JP2005534922A - 蛍光偏光アレイ - Google Patents

Abstract

本発明は、特異的なアプタマーへの分析物の結合に結果としての蛍光異方性における変化を測定することによる、サンプル中の１つ以上の目的分析物の存在を検出するための方法に関する。これらのアプタマーは、固体支持体上に固定化され、そしてアレイの形式であり得る。１つの局面において、本発明は、サンプル中の分析物を検出するための方法を提供する。固体支持体に結合された、発蛍光団標識されたアプタマーは、サンプルと接触され、そして偏光に照らされる。

Description

（発明の分野）
本発明は、蛍光異方性における変化を測定することによる、アプタマーへの目的分析物の結合を検出するための方法に関する。

（関連技術の説明）
１９５９年における免疫アッセイの導入、および１９７１年における固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、臨床診断薬に改革をもたらした。最近まで、分子認識の可能な分子、およびこれによる診断アッセイにおいて有用な分子は、抗体に限られてきた。コンビナトリアル化学方法論により高親和性リガンドを選択するためのインビトロ方法の最近の開発は、独自の新規な治療試薬および診断試薬の見込みがある。これらの方法は、高い親和性および特異性を有する、非常に多くの異なるオリゴヌクレオチド配列を同定するのを可能にする。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、強力な薬物として、オリゴヌクレオチドリガンド（アプタマーとも知られる）の同定のための一般的な方法である、リガンドの指数関数的富化による系統的進化（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）によって同定され得る。この方法において、ＲＮＡのプール（特定の部位で完全にランダムにされる）は、ニトロセルロースフィルター上に固定化されている特定の核酸結合性タンパク質への結合のための選択に供される。次いで、結合されたＲＮＡまたはＤＮＡは、回収されて、そしてＤＮＡとしてさらに増幅される。このＤＮＡは、さらなる特徴付けに供され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、種々の分析物、特にＨＩＶの種々の酵素、増殖因子および炎症誘導性酵素を含むタンパク質の、同定のためのプローブとして使用され得る（Ｓｕｎ，Ｓ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（１）：１００−５（２０００））。

分析物に結合されたアプタマーの同定および定量のために代表的に使用されてきたプラットフォームは、これらが一方または両方の未結合の反応物から、結合された産物を分離するための方法を必要とすることにおいて、非常に限定される。未結合の反応物から結合された反応物を分離する例としては、固相への結合、液体クロマトグラフィーおよび電気泳動が挙げられる。

（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、サンプル中の分析物を検出するための方法を提供する。固体支持体に結合された、発蛍光団標識されたアプタマーは、サンプルと接触され、そして偏光に照らされる。発蛍光団の蛍光異方性が測定され、そしてその蛍光異方性の値が、サンプルの非存在において取得された異方性の値より大きい場合、分析物の存在が同定される。

１つの実施形態において、発蛍光団標識されたアプタマーが結合される固体支持体は、ビーズ（例えば、シリカビーズ）である。このビーズは、約１μｍと約１０μｍとの間の直径を有し得る。特定の実施形態において、このビーズは、約５μｍの直径を有し得る。このビーズは、液体中に懸濁されるかまたは二次元アレイで並べられ得る。

別の実施形態において、アプタマーは、フルオレセイン誘導体、エオシン誘導体、クマリン誘導体およびローダミン誘導体からなる群より選択される発蛍光団で、標識される。特定の実施形態において、この発蛍光団はカルボキシフルオレセインである。

アプタマーは、アプタマーのアレイの一部であり得る。１つの実施形態において、アプタマーのアレイは、２つ以上のアドレス付け可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置を備える。各々のアドレス付け可能な位置は、１つの型のアプタマーを備える。別の実施形態において、各々のアドレス付け可能な位置は、複数の型のアプタマーを備え得る。

１つの実施形態において、アプタマーを照射するために使用される偏光は、レーザー光でる。

別の実施形態において、目的の分析物は、疾患または障害と結び付けられる。サンプルは、疾患または障害に羅患していると疑われる患者から取得され得る。

１つの実施形態において、分析物はタンパク質である。別の実施形態において、分析物は代謝産物である。

別の局面において、サンプルは、疾患または障害に羅患していると疑われた患者から取得される。疾患または障害と関連する分析物が同定され、そしてサンプルにおいて分析物の存在または非存在が決定される。患者は、患者から採取されたサンブルにおいて分析物が存在することが決定される場合、その疾患または障害に羅患しているとして診断される。

（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、標識されたアプタマーへの分析物の結合の結果から生じる蛍光異方性における変化を測定することにより、サンプル中の１つ以上の分析物を同定するための方法を提供する。

（定義）
他に定義されない場合、本明細書中に使用される技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。当業者は、本明細書中に記載された方法および材料と同じであるかまたは等価である、本発明の方法の実施において使用され得る多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および材料には決して限定されない。本発明の目的のため、次の用語が下に定義される。

本明細書中で使用される場合、用語「アプタマー」は、塩基対ハイブリダイゼーション以外の他の方法により、目的の分析物に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドである。アプタマーは代表的に、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。アプタマーは、天然に存在し得るか、または合成手段もしくは組換え手段により製作され得る。アプタマーは代表的に一本鎖であるが、二本鎖でも三本鎖でもあってもよい。これらは天然に存在するオリゴヌクレオチド、いくつかの方法（例えば、化学修飾）で修飾されたヌクレオチド、および非天然の塩基（例えば、２−アミノプリン）を含み得る。例えば、米国特許第５，８４０，８６７号を参照のこと。アプタマーは、例えば、標識（例えば、発蛍光団）の付加によるか、またはこのアプタマーが結合される分子にこのアプタマーが架橋するのを可能にする分子の付加によって、化学修飾され得る。アプタマーは、これらが同じ配列を有するかまたは同じ分子に特異的に結合し得る場合、同じ「型」のものである。アプタマーの長さは変動するが、代表的に、約１００ヌクレオチド未満である。

非常に多くのアプタマーが当該分野で公知であり、そしてこれらの公知の特性に基づき、特定の用途における使用のため選択され得る。あるいは、新規のアプタマーが、目的の特異的な分子に結合する能力に基づいた、オリゴヌクレオチドのランダムなプールからの選択により、調製および同定され得る。例えば、新規のアプタマーは、例えば米国特許第５，４７５，０９６号および同第５，２７０，６１３号に記載される、指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ：ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）のプロセスによって、調製および同定され得る。

アプタマーは、１つ以上の発蛍光団で標識される。発蛍光団は、蛍光発光プローブまたは蛍光発光色素ともいわれ得る。「発蛍光団」は、特定の波長の光で励起される場合に異なる波長の光を放射する、任意の分子である。発蛍光団としては、フルオレセイン（米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，０８８，３７９号；同第６，０２０，４８１号）、エオシン、クマリン、ローダミン（米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；同第６，１９１，２７８号）（例えば、テトラメチルローダミン）、ベンゾフェノキサジン（米国特許第６，１４０，５００号）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）およびダンシル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。生体分子を標識するのに有用な蛍光発光レポーター色素としては、ドナーおよびアクセプターのエネルギー転移色素対（米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号）ならびにシアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ ９７／４５５３９）、ならびに検出可能なシグナルを生成し得る任意の他の蛍光発光標識が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、５−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）、６−カルボキシフルオレセイン（「６−ＦＡＭ」）；２’，４’，４，７−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’５’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられる。米国特許第５，１１８，９３４号を参照のこと。

発蛍光団は、任意の部位でアプタマーに組み込まれ得る。例えば、アプタマーは、その骨格に沿ってか、その塩基中の位置か、またはいずれかの末端で標識され得る。アプタマーは、当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、蛍光発光性に標識されたリンカー化合物を使用する、標準的なＤＮＡ合成技術を使用することによって）、標識され得る。あるいは、非標識化リンカー化合物が、合成およびそれに続く発蛍光団を用いた標識化の間に使用され得る。（例えば、Ｒｕｔｈ，Ｊ．（１９９１） Ｏｌｉｇｏ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，２５５−２８２頁，Ｅｃｈｓｔｅｉｎ，Ｆ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｖｉｎａｙａｋ Ｒ．（１９９９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０：７６１１−７８１３を参照のこと）。アプタマーがＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスにより調製される場合、発蛍光団は、この発蛍光団がアプタマーへの分析物の結合を妨害しないことを確実にするための選択プロセス中に、組み込まれ得る。さらに、アプタマーの結合ドメインの一部である発蛍光団位置の同定は、分析物の結合が蛍光異方性における有意な変化を生じることを、確実にし得る。

「標識」は、ポリヌクレオチドに結び付けられ得る任意の部分であり、そして検出可能なシグナル（例えば、発蛍光団）を提供する。

「蛍光発光」は、サンプルまたは色素からの光の放射であり、これはサンプルまたは色素に当たる光より長波長である。サンプルまたは色素に当たる光（通常「励起」光といわれる）は、サンプルまたは色素に吸収され、次いで「放射」光として放射される。

「異方性」は、方向における変化を有する、系の特性における差異である。「蛍光異方性」の文脈において、これは、上に定義されるように、放射光の偏光における差異を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互に交換可能に使用され、そしてヌクレオチドモノマー（２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む）の一本鎖ポリマー、二本鎖ポリマーおよび三本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、全てデオキシリボヌクレオチドからからなり得るか、全てリボヌクレオチドからなり得るか、またはこれらのキメラ混合物であり得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログおよび糖アナログからなり得、非天然塩基、糖、Ｌ−ＤＮＡおよび改変されたヌクレオチド間結合を含む。

「リンカー」とは、共有結合を含む分子における化学部分、または１つの部分もしくは分子を別のものに共有結合する原子（例えば、発蛍光団をアプタマーに共有結合するか、またはアプタマーを固体支持体に共有結合する原子）の鎖を、いう。

リンカーは、除去可能な保護基を含み得る。「保護基」は、分子に結合されそしてアクチベーター（例えば、光）への選択的な曝露の際に取り外され得る物質である。

用語「固体支持体」とは、アプタマーが結合され得るかまたは固定化され得る、任意の固相物質をいう。例えば、固体支持体は、ガラス、金属、シリコン、ゲルマニウム、ＧａＡｓまたはプラスチックを含み得る。固体支持体は、「樹脂」、「固相」および「支持体」のような用語を包含する。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフト物からなり得る。固体支持体はまた、無機性であり得る（例えば、ガラス、シリカ、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ：ＣＰＧ）または逆相シリカ）。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、細粒、ゲル、ファイバーまたは面の形態であり得る。面は、平面であっても、実質的に平面であっても、非平面であってもよい。固体支持体は、多孔性であっても非多孔性であってもよく、そして盛り上がった特徴を有していても盛り上がっていない特徴を有していてもよい。固体支持体は、ウェルの形態、窪みの形態、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ、ｖｅｓｓｅｌ）、造形（ｆｅａｔｕｒｅ）もしくは位置の形態で、構成され得る。複数の固体支持体は、アレイで構成され得る。

「アレイ」または「マイクロアレイ」は、基材上に存在するアプタマーの、予め決定された空間的配置を意味する。これらのアプタマーは、基材に直接結合され得るか、または基材と会合して固体支持体に結合され得る。これらのアプタマーは、単独の分析物を検出するように設計されるアレイの場合のように全て同一であり得るか、または例えばサンブル中の種々の異なる分子を検出および／もしくはは同定するように設計されるアレイにおいては、これらのアプタマーは異なり得る。アレイは、１つ以上の「アドレス付け可能な位置」、すなわち既知の型のアプタマーを備える物理的位置を、備え得る。１つの実施形態において、アドレス付け可能な位置は、１つより多くの型のアプタマーを備え得る。しかし、各位置に存在するアプタマーの型は、既知であるか、または決定され得る。

アレイは、多く（例えば、１から約１００（低い数）、１００から約１０００（中程度の数）、または１０００以上（高い数））のアドレス付け可能な位置を備え得る。さらに、アレイ上のアドレス付け可能な位置の密度は、変動され得る。例えば、基材上のアドレス付け可能な位置の密度は、必要な基材のサイズを低減させるために増加され得る。代表的に、アレイの形式は幾何学的に規則正しい形であり、これは、例えば、製造、操作、積み重ね、試薬およびサンプルの導入、検出、ならびに保存を容易にし得る。アレイは、各位置の間に規則正しい空間が空けられた、行列の形式で構成され得る。あるいは、この位置は、群で配置されても、ランダムに配置されても、または任意の他のパターンで配置されてもよい。１つの実施形態において、アレイは、高スループット操作のため各位置が空間的にアドレス付け可能であるように構成される、複数のアドレス付け可能な位置を備える。

二次元アレイにおいて、アドレス付け可能な位置は、面上の位置により決定される。しかし、１つの実施形態において、アレイは、溶液に多くの粒子（例えば、ビーズ）を備える。各粒子は、特定の型（単数または複数）のアプタマーを備える。この場合において、アプタマーの同一性は、粒子の特徴によって決定され得る。例えば、粒子は同定可能な特徴（例えば、形、パターン、発色団または発蛍光団）を有し得る。

「標的」および「分析物」は両方とも、検出される存在、非存在または量の特定の分子または化合物、およびアプタマーと相互作用し得る特定の分子または化合物をいう。分析物は、任意の分子（ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、多糖、代謝産物、栄養物、薬物または低分子を含むがこれらに限定されない）であり得る。分析物は、天然に存在しても、合成であってもよい。１つの実施形態において、分析物は、生存している生物または以前生存した生物（原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルスを含むが、これらに限定されない）に由来するポリペプチドである。

「基材」とは、本明細書中で使用される場合、本発明のアレイの、下方に存在する中心物質をいう。代表的に、基材は、固体支持体であり、硬質な表面または半硬質な表面を有する。１つの実施形態において、基材の表面は平面である。他の実施形態において、基材の表面は、物理的な造形（例えば、ウェル、溝（ｔｒｅｎｃｈ）、および盛り上がった領域または窪んだ領域）を備え得る。アレイを形成するアプタマーは、基材に直接的に結合され得るか、または基材に自体が会合された（例えば、基材に結合されるかまたは基材に含まれる）固体支持体に結び付けられ得る。

（発明を実施するための例示的な形態）
本発明は、蛍光標識されたアプタマーへの分析物の結合の際の蛍光異方性における変化に基づき、サンプル中の１つ以上の分析物の存在、非存在、量を決定するための方法を提供する。蛍光異方性は、蛍光の偏光より生じ、これは、フォトンの吸収とそれに続くフォトンの放射との間に生じる、発蛍光団の平均角分散を明らかにする。

上記に考察されるように、分析物は任意の方法に限定されず、従って本明細書中に開示される方法は、多くの異なる分野に広範に適用可能である。分析物の同一性は分析物の性質に依存して変動し、そして特定の分野における当業者は、これらの方法を、特定の状況に適応させ得る。

サンプル中の１つ以上の分析物の存在または非存在が、決定される。サンプルは、分析物の存在について分析されることが所望される任意の組成であり得、そして任意の方法に限定されない。例えば、非限定的に、医療的状況において、疾患または障害と関連するポリペプチド（例えば、感染性因子）の存在について、患者より体液（例えば、血液）のサンプルを分析することが望ましくあり得、一方、工業的状況において、特定の有機化合物の存在について、廃棄物流を分析することが望ましくあり得る。

目的の分析物に特異的であるアプタマーが、同定される。このアプタマーは、目的の分析物を結合し得るとしてこれまでに同定されているアプタマーである。このような多くのアプタマーは、当該分野で公知である。たとえば、既知の選択性を有するアプタマーのデータベースは、ＡｕｓｔｉｎのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ（ｈｔｔｐ：／／ａｐｔａｍａｒ．ｉｃｍｐ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ）で維持される。多くの異なるアプタマーもまた、市販され得る（例えば、Ｓｏｍｏｌｏｇｉｃ（Ｃｏｒｏｌａｄｏ，ＵＳＡ）またはＧｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））。目的の分析物に特異的であるアプタマーがこれまでに記載されていない場合、これは当該分野で公知の任意の方法によって同定され得る。特定の化合物と相互作用するアプタマーを同定するための方法は、周知である。例えば、特定のリガンドに特異的であるアプタマーは、例えば米国特許第５，４７５，０９６号および同５，２７０，６１３号に記載される、指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ^ＴＭ）のプロセスによって、同定され得る。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスにおいて、ランダムにされたＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列のプールが、所望の標的に対して選択される。標的とより強力な結合を示す配列が、単離および増幅される。この選択は、有用なアプタマーを同定するために、前回の選択より導かれた富化プールを使用して、数回繰り返される。

一旦、アプタマーが同定されると、アプタマーの１つ以上のコピーが、分析物の存在を検出するためのアッセイにおける使用のために、作製される。アプタマーは、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。従って、これらアプタマーは、標準的な手順によって化学合成され得る。アプタマーは、合成の間かまたは合成後のいずれかに、発蛍光団で標識され得る。これらは、当該分野で公知の任意の方法によって標識され得る。例えば、アプタマーは合成の間に修飾ヌクレオチドの組み込みによって標識され得る。あるいは、アプタマーは、合成後に化学修飾され得る。標識化後、これらのアプタマーは分析されるサンプルと接触される。別の実施形態において、標識は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスの間に組み込まれ得る。このことは、分析物に対する結合部位の中に標識を配置するのを助け得、このことは次いで、分析物の結合の際に蛍光異方性における非常に大きな変化を確実にする。

アプタマーは、これらが分析されるサンプルと接触される場合、代表的に、固体支持体上に存在する。アプタマーは、固体支持体上で直接的に合成され得るか、または代替的に、アプタマーは合成後に固体支持体に結合され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０（７）：１６７９−１６８４（１９９２）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：１００８−１００１７（１９９２）；ＷＯ０２／３０５６１；ＷＯ０２／０７５０；ＷＯ９６／４０７９０；Ｍａｃｌｅａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：２８０５−２８１０（１９９７）；ならびに米国特許第５，７４４，３０５号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４４５，９３４号および同第６，２６１，７７６号。アプタマーは、当該分野で公知の任意の方法によって、固体支持体に結合され得る。例えば、３’−アミンで修飾されたアプタマーはが、固体支持体の活性化された表面に適用され得る（Ｐｏｔｙｒａｉｌｏら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７０（１６）：３４１９−３４２５（１９９８））。１つの実施形態において、ガラス基材が、（グリシドオキシプロピル）トリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）を用いて活性化される。蛍光標識されたアプタマー（３’末端へのアルキルアミノ基の連結により改変される）は、引き続きガラス基材に共有結合される。未反応のアプタマーは、洗浄によって除去され得、そして未反応の表面の基はブロックされ得る。１つの実施形態において、未反応の表面の基は、０．１Ｍのエタノールアミン溶液を用いたインキュベーションによってブロックされる。別の特定の実施形態において、５’末端にＣ６アミノリンカーを有するアプタマーは、処理されたシリカ粒子に結合される。

別の実施形態において、アプタマーはリンカー分子を介して固体支持体に結合される。リンカー分子は、基材の表面上に提供される。次いでリンカー分子は、このリンカー分子を介してアプタマーが基材に結合されるような条件下で、アプタマーと接触される。

特定の実施形態において、アプタマーのアレイは、リンカー分子を含む基材上に形成され、ここで、このリンカー分子の遠位末端が保護基を有する官能基を含む。このようなアレイの形成は、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号、同第５７４４，３０５号および同第５，４０５，７８３号に記載され、これらの開示は、本明細書中で参考として援用される。保護基は、適切な条件（例えば、光、放射線、電場、電流または他のアクチベーター）にリンカー分子を曝すことによって、官能基を露出させるために除去され得る。特定のリンカー分子にアクチベーターを指向させることによって、基材の規定される部分が活性化され得る。例えば、保護基が光により除去可能である場合、基材の規定された領域が照射され得、これによってこの領域中のリンカー分子を活性化する。次いで、特定の型のアプタマーが、活性化されたリンカー分子と接触され得る。次いで、過剰のアプタマーが除去され、そして任意の未反応のリンカー分子がブロックされる。この方法において、アプタマーの特定の型を備えるアドレス付け可能な位置が、作製される。次いで、基材上のリンカー分子の異なる別個の領域が、活性化され得る。次いで、第二の型のアプタマーが、第二の別個の領域に結合され得る。このプロセスを繰り返すことによって、既知のアプタマーの型を備える多くのアドレス可能な位置を備えるアレイが、基材上に形成され得る。代替の実施形態において、以前に合成されたアプタマーを結合するよりもむしろ、アプタマーは基材の活性化領域上に直接合成され得る。

アプタマーは、溶液中に懸濁された固体支持体に結合され得る。例えば、アプタマーはビーズに結合され得、このビーズは引き続き緩衝液中に懸濁される。１つの実施形態において、ビーズがウェル中（例えば、マイクロプレートのウェル中）に懸濁される。各ウェルは、同じ型のアプタマーを各々備えるビーズを含み得る。この方法において、１つの分析物の存在について、複数のサンプルが同時に分析され得る。別の実施形態において、各ウェルは、異なる型のアプタマーを備えるビーズを含み、種々の異なる分析物の検出を可能にする。なお別の実施形態において、各ウェルは種々の異なるアプタマーを備えるビーズを含み、１つ以上の種々の分析物の存在の決定を可能にする。

サンプル中の目的の分析物の存在は、アプタマーへの分析物の結合の際に、アプタマーに結合された発蛍光団の蛍光異方性における変化を同定することによって、決定される。分析物の非存在における基底の蛍光異方性が、以下に記載するように測定される。引き続き、アプタマーは、サンプルと接触されて分析物の存在について分析され、そして蛍光異方性が再度測定される。分析物の存在は、蛍光異方性における変化の観察によって示される。あるいは、基底の蛍光異方性は、並行して実行されそして引き続いてサンプルとは接触されない、アプタマーでコーティングされた固相から、決定され得る。

励起偏光子および放射偏光子の選択された位置に対する蛍光強度が、決定される。アプタマーに結合された発蛍光団は、偏光での照射によって励起される。当該分野で公知の任意の励起供給源が使用され得る。例えば、キセノンアークランプからの光が、偏光され得、そして所望の領域に集束され得る。別の実施形態において、レーザー励起供給源が使用され、これによって励起偏光の必要性を除去する。

蛍光測定は、当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、１つのチャネル検出を用い、そしてＴ形式もしくはＬ形式おける直角（９０°）放射収集ジオメトリーか、または蛍光分光形を使用した前面放射収集ジオメトリー（例えば、ＳＰＥＸ（ＮＪ．ＵＳＡ）より市販される、Ｆｌｕｒｏｌｏｇ−３^ＴＭ装置）のいずれかににおいて）なされ得る。例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」，１１１−１５３頁，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）およびＰｏｔｙｒａｉｌｏら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：３４１９−３４２５（１９９８）を参照のこと。

従って、蛍光異方性における変化を測定するための代表的な装置は、励起供給源、光の所望の波長を透過する励起フィルター、励起光がアプタマーに接触する前に励起供給源からの光を偏光する偏光フィルター、および目的のアプタマーに対する励起光を、例えば基材上のアドレス付け可能な位置に集束させるためのレンズを、備える。１つの実施例において、レーザーが使用される。この実施形態において、レーザー光の性質に起因して、偏光子およびレンズは必要とされなくてよい。

装置はまた、代表的に、サンプルチャンバ、放射された光を偏光するための１つ以上の放射偏光子、放射された光の所望の波長を透過する放射フィルター、および放射された光の量を収集しそして定量するための検出器を、備える。

蛍光異方性は、蛍光の偏光より生じ、これは、フォトンの吸収とそれに続くフォトンの放射との間に生じる、発蛍光団の平均角分散を明らかにする。

蛍光異方性（ＦＡ）は、以下のように放射強度Ｉの測定より計算される：
ＦＡ＝（Ｉ_ｖｖ−ＧＩ_ｖｈ）／（Ｉ_ｖｖ＋２ＧＩ_ｖｈ） （Ｉ）
ここで、Ｇは装置補正因子であり、Ｇ＝Ｉ_ｈｖ／Ｉ_ｈｈ、そして添え字のｖおよびｈは、それぞれ偏光子の垂直方向および水平方向をいう。

１つの実施形態において、測定は、約２５℃の温度で約１秒（１ｓ）の一定な検出時間を用いて、なされる。

目的の分析物への結合についての経時的な発蛍光団標識されたアプタマーの偏光異方性における変化は、そのアプタマーに結合する分析物の動態力学を決定するために、決定され得る。

この方法の感度は、サンプル中の目的の少量の分析物の同定を可能にする。例えば、高親和性で分析物に結合するアプタマーについて、１〜１０ｐＭの分析物まで下げた検出が、実行可能である。

（ビーズアレイ）
アプタマーのアレイを使用して、サンプル中の１つ以上の分析物の存在を同定し得る。本発明の１つの局面において、アレイは、基材表面上に固定化されたアプタマーを備える。１つの実施形態において、目的の分析物に特異的である標識化アプタマーが、ミクロスフェアまたはビーズに結合される。次いで、これらのビーズを使用して、１つ以上の分析物の検出のために有用なアレイを形成し得る。Ｗａｌｔｏｎら Ａｎａｌｙｔｉｃ．Ｃｈｅｍ．７４：２２４０−２２４７（２００２）；Ｚｈｏｕら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：Ｓ３４−Ｓ３９（２００１）；ＷＯ０２／２４９５９；ＷＯ００／５０９０３；ＷＯ００／６１８０３ならびに米国特許第５，３４０，４２２号および同６，０７４，６０９号を、参照のこと。

アプタマーを結合されたビーズは、溶液中に自由であり得るか、または基材に物理的に結合され得るかもしくは基材と会合され得る。溶液中で自由である場合、蛍光異方性は、フローサイトメーターで測定され得る。ビーズが固体支持体または基材の表面に結合される場合、これらビーズは特定の部位に結合されて、１つ以上のアドレス付け可能な位置を有するアレイを形成し得る。

「ミクロスフェア」または「ビーズ」は、小さな別個の粒子である。ビーズは一般的に球状の幾何学を有する一方、それらの形状は不規則であり得る。１つの実施形態において、不規則なサイズまたは形状は、特定の型のアプタマーを備えるビーズを同定する。代表的に、ビーズは約１μｍ〜約１０μｍまでの直径を有する。あるいは、これらビーズは、約１０ｎｍ〜約１ｍｍまでの直径、またさらに約１０ｍｍ〜約１００μｍまでの直径を有し得る。ビーズは、アプタマーが結合され得る任意の物質（非限定的に、プラスチック、ガラス、セラミック、金属、セルロース、ナイロンまたはラテックスを含む）からなり得る。

１つのビーズ上のアプタマーの数は、いかなる方法でも限定されない。しかし代表的に、各ビーズは、少なくとも約１０^５個のアプタマーを備える。各ビーズは、１つの型のアプタマーを備え得る。しかしあるいは、各ビーズは１つより多くの型のアプタマーを備え得る。このことは、例えば、サンプル中で多くの化合物のうちの少なくとも１つの存在が決定されるべきでありそしてどれか特定の化合物の存在を知る必要がない場合に、有用であり得る。別の実施形態において、各ビーズは、いくつかの異なる型のアプタマー（各々のアプタマーが異なる発蛍光団を含む）を含み得る。この様式において、各ビーズは、複数の分析物を検出する能力があり得る。

アプタマーは、ビーズ上で直接的に合成され得るか、または作製され得そして引き続きリンカー分子を用いてビーズに結合され得る。例えば、ビーズの表面は、アプタマーの結合を可能にするように、例えば、チオールまたはアミンのような化学反応性の基を用いて、改変され得る。このような改変は当該分野で周知である。ビーズに結合されたアプタマーは、ビーズへの結合前または結合後に蛍光標識され得る。

アプタマー結合ビーズを使用して、サンプル中における１つ以上の分析物の存在を検出し得る。アプタマー結合ビーズは、それら自体が固体支持体に結合され得る。しかし代表的に、これらのビーズは、容器（例えば、キュベットまたはマイクロタイタープレートのウェル）の中で溶液中に置かれる。

ビーズのアレイを使用して、サンプル中の１つの分析物を検出し得る。この場合において、アレイ中の全てのビーズは、同じ型のものであり、従って代表的に同じ型のアプタマーを用いて誘導体される。

１つの実施形態において、目的の分析物に特異的である、蛍光標識されたアプタマーで標識されたビーズは、容器（例えば、キュベットまたはマイクロタイタープレートのウェル）の中で溶液中に置かれる。検出可能なシグナルを生成するのに十分な数のアプタマー結合ビーズが、存在しなければならない。少なくとも約１０^６個のビーズが、一般的に、容器の中の溶液中に存在する。分析されるためのサンプルが、この容器に添加される。蛍光異方性が、上記のように、サンプルの添加前および添加後の両方に測定される。サンプル添加後の蛍光異方性における変化は、サンプル中の分析物の存在について示す。

１つの分析物の存在について複数のサンプルを同時に分析するために、多くの容器が使用され得る。多くの個々の容器（例えば、多くのキュベット）が、使用され得る。あるいは、これらの容器は、迅速な操作を容易にするために、例えば、マルチウェルのマイクロタイタープレートにおいて、互いに会合され得る。１つの実施形態において、マルチマイクロタイタープレートの各ウェルは、溶液中に、同じ型のアプタマー結合ビーズを含む。次いで、サンプルが、ウェルあたり１サンプル、ウェルに添加される。各ウェルにおける蛍光異方性が、サンプルの添加前および添加後に、測定される。サンプルの添加の際の蛍光異方性における変化は、サンプル中の分析物の存在について示す。蛍光異方性の変化が測定されたウェルに添加されたサンプルは、目的の分析物を含むとして同定される。

アプタマー結合ビーズを含むアレイをまた使用して、サンプル中に１つ以上の種々の異なる分析物が存在するかどうかを決定し得る。この実施形態において、ビーズの集団中に、多くの異なる型のアプタマー（同定されるための分析物の数に等しいかまたはそれより多い）が、表される。

代表的に、任意の分析物の存在についての同定が目的である。従って、異なる分析物の結合が区別され得るように、アレイ中の各位置での各ビーズ上のアプタマーの型を同定することが、必要である。このことは、アレイ中の既知のアプタマーを有するビーズを個々に配置することによって達成され得る。あるいは、これらのビーズは、アレイ中にランダムに分散され得、そしてアレイが形成された後に、アレイ中の個々のビーズの特定の位置が、決定され得る。このことは、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。例えば、ビーズは、発蛍光団、バーコード、ＩＲタグを用いて、コード化され得る。１つの実施形態において、特定のアプタマー配列に相補的である、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを使用して、そのアプタマーを含むビーズの正確な位置を決定し得る。

１つの実施形態において、アレイを使用して、サンプル中の２つ以上の分析物の存在を検出する。検出されるための各分析物に特異的であるアプタマー結合ビーズが、調製される。次いで、異なる型のアプタマー結合ビーズが、別々の容器中の溶液中に配置され、その結果、各容器は、１つの特定の分析物に特異的であるアプタマーを備えるビーズのみを、含む。１つの実施形態において、アプタマー結合ビーズは、マイクロタイタープレートのウェル中の溶液中に配置される。特定の型のアプタマー結合ビーズを含むウェルの位置が、注記される。次いで、目的の特定のサンプルが、特定の型のアプタマー結合ビーズを含むウェルの各々の間に分けられる。各ウェル中の蛍光異方性が、サンプルの添加前および添加後に測定される。次いで、サンプル中に存在する分析物の同定が、特定の型のアプタマー結合ビーズの注記した位置と、ポジティブな結果（すなわち、蛍光異方性における変化）を比較することによって、決定され得る。

別の実施形態において、アプタマー結合ビーズは、二次元アレイを形成するために基材に物理的に結合される。これらのビーズは、同型のアプタマーを備えるビーズがアドレス付け可能な位置に一緒に位置付けられるような方法で、結合され得る。異なる型のビーズは、物理的な障壁によって（例えば、マイクロタイタープレートの異なるウェル中での位置付けによって）、分けられ得る。あるいは、異なる型のビーズは、空間的に分けられ得る。各位置におけるビーズの分析物特異性が、注記されるかまたは決定される。サンプルがビーズと接触され、そしてアレイ中の各アドレス付け可能な位置について、蛍光異方性における任意の変化が、決定される。蛍光異方性の変化と関係した、アドレス付け可能な位置が同定され、そしてアレイ中のそれらの位置でのアプタマーについての分析物特異性に基づき、サンプル中の特定の分析物の存在が、決定される。

代替の実施形態において、サンブル中の、分析物の群からの１つ以上の分析物の存在が、存在する分析物の特定の同一性についての決定なしに、決定され得る。この場合、アレイ中のビーズの型を区別することは、必要ではない。しかし、アレイ中に一緒になった同型ビーズの位置は、増大したシグナルを生成し得、従って、より少量の目的の分析物の検出を容易にし得る。

（非ビーズアレイ）
非ビーズアレイにおいて、アプタマーは、１つ以上の分析物の検出における使用のため、基材上に直接的に配置される。非ビーズアレイは、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号、同第５，４０５，７８３号、同第５，７４４，３０５号、同第６，３６５，４１８号に記載される。これらのアプタマーは、当該分野で周知の方法を使用して、リンカーを介して基材に結合され得る。あるいは、アプタマーは、基材上に直接的に合成され得る。

代表的なアレイにおいて、基材は、アプタマーについての１つ以上のアドレス付け可能な位置を備える。これらのアドレス付け可能な位置は、互いに直接的に隣接し得るか、またはギャップもしくは障壁によって物理的に分けられ得る。１つの実施形態において、アドレス付け可能な位置は十分に分けられ、蛍光異方性の検出のための、１つのアドレス付け可能な位置の照射が、隣接する位置のいずれの部分も照射しない。従って、照射の面積がアドレス付け可能な位置のアプタマーよりも小さい場合、アドレス付け可能な位置は、それらの間に空間なしに、直接的に隣接し得る。換言すると、アドレス付け可能な位置のサイズが照射の最小面積より小さい場合、これらの位置の間の距離は、照射の重なりを防ぐように十分に大きい。

代表的に、各アドレス付け可能な位置は、１つの型のアプタマーを備える。しかし、１つの実施形態において、少なくとも１つのアドレス付け可能な位置な、１つより多くの型のアプタマーを備える。この配置は、例えば、多くの分析物のうちの１つの存在が決定されるべきであり、そして特定の分析物の同一性が関心にされない場合に、有用である。あるいは、複合の分析物検出が、同じ位置に結合されたアプタマーの組（各々が異なる発蛍光団を有する）を使用して、達成され得る。発蛍光団の各々は、異なるスペクトル特性を有し、複数の分析物の結合が区別されることを可能にする。

他の実施形態において、各アドレス付け可能な位置は、１つの型のアプタマーを備える。この場合において、アプタマーのアレイ上の位置の数は、使用される異なる型のアプタマーの数と、少なくとも同じくらい大きく、従って、検出される分析物の数と少なくとも同じくらい大きい。例えば、サンプル中に１０個の分析物の存在が検出されるべき場合、アプタマーの少なくとも１０個のアドレス付け可能な位置が、基材上に存在する。アドレス付け可能な位置の数は、いかようにも限定されず、そして例えば、検出される分析物の数およびアレイが形成される基材の物理的サイズによって、決定される。１つの実施形態において、各アドレス付け可能な位置は、少なくとも約１０^６個のアプマターを備える。

代表的に、アプタマーの組成および各アドレス付け可能な位置の物理的位置が、既知である。１つの実施形態において、アレイ中のアドレス付け可能な位置の各々は、異なる型のアプタマーを備える。例えば、１０個の分析物が分析されるべき場合、アレイは、１０個のアドレス付け可能な位置を備え、各々は異なる型のアプタマーを備える。代替の実施形態において、特定の型のアプタマーを備える、１つより多くのアドレス付け可能な位置が、存在する。

アレイにおいて、アドレス付け可能な位置のアプタマーは、任意の幾何学の形状であり得る。例えば、アドレス付け可能な位置は、円形、長方形、四角形または不規則な形であり得る。代表的に、アドレス付け可能な位置の形状は、基材へのアプタマーの結合および蛍光異方性の決定を容易にするように、選択される。

アレイの全体的なサイズは、限定されず、そして種々の要因（各アドレス付け可能な位置におけるアプタマーの数、アドレス付け可能な位置の数、および蛍光異方性の変化を検出するために使用されるシステムより起因する基材のサイズについての物理的制限を含む）に基づき、決定される。１つの実施形態において、アレイのアドレス付け可能な位置は、約１００ｃｍ^２未満の面積を有する基材上に、全て存在する。別の実施形態において、アレイの別個の領域は、約１０ｃｍ^２未満の面積を有する基材上に全て存在する。

サンプル中の１つ以上の分析物の存在を検出するため、サンプルが、アプタマーのアレイと接触される。アドレス付け可能な位置のアプタマーの各々は、サンプルを接触する前およびその後に、偏光された光で個々に照射され、そして蛍光異方性における任意の変化が決定される。任意の特定のアドレス付け可能な位置のアプタマーについて、蛍光異方性における変化が測定される場合、特定の型のアプタマーが相互作用する化合物が、サンプル中に存在するように同定される。

（例示的な適用）
１つ以上の特定の分析物の存在についてのサンプルの分析は、医療的診断、基礎生物学的研究診断、薬学的診断、農学的診断、環境学的診断および産業的診断からプロテオミクスまでの、広範な分野における使用を見出す。

別の実施形態において、本発明のアレイは、診断適用、および診断デバイスにおける使用のために有用であり得る。１つの実施形態において、アレイを使用して、特定のタンパク質の発現レベルと、疾患または疾患の特定のステージとの間の相関関係を確立する。さらなる実施形態において、一旦タンパク質の発現レベルと、特定の疾患または疾患の特定のステージとの間のこのような相関関係がなされたか、または既知であると、本発明のアレイを使用して、生物の組織における特定の疾患または疾患のステージを診断し得る。従って、１つの実施形態において、本発明は、患者における疾患または障害を診断する方法を提供する。患者が羅患していると考えられる疾患または障害と関連することが知られている１つ以上の分析物が、選択される。例えば、患者が腫瘍に羅患していると疑われる場合、本発明の方法を使用して、腫瘍細胞において発現されるが正常細胞においては発現されないことが知られている１つ以上のタンパク質の存在を、同定し得る。同様に、患者が感染性因子に曝露されたと疑われる場合、その感染性因子と関連することが知られているタンパク質が、同定のために選択される。例えば、ＨＩＶで感染されることが疑われる患者からのサンプルが、ＨＩＶと関連することが知られているタンパク質（例えば、ＧＰ１２０ＭＮ）の存在について、分析され得る。

選択された分析物を特異的に認識するアプタマーが、同定され、そして合成される。これらのアプタマーは、蛍光標識され、そして１つより多くの分析物の同定を可能にするアレイの様式で、固体支持体に結合される。各々の型のアプタマーについての蛍光異方性が、上記のように測定され、そして次いで、これらのアプタマーは患者からの適切なサンプルと接触される。サンプルとの接触後の、特定の型のアプタマーについての蛍光異方性における変化は、この型のアプタマーが特異的である特定の分析物の存在の表示としてとられる。

同様に、本発明のアレイを使用して、処置レジメンの有効性を評価し得る。例えば、疾患または障害と関連することが公知である１つ以上の分析物の存在が、処置前および処置後の患者からの生物学的サンプルについて、分析され得る。このことは、特定の処置選択肢の有効性を決定するのを助け得る。

別の実施形態において、本発明は、２つ以上の細胞または２つ以上の集団の細胞において、特定のタンパク質の発現を比較する方法を提供する。方法は、生物からの細胞または細胞集団のサンプル（例えば、発現産物またはそのフラグメント）中の複数の異なるタンパク質について、並行してアッセイする工程を包含する。これらの方法は、目的のタンパク質を特異的に結合するアプタマーを備える、本発明のアプタマーアレイに対して特異的なタンパク質の存在について分析するために、サンプルをインキュベートする工程を包含する。サンプル中の目的のタンパク質の存在および／または量が、検出される。このような方法は、必要に応じて、アレイ中の少なくとも１つの型のアプタマーに結合されたタンパク質をさらに特徴付ける、さらなる工程を包含する。さらに、タンパク質以外の分析物（例えば、代謝産物）の存在が、検出され得る。

本方法は、コントロールの細胞または集団のタンパク質発現パターンに対する、細胞または細胞集団（必要に応じて、異なる条件に供される）のタンパク質発現パターンの比較を含み得る。例えば、新生細胞のタンパク質発現パターンが、コントロールの細胞または集団のタンパク質発現パターンに対して比較され得る。さらなる例において、異なる条件として、１つの細胞または集団を病原体に感染させる工程、１つの細胞または集団をストレス因子（ｓｔｒｅｓｓｏｒ）に曝す工程、あるいは１つの細胞または集団を薬物（例えば、潜在的な治療剤）に曝す工程が、挙げられる得る。このような比較のために、第一の細胞または細胞集団の発現産物（またはそのフラグメント）を含むサンプルが、タンパク質の結合に適した条件下でアプタマーのアレイとインキュベートされる。同様の様式で、第二の細胞または細胞集団の発現産物（またはそのフラグメント）を含むサンプルが、第一のアプタマーアレイと同一である第二のアプタマーアレイとインキュベートされる。第一のアプタマーアレイの、蛍光標識されたアプタマーへの結合の際の、蛍光異方性における変化によって同定されるタンパク質の型が、対応する第二のアプタマーアレイによって同定されるタンパク質の型に対して比較され得る。

２つの細胞または２つの細胞集団の間のタンパク質発現を比較する方法は、新規の強力な薬物標的の同定および確立において、ならびに薬物スクリーニングのために、有用であり得る。特に、本方法を使用して、疾患（例えば、腫瘍細胞）において過剰発現されるが、正常細胞においては過剰発現されないタンパク質を、同定し得る。このようなタンパク質は、例えば、このように差示的に発現されるタンパク質に標的化されるインヒビターを用いた、薬物介入のための標的であり得る。

本発明のアプタマーアッセイをさらに使用して、特定の薬物の有効性および特異性を評価し得る。例えば、特定の薬物に曝された細胞または細胞集団における特定のタンパク質の発現パターンが、その薬物に曝されていないコントロールの細胞または細胞集団の発現パターンに対して、比較され得る。

別の実施形態において、アレイを使用して、特定のタンパク質の発現と、疾患または疾患の特定のステージとの間の相関関係を、確立し得る。

当業者は、開示された方法を、特定の使用に容易に適応させ得るであろう。

（実施例）
以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいかようにも限定することを意図されない。

本明細書中に掲載した全ての特許および文献の参照は、その全体が本明細書により参考として援用される。

（Ａ．アプタマー結合ビーズへのタンパク質の結合を検査するための方法）
色素標識されたアプタマーの偏光異方性は、特定のタンパク質の結合の際に経時的に変化する。特定のタンパク質の結合の際に固体支持体に結合された３個のアプタマーの蛍光異方性における変化を、測定した。

これらの実験において使用した、３個の発蛍光団標識されたアプタマーは、以下であった：抗トロンビンアプタマー（ＦＡＭ標識化、１５マー）（これは、ヒト血漿からのトロンビンに特異的である）、５１８−アプタマー（ＦＡＭ標識化、６０マー）（これは、ＨＩＶ−１のＧＰ１２０ＭＮに特異的である）、および６５０−アプタマー（ＦＡＭ標識化、６０マー）（これは、組換えヒトＦＧＦ塩基性タンパク質に特異的である）。

（１．トロンビンに対する抗トロンビンアプタマー）
ＦＡＭ標識化抗トロンビンアプタマーへのトロンビンの結合を、測定した。５ミクロンのシリカ粒子を、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＨ，ＵＳＡ）より購入し、そして１Ｎ ＮａＣｌ溶液で１００℃で１時間、前処理した。次いで、このシリカ粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で３０分間処理し、２００プルーフエタノール中で１０ｍＭに希釈した。反応後、粒子をエタノールで３回洗浄し、そしてＶａｃｕｆｕｇｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で一晩６０℃で乾燥させた。乾燥したシラン化粒子を、ビス（チオプロピルＮ−ヒドロキシスクシンイミジル）（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）の１０ｍＭ溶液を用いて、ＤＭＦ中で４０℃で３０分間処理し、その後ＤＭＦおよびエタノールで即座に洗浄した。５’にＣ６−アミノリンカーおよび３’にＦＡＭを有する、１５マーの抗トロンビンアプタマーを、ＡＢＩ３０４合成機を使用して合成し、そしてＨＰＬＣ精製に供した。シランおよびＮＨＳを有する１０ｍｇの反応性シリカビーズを、１００□ｍのアプタマーと、４℃で１２時間インキュベートした。サンプルを洗浄し、そして真空中で乾燥させた。

偏光実験のため、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｇ／ｍｌ（約１×１０^５粒子）のＦＡＭ標識化抗トロンビンアプタマー結合ビーズ溶液を、１６０μＬの水晶キュベット中に周囲の条件で置いた。このキュベットを、偏光モードに設定したＳＰＥＸ Ｆｌｕｒｏｌｏｇ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＮＪ，ＵＳＡ）中に置いた。これらのサンプルを、実験の間、小さな磁気撹拌子を使用して、十分に混合した。異なる濃度のトロンビン分析物を、このアプタマー結合ビーズ溶液に添加した。得られた偏光または異方性を、実験の間の時間に対してプロットした。

（２．ＧＰ１２０ＭＮタンパク質に対する５１８−アプタマー）
ＧＰ１２０ＭＮタンパク質と、ビーズに結合された５１８アプタマーとの間の結合を、試験した。５’末端にＣ６−アミノリンカーおよび３’末端にＦＡＭを有する５１８アプタマーを、ＡＢＩ３９４合成機を使用して合成した。引き続き、標識されたアプタマーをＨＰＬＣ精製した。上記のように調製された反応性シリカビーズを、１００□Ｍの標識化５１８−アプタマーで、４０℃で１２時間処理した。サンプルを洗浄し、そして真空中で乾燥させた。

ＦＡＭ標識化５１８アプタマー結合ビーズおよびＧＰ１２０ＭＮタンパク質を使用した偏光実験を、上記のように実施した。

（３．組換えヒトＦＧＦ塩基性タンパク質に対する６５０−アプタマー）
組換えヒトＦＧＦ塩基性タンパク質と、ビーズに結合された６５０アプタマーとの間の結合を、試験した。５’にＣ６−アミノリンカーおよび３’にＦＡＭを有する６５０アプタマーを、ＡＢＩ３９４合成機を使用して合成し、引き続き、ＨＰＬＣ精製した。上記のように調製された反応性シリカビーズを、１００□Ｍの標識化６５０−アプタマーで、４０℃で１２時間処理した。サンプルを洗浄し、そして真空中で乾燥させた。

ＦＡＭ標識化６５０アプタマー結合ビーズおよび組換えヒトＦＧＦ塩基性タンパク質を使用した偏光実験を、上記のように実施した。

（Ｂ．アプタマー結合ビーズへのタンパク質の結合の結果）
上記のように、５□ｍにサイズ分けされた粒子に結合したアプタマーへのタンパク質の結合を、蛍光異方性によって検査した。３’−ＦＡＭ標識されそしてシリカビーズに結合された、５’−アミノ化抗トロンビンアプタマーを使用して、蛍光異方性を分析した。トロンビンアプタマー結合粒子を、トロンビンタンパク質に曝し、そして蛍光異方性における変化を測定した。１００ｎＭのトロンビンの添加の際に、異方性における増加（図１）を観察した。この変化は、溶液中のトロンビンアプタマーへのトロンビンの結合の際に観察された変化と同様であった。リゾチーム（全てのアプタマーに非特異的に結合するカチオン性タンパク質）への非特異的結合もまた、このアッセイにおいて観察された（図１）。

アプタマー５１８（６０マー）は、Ｇ１２０ＭＮ（ＨＩＶ−１）タンパク質に特異的である。１００ｎＭのＧＰ１２０の添加の際、蛍光異方性における大きな増加を観察した（図２）。この増加は、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡまたは１００ｎＭのトロンビンの添加の際の非特異的結合より生じた蛍光異方性における小さな増加よりも有意に大きく、且つこの小さな増加から容易に区別された。ＦＡＭ−５１８アプタマー結合ビーズへのリゾチームの非特異的結合もまた、観察された（図３）。ＦＡＭ−５１８アプタマーへのリゾチームの結合は、０．５％のＳＤＳの添加の際に、可逆性であった（図４）。

図１は、ビーズに結合された、ＦＡＭ標識された抗トロンビンアプタマーへの、トロンビンおよびリゾチームの結合の動力学的データを示す。 図２は、ビーズに結合された、ＦＡＭ−５１８アプタマーへのＧＰ−１２０の結合の動力学的データを示す。 図３は、ビーズに結合された、ＦＡＭ−５１８アプタマーへのリゾチームの結合の動力学的データを示す。 図４は、ビーズに結合された、ＦＡＭ−５１８アプタマーへのリゾチームの可逆的結合の動力学的データを示す。

Claims (21)

1. サンプル中の分析物を検出するための方法であって、以下の工程：
   （ａ）固体支持体に結合された、発蛍光団標識されたアプタマーを、該サンプルと接触させる工程；
   （ｂ）偏光で該アプタマーを照射する工程
   （ｃ）該発蛍光団の蛍光異方性を測定する工程；および
   （ｄ）該蛍光異方性の測定値が、該サンプルの非存在において、得られた異方性の測定値より大きい場合に、該分析物の存在または量を同定する工程
   を包含する、方法。
2. 前記固体支持体がビーズである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ビーズがシリカビーズである、請求項２に記載の方法。
4. 前記ビーズが約１μｍと約１０μｍとの間の直径を有する、請求項２に記載の方法。
5. 前記ビーズが約５μｍの直径である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ビーズが溶液中に懸濁される、請求項２に記載の方法。
7. 前記ビーズが二次元アレイ中に配置される、請求項２に記載の方法。
8. 前記アプタマーが約１０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記アプタマーが、フルオレセイン誘導体、エオシン誘導体、クマリン誘導体およびローダミン誘導体からなる群より選択される発蛍光団で標識される、請求項１に記載の方法。
10. 前記アプタマーがカルボシキフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識される、請求項９に記載の方法。
11. 前記アプタマーがアプタマーのアレイの一部である、請求項１に記載の方法。
12. 前記アレイが２つ以上のアドレス付け可能な位置を備える、請求項１１に記載の方法。
13. 各々のアドレス付け可能な位置が１つの型のアプタマーを備える、請求項１２に記載の方法。
14. 各々のアドレス付け可能な位置が複数の型のアプタマーを備える、請求項１２に記載の方法。
15. 各々の型のアプタマーが独特のスペクトル特性を有する発蛍光団で標識される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記偏光がレーザー光である、請求項１に記載の方法。
17. 前記分析物が疾患または障害と関連する、請求項１に記載の方法。
18. 前記サンプルが、疾患または障害に羅患していると疑われる患者から取得される、請求項１に記載の方法。
19. 前記分析物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
20. 前記分析物が代謝産物である、請求項１に記載の方法。
21. 前記サンプルがヒトの患者由来であり、そして前記分析物が疾患または障害と関連する、請求項１に記載の方法。

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