvent is preferable from the viewpoint of ease of handling, and dioxane is more preferable from the viewpoint of reaction operability.
担体を被覆した水溶性高分子を架橋するのに使用される架橋剤は当該水溶性高分子が有する官能基と反応する多官能性化合物であれば、特に限定されない。また、単に有機過酸化物のようなラジカル発生剤であってもよい。水溶性高分子が水酸基及び／またはスルホ基を有している場合には、これらの官能基と反応する多官能性化合物を用いることができる。例えば、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドのようなジアルデヒド類やエチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジグリシジルエーテルのようなジグリシジル類、さらにエピクロロヒドリンを挙げることができる。これらの中でも、反応の制御等の点からジグリシジル類が好ましく、入手のしやすさを考慮するとエチレングリコールジグリシジルエーテルが特に好ましい。 The crosslinking agent used for crosslinking the water-soluble polymer coated with the carrier is not particularly limited as long as it is a polyfunctional compound that reacts with the functional group of the water-soluble polymer. Alternatively, a radical generator such as an organic peroxide may be used. When the water-soluble polymer has a hydroxyl group and / or a sulfo group, a polyfunctional compound that reacts with these functional groups can be used. For example, dialdehydes such as glutaraldehyde, terephthalaldehyde and ethylene glycol diglycidyl ether, diethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, 1,4-butane diglycidyl ether, Furthermore, epichlorohydrin can be mentioned. Among these, diglycidyls are preferable from the viewpoint of reaction control and the like, and ethylene glycol diglycidyl ether is particularly preferable in view of availability.
上記ジグリシジル化合物を用い架橋する際、反応促進のため触媒を適時用いることができる。触媒としては、塩酸、硫酸のような無機酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ類、トリエチルベンジルアンモニウムクロライドやテトラメチルアンモニウムクロライドのような四級アンモニウム塩類、ベンジルジメチルアミンやトリブチルアミンのような三級アミン類、２−メチル−４−エチルイミダゾールや２−メチルイミダゾールのようなイミダゾール化合物さらには三フッ化ホウ素、ホウフッ化亜鉛、塩化スズのようなルイス酸を挙げることができるが、反応効率の点からルイス酸が好ましく、中でも反応の制御の点からホウフッ化亜鉛が特に好ましい。 When crosslinking is performed using the diglycidyl compound, a catalyst can be used as appropriate to accelerate the reaction. Catalysts include inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, alkalis such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, quaternary ammonium salts such as triethylbenzylammonium chloride and tetramethylammonium chloride, benzyldimethylamine and tributylamine. Examples of such tertiary amines, imidazole compounds such as 2-methyl-4-ethylimidazole and 2-methylimidazole, and Lewis acids such as boron trifluoride, zinc borofluoride, tin chloride, Lewis acid is preferred from the viewpoint of reaction efficiency, and zinc borofluoride is particularly preferred from the viewpoint of reaction control.
担体の表面改質において、水溶性高分子に対する架橋剤の使用量は通常実際に担体表面を被覆している水溶性高分子の架橋に必要な量より過剰に加えられるが、担体に対しては0.1〜２質量倍、好ましくは0.25〜1.5質量倍使用される。 In the surface modification of the carrier, the amount of the crosslinking agent used for the water-soluble polymer is usually added in excess of the amount necessary for crosslinking the water-soluble polymer actually covering the carrier surface. 0.1 to 2 times by mass, preferably 0.25 to 1.5 times by mass is used.
本発明における表面が改質された充填剤は、分子内に極性基を有する充填剤の表面が水溶性高分子で被覆されることで改質された液体クロマトグラフィー用充填剤である。 The surface-modified packing material in the present invention is a liquid chromatography packing material modified by coating the surface of a packing material having a polar group in the molecule with a water-soluble polymer.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
実施例１：
スルホン化ポリスチレンゲルで、その対イオンを水素型にした粒子（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）KS-807ゲル）５ｇを２５ｇのジオキサン中に分散し、次いで、室温中グリシドール５ｇを添加し、３０分撹拌した。その後ホウフッ化亜鉛１ｇを添加し温度を８０℃へ昇温し４時間反応を行った。冷却後、グリシドールで表面処理された粒子をNo.101のろ紙によりろ別した後、脱イオン水１００ｍＬ、さらに、アセトン１００ｍＬで洗浄し、ステンレス製バット上に広げ風乾した。
グリシドールで表面処理されたスルホン化粒子５ｇを２００ｍＬなす形フラスコに入れ、さらに0.05質量％ヒドロキシエチルセルロース水溶液２５ｍＬを入れ分散させた後ロータリーエバポレータを用い水分を留去し、粒子表面にヒドロキシエチルセルロース皮膜を形成した。
この表面にヒドロキシエチルセルロース皮膜が形成された粒子が入ったなす形フラスコに５０ｇにジオキサンを入れ、粒子をよく分散させた後エチレングリコールジグリシジルエーテル2.5ｇを入れ１０分間撹拌を続けた後ホウフッ化亜鉛2.5ｇを入れ８０℃で３時間反応させ表面のヒドロキシエチルセルロース皮膜を架橋した。
こうして得られた表面がヒドロキシエチルセルロースで改質された粒子を、パッカーと高圧ポンプを用いて内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
Example 1:
Disperse 5 g of particles of sulfonated polystyrene gel in which the counter ion is in the hydrogen form (Shodex (Showa Denko ™ KS-807 gel) manufactured by Showa Denko KK) in 25 g of dioxane, and then 5 g of glycidol at room temperature. Was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, 1 g of zinc borofluoride was added, the temperature was raised to 80 ° C., and the reaction was carried out for 4 hours. After cooling, the particles surface-treated with glycidol were filtered off with No. 101 filter paper, washed with 100 mL of deionized water and 100 mL of acetone, spread on a stainless steel vat and air-dried.
5 g of sulfonated particles surface-treated with glycidol are placed in a 200 mL flask, and 25 mL of 0.05% by weight hydroxyethyl cellulose aqueous solution is added and dispersed, and then water is distilled off using a rotary evaporator to form a hydroxyethyl cellulose film on the particle surface. did.
Dioxane is added to 50 g in an eggplant-shaped flask containing particles having a hydroxyethylcellulose film formed on the surface, and the particles are well dispersed, then 2.5 g of ethylene glycol diglycidyl ether is added and stirring is continued for 10 minutes, and then zinc borofluoride is added. 2.5 g was added and reacted at 80 ° C. for 3 hours to crosslink the hydroxyethylcellulose film on the surface.
Particles whose surface is modified with hydroxyethylcellulose thus obtained are packed into a liquid chromatography stainless steel column with an inner diameter of 8 mm and a length of 300 mm using a packer and a high-pressure pump by the equilibrium slurry method, and packed for liquid chromatography. A column was obtained.
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を溶離液に0.03質量％になるように溶解した試料１００マイクロリットルを注入し分子量を測定した。なお、検出器には示差屈折計（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）ＲＩ−７１）を用いた。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
さらに、このカラムを別の高速液体クロマトグラフ装置に接続し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を溶離液として1.0ｍＬ毎分の流速で流し、試料としてウシ血清アルブミン（SIGMA-ALDRICH社製）の0.03質量％溶離液１０マイクロリットルを注入し、紫外分光検出器（昭和電工（株）製Shodex（昭和電工登録商標）ＵＶ−４１）を用いて検出波長２８０ｎｍでクロマトグラムを得、その面積値を測定した。続いてカラムを高速液体クロマトグラフ装置から取り外し、代わりに内径0.5ｍｍ、長さ１０ｍのポリテトラフルオロエチレンチューブをウシ血清アルブミンを吸着しない参照カラムとして接続し、同様に0.03質量％ウシ血清アルブミン溶離液溶液１０マイクロリットル注入してクロマトグラムを得、その面積値を測定した。
表面改質充填剤充填カラムから得られたクロマトグラム面積値を参照カラム（ポリテトラフルオロエチレンチューブ）から得られる面積値で除した値として定義したウシ血清アルブミンの回収率は７８％であった。
This column is connected to a high-performance liquid chromatograph, and 0.2 M sodium chloride solution is used as an eluent and 0.5 mL is flowed at a flow rate of every minute. 100 microliters of the sample dissolved so as to be 0.03% by mass was injected and the molecular weight was measured. In addition, the differential refractometer (Showa Denko Co., Ltd. Shodex (Showa Denko registered trademark) RI-71) was used for the detector. From the obtained chromatogram, it was confirmed that the molecular weight distribution could be analyzed without reaching the exclusion limit molecular weight of the column even with the maximum molecular weight of the hyaluronic acid.
Furthermore, this column was connected to another high performance liquid chromatograph, and 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) was used as an eluent at a flow rate of 1.0 mL / min, and bovine serum albumin (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was used as a sample. 10 microliters of eluent of 0.03% by mass) was obtained, and a chromatogram was obtained at a detection wavelength of 280 nm using an ultraviolet spectroscopic detector (Shodex (Showa Denko registered trademark) UV-41 manufactured by Showa Denko KK). The value was measured. Subsequently, the column was removed from the high performance liquid chromatograph, and instead, a polytetrafluoroethylene tube having an inner diameter of 0.5 mm and a length of 10 m was connected as a reference column that does not adsorb bovine serum albumin, and similarly 0.03% by mass bovine serum albumin eluent A chromatogram was obtained by injecting 10 microliters of the solution, and the area value was measured.
The recovery rate of bovine serum albumin defined as the value obtained by dividing the chromatogram area value obtained from the surface-modified packing column by the area value obtained from the reference column (polytetrafluoroethylene tube) was 78%.
比較例１：
実施例１と同様のスルホン基の導入されたポリスチレンゲル粒子を実施例１と同様にパッカーと高圧ポンプを用い、内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を実施例１と同様に測定した。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
さらに、このカラムを実施例１と同様の条件で試料として0.03質量％ウシ血清アルブミン１０マイクロリットル注入したが、ウシ血清アルブミンが充填剤に吸着され、ほとんど流出してこなかったため正確なクロマトグラムを得ることはできなかった。
Comparative Example 1:
The polystyrene gel particles having the same sulfone group introduced as in Example 1 were packed into a stainless steel column for liquid chromatography having an inner diameter of 8 mm and a length of 300 mm using an equilibration slurry method in the same manner as in Example 1 using a packer and a high-pressure pump. A packed column for liquid chromatography was obtained.
This column was connected to a high-performance liquid chromatograph, and 0.2 M sodium chloride solution was used as an eluent and flowed at a flow rate of 0.5 mL / min. Was measured in the same manner. From the obtained chromatogram, it was confirmed that the molecular weight distribution could be analyzed without reaching the exclusion limit molecular weight of the column even with the maximum molecular weight of the hyaluronic acid.
Furthermore, although 10 microliters of 0.03% by mass bovine serum albumin was injected as a sample under the same conditions as in Example 1, bovine serum albumin was adsorbed on the packing material and almost did not flow out to obtain an accurate chromatogram. I couldn't.
比較例２：
実施例１のグリシドールで表面処理された段階のスルホン化ポリスチレン粒子を実施例１と同様パッカーと高圧ポンプを用い、内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍの液体クロマトグラフィー用ステンレスカラムに平衡スラリー法で高圧充填し、液体クロマトグラフィー用充填カラムを得た。
このカラムを高速液体クロマトグラフ装置に接続し、0.2Ｍ塩化ナトリウム液を溶離液として0.5ｍＬ毎分の流速で流し、粘度平均分子量が３３７万のヒアルロン酸（資生堂（株）製）を実施例１と同様に測定した。得られたクロマトグラムから当該ヒアルロン酸の最大分子量のものであってもカラムの排除限界分子量に達することなく、分子量分布が分析できていることが確認された。
Comparative Example 2:
The sulfonated polystyrene particles at the stage of surface treatment with glycidol in Example 1 were packed at high pressure by a balanced slurry method into a stainless steel column for liquid chromatography having an inner diameter of 8 mm and a length of 300 mm using a packer and a high-pressure pump as in Example 1. A packed column for liquid chromatography was obtained.
This column was connected to a high-performance liquid chromatograph, and 0.2 M sodium chloride solution was used as an eluent and flowed at a flow rate of 0.5 mL / min. Was measured in the same manner. From the obtained chromatogram, it was confirmed that the molecular weight distribution could be analyzed without reaching the exclusion limit molecular weight of the column even with the maximum molecular weight of the hyaluronic acid.
さらに、このカラムを実施例１と同様の方法でウシ血清アルブミンの回収率を測定したところ、回収率は４２％であった。
Furthermore, when the recovery rate of bovine serum albumin was measured for this column in the same manner as in Example 1, the recovery rate was 42%.
Claims (22)
A liquid chromatography column, which is packed with the liquid chromatography packing material having a modified surface according to any one of claims 1 to 11.
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