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JP2005514912A - 乳がんに関連する核酸およびポリペプチドならびにその使用 - Google Patents

乳がんに関連する核酸およびポリペプチドならびにその使用 Download PDF

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JP2005514912A JP2003523489A JP2003523489A JP2005514912A JP 2005514912 A JP2005514912 A JP 2005514912A JP 2003523489 A JP2003523489 A JP 2003523489A JP 2003523489 A JP2003523489 A JP 2003523489A JP 2005514912 A JP2005514912 A JP 2005514912A
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Griffith University
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Abstract

本発明は、Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を仲介するＧ３ＢＰ−２の単離ドメインおよびこれをコードする核酸に関する。さらに本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて乳がんを検出、治療または予防するために、Ｇ３ＢＰ−２の核酸および／またはコードされたポリペプチドまたはその断片を使用する工程を含む、乳がんを診断、治療および予防する方法に関する。特定の１形態では、本発明は、Ｇ３ＢＰ−２またはその断片を提示しうる抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞に関する。さらに本発明は、Ｇ３ＢＰ−２抗原特異的なリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球にも関する。

Description

本発明は、Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を仲介するＧ３ＢＰ−２の単離ドメインおよびこれをコードする核酸に関する。より詳細には、哺乳動物での乳がんを検出、治療または予防するためにＧ３ＢＰ−２をコードする核酸および／またはコードされたポリペプチドを使用する工程を含む、乳がんを診断、治療および予防する方法に関する。
ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＳＨ３−ドメイン結合タンパク質（Ｇ３ＢＰ）は、ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、ｒａｓ−ＧＡＰ１２０に特異的に結合することが判明しているＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するタンパク質ファミリーである（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年；ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）。さらに、このタンパク質ファミリーは、ｃ−ｍｙｃ転写物に対してＲＮＡアーゼ活性を有し得る（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら、１９９８年）ＲＮＡ結合タンパク質である（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）ことが判明している。ｒａｓ−ＧＡＰシグナル経路およびｃ−ｍｙｃはいずれも、発がん活性に関与している（ボス（Ｂｏｓ）、１９８９年；ファッチーニ（Ｆａｃｃｈｉｎｉ）およびペン（Ｐｅｎｎ）、１９９８年）。提示されている証拠から、Ｇ３ＢＰタンパク質ファミリーは、前述の経路の構成成分を利用してｍＲＮＡの安定性を調節し、これらの経路を介して発がん性のシグナルまたは因子を調節しうる新規なシグナル伝達メカニズムのメンバーであることが示唆されている。これらの活性は、そのＳＨ３ドメイン結合活性（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）、そのＲＮＡアーゼ活性（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら、１９９８年）またはそのヘリカーゼ活性（コスタ（Ｃｏｓｔａ）ら、１９９９年）を介して変調されうる。Ｇ３ＢＰは近年、一部のがんにおいて転写レベルで上方制御される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが判明している（ギタード（Ｇｕｉｔａｒｄ）ら、２００１年）。
がん遺伝子ｒａｓを正および負に制御することに関係するので、ｒａｓＧＡＰ１２０はシグナル伝達の重要な調節物質である（ポメランス（Ｐｏｍｅｒａｎｃｅ）ら、１９９６年）。ｒａｓＧＡＰ１２０自体がＧＴＰ結合型ｒａｓの加水分解を刺激し（総説：トッケ（Ｔｏｃｑｕｅ）ら、１９９７年）、それによりｒａｓの活性を調節する。ｒａｓＧＡＰ１２０のアミノ末端は、エフェクター様活性に関与している（ダッヘンスン（Ｄｕｃｈｅｎｓｎｅ）ら、１９９３年）Ｓｃｒホモロジー（ＳＨ３）ドメインを含む（トッケ（Ｔｏｃｑｕｅ）ら、１９９７年）。
ｒａｓＧＡＰ１２０のカルボキシ末端ドメインに対して作製された抗体を用いたｒａｓＧＡＰ１２０との免疫共沈降により、ヒトＧ３ＢＰ−１が初めて同定された（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）。Ｇ３ＢＰは、ｒａｓＧＡＰ１２０ＳＨ３ドメインに結合することが示された最初のタンパク質であったが、その後他のｒａｓＧＡＰ１２０ＳＨ３結合タンパク質が報告されており、該タンパク質には１４ｋＤａタンパク質（ヒュー（Ｈｕ）およびセトルマン（Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ） １９９７年）およびハンチンチンタンパク質（リウ（Ｌｉｕ）ら、１９９７年）が含まれる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａでの遺伝学的研究は、ｒａｓシグナル伝達でのＧ３ＢＰの役割を支持している（パズマン（Ｐａｚｍａｎ）ら、２０００年）。
本発明者らは以前に、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）含有タンパク質に関する一般的なスクリーニングの一部として、マウスＧ３ＢＰ−２をクローン化および配列決定した（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）。Ｇ３ＢＰの一次配列分析からも、Ｇ３ＢＰがＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）（ナガイ（Ｎａｇａｉ）ら、１９９５年）、ＲＧＧドメ
イン（バード（Ｂｕｒｄ）およびドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ） １９９４；シオミ（Ｓｉｏｍｉ）およびドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ） １９９７）および核移行因子２様（ＮＴＦ２様（ＮＴＦ２‐ｌｉｋｅ））ドメイン（スヤマ（Ｓｕｙａｍａ）ら、２０００年）を含むことが示された。Ｇ３ＢＰ中のＲＲＭについて提示された構造は、他でも報告されている（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７）。Ｇ３ＢＰは酸リッチドメイン（ａｃｉｄ‐ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）およびＲＧＧドメインも含むが、これらのドメインはたいていＲＲＭタイプのＲＮＡ結合タンパク質の補助ドメインと考えられている（バード（Ｂｕｒｄ）およびドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ） １９９４年；シオミ（Ｓｉｏｍｉ）およびドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ） １９９７年）。これらの構造モチーフは、Ｇ３ＢＰ−１がｃ−ｍｙｃ転写物の切断因子としてインビトロで作用することによりＲＮＡ代謝に関与するとみなされた最近の発見と一致している（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら １９９８年）。
ＮＴＦ２ポリペプチドは、ポリペプチドの核移行に関与しており、細胞質中でＲａｎＧＤＰに結合することにより促進されるようである。ＮＴＦ２／ＲａｎＧＤＰが移行対象物に結合すると、この複合体は核に取り込まれ、そこで対象物が分離され、Ｒａｎヌクレオチド交換因子ＲＣＣ１がＲａｎＧＤＰをＲａｎＧＴＰに換える。このシグナルによりＮＴＦ２は細胞質へと送り出され、細胞質ではＲａｎＧＴＰがＲａｎＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）により加水分解されてこの系が元に戻る（総説：マカラ（Ｍａｃａｒａ） １９９９年）。Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインは、Ｇ３ＢＰ−２を核膜へと向けることが可能であるが、この活性に関するメカニズムは不明である（プリジェント（Ｐｒｉｇｅｎｔ）ら、２０００年）。
ＲＮＡプロセッシングは、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング、ＲＮＡ移行およびＲＮＡ安定性を介して制御される細胞代謝に必須の部分である（ドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）ら、１９９６年）。ＲＮＡ代謝の調節は、発生において重要な役割を果たすことが判明している。近年、ＲＮＡ結合タンパク質により仲介されるｍＲＮＡ翻訳の制御、特に、伸長因子に影響を及ぼす５’ＵＴＲ相互作用（スヴィトキン（Ｓｖｉｔｋｉｎ）ら、１９９６年）、ならびに翻訳活性（ドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）ら、１９９６年）および分解（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら １９９８年）に関与する３’相互作用における上記タンパク質の役割に対する興味が高まっている。ＲＮＡ結合タンパク質が伝達カスケードを介して環境および発生シグナルに応答しうるメカニズムを解析することが、ヒトの疾患でのその役割を理解するためには重要である。
ＳＨ３ドメインは、Ｓｒｃ、ＦｙｎおよびＧｒｂならびにｒａｓＧＡＰ１２０などのシグナル伝達タンパク質において初めに特性解析された。通常、これらのドメインは、ＰｘｘＰの最小コンセンサスを有するプロリンリッチモチーフと相互作用する（ウルクハート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、２０００年および本明細書に引用されている文献）。Ｇ３ＢＰ−２のＲＮＡ結合ドメインでもなく、ＮＴＦ２様ドメインでもなく、酸性ドメインおよびＰｘｘＰドメインが、ＩκＢαへの結合を仲介するに十分であることも判明している（プリジェント（Ｐｒｉｇｅｎｔ）ら、２０００年）。ヒトＧ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂという二者択一的にスプライシングされた相同体の一次配列の分析により、これらがそれぞれ５個および６個の潜在的な最小ＳＨ３ドメイン結合モチーフを含むことが明らかである（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９６年）。Ｇ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂはＰｘｘＰ配列を含むので、これらのプロリンリッチモチーフはポリペプチドのＳＨ３ドメインと結合するのであろうと予測された。
乳がんの早期診断（スクリーニングマンモグラフィ）および治療（補助療法）において
は、大きな進歩が達成されており、このことはこの疾患による死亡率の著しい減少に反映されている（クレボフスキー（Ｃｈｌｅｂｏｗｓｋｉ）、２００２年）。しかしながら、乳がんは未だに、１９９９年にオーストラリアで診断されたがんの２６％を占めており、１９９６年には、９５５６例の新たな症例が診断され、２６１９人が死亡している（（ＡＩＨＷ）、１９９９年）。この疾患をより良好に管理するための付加的で重要なインプットは、乳がんを発症するリスクを有する女性の割合（１０％）を予測可能とする遺伝的素因マーカーＢＲＣＡ１及び２（総説：ナサンソン（Ｎａｔｈａｎｓｏｎ）ら、２００１年）の特性解析であった。現在利用可能な補助療法（プリッチャード（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ）、２００２年）の選択肢の減少とその使用に関連するリスクとを考慮すると、この疾患の初期段階にあり、かつ／または比較的高い遺伝的リスクを有するヒトでのこの疾患の進展を予防することができる新規な方策が緊急に必要とされている。
Ｇ３ＢＰがＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインに結合することは判明していたが、本発明者らは、この結合がＧ３ＢＰのＮ末端ＮＴＦ２様ドメインを介して仲介されており、従来示唆されていたようにＧ３ＢＰ−２内に含まれるプロリンリッチモチーフ（ＰｘｘＰ）により促進されるのではないことを意外にも発見した。ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインに結合しうる最小のＧ３ＢＰ短縮タンパク質は、通常はＳＨ３結合に関連して予測されるＰｘｘＰモチーフをまったく含まなかった。この予測外の結果は、Ｇ３ＢＰのＮ末端ＮＴＦ２様ドメインがＮ末端ｒａｓＧＡＰ１２０との結合相互作用を担うことを明らかに示していた。この発見により、乳がんを診断、治療または予防するための潜在的薬剤を同定および製造するための、本明細書に記載のＧ３ＢＰ、特にそのＮＴＦ２様ドメインの新規の使用がもたらされた。
第１の態様では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメインを含み、前記ＮＴＦ２様ドメインを介して他のタンパク質に結合することが可能であり、完全長Ｇ３ＢＰ−１でも完全長Ｇ３ＢＰ−２でもない単離タンパク質を提供する。
ＮＴＦ２様ドメインは、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインであることが好ましい。
他のタンパク質は、ｒａｎ核膜孔ポリペプチド、ユビキチンヒドロラーゼおよびＧＡＰ１２０からなる群から選択されることが好ましい。
さらに好ましくは、ユビキチンヒドロラーゼはＯＤＥ１である。
ＮＴＦ２様ドメインは、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５に記載されているアミノ酸残基１〜１４６によりコードされることが好ましく、ここでアミノ酸残基１は開始メチオニン（Ｍ）である。
第２の態様では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメインを有するタンパク質と、ｒａｎ核膜孔ポリペプチド、ユビキチンヒドロラーゼおよびＧＡＰ１２０からなる群から選択される他のタンパク質とを含む単離タンパク質複合体を提供する。
第３の態様では、本発明は、動物において免疫応答を誘発可能な、その断片、相同体、変異体または誘導体を含めた単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質を提供する。
好ましくは、前記動物はヒトである。
好ましくは、Ｇ３ＢＰ−２断片は、
（ｉ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］；
（ｉｉ）ＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］および
（ｉｉｉ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
からなる群から選択される。
第４の態様では、本発明は、
（ａ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］；
（ｂ）ＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］および
（ｃ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
からなる群から選択される単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片を提供する。
第５の態様では、本発明は、その断片、相同体、変異体および誘導体を含めた第１の態様のタンパク質であって各々前記ＮＴＦ２様ドメインにより他のタンパク質に結合可能なタンパク質をコードする単離核酸を提供する。
１形態では、この単離核酸は配列番号：５に記載されているＮＴＦ２様ドメインを含むタンパク質をコードし、ここで、前記ＮＴＦ２様ドメインはアミノ酸残基１〜１４６によりコードされ、アミノ酸残基１は開始メチオニン（Ｍ）である。
別の形態では、単離核酸は配列番号：４に記載されている配列のヌクレオチド２３９〜６７６を含む。
第６の態様では、本発明は、第４の態様のＧ３ＢＰ−２タンパク質断片をコードする単離核酸を提供する。
第７の態様では、本発明は、前記態様のいずれか１態様の核酸を含む発現ベクターを提供する。
第８の態様では、本発明は、Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を阻止または妨害するためにアンタゴニストを使用することに関する。
１形態では、第８の態様のアンタゴニストは、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと前記他のタンパク質との結合を阻止または妨害する。
別の形態では、該アンタゴニストはＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインの模倣物質（ｍｉｍｅｔｉｃ）である。
さらに他の形態では、該アンタゴニストはＮＴＦ２様ドメインに結合する。
該アンタゴニストは、タンパク質であってもよい。
１形態では、タンパク質はＳｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインを含む。
該タンパク質は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
該アンタゴニストは、非ペプチド化合物であってもよい。
第９の態様では、本発明は、Ｇ３ＢＰ−２タンパク質、その断片、相同体、変異体または誘導体と予め接触させた単離抗原提示細胞を提供するが、ここで接触とは、抗原提示細胞をＧ３ＢＰ−２タンパク質、その断片、相同体、変異体または誘導体でパルス処理または装荷（ｌｏａｄ）することを含む。
第１０の態様では、本発明は、その断片、相同体、変異体または誘導体を含めたＧ３ＢＰ−２タンパク質をコードする核酸でトランスフェクションされている単離抗原提示細胞を提供する。
第９および第１０の態様の単離抗原提示細胞は樹状細胞であることが好ましい。
第９および第１０の態様の、断片、相同体、変異体および誘導体を含めた前記Ｇ３ＢＰ−２タンパク質は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
第９および第１０の態様のＧ３ＢＰ−２断片は、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］
およびＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
第１１の態様では、本発明は、Ｇ３ＢＰ−２抗原特異的な単離リンパ球を提供する。
単離リンパ球は、細胞傷害性Ｔリンパ球であることが好ましい。
その断片、相同体、変異体および誘導体を含めたタンパク質であって配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に対して、リンパ球がＧ３ＢＰ−２抗原特異的であることが好ましい。
Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片は、配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
第１２の態様では、本発明は、前記態様のいずれか１態様に記載のタンパク質、核酸または単離細胞からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含有する薬剤組成物を提供する。
第１３の態様では、本発明は、哺乳動物での乳がんを予防または治療する方法であって、前記態様のいずれか１態様に記載のタンパク質、核酸、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインの模倣物質、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと他のタンパク質との結合を阻止または妨害するアンタゴニスト、または単離細胞からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含有する薬剤組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
該哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
第１４の態様では、本発明は、Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を阻止または妨害する活性物質を、動物または単離細胞に投与する工程を含む、細胞増殖を変調する方法を提供する。
該動物は、ヒトであることが好ましい。
第１５の態様では、本発明は、試料中の１つまたは複数の候補がＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと結合するかどうかを決定する工程を含む、Ｇ３ＢＰ−２と結合する分子を単離する方法を提供する。
１形態では、該分子はアンタゴニストである。
アンタゴニストは、タンパク質または非タンパク質分子であってもよい。
第１６の態様では、本発明は、哺乳動物の乳がんを診断する方法であって、該哺乳動物から得られた試験試料中のＧ３ＢＰ−２タンパク質の発現と参照試料中のＧ３ＢＰ−２とを比較する工程を含み、試験試料でのＧ３ＢＰ−２の発現が参照試料とは異なる場合に、該哺乳動物が乳がんを有する可能性が高いと診断することを特徴とする方法を提供する。
抗体を使用して、Ｇ３ＢＰ−２タンパク質の発現を検出することが可能である。
該抗体は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む、その断片、相同体、変異体および誘導体を含めたＧ３ＢＰ−２タンパク質に結合することが可能である。
１形態では、抗体は、アミノ酸配列ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］を含むＧ３ＢＰ−２タンパク質断片に結合する。
Ｇ３ＢＰ−２断片は、ＮＴＦ２様ドメインを含んでもよい。
哺乳動物はヒトであることが好ましい。
第１７の態様では、本発明は、哺乳動物から得られた試験試料中で、Ｇ３ＢＰ−２核酸またはその断片を検出する工程を含む、該哺乳動物での乳がんを診断する方法を提供する。
試験試料は乳房組織であることが好ましい。
哺乳動物はヒトであることが好ましい。
第１８の態様では、本発明は乳がんに対して哺乳動物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に、
（１）Ｇ３ＢＰ−２タンパク質；
（２）（１）の断片、相同体、変異体または誘導体；
（３）Ｇ３ＢＰ−２核酸；
（４）（３）の断片、相同体、変異体または誘導体；
（５）予め（１）または（２）と接触させた単離抗原提示細胞；および
（６）予め（３）または（４）の核酸でトランスフェクションした単離抗原提示細胞
からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含む免疫原性剤を投与する工程を含む方法を提供する。
免疫化は、予防的なものでも、乳がんを有する動物の治療としてであってもよい。
Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片は、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］およびＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］からなる群から選択することが好ましい。
抗原提示細胞は樹状細胞であることが好ましい。
哺乳動物はヒトであることが好ましい。
本発明の前記態様による単離タンパク質および核酸ならびに方法は、乳がんの治療的処置または予防的処置ならびにその診断で使用することができる。下記でさらに詳述するように、Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質または内在性結合相手との相互作用の妨害により、腫瘍の増殖を阻害することができる。
（定義）
別途定義しないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の通常の専門家に一般的に理解される意味を有する。本願明細書に記載されている方法および材料と同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明のために、次の用語を、下記で定義する。
本発明では、「単離（された）」とは、その本来の状態から取り出されているか、もしくは人為的に操作された材料を意味する。単離された材料は、自然な状態では通常伴う成分を実質的または本質的に含まなくてもよく、あるいは自然な状態で通常伴う成分と共に人工的な状態にあるように操作されていてもよい。単離された材料には、天然型および組換え型の材料が含まれる。例えば、Ｇ３ＢＰ−２核酸およびコードされたポリペプチド（ヒトから単離されたＨｓａＧ３ＢＰ−２ａ、ＨｓａＧ３ＢＰ−２ｂ；マウスから単離されたＭｍｕＧ３ＢＰ−２ａおよびＭｍｕＧ３ＢＰ−２ｂを含む）がそれぞれヒトおよびマウスから単離されている。
「内在性」核酸またはポリペプチドとは、天然の細胞、組織または動物中で単離またはその他の状態で見いだされうる核酸またはポリペプチドを意味する。
（ポリペプチドまたはタンパク質）
「ポリペプチド」は「タンパク質」をも意味し、どちらの用語も、当技術分野でよく理解されるように、天然および／または非天然アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを指す。例えば、Ｇ３ＢＰ−２はタンパク質ともポリペプチドともいうことができる。「タンパク質」は、ペプチド、ポリペプチドまたはこれらの断片を指し得る。「Ｇ３ＢＰ−２」タンパク質は、特定のアイソフォームに言及しない限り、Ｇ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂ
および他のすべてのアイソフォームを含めたＧ３ＢＰ−２アイソフォームを包含する。
「ペプチド」とは、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
１実施形態では、「断片」とは、前記ポリペプチドの１００％未満だが少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％を構成するアミノ酸配列を含む。
断片は、所定のポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性を維持している「生物活性断片」を含むことも可能である。例えば、Ｇ３ＢＰ−２の生物活性断片は、ＳＨ３ドメインとの結合に関与するＮＴＦ２様断片を含む。ＮＴＦ２様ドメインは、図１に示されているアミノ酸残基１〜１４６を含む。当然のことであるが、この断片は、天然または組換えいずれかのポリペプチドまたはペプチドに由来しうる。生物活性断片は、ポリペプチドまたはペプチド全体の生物活性の少なくとも１％より多くを、好ましくは生物活性の少なくとも１０％より多くを、さらに好ましくは生物活性の少なくとも２５％より多くを、さらにいっそう好ましくは生物活性の少なくとも５０％より多くを構成している。
他の実施形態では、「断片」は、１個又は複数の抗原決定基またはエピトープを含む、例えば長さが少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２０アミノ酸からなる小さなペプチドである。複数のペプチドを含む比較的大きな断片も想到され、これらを標準的な組換え核酸技法の適用により得ることも、慣用の液相または固相合成技法を使用して合成することも可能である。例えば、ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ）編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ出版の「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題された刊行物に含まれている第９章「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）およびシェファード（Ｓｈｅｐｈａｒｄ）著）などに記載されている液合成または固相合成を参照することが可能である。代替例として、適切なプロテイナーゼを用いて本発明のポリペプチドを消化することにより、ペプチドを製造することも可能である。消化された断片を、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技法により精製することが可能である。
１形態では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメインを含むタンパク質を提供する。「含む」という用語は、ＮＴＦ２様ドメインおよび任意の追加アミノ酸配列を少なくとも有するタンパク質を指す。
別の形態では、本発明は、本質的にＮＴＦ２様ドメインから構成されるタンパク質を提供する。タンパク質に関しての「本質的に〜から構成される」という用語は、前記タンパク質の所定の一部分（例えばＮＴＦ２様ドメイン）以外に、該タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に位置する３０個以下の追加アミノ酸から構成されるタンパク質に関する。該タンパク質は、２０個以下の追加アミノ酸から構成されることが好ましい。さらに好ましくは、該タンパク質は１〜１０個のアミノ酸から構成される。追加アミノ酸または「付加物」は、融合タンパク質、例えば、後述するようなＧＳＴおよび（６×−ＨＩＳ）−タグを含む当技術分野でよく知られている融合タンパク質を含みうる。
別の形態では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメイン「から構成される」タンパク質を提供する。これは、ＮＴＦ２様ドメインのみのアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。
ＮＴＦ２様ドメインは、アミノ酸残基１〜１４６について示している配列番号：５に記載されており、ここでアミノ酸残基１は開始メチオニン（Ｍ）である。
本明細書中で使用する場合、「変異体」ポリペプチドとは、１個又は複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されている本発明のポリペプチドである。当技術分野では当然のこ
とであるが、ポリペプチドの活性の性質を変えることなく、いくつかのアミノ酸を、ほぼ類似の特性を有する他のアミノ酸に代えることが可能である（保存的置換）。ポリペプチドの保存的置換の例は、表１（図１２）に従い実施することが可能である。
表１（図１２）に示されている置換よりも保存的でない置換基を選択すると、機能が実質的に変化する。他の置き換えは、非保存的置換であろうし、これらのうち比較的少数しか許容され得ない。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化を与えるような置換とは、（ａ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）を、疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）に（で）置換する；（ｂ）システインまたはプロリンを、他の何らかの残基に（で）置換する；（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）を、電気的に陰性の残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に（で）置換する、または（ｄ）嵩高な側鎖を有する残基（例えば、ＰｈｅまたはＴｒｐ）を、より小さい側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）か、側鎖のない残基（例えば、Ｇｌｙ）に（で）置換するような置換である。
（ポリペプチドおよび核酸配列の比較）
個々の核酸とポリペプチドとの配列の関係を記載するために本願明細書中で使用される用語には、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一率」および「実質的同一性」が含まれる。個々の核酸／ポリペプチドはそれぞれ、（１）該核酸／ポリペプチドにより共有される、完全な核酸／ポリペプチド配列のうちの唯一または複数の部分、ならびに（２）核酸／ポリペプチド間で異なる１つまたは複数の部分を含みうるので、配列比較は通常、配列類似性の局所領域を同定および比較するために「比較ウィンドウ」上で配列を比較することにより行う。「比較ウィンドウ」とは、参照配列と比較される通常少なくとも６個の連続残基からなる概念的なセグメントのことである。比較ウィンドウは、個々の配列を最適に整列させた状態で、参照配列（付加または欠失がない）に比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を有してよい。比較ウィンドウの位置を決めるための配列の最適な整列は、コンピュータを用いたアルゴリズム（例えば、本願明細書に援用される、ＷｅｂＡｎｇｉｓ ＧＣＧにより提供されるＥＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＢＥＳＴＦＩＴ、２Ｄ Ａｎｇｉｓ、ＧＣＧならびにＧｅｎｅＤｏｃの各プログラム）の実行によって、または、検証および選択される様々な方法のいずれかによりもたらされる最良の整列（すなわち、比較ウィンドウについての相同性を最も高くする）により実施可能である。
ＥＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを使用して、複数の配列を整列する。このプログラムは、トンプソン、ジェイ．ディ．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．）、ヒギンス、ディ．ジー．（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．）およびギブソン、ティ．ジェイ．（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．）（１９９４）による方法に従い、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の多重整列を算出する。これは、ＥＧＣＧに含めるために修正した、オリジナルの配布プログラムＣｌｕｓｔａｌＷの一部である。ＢＥＳＴＦＩＴプログラムは、順方向および逆方向の配列ならびに反復配列を整列させる。このプログラムは、２つの配列間の相同性について最良のセグメントが生じる最適な整列を作成する。スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の局所的相同性アルゴリズムを使用して整合数が最大化となるようにギャップを挿入することにより、最適な整列が決定される。ＥＣＬＵＳＴＡＬＷおよびＢＥＳＴＦＩＴ整列パッケージは、ＷｅｂＡＮＧＩＳ ＧＣＧ（オーストラリア国、Ｎ．Ｓ．Ｗ．２００６、シドニー大学内、ＪＯ３ビルディングに所在のオーストラリアゲノム情報センター（Ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｃｅｎｔｒｅ））で提供されている。
例えば、本願明細書に援用されるアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２５巻、第３３８９頁に開示されているプログラムの
ＢＬＡＳＴファミリーを参照することも可能である。
配列分析の詳細な検討については、前記オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの１９．３章に見出すことが可能である。
本願明細書中では、「配列同一性」との用語を、比較ウィンドウ上で配列が同一である程度を考慮しつつ、標準的なアルゴリズムによる適切な整列に関してヌクレオチドまたはアミノ酸の正確な一致の数を含むように、その最も広い意味で使用する。したがって、比較ウィンドウ上で最適に整列された２つの配列を比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が生じている位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一率を得ることにより、「配列同一率」を算出する。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン２．５、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在の日立ソフトウェアエンジニアリング社（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））により算出される「配列の一致率」を意味すると解してもよい。
通常、本願明細書中で使用する場合、「相同体」は、それが相同体でありうる場合には、本発明の核酸またはポリペプチドとの間に規定可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列の関係を共有する。
「ポリペプチド相同体」とは、前記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する。ポリペプチド相同体には例えばＧ３ＢＰ−１が含まれる。さらに、Ｇ３ＢＰ−２アイソフォームＧ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂも含まれる。
他の生物から単離された、機能的に関連のあるポリペプチドおよびそれらをコードする核酸である「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、相同体の範囲に含まれる。例えば、ヒトから単離されたＧ３ＢＰ−２ポリペプチド（例えば、ＨｓａＧ３ＢＰ−２ａ、ＨｓａＧ３ＢＰ−２ｂ）およびマウスから単離されたＧ３ＢＰ−２ポリペプチド（例えば、ＭｍｕＧ３ＢＰ−２ａ、ＭｍｕＧ３ＢＰ−２ｂ）である。
ポリペプチド変異体に関しては、ポリペプチドに突然変異を誘発するか、またはコードする核酸に突然変異を誘発することにより、例えばランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発により、生じさせることが可能である。核酸突然変異誘発法の例は、本願明細書に援用される前記の「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら）の第９章に提示されている。
当業者には当然のことであるが、生物活性に寄与するアミノ酸残基についての知見を利用可能な場合に部位特異的突然変異誘発を行うことが最良である。多くの場合、そのような情報は入手不可能であるか、あるいは、例えば分子モデリング近似により推測するしかない。
このような場合には、ランダム突然変異誘発が実施される。ランダム突然変異誘発法には、ヒドロキシルアミンによるタンパク質の化学修飾（ルアン（Ｒｕａｎ）ら、１９９７年、Ｇｅｎｅ、第１８８巻、第３５頁）、核酸へのｄＮＴＰ類似体の導入（ザッコロ（Ｚａｃｃｏｌｏ）ら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５５巻、第５８９頁）および、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、第１０７４７頁またはシャフィカニ（Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ）ら、
１９９７年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２３巻、第３０４頁に記載されているようなＰＣＲを使用したランダム突然変異誘発が含まれる（引用文献はそれぞれ本願明細書に援用される）。ＰＣＲを使用したランダム突然変異誘発キット、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標）キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））が市販されていることも特記する。
本願明細書で使用する場合、「誘導体」ポリペプチドは、例えば他の化学的成分と結合または縮合することにより、あるいは当技術分野で理解されるような翻訳後修飾技法により変更された本発明のポリペプチドである。このような誘導体には、本発明のポリペプチドまたはこれらの変異体へのアミノ酸の欠失および／または付加物が含まれる。
アミノ酸の「付加物」には、ペプチドまたはポリペプチドまたはその変異体と他のペプチドまたはポリペプチドとの融合物が含まれうる。このようなペプチドの具体例には、「タグ」として使用するために加えられたアミノ（Ｎ）およびカルボキシル（Ｃ）末端アミノ酸が含まれる。発現させた融合ポリペプチドを単離するためのＮ末端６×−Ｈｉｓタグの使用を、本願明細書中に記載する。
Ｎ末端およびＣ末端タグには、特異的基質に結合するか、既知の抗体、好ましくはモノクローナル抗体に結合する既知のアミノ酸配列が含まれる。ｐＲＳＥＴ Ｂベクター（ＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））は、ＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）樹脂に結合するＮ末端６Ｘ−Ｈｉｓタグを含むベクターの例である。
本発明により実施される他の誘導体には、側鎖の修飾、ペプチド又はポリペプチド合成時の非天然アミノ酸および／またはその誘導体の導入、ならびに架橋剤の使用および本発明のポリペプチド、断片および変異体に構造上の制約をもたらすその他の方法の使用が含まれる。本発明により実施される側鎖修飾の例には、無水酢酸を用いたアシル化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸無水物を用いたアミノ基のアシル化；メチルアセトイミデートを用いたアミジン化；シアン酸を用いたアミノ基のカルバモイル化；ピリドキサル−５−リン酸を用いたリジンのピリドキシル化に続くＮａＢＨ４を用いた還元；アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続くＮａＢＨ４を用いた還元；および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化などによるアミノ基の修飾が含まれる。
カルボキシル基を、Ｏ−アシルイソウレア生成を介したカルボジイミド活性化に続く誘導体化により、例えば、対応するアミドへと修飾してもよい。
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルなどの試薬を用いて複素環縮合産物を生じさせることにより修飾してもよい。
スルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を、システイン酸への過ギ酸酸化；４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、４−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀および他の水銀剤を使用する水銀誘導体の形成；他のチオール化合物を用いた混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；およびアルカリ性ｐＨでのシアン酸を用いたカルバモイル化などの方法によって修飾してもよい。
トリプトファン残基を、例えば２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドもしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化により、またはＮ−ブロモス
クシンイミドを用いた酸化により修飾してもよい。
チロシン残基を、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成させることにより修飾してもよい。
ヒスチジン残基のイミダゾール環を、ジエチルピロカルボン酸塩を用いたＮ−カルボエトキシ化により、またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化により修飾してもよい。
ペプチド合成時の非天然アミノ酸および誘導体の導入の例には、４−アミノ酪酸、６−アミノへキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が含まれる。
図１に例示されているもののような本発明に関連するポリペプチド（一般に断片、変異体、誘導体および相同体を含む）は、当技術分野の専門家に知られている任意の適切な手順により調製することが可能である。
例えば、ポリペプチドは、
（ｉ）１個又は複数の調節ヌクレオチド配列、例えばＴ７プロモーターに作動可能なように連結された本発明の組換え核酸を含む発現構築物を調製する工程と；
（ｉｉ）適切な宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）に発現構築物をトランスフェクションまたは形質転換する工程と；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞中でポリペプチドを発現させる工程と
を含む手順により調製することが可能である。
本発明の組換え核酸は、図１に示されているポリペプチドまたはその断片をコードすることが好ましい。
当業者は、市販のキット、例えば本願明細書に援用される、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）より入手可能な「ＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」を使用して、組換えタンパク質を簡単に発現させて精製することが可能である。代替例として、例えば、本願明細書に援用されるサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」（コールドスプリングハーバー出版、１９８９年）（特に第１６章および第１７章）；本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９５−１９９９）（特に第１０章および第１６章）；ならびに本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ社、１９９５−１９９９）（特に第１、５、６および７章）に記載されているような標準的な分子生物学プロトコルを使用してもよい。
（核酸）
本願明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＤＮＡを意味しており、ＤＮＡには、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。
本願明細書で使用される「単離（された）核酸」という用語は、インビトロで操作して自然には通常は見いだされない形態になっている核酸のことである。単離核酸には、天然
および組換え（非天然）核酸の両方が含まれる。例えば、ヒトまたはマウスから単離された核酸である。
「ポリヌクレオチド」とは、８０個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。
核酸に関連する「本質的に〜から構成される」との用語は、その５’および／または３’に位置するヌクレオチドが９０個以下である核酸に関する。核酸は、付加される核酸が６０個未満であることが好ましく、さらに好ましくは、核酸は１〜３０個のヌクレオチドからなる。
「プローブ」は、例えばノーザンブロット法またはサザンブロット法において相補配列を検出するために適切に標識された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってよい。
「プライマー」は通常、好ましくは２０〜５０個の連続したヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、相補的核酸「テンプレート」にアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用によりテンプレート依存的に伸長させることが可能である。例えば、次のプライマーを、ヒトＧ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２の染色体マッピングのために使用した。
ＨｓａＧ３ＢＰ−１特異的プライマー：
５’ＧＧＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ［配列番号：１２］；および
５’ＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧ［配列番号：１３］
ＨｓａＧ３ＢＰ−２特異的プライマー：
５’ＧＴＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＴＴＡＴ［配列番号：１４］；および
５’ＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＧ［配列番号：１５］。
宿主細胞で発現させるために、組換え核酸を、発現ベクター内の１つまたは複数の調節配列、例えばＴ７プロモーターに作動可能なように連結する。
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製する染色体外ベクターでも、宿主ゲノムに入り込むベクターでもよい。発現ベクターの例は、ｐＲＳＥＴ Ｂ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））およびその誘導体である。
「作動可能なように連結（された）」とは、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列が、本発明の組換え核酸に対して、転写を開始、調節、さもなければ制御するように配置されていることを意味している。
調節ヌクレオチド配列は、一般に発現のために使用される宿主細胞に適したものになるであろう。様々な宿主細胞に関する数多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、当技術分野では周知である。
通常、前記の１種または複数の調節ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むことが可能である。
当技術分野で知られている構成的または誘導性プロモーターが本発明により意図される。プロモーターは、天然に生じるプロモーター、複数のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。例えば、ｌａｃプロモーターはＩ
ＰＴＧにより誘導される。
発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子をさらに含むことも可能である。選択マーカー遺伝子は当技術分野ではよく知られており、使用される宿主細胞に応じて変わる。例えば、アンピシリンを含有する培地中で成長させて確実に形質転換された宿主細胞を選択するための、アンピシリン耐性遺伝子である。
発現ベクターは、本発明の組換えポリペプチドが融合相手との融合ポリペプチドとして発現されるように、融合相手（通常は、発現ベクターが提供）を含むことも可能である。融合相手の利点は、これらが融合ポリペプチドの同定および／または精製の助けとなることである。同定および／または精製には、融合相手、例えば６×−ＨｉｓタグまたはＧＳＴに対して特異的なモノクローナル抗体または基質を使用することが含まれうる。融合相手はさらに、組換えポリペプチドの分泌を指定するためのリーダー配列、例えば、α因子リーダー配列を含むことも可能である。
融合相手のよく知られている例には、ヘキサヒスチジン（６×−ＨＩＳ）−タグ、Ｎ−フラグ（Ｆｌａｇ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が含まれ、これらはアフィニティ（親和性）クロマトグラフィーにより融合ポリペプチドを単離するために特に有用である。アフィニティクロマトグラフィーによる融合ポリペプチド精製のために、アフィニティクロマトグラフィー用の適切なマトリックスには、それぞれニッケル結合またはコバルト結合樹脂、融合ポリペプチド特異抗体、グルタチオン結合樹脂およびアミロース結合樹脂がありうる。いくつかのマトリックスは、例えば６×−Ｈｉｓ融合ベクターおよびＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）樹脂を用いた精製を取り入れているＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）などの「キット」の形態で入手可能である。
融合ポリペプチドを発現させるためには、本発明の核酸を、融合相手と本発明のヌクレオチド配列との翻訳上の読み枠が一致するように発現ベクターに連結させることが必要である。
融合相手は、例えばエンテロキナーゼ（ＥｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅＭａｘ（登録商標）としてインビトロジェン社より入手可）、因子Ｘａまたはトロンビンなどのプロテアーゼの切断部位を有してもよく、該切断部位により、該当プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを消化して、その結果本発明の組換えポリペプチドを遊離させることができる。次いで、遊離されたポリペプチドを後続のクロマトグラフィーを用いた分離により融合相手から単離することが可能である。
融合相手はさらに、通常は短いペプチド配列であり該配列に対する特異抗体を利用可能な「エピトープタグ」をその範囲内に含んでもよい。
上記のように、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド相同体をコードする核酸を含有する発現構築物で形質転換された宿主細胞を培養することにより、本発明のポリペプチドを生じさせることが可能である。ポリペプチドの発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて変わることになる。例えば、所定の宿主細胞内でのポリペプチドの発現を成功または改善させるために、本発明のヌクレオチド配列を変更することが可能である。変更には、宿主細胞で優先されるコドン使用に応じてヌクレオチドを変えることが含まれる。代替例として、あるいは追加として、本発明のヌクレオチド配列を変更して宿主特異的なスプライシング部位を加えたり除いたりしてもよい。これらの変更は、当技術分野の専門家であれば確認することが可能である。
発現のための宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
有用な原核宿主細胞は、細菌である。
典型的な細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ株である。
有用な真核細胞は、酵母、本願明細書に記載されているバキュロウイルス発現系と共に使用可能なＳＦ９細胞、および他の哺乳動物細胞である。
当業者は、例えば、本願明細書に援用されるサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（コールドスプリングハーバー出版、１９８９年）（特に第１６章および第１７章）；本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１９９５−１９９９）（特に第１０章および第１６章）；ならびに本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ社、１９９５−１９９９）（特に第１、５および６章）に記載されているような標準的なプロトコルを使用して、組換えポリペプチドを簡単に調製することが可能である。
１実施形態では、核酸相同体は、その変異体、断片および誘導体を含めた本発明のポリペプチド相同体をコードする。
別の実施形態では、核酸相同体は、本発明の核酸と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
さらに別の実施形態では、核酸相同体は、少なくとも厳密度の低い条件下で、好ましくは少なくとも厳密度が中程度の条件下で、さらに好ましくは厳密度の高い条件下で本発明の核酸にハイブリダイズする。
「ハイブリダイズおよびハイブリダイゼーション」は、本願明細書では、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を対合させて、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生じさせることを意味するために使用する。相補的ヌクレオチド配列からなるハイブリッド配列は、塩基の対合を介して生じる。
ＤＮＡでは、相補的な塩基は
（ｉ）ＡとＴ；および
（ｉｉ）ＣとＧである。
ＲＮＡでは、相補的な塩基は
（ｉ）ＡとＵ；および
（ｉｉ）ＣとＧである。
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、相補的な塩基は
（ｉ）ＡとＵ；
（ｉｉ）ＡとＴ；および
（ｉｉｉ）ＧとＣである。
修飾プリン（例えば、イノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾ピリミジン（チオウリジンおよびメチルシトシン）も、塩基対合に関与しうる。
本願明細書で使用する場合の「厳密度」とは、ハイブリダイゼーション時の温度およびイオン強度の条件、ならびにある種の有機溶剤および／または界面活性剤の有無のことで
ある。厳密度が高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間で必要な相補性レベルが高くなる。
「厳密（ストリンジェント）な条件」とは、相補的塩基を高い頻度で有する核酸のみがハイブリダイズする条件を意味している。
本願明細書における厳密度の低い条件としては、
（ｉ）少なくとも約１％（ｖ／ｖ）から少なくとも約１５％（ｖ／ｖ）までのホルムアミドと、少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩で４２℃でハイブリダイゼーション、および、少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩で４２℃で洗浄；ならびに
（ｉｉ）１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でハイブリダイゼーション、および（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳで室温で洗浄
があり、包含される。
厳密度が中程度の条件としては、
（ｉ）少なくとも約１６％（ｖ／ｖ）から少なくとも約３０％（ｖ／ｖ）までのホルムアミドと、少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍまでの塩で４２℃でハイブリダイゼーション、および少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍまでの塩で４２℃で洗浄；ならびに
（ｉｉ）１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でハイブリダイゼーション、および（ａ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｂ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳで４２℃で洗浄
があり、包含される。
厳密度の高い条件としては、
（ｉ）少なくとも約３１％（ｖ／ｖ）から少なくとも約５０％（ｖ／ｖ）までのホルムアミドと、少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍまでの塩で４２℃でハイブリダイゼーション、および少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍまでの塩で４２℃で洗浄；
（ｉｉ）１％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳで６５℃でハイブリダイゼーション、および（ａ）０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｂ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳで６５℃を上回る温度で約１時間の洗浄；ならびに
（ｉｉｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、６８℃以上で約２０分間の洗浄
があり、包含される。
通常、二重鎖ＤＮＡのＴｍは、不一致な塩基の数が１％増大するごとに、約１℃ずつ低下する。
上記にかかわらず、厳密な条件は、本願明細書に援用される上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の２．９章および２．１０章に記載されているように、当技術分野でよく知られている。専門家には当然のことであるが、様々な要因を操作してハイブリダイゼーションの特異性を最適化することが可能である。最終洗浄の厳密度を最適化することにより、高度なハイブリダイゼーションを確実にすることが可能である。
通常、ヌクレオチドをマトリックス（好ましくは、ニトロセルロースなどの合成膜）上に固定化する工程と、ハイブリダイゼーション工程と、検出工程とを含むブロット技法により、相補的ヌクレオチド配列を同定する。サザンブロット法を使用して、相補的ＤＮＡ
配列を同定し；ノーザンブロット法を使用して、相補的ＲＮＡ配列を同定する。ドットブロット法およびスロットブロット法を使用して、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド配列を同定することが可能である。このような技法は、当技術分野の専門家にはよく知られており、本願明細書に援用される上記オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の２．９．１頁〜２．９．２０頁に記載されている。
このような方法では、サザンブロット法は、ゲル電気泳動によりサイズに応じてＤＮＡ分子を分離する工程と、サイズにより分離されたＤＮＡを合成膜にトランスファーする工程と、膜結合ＤＮＡを相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる工程とを含む。
ドットブロット法およびスロットブロット法では、ＤＮＡ試料を、前記のようにハイブリダイズさせる前に合成膜に直接施与する。
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ中の相補的核酸を同定する場合には、プラークまたはコロニーハイブリダイゼーションの手法を介するような別のブロット工程を使用する。この手法の他の典型的な例は、本願明細書に援用される上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの文献の第８〜１２章に記載されている。
通常、次の一般的な手順を使用して、ハイブリダイゼーション条件を決定することが可能である。核酸を前記のように合成膜にブロットおよび／またはトランスファーする。本発明のヌクレオチド配列を前記のように標識し、この標識された核酸が固定化ヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力を分析する。
専門家には当然のことであるが、多くの要因がハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。放射性標識されたポリヌクレオチド配列の比放射能は通常、検出可能なシグナルを生じるために約１０８ｄｐｍ／μｇ以上であるべきである。比放射能が１０８〜１０９ｄｐｍ／μｇの放射性標識ヌクレオチド配列により、約０．５ｐｇのＤＮＡを検出することが可能である。検出を可能にするために、十分量のＤＮＡを膜上に固定すべきであることは、当技術分野ではよく知られている。過剰量の固定ＤＮＡ、通常１０ｐｇを有することが望ましい。ハイブリダイゼーションの際に１０％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸（ＭＷ５００，０００）またはポリエチレングリコール６０００などの不活性ポリマーを加えることにより、ハイブリダイゼーションの感度を高めることが可能である（上記オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献、２．１０．１０を参照のこと）。
膜に固定化された核酸と標識された核酸とのハイブリダイゼーションから有意義な結果を得るためには、十分量の標識核酸を固定化された核酸にハイブリダイズさせてから洗浄すべきである。洗浄により、標識された核酸に対し望ましい程度の相補性を備えた固定化核酸にのみ、標識核酸がハイブリダイズすることが保証される。
固定された核酸にハイブリダイズした標識核酸を検出する方法は、当技術分野の技術者にはよく知られている。このような方法には、オートラジオグラフィ、化学発光法、蛍光法および比色分析が含まれる。
本発明の核酸相同体は、次の手順に従い調製することが可能である：
（ｉ）適切な宿主、例えば、細菌種から核酸抽出物を得る工程と；
（ｉｉ）本発明のヌクレオチド配列の一部をそれぞれ含む、任意選択で縮重しているプライマーを作成する工程と；
（ｉｉｉ）前記のプライマーを使用して、核酸増幅技法により、前記の核酸抽出物から１種または複数の増幅生成物を増幅する工程。
本願明細書で使用する場合、「増幅生成物」とは、核酸増幅技法により作製された核酸
生成物のことである。
適切な核酸増幅技法は専門家にはよく知られており、例えば本願明細書に援用される上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の第１５章に記載されているようなＰＣＲ；例えば本願明細書に援用される米国特許第５，４２２，２５２号に記載されているような鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）；例えば本願明細書に援用されるリウ（Ｌｉｕ）ら、１９９６年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１８巻、第１５８７頁と国際出願国際公開第９２／０１８１３号；およびリザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）とカプラン（Ｃａｐｌａｎ）の国際出願国際公開第９７／１９１９３号に記載されているようなローリングサークル複製（ＲＣＲ）；例えば本願明細書に援用されるスークナナン（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ）ら、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１７巻、第１０７７頁に記載されているような核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；例えば本願明細書に援用される国際出願国際公開第８９／０９３８５号に記載されているようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；ならびに、例えば本願明細書に援用されるタイアギ（Ｔｙａｇｉ）ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、第５３９５頁に記載されているようなＱ−βレプリカーゼ増幅が含まれる。増幅は、本願明細書に開示されているプライマーを使用するＰＣＲによることが好ましい。
（Ｇ３ＢＰ−２と乳がん）
Ｇ３ＢＰ−２タンパク質が、上皮組織および非増殖性組織に由来する乳がんで発見された。これは予期せぬ結果であったが、その理由の少なくとも一部は、発現が腫瘍に対して特異的であると思われることと、Ｇ３ＢＰ−２のアップレギュレーション（上方制御）は腫瘍の発生の初期に生じるようであることとは知られていなかったためである。Ｇ３ＢＰ−２は、研究された乳がんの約８０％でアップレギュレーションされた。これは、家族性乳がんの１５％（研究対象とした地方における比率）で突然変異していることが見出されたＢｒｃａ１などの、乳がんの原因であると認識されている遺伝子に匹敵する。家族性乳がんは、乳がん全体の１５〜３０％を占めているにすぎず、このことは、Ｂｒｃａ１が乳がん全体のわずか２〜５％の原因であることを意味している。
本発明者らは、Ｇ３ＢＰ−２が細胞の核へと移動して転写産物を選び出し、該転写産物をリボソームへと送り出して、選択された遺伝子転写産物の翻訳をリボソームのレベルで調節しうることを示唆するモデルを提示した。本発明者らがこのモデルを提示したのは、Ｇ３ＢＰ−２が通常ポリソームに結合しているリボソームタンパク質と共に免疫沈降されうるという意外な発見による。このことは、細胞周期を調節するがん遺伝子の転写産物をリボソームへと送り出してその転写をアップレギュレーションし、それによりがんの進行を増強しうる作用方式が存在するかもしれないことを示唆している。興味深いことに、前記のことは、Ｇ３ＢＰ−２がシグナル伝達とＲＮＡプロセシングとの関連を表しているかもしれないことも示唆している。
Ｇ３ＢＰ−２は実際には乳がんの原因ではないかもしれないが、がんが増殖するために必要とされるかもしれず、したがって乳がんの８０％でアップレギュレーションされることが説明可能である。Ｇ３ＢＰ−２は具体的には細胞周期依存的に細胞内コンパートメントに局在し、増殖時には核内へ移動し、次いで核から出て細胞質へ戻る。Ｇ３ＢＰ−２は、ＧＡＰ１２０から直接メッセージを受け取って細胞核へと移動することにより、正常なｒａｓ−ＧＡＰ１２０シグナル伝達を「短絡」させるようである。核内では、Ｇ３ＢＰ−２は標的転写産物（例えば、ｃ−ｍｙｃ）と結合し、これらを核から細胞質中のリボソームへと運び出す可能性が高い。本発明者らは、Ｇ３ＢＰ−２を、通常は翻訳活性リボソームに結合している一連のポリペプチドと共に免疫共沈降させた。したがって、Ｇ３ＢＰ−２は、発がん性遺伝子転写産物（例えば、ｃ−ｍｙｃ）のアップレギュレーションを可能にすることにより、乳がん増殖の増大を促進している可能性がある。Ｇ３ＢＰ−２の活性
を、特にＮ末端のＮＴＦ２様ドメインに対して阻止するように設計された治療法は、がんの進行を制限する可能性がある。
（クローニング、配列相同性および構造上の相同性）
本発明者らは以前に、ＲＲＭ含有タンパク質についての一般的なＰＣＲを用いるスクリーング（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）におけるＭｍｕＧ３ＢＰ−２（ＭＭＵ６５３１３）のクローニングについて報告している。ＲＲＭ内のコンセンサス配列に対して設計された縮重プライマーを使用し（バーニー（Ｂｉｒｎｅｙ）ら、１９９３年）、かつ増幅したＰＣＲ生成物を使用して後期原条期マウス胚ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡを単離することにより、これを達成した。Ｇ３ＢＰ遺伝子間で保存されている配列相同性により、ＭｍｕＧｅＢＰ−２のｃＤＮＡのコード領域を、ノーザン分析およびライブラリ・スクリーニングにおいてヒトＧ３ＢＰ−２およびＭｍｕＧ３ＢＰ−１の両方を認識するための有効なツールとして使用することが可能である。本発明者らは、ＭｍｕＧ３ＢＰ−２のコード領域を使用して、後期原条期マウス胚ｃＤＮＡライブラリおよび胎児ヒト脳ｃＤＮＡライブラリからそれぞれＭｍｕＧ３ＢＰ−１（ＭＭＡＢ１９２７）およびヒトＧ３ＢＰ−２（ＨｓａＧ３ＢＰ−２）を単離およびクローニングした。Ｍｅｔ開始コドン、オープンリーディングフレームおよび停止コドンを同定するために、該クローンを配列決定して分析した。ＨｓａＧ３ＢＰ−２とＭｍｕＧ３ＢＰ−２とのタンパク質配列比較（図３）により９８．５％の同一性が示され、ＨｓａＧ３ＢＰ−２とＨｓａＧ３ＢＰ−１（ＨＳ３２５１９１０）では６５％の同一性が示され、ＨｓａＧ３ＢＰ−１は、ＭｍｕＧ３ＢＰ−１と９４．４％の配列同一性を共有している。図３では、アミノ酸は、一文字表記されており、１０のブロックに分類されている。行の最後に位置する数字は、示されているタンパク質内でのアミノ酸の位置を示している。整列させた配列内のダッシュは、ＨｓａＧ３ＢＰ−２ａに対して保存されたアミノ酸を示しており、タンパク質間のアミノ酸の変化は、適切な置換により示されている。整列させたタンパク質内の空白は、互いに直線状に整列された状態を維持するために配列に挿入されたギャップを示している。四角の枠は、プロリンリッチ配列（ＰｘｘＰ）を示している。イタリック体の配列は、酸リッチドメインを示している。楕円の枠は、ＲＧＧドメインの成分を示しており、Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２のＲＧＧドメインが一致していないことを示している。下線および二重下線を付された配列はそれぞれ、ＲＮＰ−２およびＲＮＰ−１を示している。
ライブラリのスクリーニングにより、少なくとも２種の異なるＧ３ＢＰ−２アイソフォームがマウスおよびヒトの両方で生じることも判明した。マウスとヒトとの間で１００％保存されているもう一方のスプライシング事象では、コード領域から９９個のヌクレオチドが削除され、停止コドンもフレームシフトも導入されない。ウェスタンブロット分析および組換えタンパク質の発現（下記参照）により確認されたように、これらの転写産物はいずれもインビボで翻訳される。長い方のアイソフォームをＧ３ＢＰ−２ａと名づけた（ヒトＧ３ＢＰ−２ａ（受入番号ＡＦ１４５２８５）、マウスＧ３ＢＰ−２ａ（受入番号ＡＦ１４５２８５））。短い方のタンパク質アイソフォームを、Ｇ３ＢＰ−２ｂ（ヒトＧ３ＢＰ−２ｂ（受入番号ＡＦ０５３５３５およびＡＦ０５１３１１）およびマウスＧ３ＢＰ−２ｂ（受入番号ＭＭＵ６５３１３））と称し、Ｇ３ＢＰ−２ｂは、一次構造の中央の領域から３３アミノ酸が欠失している点でＧ３ＢＰ−２ａと異なっている（図３）。第３のＭｍｕＧ３ＢＰ−２転写産物を検出し、クローニングしたが（本願明細書中では、Ｇ３ＢＰ−２ｃと称する）；配列分析の結果、この転写産物の翻訳は短い遺伝子生成物を生じるであろうことが示され、今のところ細胞または組織中で対応するタンパク質は検出されておらず、このことから翻訳されないことが示唆されている。
すべてのＧ３ＢＰは、高次に保存されたＲＮＰ−１およびＲＮＰ−２配列を共有するが、これらの配列はＲＲＭのコンセンサスモチーフである。Ｇ３ＢＰ−２とＧ３ＢＰ−１の
ＲＲＭの間の最も顕著な差異は、ＲＮＰ−２コンセンサス配列中でのＶａｌからＩｌｅへの置換である（図３）。Ｇ３ＢＰのＲＲＭの構造は、他でも報告されている（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）。加えて、Ｇ３ＢＰは保存された酸リッチドメインおよびＲＧＧドメイン（バーニー（Ｂｉｒｎｅｙ）ら、１９９３年）を有するが、これらはいずれもＲＮＡ結合タンパク質中で共通して見出される。Ｇ３ＢＰ−１とＧ３ＢＰ−２との間にはＲＧＧドメイン構造に顕著な差異が存在し（図３参照）、このことがＲＮＡターゲットへの特異性の違いをもたらしている可能性があることを特記すべきである。酸リッチドメインは、ｈｎＲＮＰ Ｃおよびヌクレオリンなどの様々なＲＮＡ結合タンパク質に関連して見いだされるにも関わらず、このドメインの機能は不明なままであり、タンパク質−タンパク質相互作用に関与しているかもしれない。Ｇ３ＢＰ−１とＧ３ＢＰ−２タンパク質との間の最も重要な差異は、潜在的ＳＨ３ドメイン結合モチーフ（ＰｘｘＰ、ここでｘは任意のアミノ酸を表す）の数にある（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９６年）。Ｇ３ＢＰ−２ａタンパク質は、酸リッチドメインとＲＲＭドメインとの間に４個のＰｘｘＰモチーフからなるクラスターを有し、これに対してＧ３ＢＰ−２ｂはその相同領域中に５個有する（図３）。Ｇ３ＢＰ−２ｂ中の余分なプロリンリッチＰｘｘＰモチーフは、Ｇ３ＢＰ−２ａから３３アミノ酸がスプライシングされることにより生じる。Ｇ３ＢＰ−２に多重ＰｘｘＰクラスターが見いだされるのに対し、Ｇ３ＢＰ−１は同タンパク質の相同領域中にこのようなモチーフを１個しか含まない（図３）。さらに、Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２のいずれもその非保存ＲＧＧドメイン内に保存ＰｘｘＰモチーフ（ＰＧＧＰ）を有する（図３）。全体的には保存されていないタンパク質領域内に最小ＳＨ３ドメイン結合モチーフが特異的に保存されているということは、保持された機能の存在を示唆しているが、これはまだ解明されていない。Ｇ３ＢＰ間の潜在的ＳＨ３ドメイン結合モチーフの数における全般的な差異は、これらがインビボでＳＨ３ドメインを含有する別個の相手に結合するか、または同じタンパク質に対して異なる親和性を有することを示している可能性がある。
（昆虫細胞におけるタンパク質発現）
ＭｍｕＧ３ＢＰ−２ａおよび２ｂのｃＤＮＡは、サイズがそれぞれ５８．２ｋＤａおよび５２ｋＤａと予測されるタンパク質をコードする。組換え発現タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定でそれぞれ６８．５ｋＤａおよび６２ｋＤａの見かけの分子量を有する。予測重量と見かけ重量との上記の差異は翻訳後修飾による重量の増加と一致し、ＨｓａＧ３ＢＰ−１に関して報告された差異（予測重量５２ｋＤａ、観察された見かけの重量６８ｋＤａ）（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）と同様である。
（Ｇ３ＢＰ−ｒａｓＧＡＰ１２０相互作用のマッピング）
Ｇ３ＢＰ−１とｒａｓＧＡＰ１２０との相互作用については報告があり、Ｇ３ＢＰ−１はｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインと特異的に相互作用し（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）、Ｇ３ＢＰをｒａｓＧＡＰ１２０シグナル伝達経路に関与させる（パズマン（Ｐａｚｍａｎ）ら、２０００年も参照のこと）。しかしながら、ｒａｓＧＡＰ１２０との間に観察された相互作用を担うＧ３ＢＰ内の領域は、完全には調査されていない。当初、この相互作用は、ＳＨ３ドメインと相互作用することが知られている（リー（Ｌｅｅ）ら、１９９６年）プロリンリッチモチーフを介して促進されるのであろうと推測されていた。Ｇ３ＢＰとｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインとの相互作用をさらにマッピングするために、いくつかのＧＳＴ−Ｇ３ＢＰペプチド融合物を発現させ（図４）、Ｈｉｓタグを有するＮ末端ｒａｓＧＡＰ１２０ペプチドを用いたビーズ結合アッセイで探索した。Ｇ３ＢＰペプチド構築物は、単離されたプロリンリッチモチーフを有するペプチドだけでなく単一または複数のドメインを含有する短縮タンパク質に相当するように設計した（図４）。アッセイでは、ＧＳＴ−Ｇ３ＢＰペプチドをグルタチオンビーズに結合させ、Ｈｉｓ−タグを有するＮ末端ｒａｓＧＡＰ１２０を様々な構築物に加える。結合タンパク質をウェスタンブロット法に供し、抗Ｈｉｓ抗体で探索してＨｉｓ−タグを有するｒａｓ
ＧＡＰ１２０を同定することにより、Ｇ３ＢＰペプチドとｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインとの特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を検出する。その結果（図４）から示されるように、ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインとの相互作用は、Ｇ３ＢＰのＮ末端ドメイン内に含まれるＮＴＦ２様ドメインにマッピングされ、プロリンリッチモチーフにはマッピングされない。酸リッチドメイン、ＲＲＭまたはＲＧＧリッチドメインを含めたＧ３ＢＰの他のドメインとの相互作用は検出されなかった（図４）。
図４は、Ｇ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−１タンパク質内に含まれるサブドメインおよびモチーフを概略的に表示するものであり、Ｎ末端ＮＴＦ２様ドメイン、酸リッチドメイン、ＲＧＧおよびプロリンリッチドメイン、ならびにＲＮＡ認識モチーフを含む（詳細は図中の書き込みを参照のこと）。各々の完全長タンパク質の下に、Ｎ末端ＳＨ３ドメインを含有するｒａｓＧＡＰ１２０の領域との相互作用をマッピングするためにＧＳＴ融合タンパク質として発現された、様々な短縮ペプチドが示されている。付番は、ペプチド短縮部位に位置するアミノ酸に対応しており（すなわち、δ−２ａ−Ｎ１４６はＮ末端アミノ酸１〜１４６を含む短縮Ｇ３ＢＰ−２ａペプチドを表している）、これらの短縮の相対位置が、完全長タンパク質中に大体の比率で示されている。図４のＢおよびＣは、様々なＧＳＴ−Ｇ３ＢＰペプチドと結合させて、Ｈｉｓ−タグを付加したＮ末端ＳＨ３ドメイン含有ｒａｓＧＡＰ１２０領域で探索したグルタチオンビーズのウェスタンブロット分析を示している。
抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを探索することにより、Ｇ３ＢＰ−ｒａｓＧＡＰ１２０相互作用を決定した。結果は、Ｎ末端ＳＨ３ドメイン含有ｒａｓＧＡＰ１２０領域が、Ｇ３ＢＰ−２ａのＮＴＦ２様ドメイン（δ−２ａ−Ｎ１４６、パネルＢ）およびＮＴＦ２様ドメインを有する全てのＧ３ＢＰ−２ａペプチド（δ−２ａ−Ｎ２０５、δ−２ａ−Ｎ２５７、δ−２ａ−Ｎ３２９および完全長Ｇ３ＢＰ−２ａ、パネルＢ）と相互作用したことを示している。Ｇ３ＢＰ−１から得られた結果は、Ｇ３ＢＰ−２ａから得られた上記の結果と一致し、完全長Ｇ３ＢＰ−１、δ−１−Ｎ２２９およびδ−１−Ｎ３０９が、Ｎ末端ＳＨ３ドメインを含むｒａｓＧＡＰ１２０の領域と相互作用することを示している。完全なＮＴＦ２様ドメインを含まないＧ３ＢＰ−２ａまたはＧ３ＢＰ−１の短縮ペプチドは、ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３領域と結合できなかった。
本願明細書で報告する結果を、ファーウェスタン法（ｆａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎ）のプロトコル（データは示さず）を使用して確認したが、これらの結果はビーズ結合アッセイから得られたデータと一致する。
（Ｇ３ＢＰは、組織特異発現を示す）
Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２の配列から決定したアイソフォーム特異的な合成ペプチドに対して作製した抗体を使用して、成体マウス組織由来の全細胞溶解物のウェスタンブロットを探索した（図５）。図５のパネルＡは抗Ｇ３ＢＰ−１ポリクローナル抗体で探索した組織を示し、これに対してパネルＢは抗Ｇ３ＢＰ−２ポリクローナル抗体で探索した組織をコラージュのように構成したものを示している。肺、肝臓、腎臓、胃および結腸（データは示されていないが、膵臓および精巣も）を含めたいくつかの組織がＧ３ＢＰ−２の両アイソフォームを発現することが分かる（図５、パネルＢ）。脳、筋肉（少量のＧ３ＢＰ−２ｂ発現が見られ、これはおそらく試料中に様々な細胞集団が存在することが原因である）および心臓を含めた他の組織は、Ｇ３ＢＰ−２ａのみの発現に限られている（図５、パネルＢ中の上側のバンド）。小腸はＭｍｕＧ３ＢＰ−２ｂのみを発現し（図５、パネルＢの下側のバンド）、脾臓はいずれのタンパク質も検出可能なレベルでは発現しない。Ｇ３ＢＰ−１抗体の全般的な発現はＧ３ＢＰ−２の発現よりも少ないようだが、一部の組織は豊富なレベルのＧ３ＢＰ−１を発現し、それらには、肺、腎臓および結腸が含まれる。心臓、肝臓および脾臓も低レベルのＧ３ＢＰ−１を発現する。
図６は、抗Ｇ３ＢＰ−１および抗Ｇ３ＢＰ−２抗体で探索した成体マウス組織の免疫組織化学の結果を示している。パネルＡ〜Ｅは抗Ｇ３ＢＰ−１抗体で探索し、パネルＦ〜Ｊは抗Ｇ３ＢＰ−２抗体で探索した。全組織染色をホースラディッシュペルオキシダーゼで視覚化し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。パネルＡおよびＦは脳であり（Ｎｅはニューロンを示し、Ｇｌはグリア細胞を示す）、ＢおよびＧは腎臓であり（Ｇｍは糸球体を示し、Ｔｕは細管を示す）、ＣおよびＨは結腸であり（Ｉｇは腸腺を示す）、ＤおよびＩは小腸を示し（Ｖは絨毛を示す）、ＥおよびＪは胃である（Ｅｐは上皮粘液分泌細胞を示し、Ｐｇは幽門腺を示している）。すべての写真は倍率×１００で撮影されているが（棒線は１００μｍを表す）、ただし胃（パネルＥおよびＪ）は倍率×５０で示されている（棒線は１００μｍを表す）。
（Ｇ３ＢＰの染色体上の位置）
ライブラリクローンから得られた配列データを使用してＧ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２特異的プライマーを設計し、引き続きこれらをＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ（商品名）ハイブリダイゼーションパネル上で使用して上記遺伝子の染色体位置を決定した。Ｇ３ＢＰ−１は第５染色体のＦＢ２５Ｄ１０から１．５１ｃＲにマッピングされ（ロッド値＞３．０）、同遺伝子は５ｑ３３．１〜５ｑ３３．３の間に位置付けられた。Ｇ３ＢＰ−２は第４染色体のＷＩ−５５６５から３．３６ｃＲにマッピングされ（ロッド値＞３．０）、同遺伝子は４ｑ１２〜４ｑ２４の間に位置付けられた。続いてプラスミド由来人工染色体（ＰＡＣ）ライブラリ（オーストラリア国マードック大学のピー．イオアノウ（Ｐ．Ｉｏａｎｎｏｕ）博士提供）をスクリーニングし、単離されたクローンを使用して蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。ＦＩＳＨの結果から、これらの遺伝子の遺伝子位置を確認した。ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅハイブリダイゼーションパネルのスクリーニングおよびＦＩＳＨ分析に加えて、ヒトＧ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２のｃＤＮＡ配列を用いてＮＣＢＩデータベース（http://ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/ ）のヒトゲノム配列をＢＬＡＳＴ検索した。その結果、Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２のいずれかに適合する複数の染色体が存在することが示され、このことは遺伝子重複または偽遺伝子を表している可能性がある。ＢＬＡＳＴ分析単独ではＧ３ＢＰをマッピングするためには不十分であるが、ＦＩＳＨおよびＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅハイブリダイゼーションパネルの結果と組み合わせると、前記で示されたようなこれら遺伝子の染色体上の位置が確認された。
ゲノムデータベース（http://gdbwww.gdb.org/gdbreports/GeneByChromosome.4.alpha.htmlおよびhttp://gdbwww.gdb.org/gdbreports/GeneBychromosome.5.alpha.htmlで利用可能）の検索からは、このタンパク質ファミリーの遺伝的欠陥／多型性を表しうる疾患の候補遺伝子座は明らかにならなかったが、ｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂ（ＧＤＢ：１２８８３７）、ｈｎＲＮＰ Ｈ１（ＧＤＢ：５４２８５９７）、リボソームタンパク質Ｌ７偽遺伝子（ＧＤＢ：２７７８８９）、リボソームタンパク質Ｓ１４（ＧＤＢ：１１９５７２）、リボソームタンパク質Ｓ１７ａ様１（ＧＤＢ：１１９５７３）、リボソームタンパク質Ｓ２０Ａ（ＧＤＢ：１１９５７５）およびリボソームタンパク質Ｓ２０Ｂ（ＧＤＢ：１１９５７６）を含む、染色体５ｑ上のＲＮＡ結合タンパク質遺伝子からなるいくつかのクラスター形成が存在するようである。染色体４ｑにも、ＥＩＦ４ＥＬ１（ＧＤＢ：１２６３７１）、ＧリッチＲＮＡ配列結合因子１（ＧＤＢ：６９６３５４）、ｈｎＲＮＰ Ｄ（ＧＤＢ：９３９１６９４）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩポリペプチドＢ（ＧＤＢ：１３５０３４）およびリボソームタンパク質Ｌ３４（ＧＤＢ：９８６３２４２）を含めた複数のＲＮＡ結合タンパク質が含まれる。Ｇ３ＢＰ−１の染色体上の位置に重複している領域の部分欠失および分断の解析から、この領域が骨髄性白血病に関与している可能性が示唆されており（ホリガン（Ｈｏｒｒｉｇａｎ）ら、１９９９年）、一方、染色体４ｑに関する同様の研究から、Ｇ３ＢＰ−２遺伝子を含有する領域が結腸直腸腺腫（ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、１９９
９年）およびホジキン病（アトキン（Ａｔｋｉｎ）、１９９８年）に関与している可能性が示唆されている。しかしながら、ヒト染色体のこれらの領域に関連しているヒトの病理にＧ３ＢＰが関与していることを示唆する十分なデータは存在しない。
（Ｇ３ＢＰ−２に対する抗体）
本発明は、単離されたＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、変異体および誘導体に対する抗体にも関する。Ｇ３ＢＰ−２のペプチド断片は、本願明細書に記載されているようにアミノ酸配列ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］を含むことも可能である。本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体製造、精製および使用に適したよく知られているプロトコルは例えば、いずれも本願明細書に援用される、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」、ニューヨーク所在のジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９１−１９９４）の第２章およびハーロウ，イー．（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．）およびレーン，ディー．（Ｌａｎｅ，Ｄ．）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハーバー研究所、１９８８年）に見ることができる。
通常、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体と結合またはコンジュゲートする。例えば、抗体はポリクローナル抗体を含むことが可能である。このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチド、断片、変異体または誘導体をマウスまたはウサギなどの抗体産生用の動物種に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることにより調製することが可能である。ポリクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野の専門家にはよく知られている。使用可能なプロトコルの例は、例えば、上記のコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）らの「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」および上記のハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、１９８８年、に記載されている。
抗体産生用の動物種中に得られたポリクローナル抗血清の代わりに、例えば、本願明細書に援用される論文（ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻、第４９５頁）に記載されているような標準的な方法を使用して、または、例えば、上記のコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」に記載されているような、本発明の１種または複数のポリペプチド、断片、変異体または誘導体を予め接種した抗体産生用の動物種由来の脾臓またはその他の抗体産生細胞を不死化することによる最近の変法により、モノクローナル抗体を製造することも可能である。
さらに本発明はその範囲内に、前記のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃまたはＦａｂ断片からなる抗体を含む。代替例として、抗体は本発明のペプチドに対する一本鎖Ｆｖ抗体（ＳｃＦｖｓ）からなっていてもよい。例えば本願明細書に援用される米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号またはウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）による論文（１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ第３４９巻、第２９３頁）にそれぞれ記載されている方法に従い、そのようなｓｃＦｖｓを調製することも可能である。
本発明の抗体は、本発明の天然型または組換えポリペプチドを単離する際に親和性クロマトグラフィーに使用することができる。例えば、上記のコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」の第９．５章に記載されている免疫親和性クロマトグラフィー手順を参照することが可能である。
硫酸アンモニウム分画法、アフィニティ精製により、または当技術分野でよく知られて
いる他の方法により、動物の適切な体液から抗体を精製することが可能である。抗体を精製するためのプロトコル例は、本願明細書に援用される上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの第１０．１１節および第１１．１３節に示されている。
野生型または親ポリペプチドに対する抗体の免疫反応性は、例えばウェスタンブロット法などの任意の適切な手順により決定することが可能である。
（模倣物質、アゴニストおよびアンタゴニスト）
Ｇ３ＢＰ−２が発がん経路と相互作用すること、細胞周期を調節すると思われる固有の特徴を有することから、Ｇ３ＢＰ−２により独自の治療可能性がもたらされる。特に重要なのは、意外にも複数の活性を担っているＮ−末端ＮＴＦ２様ドメインである：
（１）ＮＴＦ２様ドメインは、ｒａｎ核膜孔タンパク質との相互作用を介して核局在化を、
（２）ユビキチンヒドロラーゼであるＯＤＥ１との相互作用を介して既知のがん遺伝子ＮｆκＢの発現を、
（３）ＧＡＰ１２０との相互作用を介してシグナル伝達を、
調節するようである。
さらに本発明者らは、Ｇ３ＢＰ−２がＮＴＦ２様ドメインを介してＧＡＰ１２０からのそのメッセージを受け取ることを解明した。Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインは、ＮＴＦ２タンパク質全体に対して高度に保存されている。ＮＴＦ２は、ｒａｎとのエネルギー依存性相互作用を介して核へと往復する核膜孔タンパク質である。本発明者らは、Ｇ３ＢＰ−２がＮＴＦ２と同じメカニズムを使用して核内外を往復すると推測し、この点で、Ｇ３ＢＰ−２がｒａｎと相互作用することを示した。さらに本発明者らは、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインがＯＤＥ１（ユビキチンヒドロラーゼの１種）と相互作用すること、ならびにこの相互作用により、腫瘍の進行に関与する他のタンパク質ＮＦκＢの遺伝子発現が増加されうることを解明した。
抗がん剤のためにＮＴＦ２様ドメインを標的とすることにより、腫瘍の細胞増殖を抑制する可能性がある。これは、ＧＡＰ１２０からのシグナルを受け取るＧ３ＢＰ−２の能力を阻止すること、核から細胞質へとｍＲＮＡ転写産物を往復させるＧ３ＢＰ−２の能力を阻止すること、およびＮＦκＢのアップレギュレーションをもたらすＧ３ＢＰ−２の能力を阻止することにより、達成することができるであろう。
本発明は、Ｇ３ＢＰ−２と天然または内在性の標的ポリペプチドとからなるポリペプチド複合体の生成を阻止または妨害することが可能な薬剤を想到するものである。そのような薬剤は、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチドまたはその相同体の１種または複数の生物活性と拮抗するか、該活性を模倣する模倣物質であってよい。
当然のことであるが、Ｇ３ＢＰ−２は、複数の明確なサブドメイン（酸リッチドメイン、ＲＮＡ認識モチーフ、アルギニン−グリシンリッチモチーフおよびプロリンリッチモチーフ）を有する。がんの進行を促進しうるポリペプチドとしてのその生物活性に対する鍵は、Ｇ３ＢＰ−２のＮ末端ＮＴＦ２様ドメインにあるようである。
ＮＴＦ２様ドメインは、Ｇ３ＢＰ−２模倣物質となりうるものをスクリーニングまたは設計するための好ましい標的であると考えられる。
本願明細書では、「模倣物質（ミメティクス）」との用語をタンパク質またはペプチドの特定の機能領域に似せて設計された分子に対して使用し、該用語は本願明細書の範囲内では、当技術分野でよく理解されている「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」との用語を含む。
アンタゴニストは、競合的アンタゴニストでも非競合的アンタゴニストでもよい。
Ｇ３ＢＰ−２と内在性標的ポリペプチドとのポリペプチド複合体の生成を妨害または阻止する模倣物質を人工的に設計することが可能であると考えられる。模倣物質は、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと内在性標的ペプチド、例えばｒａｓＧＡＰ１２０との複合体の生成を妨害または阻止することが好ましい。具体的には、ＳＨ３ドメインを含むアミノ酸配列［配列番号：６］（ＮＣＢＩ 受入番号：Ｐ２０９３６）：
ＶＲＡＩＬＰＹ ＴＫＶＰＤＴＤＥＩＳ ＦＬＫＧＤＭＦＩＶＨ ＮＥＬＥＤＧＷＭＷＶ ＴＮＬＲＴＤＥＱＧＬ ＩＶＥＤＬＶＥＥＶＧ ＲＥＥＤ
を有するｒａｓＧＡＰ１２０のポリペプチド断片である。
これとは逆に、Ｇ３ＢＰ−２の内在性天然標的ポリペプチドとの複合体形成を可能にするＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインの類似体を人工的に設計して、これを用いて内在性天然標的との結合についてＧ３ＢＰ−２と競合させることも考えられる。適切には、該類似体はＧ３ＢＰ−２の内在性ターゲットポリペプチドとも結合するであろう。
前記の模倣物質は、所望の生物活性および半減期を有するペプチド、ポリペプチドまたは他の有機分子、好ましくは、小さい有機分子であってよい。
ネストラー（Ｎｅｓｔｌｅｒ）およびリウ（Ｌｉｕ）、１９９８年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．第１巻、第１１３頁およびキルクパトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）ら、１９９９年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ
Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ第２巻、第２１１頁に記載されているような方法により、コンビナトリアル・ライブラリを含めた合成化学ライブラリなどの分子ライブラリをスクリーニングすることにより、模倣物質を同定することが可能である。
さらに、コルブ（Ｋｏｌｂ）、１９９８年、Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．第５１巻、第１８５頁に概観されているような方法論により、天然に生じる分子のライブラリをスクリーニングしうることも想到される。
模倣物質を設計するためのさらに合理的な手法では、当技術分野でよく知られているような構造データベースのコンピュータ利用スクリーニング、コンピュータ利用モデリング、または分子の結合相互作用を検出する比較的慣用の生物物理学的技法を使用することが可能である。
模倣物質を同定する手順として、コンピュータ利用構造データベース検索の利用がますます高まっている。模倣物質を同定するために原則的に適しているデータベース検索方法は、それぞれ本願明細書に援用される国際出願国際公開第９４／１８２３２号（ＨＩＶ抗原模倣物質の製造を目的としたもの）、米国特許第５，７５２，０１９号および国際出願国際公開第９７／４１５２６号（ＥＰＯ模倣物質の同定を目的としたもの）に見ることができる。
他の方法は、分子相互作用を同定する様々な生物物理学的技法を含む。これらは、例えば候補分子がＧ３ＢＰ−２：内在性標的ポリペプチド複合体の生成に影響を及ぼすかどうかによって、候補分子をスクリーニングすることを可能にしている。競合的な放射性リガンド結合アッセイ（関連方法に関しては上記のアップトン（Ｕｐｔｏｎ）ら、１９９９年を参照のこと）、分析用超遠心分離、微小熱量測定法、表面プラズモン共鳴および光学バイオセンサを用いる方法などの、利用可能な技法に当てはまる方法が、本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９７年）の第２０章に提示されている。
（薬剤組成物）
本発明のさらなる特徴は、薬剤組成物中の活性物質としてポリペプチド、その断片、変異体または誘導体を使用することである。活性物質は、動物の免疫応答を誘発しうる「免疫原性剤」であってよい。免疫原性剤には、抗原を装荷または抗原でパルス処理されたタンパク質、核酸、ワクチンもしくは抗原提示細胞、またはこれらの組合せが含まれうる。抗原提示細胞と抗原、例えば、本発明のタンパク質、ポリペプチド、断片、変異体または誘導体とを接触させることにより、該抗原提示細胞に抗原を装荷または抗原でパルス処理することが可能である。例えば食作用、マイクロインジェクション、抱き込み（ｅｎｇｕｌｆｉｎｇ）等を含めた任意の適切な手段により、抗原提示細胞内に抗原を取り込むことが可能である。抗原を、任意の適切な担体、例えばラテックスビーズ、融合タンパク質、または当技術分野で一般に使用される何らかの他の輸送粒子と組み合わせることも可能である。抗原提示細胞は、例えば樹状細胞または免疫学の分野で知られている他の任意の抗原提示細胞であってよい。
薬剤組成物は、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインとその内在性結合相手との結合を阻止するアンタゴニストを含むことも可能である。
適切には、薬剤組成物は、薬剤として許容可能な担体を含む。「薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与の際に安全に使用することが可能な固体または液体の充填剤、希釈剤または封入物質を意味している。投与の特定経路に応じて、当技術分野でよく知られている様々な担体を使用することが可能である。これらの担体は、糖、でんぷん、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張性食塩水、発熱物質を含有しない水、を含む群から選択することが可能である。
患者に本発明の薬剤組成物を施与するために任意の適切な投与経路を使用することが可能である。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用することが可能である。本発明の免疫原性剤の投与には、筋肉内および皮下注入が適している。
剤形には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ、トローチ、カプセル、座薬、エアロゾル、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形は、その目的のために特に設計された注入式または埋込式の放出制御装置、または付加的にこのように作用するように変更された他の形態のインプラントを含むことも可能である。治療薬を、例えば、アクリル樹脂を含めた疎水性ポリマー、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのある種のセルロース誘導体で被覆することにより、該治療薬の放出制御を行うことが可能である。加えて、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用することにより、放出制御を行うことが可能である。
投与に適した本発明の薬剤組成物は、予め決定された量の１種または複数の本発明の免疫原性剤を、粉末または顆粒として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルションまたは油中水型液体エマルション中の溶液または懸濁液としてそれぞれ含有する、バイアル、カプセル、サッシェまたは錠剤などの個別単位として提供することが可能である。製薬学の任意の方法によりこのような組成物を調製することが可能であるが、該方法はすべて、前記の１種または複数の免疫原性剤と、１種または複数の必要な成分を構成する担体とを結びつける工程を含む。通常、本発明の薬剤と、液体担体または微細固体担体またはその両方とを均一かつ十分に混合し、次いで、必要な場合には生成物を所望の体裁に成形することにより、組成物を調製する。
（ワクチン）
前記の組成物を、本発明のポリペプチドおよび／または核酸またはその個々の断片を含む治療用または予防用ワクチンとして使用することが可能である。１実施形態では、ワクチンは前記の免疫原性剤を含有する。好ましくは、該ワクチンは乳がんを予防または治療する。
したがって、本発明は活性物質として１種または複数の本発明の免疫原性剤を含有するワクチンを製造することにも及ぶ。このようなワクチンを製造するために、任意の適切な手順が考えられる。例示的な手順には例えば、本願明細書に援用される「ＮＥＷ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ」（１９９７年、レバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら、ニューヨーク、バーゼル、ホンコン所在のマルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．））に記載されている手順が含まれる。
本発明による免疫原性剤を、他の抗原のＢまたはＴ細胞エピトープを含めた他の抗原と混合、コンジュゲートまたは融合させることが可能である。加えて、下記のような担体にコンジュゲートさせることが可能である。
本発明のハプテンペプチド（すなわち、同種の抗体と反応するがそれ自体は免疫応答を引き起こすことができないペプチド）を使用する場合、これを免疫原性の担体とコンジュゲートさせることが可能である。有用な担体は当技術分野でよく知られており、例えば：チログロブリン；ヒト血清アルブミンなどのアルブミン；破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス、大腸菌、スタフィロコッカスおよびストレプトコッカス由来の毒素、トキソイドまたは該毒素の任意の突然変異による交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸；インフルエンザ；ロタウイルスのＶＰ６、パルボウイルスのＶＰ１及びＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが含まれる。代替例として、担体タンパク質または他の免疫原性ポリペプチドの断片またはエピトープを使用することも可能である。例えば、本発明のハプテンペプチドを、細菌毒素、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトープとカップリングさせることも可能である。これに関連して、本願明細書に援用される米国特許第５，７８５，９７３号を参照することができる。
ワクチンは、水、リン酸緩衝生理食塩水および生理食塩水などの生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含有することも可能である。
ワクチンおよび免疫原性剤は、当技術分野でよく知られているアジュバントを含有することも可能である。適切なアジュバントには、これらに限らないが、ヒトで使用するためのアジュバント、例えばＳＢＡＳ２、ＳＢＡＳ４、ＱＳ２１またはＩＳＣＯＭが含まれる。
本発明の免疫原性剤を、弱毒化ウイルス宿主により発現させることが可能である。「弱毒化ウイルス宿主」とは、自然にまたは人為的に十分無毒化されたウイルスベクターを意味している。任意の適切な物理的手段（例えば、熱処理）または化学的手段（例えば、ホルムアルデヒド処理）により、ウイルスを十分に無毒化することが可能である。「十分に無毒」とは、感染性が破壊されているウイルスを意味している。理想としては、ウイルスの免疫原性を担持するポリペプチドに影響を及ぼすことなくウイルスの感染性を破壊する。前記から、弱毒化ウイルス宿主は、生きたウイルスまたは不活化ウイルスを含有することも可能であることは認められるであろう。
本発明によるワクチンに使用することが可能な弱毒化ウイルス宿主には、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好ましくはワクシニアなどのポックスウイルス（例えば、本願明細書に援用されるパオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）およびパニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）の米国特許第４，６０３，１１２号参照）および弱毒化サルモネラ株（例えば
、本願明細書に援用されるストッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）の米国特許第４，５５０，０８１号参照）を含めたウイルスベクターが含まれうる。生ワクチンが特に有利である。それというのも、これらは十分に長期の免疫を与えうる長期刺激をもたらすためである。
１種または複数の異なるＧ３ＢＰ−２のエピトープから、多価ワクチンを調製することが可能である。
組換えワクシニアウイルスを調製して、本発明による核酸を発現させることが可能である。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性剤を発現し、したがって宿主ＣＴＬ応答をもたらす。例えば、本願明細書に援用される、免疫化プロトコルで有用なワクシニアベクターおよび方法が記載されている米国特許第４，７２２，８４８号を参照することが可能である。
本願明細書の開示から、本発明の免疫原性剤の治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクターが、当技術分野の専門家には明らかであろう。
本発明の核酸は、当技術分野で知られている「裸ＤＮＡ」の形態のワクチンとして使用することが可能である。本願明細書に援用されるバリー，エム．（Ｂａｒｒｙ，Ｍ．）ら（１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ第３７７巻：６３２−６３５頁）に例えば記載されているように、例えば本発明の発現ベクターを哺乳動物に導入してインビボでポリペプチドを産生することが可能であり、これに対して宿主は免疫応答を開始する。
（樹状細胞療法）
「樹状細胞」（ＤＣ）は、動物において抗原特異的Ｔ細胞応答を開始しうる抗原提示細胞である。ＤＣは、末梢血を含めた動物の体の様々な場所から単離することが可能である。ＤＣ前駆体をインビトロで増生および増殖させる方法は、例えば本願明細書に援用される米国特許第５，９９４，１２６号に記載されている。さらに、増殖性の樹状細胞前駆体から、培養物中で成熟樹状細胞を製造するための方法が記載されている。
「樹状細胞療法」とは、がんの治療方法としての腫瘍免疫療法のために使用される治療用がんワクチンまたは細胞ワクチンに関している。樹状細胞療法は通常、患者からＤＣを単離すること、単離されたＤＣを腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の存在下に培養して、ＤＣとＴＡＡとを接触させること（「抗原装荷またはパルス処理」）、および抗原装荷ＤＣを患者に投与することを含む。単離されたＤＣに抗原を装荷するための他の方法には、腫瘍関連抗原をコードする単離核酸を単離ＤＣへとトランスフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、電気穿孔法またはその他の導入法により導入することが含まれる。細胞に核酸を導入するための一般的な方法は、本願明細書に援用されるオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）１９９５−１９９９）の第９章に記載されている。ＴＡＡは、Ｇ３ＢＰ−２、その断片、変異体、相同体または誘導体であることが好ましい。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。核酸は、当技術分野で知られているように、一過性に、または安定的にＴＡＡを発現することが可能である。
樹状細胞に抗原を装荷または抗原でパルス処理する方法は、本願明細書に援用される（マイデンバウアー（Ｍｅｉｄｅｎｂａｕｅｒ）ら、２００１年、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 第４巻、第５０７頁；レインズ（Ｒａｉｎｓ）ら、２００１年、Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 第３８巻、第３４７頁；ネスレ（Ｎｅｓｔｌｅ）、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第５６巻、第６６７３頁；ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）およびライアリー（Ｌｙｅｒｌｙ）、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ 第４６巻、第８２頁）に記載されている。
本願明細書に援用される米国特許第５，７８８，９６３号には、原発性および転移性前立腺がんに対する免疫治療応答のためにＴ細胞を活性化するための、ヒト樹状細胞を使用する方法および組成物が記載されている。１実施形態では、患者に投与する前に、単離ＤＣをインビトロで前立腺がん抗原に曝露する。
本発明の１実施形態では、薬剤組成物は、本発明によるＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、変異体または誘導体を装荷されているＤＣ抗原を含む。本発明の他の実施形態では、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、変異体または誘導体をコードする核酸でＤＣをトランスフェクションする。ＤＣ細胞療法で使用するための適切なＧ３ＢＰ−２タンパク質断片は、配列番号：１及び２のように記載される。専門家には当然のことであるが、ＤＣ以外の抗原提示細胞を使用可能であり、ＤＣの使用は単に好ましいということにすぎない。
（免疫反応性断片の調製）
本発明はさらに、本発明によるポリペプチド、変異体または誘導体の免疫活性を有する断片を同定する方法も対象としている。この方法は基本的に、ポリペプチド、変異体または誘導体の断片を作製すること、該断片を哺乳動物に投与すること、および該哺乳動物における免疫応答を検出することを含む。このような応答には、乳がんに対して防護効果をもたらしうる、ＮＴＦ２様ドメインを含むＧ３ＢＰ−２、その変異体または誘導体と特異的に結合する因子の産生が含まれうる。
前記の方法で免疫反応性に関して個々の断片を試験する前に、様々な予測方法を使用して、天然抗原と交差反応する抗体を得るために個々の断片を使用することが可能かどうかを推論することが可能である。これらの予測方法は、例えば上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の第１１．１４章に記載されているようなアミノ末端またはカルボキシ末端の配列に基づいてもよい。もしくは、またはこれに加えて、これらの予測方法は、例えば本願明細書に援用されるカイト（Ｋｙｔｅ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５７巻、第１０５頁ならびにホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッズ（Ｗｏｏｄｓ）、１９８３年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２０巻、第４８３頁）に記載されているような親水性の予測に基づいてもよいし、例えば本願明細書に援用されるチュー（Ｃｈｏｏ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）、１９７８年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４７巻、第２５１頁に記載されているような二次構造の予測に基づいてもよい。
通常、１０〜１５残基で構成されるペプチド断片により最適な結果が得られる。６残基ほどの小さい、または２０残基ほどの大きいペプチドも、有効に作用した。次いでこのようなペプチド断片を、例えば上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の第１１．１４節および第１１．１５節に記載されているように、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体分子に化学的にカップリングすることが可能である。
ペプチドを使用して、例えば上記のように動物を免疫化することが可能である。次いで、ペプチドを選択するもととした天然または親ポリペプチドに対する抗体価を、例えば上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らの文献の第１１．１６節および第１１．１４節に記載されているような、ラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡなどにより決定することが可能である。
本願明細書に援用されるシュルツェ（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ）およびフォンダーハイデ（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ）、２００１年により記載された方法を含めた当技術分野でよく知られている方法を使用して、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する免疫反応性タンパク
質断片を決定することが可能である。
（検出キット）
さらに本発明は、生体試料中でＧ３ＢＰ−２を検出するためのキットも提供する。キットは、使用される試験方法の性質に応じて、上記の１種または複数の個々の薬剤を含む。これに関連して、キットは、本発明による１種または複数のポリペプチド、断片、変異体、誘導体、抗体、抗体断片または核酸を含有することも可能である。さらにキットは任意選択で、標識を検出するための適切な試薬、正および負の対照、洗浄液、希釈緩衝剤などを含むことも可能である。例えば、抗体をベースとする検出キットは、（ｉ）本発明によるポリペプチドまたはその断片または変異体（正の対照として使用可能）、（ｉｉ）（ｉ）のＧ３ＢＰ−２またはその断片に結合する本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）および（ｉｉｉ）標的（例えば試料中のＧ３ＢＰ−２）と（ｉｉ）の抗体とで生じる複合体を検出するための適切な手段を含むことが可能であり、検出手段には、例えば金コロイドが含まれうる。検出キット中での使用に適した抗体は、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学に関連して本願明細書中に記載されたものを含む。
さらに検出キットは、核酸を用いるものであってもよい。このような検出キットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で知られている他の増幅方法などの技法を使用して、動物から得られた試験試料から核酸を増幅する工程を含むことが可能である。有用なＰＣＲプライマーには、配列番号：１６〜２１として本願明細書中に記載されたものが含まれうる。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。試験試料は好ましくは、患者から単離された乳房組織である。
本明細書全体を通して、特記されていない限り、「含む」「含有する」および「からなる」との語は、記載された整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を排除することを示すものではないと理解されたい。
本発明を容易に理解し実際に利用するために、ここで特に好ましい実施形態について次の非制限的実施例により記載する。
（クローニング、配列相同性および構造相同性）
（ＰＣＲおよびサブクローニング）
１．１ユニットのＴｔｈ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ断片（バイオテク・インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））および製造者（バイオテク・インターナショナル）供給の緩衝液にテンプレートＤＮＡ１００ｎｇとそれぞれ適切なプライマー５０ｐｍｏｌを含めたものを使用して、プローブを増幅させるため、またはハイブリッドマッピングのためのＰＣＲ反応を実施した。サイクル条件は、９４℃で１分間のＤＮＡの変性、６５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長反応を２５サイクルとした。完全長Ｇ３ＢＰまたはＧ３ＢＰのＮＴＦ２様ドメインのいずれかを増幅するために使用可能なプライマーは以下のとおりである：
完全長ヒトＧ３ＢＰ−１は、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にＧ３ＢＰ−１ｓｔｏｐを使用して増幅させ；完全長ヒトＧ３ＢＰ−２は、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−２ｓｔｏｐを使用して増幅させ；ヒトＧ３ＢＰ−１のＮＴＦ２様ドメインは、プライマーＧ３ＢＰ−１ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−１ｎｔｆを使用して増幅させ；かつヒトＧ３ＢＰ−１のＮＴＦ２様ドメインは、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−２ｎｔｆを使用して増幅させる。
プライマー配列：
Ｇ３ＢＰ−１ｍｅｔ ａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇａａｇｃｃｔａｇｔｃｃｃｃｔｇｃｔ
ｇｇｔ［配列番号：１６］
Ｇ３ＢＰ−２ｍｅｔ ａｔｇｇｔｔａｔｇｇａｇａａｇｃｃｃａｇｔｃｃｇ［配列番号：１７］
Ｇ３ＢＰ−２ｎｔｆ ａｔｃａａｇｔｔｃａｇｇｃｔｃａｇａａｔｃａｃｃ［配列番号：１８］
Ｇ３ＢＰ−１ｎｔｆ ｃｔｇａｇｇｃｔｃａｇｔｇａｃａａａｃｃｃａａｃ［配列番号：１９］
Ｇ３ＢＰ−２ｓｔｏｐ ｇｃｔｔｃａｇｃｇａｃｇｃｔｇｔｃｃｔｇｔｇａａｇｃ［配列番号：２０］
Ｇ３ＢＰ−１ｓｔｏｐ ｃｔｇｃｃｇｔｇｇｃｇｃａａｇｃｃｃｃｃｔｔｃｃ［配列番号：２１］
（ライブラリスクリーニングおよびファージの単離）
プローブとして使用されるプラスミドの調製、ライブラリスクリーニングまたは配列決定を、サムブルックら、１９８９年（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）に記載されているように行った。後期原条期マウス胚ｃＤＮＡ（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）および胎児ヒト脳（オーストラリアのアデレード大学のティー．コックス（Ｔ．Ｃｏｘ）博士の好意により提供されたｃＤＮＡ）のライブラリを１３０ｍｍプレート１枚あたり約２５０００ｐｆｕとなるように播き、２１枚のプレートから２枚ずつフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（登録商標）、アマシャム）を作成した。ライブラリのスクリーニングは、アマシャムのＭｅｇａｐｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡラベリングシステムを使用して製造者の指示に従って調製した放射性プローブを用いて、サムブルックら、１９８９年（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）に記載されているように実施した。ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液および０．１％ＳＤＳ、４２℃であった。ハイブリダイズさせたフィルターを、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で最低３×２０分間洗浄した。精製されたプラークから得たｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にサブクローニングした。
（昆虫細胞におけるタンパク質発現）
（バキュロウイルスを使用したサブクローニングおよびタンパク質の発現）
ＭｍｕＧ３ＢＰ−２ａおよび２ｂをコードする完全長ｃＤＮＡを、ＥａｇＩ（ｍｅｔ 開始コドンから−８５ｂｐ）およびＡｃｃＩ（停止コドンから＋１４０ｂｐ）を使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）から切除した後、クレノウ断片ポリメラーゼを使用して末端を平滑化した。これらのｃＤＮＡをＳｍａＩで直線状にしたｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５’αのコンピテント細胞中に形質転換した。この挿入物の向きを、ＰＣＲにより確認した。正しい向きに挿入物を有するプラスミドを、製造者の指示書（クロンテック＃Ｋ１６０１−１）に従ってＢｓｕ３６Ｉで消化されたＢａｃＰＡＫ６ウイルス発現ベクターを用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＩＰＬＢ−Ｓｆ２１（Ｓｆ２１）細胞にトランスフェクションした。組換えウイルスプラークを、Ｓｆ２１細胞単層から選択し、ＰＣＲにより再度スクリーニングした。コードｃＤＮＡを有するウイルスをＳｆ２１細胞中で増殖させ、タンパク質の発現を確認するために全細胞溶解物をポリアクリルアミドゲル上で可視化した。
（Ｇ３ＢＰ−ｒａｓＧＡＰ１２０相互作用のマッピング）
（融合タンパク質の構築物および発現）
Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２ａのＮ末端またはＣ末端のいずれかの配列を提示する
短縮されたｃＤＮＡ（図２）を、ＧＳＴ融合細菌発現ベクター（ｐＧｅｘ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にサブクローニングして、組換え融合タンパク質を発現させてビーズ結合アッセイ（下記参照）に使用しｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインと相互作用するＧ３ＢＰのサブドメインを同定できるようにした。組換え融合タンパク質の構築物を有するベクターで大腸菌ＤＨ５’のコンピテント細胞を形質転換し、ＩＰＴＧ誘導で発現させた。組換えタンパク質を回収するために、細胞を洗浄してＰＢＳ中に再懸濁させ、超音波で破砕して融合タンパク質を遊離させた。
ｒａｓＧＡＰ１２０の完全なＳＨ３ドメインを包含するアミノ酸１〜３５６を含むｒａｓＧＡＰ１２０のＮ末端ドメイン（バージニア大学のアイ．ジー．マカラ（Ｉ．Ｇ．Ｍａｃａｒａ）教授の好意により提供）を、ｐｒｏＥＸ ＨＴ細菌発現ベクター（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））にサブクローニングして前記のように発現させた。
（ビーズ結合アッセイ）
グルタチオンカラム（ファルマシア）を、１×結合緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＦＳおよびプロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル、オーストラリア所在のロシュ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））中で４℃で一晩ブロッキングした。翌日、このカラムを結合緩衝液Ａで２回洗浄した。ＧＳＴ単独またはＧＳＴ融合タンパク質のいずれかを発現された細菌の溶解物を、２×結合緩衝液Ａで１：１に希釈し、平衡化したＧＳＴカラムに加え、このカラムを４℃で一晩穏やかに振盪させた。過剰なタンパク質を除去するために、カラムを１×結合緩衝液Ａで２回洗浄した。ｒａｓＧＡＰ１２０タンパク質のＨｉｓタグを付加したＮ末端を有する細菌溶解物を、２００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎとを含有する等容量の２×結合緩衝液Ａと合わせた。非特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を阻止するために使用される高濃度のＢＳＡに加え、臭化エチジウムを添加して最終濃度２５ｎｇ／ｍｌとし、過剰な細菌ゲノムＤＮＡおよび細菌ＲＮＡにより生じる非特異的相互作用を排除した。次いでこの混合物を、予め結合処理したＧＳＴカラム（上記）に加え、４℃で２時間結合させた。次に該カラムを結合緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＦＳおよびプロテアーゼ阻害剤）で３回洗浄した。
（タンパク質−タンパク質相互作用のウェスタン分析）
上記のような、タンパク質と複合させたＧＳＴビーズ１μｌを、等容量の２×ＰＡＧＥローディング色素に加え、９５℃で５分間加熱し、７．５％ポリアクリルアミドゲルに装入して１００Ｖで３時間泳動させた。該タンパク質をニトロセルロースにトランスファーし、抗Ｈｉｓ抗体（Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ（登録商標）抗体、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））で探索した。ＧＳＴ単独と結合させたカラムを負の対照として使用し、カラムに結合したままの非特異的Ｈｉｓタグ付加Ｎ末端ｒａｓＧＡＰ１２０がないことを保証した。ＧＳＴカラムが適切なＧＳＴ−Ｇ３ＢＰペプチドで飽和したことを保証するために、すべての実験を抗ＧＳＴで探索してカラムが「エサ（ｂａｉｔ）」ペプチド（データは示さず）を含むことを確認した。
（タンパク質精製）
１．２〜２．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度のＳｆ２１細胞５００ｍｌに、タンパク質を発現させるためのｃＤＮＡを含有するバキュロウイルス（６．６×１０８〜１．６×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）６０ｍｌを感染させ、回転式（ｏｒｂｉｔａｌ）インキュベータ中２８℃で４日間インキュベーションした。細胞をハーベストし、ＰＢＳを用いて４℃で２回洗浄し、ＨＮＴＧ細胞溶解緩衝液５０ｍｌ中で３０秒間のボルテックス処理と４℃で３０
分間の穏やかな振盪とにより溶解し、４℃で９５００ｒｐｍ×１０分遠心分離することにより清澄化した。ＮａＣｌとＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）を含まないＨＮＴＧ細胞溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含む）を加えることにより最終塩濃度を３０ｍＭ ＮａＣｌに調節し、ヘパリンセファロース１ｍｌあたりのタンパク質が１５ｍｇの濃度に予め平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）＃１７−０４６７−０１）と共に回転ミキサーを用いて４℃で一晩インキュベーションした。ゲルを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、グリセロール１０％中で洗浄し、カラム（ファルマシア ＸＫ−２６）に充填した。このカラムを、ファルマシアのＦＰＬＣシステムを用いて流速０．８３ｍｌ／分で１２０分かけて３０ｍＭ〜１．０ＭのＮａＣｌ勾配に供した。試料を１．５ｍｌずつ回収し、ポリアクリルアミドゲルで分離することによりＭｍｕＧ３ＢＰに関してアッセイし、クーマシーブルー染色または６６３抗体を使用するウェスタンブロット分析により可視化した。
組換えＧ３ＢＰタンパク質を含む分画をプールし、終濃度６０ｍＭのＮａＣｌまで再度希釈した。プールした試料を、ゲル１ｍｌあたりタンパク質１．５ｍｇの濃度のタイプ６のアガロース−ポリリボウリジル酸ＡＧＰｏｌｙ（Ｕ）（ファルマシアバイオテク＃２７−５５３５）と共に、回転ミキサーを用いて４℃で一晩インキュベートした。翌朝、ゲルを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、グリセロール１０％で洗浄し、ガラス製カラム（ファルマシア ＸＫ−２６）に充填し、上記のように流速０．３３ｍｌ／分で６０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ勾配に供した。上記のように、分画を０．５ｍｌずつ回収し、上記のようにアッセイし、プールした。プールした試料を上記のようにして３０ｍＭのＮａＣｌまで希釈し、ｍｏｎｏＳ ＨＲ５／５イオン交換カラム（ファルマシア＃１７−０５４７−０１）に流速０．３ｍｌ／分で装荷し、３０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ勾配に供した。分画を０．５ｍｌずつ回収し、上記のようにアッセイした。
（Ｇ３ＢＰ−２抗血清）
（ポリクローナル抗体の製造）
内部ペプチド配列（ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ）に対して作製した抗血清から、Ｇ３ＢＰ−２に対するアフィニティ精製抗体を得た。Ｇ３ＢＰ−１に対して作製したポリクローナル抗体は、他所（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）に記載されており、モノクローナルＧ３ＢＰ−１抗体は市販されている（オーストラリア国シドニー所在のビーディーバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。
（Ｇ３ＢＰ−２抗体の特異性）
ヒト組換えＧＳＴ融合Ｇ３ＢＰ−１、Ｇ３ＢＰ−２ａ、Ｇ３ＢＰ−２ｂおよびＧ３ＢＰ−２ａ短縮体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）への結合能力を試験することにより、Ｇ３ＢＰ−２抗体の特異性を評価した。ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）らの文献（２００１）に以前に記載されたように、ＬＢ／Ａｍｐ寒天平板培地に、完全長Ｇ３ＢＰ−１、２ａおよび２ｂのみならずＧ３ＢＰ−２ａの４種の択一的短縮体（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ１およびＣ２）を含有するｐＧＥＸベクター（アマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＧＳＴ遺伝子融合システム）で形質転換した大腸菌を播種した。各平板培地から１個のコロニーを使用して、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地５ｍｌに接種し、これを３７℃で一晩インキュベートした。製造者（アマシャムバイオサイエンシズ）の指示に従い、ＩＰＴＧで誘導した培養物から、グルタチオンセファロースアフィニティクロマトグラフィーによりＧＳＴ融合タンパク質の単離を行った。グルタチオンで溶離させた後、溶液を５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みをＰＢＳ中で透析した。
精製された組換えＧ３ＢＰ−１、Ｇ３ＢＰ−２ａ、Ｇ３ＢＰ−２ｂおよび４種のＧ３ＢＰ−２ａ短縮体を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ（ミリポア（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ））にトランスファーし、抗Ｇ３ＢＰ−２抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬシステム（アマシャムバイオサイエンシズ）を使用して、ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体によりタンパク質を可視化した。
（細胞抽出物、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット）
ウェスタンブロットにより、ヒト細胞株でのＧ３ＢＰの発現を調べた。細胞を、ＦＣＳ１０％を添加したＤＭＥＭ中インビトロで維持し、トリプシン処理によりハーベストし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＨＮＴＧ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）、１０％グリセロール、１ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１×哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル＃Ｐ８３４０（オーストラリア国キャッスルヒル所在のシグマ（Ｓｉｇｍａ））中に再懸濁した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより細胞溶解物を清澄化し、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のＢＣＡタンパク質アッセイ（米国ロックフォード）を使用してタンパク質濃度を決定した。全部で７５μｇのタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、上記の抗体を使用してウェスタン分析するためにイモビロン−Ｐ ＰＶＤＦ膜（オーストラリア国シドニー所在のミリポア）にトランスファーした。ＥＣＬシステム（オーストラリア国シドニー所在のアマシャムバイオサイエンシズ）を使用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした抗ウサギまたはマウス抗体により、タンパク質を可視化した。
（免疫組織化学のために使用される抗体は極めて特異的であった）
抗体特異性および各種の細胞におけるＧ３ＢＰの発現を評価するために、乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および子宮頚がん細胞株ＨｅＬａを溶解し、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。試料を膜にトランスファーし、ウェスタンブロット法により分析した。市販のモノクローナルＧ３ＢＰ−１抗体（ビーディーバイオサイエンシズ）を使用してＧ３ＢＰ−１発現を評価し、ポリクローナルＧ３ＢＰ−２抗体（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、２００１年）を使用してこれらの細胞株でのＧ３ＢＰ−２の発現を調査した。図９のパネルＡに示されているように、いずれの細胞系もかなりのレベルのＧ３ＢＰ−１（単一の顕著なバンドとして存在）およびＧ３ＢＰ−２（２つの別個のバンドとして存在し、２個の異なるアイソフォームを示している）を発現することは明らかである。同じ発現パターンが、不死化ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔで見られた（データは示さず）。大きな交差反応性はないようであった。しかしながら、Ｇ３ＢＰ−１、２ａおよび２ｂのアミノ酸配列に従った相対分子量と、ＰＡＧＥにより決定された前記タンパク質の見かけの分子量との間には若干の変動があった。データに従えば、Ｇ３ＢＰ−２ａはＧ３ＢＰ−１のすぐ上の地点に分離されるはずだが、実際にはＧ３ＢＰ−１のすぐ下の地点に分離されるようである。
ポリクローナルＧ３ＢＰ−２抗体の特異性をさらに調査した。該抗体を、組換えＧＳＴ融合Ｇ３ＢＰ−１、２ａおよび２ｂ、ならびに複数の異なる短縮形態のＧ３ＢＰ−２に対して試験した。図９のパネルＢに示されているように、抗Ｇ３ＢＰ−２抗体は組換えＧ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂ（それぞれ、レーン３および１）に特異的に結合するが、Ｇ３ＢＰ−１（レーン２）には結合しない。該抗体は、２つの組換えＧ３ＢＰ−２ａ短縮体（レーン５および７）には結合したが、短いＣ末端またはＮ末端短縮体（レーン４および６）には結合しなかった。このことは、図９のパネルＣに示されているように、抗体が結合する領域が中央のドメインであることを示していた。Ｇ３ＢＰ−２抗体はＧ３ＢＰ−２ａおよび２ｂに対して特異的で、該タンパク質の中央の領域のみに結合することが判明した。過剰に高いタンパク質装荷量（１レーン当たり組換えタンパク質３μｇ）にもかかわらず、該抗体はＧ３ＢＰ−１またはＧ３ＢＰ−２の短いほうのＮ末端（Ｎ１）短縮体またはＣ末端（Ｃ２）短縮体とは交差反応しなかった。
（Ｇ３ＢＰは組織特異的に発現する）
（ウェスタンブロット法）
レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法を使用してドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ゲル）でタンパク質を分画し、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシンおよび１５％メタノールを含有するトランスファー用緩衝液を用いてバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のトランスブロットセル中でポリニフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．））上にトランスファーした。エレクトロブロッティングを、１００ボルト、４℃で一晩実施した。このブロットを、１０％スキムミルクを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（ブロッキング溶液）中で室温で１時間インキュベートした後、ブロッキング溶液に含めた１次抗体、抗Ｇ３ＢＰ−１（１：５００に希釈）または抗Ｇ３ＢＰ−２（１：４０００に希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。該ブロットをブロッキング溶液中で１０分間、３回洗浄した後、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしている抗ウサギ抗体（バイオラッド）をブロッキング溶液で１：１００００に希釈した２次抗体中で、３７℃で２時間インキュベーションした。
（全タンパク質の細胞および組織溶解物）
細胞および組織を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）、１０％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７及び１０ｍＭ ＮａＦ）およびプロテアーゼ阻害剤（１ｍｌ当たり１μｇのロイペプチン、１ｍｌ当たり１μｇのトリプシン阻害剤、１μｇのペプスタチンＡ、１ｍｌ当たり２μｇのアプロチニン、１ｍｌ当たり１０μｇのベンズアミジン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｌ当たり１μｇのアンチパイン、１ｍｌ当たり１μｇのキモスタチン）からなるＨＮＴＧ溶解緩衝液中で、ドーンス（ｄｏｕｎｃｅ）型ホモジナイザーを用いて可溶化またはホモジナイズした。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより溶解物を清澄化し、バイオラッドのタンパク質アッセイ（＃５００−０００１）を使用して、ブラッドフォードの色素結合手法によりタンパク質濃度を決定した。
（免疫組織化学）
免疫組織化学を使用して、Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２発現の細胞特異性の程度を分析した。Ｇ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂに対してアイソフォーム特異抗体が作製されるまでは、免疫組織化学的にこれらのアイソフォームを区別することはできないが、一部の組織では、ウェスタンブロットデータ（本願明細書中に記載）と比較することにより、どちらの特異アイソフォームが発現されているかを決定することが可能である。
図６Ａおよび６Ｂは、調査した組織の一部の結果の断面図を示している。パネルＡ〜Ｅは抗Ｇ３ＢＰ−１抗体をプローブとしており、パネルＦ〜Ｊは抗Ｇ３ＢＰ−２抗体をプローブとしている。パネルＡおよびＦは、成体マウス脳の比較を示している。ウェスタン分析により決定されるように（図５、パネルＡ）、脳はＧ３ＢＰ−１を発現しないが（図６、パネルＡ）、一部の細胞集団はＧ３ＢＰ−２ａを発現する（パネルＦ）。
本発明者らは、細胞の形態観察および神経マーカーを用いた二重染色により（データは図示せず）、Ｇ３ＢＰ−２ａ陽性細胞が神経細胞（パネルＦ、Ｎｅで表示）であり、陰性の細胞がグリア細胞（パネルＦ、Ｇｌで表示）であると決定した。腎臓では（パネルＢおよびＣ）、Ｇ３ＢＰ−１は間質細胞または細管の部分集団（パネルＢ）で発現されている
ようであり、Ｇ３ＢＰ−２はすべての細管（パネルＧ中、Ｔｕと表示）で低レベルで発現される。Ｇ３ＢＰ−１もＧ３ＢＰ−２も、糸球体（パネルＧ中、Ｇｍと表示）では発現されない。結腸（パネルＣおよびＨ）では、Ｇ３ＢＰ−１が腸腺の周囲で発現、または間質細胞で発現されている可能性もあり、他方でＧ３ＢＰ−２が、腸腺（パネルＨおよびＩ中、Ｉｇと表示）の管腔で発現されることを示している。Ｇ３ＢＰ−２は小腸の絨毛でも高レベルで発現されるが（図６、パネルＩ）、Ｇ３ＢＰ−１（図６、パネルＤ）は、陰性対照のバックグラウンドの染色を上回るレベルでは検出されなかった。ここでも胃（図６、パネルＥ）ではＧ３ＢＰ−１に関する検出可能な染色は観察されなかったが、Ｇ３ＢＰ−２（ウェスタンブロットデータからみるとおそらくＧ３ＢＰ−２ｂのみ）は、胃内腔の粘液分泌細胞（パネルＪ中、Ｅｐと表示）および幽門腺（パネルＪ中、Ｐｇと表示）の内表面中で発現されるようである。免疫組織化学により調査された他の組織には、心臓、肝臓および脾臓が含まれる（データは図示せず）。心臓および肝臓は、概して低いレベルのＧ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２の発現を示したが、脾臓はＧ３ＢＰ−２に関して陰性でＧ３ＢＰ−１については細胞特異的染色を示した。どのタイプの細胞が、脾臓内で観察されたＧ３ＢＰ−１発現性の島状物を構成しているのかは、さらに調べなければならない。
凍結マウス組織切片（厚さ１０μｍ）を、Ｈｉｓｔｏｇｒｉｐ（登録商標）で処理されたスライド（ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）顕微鏡スライド、ドイツ連邦共和国所在のメンツェル‐グラザー（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ））に固定し、室温で一晩風乾燥させた。切片を、クロロホルム５０％、アセトン５０％中で５分間固定し、風乾させ、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭトリス、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で再水和した。スキムミルク粉末４％を含有するＴＢＳと共に１５分間インキュベートし、続いて正常ヤギ血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））１０％を含有するＴＢＳ中でさらに２０分間インキュベートすることにより、非特異的な抗体の結合を阻害した。次いで切片を抗Ｇ３ＢＰ−１（１：３００に希釈）または抗Ｇ３ＢＰ−２（１：２０００に希釈）いずれかと共に一晩インキュベーションした。ＴＢＳ中で洗浄（３×５分）することにより過剰な抗体を除去し、予め希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ標識された抗ウサギ免疫グロブリン（エンビジョン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ））を３０分間適用した。次いで切片をＴＢＳで洗浄（３×５分）し、基質としてＨ２Ｏ２とともに用いる３，３’−ジアミノベンジジン（ザイメド（Ｚｙｍｅｄ））で２分間発色させた。水道水を穏やかに流すことにより切片を１０分間洗浄して、過剰な色素原を除去し、マイヤーヘマトキシリンで軽く対比染色し、濃度を段階的に上げたアルコールで脱水し、キシレン中で不純物を除去し、次いで、ＤＰＸを使用して封入した（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ） １９８８年）。
（Ｇ３ＢＰの染色体上の位置）
（ＰＡＣの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法）
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、末梢のヒト中期染色体上で行った。ＢｉｏＮｉｃｋ（登録商標）ラベリングシステム（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用したニックトランスレーションにより、ＰＡＣ ＤＮＡをビオチン１４ｄＡＴＰで標識した。染色体の調製およびＦＩＳＨの条件は、以前記載されたもの（ウィッキング（Ｗｉｃｋｉｎｇ）ら、１９９５年）と同様であった。オリンパスのＢＨ２蛍光顕微鏡を使用してスライドを分析した。
（染色体マッピング）
２種のＨｓａＧ３ＢＰ−１特異プライマー、５’ＧＧＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡ［配列番号：１２］および５’ＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧ［配列番号：１３］、ならびに２種のＨｓａＧ３ＢＰ−２特異プライマー、５’ＧＴＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＴＴＡＴ［配列番号：１４］および５’ＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴ
ＧＴＣＧＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＡＧ［配列番号：１５］を使用して、ヒトゲノムＤＮＡの特異的テンプレートを増幅し、続いてＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４（商品名）ハイブリッドパネル上で使用して陽性のものを同定した。次いで、このデータを、ホワイトヘッド研究所／ＭＩＴ ゲノムリサーチセンター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（http://carbon.wi.mit.edu）を介して利用可能なオンラインマッピングソフトウェアにより処理した。
（Ｇ３ＢＰ−２のアンタゴニスト）
Ｇ３ＢＰ−２とその内在性の標的との結合を阻止または妨害するアンタゴニストは、乳がんの予防または治療において有用な可能性がある。アンタゴニストは、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインか、ＮＴＦ２様ドメインに結合する内在性の標的のいずれかを模倣しうる。例えば、ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインは、乳がんにおけるＧ３ＢＰ−２の活性を阻止するためのペプチドアンタゴニストとして使用することができるであろう。ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインのアミノ酸配列は：
ＶＲＡＩＬＰＹ ＴＫＶＰＤＴＤＥＩＳ ＦＬＫＧＤＭＦＩＶＨ ＮＥＬＥＤＧＷＭＷＶ ＴＮＬＲＴＤＥＱＧＬ ＩＶＥＤＬＶＥＥＶＧ ＲＥＥＤ［配列番号：６］
である。前記配列のＮＣＢＩアクセス番号はＰ２０９３６である。アンタゴニストはポリペプチドでよいが、アンタゴニストとして作用しうる非ペプチド分子であってもよい。
上記のネストラー（Ｎｅｓｔｌｅｒ）およびリウ（Ｌｉｕ）、１９９８年および上記のキルクパトリック（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ）ら、１９９９年に記載されているような方法を用いて、コンビナトリアルライブラリを含めた合成化学ライブラリなどの分子ライブラリをスクリーニングすることにより、模倣物質を同定することが可能である。上記のコルブ（Ｋｏｌｂ）、１９９８年のレビューの方法論により、天然に生じる分子のライブラリをスクリーニングすることも可能である。
相同性による三次元（３Ｄ）構造モデリングを使用して、ＮＴＦ−２ポリペプチドの既知の結晶構造からの構造的情報を元に、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインに３Ｄ構造を与えることが可能である。相同性による３Ｄ構造モデリングのための方法は、本願明細書に援用されるブルンデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）ら、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２６巻、第３４７頁に記載されている。相同性による構造モデリングを用いて、ＮＴＦ２様ドメインと相互作用するアンタゴニストを設計することも可能である。
当技術分野でよく知られているように、構造データベースのコンピュータ利用スクリーニング、コンピュータ利用モデリング、または分子結合相互作用を検出する、より慣用的な生物物理的技法を使用して、模倣物質を設計することが可能である。
他の方法には、分子相互作用を同定する様々な生物物理的技術が含まれる。これらの方法により、候補分子がＧ３ＢＰ−２：内在性標的ポリペプチド複合体の形成に影響を及ぼすかどうかによって、候補分子をスクリーニングすることが可能である。競合的放射リガンド結合アッセイ（関連方法に関しては、上記のアップトン（Ｕｐｔｏｎ）ら、１９９９年参照）、分析用超遠心分離、微小熱量測定法、表面プラズモン共鳴および光学バイオセンサを用いる方法などの利用可能な技法に当てはまる方法が、本願明細書に援用される「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ、１９９７年）の第２０章に提示されている。
（乳がんの診断）
個人の乳がんを診断するためにＧ３ＢＰ−２を使用することが可能である。１実施形態では、この方法は（ｉ）哺乳動物から得られた試験試料をＧ３ＢＰ−２ポリペプチドの発現に関してアッセイする工程と；（ｉｉ）試験試料からのＧ３ＢＰ−２発現と、正常哺乳動物からの正常試料での発現とを比較する工程と；（ｉｉｉ）試験試料でのＧ３ＢＰ−２の発現が正常試料とは異なる場合に、該哺乳動物が乳がんを有する可能性が高いと診断する工程とを含みうる。「異なる」との用語は少なくとも、補助付き手段または補助無し手段により検出可能な差異を意味する。例えば、補助無し手段には、ウェスタンブロットでの「バンド」の濃さもしくは暗さ、またはＥＬＩＳＡのウェルの色の濃さなどの相対的な見た目のタンパク質量の差異をヒトが視覚的に比較することが含まれる。補助付き手段には、例えば組織切片の抗体結合を評価するための顕微鏡、またはタンパク質量の差異を検出および測定することが可能な装置、例えばＥＬＩＳＡプレートリーダーもしくはＦＡＣＳの使用が含まれる。乳がんを診断する方法には、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチドまたはその断片に結合する抗体を使用して、試験試料中のＧ３ＢＰ−２ポリペプチドまたはその断片を検出する工程が含まれうる。例えば図７〜９で使用される本願明細書に記載の抗体は、診断キットにおいて役に立ち得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。
乳がんを診断する方法には、当技術分野で一般に知られている、例えばウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および免疫組織化学などの、ポリペプチドを検出する方法が含まれうる。本願明細書に記載されているウェスタンブロット分析および免疫組織化学の実施例は、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体を検出する際に有用であろう。例えば図５に示されているように、サイズによって識別可能なＧ３ＢＰ−２の異なるアイソフォーム、すなわちＧ３ＢＰ−２ａおよびＧ３ＢＰ−２ｂの発現を検出する際は、ウェスタンブロット分析が有用である。例えば、図６Ａおよび６Ｂに示されているように、Ｇ３ＢＰ−２の細胞レベルおよび細胞内の局在化を測定する際には、免疫組織化学が有用である。それぞれ個々のＧ３ＢＰ−２アイソフォームの発現を検出する際には、Ｇ３ＢＰ−２ａまたはＧ３ＢＰ−２ｂのいずれかに特異的に結合する抗体が有用である。
（免疫組織化学による、ヒトのがんにおけるＧ３ＢＰ−２タンパク質の検出）
（患者）
１９８１年から１９９０年の間にロイヤルブリスベーン病院（Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の病理学部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）で診断を受けた５９例の浸潤性乳がんをランダムに選択した。記録保管用のパラフィンブロックは、ロイヤルブリスベーン病院から倫理承認された被検物であり、すでに以前に上皮ムチンＭＵＣ１発現についての比較的大きな研究の一部として特性解析されている（マクガッキン（ＭｃＧｕｃｋｉｎ）ら、１９９５年）。腫瘍の組織分類およびグレードの判定を、ブルーム（Ｂｌｏｏｍ）およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）のシステムのノッティンガム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ）による変法（エルストン（Ｅｌｓｔｏｎ）およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）、１９９０年）に従って行った。生化学的デキストランチャコール法により決定された結節の状態およびエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を含むデータを、臨床カルテおよび病理記録から得た。
（乳がん切片の免疫組織化学）
乳房腫瘍切片（３〜４μｍ）を接着スライドに付着させて３７℃で一晩乾燥させた。標準的なプロトコルを使用して、切片のワックスを除去し、アルコール濃度の勾配を脱イオン水まで低下させることにより再水和させた。Ｇ３ＢＰ−１に関して染色しようとする切片は、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中１２０℃で２０分間オートクレーブすることにより、熱処理による抗原性賦活化に供した。Ｇ３ＢＰ−２用の試料は、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０〜９．２）中マイクロ波をかけて５分間沸騰させ、これを新鮮なト
リス−ＨＣｌ緩衝液を用いて繰り返すことにより、熱処理による抗原性賦活化に供した。すべての切片を室温まで冷却させ（２０〜３０分）、次いでｐＨ７．４のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で洗浄した。１．０％Ｈ２Ｏ２、０．１％ＮａＮ３を含むＴＢＳ中で切片を１０分間インキュベートすることにより、内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片をＴＢＳ中で洗浄し、続いて４％脱脂スキムミルク粉末を含むＴＢＳ中で１５分間インキュベートした。切片をＴＢＳ中で切片を軽くすすぎ、次いで１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）と共に加湿室中で２０分間インキュベートした。過剰な正常血清を静かに除き、室温で一晩１次抗体（または陰性対照としてＴＢＳ）と反応させた。切片をＴＢＳ中で洗浄し、次いで２次抗体（デンマーク国グロストルップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）所在のＤＡＫＯ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）キット）と共に４５分間インキュベートした。切片をＴＢＳ中で洗浄し、基質としてＨ２Ｏ２を用いて３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で発色させた。切片を流水（水道水）で穏やかに洗浄し、次いでマイヤーヘマトキシリン中で軽く対比染色し、濃度を段階的に上げたアルコールを用いて脱水し、キシレン中で不純物を除去し、ＤＰＸ封入剤に封入した。
（Ｇ３ＢＰ−２は、乳がんの８８％で過剰発現する）
Ｇ３ＢＰ−２発現の測定に加えて、Ｇ３ＢＰ−１の発現についても、図８に示すように免疫組織化学により２４例の乳がんについて調べた。このうち、２２例の切片は浸潤性腺管がん（ＩＤＣ）であり、２例は、浸潤性小葉がん（ＩＬＣ）であった。核を青色に染色するヘマトキシリンですべての切片を対比染色し、ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、茶色の染色として見られるようにＧ３ＢＰ−１の発現を視覚化した（図８、パネルＡ〜Ｃ参照）。ほとんどの正常細胞が細胞質で検出可能な程度のＧ３ＢＰ−１発現を示した（図８、パネルＣ参照）。２例の正常腺管（ＮＤ）が図８のパネルＣで見られ、Ｇ３ＢＰ−１の細胞質での発現は、明確な茶色の染色として見られるように明らかである。Ｇ３ＢＰ−１染色は、図８のパネルＡおよびＢに示されているＩＤＣ切片でも明らかだが、隣接する結合組織（ＣＴ）は、検出可能なレベルではＧ３ＢＰ−１を発現しない。図８のパネルＡおよびＢの腫瘍細胞は、図８のパネルＣの正常腺管で見られるＧ３ＢＰ−１の発現と比較して、細胞質中でより高いレベルのＧ３ＢＰ−１を発現するようである。
多くの症例において腫瘍染色は不均質であり、一部の例では、Ｇ３ＢＰ−１が細胞の一方に一層顕著に局在しているようであった。このことは、図８のパネルＡの腫瘍細胞の一部（矢印で示されている）において特に明確にみることが可能である。正常細胞のいずれにおいても核の染色はなかったが、２４の腫瘍症例のうちの２例では、腫瘍細胞の１０％未満に明らかな核の染色が含まれていた。
まとめると、ほとんどの正常乳房細胞はＧ３ＢＰ−１を発現したが、調査したすべての腫瘍細胞がある程度Ｇ３ＢＰ−１を過剰発現するようであった（表３（図１４）参照）。Ｇ３ＢＰ−１の過剰発現と、リンパ節波及、ホルモン受容体の状態あるいは核または組織学的悪性度（グレード）などの乳がんの臨床病理学的パラメータとの間に、重大な関連は見られなかった。
Ｇ３ＢＰ−２発現の変化に関する免疫組織化学により、全部で５８の乳房腫瘍例を調査した。これらのうち５４例の腫瘍がＩＤＣで、４例がＩＬＣであった。Ｇ３ＢＰ−１の場合と同様に、すべての切片をヘマトキシリンで対比染色し、Ｇ３ＢＰ−２の発現をホースラディッシュペルオキシダーゼで視覚化した（図７および図８のパネルＤ〜Ｏ）。Ｇ３ＢＰ−１の場合と異なり、免疫組織化学による結果は、小葉および腺管上皮組織および周囲の結合組織を含めた乳房の正常葉（図８、パネルＤ参照）でのＧ３ＢＰ−２の検出可能な発現を示さなかった。図８のパネルＥおよびＦは２種の異なる腺管をより高い倍率で示すものであり、パネルＥは腺管の横断面を、パネルＦは縦断面を示している。これらから分かるように、乳房の正常腺管中またはその周囲の結合組織の細胞内には、検出可能なＧ３
ＢＰ−２の発現はない。
免疫組織化学により、乳房の腫瘍ではＧ３ＢＰ−２が過剰発現されることが判明した。図８のパネルＧは、ＩＤＣに隣接する正常腺管を示している。茶色の染色により分かるように、Ｇ３ＢＰ−２は腫瘍中では高発現されるが、正常腺管では発現されない。このことは、正常腺管に隣接するＩＤＣをより高倍率で示すパネルＨでより明確に見ることが可能である。この場合にも、正常腺管はＧ３ＢＰ−２を発現せず、ＩＤＣはＧ３ＢＰ−２を高発現している。
乳房の腫瘍におけるＧ３ＢＰ−２の過剰発現は、調査した全ての乳房腫瘍で観察されたわけではない（１２％）。図８のパネルＩは、Ｇ３ＢＰ−２を発現しないＩＤＣの１例を示している。ヒトの乳房腫瘍でＧ３ＢＰ−２の発現を調査した際に特記された他の重要な観察は、一部の症例では、腫瘍の間に存在する結合組織内の正常細胞の核内でＧ３ＢＰ−２が発現され（矢印で表示）、腫瘍から離れている結合組織内の細胞中では発現されないということである（図８、パネルＪ参照）。
図８のパネルＫは、腫瘍および隣接する結合組織を低倍率で示す例である。これから分かるように、Ｇ３ＢＰ−２は腫瘍周辺の結合組織内の細胞で発現され、発現は細胞が腫瘍から離れるほど低くなっている。これらの細胞はおそらく浸潤性リンパ球である。というのも腫瘍細胞の周りにはこれらの細胞からなる比較的大きな集団が存在するようであるからである。このことは、Ｇ３ＢＰ−２の発現が何らかの腫瘍細胞により分泌された因子に応答して誘発されるか、またはＧ３ＢＰ−２が走化性様効果をもたらすことを示唆しうるものである。
表２（図１３）は、Ｇ３ＢＰ−２発現に関して調査されたすべての乳房腫瘍の結果を示している。さらに、エストロゲン受容体の状態、腫瘍のグレードおよびステージを含めた各乳房腫瘍についての入手可能な情報が列記されている。まとめると、調査したすべての腫瘍のうち８８％がＧ３ＢＰ−２を過剰発現し、Ｇ３ＢＰ−２過剰発現と乳がんの臨床病理的パラメータ（ステージ、ホルモン受容体の状態または核もしくは組織学的グレードなど）との間に重大な関連性は見出されなかった。
スクリーニングしたヒト乳房腫瘍の大部分においてＧ３ＢＰ−２が過剰発現され、多くの症例で明らかな核への局在（図８、パネルＭ〜Ｏ参照）を示す。パネルＬ〜Ｏは、ＩＤＣの４種の異なる症例における３種の異なる細胞内局在化を示している。パネルＬは、Ｇ３ＢＰ−２がもっぱら細胞質に見られる乳房腫瘍の例である。パネルＭおよびＮは、Ｇ３ＢＰ−２が核および細胞質で見出される乳房腫瘍の２例である。パネルＯは、核膜領域の周囲に局在しているＧ３ＢＰ−２を示している。これらの腫瘍は、Ｇ３ＢＰ−２の細胞質分布も示している。これは、Ｇ３ＢＰ−２がｉｎ ｓｉｔｕで核内に見いだされた初めての事例である。Ｇ３ＢＰ−２を発現するすべての腫瘍の約５０％が核内にＧ３ＢＰ−２を含有するが、ヘマトキシリン対比染色でマスキングされることにより、低いレベルでＧ３ＢＰ−２を発現する一部の細胞では、核染色が観察されなかった可能性があることに注意すべきである。核染色は、症例によって様々であった。一部の症例ではすべての細胞の核にＧ３ＢＰ−２を有したが、他の症例では核が染色された細胞は１０％未満であった。核内でＧ３ＢＰ−２を発現する細胞の比率は、腫瘍のグレードまたは転移のレベルと関連はない。
（細胞周期におけるＧ３ＢＰ−２の発現）
興味深いことに、Ｇ３ＢＰ−２は核へと往復することが可能であり、その動きは細胞周期に依存しているようである（図８Ｐ〜８Ｔ参照）。血清飢餓による休止細胞中ではＧ３
ＢＰ−２は細胞質に局在しているが（図８Ｐ）；Ｇ０期から細胞が開放されると２時間以内にＧ３ＢＰ−２の核内への移動が見られ（図８Ｑ〜８Ｔ）、５時間目にはほぼ全部が核内にあるようである（図８Ｒ）。この後、Ｇ３ＢＰは両方のコンパートメントでも見ることが可能であり、このことは核と細胞質との間を往復することと一致する（図８Ｓおよび８Ｔ）。
図８Ｐ〜８Ｔは、同調させたＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫蛍光を示している。細胞を血清飢餓により同調させた後、血清刺激により細胞周期へと入らせる。血清飢餓の後数時間ごとに、免疫蛍光技術を使用してＧ３ＢＰ−２に関して細胞を染色した。図８Ｐは、Ｇ０期（時間＝０）の細胞におけるＧ３ＢＰ−２の細胞内局在を示している。血清刺激後、したがって細胞周期開始後の時間は、図８Ｑ、８Ｒ、８Ｓおよび８Ｔについてそれぞれ２時間、５時間、９時間および１２時間である。
（ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞周期同調）
血清欠乏法（トビー（Ｔｏｂｅｙ）ら、１９８８年）を使用して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞周期同調を実施した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＣＳ中サブコンフルエントな条件でカバーガラス上に播種した。２４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、無血清培地を該培養物に添加して２４時間放置した。次いで無血清培地を、１０％ＦＣＳを含む培地と交換した。血清飢餓の間と、血清刺激の後２、５、９および１２時間目に、カバーガラスを培地から外した。次いで、カバーガラスを、Ｇ３ＢＰ−２の発現を調査する免疫蛍光法のために処理した。
（培養細胞の免疫蛍光）
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をカバーガラス上で成長させ、上記のように処理し、ＰＢＳで３×２分間洗浄して室温で一晩乾燥させた。細胞を、１００％冷アセトンを用いて５分間固定し、放置して乾燥させ、次いでＰＢＳで３×５分間カバーグラスを洗浄することにより再水和した。次に０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）を含むＰＢＳ中でカバーガラスを５分間インキュベートすることにより、細胞の透過性を高めた。次いで、カバーガラスをＰＢＳで３×５分間洗浄することにより、前記界面活性剤を除去した。ＰＢＳで適切な濃度に希釈した１次抗体と反応させて４℃で一晩放置した。翌朝、１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で、カバーガラスを３×５分間洗浄した。次いで、２次抗体と反応させて室温で１時間インキュベートした。２次抗体は、ＦＩＴＣまたはローダミンいずれかの蛍光タグとコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体（米国ユージーン所在のモレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））であり、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）を含むＰＢＳで製造者の指定の希釈率に希釈した。次いで、カバーガラスを、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（登録商標）を含むＰＢＳ中で２×５分間、その後ＰＢＳ中で２×５分間洗浄した。最後に、カバーガラスを５０％グリセリン／５０％ＰＢＳを用いてスライド上にマウントし、マニキュア液で密封した。オリンパスのＰｒｏｖｉｓ ＡＸ−７０を使用して画像化し、ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ１．６２フレーム取込みソフトウェアを使用してＤＡＧＥ−ＭＴＩ ＣＣＤカメラでデジタル形式で取り込んだ。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５画像処理ソフトウェアを使用して画像を分析した（アドビシステムズインコーポレイテッド（Ａｄｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、イーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９６年）。
（樹状細胞療法）
本発明は、動物において乳がんを予防または治療するための薬剤組成物および方法を提供する。薬物組成物は、予めＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体と接触させることにより抗原を装荷またはパルス処理した単離抗原提示細胞を含む。単離
抗原提示細胞は、樹状細胞療法を受ける患者から単離された樹状細胞であることが好ましい。抗原提示細胞は、樹状細胞前駆体であってもよい。抗原提示細胞を、抗原装荷の前または後にインビトロで培養して、増殖または細胞数を増加させてもよい。抗原提示細胞にＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体を装荷する代わりに、またはそれに加えて、抗原提示細胞を、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体をコードする核酸でトランスフェクションすることも可能である。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
動物において乳がんを予防または治療する方法は、予めＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体を装荷またはパルス処理された抗原提示細胞；または予めＧ３ＢＰ−２、その断片、相同体または誘導体をコードする核酸でトランスフェクションされた細胞を含有する薬剤組成物を該動物に投与する工程を含む。
１実施形態では、該方法は：（ａ）動物から抗原提示細胞を単離する工程と；（ｂ）単離された細胞とＧ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体とを接触させて、該単離細胞に抗原を装荷またはパルス処理する工程と；（ｃ）装荷またはパルス処理された単離細胞を動物に投与する工程とを含む。細胞は、薬剤組成物を投与される動物から単離された自己樹状細胞であることが好ましい。
別の実施形態では、本発明の方法は：（ａ）動物から抗原提示細胞を単離する工程と；（ｂ）単離された細胞を、Ｇ３ＢＰ−２ポリペプチド、その断片、相同体または誘導体をコードする核酸でトランスフェクションする工程と；（ｃ）トランスフェクションされた細胞を動物に投与する工程とを含む。細胞は、薬剤組成物を投与される動物から単離された自己樹状細胞であることが好ましい。
どちらか一方または両方の実施形態において、該方法は、工程（ｃ）の前に単離された抗原提示細胞を培養して増殖させる工程をさらに含むことも可能である。
（Ｇ３ＢＰ−２および乳がんのための新規免疫療法）
腫瘍負荷（ｔｕｍｏｒ ｌｏａｄ）が最小であること、および免疫系による介入の理想的なターゲットであることから、免疫による予防は、乳がんにとって非常に魅力的な療法である。免疫学的予防療法のために最も有望な戦略の１つは、免疫応答の開始（ハート（Ｈａｒｔ）、１９９７年）および先天免疫と適応免疫との活発な連携（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、２０００年）を担う樹状細胞（ＤＣ）、すなわち免疫系の最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用に基づく。研究者により、健康および疾患におけるＤＣの重要な役割が研究され（ホー（Ｈｏ）ら、２００１年）、そのＡＰＣとしての能力を最適化するメカニズムが構築された（ホー（Ｈｏ）ら、２００２年）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発するＤＣの有効な能力を、様々な腫瘍を治療するために利用することは成功している（総説：ロペス（Ｌｏｐｅｚ）およびハート（Ｈａｒｔ）、２００２年）。さらに、血液から大量のＤＣを得ることが可能であることは証明されている（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら、２００２年）。この非常に有望な研究分野はまだ、一般的な形で適用される前の決め手を待っている。
乳がんの研究において、最も重要なハードルは、十分に強力な免疫応答をもたらしうる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を得られるかどうかである。理想的なＴＡＡは、がん細胞の発生に不可欠で、がん細胞で過剰に（または選択的に）発現され、細胞内に局在化し、免疫系により認識されるという特徴を有するはずである（パードル（Ｐａｒｄｏｌｌ）、２００２年）。利用可能な安定なＴＡＡ候補は２種のみであり、これらは近年試験されている。ＭＵＣ−１（ＣＤ２２７）は、ＧＣリッチなランダムリピートからなる大きな細胞外ドメインを特徴とする、通常は上皮細胞の頂端側表面に局在している膜貫通型ムチン分子であり（ジェンドラー（Ｇｅｎｄｌｅｒ）ら、１９９１年）；同分子は乳がん細胞で高発現さ
れ、９０％を超える乳がん患者で過剰発現される（ハッデン（Ｈａｄｄｅｎ）、１９９９年）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、乳がん患者の２０〜３０％で過剰発現される上皮成長因子受容体に相同な膜貫通型糖タンパク質である（ワン（Ｗａｎｇ）ら、２００１年）。この分子は疾患の侵攻性に関連があり、予後不良の指標である。このタンパク質に対する細胞性および液性の両方の免疫応答が患者で検出されている（ワン（Ｗａｎｇ）およびハン（Ｈｕｎｇ）、２００１年）。加えて、他の悪性疾患と共通のＴＡＡ、例えば、ＭＡＧＥ１及び３（黒色腫抗原）が、乳がんのそれぞれ２０％および２６％で発現される（マシノ（Ｍａｓｈｉｎｏ）ら、２００１年；オッテ（Ｏｔｔｅ）ら、２００１年；ルッソ（Ｒｕｓｓｏ）ら、１９９５年）。最後に、炭水化物抗原ｇｌｏｂｏ Ｈ（ギレフスキー（Ｇｉｌｅｗｓｋｉ）ら、２００１年）などの新規の抗原が最近は出現しており、これらは現在評価されているところである。利用可能なＴＡＡ候補のいずれも、乳がんの最適なＴＡＡに関する前記の基準を満たしていない。しかしながら、本発明の研究者らの最近のデータは、Ｇ３ＢＰタンパク質が優れたＴＡＡ候補に相当することを示している。
本願明細書に援用されるゲノム／免疫原性手法（シュルツェ（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ）およびフォンダーハイデ（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ）、２００１年）に従って、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の最も一般的にみられる対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子についてＧ３ＢＰタンパク質の免疫原性を検討した。予測されたＨＬＡ結合配列を、ウェブ上のアルゴリズム（例えば、ＳＹＰＥＩＴＨＩ（http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/）およびＢＩＭＡＳ（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/）より提供される）を適用して同定し、更なる評価のために合成ペプチドを製造した。図１０に示されているように、製造したペプチドから、ＭＨＣ／ペプチド結合アッセイによりＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に非常に強力に結合することが証明された。Ｔ２細胞を、示されているペプチド希釈物と共にインキュベーションし、ＨＬＡ発現をフローサイトメトリーにより測定した。Ｇ３ＢＰ−２の２種のペプチド（ペプチド１及び２）を試験し、対照マトリックスタンパク質インフルエンザペプチド５８〜６６を、参照として使用した。ペプチド１はアミノ酸配列ＫＬＰＮＦＧＦＶＶを有し、ペプチド２はアミノ酸配列ＩＭＦＲＧＶＲＬを有する。ペプチド１及び２は、対照のインフルエンザＭＰ５８〜６６ペプチド（ＣＴＬエピトープであると確定されている）の親和性と同等の親和性でＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合した。
健康な個人由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中でＤＣにより誘発し、ＥＬＩＳＰＯＴ（ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、２０００年）で試験したＣＴＬ応答の発生に関して、様々なペプチドを評価した。ペプチド１でパルス処理されているか、パルス処理されていないＴ２細胞（ターゲット）を５１Ｃｒで標識し、様々な比でＩＨ７クローン（エフェクター）と共にインキュベートした。４時間後、細胞溶解物から放出された５１Ｃｒを測定し、式：１００×（実験による放出量−自発的放出量）／（全放出量−自発的放出量）を用いて特異溶解率を算出した。全放出量は、標識されたターゲットを界面活性剤で溶解することにより得た。
ペプチド１に関して強力な応答が有効に生じたが、これは、２つの別の供給源における１回（および２回）の刺激の後にＩＦＮ−γ産生ペプチド特異的ＣＤ８＋リンパ球が高頻度で得られたことにより証明された。これらの結果は、ペプチド１エピトープが確かにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーに含まれており、したがって免疫原性であることを示している。この発見を確認するために、慣用的なクロム放出アッセイにおいてペプチド装荷ターゲットを同定しうる（図１１）、すなわち有効な抗腫瘍応答のための望ましいプロファイル（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）およびハート（Ｈａｒｔ）、２００２年、本願明細書に援用）のペプチド１特異ＣＴＬクローンを作製した。これらのクローンは、がん細胞中のこの抗原の発現を評価する際に役立つものであり、この分子をＴＡＡとして正式に評価することを可能にする。
本願明細書を通して、本発明をいずれか１つの実施形態または特定の特徴の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することを意図してきた。したがって当然ながら、当技術分野の専門家であれば、このわずかな開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく、例示された個々の実施形態の様々な修正および変更を行うことが可能である。
本願明細書に挙げられている各特許文献および学術文献、コンピュータプログラムならびにアルゴリズムの開示全体が、本願明細書に援用される。
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ＨｓａＧ３ＢＰ−２ａのヌクレオチド配列［配列番号：４］およびコードされるアミノ酸配列［配列番号：５］を示す図。 ＳＨ３ドメインを含む、ｒａｓＧＡＰ１２０のＮ末端のアミノ酸配列［配列番号：６］を示す図。 Ｇ３ＢＰタンパク質ファミリー［配列番号：５、７〜１１］をまとめて整列させた図。 Ｎ末端ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインとＧ３ＢＰとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の解析を示す図。 様々な組織中でのＧ３ＢＰ発現のウェスタンブロット分析を示す図。 抗Ｇ３ＢＰ−１および抗Ｇ３ＢＰ−２抗体をプローブとした成体マウス組織の免疫組織化学を示す図。 抗Ｇ３ＢＰ−１および抗Ｇ３ＢＰ−２抗体をプローブとした成体マウス組織の免疫組織化学を示す図。 ２種のヒト乳がんのＧ３ＢＰ−２免疫組織化学を示す図。パネルＡは原位置にある腺管腫瘍であり、パネルＢは浸潤性のがんを示す。 Ｇ３ＢＰに特異的な抗体を用いた、乳房腫瘍の切片の免疫組織化学的染色および同調ＮＩＨ３Ｔ３の免疫蛍光分析を示す図（Ａ〜Ｔ）。パネルＡ〜Ｃは、Ｇ３ＢＰ−１に特異的な抗体を使用して染色された乳房腫瘍の切片である。パネルＡおよびＢは染色されたＩＤＣを示しており、パネルＣは、染色された正常な腺管（ＮＤ）の小断面を示している。パネルＤ〜Ｏは、ヒト乳房腫瘍のＧ３ＢＰ−２の免疫組織化学を示している。パネルＤは正常な葉を示しており、パネルＥおよびＦはそれぞれ正常な腺管の横断面および縦断面を示している（ＣＴは結合組織を意味する）。パネルＧおよびＨはＩＤＣに隣接する正常な腺管を示している（ＤＣは腺管がんを意味する）。パネルＩはＧ３ＢＰ−２を発現しないＩＤＣを示している。パネルＪは、正常結合組織に隣接するＩＤＣを示している。矢印は、核内のＧ３ＢＰ−２が正に染色される結合組織内の細胞を示している。パネルＫは、正常結合組織に隣接するＩＤＣ（左側）を低倍率で示している。パネルＬ〜Ｏは、ヒト乳がんにおけるＧ３ＢＰ−２の様々な細胞内局在を示している。すべてのパネルは様々な患者由来の腺管がんである。パネルＬはＧ３ＢＰ−２の細胞質局在を示す。パネルＭおよびＮは、２種の異なる乳がん症例におけるＧ３ＢＰ−２の核局在を示している；細胞質での発現はこれらの切片でも観察される。パネルＯは、核膜領域の周囲におけるＧ３ＢＰ−２の発現を示し；細胞質の染色も観察される。パネルＰ〜Ｔは、同調化ＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫蛍光分析を示す。パネルＰは、Ｇ０相（時間＝０）での細胞中でのＧ３ＢＰ−２の細胞内分布を示す。血清刺激後、したがって細胞周期開始後の時間は、パネルＱ、Ｒ、ＳおよびＴについてそれぞれ２時間、５時間、９時間および１２時間である。 Ｇ３ＢＰ−２抗体の抗体特異性を示す図。乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および子宮頚がん細胞株ＨｅＬａ（それぞれ４３５およびＨｅＬａと表示）を溶解させ、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。試料を膜にトランスファーし、表示のようにポリクローナルＧ３ＢＰ−２抗体または市販のＧ３ＢＰ−１抗体のいずれかをプローブとして探索した（パネルＡ）。精製された組換えＧ２ＢＰ−２ｂ（レーン１）、Ｇ３ＢＰ−１（レーン２）およびＧ３ＢＰ−２ａ（レーン３）を、Ｇ３ＢＰ−２ａの４種の様々な短縮体、Ｎ１（レーン４）、Ｃ１（レーン５）、Ｃ２（レーン６）、Ｎ２（レーン７）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。これらの試料を膜にトランスファーし、Ｇ３ＢＰ−２抗体（パネルＢ）をプローブとして探索した。パネルＣは、Ｇ３ＢＰ−２ａおよび組換えＧ３ＢＰ−２ａ短縮体（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ１、Ｃ２）の図式化して示すものである。パネルＣは、Ｇ３ＢＰ−２ポリクローナル抗体が結合する領域も示している。挿入図は、Ｇ３ＢＰ−２ａのサブドメインを示している。 Ｔ２結合アッセイにより測定された、Ｇ３ＢＰ−２ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合を示す図。 様々なエフェクター細胞：ターゲット細胞比を使用したクロム放出細胞傷害性アッセイに関するデータを示すグラフ。 ポリペプチドにおける保存的置換の例を示す表（表１）。 ５８例の乳房腫瘍切片におけるＧ３ＢＰ−２の発現をまとめた表（表２）。ＤＣＩＳ＝原位置にある腺管がん、ＩＤＣ＝浸潤性腺管がん、ＬＣＩＳ＝原位置にある小葉がん、ＩＬＣ＝浸潤性小葉がん。悪性度（グレード）は、各種の因子に応じて割り当てた。高度に分化した腫瘍は通常グレード１としたが、未分化な腫瘍はグレード３とした。ＥＲ＝エストロゲン受容体の状態。結節の状態は、リンパ節中の腫瘍の有（＋）無（−）を表す。ＮＧ＝グレード付けせず。ＮＤ＝測定せず。細胞質と記されたカラムは、細胞の細胞質中でのＧ３ＢＰ−２の発現レベルを示している（１＋＝低、２＋＝中、３＋＝高）。特に記載のない場合、細胞集団の７５％より多い場合を染色ありとした。核と記されたカラムは、がん細胞の核内のＧ３ＢＰ−２の有（＋）無（−）を示している。 ２４例の乳房腫瘍切片におけるＧ３ＢＰ−１についてまとめた表（表３）。ＤＣＩＳ＝原位置にある腺管がん、ＩＤＣ＝浸潤性腺管がん、ＬＣＩＳ＝原位置にある小葉がん、ＩＬＣ＝浸潤性小葉がん。悪性度（グレード）は、各種の因子に応じて割り当てた。高度に分化した腫瘍は通常グレード１としたが、未分化な腫瘍はグレード３とした。ＥＲ＝エストロゲン受容体の状態。結節の状態は、リンパ節中の腫瘍の有（＋）無（−）を表す。ＮＧ＝グレード付けせず。ＮＤ＝測定せず。細胞質と記されたカラムは、細胞の細胞質中でのＧ３ＢＰ−１の発現レベルを示している（１＋＝低、２＋＝中、３＋＝高）。特に記載のない場合、細胞集団の７５％より多い場合を染色ありとした。核と記されたカラムは、がん細胞の核内のＧ３ＢＰ−１の有（＋）無（−）を示している。Ｎｅｇａｔｉｖｅ＝無。
ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＳＨ３−ドメイン結合タンパク質（Ｇ３ＢＰ）は、ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、ｒａｓＧＡＰ１２０に特異的に結合することが判明しているＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するタンパク質ファミリーである（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年；ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）。さらに、このタンパク質ファミリーは、ｃ−ｍｙｃ転写物に対してＲＮＡアーゼ活性を有し得る（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら、１９９８年）ＲＮＡ結合タンパク質である（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９７年）ことが判明している。ｒａｓ−ＧＡＰシグナル経路およびｃ−ｍｙｃはいずれも、発がん活性に関与している（ボス（Ｂｏｓ）、１９８９年；ファッチーニ（Ｆａｃｃｈｉｎｉ）およびペン（Ｐｅｎｎ）、１９９８年）。提示されている証拠から、Ｇ３ＢＰタンパク質ファミリーは、前述の経路の構成成分を利用してｍＲＮＡの安定性を調節し、これらの経路を介して発がん性のシグナルまたは因子を調節しうる新規なシグナル伝達メカニズムのメンバーであることが示唆されている。これらの活性は、そのＳＨ３ドメイン結合活性（パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら、１９９６年）、そのＲＮＡアーゼ活性（ギャロウジ（Ｇａｌｌｏｕｚｉ）ら、１９９８年）またはそのヘリカーゼ活性（コスタ（Ｃｏｓｔａ）ら、１９９９年）を介して変調されうる。Ｇ３ＢＰは近年、一部のがんにおいて転写レベルで上方制御される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが判明している（ギタード（Ｇｕｉｔａｒｄ）ら、２００１年）。
第１の態様では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメインを含み、前記ＮＴＦ２様ドメインを介して他のタンパク質に結合することが可能な単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片を提供する。
Ｇ３ＢＰ−２タンパク質は、Ｇ３ＢＰ−２ａおよび／またはＧ３ＢＰ−２ｂタンパク質を含むことが好ましい。
第９および第１０の態様のＧ３ＢＰ−２断片は、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］およびＩＭＦＲＧＥＶＲＬ［配列番号：２］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
免疫化は、予防的なものでも、乳がんを有する動物の治療としてであってもよい。
Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片は、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］およびＩＭＦＲＧＥＶＲＬ［配列番号：２］からなる群から選択することが好ましい。
（Ｇ３ＢＰは組織特異発現を示す）
Ｇ３ＢＰ−１およびＧ３ＢＰ−２の配列から決定したアイソフォーム特異的な合成ペプチドに対して作製した抗体を使用して、成体マウス組織由来の全細胞溶解物のウェスタンブロットを探索した（図５）。図５のパネルＡは抗Ｇ３ＢＰ−１ポリクローナル抗体で探索した組織を示し、これに対してパネルＢは抗Ｇ３ＢＰ−２ポリクローナル抗体で探索した組織をコラージュのように構成したものを示している。肺、肝臓、腎臓、胃および結腸（データは示されていないが、膵臓および精巣も）を含めたいくつかの組織がＧ３ＢＰ−２の両アイソフォームを発現することが分かる（図５、パネルＢ）。脳、筋肉（少量のＧ３ＢＰ−２ｂ発現が見られ、これはおそらく試料中に様々な細胞集団が存在することが原因である）および心臓を含めた他の組織は、Ｇ３ＢＰ−２ａのみの発現に限られている（図５、パネルＢ中の上側のバンド）。小腸はＭｍｕＧ３ＢＰ−２ｂのみを発現し（図５、パネルＢの下側のバンド）、脾臓はいずれのタンパク質も検出可能なレベルでは発現しない。Ｇ３ＢＰ−１の全般的な発現はＧ３ＢＰ−２の発現よりも少ないようだが、一部の組織は豊富なレベルのＧ３ＢＰ−１を発現し、それらには、肺、腎臓および結腸が含まれる。心臓、肝臓および脾臓も低レベルのＧ３ＢＰ−１を発現する。
（クローニング、配列相同性および構造相同性）
（ＰＣＲおよびサブクローニング）
１．１ユニットのＴｔｈ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ断片（バイオテク・インターナショナル（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））および製造者（バイオテク・インターナショナル）供給の緩衝液にテンプレートＤＮＡ１００ｎｇとそれぞれ適切なプライマー５０ｐｍｏｌを含めたものを使用して、プローブを増幅させるため、またはハイブリッドマッピングのためのＰＣＲ反応を実施した。サイクル条件は、９４℃で１分間のＤＮＡの変性、６５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長反応を２５サイクルとした。完全長Ｇ３ＢＰまたはＧ３ＢＰのＮＴＦ２様ドメインのいずれかを増幅するために使用可能なプライマーは以下のとおりである：
完全長ヒトＧ３ＢＰ−１は、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にＧ３ＢＰ−１ｓｔｏｐを使用して増幅させ；完全長ヒトＧ３ＢＰ−２は、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−２ｓｔｏｐを使用して増幅させ；ヒトＧ３ＢＰ−１のＮＴＦ２様ドメインは、プライマーＧ３ＢＰ−１ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−１ｎｔｆを使用して増幅させ；かつヒトＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインは、プライマーＧ３ＢＰ−２ｍｅｔと共にプライマーＧ３ＢＰ−２ｎｔｆを使用して増幅させる。
本願明細書に援用されるゲノム／免疫原性手法（シュルツェ（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ）およびフォンダーハイデ（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ）、２００１年）に従って、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の最も一般的にみられる対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子についてＧ３ＢＰタンパク質の免疫原性を検討した。予測されたＨＬＡ結合配列を、ウェブ上のアルゴリズム（例えば、ＳＹＰＥＩＴＨＩ（http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/）およびＢＩＭＡＳ（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/）より提供される）を適用して同定し、更なる評価のために合成ペプチドを製造した。図１０に示されているように、製造したペプチドから、ＭＨＣ／ペプチド結合アッセイによりＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に非常に強力に結合することが証明された。Ｔ２細胞を、示されているペプチド希釈物と共にインキュベーションし、ＨＬＡ発現をフローサイトメトリーにより測定した。Ｇ３ＢＰ−２の２種のペプチド（ペプチド１及び２）を試験し、対照マトリックスタンパク質インフルエンザペプチド５８〜６６を、参照として使用した。ペプチド１はアミノ酸配列ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］を有し、ペプチド２はアミノ酸配列ＩＭＦＲＧＥＶＲＬ［配列番号：２］を有する。ペプチド１及び２は、対照のインフルエンザＭＰ５８〜６６ペプチド（ＣＴＬエピトープであると確定されている）の親和性と同等の親和性でＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合した。
ＨｓａＧ３ＢＰ−２ａのヌクレオチド配列［配列番号：４］およびコードされるアミノ酸配列［配列番号：５］を示す図。 ＳＨ３ドメインを含む、ｒａｓＧＡＰ１２０のＮ末端のアミノ酸配列［配列番号：６］を示す図。 Ｇ３ＢＰタンパク質ファミリー、マウスＭｍｕＧ３ＢＰ２ａ［配列番号：７］、ヒトＨｓａＧ３ＢＰ２ａ［配列番号：５］、マウスＭｍｕＧ３ＢＰ２ｂ［配列番号：８］、ヒトＨｓａＧ３ＢＰ２ｂ［配列番号：９］、ヒトＨｓａＧ３ＢＰ１［配列番号：１０］、およびマウスＭｍｕＧ３ＢＰ１［配列番号：１１］をまとめて整列させた図。 Ｎ末端ｒａｓＧＡＰ１２０のＳＨ３ドメインとＧ３ＢＰとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の解析を示す図。 様々な組織中でのＧ３ＢＰ発現のウェスタンブロット分析を示す図。 抗Ｇ３ＢＰ−１および抗Ｇ３ＢＰ−２抗体をプローブとした成体マウス組織の免疫組織化学を示す図。 抗Ｇ３ＢＰ−１および抗Ｇ３ＢＰ−２抗体をプローブとした成体マウス組織の免疫組織化学を示す図。 ２種のヒト乳がんのＧ３ＢＰ−２免疫組織化学を示す図。パネルＡは原位置にある腺管腫瘍であり、パネルＢは浸潤性のがんを示す。 Ｇ３ＢＰに特異的な抗体を用いた、乳房腫瘍の切片の免疫組織化学的染色および同調ＮＩＨ３Ｔ３の免疫蛍光分析を示す図（Ａ〜Ｔ）。パネルＡ〜Ｃは、Ｇ３ＢＰ−１に特異的な抗体を使用して染色された乳房腫瘍の切片である。パネルＡおよびＢは染色されたＩＤＣを示しており、パネルＣは、染色された正常な腺管（ＮＤ）の小断面を示している。パネルＤ〜Ｏは、ヒト乳房腫瘍のＧ３ＢＰ−２の免疫組織化学を示している。パネルＤは正常な葉を示しており、パネルＥおよびＦはそれぞれ正常な腺管の横断面および縦断面を示している（ＣＴは結合組織を意味する）。パネルＧおよびＨはＩＤＣに隣接する正常な腺管を示している（ＤＣは腺管がんを意味する）。パネルＩはＧ３ＢＰ−２を発現しないＩＤＣを示している。パネルＪは、正常結合組織に隣接するＩＤＣを示している。矢印は、核内のＧ３ＢＰ−２が正に染色される結合組織内の細胞を示している。パネルＫは、正常結合組織に隣接するＩＤＣ（左側）を低倍率で示している。パネルＬ〜Ｏは、ヒト乳がんにおけるＧ３ＢＰ−２の様々な細胞内局在を示している。すべてのパネルは様々な患者由来の腺管がんである。パネルＬはＧ３ＢＰ−２の細胞質局在を示す。パネルＭおよびＮは、２種の異なる乳がん症例におけるＧ３ＢＰ−２の核局在を示している；細胞質での発現はこれらの切片でも観察される。パネルＯは、核膜領域の周囲におけるＧ３ＢＰ−２の発現を示し；細胞質の染色も観察される。パネルＰ〜Ｔは、同調化ＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫蛍光分析を示す。パネルＰは、Ｇ０相（時間＝０）での細胞中でのＧ３ＢＰ−２の細胞内分布を示す。血清刺激後、したがって細胞周期開始後の時間は、パネルＱ、Ｒ、ＳおよびＴについてそれぞれ２時間、５時間、９時間および１２時間である。 Ｇ３ＢＰ−２抗体の抗体特異性を示す図。乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５および子宮頚がん細胞株ＨｅＬａ（それぞれ４３５およびＨｅＬａと表示）を溶解させ、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。試料を膜にトランスファーし、表示のようにポリクローナルＧ３ＢＰ−２抗体または市販のＧ３ＢＰ−１抗体のいずれかをプローブとして探索した（パネルＡ）。精製された組換えＧ２ＢＰ−２ｂ（レーン１）、Ｇ３ＢＰ−１（レーン２）およびＧ３ＢＰ−２ａ（レーン３）を、Ｇ３ＢＰ−２ａの４種の様々な短縮体、Ｎ１（レーン４）、Ｃ１（レーン５）、Ｃ２（レーン６）、Ｎ２（レーン７）と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。これらの試料を膜にトランスファーし、Ｇ３ＢＰ−２抗体（パネルＢ）をプローブとして探索した。パネルＣは、Ｇ３ＢＰ−２ａおよび組換えＧ３ＢＰ−２ａ短縮体（Ｎ１、Ｎ２、Ｃ１、Ｃ２）の図式化して示すものである。パネルＣは、Ｇ３ＢＰ−２ポリクローナル抗体が結合する領域も示している。挿入図は、Ｇ３ＢＰ−２ａのサブドメインを示している。 Ｔ２結合アッセイにより測定された、Ｇ３ＢＰ−２ペプチドによるＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合を示す図。 様々なエフェクター細胞：ターゲット細胞比を使用したクロム放出細胞傷害性アッセイに関するデータを示すグラフ。 ポリペプチドにおける保存的置換の例を示す表（表１）。 ５８例の乳房腫瘍切片におけるＧ３ＢＰ−２の発現をまとめた表（表２）。ＤＣＩＳ＝原位置にある腺管がん、ＩＤＣ＝浸潤性腺管がん、ＬＣＩＳ＝原位置にある小葉がん、ＩＬＣ＝浸潤性小葉がん。悪性度（グレード）は、各種の因子に応じて割り当てた。高度に分化した腫瘍は通常グレード１としたが、未分化な腫瘍はグレード３とした。ＥＲ＝エストロゲン受容体の状態。結節の状態は、リンパ節中の腫瘍の有（＋）無（−）を表す。ＮＧ＝グレード付けせず。ＮＤ＝測定せず。細胞質と記されたカラムは、細胞の細胞質中でのＧ３ＢＰ−２の発現レベルを示している（１＋＝低、２＋＝中、３＋＝高）。特に記載のない場合、細胞集団の７５％より多い場合を染色ありとした。核と記されたカラムは、がん細胞の核内のＧ３ＢＰ−２の有（＋）無（−）を示している。 ２４例の乳房腫瘍切片におけるＧ３ＢＰ−１についてまとめた表（表３）。ＤＣＩＳ＝原位置にある腺管がん、ＩＤＣ＝浸潤性腺管がん、ＬＣＩＳ＝原位置にある小葉がん、ＩＬＣ＝浸潤性小葉がん。悪性度（グレード）は、各種の因子に応じて割り当てた。高度に分化した腫瘍は通常グレード１としたが、未分化な腫瘍はグレード３とした。ＥＲ＝エストロゲン受容体の状態。結節の状態は、リンパ節中の腫瘍の有（＋）無（−）を表す。ＮＧ＝グレード付けせず。ＮＤ＝測定せず。細胞質と記されたカラムは、細胞の細胞質中でのＧ３ＢＰ−１の発現レベルを示している（１＋＝低、２＋＝中、３＋＝高）。特に記載のない場合、細胞集団の７５％より多い場合を染色ありとした。核と記されたカラムは、がん細胞の核内のＧ３ＢＰ−１の有（＋）無（−）を示している。Ｎｅｇａｔｉｖｅ＝無。
さらに好ましくは、ユビキチンヒドロラーゼはＯＤＥ１である。
ＮＴＦ２様ドメインは、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２２に記載されているアミノ酸残基１〜１４６によりコードされることが好ましい。
第２の態様では、本発明は、ＮＴＦ２様ドメインを有するＧ３ＢＰ−２タンパク質と、該ＮＴＦ２様ドメインに結合した、ｒａｎ核膜孔ポリペプチド、ユビキチンヒドロラーゼおよびＧＡＰ１２０からなる群から選択される他のタンパク質とを含む単離タンパク質複合体を提供する。
好ましくは、Ｇ３ＢＰ−２断片は、
（ｉ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］；
（ｉｉ）ＩＭＦＲＧＥＶＲＬ［配列番号：２］および
（ｉｉｉ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
からなる群から選択される。
第４の態様では、本発明は、
（ａ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］；
（ｂ）ＩＭＦＲＧＥＶＲＬ［配列番号：２］および
（ｃ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
からなる群から選択される単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片を提供する。
１形態では、この単離核酸は配列番号：２２に記載されているアミノ酸配列からなるＮ
ＴＦ２様ドメインを含むタンパク質をコードし、ここで、前記ＮＴＦ２様ドメインはアミノ酸残基１〜１４６によりコードされ、アミノ酸残基１は開始メチオニン（Ｍ）である。
別の形態では、単離核酸は配列番号：２３に記載されているヌクレオチド配列を含む。

Claims (53)

  1. ＮＴＦ２様ドメインを含み、該ＮＴＦ２様ドメインを介して他のタンパク質に結合可能な単離タンパク質であって、完全長Ｇ３ＢＰ−１タンパク質でも、完全長Ｇ３ＢＰ−２タンパク質でもない単離タンパク質。
  2. ＮＴＦ２様ドメインがＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインである、請求項１に記載の単離タンパク質。
  3. 前記他のタンパク質が、ｒａｎ核膜孔ポリペプチド、ユビキチンヒドロラーゼおよびＧＡＰ１２０からなる群から選択される、請求項１に記載の単離タンパク質。
  4. ユビキチンヒドロラーゼがＯＤＥ１である請求項３に記載の単離タンパク質。
  5. ＮＴＦ２様ドメインが配列番号：５に記載されているアミノ酸残基１〜１４６によりコードされ、アミノ酸残基１が開始メチオニン（Ｍ）である、請求項１に記載の単離タンパク質。
  6. ＮＴＦ２様ドメインを有するタンパク質と、ｒａｎ核膜孔ポリペプチド、ユビキチンヒドロラーゼおよびＧＡＰ１２０からなる群から選択される他のタンパク質とを含む、単離タンパク質複合体。
  7. 動物において免疫応答を誘発可能な、その断片、相同体、変異体または誘導体を含めた単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質。
  8. 前記動物がヒトである、請求項７に記載の単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質。
  9. （ｉ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］、
    （ｉｉ）ＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］、および
    （ｉｉｉ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
    からなる群から選択される、請求項７に記載の単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質。
  10. （ｉ）ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］、
    （ｉｉ）ＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］、および
    （ｉｉｉ）ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］
    からなる群から選択される、単離Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片。
  11. 前記単離タンパク質の断片、相同体、変異体および誘導体を含めた請求項１に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
  12. 配列番号：５に記載されているＮＴＦ２様ドメインを含むタンパク質をコードする請求項１１に記載の単離核酸であって、前記ＮＴＦ２様ドメインがアミノ酸残基１〜１４６で構成され、アミノ酸残基１が開始メチオニン（Ｍ）であることを特徴とする単離核酸。
  13. 配列番号：４に記載されている配列のヌクレオチド２３９〜６７６を含む、請求項１１に記載の単離核酸。
  14. 請求項１０に記載のＧ３ＢＰ−２タンパク質断片をコードする単離核酸。
  15. 請求項１１または請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
  16. Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を阻止または妨害するためのアンタゴニストの使用。
  17. 前記アンタゴニストがＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと前記他のタンパク質との結合を阻止または妨害することを特徴とする、請求項１６に記載のアンタゴニストの使用。
  18. 前記アンタゴニストがＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインの模倣物質であることを特徴とする、請求項１６に記載のアンタゴニストの使用。
  19. 前記アンタゴニストがＮＴＦ２様ドメインに結合することを特徴とする、請求項１６に記載のアンタゴニストの使用。
  20. 前記アンタゴニストがタンパク質であることを特徴とする、請求項１６に記載のアンタゴニストの使用。
  21. 前記タンパク質がＳｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインを含むことを特徴とする、請求項２０に記載のアンタゴニストの使用。
  22. 前記タンパク質が配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のアンタゴニストの使用。
  23. 前記アンタゴニストが非ペプチド化合物であることを特徴とする、請求項１６に記載のアンタゴニストの使用。
  24. Ｇ３ＢＰ−２タンパク質、その断片、相同体、変異体または誘導体と予め接触させた単離抗原提示細胞。
  25. その断片、相同体、変異体または誘導体を含めたＧ３ＢＰ−２タンパク質をコードする核酸でトランスフェクションされている単離抗原提示細胞。
  26. 前記細胞が樹状細胞である、請求項２４または請求項２５に記載の単離抗原提示細胞。
  27. その断片、相同体、変異体および誘導体を含めた前記Ｇ３ＢＰ−２タンパク質が配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２４または請求項２５に記載の単離抗原提示細胞。
  28. 前記Ｇ３ＢＰ−２断片が、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］およびＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２４または請求項２５に記載の単離抗原提示細胞。
  29. Ｇ３ＢＰ−２抗原特異的な単離リンパ球。
  30. 前記単離リンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項２９に記載の単離リンパ球。
  31. 前記Ｇ３ＢＰ−２抗原が、その断片、相同体、変異体および誘導体を含めたタンパク質であり、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の単離リンパ球。
  32. 前記Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片が配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の単離リンパ球。
  33. 請求項１、７、１０のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項１１、１４、１５のいずれか１項に記載の核酸、または請求項２４、２５、２９のいずれか１項に記載の単離抗原提示細胞またはリンパ球からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含有する、薬剤組成物。
  34. 哺乳動物において乳がんを予防または治療する方法であって、請求項１、７、１０のいずれか１項に記載のタンパク質；請求項１１、１４、１５のいずれか１項に記載の核酸、Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインの模倣物質；Ｇ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと他のタンパク質との結合を阻止または妨害するアンタゴニスト；または請求項２４、２５、２９のいずれか１項に記載の単離細胞からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含有する薬剤組成物を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法。
  35. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
  36. Ｇ３ＢＰ−２と他のタンパク質との結合を阻止または妨害する活性物質を、動物または単離細胞に投与する工程を含む、細胞増殖を変調する方法。
  37. 前記動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
  38. 試料中の１つまたは複数の候補がＧ３ＢＰ−２のＮＴＦ２様ドメインと結合するかどうかを決定する工程を含む、Ｇ３ＢＰ−２と結合する分子を単離する方法。
  39. 前記分子がアンタゴニストである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記アンタゴニストがタンパク質または非タンパク質分子である、請求項３９に記載の方法。
  41. 哺乳動物の乳がんを診断する方法であって、該哺乳動物から得られた試験試料中のＧ３ＢＰ−２タンパク質の発現と参照試料中のＧ３ＢＰ−２とを比較する工程を含み、試験試料中のＧ３ＢＰ−２の発現が参照試料とは異なる場合に、該哺乳動物が乳がんを有する可能性が高いと診断することを特徴とする方法。
  42. 抗体を使用してＧ３ＢＰ−２タンパク質の発現を検出する、請求項４１に記載の方法。
  43. その断片、相同体、変異体および誘導体を含めたＧ３ＢＰ−２タンパク質であって配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質に、前記抗体が結合する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記Ｇ３ＢＰ−２断片がＮＴＦ２様ドメインを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記抗体が、アミノ酸配列ＳＡＴＰＰＰＡＥＰＡＳＬＰＱＥＰＰＫＰＲＶ［配列番号：３］を含むＧ３ＢＰ−２タンパク質断片に結合する、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記試験試料が乳房組織である、請求項４７に記載の方法。
  48. 哺乳動物から得られた試験試料中のＧ３ＢＰ−２核酸またはその断片を検出する工程を含む、該哺乳動物の乳がんを診断する方法。
  49. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４７に記載の方法。
  50. 乳がんに対して哺乳動物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に、
    （１）Ｇ３ＢＰ−２タンパク質；
    （２）（１）の断片、相同体、変異体または誘導体；
    （３）Ｇ３ＢＰ−２核酸；
    （４）（３）の断片、相同体、変異体または誘導体；
    （５）予め（１）または（２）と接触させた単離抗原提示細胞；および
    （６）予め（３）または（４）の核酸でトランスフェクションした単離抗原提示細胞
    からなる群から選択される少なくとも１種の活性物質を含む免疫原性剤を投与する工程を含む方法。
  51. 前記Ｇ３ＢＰ−２タンパク質断片が、ＫＬＰＮＦＧＦＶＶ［配列番号：１］およびＩＭＦＲＧＶＲＬ［配列番号：２］からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記哺乳動物がヒトである、請求項５０に記載の方法。
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