JP2005525128A - Ｐ５３結合ｔ細胞受容体分子とその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｐ５３蛋白質、好ましくはヒトｐ５３蛋白質由来のペプチドに結合する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子を提供する。該ＴＣＲ分子は、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１とのかかわりあいで提示されるｐ５３蛋白質の好ましくは約２６４から２７２位にわたるアミノ酸配列に特異的に結合する、ヘテロダイマー分子及び一本鎖分子を含むものである。またそのようなＴＣＲ分子の製造及び使用方法も開示されている。本発明は治療的な使用及びｐ５３蛋白質を発現する細胞の検出における使用を含む、広範な有用な適用を有している。

Description

（関連出願）
本出願は２００１年２月１日出願の米国特許出願第０９／７７４６８１号に３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２０に基づく優先権を主張し、該出願は１９９７年３月５日出願の米国特許出願第０８／８１２３９３号に優先権を主張するものであり、該出願は１９９６年３月５日出願の米国仮出願第６０／０１２８４５号に優先権を主張するものである。本出願はまた２００１年６月５日に出願された米国仮出願第６０／２９６３２４号に３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。これらの出願の全内容は引用することにより取り込まれる。

（政府資金）
本発明は国立衛生研究所による契約番号ＣＡ２５８０３に基づく政府資金で行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。

（技術分野）
本発明は、特にＰ５３蛋白質配列に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子に関するもの、及び、当該そのような分子の製造及び使用方法に関するものである。本発明のＴＣＲ分子は、治療及び診断目的を含む様々な適用において有用である。

（背景技術）
ガンのような疾病の治療への伝統的なアプローチには、手術、放射線治療、化学療法、抗生物質、あるいは治療の組み合わせが包含される。しかしながらそのような療法は、これらの兆候の多くに対して効果的であることは証明されていない。このようなヒトの疾病の予防及び／又は治療のための代わりとなる治療の開発が必須である。近年、抗体やＴリンパ球を用いる免疫療法及び遺伝子治療のアプローチが、ヒトの疾病を治療するための新しく有望な方法として浮上している。

一つのそのような治療のアプローチは、特定の対象を治療あるいは診断用試薬の標的とするための抗体の使用を含む。多くのグループが標的化試薬として抗体を使用することを展開する開発を行っている。そのような開発には、抗体融合蛋白質や、抗体を、放射性分子、化学療法試薬、毒、付加的な生物活性蛋白質を含む様々なエフェクター分子と結合させた抗体結合分子の構築が包含される。そのような分子を使用して開発された治療法や診断法は、抗体結合分子により標的化されるという特定の効果を生じるように設計されている。

抗体が治療法において開発されてきたのとちょうど同じように、免疫システムの付加的な第１エフェクターであるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、治療法の開発のための土台として特有の利点を有している。抗体が血中及び細胞外領域における病原体、あるいは細胞表面の標的蛋白質を認識することに限定されるのに対して、Ｔ細胞受容体は細胞表面上のＭＨＣ分子とともに提示される抗原（細胞内蛋白質由来の抗原を含む）を認識できる。提示された抗原を認識して活性化されるＴ細胞のサブタイプに依存して、Ｔ細胞受容体とＴ細胞受容体を宿すＴ細胞は、様々な免疫応答のコントロールに参加することができる。たとえばＴ細胞は、B細胞の抗体産生細胞への分化を誘導することを通じて、体液性免疫応答の制御にかかわっている。加えて、活性化されたＴ細胞は細胞介在性免疫応答を誘発するように作用する。このように、Ｔ細胞受容体は抗体には利用できないさらなる標的を認識することができる。

Ｔ細胞応答は抗原がＴ細胞受容体分子に結合することにより調節される。ＴＣＲの一つのタイプは免疫グロブリンの可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域に類似するα鎖とβ鎖からなる膜結合性ヘテロダイマーである。ＴＣＲのα鎖は共有結合したＶαとＣα鎖を含む一方で、β鎖はＣβ鎖に共有結合したＶβ鎖を含んでいる。ＶαとＶβ鎖はＭＨＣ（ヒトにおいてHLA複合体として知られている）とのかかわりあいでスーパー抗原あるいは抗原に結合できるポケットや割れ目を形成する。一般的にDavis, Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985)、及び Fundamental Immunology 3^ｒｄ Ed., W. Paul編、Raven Press LTD. New York (1993)参照のこと。

ＴＣＲは免疫システムの発達と機能において重要な役割を果たすと信じられている。たとえば、ＴＣＲは細胞死を仲介し、B細胞増殖を増加させ、ガン、アレルギー、ウイルス感染、自己免疫疾患を含む様々な疾患の発達と重症度に影響を与えることが報告されている。

ヒトｐ５３は腫瘍抑制蛋白質であることが報告されており、ｐ５３由来のペプチドエピトープは特有のクラスＩＭＨＣ分子により提示される。ｐ５３はさらに広範な腫瘍関連細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）標的の候補であることが報告されている。たとえばTheobald M.ら、 (1995) PNAS (USA) 92: 11993及びそこで引用される参考文献を参照のこと。

ヒトｐ５３蛋白質の異常体が様々なガンと関連しているという認識がある。異常あるいは変異型は、普通（野生型）ｐ５３蛋白質の防御性特質を覆すと信じられている。たとえば Lavine A. J.ら、(1991) Nature (London) 351: 453参照のこと。

ヒトｐ５３蛋白質に由来するペプチドを認識して特異的に結合するヒトクラスＩ分子が開示されている。そのような分子の一つはＨＬＡ−Ａ２．１である。Theolakd M.ら、上述文献参照のこと。

ヒトｐ５３蛋白質由来のペプチドを認識して結合するＴＣＲ分子が好ましいだろう、ヒトｐ５３蛋白質の約２６４から２７２位にわたるアミノ酸配列に特有に結合するヘテロダイマー及び一本鎖（ｓｃ）ＴＣＲ分子が特に望まれるだろう。

（発明の要約）
我々はヒトｐ５３蛋白質由来のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子を同定した。一つの態様では、ＨＬＡ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１とのかかわりあいで提示されるヒトｐ５３蛋白質の好ましくは約２６４から２７２位のアミノ酸配列に特異的に結合するヘテロダイマーＴＣＲ分子を単離した。他の態様では、我々はその配列に特異的に結合する一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ−ＴＣＲ）分子を製造した。またそのようなＴＣＲ分子の製造及び使用方法も開示している。本発明は、治療的使用及びｐ５３蛋白質発現細胞の検出における使用を含む、広範にわたる有用な適用を含んでいる。

本発明のＴＣＲ分子は、好ましくはヒトｐ５３分子の約２６４から２７２位にわたる配列に結合する、主としてヘテロダイマーあるいは一本鎖分子である。特に好ましい配列は、ヒトｐ５３分子の２６４から２７２位にわたるＬｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）であらわされるエピトープである。他の適したｐ５３配列は以下に記載される。

特有のＴＣＲ分子は様々な有用な活性を特徴とする。たとえばここに開示されるヘテロダイマーＴＣＲ分子は、特に適切な抗原提示複合体とのかかわりあいで、ｐ５３蛋白質の細胞発現を検出するのに使用されることができる。そのような複合体の実例は、ｐ５３蛋白質の免疫的に関係のある断片に結合してＣＴＬに提示する霊長類のクラスＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣ）である。好ましいクラスＩＭＨＣ分子は、以下に開示されるヒトＨＬＡ−Ａ２．１複合体である。

本発明は、その状況が通常すでに目的となる使用に適したように決定されている様々なヘテロダイマーＴＣＲ分子をも包含する。たとえば一つの態様では、ヘテロダイマーＴＣＲ分子は、トランスフェクトされたもしくは遺伝子組換え細胞の細胞表面分子として発現される。細胞の例は以下に挙げられている。さらに適したヘテロダイマーＴＣＲ分子は、たとえば以下で議論される一つもしくはそれ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）配列を含むヘテロダイマー等の、より溶解した形態で提供される。

本発明のより特有のヘテロダイマーＴＣＲ分子の特徴はα鎖とβ鎖であり、その鎖は典型的には一つもしくはそれ以上の共有結合で結合されている。好ましくはそのような共有結合には、一つもしくはそれ以上のジスルフィド結合が含まれる。より好ましくはヘテロダイマーは、ヒトｐ５３分子の約２６４から２７２位にわたるアミノ酸配列、好ましくは２６４から２７２位にヘテロダイマーが結合する割れ目内あるいはその近傍において、好ましくは効果的な位置を設計する少なくとも一つのＶα鎖と少なくとも一つのＶβ鎖を含む。「効果的な位置」という用語は、本発明のＴＣＲＶ鎖（ヘテロダイマーあるいは一本鎖形態）が、好ましいＴ細胞結合性及び下記のＥＬＩＳＡテストを含むここに開示される標準的なアッセイにより決定された特異的ｐ５３配列に結合するのに関与していることを意図している。

ヘテロダイマーＴＣＲのより特徴的Ｖ鎖は、Ｃα鎖に共有結合したＶα鎖及びＣβ鎖に結合したＶβ鎖を含む。ほとんどの態様では、Ｃα鎖とＣβ鎖はそれぞれ適した細胞の膜貫通ドメインに独立して結合しており、そのドメインは適したサイトソルドメインに主としてさらに独立して結合している。可溶性のヘテロダイマー分子が好まれる場合には、少なくとも膜貫通ドメイン、好ましくはたとえば標準的な組換えＤＮＡ操作により本質的に全ての膜貫通ドメインを取り除くことがより好ましいだろう。

本発明はここに開示される一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃ−ＴＣＲ）分子を含む他の有用なＴＣＲ分子を特徴とする。そのような分子は、一般に少なくとも一つのペプチド配列により少なくとも一つのＶβ鎖に結合する少なくとも一つのＶα鎖を含む。所望によりｓｃ−ＴＣＲはさらに少なくとも一つのＣα鎖断片と、任意に少なくとも一つのＣβ鎖断片を含むことができる。より好ましい本発明の態様では、ｓｃ−ＴＣＲは少なくとも一つのペプチドリンカー配列により約一つのＶβ鎖に結合する約一つのＶα鎖を含むだろう。目的となる結合結果が達成されるかぎり、ｓｃ−ＴＣＲにおけるＶあるいはＣ配列の整列順は普通重要でない。しかしながら、標準的な結合試験で決定される約２６４から２７２位にわたるヒトｐ５３のアミノ酸配列に効果的に結合するのに十分なＶα及びＶβ鎖が、一般的に好まれる。

本発明は重要な利点を提供する。

たとえばこのヘテロダイマー及び一本鎖ＴＣＲは、初めて重要なｐ５３エピトープを認識して結合するＴＣＲ分子を提供するものである。本発明の分子によるその配列への結合は、ガンあるいは前ガン性細胞において、ｐ５３腫瘍抑制蛋白質の重要で信頼できる認識を提供する。このように一つの発明の態様では、本分子は、細胞、組織、あるいは器官におけるｐ５３の存在及び量を検出、所望により定量するために診断的に使用されることができる。そのような細胞には、初代、二代、不死化セルラインと同様に培養細胞が含まれる。ｐ５３蛋白質を検出するための能力は、インビトロ及びインビボでのガンの診断において非常に有用である。あるいは本発明のＴＣＲ分子は、細胞、特に適したＭＨＣクラスＩ分子、好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１複合体とのかかわりあいで、ｐ５３抗原を提示できる細胞において、ｐ５３の発現を検出及び任意に定量するために使用されることができる。

したがって一つの態様では、本発明はＶα鎖とＶβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロダイマーを特徴とする。好ましくはヘテロダイマーは、特に好ましくＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する配列の変異体を含む次の「標的」アミノ酸配列、Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）に結合できる。好ましい結合は無関係の（対照）ＴＣＲへの結合とは著しく異なる結合の増加として、（ここで「著しく」とは、当該分野で知られている慣用の統計手法、たとえばｐ≦０．０５を用いて決定される）結合特異性が示される標準的なＴＣＲ結合アッセイにより決定される。好ましくは、結合能は、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、あるいは少なくとも約１００倍対照値よりも高い。特に好ましいＴＣＲ結合アッセイと無関係のＴＣＲヘテロダイマーが以下に記載される。

より特別の態様において、本発明はα鎖が、ａ）Ｖα鎖とｂ）Ｃα鎖が順に共有結合したものを含み、β鎖がｃ）Ｖβ鎖とＣβ配列が順に共有結合したものを含むものであるα鎖とβ鎖を含む単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロダイマーを特徴とする。好ましくはヘテロダイマーは、ＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、配列番号１の上述のアミノ酸配列と同様に、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する標的配列の変異体に結合できるものである。

以上検討したように、本発明はまた配列番号１の標的配列に特異的に結合できるＶ鎖を含むｓｃ−ＴＣＲ分子を特徴とする。

一つの態様では、そのようなｓｃ−ＴＣＲは少なくとも一つのペプチドリンカーで、少なくとも一つのＶβ鎖に共有結合した少なくとも一つのＶα鎖を含む。好ましくはそのようなｓｃ−ＴＣＲ、は約１から５のそのようなＶ鎖、より好ましくは約１または２のそのようなＶ鎖を含む。また好ましくはそのようなＶ鎖は、約１乃至５のペプチドリンカー、より好ましくは約１から２のそのようなリンカーで結合されるだろう。より好ましいｓｃ−ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、少なくとも一つ以上の保存的アミノ酸置換を有する変異体を含む次の標的アミノ酸配列、Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）に結合できる。

好ましい結合は無関係の（対照）ＴＣＲへの結合とは著しく異なる結合の増加として表される（ここで「著しく」とは、当該分野で知られている慣用の統計手法、たとえばｐ≦０．０５を用いて決定される）。好ましくは、結合能は、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、あるいは少なくとも約１００倍対照値よりも高い。特に好ましいｓｃ−ＴＣＲ結合アッセイと無関係のｓｃ−ＴＣＲが以下に記載される。

他の態様では、本発明はここに提供される一つもしくはそれ以上のヘテロダイマーをコードする核酸セグメント（典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも対を特徴とする。

他の態様では、本発明はＴＣＲヘテロダイマーをコードするＤＮＡセグメントの少なくとも一つを含むＤＮＡベクターを包含する。たとえば最初のＤＮＡセグメントはα鎖をコードでき、二番目のＤＮＡセグメントはβ鎖をコードできる。ある場合においては、ヘテロダイマーのα鎖とβ鎖の両方をコードするセグメントを有する単一のＤＮＡベクターを提供することがより好ましいだろう。

またここで開示されるＤＮＡベクターを含む細胞も想起される。

本発明はまた、少なくとも一つ、好ましくは約１から５、より好ましくは約１から２のここで提供されるｓｃ−ＴＣＲ分子をコードする核酸セグメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を特徴とする。またその核酸セグメントを含むＤＮＡベクターが含まれる。

他の態様では、本発明はＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、ｐ５３蛋白質を発現する細胞や組織を同定するための方法を特徴とする。一つの態様では、そのような方法にはここで開示されるｓｃ−ＴＣＲまたはＴＣＲヘテロダイマーを含む形質導入されたもしくは遺伝子組換え細胞と、細胞または組織を接触させることを含む。もしくは細胞あるいは組織は、ｓｃ−ＴＣＲやＴＣＲヘテロダイマーを発現する形質導入されたまたは遺伝子組換え細胞の代わりに（あるいはそれとともに）、可溶性のｓｃ−ＴＣＲやＴＣＲヘテロダイマーと接触させられることができる。

本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２．１分子とのかかわりあいで、ｐ５３蛋白質を発現する細胞または組織を同定するための方法を特徴とする。本発明の好ましい例では、その方法は細胞または組織を、ここで提供されるｓｃ−ＴＣＲと接触させることを含む。

また本発明は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する配列の変異体を含む、以下の標的アミノ酸配列、Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）を発現する細胞を殺すための方法を包含する。より特有の方法は、細胞をここで提供されるｓｃ−ＴＣＲやヘテロダイマーＴＣＲ分子を発現する形質導入されたもしくは遺伝子組換え細胞と接触させる方法を含む。加えて好ましい方法はさらに慣用的なアッセイ（例、トリパンブルー除去、アポトーシスの特徴の存在等）で決定される、細胞を傷つけるもしくは殺すのに一般的に十分な量のｓｃ−ＴＣＲまたはヘテロダイマーＴＣＲと、細胞を接触させることを含む。

他の態様では、本発明は、ａ）ここで提供されるＴＣＲヘテロダイマーを含む形質導入されたまたは遺伝子組換え細胞、ｂ）本発明のｓｃ−ＴＣＲの少なくとも一つ、好ましくはそのようなｓｃ−ＴＣＲの一つの、少なくとも治療に有効な量を哺乳動物に投与することを含む、ガンの治療方法を特徴とする。好ましくは、ガンは以下に記載される標準的なイムノヒストケミストリーまたはフローサイトメトリーで決定される、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも５から１０倍、好ましくは約１００倍のｐ５３蛋白質の活性化で特徴付けられる。

本発明の他の態様は、以下に議論される。

（発明の詳細な説明）
先に要約されたように、我々はＶα鎖とＶβ鎖、すなわち二本鎖複合体を一般的に含む非常に有用なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ヘテロダイマーを単離した。より好ましいヘテロダイマーは、典型的にはＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、ヒトｐ５３蛋白質配列の約２６４から２７２位間のアミノ酸配列、好ましくはｐ５３蛋白質の２６４から２７２位のアミノ酸、つまり以下の標的アミノ酸配列、Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）に結合する。またすでに要約されたように、良好な結合は標準的な以下に記載のＴ細胞結合アッセイで決定される。

多くの天然に生じるＴＣＲヘテロダイマーの、一般的な構造が報告されている。たとえば、Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985)、Fundamental Immunology 3^ｒｄ Ed., W. Paul編、Raven Press LTD. New York (1993)、及びそれらに開示されている参考文献を参照のこと。

一般的にＴ細胞は、その細胞表面に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により、細胞表面に提示される抗原を認識する。ＴＣＲはほとんどα及びβ鎖グリコプロテインからなる、ジスルフィド結合されたヘテロダイマーである。Ｔ細胞は、Ｂ細胞で機能する抗体の多様性を産生する機構と類似した機構を、受容体分子の多様性を産生するために使用する（Janeway及びTravers; Immunobiology 1997）。免疫グロブリン遺伝子と同様に、ＴＣＲ遺伝子はＴ細胞の発達段階において再整列するセグメントからなる。ＴＣＲポリペプチドは、Ｎ可変末端及びＣ末端定常領域からなる。Ｃ末端領域は、膜貫通アンカーとして機能して、受容体が占拠された際に細胞内シグナリングに関与する一方、可変領域は抗原の認識を担っている。ＴＣＲα鎖はＶ及びＤセグメントのみでコードされる可変領域を含む一方、β鎖はさらにＪセグメントを含む。ＴＣＲの多様なレパートリーにおけるこれらのセグメントの再整列は、異なるＭＨＣ分子とのかかわりあいで提示される、非常に多くの異なる抗原の認識を可能にする。

特有の抗原を認識する特別なＴＣＲが報告されている。たとえば、係属中の米国特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８１３７８１号及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／４２２３７５号は参照としてここに挿入され、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４号及びＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６４５号とそこに記載される参考文献は、特異的なＴＣＲの製造及び使用方法を開示している。さらに、特有の特別なＴＣＲは、組換え技術を用いて可溶性一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ−ＴＣＲ）として製造される。ｓｃ−ＴＣＲの製造及び使用方法は、ここに参考文献として挿入される係属中の特許出願０８／９４３０８６号及び国際公開ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３号に開示されている。

本発明の好適なＴＣＲヘテロダイマーは、少なくとも一つのジスルフィド結合で共有結合されたα鎖及びβ鎖を含む。たとえば水素結合等、鎖間の非共有結合が報告されている。個々の鎖は約１５０−３５０アミノ酸長、好ましくは約２００−３００アミノ酸長、より好ましくは約２５０−２９０アミノ酸長であり、約２８０アミノ酸長がほとんどの発明の適用において有用である。本発明のヘテロダイマー分子は、グリコシル化されていてもよい。

「ＨＬＡ−Ａ２．１ ＭＨＣ分子」という用語は、霊長類クラスＩＭＨＣ分子、好ましくはヒト由来の分子であり、産生（generate）でき、またはＡ２．１制限性の、ヒトｐ５３蛋白質から得られる配列を有するペプチドに特異的なＴＣＲを有する腫瘍反応性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されることが出来ることを意味する。好ましいアミノ酸配列は、通常ヒトｐ５３配列の約２５０−２９０アミノ酸、好ましくは約２６４−２７２であり、ほとんどの適用においてはｐ５３の２６４から２７２位のアミノ酸配列が好まれる。

本発明のより好ましいＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子は、三つの細胞外ドメイン（すなわちα１、α２及びα３）、膜貫通ドメイン、及び、細胞質ドメインを有するグリコプロテイン重鎖をしばしば含む、完全な膜蛋白質である。重鎖は典型的には、可溶性β２ミクログロブリンサブユニットと非共有結合で結合する。重鎖のα１及びα２ドメインは、特別なｐ５３配列へのペプチド結合の溝を形成するように、一緒に折りたたまれる。重鎖とβ２ミクログロブリン間のかかわりは、ペプチド結合の溝を安定化することを助けるだろう。ＭＨＣ分子は、天然に生じるあるいは組換えクラスＩ重鎖（あるいはその断片）及び天然に生じるあるいは組換えのβ２ミクログロブリン分子（あるいはその生物学的に活性な断片）のほとんどいかなる組み合わせからもなることができる。

ヒトｐ５３アミノ酸及び核酸配列に関する情報は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）−国立医学図書館、38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894の遺伝配列データバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から入手可能である。Ｇｅｎｂａｎｋはまたインターネットhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.からも入手可能である。Ｇｅｎｂａｎｋの定義に関してはBenson, D. A.ら、(1997) Nucl. Acids. Res. 25: 1を参照のこと。またTheobald, Mら、(1995)、上述の文献（本出願で採用されているｐ５３のアミノ酸の番号付けを開示している）を参照のこと。

腫瘍抑制蛋白質ｐ５３の発現は、悪性腫瘍細胞において活性化（アップレギュレート）されていることが報告されている。全腫瘍の５０％が表面に増加したレベルのｐ５３を発現することが示されている（Holliston, M.D.ら、Science (1991), 253: 49）。

特にｐ５３を発現する腫瘍細胞とのかかわりあいにおける、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子の製造及び使用に関する情報が、Theobald, Mら、(1995)、上述文献とそこに開示される参考文献により報告されている。また、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６１１及び、１９９６年３月５日付けのＵＳＳＮ６０／０１２８４５に利益を主張する出願である、１９９７年３月５日付けのＵＳＳＮ０８／８１２３９３参照のこと。ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６１１、ＵＳＳＮ０８／８１２３９３、及び、ＵＳＳＮ６０／０１２８４５出願の開示は、参考としてここに挿入される。

ＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子と、ｐ５３蛋白質から得られるアミノ酸配列の間に生じる結合を検出する方法が、たとえばTheobald, Mら、(1995)、上述の文献に報告されている。一般に当該方法は、ｐ５３ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１分子への結合を評価するための認知された競合アッセイの使用を含む。ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６１１、ＵＳＳＮ０８／８１２３９３、及び、ＵＳＳＮ６０／０１２８４５出願も参照のこと。

本発明のより特有なＴＣＲヘテロダイマーＴＣＲ分子は、少なくとも約９０％、好ましくは約９５％から約１００％の間で同一であり、図４Ａ−Ｃに示されるＶａ３鎖と同一のＶα鎖を含む。本発明のさらなるヘテロダイマーは、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に示されるＶｂ３鎖に少なくとも９０％、好ましくは約９５−約１００％同一のＶβ鎖を含む。

好ましくは二つのアミノ酸配列の同一性パーセンテージを決定するために、それらの配列は最適な比較を目的として整列される。（たとえば、最適なアラインメントのために第一及び第二アミノ酸の一つもしくは両方にギャップが導入され、非相同な配列は比較目的のために無視される。）「比較表示（comparison window）」とは、二つの配列が最適に整列されたあとに、同数の連続的な位置の参照配列とその配列が比較されるであろう、２５から６００、通常約５０から２００、さらに普通約１００から約１５０からなる集団から選択された連続的な位置のいかなるセグメントをも意図する。ここで開示されるように、適切な同一性パーセンテージで配列を同定するために、比較表示（comparison window）は上述したセグメントの範囲のいずれを含んでいてもよいだろう。

二つの配列間の同一性パーセンテージは、ギャップの数及び二つの配列の最適な整列のために導入されることが必要な個々のギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一な位置の数の関係で決まる。対応するアミノ酸の位置のアミノ酸残基がそれから比較される。最初の配列における位置が、二番目の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基で占められているときには、これらの分子はその位置で同一である。（ここで使用されるアミノ酸「同一性」とは、アミノ酸「相同性」と等価である。）

二つの配列間の同一性パーセンテージは、当該分野で知られるように数学的アルゴリズムを使用して決定されることができる（たとえばComputational Molecular Biology, Lesk, A. M.編、Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Project, Smith, D. W.編、Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編、Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press, 1987、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDavereux, J.編、M Stockton Press, New York, 1991）。たとえば二つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、（http://www.gcg.comで入手可能な）ＧＣＧソフトウエアパッケージのギャップ（ＧＡＰ）プログラムの部分であるNeedleman and Wunschアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48): 444-453, 1970）、Smith & Watermanのローカルホモロジーアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981）、Pearson & Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988）及びAltschulら(Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997)の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.から入手できるウィスコンシンジェネティクスソフトウエアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴ）のコンピュータによる実行、あるいは手動による整列及び視覚的な
調査（たとえばAusubelら、上述文献参照）により決定できる。

利用者の要望にあわせてギャップ（ＧＡＰ）パラメータは修飾されることができる。たとえばＧＣＧソフトウエアパッケージを使用するときには、NWSgapdna.CMPマトリックスと、４０，５０，６０，７０あるいは８０のギャップウエイトと、１，２，３，４，５または６の長さウエイトが使用できる。Blossom 62マトリックスあるいはPAM250マトリックスを使用する際の典型的なギャップウエイトは、１６，１４，１２，１０，８，６あるいは４であり、一方典型的な長さウエイトは１，２，３，４，５または６である。二つのアミノ酸間の同一性パーセンテージはまた、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を使用して、ALIGNプログラム（version 2.0）へ挿入されるE.Myers and W.Millerのアルゴリズム(CABIOS 4: 11-17, 1989)を使用して決定されることができるだろう。

このように、「１００％同一」という用語は、対象となるＶ鎖のアミノ酸が対応する天然に存在するＴＣＲＶβまたはＶα鎖、または同じ結合特性（たとえば結合特異性及び親和性において著しい違いがない）を有するアレル変異体と１００％相同であることを意味する。すなわち、対象となるＶ鎖は、対応する天然に存在する鎖あるいは同じ結合特性を有するアレル変異体と同じ長さで同じアミノ酸配列を有している。

本発明のさらに好ましいヘテロダイマー分子は、図５（配列番号３）及び図４Ａ−Ｃ（配列番号２）各々に示されるＣα及びＣβ鎖と少なくとも約９０％同一なＣα及びＣβ配列を含む。好ましくはＣα及びＣβ配列は、図５及び図４Ａ−Ｃに示されるＣα及びＣβ鎖と約９５から約１００％同一である。

ｓｃ−ＴＣＲ分子の一般的な構造とその製造及び使用方法は、係属中のＵＳＳＮ０８／８１３７８１及びＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４に開示されている。このＵＳＳＮ０８／８１３７８１及びＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４の開示は引用することによりここに取り込まれる。

また、ｓｃ−ＴＣＲ分子の製造及び使用に関するさらなる開示として、係属中のＵＳＳＮ０８／９４３０８６及びＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３を参照されたい。このＵＳＳＮ０８／９４３０８６及びＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３の開示は引用することによりここに取り込まれる。

上述したように、本発明は一般的に約１から約５のＶα鎖が、約１から５のＶβ鎖に、約１から５のペプチドリンカー配列により共有結合された、非常に有用な一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃ−ＴＣＲ）蛋白質を特徴とする。好ましいｓｃ−ＴＣＲは、ここで提供されるように約一つのペプチドリンカー配列により結合された、約一つのＶα鎖と約一つのＶβ鎖を含む。

さらに加えて好ましいｓｃ−ＴＣＲは、典型的にはＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、ヒトｐ５３蛋白質から得られた配列を有するペプチドに結合することができる。好ましいアミノ酸配列は通常ヒトｐ５３配列の約２５０乃至約２９０、好ましくは約２６４から約２７２であり、ほとんどの適用において好まれるのはｐ５３蛋白質の２６４位から２７２位にわたるアミノ酸配列である。良好な結合は好ましくは以下に記載される標準的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＥＬＩＳＡアッセイにより決定される。

本発明のより特別なｓｃ−ＴＣＲ分子は、以下の図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に示されるＶa３鎖と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％から約１００％同一のVα鎖を含む。さらに加えて好ましいｓｃ−ＴＣＲ分子は、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に示されるＶｂ３鎖と少なくとも約９０％、好ましくは約９５から約１００％同一のＶβ鎖を含む。

本発明のさらに加えて好ましいｓｃ−ＴＣＲ分子は、図４Ａ−Ｃに示されるＣβ鎖配列と少なくとも約９０％同一なＣβ配列を含む。好ましくはＣβ配列は図４Ａ−Ｃに示されるＣβ鎖と約９５から約１００％同一である。

標準的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＥＬＩＳＡアッセイで、Ｃα鎖は常に良好なｓｃ−ＴＣＲ結合を示すために必要なわけではないことが見出された。これらの態様において、ｓｃ−ＴＣＲ分子の部分としてＣα鎖を含むことは必要ではない。たとえば以下の図４Ａ−５Ｃ（特に好ましい２６４ｓｃ−ＴＣＲ配列を開示している）参照のこと。しかしながら、ｓｃ−ＴＣＲ分子は少なくとも一つのＣα鎖（たとえば図５に示されるような）あるいはその機能的断片、好ましくは約１から５の鎖、好適には約一つのＣα鎖を含んでもよい。

特有のｓｃ−ＴＣＲがＣα鎖またはその機能的な断片を含む発明の態様では、その鎖は好ましくは図５（配列番号３）に示されるＣα鎖配列に少なくとも約９０％同一であるだろう。好ましくはその配列は、図５（配列番号３）に示されるＣα鎖配列と約９５から約１００％同一である。

本発明においてより特有のｓｃ−ＴＣＲ分子は、１）図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に示されるＶα３鎖、２）ペプチドリンカー、３）図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に示されるＶβ３鎖を順に共有結合により含んでいる。一つの態様では、ｓｃ−ＴＣＲはさらに図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に提供されるようにＣβ鎖を含み、好ましくは該鎖はＶβ鎖のＣ末端に結合されている。

前述の特異的なｓｃ−ＴＣＲ分子の一つの態様では、ｓｃ−ＴＣＲはさらに図５（配列番号３）に提供されるようなＣα鎖を含み、該鎖は好ましくはＶα鎖のＣ末とペプチドリンカーのＮ末の間に共有結合されている。

ここに開示されるヘテロダイマー及び一本鎖ＴＣＲ分子の典型的なＶα及びＶβ鎖は、一般に約２００から４００長のアミノ酸、好ましくは約３００から３５０長のアミノ酸である。アミノ酸長の決定方法は、当該分野で知られているものであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動が含まれる。

議論したように、本発明の好ましいｓｃ−ＴＣＲ分子は、好ましくはＶαとＶβ鎖の間に位置した一つもしくはそれ以上のペプチドリンカー配列を含む。好ましくはリンカー配列は、約７から２０アミノ酸、より好ましくは約８から１６アミノ酸を含む。リンカー配列は好ましくは可とう性であり、単一の所望される構造でヒトｐ５３蛋白質由来の（ＨＬＡ−Ａ２．１分子とのかかわりあいで提示される）配列を保持するものではない。特にペプチドリンカー配列は、典型的にはこれらの鎖の結合柔軟性を増強させるためにＴＣＲ可変鎖間に配置されることができる。リンカーは主に、グリシン、アラニン、あるいはセリン残基のような小さい側鎖を有するアミノ酸を含み、可とう性を提供する。好ましくは約８０あるいは９０％もしくはそれ以上のリンカー配列が、グリシン、アラニン、あるいはセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。ヘテロダイマーＴＣＲでは、リンカー配列はまたＴＣＲ分子のα鎖へ結合させられることができるだろうが、ＴＣＲ分子のβ鎖に適切に結合される。もしくは、リンカー配列は、ＴＣＲ分子のα、β両鎖に結合されるだろう。

ｓｃ−ＴＣＲ分子の製造及び使用に関する補足的な開示として以下の参考文献を参照されたい。Novotony, J.ら、PNAS(USA) 88: 8646 (1991)、Soo Hoo, W.F.ら、PNAS(USA) 89: 4759 (1992)、Wulfing, C.及びPluckthun, A., J. Mol. Biol. 242: 655 (1994)、Kurucz, I. ら、PNAS(USA) 90: 3830 (1993)、PCT WO96/13593、Ward E.S.ら、J. Mol. Biol. 224: 885, (1992)、Schlueter, C. J.ら、J. Mol. Biol. 256: 859 (1996)、Mariuzza, R. A.及びWinter, G., (1989) 264: 7310、Gascoigne, N. R. J.ら、PNAS(USA) (1987), 84: 2936。

特有の本発明の態様では、適したリンカー配列はＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（すなわちＡｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）（配列番号４）が4回もしくはそれ以上繰り返された配列であり、好ましくはＴＣＲβドメインの最初のアミノ酸配列に結合されている。抗体の可変領域を首尾よく結合させるようにデザインされた多くの可とう性リンカーを含む、異なるリンカー配列が使用されることができるだろう。Whitlow, M.ら、(1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 2: 97-105参照のこと。適したリンカー配列は、実験に基づいて容易に同定されることができる。加えて、リンカー配列の適した大きさと配列もまた、ＴＣＲ分子の予測された大きさと形に基づく慣用的なコンピュータモデル技術で決定されることができる。

したがって、そして一つの態様において、本発明は、その少なくとも一つのペプチド配列、好ましくはその一つが以下の配列Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒを4回もしくはそれ以上繰り返す（配列番号５）ものである、特有のｓｃ−ＴＣＲ分子を特徴とする。

特有の２６４ＴＣＲ関連分子に関する追加情報については、Ｔ細胞受容体融合体、結合体、及びそれらの使用方法という題の、２００１年６月５日出願の同時係属出願（発明者がJon A. Weidanz, Kimberlyn F. Card及びHing C. Wongである、ＵＳＳＮ０９／８７４９０７）を参照のこと。その内容は引用することによりここに取り込まれる。

ある場面では、たとえばｓｃ−ＴＣＲの価数を増やすこと等、本発明のｓｃ−ＴＣＲ分子を多価にすることが有用であろう。端的に述べると、多価ＴＣＲ蛋白質は、たとえば標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識技術、またはラテックスビーズのような適した固体支持体に結合させることで、（同じもしくは異なる）２及び４蛋白質間を共有結合することにより製造される。（たとえばデシドリマーにクロスリンクされた）化学的にクロスリンクされた蛋白質もまた、多価種に適している。たとえば蛋白質は、ＣｙｓやＨｉｓのような化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を導入することで、修飾されることができる。化学的に反応性の側鎖を有するそのようなアミノ酸は、結合される蛋白質の様々な位置に、好ましくはＴＣＲの抗原結合領域末端に配置されるだろう。たとえば可溶性蛋白質のCβ鎖断片のC末端は、蛋白質精製タグまたはそのような反応性アミノ酸を含む他の蛋白質に共有結合させることができる。適した側鎖は、適したデンドリマー粒子に二つもしくはそれ以上の蛋白質を化学的に結合させマルチバレント分子を与えることを、含まれることができる。デンドリマーはその表面に多くの異なる機能性グループのいずれか一つを有することができる合成された化学ポリマーである（D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26: 91-101 (1993)）。本発明において使用するための模範的なデンドリマーは、たとえばＥ９スターバーストポリアミンデンドリマー及びＥ９コンバストポリアミンデンドリマーという、システイン残基に結合できるデンドリマーを含むものである。

ここに提供されるヒトｐ５３配列の本発明のＴＣＲ分子への提示の成功は、以下に記載されるＴ細胞結合アッセイやＴＣＲ ＥＬＩＳＡを含む様々な特有のアッセイにより決定されることができる。もしくは、提示の成功は、もし望まれればＴ細胞増殖の誘導もしくは阻害、あるいは特定の部位または標的への免疫応答の誘導もしくは阻害を追跡することによりＴ細胞活性をモニターすることで、検出及び定量することができるだろう。そのような適したアッセイには、Ｔ細胞を増殖させるためにＴ細胞を培養し、Ｔ細胞をＭＨＣペプチド抗原複合体と接触させて、細胞による生物学的応答を評価する一連のステップを含むインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなアッセイのより特定の例として、ＵＳＳＮ０８／８１３７８１及びＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４出願を参照のこと。

ある態様では、ＴＣＲ分子の機能は、適切なＭＨＣ分子（たとえばＨＬＡ−２Ａ）とのかかわりあいで、適切なｐ５３ペプチドを認識するＴＣＲの能力を、たとえばＴＣＲのＭＨＣ：ｐ５３ペプチド複合体への結合をモニターすることにより決定される。そのような複合体は、細胞上に提示されることができ、その場合にはＴＣＲ機能は、ｐ５３提示細胞と標識されたＴＣＲを接触させて、当該細胞への結合を非ｐ５３提示細胞への結合と比較して測ることによって測定される。標識された細胞は、顕微鏡でもしくは当該分野で慣用のフローサイトメトリー分析を用いて検出されることができる。

他の態様では、ＴＣＲ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような非細胞に基づくアッセイが使用される。たとえばＴＣＲは直接支持体に結合させられ、そのＭＨＣ：ｐ５３ペプチド複合体への結合能が測定されることができ、あるいはＭＨＣ：ｐ５３複合体が支持体に結合され、その複合体のＴＣＲへの結合能が測定されることもできる。適した支持体には、マイクロタイタープレートウエル、細胞培養プレート、膜、ガラスあるいはポリマー基質等が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＣＲの支持体への直接的な結合の代わりに、ＴＣＲを認識することでＴＣＲを捕獲して非直接的に支持体へＴＣＲを結合させることができる抗体で、支持体を被覆することもできる。そのようなアッセイにおける適した対照は、当該分野の当業者に自明であり、それらには、無関係な抗原へのＭＨＣ分子の結合、非ｐ５３認識ＴＣＲ、緩衝液等が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＣＲ ＥＬＩＳＡでは、ＴＣＲ分子、ＭＨＣ分子、あるいはペプチドのいずれかが標識される。好ましくは支持体に結合する分子は標識されない。ここで使用される「標識された」とは、直接及び間接的な標識を意図する。すなわち「標識されたＴＣＲ分子」は、ＴＣＲに直接結合したラベル、あるいは抗体のようなＴＣＲあるいはＴＣＲに結合した抗体を認識する、標識された結合パートナーに、直接的あるいは間接的に結合されたＴＣＲを含んでいてよい。ここで使用される「結合した」とは、共有結合あるいは非共有結合であり得る、二つの分子間の安定したつながりを意図する。

ＴＣＲ機能をモニターするアッセイには、ＴＣＲ介在性シグナル伝達の測定もまた含まれるだろう。一つの態様では、ＴＣＲヘテロダイマーをコードする核酸構築物は、ＴＣＲを発現しない、あるいは少なくとも同じ特異性を有するＴＣＲを発現しない細胞へ導入される。ＴＣＲ発現細胞のｐ５３：ＭＨＣ複合体への結合による適切なシグナル伝達能力は、それからモニターされることができる。たとえばＴＣＲ発現細胞のＩＬ−２産生能が測定されるだろう。ｓｃ−ＴＣＲもまた細胞にトランスフェクトされるだろう。そのようなアッセイにおいて、ｓｃ−ＴＣＲは好ましくは膜貫通ドメインポリペプチド（たとえばイムノグロブリン分子由来の）と融合して、より好ましくはまた適切な細胞質シグナルドメインとの融合として発現される。一つの態様では、細胞質シグナルドメインはＣＤ３ゼータ分子である。ＭＨＣ：ｐ５３複合体は、天然もしくは調製された抗原提示細胞により提示されるか、複合体として単離されるだろう。

ＴＣＲの細胞溶解応答仲介能もまた決定されることができる。そのようなアッセイのために、ＴＣＲ分子をコードする核酸構築物が、好ましくは適切な共刺激分子を発現できる細胞へと導入される。

上述のアッセイの全てにおいて、「機能的」ＴＣＲはＭＨＣ：ｐ５３複合体に結合しない対照ＴＣＲに比べて増加した機能（たとえば増強した結合、ＩＬ−２産生のような増加したシグナル伝達、増加した細胞殺傷等）を示すものである。「機能的ＴＣＲ」であることを実証するために必要な機能の増強量は、必然的に使用されるアッセイのタイプに依存するだろう。たとえば一つの態様では、機能的なＴＣＲであることを実証するアッセイ値は、対照ＴＣＲから得られる値よりも約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、あるいは約１００％大きい。他のアッセイでは、機能的なＴＣＲであることを示すアッセイ値は、対照ＴＣＲから得られる値よりも約２倍、約４倍、約８倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、あるいは約１００倍大きい。他のアッセイでは、機能的なＴＣＲであることを示すアッセイ値は、対照アッセイから得られる値からｐ≦０．０５という統計的に著しく異なるものである。当業者は使用される特有のアッセイにおける著しさ（significance）の測定を慣用的に評価できる。

一般に本発明のＴＣＲの調製は、ここに開示される手順と、たとえばポリメラーゼ鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡの結合、ｍＲＮＡの単離、ＤＮＡの適切な細胞への導入、宿主の形質転換及びトランスフェクト、宿主の培養を含む、認知された組換えＤＮＡ技術により達成されることができる。加えてＴＣＲ分子は、カオトロピック試薬を用いて、公知の電気泳動、遠心、クロマトグラフィー手法により単離及び精製される。一般的にはこれらの方法に関する開示として、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^ｎｄ ed. (1989)、及び、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)を参照のこと。

ここに開示される分子に製造及び使用に関する、より特別な背景情報として、ＵＳＳＮ０８／８１３７８１、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４、及び、Ｔ細胞受容体融合体、結合体、及びそれらの使用方法という題の、２００１年６月５日出願の同時係属出願（発明者がJon A. Weidanz, Kimberlyn F. Card及びHing C. Wongである、ＵＳＳＮ０９／８７４９０７）を参照のこと。

議論したように、本発明の好ましい分子は、ここで標準的なＴ細胞結合アッセイまたはＴＣＲ ＥＬＩＳＡとして言及されるアッセイにおいて、良好な結合を示す。「標準的なＴ細胞結合アッセイ」という用語は、適切なＴ細胞と、抗原との複合体であるＭＨＣ間の結合を検出そして好ましくは定量する結合試験を意味する。端的にいうと、好ましい試験は、検出可能な標識されたＭＨＣ分子を提供し、標識されたＭＨＣ分子（抗原との複合体）を、ＭＨＣ−抗原・Ｔ細胞の複合体の形成を誘導する条件下で接触させ、標準的な検出手法により複合体の形成をモニターするものである。所望により、複合体の形成は定量されることができる。上述したほかのＴＣＲ機能アッセイもまた、使用されるだろう。

ここで提供されるヘテロダイマーと一本鎖分子を含む好ましいＴＣＲ分子は、一般にＴＣＲをＭＨＣ分子へ特異的に結合をさせるのに十分な大きさである。ＭＨＣが抗原と複合体を形成し、ペプチド−ＭＨＣ分子としても言及される態様において、ＴＣＲ分子は少なくとも一つのＭＨＣ−ペプチド結合ポケットを形成するＣＤＲ結合ループを含む。ＭＨＣ−ペプチド結合ポケットを含む有用なα／βＴＣＲ分子は、好ましくは少なくともα鎖可変ドメイン（α鎖のＣＤＲ長に依存して約１から約１１０、約１３０アミノ酸）と、β鎖可変ドメイン（β鎖のＣＤＲ長に依存して約１から約１１０、約１３０アミノ酸））からなる。

本発明での使用においてより好ましいＴＣＲ分子は、標準的Ｔ細胞結合試験としてここで言及される方法で、顕著な結合活性を示すものである。好ましくは、ＴＣＲ分子は、無関係の（対照）ＴＣＲへの結合とは顕著に異なる（ここで「顕著」とは、たとえばｐ≦０．０５等、当該分野で知られた慣用の統計手法を用いて決定される）レベルで、その同起源のＭＨＣ抗原分子複合体へ特異的に結合する。好ましくは、結合は対照値よりも少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、あるいは少なくとも約１００倍高い。適した対照分子の例には、ここで引用される他の参考文献と同様に、たとえばＵＳＳＮ０８／８１３７８１、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／４２２３７５、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６４５に開示される１４９ＴＣＲ分子が含まれる。

非常に有用な、インビトロ及びインビボＴ細胞結合アッセイが、係属中のＵＳ特許出願番号０８／３８２４５４、０８／５９６３８７及び０８／９４３０８６と同様に、公開されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７に開示されている。本発明のＴＣＲ分子と、適切なＭＨＣ分子とのかかわりあいで提示される開示されたｐ５３アミノ酸間の良好な結合を同定することが必要であれば、それらの開示されたＴ細胞結合アッセイは使用あるいは容易に適用されることができる。上述の公開されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３１４、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６１７、係属中のＵＳ特許出願番号０８／３８２４５４、０８／５９６３８７の開示は、それぞれ引用することによりここに取り込まれる。

標準的なＴ細胞結合試験の好ましい例は、T細胞受容体相互作用の調節というタイトルの２００１年５月１６日出願の同時係属出願（Peter Rhode, Vaughan Wittman, Jon A. Weidanz, Martin Burkhardt, Kimberlyn F. Card, Rony Tal, Jorge Acevedo, Hing C. Wongが発明者であるＵＳＳＮ０９／８５９０１２）に開示され、その出願の開示は引用することによりここに取り込まれる。（以後、「２００１年５月１６日出願の同時係属出願」という。）前述の２００１年５月１６日出願の同時係属出願は、ＵＳＳＮ６０／２０６９２０の一部継続出願である。ＵＳＳＮ６０／２０６９２０出願の開示は、引用することによりここに取り込まれる。

特に２００１年５月１６日出願の同時係属出願の実施例１５は、標準的なＴ細胞結合試験の説明を開示している。典型的には、試験はたとえば本発明のヘテロダイマーのような当該対象となるＴＣＲを発現するＴ細胞の産生、及び、適切なクラスＩＭＨＣ分子、特にＨＬＡ−Ａ２．１分子で、これらの細胞を染色することを含む。慣用的なビオチン／ストレプトアビジン技術を含むＴ細胞染色法は、２００１年５月１６日出願の同時係属出願に開示されている。そこで開示されるように、他の検出形式が、ある適用においてはより好ましいかも知れないが、好ましい検出方法はフローサイトメトリーである。

「標準的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＥＬＩＳＡ」という用語は、たとえば前述の２００１年５月１６日出願の同時係属出願において開示される、適したアッセイのいずれか一つを含むことを意図するが、それに限定されるものではない。好ましいアッセイはたとえばプレートに基づくＥＬＩＳＡなどの、一本鎖またはヘテロダイマーＴＣＲ構築物を操作することを含む。端的に述べると、アッセイは検出可能に一本鎖あるいはヘテロダイマーＴＣＲを標識して、標識されたＴＣＲ分子を適切なペプチドが取り付けられたＭＨＣ分子、好ましくはここに開示されるＨＬＡ−Ａ２．１分子と接触させ、その接触はＴＣＲ：ＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するのに十分な条件で行うことを含む。好ましい標識方法は２００１年５月１６日出願の同時係属出願全体にわたって開示され、それは標準的なビオチン／ストレプトアビジン標識技術を含んでいる。たとえば２００１年５月１６日出願の同時係属出願の実施例１５を参照のこと。

議論したように、本発明の好ましいＴＣＲ分子は、典型的にはＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子とのかかわりあいで、ヒトｐ５３蛋白質の約２６４から約２７２アミノ酸の間、好ましくはｐ５３蛋白質の２６４から２７２位、つまり次の「標的」アミノ酸配列Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）に結合する。加えて、標的アミノ酸の誘導体、つまり、そこで少なくとも一つの保存的置換を有するアミノ酸配列が考えられる。標的配列残基のいずれかに二つもしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換がなされる態様では、必要に応じてこれらの置換が近接もしくは非近接している。

好ましくは、保存的置換は表現型がサイレント、つまり標準的アッセイにおいて置換がＴＣＲの結合に著しい影響を与えないものである。保存的なアミノ酸の置換例は、好ましい標的配列の７位（ヒトｐ５３蛋白質に関しては２７０位のアミノ酸）のフェニルアラニンをチロシンで置換することである。対照的に、標的配列のロイシン残基をアルギニンで置換することは、非保存的アミノ酸置換の例となるだろう。保存的アミノ酸置換の好ましい例は、米国特許第６１２７５２４号（図１５A−B）に記載されており、その開示は参考としてここに挿入される。

本発明はさらに核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）及び好ましいヘテロダイマーと一本鎖構築物を含む本ＴＣＲ分子をコードする特有のＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮＡ配列は、好ましくはファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣまたはエピソームのような、染色体外複製に適したベクターで運ばれる。いくつかの態様では、ＤＮＡベクターはその唯一の機能がここに記載される調製方法を容易にして蛋白質の顕著な量を得るための他の補助的な蛋白質をコードできる。ＤＮＡ配列は適切な発現ベクター、つまり挿入された蛋白質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入されることができる。様々な宿主−ベクターシステムが蛋白質をコードする配列の発現に使用されることができるだろう。それらには、ウイルス（たとえば、ワクチニアウイルス、アデノウイルス等）で感染された、あるいは発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳細胞システム、ウイルス（たとえば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞システム、酵母ベクターを含む酵母のような微生物、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアが含まれる。使用される宿主−ベクターシステムに依存して、適した多くの転写及び翻訳要素が使用されるだろう。 一般的にはSambrookらによる上述文献、及び、Ausubelらによる上述文献を参照のこと。

一般に本発明の好ましいＤＮＡベクターは、５‘→３’の方向に、エフェクター分子をコードする配列に操作可能に結合されたＴＣＲ鎖をコードする最初の核酸配列を導入するための最初のクローニング部位を含む、つまり融合蛋白質または結合体のホスホジエステル結合で結合された核酸配列を含んでいる。

ここで使用されるように、「エフェクター分子」とは、蛋白質、ポリペプチドあるいはペプチドのようなアミノ酸配列、糖質または多糖、脂質または糖脂質、糖蛋白質、リポプロテイン、あるいはここで議論されたような、所望の効果を発揮できる化学試薬を意図する。このように適した分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドと同様に、制御因子、酵素、抗体、あるいは薬剤を含む。生物学的に活性なエフェクター分子は、天然のものであっても、たとえば組換えあるいは化学合成等の公知の構成要素から合成できるものであってもよく、異種の構成要素を含んでいてもよい。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は一般に約０．１から１００ｋＤの間、あるいは約１０００ｋＤまでであり、好ましくは遠心やＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような、標準的な分子サイジング技術により決定される値として、約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、５０ＫＤの間である。本発明の好ましい効果には、たとえば細胞増殖あるいは細胞死の誘導、免疫応答の誘導、あるいは細胞を培養して増殖させ、該細胞と本発明のＴＣＲ融合複合体と接触させ、ＴＣＲ融合複合体が細胞のさらなる発達を阻害するか否かを評価するという一連のステップを含むアッセイを包含する下記のアッセイにより決定されるような、診断目的のための検出分子として機能することが含まれる。

ほとんどの例では、ＤＮＡベクターでコードされる融合蛋白質の個々の構成要素は、「カセット」形態で提供されることが好ましいだろう。「カセット」という用語は標準的な組換え技術で個々の構成要素と他の構成要素で容易に置換できることを意味する。ここで提供されるＴＣＲ分子をコードするベクターを製造するために、ＴＣＲ分子をコードする配列は適したリガーゼを用いてベクター配列に結合される。

所望により、他のヌクレオチド配列が遺伝子構築物に含まれることができる。たとえばＴＣＲ分子をコードする配列の発現を制御するプロモータ配列、あるいはＴＣＲ融合複合体を細胞表面あるいは培養培地へ向けるリーダー配列が、構築物の中に含まれることができ、あるいは、構築物が挿入された発現ベクター上に存在することができる。イムノグロブリンまたはＣＭＶプロモータは、哺乳動物細胞における発現に特に好ましい。

本発明のＴＣＲ分子の構成要素は、可変鎖、膜貫通ドメイン、定常鎖等を含むが、これらに限定されることはなく、個々が目的とする機能を発揮できるほとんどいかなる順序でも編成されることが強調される。

ここで提供されるＴＣＲ分子を発現するために、多くの手法を採用することができる。たとえばＨＬＡ分子とのかかわりあいで、配列番号１の標的アミノ酸配列と結合するｓｃ−ＴＣＲ分子は、構築物を挿入するためのベクターを切断するために制限酵素を使用してからライゲーションを行うというような公知の手法により、適したベクターへ挿入されることができる。組換え遺伝子構築物を含むベクターは、それからＴＣＲ融合ペプチドの発現に適した宿主へ導入される。一般に、Sambrookらによる上述文献を参照のこと。適したベクターの選択は、クローニングプロトコールと関連する因子に基づいて経験的に行われることができる。たとえばベクターは用いられる宿主と一致し、適切なレプリコンを有していなければならない。さらにベクターは、発現されるＴＣＲ分子をコードするＤＮＡ配列を収容できるものでなければならない。さらにベクターは発現されるＴＣＲ分子をコードするＤＮＡ配列を収容できるものでなければならない。適した宿主細胞には、真核及び原核細胞が包含され、好ましくは容易に形質転換されて、培養培地で迅速に成長できるものである。特に好ましい宿主細胞には、大腸菌、バチルスズブチリス等のような原核細胞と、動物細胞や、たとえばサッカロマイセスセレビシエ等の酵母のような真核細胞が含まれる。哺乳動物細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−ＯあるいはＣＨＯが一般的に好まれる。他の適した宿主には、たとえばＳｆ９のような昆虫細胞が含まれる。慣用的な培養条件が採用される。Sambrookらによる上述文献を参照のこと。安定な形質転換もしくはトランスフェクトされたセルラインが次に選択される。ＴＣＲ分子を発現する細胞は、公知の手法により決定されることができる。たとえばＴＣＲ分子、好ましくは、免疫グロブリンに結合したヘテロダイマーは、結合した免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ及び／またはイムノブロッティングにより決定されることができる。

上記において一般的に述べたように、宿主細胞は所望の融合蛋白質をコードする核酸を増やすという準備目的のために使用されることができる。すなわち、宿主細胞には、融合蛋白質の産生が特に望まれる真核あるいは原核細胞が含まれる。このような宿主細胞には、特に融合蛋白質をコードする核酸を増やすことができるバクテリア、酵母、ハエ、昆虫、植物、カエル、哺乳動物細胞及び組織が含まれる。使用されることができる哺乳動物セルラインの非限定的な例には、ＣＨＯ，ｄｈｆｒ欠損細胞（Urlaub及びChasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)）、２９３細胞(Grahamら、J. Gen. Virol., 36: 59 (1977))、あるいはＳＰ２やＮＳＯのような(Galfre及びmilstein, Meth. Enzymol., 73(B): 3 (1981))ミエローマ細胞が含まれる。

所望のヘテロダイマーや一本鎖ＴＣＲをコードする核酸を増幅できる宿主細胞には、昆虫（たとえば、Sp. Frugiperda）、酵母（たとえば、一般的にFleer, R., Current Opiniopn in Biotechnology, 3(5): 486-496 (1992)において概説されるような、サッカロマイセスセレビシエ、サッカロマイセスポンベ、サッカロマイセスパストリス、K.lactis、H,polymorpha、）、真菌類及び植物細胞のような、非哺乳動物真核細胞が含まれる。また、大腸菌やバチルスのようなある種の原核細胞も考慮される。

所望の融合蛋白質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトする標準的な技術によって宿主細胞に導入されることができる。「トランスフェクティング」あるいは「トランスフェクション」という用語は、カルシウムリン酸共プレシピテーション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入及び／またはインテグレーションを含む、核酸を宿主細胞へ導入する全ての慣用的な方法を含むことを意図する。宿主細胞をトランスフェクトするのに適した方法は、Sambrookら、上述、あるいは他の実験教科書に記載されているだろう。

本発明はさらに、ここに開示されるＴＣＲ分子のいずれか一つを単離するための製造方法を提供する。その工程において、制御配列に動作可能なように結合された当該蛋白質をコードする核酸が導入される宿主細胞（たとえば、酵母、かび、昆虫、バクテリア、あるいは動物細胞）は、当該融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するために培養培地において生産規模で成長させられる。続いて、ＴＣＲ分子は培養されて集められた宿主細胞、あるいは培養培地から単離される。標準的な蛋白質精製技術が、培地あるいは集められた細胞から当該蛋白質を単離するために使用されることができる。特に、精製技術は、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養皿、バイオリアクター、あるいは発酵槽を含む様々な実施により大規模に（すなわち、少なくともミリグラム量で）所望のＴＣＲ蛋白質を発現及び精製するために使用されることができる。

本発明の発現されたＴＣＲ分子は、公知の方法により単離精製されることができる。典型的には培養培地は遠心され、それから上清はたとえばプロテイン−Ａ、プロテイン−Ｇ親和性クロマトグラフィー、あるいは、発現されたＴＣＲ分子に結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコール等の、親和性あるいは免疫親和性クロマトグラフィーにより精製される。そのような分子は公知の方法の適切な組み合わせにより分離精製されることができる。これらの方法には、たとえば、塩沈降及び溶媒沈降のような溶解度を利用する方法や、透析、超ろ過、ゲルろ過、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の違いを利用する方法や、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の違いを利用する方法や、親和性クロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法や、逆相高パフォーマンス液体クロマトグラフィーのような疎水性の違いを利用する方法や、等電点収束電気泳動のような等電点の違いを利用する方法や、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属親和性カラムが含まれる。一般的には、これらの方法に関する開示として、Sambrookら、及びAusubelらによる、上述文献を参照のこと。

特に本発明の一本鎖ＴＣＲ分子は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、当該分子は自然に伴われる細胞置換基から単離され、融合蛋白質が、好ましくは少なくとも約８０％、あるいは９０％から９５％の均一性（ｗ／ｗ）で存在する。少なくとも９８乃至９９％の均一性（ｗ／ｗ）を有するそのような蛋白質は、多くの薬学的、医学的及び研究に適用する際にもっとも好まれる。一度実質的に精製されたならば、蛋白質は治療に用いるために、実質的に汚染物を含んではならない。一度部分的にあるいは実質的に純粋なまでに精製された可溶性ＴＣＲ分子、好ましくは一本鎖形態のものは、治療、あるいはここに開示されるインビトロまたはインビボアッセイに用いられることができる。実質的に純粋であることは、クロマトグラフィーやゲル電気泳動のような様々な標準的な技術により決定されることができる。

本発明の切断されたＴＣＲ分子は、本発明のＴＣＲ分子が発現後に培養培地へと分泌されることができるように十分に切断されたＴＣＲ分子を含むものである。したがって、切断されたＴＣＲ分子、ｓｃ−ＴＣＲ、ＴＣＲ融合あるいは複合体は、典型的には疎水性残基が豊富な領域、典型的にはＴＣＲ分子の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含まないだろう。このように、たとえば本発明の好ましい切断されたTCR分子は、好ましくはＴＣＲ分子のβ鎖の約１９９から２３７アミノ酸残基と、α鎖の約１９３から２３０アミノ酸残基が切断されたＴＣＲ複合体に含まれないものである。

「可溶性」あるいは類似の用語によって、本発明のＴＣＲ分子は、普通一本鎖構築物に限らず、たとえば細胞培地などの水性緩衝液から（たとえば、標準的な遠心で一分間に約３００００回転以下の）重力遠心で、容易に沈殿されるものではない。さらに、約５−３７℃以上の温度、アニオンあるいは非イオン性界面活性剤の低濃度あるいは非存在下、中性あるいはその近辺のｐHで、水溶液中に溶解しているならば、そのような分子は可溶性である。これらの条件下で、可溶性蛋白質はしばしば、たとえば約１０−５０スヴェードベリー単位の低い沈殿値を有するだろう。

ここで参照される水溶液は、典型的には約ｐH５−９の範囲に調製し、イオン強度を約２ｍMから５００ｍMの範囲にするための緩衝物質を主として含んでいる。時々蛋白質阻害剤あるいはマイルドな非イオン性界面活性剤が添加される。加えて、所望により牛血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のようなキャリアー蛋白質が数ｍｇ／ｍｌ添加されるだろう。模範的な水性緩衝液には、標準的なリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、あるいは他のよく知られた緩衝液や細胞培地形成物が含まれる。

本ＴＣＲ分子は、ガン、前ガン性、あるいは発ガン性等の様々な細胞へ、インビトロもしくはインビボにおいて使用するのに適している。好ましくは、そのような細胞は、ガン、前ガン性、あるいは発ガン性であることが知られていない正常（野生型）細胞と比較して、高レベルのｐ５３蛋白質を発現するものである。

本発明の分子は、特に悪性腫瘍疾患、ｐ５３の異常な発現に伴う疾患あるいは状況（たとえば、少なくとも２倍その分子を過剰発現するなど）を有している、もしくは、有することが疑われるヒト患者にとって有用である。たとえば、本発明の分子あるいはその誘導体は、ｐ５３の異常発現と関連するヒト患者における腫瘍を標的化するのに特に有用である。本発明にしたがって治療されるであろう疾患の特別な例には、たとえば胸、前立腺等のガンを含め、ここに記載される他の特別な疾患や状況が含まれる。

本発明の分子の投与には、経口、局所（経皮、舌下錠あるいは舌下を含む）、経鼻及び腸管外（腹腔内、皮下、静脈、経皮、あるいは筋肉注入を含む）が含まれ、一般的には経口あるいは腸管外が好まれる。また投与の好ましい方法及び投与量は、たとえば患者の状況や年齢により異なるであろう。有効投与量は、腫瘍退化、ガン特異的マーカー（ｐ５３を含む）の発現の減少、細胞増殖の減少、改善されたもしくは正常な生体組織検査の結果等のような標準的な医学治療終点（endpoint）を決定することにより、モニターされるだろう。

本発明の分子は、単独で、もしくは、所望される兆候を処置するのに薬学的に活性であることが認識されているような他の薬物療法と共に、治療に使用されるだろう。模範的な薬物療法には、手術、放射線治療、化学療法、及び免疫学的治療の他の形態（たとえば、ワクチン、抗体に基づく治療）が含まれる。本発明の分子は、そのような治療が必要とされる前、間、もしくは後に投与されることができる。

本発明の一つもしくはそれ以上の分子が単独で投与されることができる一方で、それらの分子は慣用的な賦形剤、すなわち、薬学的に許容できる有機もしくは無機の腸管外、経口、あるいは他の好ましい投与方法に適した担体物質であって、有害に活性化合物と反応せずにその患者に対しても有害でないものと混合した薬学的組成物の一部としても存在するだろう。本発明の薬学的組成物は、一般に一つもしくはそれ以上の本発明のＴＣＲ分子、あるいは、そのようなＴＣＲ分子をコードするＤＮＡ構築物を、一つもしくはそれ以上の許容可能な担体とともに含むものである。担体は、他の処方含有物と適合して、その受容者に有害でないという意味において「許容可能」でなくてはならない。適した薬学的に許容可能な担体には、水、食塩水、アルコール、野菜の油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、マグネシウムステアリン酸、タルク、シアル酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジクリセリド、ペトロエーテル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。薬学的調製物は殺菌されることができ、所望によりたとえば潤滑油、保存剤、安定剤、界面活性剤（湿潤剤）、エマルジョン、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、香料、及び／または芳香性物質等の、本発明の活性な分子と有害に反応しない補助試薬と混合されることができるだろう。

腸管外適用のために、特に好ましいものは溶液であり、好ましくは、座薬を含む、懸濁液、エマルジョン、あるいは移植片と同様に、油性あるいは水性溶液である。アンプルは便利な単位用量である。

経腸適用のために、特に好ましいものは、タルク及び／または炭水化物担体結合剤等を有する錠剤、糖衣錠あるいはカプセルであり、担体は好ましくはラクトース及び／またはコーンスターチ、及び／またはポテトスターチである。シロップ、エリキシル剤等も甘い媒体が用いられる際に使用されることができるだろう。徐放性組成物は、活性成分が異なる程度のコーティング、たとえばマイクロエンキャプシレーション、マルチプルコーティング等で保護されている場合において、これらを含んで処方されることができる。

本発明の治療用化合物はまた、リポソームに取り込まれるだろう。取り込みは、公知のリポソーム調製手順、たとえばソニケーションやエクストルージョンなどにより行われることができる。リポソーム調製の適した慣用的な手法は、たとえばA. D. Banghamら、J. Mol. Biol., 23: 238-252 (1965)、F. Olsonら、Biochim.Biophys.Acta, 557: 9-23 (1979)、F.Szokaら、Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 4194-4198 (1978)、S. Kimら、Biochim. Biophys. Acta, 728: 339-348 (1983)、Mayerら、Biochim. Biophys. Acta. 858: 161-168 (1986)に記載されている。

本発明はまた、ヒトのような哺乳動物における免疫応答を引き起こす方法を提供するものであり、その方法はヒトのような哺乳動物にガンのようなｐ５３の過剰発現を伴う標的疾患に対するワクチンを投与することを含む、。

これらの手法には、哺乳動物に、本発明のＴＣＲ分子をコードするＤＮＡベクターを含むＤＮＡ配列の有効量を投与することが含まれる。ＴＣＲ分子の発現ベクター調製は上述され、また、以下につづく実施例に記載されている。プラスミドＤＮＡの投与方法、投与された対象細胞によるＤＮＡの取り込み、及び蛋白質の発現が報告されている。Ulmer, J. B.ら、Science (1993) 259: 1745-1749参照。

本発明のＴＣＲ分子をコードするＤＮＡベクターは、ヒトを含む哺乳動物に、好ましくは筋肉注射により適切に投与される。哺乳動物の骨格筋へのｃＤＮＡ投与はそれに続く筋肉細胞による投与された発現ベクターの取り込みとＤＮＡによってコードされた蛋白質の発現を伴うものであり、Ulmerらにより開示されており、模範的なプロトコールを表している。（Ulmer, J. B.ら、Science 259: 1745-1749）所定の治療に最適な投与量は、慣用的な方法により決定されることができる。

ヒトの疾患の治療に加え、本発明のＴＣＲ分子とそのＴＣＲ分子をコードする本発明のＤＮＡ構築物は、獣医による適用における重要な用途を、たとえば牛、羊等の家畜、犬や猫のようなペットの疾患の、動物種に適切な同起源のｐ５３抗原とＭＨＣ分子を使用する治療等の用途を有するだろう。

本発明のＴＣＲ分子あるいはそれをコードするＤＮＡ構築物の治療において使用される実際に好ましい量は、特定の活性化合物あるいは使用される化合物、特定の処方される組成、適用様式、投与される特定の部位、患者の体重、一般的な健康状態、性別等、処置される特定の兆候等、及び担当医者あるいは獣医を含む当業者によって認識されるほかの要因により、様々であろう。与えられたプロトコールにおける適した投与割合は、たとえば上述のガイドラインやここに開示されるアッセイ等の実施される慣用的な投与量決定試験を用いて当業者により容易に決定されることができる。

「ポリペプチド」の用語はその大きさにかかわらず好ましくは本質的に２０天然アミノ酸のいずれかから成るあらゆるポリマーを意図している。「プロテイン」の用語は、比較的大きな蛋白質に関してよく使われ、「ペプチド」の用語は、小さなポリペプチドに関してよく使われるが、これらの用語はこの分野では重複して使用されることが多い。「ポリペプチド」の用語は、特に注記されていなければ一般にプロテイン、ポリペプチド及びペプチドを意図している。一般に本願で有用なペプチドは、約０．１から１００ｋＤの間、あるいは約１０００ｋＤまでであり、好ましくは遠心やＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような、標準的な分子サイジング技術により決定される値として、約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、５０ＫＤの間である。

ここで使用されるように、「細胞」という用語は、いかなる初代細胞あるいは不死化されたセルライン、組織あるいは器官における細胞の集団を含むことを意図する。好ましくは細胞は哺乳動物特にヒト起源のものであり、一つもしくはそれ以上の病原体により感染されることができるものである。本発明の「宿主細胞」は、感染された細胞、あるいはここに開示される核酸を増殖させるのに使用されることができる大腸菌のような細胞であり得る。

ここに言及されるすべての文献は、引用することによりここに取り込まれる。以下の非制限的な実施例は、本発明の実例である。

実施例１
２６４一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ−ＴＣＲ）の構築
Ｔ細胞クローン２６４は、ＨＬＡ−Ａ２．１制限性ヒト野生型腫瘍抑制蛋白質ｐ５３のペプチド断片（アミノ酸配列）２６４−２７２、すなわちＬＬＧＲＮＳＦＥＶ（配列番号１）を認識する。Ｔ細胞受容体遺伝子は、可溶性ＴＣＲと機能を有する受容体分子を産生することがすでに示されている３つのドメインからなる一本鎖構成へとクローニングされた。

端的にいうと、Ｔ細胞クローンからｍＲＮＡが単離され、マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Clonetech）を用いてｃDNAが作られた。ｃDNAクローンの配列決定により、二つの異なるVα鎖（Ｖα３及びＶα１３）及び一つのＶβ鎖（Ｖβ３）を同定した。ｃＤＮＡは５‘ＳｆｉＩ−３’ＳｐｅＩＶα３あるいはＶα１３断片のそれぞれを産生するための、ＫＣ２２８とＫＣ２２９、または、ＫＣ２２６とＫＣ２２７プライマーでポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行う際の鋳型として使用された。同じＤＮＡはそれから５‘ＸｈｏＩ−３’ＸｍａＩＶβＣβ鎖断片を産生するために、ＰＲＩＢ４とＫＣ１７６プライマーでＰＣＲを行う鋳型として使用された。Ｃβ鎖は全長Ｃβ鎖のアミノ酸１２７位システイン残基の直前で切断された。

α及びβ鎖断片は、ＤＮＡ配列決定のために、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターシステム（Promega）へクローニングされた。正しい断片が制限酵素で切断され、発現ベクターｐＫＣ６０（係属中の米国特許出願第０８／８１３７８１号にすでに記載されている）へクローニングされ、二つのＶα―（Ｇ_４Ｓ）_４ Ｖβ Ｃβ ｓｃ−ＴＣＲ分子である、（Ｖα３を伴う）２６４−Ａ、（Ｖα１３を伴う）２６４−Ｂを産生した。

上述したＤＮＡ構築物（２６４−Ａ及び２６４−Ｂ）は、プライマーＥＴ−ＴＣＲＦ１とＫＣ１７０、またはＥＴ−ＴＣＲＦ２とＫＣ１７０を用いてＰＣＲで再増幅され、それぞれ５‘ＡｇｅＩ−３’Ｃｌａ ＤＮＡ断片を産生した。断片はＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターシステムへクローニングされた。

５‘ＡｇｅＩ−３’ＣｌａＩ断片はそれから、プライマーＫＣ２３２とＫＣ２０８、あるいはＫＣ２３１とＫＣ２０８を用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡとして使用され、それぞれがＣＤ３ゼータ融合分子またはそのような分子を含むベクター（以下に記載）、及び最終的には２６４ＩＬ−２融合分子またはそのような分子を含むベクター（以下に記載）を産生するためのクローニングするために５‘ＡｇｅＩ−３’ＨｐａＩＤＮＡ断片を産生した。

実施例２ CD３ゼータ融合シャトルベクター構築
二つのＶα鎖のいずれが機能的かを決定するために、２６４−Ａ及び２６４−Ｂ ｓｃ−ＴＣＲがＣＤ３ゼータ融合分子として発現された。

「シャトルベクター」の構築については、係属中の米国出願番号０９／４２２３７５にすでに記載されており、その内容は引用することによりここに取り込まれる。

端的には、α及びβ鎖ＴＣＲ断片は、ｐＫＣ６０発現ベクターへクローニングされ、Ｖα―（Ｇ_４Ｓ）_４ Ｖβ Ｃβｓｃ−ＴＣＲ分子を製造した。新しいベクターはｐＮＡＧ２（図１）と名づけられた。ｐＮＡＧ２はそれからＫＣ２０３とＫＣ２０８プライマーを用いてＰＣＲにより再増幅され、５‘ＡｇｅＩ−３’ＨｐａＩ／ＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を産生した。ｓｃ−ＴＣＲ断片は、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターシステムへクローニングされ、この新しいｐGEMに基づくベクターは、それから二重特異性あるいは融合ｓｃ分子を製造するために、他のＤＮＡ断片を導入するためのシャトルベクターとして使用された。

ｓｃ−ＦｖＤＮＡがそれから制限酵素で切断され、「シャトルベクター」のｓｃ−ＴＣＲ下流へクローニングされた。ｓｃ−ＴＣＲとｓｃ−Ｆｖを一緒に一本鎖融合蛋白質として結合させるために、「シャトルベクター」は既存のリンカーＤＮＡ断片を欠落させ、ｓｃ−ＴＣＲとｓｃ−Ｆｖ間のリンカー配列を結合させる適切な制限酵素で消化された。

以上概説した「シャトルベクター」デザインにおいて、終止コドンとスプライシング部位は、ＫＣ２０８「バック」プライマーを用いたｓｃ−ＴＣＲのＰＣＲ増幅の部分として、ＮｒｕＩ及びＣｌａＩ制限酵素部位の間に挿入された。二重特異性であるｓｃ蛋白質の下流での精製を補助するために、アニールされたオリゴヌクレオチド（ＫＣ２３７とＫＣ２３８）のセットが、終止コドンとスプライシング部位とともに３‘ＥＥタグ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ）（配列番号４）を導入するようにデザインされた。アニールされたオリゴヌクレオチドペアは、完全な二重特異性ｓｃ−ＴＣＲ分子をすでにコードする「シャトルベクター」の５’ＮｒｕＩ−３‘ＣｌａＩ領域へクローニングされた。

二重特異性ｓｃ分子デザインを完成させるために、「シャトルベクター」にｓｃＴＣＲ、ｓｃ−Ｆｖ、リンカー及びタグＤＮＡ断片をクローニングした後、ＤＮＡは制限酵素でＡｇｅＩ−ＣｌａＩ）で切断され、哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２７（図２）（係属中の米国特許出願番号０８／９４３０８６号においてすでに記載されている）へ、ｐＢＩＳＰ／１４９とｐＢＩＳＰ／Ｄ０１１．１０（図３）を作り出すためにクローニングされた。ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０は、ｐＳＵＮ２８として寄託されているｐＢＩＳＰ／１４９及び３つのＤＯ１１．１０ｓｃ−ＴＣＲプラスミド（ｐＳＵＮ１８−ＡＴＣＣ＃９７８９５、ｐＳＵＮ１９−ＡＴＣＣ＃９７８９６またはｐＳＵＮ２７−ＡＴＣＣ＃２０９２７６）のいずれかを用いて当業者によって作り出されることができる。ＵＳＳＮ０８／９４３０８６の開示は引用することによりここに取り込まれる。

ＣＤゼータの融合ベクターの構築
端的にいうと、マウスｃDNAがＫＣ３１２及びＫＣ３０４プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における鋳型として使用され、５‘HｐａＩ−３’CｌａＩマウスCD３ゼータ断片を産生した。

マウスＣＤ３ゼータ断片は、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターシステムにDNA配列決定のためにクローニングされた。正しい断片は制限酵素で分解され、既存のリンカーとｓｃ−FVとＥＥタグを効果的に除去して「シャトルベクター」へクローニングされた。

「シャトルベクター」へＣＤ３ゼータ遺伝子をクローニングした後、DNAは（上述した）２６４−Ａ及び２６４−Ｂ ｓｃ−ＴＣＲ断片と結合させられるようにＡｇｅＩ−ＨｐａＩで消化され、二つの新しいｓｃ−ＴＣＲ／ＣＤ３ゼータ融合物を製造した。最後に、新しいＤＮＡ調製物は、制限酵素で切断され（ＡｇｅＩ−ＣｌａＩ）、係属中の米国特許出願番号０９／４２２３７５にすでに開示されている図３の、哺乳動物発現ベクターｐＳＵＮ２８（ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０ベクター）へクローニングされた。

実施例３ ２６４ｓｃ−ＴＣＲ／ＣＤ３ゼータ融合分子の発現
ジャーカット細胞が、冷たいＤＰＢＳで洗浄してトランスフェクションのために調製された。細胞はＤＰＢＳに再懸濁され、ＰｖｕＩ２０μｇで切断された２６４−Ａ／ＣＤ３ゼータまたは２６４−B／ＣＤ３ゼータ ＤＮＡと混合された。氷上で５分後、細胞は２５０ボルト、９６０μＦｄ、1パルスを伝達するようにセットされたGene Pulser (BioRad)を用いてエレクトロポレーションされた。パルスされた細胞は5分間氷上に置かれた。細胞は１０％ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ，１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）１０ｍｌへ溶解され、３７℃、５％二酸化炭素下で、Ｔ−２５ｃｍ^２ＴＣフラスコ内で一晩成長させられた。翌日、細胞は選択培地（１０％ＩＭＤＭ、１．０ｍｇ／ｍｌ、Ｇ４１８）とともに、９６ウエルプレートに植え付けられた。一週間後、Ｇ４１８の濃度は２ｍｇ／ｍｌまで増加した。成長しているコロニーは、トランスフェクションから約２週間後に再供給され、約一週間後にスクリーニングされた。

トランスフェクトされたジャーカット細胞は、フローサイトメトリー分析を用いてｓｃ−ＴＣＲの表面発現をスクリーニングされた。陽性のトランスフェクタントは、マウスＴＣＲのＣβドメインの部分を検出する蛍光のタグのついたｍＡｂ（Ｈ５７−５９７）で染色することにより同定された。

実施例４ 正しい２６４ｓｃ−ＴＣＲＶαドメインの同定
ＣＤ３ゼータ融合分子の２６４−Aまたは２６４−Bバージョンのいずれかを発現したトランスフェクトされたジャーカット細胞が、細胞活性化アッセイで使用された。アッセイではＡＰＣとしてＨＬＡ−Ａ２提示セルラインＴ２が使用された。Ｔ２細胞には２６４ペプチド（あるいは無関係のペプチド）が３７℃、５％二酸化炭素下、一晩入れられた。次の日、トランスフェクトされたジャーカットセルラインが添加され、ペプチドパルスされたＡＰＣと一晩反応させた。

２６４が搭載されたＡＰＣによるトランスフェクタントの特有の刺激は、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡを用いて評価された。抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体が、９６穴プレートで一晩不動状態で被覆された。プレートは洗浄され、１時間１０％ＦＢＳ／ＤＰＢＳでブロッキングされた。ブロッキング試薬は除去された。アッセイ由来の上清が１時間３７℃でプレートに添加された。洗浄後結合したＩＬ−２は、ビオチンに結合した他の抗ＩＬ−２モノクローナル抗体を用いて検出された。３７℃で４５分間続けた後、プレートは洗浄され、ストレプトアビジン−ＨＲＰが１５分間添加された。最後にプレートは洗浄され、ＡＢＴＳ基質を用いて現像された。吸光度は４０５ｍｍで測定された。

細胞活性化アッセイに基づくと、Ｖα３ドメインは機能的である。２６４−Ａ分子を発現している細胞のみが、２６４ペプチドが搭載されたＡＰＣの存在下でＩＬ−２を産生するように刺激された。

次のページに示される表１は、前述の実施例で使用される様々なオリゴヌクレオチドの一次配列を表している。

本発明の好ましい態様が特定の用語で表現されているが、そのような表現は説明目的のためのみであり、以下の請求の範囲に記載の精神又は範囲から逸脱することなく変更及び改変がなされてよいことは理解されるべきである。

図１はｐＮＡＧ２ベクターの図式的な説明である。 図２は（ＡＴＣＣ＃２０９２７６として寄託された）ｐＳＵＮ２７ベクターを示す図である。 図３は（ｐＳＵＮ２８の指定でＡＴＣＣ＃２０３１８６として寄託された）好ましい二重特異性融合分子である、ｐＢＩＳＰ／Ｄ０１１．１０及びｐＢＩＳＰ／１４９をコードするベクターの領域を示す図である。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃは、２６４一本鎖ＴＣＲ（２６４ ｓｃ−ＴＣＲ）（配列番号２）のアミノ酸及び核酸配列を示す図である。Ｖａ３＝ＴＣＲ Vα３鎖ドメイン（アミノ酸６１−３９９）、リンカー配列（アミノ酸４００−４７１）、Ｖｂ３＝ＴＣＲ Vβ３ドメイン（アミノ酸４７２−８１３）、Ｃｂ＝ＴＣＲ Ｃβドメイン（アミノ酸４７２−８１３）である。 図５は２６４ＴＣＲの任意のＣαドメイン（配列番号３）を示す図である。

Claims (38)

1. Ｖα鎖とＶβ鎖を含み、ＭＨＣ分子とのかかわりあいにおいてｐ５３ペプチドと結合できる単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
2. ｐ５３ペプチドが以下のアミノ酸配列：Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ（配列番号１）を含むものである、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
3. ＭＨＣ分子がＨＬＡ分子を含むものである、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
4. ＨＬＡ分子がＨＬＡ Ａ２．１を含むものである、請求項３に記載の単離されたＴＣＲ。
5. α鎖が、ａ）Ｖα鎖及びｂ）Ｃα鎖が順に共有結合しているものを含む、請求項１−４のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
6. β鎖が、ａ）Ｖβ鎖及びＣβ配列を順に共有結合しているものを含む、請求項１−５のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
7. 配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドとの複合体であるＭＨＣ分子への、ＴＣＲの結合をモニターすることにより結合を決定する、請求項１−６のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
8. 結合が、ＴＣＲ ＥＬＩＳＡあるいは標準的なＴＣＲ結合アッセイでモニターされる、請求項７に記載の単離されたＴＣＲ。
9. 結合が、ＴＣＲによるシグナル伝達を測定することによりモニターされる、請求項７に記載の単離されたＴＣＲ。
10. アミノ酸配列とＴＣＲ分子間の結合が、対照のＴＣＲヘテロダイマーと比較して少なくとも約２倍増加している、請求項７−９のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
11. アミノ酸配列とＴＣＲヘテロダイマー間の結合が、対照のＴＣＲヘテロダイマーと比較して少なくとも約１０％増加している、請求項７−９のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
12. Ｖａ鎖が図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶα３鎖と少なくとも９０％同一である、請求項１−１１のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
13. Ｖβ鎖が図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶβ３鎖と少なくとも約９０％アミノ酸配列が同一である、請求項１−１２のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
14. 図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＣβ鎖と少なくとも約９０％アミノ酸配列が同一であるＣβ配列をさらに含む、請求項１−１３のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
15. Ｃα鎖が図５（配列番号３）で示されるＣα鎖と少なくとも約９０％アミノ酸配列が同一である、請求項１−１４のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
16. ＴＣＲがヘテロダイマーを含むものである、請求項１−１５のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
17. ＴＣＲが一本鎖ＴＣＲを含むものである、請求項１−１６のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
18. Ｖα鎖がペプチドリンカー配列によりＶβ鎖に共有結合している、請求項１７に記載の単離された一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）。
19. ｓｃ−ＴＣＲが膜貫通ドメインを含むものである、請求項１７及び１８のいずれかに記載のｓｃ−ＴＣＲ。
20. ｓｃ−ＴＣＲが細胞質シグナルドメインを含むものである、請求項１７−１９のいずれかに記載のｓｃ−ＴＣＲ。
21. ｓｃ−ＴＣＲが、１）図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶα３鎖、２）ペプチドリンカー、３）図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶβ３鎖を順に含むものである、請求項１７−２０のいずれかに記載のｓｃＴＣＲ。
22. Ｖβ３鎖のＣ末端に結合した、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）に記載のＣβ鎖をさらに含む、請求項２１に記載のｓｃ−ＴＣＲ。
23. 図５（配列番号３）で示されるＣα鎖の断片をさらに含み、その断片がＶα鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端の間に共有結合されたものである、請求項２１及び２２のいずれかに記載のｓｃ−ＴＣＲ。
24. ペプチドリンカーが以下の配列：Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ（配列番号５）を少なくとも4回繰り返したものである、請求項２１−２３のいずれかに記載のｓｃ−ＴＣＲ。
25. 請求項１−２４のいずれかに記載のＴＣＲをコードする単離された核酸。
26. 請求項２５に記載の核酸を含むベクター。
27. 請求項２５に記載の単離された核酸または請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
28. 第一のＤＮＡセグメントがＶα鎖をコードし、第２のＤＮＡセグメントがＶβ鎖をコードするものである、請求項１６に記載のヘテロダイマーをコードするＤＮＡセグメント対。
29. コードされたＶα鎖が、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶα３鎖とアミノ酸配列が少なくとも約９０％同一である、請求項２８に記載のＤＮＡセグメント対。
30. コードされたＶβ鎖が、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＶβ３鎖とアミノ酸配列が少なくとも約９０％同一である、請求項２８及び２９のいずれかに記載のＤＮＡセグメント対。
31. 第２のセグメントがさらに、図４Ａ−Ｃ（配列番号２）で示されるＣβ鎖とアミノ酸配列が少なくとも約９０％同一であるＣβ鎖をコードし、コードされたＶβ鎖のＣ末端がコードされたＣβ鎖のＣ末端に結合している、請求項２８−３０のいずれかに記載のＤＮＡセグメント対。
32. 細胞あるいは組織を、請求項１−２４のいずれかに記載のＴＣＲと接触させることを含む、ｐ５３を発現する細胞あるいは組織を同定する方法。
33. 細胞あるいは組織を、請求項２７に記載の細胞と接触させることを含む、ｐ５３を発現する細胞あるいは組織を同定する方法。
34. 細胞を、請求項２７に記載の細胞と接触させることを含む、ＭＨＣ分子とのかかわりあいでｐ５３ペプチドを発現する細胞を殺傷する方法。
35. ＭＨＣ分子と請求項２７に記載の細胞で発現されるＴＣＲ間の免疫複合体を形成させることをさらに含むものである、請求項３４に記載の方法。
36. 細胞を殺傷するのに十分な免疫応答の誘導をさらに含むものである、請求項３５に記載の方法。
37. ガンがｐ５３のアップレギュレーションにより特徴づけられるものである、請求項１−２４のいずれかに記載のＴＣＲの治療における有効量を哺乳動物に投与することを含む、ガンの治療方法。
38. 請求項２７に記載の細胞の治療における有効量を哺乳動物に投与することを含む、ガンの治療方法。
    

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