JP2005218385A - １本鎖ｄｎａを調製するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は１本鎖ＤＮＡの調製のための方法に関し、そして具体的には１本鎖ＤＮＡ調製物からの２本鎖および部分的２本鎖ＤＮＡ分子の除去のための満足できる解決法を提供する。
【解決手段】２本鎖ＤＮＡからの１本鎖ＤＮＡの調製および２本鎖ＤＮＡに由来する１本鎖ＤＮＡの精製のための方法を開示する。１本鎖ＤＮＡ調製物から望ましくない２本鎖ＤＮＡを除去するため、およびその他の関連する目的のために１本鎖ＤＮＡ結合物質を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと組み合わせて使用する。
【選択図】 図１

Description

本発明は２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを調製する方法および２本鎖ＤＮＡに由来する１本鎖ＤＮＡを精製する方法に関するものである。本発明はまた１本鎖ＤＮＡ調製物から望ましくない２本鎖ＤＮＡを除去することにも関する。さらに本発明は前記した方法のためのキットおよび１本鎖ＤＮＡを調製または精製に関与する適用に関する。

生物の遺伝情報は２本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に蓄えられ、そこでは２本鎖の配列は互いに相補的であり、そして配列の個々の塩基対間で形成された特異的な水素結合より対合している。バイオテクノロジーもしくは分子生物学における分析、操作またはいずれかその他の適用のために、通常ゲノムＤＮＡを断片化し、そしてその増幅および操作のためにベクターにクローニングする。同様に転写されたゲノムＤＮＡの領域を、逆転写によりリボ核酸（ＲＮＡ）の形態で得られる転写物をＤＮＡに変換することによりクローニングすることができる。分子生物学の当業者に公知のＤＮＡおよびＲＮＡのクローニングおよび操作のための標準的な技術はＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（参照することによって本明細書に組み込むものとする）に記載されている。

ＤＮＡをプラスミドと称される染色体外分子にクローニングすることは非常に頻繁にあることで、プラスミドは通例、環状ＤＮＡ分子を形成するために共有結合で閉じた２本鎖ＤＮＡ分子から構成される。プラスミドはいわゆるレプリコンの制御エレメントを宿すアクセサリ遺伝子単位として挙動し、そして宿主細胞内でそのコピー数を維持および調節するためにその宿主細菌の複製機構を使用する。さらにプラスミドはしばしば選択マーカーとして用いることができる酵素活性をコードする遺伝子を含有する。クローニングされたＤＮＡを取り扱い、増幅し、そして操作するためのベクターとしてプラスミドを使用する目的のために、通例これらの選択マーカーは特異的な抗生物質に対する抵抗性を付与する遺伝子をコードし、そして従って細菌表現型によるその選択が可能になる。

２本鎖形態は最も通例的に用いられるＤＮＡ分子であるが、分子生物学およびバイオテクノロジーにおける多くの適用および技術は１本鎖ＤＮＡの鎖特異的調製を必要とする。このような適用には、配列決定または、標識プローブの合成、ウラシルによるチミン残基の置換、点変異の誘導、種々ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の混合物中のサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションもしくは個々のクローンの検出および単離のためのテスターおよびドライバーの調製、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および分析、ならびにマイクロアレイの調製などの鎖特異的ＤＮＡ合成のための鋳型ＤＮＡの調製などがあるが、これらに限定されない。これらの方法およびその適用は分子生物学の当業者に周知であり、そしてさらにＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）により記載されている。

１本鎖ＤＮＡの調製のための標準的な研究法では非常に頻繁に、いわゆるファージミドを利用し、ファージミドはバクテリオファージＭ１３ゲノムの１本鎖ゲノムからのＤＮＡ合成の開始および終止のためのシス作動性制御配列をクローニングベクターにクローニングすることにより得られたプラスミド−ファージハイブリッドである。宿主細菌が複製欠損遺伝子間領域を担持するヘルパー野生型または変異型繊維状バクテリオファージにより感染される場合、このようなファージミドにより１本鎖ＤＮＡのインビボ調製が可能になる。感染の後、ヘルパーファージによりコードされるＧｅｎｅ ＩＩ生成物が、１本鎖のローリング・サークル様の複製を開始するファージミドの遺伝子間領域に１本鎖特異的ニックを導入する。その後、ファージミドＤＮＡの１本鎖コピーを子孫バクテリオファージ粒子にパッキングし、そして培地に押し出し、そこから１本鎖ＤＮＡを単離することができる。しかしながら、実験室の日常的な作業で通例的に用いられる研究法はＦ因子によりコードされる性線毛を発現する細菌の特定のセットの使用、およびバクテリオファージＭ１３または関連するファージに由来するシス作動性エレメントを有するファージミドの使用に限定される。さらに、この研究法により得られた１本鎖ＤＮＡには、非常に頻繁にヘルパーファージＤＮＡ、少量の大きな染色体ＤＮＡおよび細胞溶解からの少しのＲＮＡが夾雑することがある。従って、多くの適用に関してその使用が可能になるためには面倒でそして複雑な１本鎖ＤＮＡの精製が必要とされる。

１本鎖ＤＮＡのインビボ調製の代替として、２つの異なる酵素活性の組み合わせを利用するインビトロ研究法が開発されている。非常に通例的には、バクテリオファージｆ１および大腸菌に由来するエクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ ＩＩＩ）の複製イニシエータータンパク質Ｇｅｎｅ ＩＩの組み合わせをこのような系で使用する。ここでは、Ｇｅｎｅ ＩＩはファージミドベクターのｆ１複製起点を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼとして作用し、そしてウイルス鎖を切断する。Ｅｘｏ ＩＩＩはニック鎖の遊離の３’末端を攻撃して、そして別の鎖が１本鎖ＤＮＡ環状ＤＮＡとして放出されるまでそれを消化する。このような系を市販により、例えばＧｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのいわゆるＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡポジティブ選択系（カタログ番号１０３５６−０２０、これは現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）の一部である）の一部として入手することができる。この市販により入手可能な系の取扱説明書を参照することによって本明細書に組み込むものとする。これらの反応においてＧｅｎｅ ＩＩ酵素活性の効率は低くなる傾向があるので、切断される標的ＤＮＡの約５０％ほどの低さでしか生じない場合には、別の鎖特異的ニッキング酵素を開発した。これには、２本鎖ＤＮＡ基質の認識配列内の１本鎖ＤＮＡのみを切断する人工的に操作されたニッキングエンドヌクレアーゼが含まれる。このような酵素には、市販により入手可能なヌクレアーゼＮ Ｂｐｕ １０Ｉ（ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ ＵＡＢ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）、Ｎ Ｂｂｖ Ｃ ＩＡ、Ｎ Ｂｓｔ ＮＢ ＩおよびＮ．Ａｌｗ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国）などがあるが、これらに限定されない。適当な認識部位を含有するスーパーコイル２本鎖プラスミドに由来する１本鎖ＤＮＡの調製のためのＮ Ｂｐｕ １０Ｉの適用のための詳細なプロトコルを、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＵＡＢのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｅｒｍｅｎｔａｓ．ｃｏｍ／で見出すことができ、このプロトコルを参照することにより本明細書に組み込むものとする。１本鎖ＤＮＡに対するインビトロ研究法の主要な欠点はこの場合も、２本鎖または少なくとも部分的に２本鎖ＤＮＡ分子での調製の夾雑である。多くの適用ではこのような夾雑を除去すべきであり、これはＧｅｎｅ ＩＩ酵素を用いる場合に特に真実である。

直線１本鎖ＤＮＡの調製には、当業者に周知の種々の技術が開発されている。多くの場合、これらの研究法はＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からの１本鎖ＤＮＡの合成に基づいてＤＮＡポリメラーゼを使用する。鋳型よりも過剰の１本鎖ＤＮＡを生じる直線鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡからのいずれかの増幅方法を適用することができる。このような研究法には、個々の反応として、または生成物の直線増幅が可能になるサイクル反応として実施されたＤＮＡポリメラーゼにより誘導されるプライミング反応の使用などがある。高品質１本鎖ＤＮＡを調製するために、ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鋳型を最初にＲＮＡに転写するのが賢明である。次いで、デオキシリボヌクレアーゼにより鋳型ＤＮＡを分解することができ、その後ＲＮＡ転写物を鋳型として用いて逆転写酵素によりその１本鎖ＤＮＡを合成する。２つの独立した反応において核酸の２つの異なる形態を用いることにより、研究法により各々デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼによる鋳型の除去のための手段が提供される。実施するのがむしろ面倒であるが、この研究法により、高品質の直線１本鎖ＤＮＡの調製が可能になる。しかしながら、これは環状１本鎖ＤＮＡの調製には適用されず、そしてこれはＲＮＡポリメラーゼを誘導する適当なプロモーター部位および転写反応の終止のための鋳型における切断部位に依存する。

特別な場合では、１本鎖ＤＮＡの合成を２つのプライマーを異なる濃度で使用する、いわゆる非対称ＰＣＲ反応により達成することができる。律速プライマーを使い果たした後、反応を２本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅から、律速プライマーよりも過剰に用いられるプライマーによりプライミングされる１本鎖の直線増幅に切り換える。代替の研究法では、λエクソヌクレアーゼを用いて５’リン酸化末端を有する２本鎖ＤＮＡの１本鎖を消化する。２つのプライマーのうち１つのみが５’末端でリン酸化されているＰＣＲ反応でこのような鋳型を調製することができる。λエクソヌクレアーゼは「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標）」としても表され、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国より市販により入手可能であり、「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡ 調製キット」（カタログ番号６９２０２）に関する文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる。同様にＥｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国のλエクソヌクレアーゼとして酵素を入手することもできる（カタログ番号ＬＥ０３５ＨおよびＬＥ３２Ｋ）。

１本鎖直線ＤＮＡの多くの適用に、２つのプライマーの１つが特異的にタグ化されるＰＣＲ反応により１本鎖ＤＮＡが調製される。これに限定するわけではないが、タグ化された鎖および第２の望ましくない鎖を鋳型ＤＮＡから分離するのにビオチン標識が非常に頻繁に適用される。この研究法は、特に目的の鎖がマトリックスまたはいずれかの種類の固体支持体に結合するように用いられると考えられる場合に価値がある。このように固定された１本鎖ＤＮＡを支持体上で直接精製でき、鎖特異的調製および１本鎖ＤＮＡの単離に依存する検出アッセイにおいて用いることができる。このような適用の１つには、例えば、いわゆるＤＡＳＨ ＳＮＰ検出系におけるゲノムＤＮＡのＳＮＰの検出および特徴づけなどがあるが、これらに限定されない。この研究法は米国特許出願第２００１０４６６７０号に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。この研究法は特定の系および適用に関して高い価値があるが、その使用は直線１本鎖ＤＮＡの調製に制限されており、そして環状１本鎖ＤＮＡの調製および取り扱いには使用できない。

１本鎖ＤＮＡの調製のための強力な手段は長い時間をかけて開発されており、そして多くの適用で通例的に用いられているが、１本鎖ＤＮＡの調製は依然ＤＮＡの純度および１本鎖ＤＮＡ調製における供給源として非常に高頻度で用いられる２本鎖ＤＮＡの夾雑により限定される傾向がある。

２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを分離するための現行の研究法はしばしばクロマトグラフィー手順に基づき、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥセルロース（ＢＮＤＣ）、ベントナイト上のメチル化アルブミン（ＭＡＢ）、またはＫｉｅｓｅｌｇｕｒ上のメチル化アルブミン（ＭＡＫ）などがあるが、これらに限定されない。多くのこれらのクロマトグラフィー基盤の研究法は適用するのが面倒であり、そして１本鎖ＤＮＡに関する回収率の低さにより限定されている。従って、２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを分離するための新たな研究法が要求され続けている。

本発明は１本鎖ＤＮＡの調製のための方法に関し、そしてより具体的には１本鎖ＤＮＡ調製物からの２本鎖および部分的２本鎖ＤＮＡ分子の除去のための満足できる解決法を提供する。特に、本明細書に開示する既定の条件下での特異的酵素活性の使用により、１本鎖ＤＮＡの使用を必要とするかまたはそれに依存する多くの適用に高い価値がある都合のよいそして時間が節約できる手順が可能になる。

本発明は、２本鎖および１本鎖ＤＮＡ分子の混合物から２本鎖ＤＮＡ分子を除去するための方法を提供し、１本鎖ＤＮＡ分子に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質を混合物に添加するステップと、２本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを同一の混合物に添加するステップとを含む。１本鎖ＤＮＡ結合物質および２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの特性および相対的親和性に依存して、１本鎖ＤＮＡ結合物質の添加を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの添加に先行して行なうこともでき、または両者の添加を同時に行うことができる。ＤＮＡに対する１本鎖ＤＮＡ結合物質の親和性が２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの親和性よりも非常に強力である場合、これらを一緒に添加することができるが、両者の親和性が同程度である場合、１本鎖ＤＮＡを最初に、次いで２本鎖エンドヌクレアーゼを最後に添加するのが好ましい。

本発明を用いて１本鎖ＤＮＡの調製物から２本鎖ＤＮＡを全てまたは部分的に除去する。当業者に公知のいずれかの研究法としては、ヘルパーファージを用いるインビボ研究法、または異なる酵素活性を用いるインビトロ研究法の使用などにより１本鎖ＤＮＡを調製することができるが、これらに限定されない。このように、本発明は当業者に公知の分野で確立されたいずれかの方法による、直鎖状鋳型からまたは環状鋳型からの１本鎖ＤＮＡの調製に関する。

より詳細には、１本鎖ＤＮＡは直鎖状ＤＮＡ分子または共有結合により閉じた環状ＤＮＡ分子であってもよく、プラスミドまたはファージミドに由来する直鎖状ＤＮＡもしくはＲＮＡ鋳型または環状ＤＮＡ分子からそれを調製することができる。環状ＤＮＡ分子は、その末端が互いに共有結合により結合しているいずれかのＤＮＡ分子などでよい。このような環状ＤＮＡ分子は最初、プラスミドのような天然起源のものか、またはファージミドのような遺伝的に修飾されたものでよい。さらに、前記したような組換えＤＮＡ技術によるか、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）により詳記されるように環状ＤＮＡ分子を修飾することができる。本発明は１本鎖ＤＮＡの調製に用いられた出発材料に依存せずに、いずれかの既定の文脈で２本鎖ＤＮＡに対して１本鎖ＤＮＡを精製または豊富にする手段を提供する。

好ましい実施形態では、本発明は２本鎖ＤＮＡ鋳型から１本鎖を特異的に除去するための酵素系の使用を包含する。本発明は環状２本鎖ＤＮＡ分子から環状１本鎖ＤＮＡ分子を調製するための方法を提供し、ここで１本の鎖は目的の１つのＤＮＡ鎖に関して、他方のＤＮＡ鎖と比較して優先的な親和性を示す酵素活性を有する基質に特異的である。酵素活性は第２の無関係な酵素活性による分解に関して特異的に１本鎖をマークする。相互に関係するが特性において区別可能である２つの酵素活性の作用のために、２本鎖環状ＤＮＡ分子を環状１本鎖ＤＮＡ分子に変換することができる。

本発明は２本鎖ＤＮＡの２本鎖特異的消化のための２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの使用を包含する。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡを特異的に消化するが、１本鎖ＤＮＡは切断することなく、１本鎖ＤＮＡと比較して２本鎖ＤＮＡに優先的な親和性を有する。このように、いずれかの２本鎖特異的エンドヌクレアーゼまたは２本鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性を有するいずれかの混合物を適用して本発明を実施することができ、ここで２本鎖ＤＮＡは、全ての１本鎖ＤＮＡまたは一部１本鎖ＤＮＡの存在下で消化される。

本発明による２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは４塩基対カッターの混合物でよい。このような制限エンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡ分子内に４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有している。多くのこのような酵素は当業者に公知であり、そして異なる供給者から市販により入手することができる。

好ましくは、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは、Ｄ．Ａ．Ｓｈａｇｉｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２巻：１９３５−１９４２頁（２００２）（参照することにより本明細書に組み込む）に記載されるカニ肝膵臓に由来するＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼ（ＤＳＮ）である。ＤＳＮはその２本鎖特異性により特徴づけられ、それにより著者が該酵素を２本鎖ＤＮＡにおけるＳＮＰの検出（Ｄ．Ａ．Ｓｈａｇｉｎら、前出）に使用することが可能になり、そして供給者Ｅｖｒｏｇｅｎ（モスクワ、ロシア）によりさらに記載されるＤＳＮに関するその製品情報を参照することにより本明細書に組み込む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｖｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）。このように、ＤＳＮは本発明を実施するために提供される酵素活性に関する好ましい酵素と見なされる。

１つの実施形態では、ＤＳＮをその単一の酵素活性に関して使用して、１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖または部分的２本鎖ＤＮＡ、および完全２本鎖ＤＮＡを含む混合物から２本鎖ＤＮＡを除去することができる。

より好ましくは、１本鎖ＤＮＡ結合親和性を有する物質とＤＳＮを一緒に適用することができる。この物質は２本鎖ＤＮＡと比較して１本鎖ＤＮＡに関して優先的な親和性を有しているべきである。１本鎖ＤＮＡに対する高い結合親和性のために、該物質は１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖ＤＮＡまたは部分的２本鎖ＤＮＡ、および完全２本鎖ＤＮＡを含む混合物中で１本鎖ＤＮＡに優先的に結合する。従って、このような物質は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる非特異的切断に対して１本鎖ＤＮＡを保護する能力を有している。

好ましくは、１本鎖ＤＮＡ結合物質は、本発明を実施するために用いる２本鎖特異的エンドヌクレアーゼに比較されたものよりも、１本鎖ＤＮＡに関して高い、またはなお一層高い結合親和性を有していてよい。１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖または部分的２本鎖ＤＮＡ、および完全２本鎖ＤＮＡを含む反応混合物中で、同一反応に適用される２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと比較して１本鎖ＤＮＡに関して高い結合親和性を有している、１本鎖ＤＮＡ結合物質は、１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより形成される複合体から１本鎖ＤＮＡを滴定する。１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖特異的エンドヌクレアーゼからなる複合体から１本鎖ＤＮＡを滴定することにより、１本鎖ＤＮＡ結合物質は反応混合物中の遊離の２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの濃度を高くし、従って、２本鎖ＤＮＡを消化する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのターンオーバー速度を増加させる。従って本発明は、１本鎖ＤＮＡ結合物質の添加により、酵素反応のターンオーバー速度を増加させることにより、より効率的に２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いる方法を包含する。

本発明はさらに１本鎖ＤＮＡ結合物質が天然由来あってもよく、またはその結合特性を変化するように修飾されていてもよいタンパク質であり、これは組換えＤＮＡの技術を用いてインビボまたはインビトロで発現される生物から単離される。このタンパク質は合成起源でもあり得る。このようなタンパク質は何ら配列特異性なしにいずれかの種類の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに親和性を有し得るが、配列特異的なまたは増強された様式で１本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質を使用することも本発明の範囲内である。

別の好ましい実施形態では、本発明は、大腸菌に由来するＳＳＢ、ファージＴ４のＧｅｎｅ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡに対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそのいずれかの混合物などの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の使用に言及する。しかしながら、方向性のあるｃＤＮＡクローニング研究法を伴うゲノムシークエンシングプロジェクトにより、細菌からヒトまでのインビボでのＤＮＡ複製および修復に必須であることが見出された多くの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が示されたので、本発明は前記の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には限定されない。従って、いずれかのこれらのタンパク質は本発明を実施するために調製および適用される可能性を有している。

本発明はまた、直鎖状および環状１本鎖ＤＮＡを含むこのような混合物を、１本鎖ＤＮＡ特異的エクソヌクレアーゼによりさらに処理することにより、環状１本鎖ＤＮＡの調製物から直鎖状１本鎖ＤＮＡをさらに除去することをも包含する。ここでは直鎖状１本鎖ＤＮＡに関する特異性を有するいずれかのエクソヌクレアーゼを適用することができ、このようなエクソヌクレアーゼは、環状１本鎖ＤＮＡと比較して直鎖状１本鎖ＤＮＡに関して高い特異性を有しているべきである。このようなエクソヌクレアーゼには、Ｅｘｏ Ｉ、およびＥｘｏ ＶＩＩなどがあるが、これらに限定されない。このようなエクソヌクレアーゼ処理を精製ステップに含めることにより、本発明は直鎖状と環状１本鎖ＤＮＡ分子とを区別することが可能になる。従って、直鎖状または環状２本鎖ＤＮＡの特異的な精製、および環状２本鎖ＤＮＡの調製物から直鎖状１本鎖ＤＮＡを除去するための特定の手段を提供することは本発明の範囲内である。

分子生物学およびバイオテクノロジーにおける多くの適用および技術は１本鎖ＤＮＡの鎖特異的調製を必要とする。このような適用には、非限定例としてはシークエンシングのための鋳型ＤＮＡの調製、標識プローブの合成などの鎖特異的ＤＮＡ合成のための鋳型ＤＮＡ、点変異の導入、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションまたは複数のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の個々のクローンの検出および単離のためのテスターおよびドライバー の調製のようなハイブリダイゼーション実験、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出、ならびにマイクロアレイの調製などがある。従って、本明細書に開示する方法により調製されるような１本鎖ＤＮＡのいずれかのこのような適用は本発明の範囲内であり、本発明はこのような適用において用いられる１本鎖ＤＮＡを提供するのに必要な手段を供する。

前記で概要を示すように、本発明は迅速で、有効で、信頼でき、着実な、そして容易に実施できる、１本鎖ＤＮＡの調製および精製のための方法のための新たな研究法を提供する。従って、本発明は１本鎖ＤＮＡの使用に依存するいずれかの種類の適用に非常に価値があり、そして将来的に本発明はさらに、今まで１本鎖ＤＮＡの調製および精製のための現在利用可能な技術における制限のために先に進めることができなかった１本鎖ＤＮＡの使用に基づく新たな技術の開発に寄与するであろう。

遺伝子発見、ゲノム研究および組換えＤＮＡを生成するための製造またはサービスにおいて広範な適用で本発明を用いることができる。本発明を概してライフサイエンスおよび医学的研究に関連する科学に適用することもできる。本明細書で開示する方法は高い商業的価値があり、そしてバイオテクノロジーの分野で多くの適用に寄与する。特に本発明の研究法は、１本鎖ＤＮＡが核酸の操作のための必要条件である分野における学術的および商業的研究および開発に大いに寄与する。

従って、本発明は直鎖状ＤＮＡ鋳型および環状２本鎖ＤＮＡ鋳型から１本鎖ＤＮＡを調製するための方法を包含する。２本鎖ＤＮＡは、その各々がデオキシリボヌクレオチドにより形成された、二量体分子を形成するための会合が可能になる互いに実質的に相補的な配列を有している２つの重合体からなる核酸分子を意味する。２つの重合体は、デオキシリボヌクレオチド内の対合する塩基対間で形成された特異的水素結合により互いに結合している。会合するための対合する相補的ＤＮＡ分子を有さない２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドにより形成される１つの重合体鎖のみからなるいずれかのＤＮＡ分子は、たとえこのような分子が２本鎖ＤＮＡ部分を含む２次構造を形成できたとしても、本発明の目的のための１本鎖ＤＮＡ分子であると考えられる。本明細書で互換的に用いられる「（複数の）核酸分子」および「（複数の）ポリヌクレオチド」は１本鎖または２本鎖、コードまたは非コード、相補的または相補的でない、およびセンスまたはアンチセンスにかかわらず、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み、そしてそのハイブリッド配列をも含む。特にこれは、転写されるかもしくは転写されない、スプライシングされるかもしくはスプライシングされない、不完全にスプライシングされたもしくはプロセシングされた、その起源から独立した、生物学的材料からクローニングされた、または合成により得られたゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡを包含する。より正確には、発現「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」および「配列」は核酸材料自体を包含し、従って特定の配列情報、ベクター、ファージミドまたはいずれかその他の特異的な核酸分子に限定されない。「核酸」なる用語もまた本明細書では天然核酸、人工合成されたかまたは調製された核酸、天然事象によるかまたは当業者に公知の研究法により少なくとも１つまたはそれ以上の修飾が導入されているいずれかの修飾された核酸を包含する。「純粋」、「富化された」、「精製」または「富化」なる用語は本明細書において互換的に用いられ、そして生成物の絶対的な純粋または富化を要求するわけではなく、むしろ相対的な定義として意図される。「特異的な」、「好ましい」、または「優先的な」なる用語は本明細書において互換的に用いられ、その基質または活性に関して絶対的な特異性を要求するわけではなく、むしろ酵素がその基質に関連するかまたは関連しないその他の化合物に対して低いかまたはより低い親和性を有し得る可能性を含む相対的定義を有することが意図される。同様に、酵素、酵素活性、または１本鎖ＤＮＡ結合物質を命名するのに用いられる用語は、本明細書ではこのような成分の機能または活性を記載するのに用いられるが、このような成分の絶対的な純粋を必要とするわけではない。したがって、このような酵素、酵素活性、１本鎖ＤＮＡ結合物質または同一物の別の成分とそれとの混合物、関連するまたは関連しない機能を含有するいずれかの混合物は本発明の範囲内である。「生物学的サンプル」なる用語は微生物、動物および植物などの生物から得られたいずれかの種類の材料、ならびにその複製に関して宿主生物に依存するウイルス、およびプリオンなどのいずれかの種類の感染性粒子を含む。このように、「生物学的サンプル」には研究、開発、診断または治療の目的のために患者、動物、植物または感染性粒子から得られたいずれかの種類の材料が含まれる。従って、本発明はいずれかの特定の核酸分子またはその起源の使用に限定されるものではないが、本発明はいずれかの既定の核酸での仕事および操作に適用され、そして使用される一般的な手段を提供する。本発明を実施するために適用されるようないずれかの核酸分子を当業者に公知のいずれかの方法により入手または調製することができる。

好ましい実施形態では、本発明を用いて１本鎖ＤＮＡの調製物から２本鎖ＤＮＡ分子の全てまたは一部を除去する。ヘルパーファージを用いるインビボ研究法または異なる酵素活性を用いるインビトロ研究法の使用などの当業者に公知のいずれかの研究法により１本鎖ＤＮＡを調製することができるが、これらに限定されない。

このように本発明は当業者に公知のこの分野で確立されたいずれかの方法による直鎖状鋳型から、または環状鋳型からの１本鎖ＤＮＡの調製に関する。

より詳細には、１本鎖ＤＮＡは直鎖状ＤＮＡ分子または共有結合により閉じた環状ＤＮＡ分子でよく、これを直鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から、もしくは環状ＤＮＡ分子から調製するか、またはプラスミドもしくはファージミドから入手することができる。本発明は１本鎖ＤＮＡの調製に用いた出発物質に依存せずに、いずれかの既定の文脈で２本鎖ＤＮＡに対して１本鎖ＤＮＡを精製または富化するための手段を提供する。

当業者に公知のいずれかの研究法により、本発明を実施するために用いることができる１本鎖ＤＮＡの調製が可能になる。従って、本発明は１本鎖ＤＮＡの調製のための特定の研究法に依存しないが、いずれかの公知の研究法に適用することができる。１つの好ましい実施形態では、本発明は直鎖状１本鎖ＤＮＡを利用する。直鎖状１本鎖ＤＮＡを調製するための鋳型ＤＮＡは自然状態で既に１本鎖または２本鎖になっている環状または直鎖状ＲＮＡまたはＤＮＡでよく、そして当業者に公知のいずれかの方法により入手、調製または修飾され得る。直鎖状１本鎖ＤＮＡの調製のために当業者に周知の種々の技術が開発されているおり、非限定例としては以下に名称を挙げるものなどがある。多くの場合で、これらの研究法ではＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からの１本鎖ＤＮＡの合成に基づくＤＮＡポリメラーゼを使用する。鋳型よりも過剰の１本鎖ＤＮＡを生じる直鎖状鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるいずれかの増幅方法を本発明に適用することができる。このような研究法には、個々の反応として、または環状反応として実施される、ＤＮＡポリメラーゼにより誘導されるプライミング反応の使用などがあるが、これに限定されない。このようなＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、またはその分野で公知のいずれかその他のＤＮＡポリメラーゼなどがあるが、これらに限定されない。Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されないＲＮＡポリメラーゼ、さらにＤＮＡ鋳型を最初にＲＮＡに転写することにより高品質な１本鎖ＤＮＡを調製することができ、この反応では鋳型を直鎖化することにより転写反応を終止することができる。次いで鋳型ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼにより破壊することができ、その後ＲＮＡ転写物を鋳型として用いて、逆転写酵素により１本鎖ＤＮＡを合成する。このような逆転写酵素には、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素ＲＮアーゼＨマイナスなどがあるが、これらに限定されない。２つの独立した反応において２つの異なる形態の核酸を使用することにより、その研究法により各々デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼによる鋳型の除去のための手段が提供される。

特別の場合では、さらに２つのプライマーを異なる濃度で用いる、いわゆる非対称ＰＣＲ反応により１本鎖ＤＮＡの合成を達成することができる。律速プライマーを使い果たした後、反応は２本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅から、律速プライマーよりも過剰に用いられるプライマーによりプライミングされる１本鎖の直線増幅に反応を切り換える。代替の研究法では、λエクソヌクレアーゼを用いて５’リン酸化された末端を有する２本鎖ＤＮＡの１本の鎖を消化する。２つのプライマーのうちの１つが５’末端でリン酸化されているＰＣＲ反応においてこのような鋳型を調製することができる。「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標）」としても称される酵素、λエクソヌクレアーゼはＮｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国から市販されており、その「Ｓｔｒａｎｄａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡ調製キット」カタログ番号６９２０２の説明書を参照することにより本明細書に組み込む。同様に、酵素もまたＥｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国からλエクソヌクレアーゼ（カタログ番号ＬＥ０３５ＨおよびＬＥ０３２Ｋ）として入手することもできる。関連する研究法では、２つのプライマーのうちの１つが特異的にタグ化された、ビオチン標識、ジゴキシゲニン、またはアミノ基などであるＰＣＲ反応により１本鎖ＤＮＡを調製するが、これらに限定されない。

修飾されたオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成サービスを提供するたいていの供給者から入手でき、本発明を実施するために容易に入手可能である。タグを用いて鋳型ＤＮＡおよび第２の望ましくない鎖からタグ化された鎖を分離することができる。目的の鎖をマトリックスまたはいずれかの種類の固体支持体に結合させて用いることを想定する場合、この研究法は特に価値がある。このように固定された１本鎖ＤＮＡを支持体上で直接精製することができ、そして鎖特異的調製および１本鎖ＤＮＡの単離に依存する検出アッセイにおいて用いることができる。

しかしながら、本発明は環状１本鎖ＤＮＡの調製にも関するので、本発明は直鎖状１本鎖ＤＮＡの調製に限定されるものではない。環状１本鎖ＤＮＡを調製するための鋳型ＤＮＡは、プラスミド、ファージミド、自己ライゲート分子から誘導された、自然状態で既に１本鎖または２本鎖になっている環状または直鎖状ＲＮＡまたはＤＮＡでよく、そして当業者に公知のいずれかの方法により入手、修復または修飾され得る。環状１本鎖ＤＮＡを当業者に公知のいずれかの方法により調製することができる。これには、１本鎖化された環状ＤＮＡのインビボ合成のためのヘルパーファージを利用する研究法などがあるが、これらに限定されない。通例的に使用されている１本鎖ＤＮＡのこの種の調製のための標準的な研究法には、バクテリオファージＭ１３ゲノムからのＤＮＡ合成を開始および終止させるためのシス作動性制御配列を有するファージミドなどがあるが、これらに限定されない。従って、宿主細菌が複製欠損遺伝子間領域を担持するヘルパー野生型または変異体繊維状バクテリオファージに感染される場合、このようなファージミドにより１本鎖ＤＮＡのインビボ調製が可能になる。このようなヘルパーファージには、干渉抵抗性ヘルパーファージＲ４０８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、米国、カタログ番号２００２５２、またはＰｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，米国、カタログ番号Ｐ２２９１およびＰ２３４１から入手可能、）、ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、米国、カタログ番号２００２５１）、またはＭ１３ＫＯ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国、カタログ番号Ｎ０３１５）などがあるが、これらに限定されない。適当なファージミドを担持する細菌の細胞培養が干渉抵抗性ヘルパーファージと感染した後、ヘルパーファージによりコードされるＧｅｎｅ ＩＩ生成物は１つの鎖のローリング・サークル様複製を開始するファージミドの遺伝子間領域に鎖特異的ニックを導入する。その後、当業者に公知で、そしてＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載される標準的な方法により、ファージミドＤＮＡの１本鎖コピーを子孫バクテリオファージ粒子にパッキングし、そして１本鎖ＤＮＡを単離または精製することができる培地に押し出す。

さらに、本発明は異なる酵素活性による環状１本鎖ＤＮＡのインビトロ調製に関する。環状１本鎖ＤＮＡを調製するための鋳型ＤＮＡは、自然状態で既に１本鎖または２本鎖になっている環状または直鎖状の、ＲＮＡまたはＤＮＡでよく、そして当業者に公知のいずれかの方法により入手、調製または修飾され得る。１本鎖ＤＮＡのインビボ調製のための代替の方法として、インビトロ研究法が開発されており、これは当業者に周知の２つの異なる酵素活性の組み合わせを利用する。最も通例的には、バクテリオファージｆ１の複製開始タンパク質 Ｇｅｎｅ ＩＩおよびＥｘｏ ＩＩＩの組み合わせをこのような系で用いる。Ｇｅｎｅ ＩＩ酵素はファージミドベクターでｆ１複製起点を認識する部位特異的エンドヌクレアーゼとして作用し、ウイルス鎖を切断する。Ｅｘｏ ＩＩＩはニックの入った鎖の遊離３’末端を攻撃し、そして他方の鎖が１本鎖環状ＤＮＡとして放出されるまで消化する。このような系を例えばＧｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのいわゆるＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡポジティブセレクション系（カタログ番号１０３５６−０２０、これは現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）の一部である）の一部として入手することができ、その取扱説明書を参照することにより本明細書に組み込む。いずれかその他の鎖特異的ニッキング酵素を用いて、このような酵素が２本鎖ＤＮＡ基質におけるその認識配列内で１つのＤＮＡ鎖のみを切断する場合、同様に本発明を実施することができる。このような酵素には、市販により入手可能なヌクレアーゼＮ Ｂｐｕ １０Ｉ（ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ ＵＡＢ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）、Ｎ Ｂｂｖ Ｃ ＩＡ、Ｎ Ｂｓｔ ＮＢ ＩおよびＮ．Ａｌｗ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国）などがあるが、これらに限定されない。適当な認識部位を含有するスーパーコイル２本鎖プラスミドに由来する１本鎖ＤＮＡの調製のためのＮ Ｂｐｕ １０Ｉの適用のための詳細なプロトコルを、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＵＡＢのウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｅｒｍｅｎｔａｓ．ｃｏｍ／で見出すことができ、これを参照することにより本明細書に組み込む。同様に、酵素を２本鎖ＤＮＡ中の１つのＤＮＡ鎖を消化できるいずれかその他のエクソヌクレアーゼで置き換えることができるので、本発明はＥｘｏ ＩＩＩの使用に限定されるものではない。

その調製方法とは独立して、いずれかの１本鎖ＤＮＡは目的のいずれかの適用においてその使用が可能になる特定の程度まで精製されなければならない。富化または精製のための手段は実験的必要性に応じて変化し得る。１本鎖ＤＮＡの精製のための多くの研究法は当業者に公知である。このような精製工程には、非限定例としてはＲＮＡを除去するためのリボヌクレアーゼ、残留するタンパク質を除去するための、非限定例としてはプロテイナーゼＫなどのプロテアーゼ、タンパク質を除去するためのフェノールでの抽出、適当なマトリックスでの、または適当な膜を通すゲル濾過、ゲル電気泳動、非限定例としては１本鎖ＤＮＡに親和性を有するマトリックスまたは物質などのクロマトグラフィー研究法の適用、１本鎖ＤＮＡ結合物質の使用、市販により入手可能なキットの使用、およびサンプルを濃縮するためのエタノールまたはプロパノールによるＤＮＡの沈殿などがある。さらに、前記で概要を記したような酵素活性による特異的な副産物を除去するための研究法、または非限定例としてはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥセルロース（ＢＮＤＣ）、ベントナイト上のメチル化アルブミン（ＭＡＢ）、またはＫｉｅｓｅｌｇｕｒ上のメチル化アルブミン（ＭＡＫ）などのクロマトグラフィー手順があり、本発明を実施する間にこれを含めるか、または意図的に排除することができる。

本発明は２本鎖ＤＮＡの２本鎖特異的消化のための２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの使用を包含する。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡを特異的に消化するが、１本鎖ＤＮＡを切断しないままにし、そして２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは１本鎖ＤＮＡと比較して２本鎖ＤＮＡに関して優先的な親和性を有している。従って、完全なまたは部分的な１本鎖ＤＮＡの存在下で２本鎖ＤＮＡを消化するために、いずれかの２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いて本発明を実施することができる。本明細書に開示した条件下で、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは残留する２本鎖ＤＮＡを消化し、部分的１本鎖および２本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ分子の２本鎖部分を除去する。例えばニックの入ったＤＮＡ株のエンドヌクレアーゼによる消化が不完全なままである場合、このような部分的２本鎖ＤＮＡ分子が２本鎖ＤＮＡから誘導される。結果的に、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、部分的１本鎖および部分的２本鎖ＤＮＡなどの基質から直鎖状１本鎖ＤＮＡを放出する。前記で概要を記した１本鎖ＤＮＡ特異的エクソヌクレアーゼによりこのような１本鎖ＤＮＡをさらに消化することができる。

同様に、その調製に用いた方法、特性、供給源、直鎖状または環状かどうかに依存せず、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは１本鎖ＤＮＡのいずれかの調製物から２本鎖または部分的２本鎖ＤＮＡを除去することができる。従って、本発明は部分的および完全１本鎖ＤＮＡのいずれかの調製物から２本鎖ＤＮＡを除去するための一般的な研究法に関する。

好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡ分子内に４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である。このような酵素の多くは当業者に公知であり、ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ ＵＡＢ（Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）、Ｔａｋａｒａ（東京、日本）、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国）などの異なる供給者から市販により入手できるが、これらに限定されない。２本鎖ＤＮＡを切断するが１本鎖ＤＮＡを切断しないこのような制限エンドヌクレアーゼには、特に限定されないが、４塩基対カッター、ＨａｐＩＩ、ＨｙｐＣＨ４ＩＶ、ＡｃｉＩ、ＨｈａＩ、ＭｓｐＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔａｑ ａｌｐｈａ Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＢｓｒＩ、ＭｎｌＩ、ＢｆａＩ、ＭａｅＩ、ＰｌｅＩ、ＭｓｅＩ、ＨｉｎＰｌＩおよびＴｓｐ ５０９Ｉなどがあり、そこから、それのいずれか既定のまたはいずれか別の酵素と組み合わせた混合物の調製のために候補を選択することができる。この当業者に明白なその他の適当な制限エンドヌクレアーゼを、本発明を実施するのに同様に適用することができる。従って、本発明は特定の酵素または特定の酵素の混合物の使用に制限されるものではない。平均して、２本鎖ＤＮＡ分子内に４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターは、約数百塩基対毎のランダムな配列の２本鎖ＤＮＡ分子を切断する。従って、２本鎖ＤＮＡ分子が数個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに断片化される場合、このような４塩基対カッターのいずれかの混合物により１本鎖ＤＮＡの存在下での２本鎖ＤＮＡの消化が可能になる。当業者に公知の標準的な方法により大きなＤＮＡフラグメントから短いオリゴヌクレオチドを容易に除去することができる。このような研究法には、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）から市販により入手可能な、ＰＣＲ反応からのプライマーの除去のために確立された方法などがあるが、これらに限定されない。

より好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤ．Ａ．Ｓｈａｇｉｎら（前出）（参照することにより本明細書に組み込む）に記載されるカニ肝膵臓に由来するＤＳＮであり、そして供給者Ｅｖｒｏｇｅｎ（カタログ番号ＥＡ００１、モスクワ、ロシア）によりさらに記載され、そのＤＳＮについての製品情報を参照することにより本明細書に組み込む（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｖｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）。ＤＳＮは２本鎖ＤＮＡに関するその優先的な特異性に関して特徴づけられ、そして１本鎖ＤＮＡと比較して２本鎖ＤＮＡに関してより高い特異性を有している。しかしながら、１本鎖ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡの伸長をも含む２次構造を形成し得るので、２本鎖ＤＮＡに関するその特異性は反応温度に依存する。従って、１本鎖ＤＮＡの存在下でのＤＳＮの使用は、安定した２次構造を形成しない短い１本鎖ＤＮＡ分子に限定されるか、またはたいていの２次構造が妨害される高い反応温度を必要とする。同様に、ＤＳＮは１つのＲＮＡおよび１つのＤＮＡ鎖から成る２本鎖ハイブリッドからＤＮＡを除去することができる。さらに、部分的または完全に修飾されたヌクレオチドから成るいずれかの核酸分子に関してＤＳＮを使用することは本発明の範囲内である。当業者に公知のこのような修飾は酵素の酵素活性と干渉してもしなくてもよい。従って、このような修飾されたヌクレオチドを用いて核酸分子内の特定の部分をＤＳＮによる消化に対して保護することを想定することができる。従って、ＤＳＮは１本鎖ＤＮＡの存在下で２本鎖ＤＮＡを消化する能力を有しているので、ＤＳＮは、本発明を実施するのに用いられる酵素活性のための好ましい酵素として、見なされる。

場合によっては、ＤＳＮを４℃から６５℃のいずれかの温度で適当なバッファー系に適用することができる。さらに好ましい条件下では、反応を３７℃または５０℃で実施することができる。なおさらに好ましい条件下では、反応を約６５℃で実施することができ、この温度で１本鎖ＤＮＡ分子のたいていの２次構造が解離する。さらに、酵素反応の実施前にＤＳＮ処理に供されるような１本鎖ＤＮＡを６５℃でインキュベートすることができる。２次構造は１本鎖ＤＮＡ分子内の相補的配列により形成される２本鎖ＤＮＡの伸長を含み得るので、２次構造の解離は、特に限定されないが、ＤＳＮなどのいずれかの２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの使用に重要である。１本鎖ＤＮＡ分子内の２本鎖ＤＮＡのいずれかのこのような伸長を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが認識して、分子の分解に至る。同様に、互いに相補的な配列を有する２つの異なる１本鎖ＤＮＡ分子における１本鎖ＤＮＡの伸長により、２本鎖ＤＮＡの伸長とのハイブリッド分子の形成に至り得る。このような場合、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを使用する処理の前にこのような２本鎖構造を解離するのが望ましい。

１つの実施形態では、ＤＳＮを単一の酵素活性に関して用いて１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖ＤＮＡおよび部分的２本鎖ＤＮＡ、ならびに完全２本鎖ＤＮＡを含む混合物から２本鎖ＤＮＡを除去することができる。

別の実施形態では、１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖ＤＮＡおよび部分的２本鎖ＤＮＡ、ならびに完全２本鎖ＤＮＡを含む混合物からいずれかの２本鎖ＤＮＡを除去するために、ＤＳＮをその酵素活性に関して、２本鎖ＤＮＡ分子内に４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターと組み合わせて用いることができる。

好ましくは、２本鎖ＤＮＡと比較して１本鎖ＤＮＡに関して優先的な親和性を有している１本鎖ＤＮＡ結合親和性を有している物質と一緒にＤＳＮを使用する。１本鎖ＤＮＡに対するその高い結合親和性のために、このような物質は、１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖ＤＮＡおよび部分的２本鎖ＤＮＡ、ならびに完全２本鎖ＤＮＡを含む混合物中で１本鎖ＤＮＡに優先的に結合する。従って、このような物質は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる非特異的切断に対して１本鎖ＤＮＡを保護することができる。

好ましくは、１本鎖ＤＮＡ結合物質は１本鎖ＤＮＡ分子の２次構造を妨害することができる。２次構造は１本鎖ＤＮＡ内の相補的配列により形成される２本鎖ＤＮＡの伸長を含み得るので、２次構造の解離は、特に限定されないが、ＤＳＮなどの、いずれかの２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの適用に重要である。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが１本鎖ＤＮＡ分子内の２本鎖ＤＮＡのいずれかの伸長を認識でき、分子を分解するに至る。従って、１本鎖ＤＮＡ結合物質により直線構造を得るための２次構造の妨害により、１本鎖ＤＮＡを２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる非特異的切断に対して保護することができる。

さらに好ましくは、１本鎖ＤＮＡ結合物質は本発明を実施するために用いられる２本鎖特異的エンドヌクレアーゼよりも、１本鎖ＤＮＡに関してより高い結合親和性を有しているべきである。なお、さらに好ましくは、１本鎖ＤＮＡ結合物質は本発明を実施するために用いられる２本鎖特異的エンドヌクレアーゼよりも、１本鎖ＤＮＡに関してさらにより高い結合親和性を有している。１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖ＤＮＡおよび部分的２本鎖ＤＮＡ、ならびに完全２本鎖ＤＮＡを含む反応混合物では、同一の反応に適用された２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと比較して、１本鎖ＤＮＡに関してより高い結合親和性を有している１本鎖ＤＮＡ結合物質は、１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより形成された複合体から１本鎖ＤＮＡを滴定する。１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの複合体から１本鎖ＤＮＡを滴定することにより、１本鎖ＤＮＡ結合物質は反応混合物中の遊離の２本鎖特異的エンドヌクレアーゼ分子の濃度を上昇させ、従って２本鎖ＤＮＡを消化する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのターンオーバー速度を高める。従って、本発明は１本鎖ＤＮＡ結合物質の添加により、反応混合物中の遊離の２本鎖特異的エンドヌクレアーゼ分子の濃度を高め、このような酵素反応における酵素のターンオーバー速度を増強することが可能になるので、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの酵素活性を改善するための方法を包含する。このメカニズムは以前に報告された、１本鎖ＤＮＡ分子と１本鎖ＤＮＡ結合物質との間に形成される複合体において、１本鎖ＤＮＡを安定化させることにより１本鎖ＤＮＡ結合物質が作用する酵素反応における１本鎖ＤＮＡ結合物質の適用とは区別される。

１本鎖ＤＮＡに結合するかまたはこれと会合する能力を有しているいずれかの物質、非限定例としては化学物質、マトリックス、その結合特異性を変化するように修飾された固体支持体、またはタンパク質の使用などを適用して本発明を実施することができる。優先的には、本発明の一般的な適用が可能になるためにこのような１本鎖ＤＮＡ結合物質が配列特異性を有するべきではない。しかしながら、このような物質が本発明を実施するのに用いられる目的の配列に結合する場合、またはこのような物質の認識モチーフが非常に短くて、それがしばしばいずれかの既定の１本鎖ＤＮＡ内に生じる場合、特定の配列特異的または配列増強された１本鎖ＤＮＡ結合物質の使用を同様に適用して本発明を実施することができる。このような１本鎖ＤＮＡ結合物質には、限定的なものではないが、強力な抗腫瘍薬アクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）などがあり、これは１本鎖ＤＮＡの特異的トリヌクレオチドモチーフに結合するための優先的な傾向を有することが示されている（Ｒ．Ｍ．Ｗａｄｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２巻：５３−６８頁（１９９６）、これを参照することにより本明細書に組み込む）。

本発明はさらに、１本鎖ＤＮＡ結合物質が、天然のタンパク質またはその結合特性を変化するように修飾されたタンパク質、生物から単離されたタンパク質、組換えＤＮＡ技術を用いてインビボもしくはインビトロで発現されたタンパク質、または合成供給源のタンパク質である方法を包含する。このようなタンパク質は何ら配列特異性を有さずに、いずれかの種類の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに関する親和性を有し得るが、前記で概要を記したように配列特異的なまたは増強された様式で１本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質を使用することもまた本発明の範囲内である。

より好ましい実施形態では、本発明は、大腸菌に由来するＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ３２、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡに対して指向する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそのいずれかの混合物などの１本鎖ＤＮＡタンパク質の使用に言及するが、これらに限定されない。大腸菌に由来するＳＳＢは種々の供給者、非限定的な例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、米国（カタログ番号６００２０１））、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国（カタログ番号Ｍ３０１１））、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国（カタログ番号Ｅ７００３２Ｙ））、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国（カタログ番号ＳＳＢ０２２００））などから市販により入手可能である。ＳＳＢが２次構造の変性を維持し、そうでなければこれはＤＮＡポリメラーゼによる鎖の伸長を阻止することができる、シークエンシング反応のような１本鎖ＤＮＡに依存する反応でこれが通例的に使用される。同様に、これはエンドヌクレアーゼによる消化を改善し、特異性およびＰＣＲ反応の収量を増強し、ｒｅｃＡタンパク質との結合における部位特異的変異誘発を改善し、そしてＤＮＡ複製におけるＤＮＡポリメラーゼの作用を改善することが見出された。その他の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、非限定例としてはファージＴ４ Ｇｅｎｅ３２の生成物などの公のドメインで入手することができる。ファージＴ４ Ｇｅｎｅ３２の生成物は、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ（東京、日本（カタログ番号３１２−０３２５１））、ＵＳＢ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、米国（カタログ番号７４０２９Ｙ））およびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国（カタログ番号２５００３９１１））などの種々の供給者から市販により入手できるが、これらに限定されない。加えて、１本鎖ＤＮＡに対する自己抗体がしばしば慢性活動性肝炎および感染性単核球症などの非リュウマチ性疾患の患者で見出される。このような自己抗体をＤＮＡマトリックスでのアフィニティ精製により精製することができるか、または動物の免疫により入手することができる。このような抗体をさらに診断目的のための公のドメインで、例えば酵素イムノアッセイで入手することができる。１本鎖ＤＮＡに対するヒト抗体は、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ、米国（コードＨＳＳ−０１００））などの種々の提供者より市販により入手できるが、これに限定されない。

しかしながら、指示されたｃＤＮＡクローニング研究法を伴うゲノムシークエンシングプロジェクトにより、細菌からヒトまでのインビボでのＤＮＡ複製および修復に必須であることが見出された多くの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が示されたので、本発明は前記した１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には限定されない。従って、これらのタンパク質のいずれかは本発明の範囲内であり、そしてその他の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に関して本明細書で記載されたように、本発明を実施するために調製および適用される可能性を有している。

非限定例として前記で名称を挙げたものなどの１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと同一の条件下で使用することができる。好ましい反応を３７℃の温度で行うことができる。より好ましい反応を５０℃の温度で行うことができる。よりさらに好ましい反応を６５℃の温度で行うことができる。ＤＳＮおよびＳＳＢは６５℃までの温度で機能する熱安定性タンパク質である。従って、本発明はいずれかの既定の温度での２本鎖特異的エンドヌクレアーゼおよび１本鎖ＤＮＡ結合物質の使用に限定されるものではないが、実験的必要性に依存していずれかの適当な反応温度を適用することができる。

なおさらに特定の実施形態では、本発明はまた１本鎖ＤＮＡ特異的エクソヌクレアーゼによる直鎖状および環状１本鎖ＤＮＡを含むこのような混合物をさらに処理することにより環状１本鎖ＤＮＡの調製物から直鎖状１本鎖ＤＮＡをさらに除去することをも包含する。エクソヌクレアーゼが環状１本鎖ＤＮＡと比較して直鎖状１本鎖ＤＮＡに関してより高い特異性を有する場合、直鎖状１本鎖ＤＮＡに関する特異性を有するいずれかのエクソヌクレアーゼを適用して本発明を実施することができる。このような酵素には、非限定例としてはエクソヌクレアーゼＥｘｏ ＩおよびＥｘｏ ＶＩＩなどがある。これらの酵素に関する反応条件は当業者に公知であり、そしてＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）によりさらに記載されている。

１本鎖ＤＮＡの調製およびその品質をＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）により記載されているアガロースゲル電気泳動により分析することができる。既定の濃度のアガロースゲルでは、ニックの入った２本鎖ＤＮＡは、ニッキング酵素の基質になり得るスーパーコイルＤＮＡよりも低い移動パターンを示す開口環状ＤＮＡとして移動する。同様に、スーパーコイルＤＮＡおよび開口環状ＤＮＡより先に移動する迅速な移動パターンにより、１本鎖環状ＤＮＡをスーパーコイルＤＮＡおよび開口環状ＤＮＡから区別することができる。従って、アガロースゲル電気泳動は１本鎖ＤＮＡ調製物の異なる段階を区別するための適当な手段であり、そして１本鎖ＤＮＡの品質のモニター観察が可能になる。さらにこれを適用して異種性ＤＮＡ分子から成る混合物からの１本鎖ＤＮＡの精製をモニター観察することができる。

１本鎖ＤＮＡに特異的または優先的に結合する試薬による比色または蛍光アッセイで１本鎖ＤＮＡを定量することもできる。このような試薬の１つには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ（Ｅｕｇｅｎｅ、米国（カタログ番号Ｏ−７５８２およびＯ−１１４９２））から市販により入手可能な、鋭敏な蛍光核酸染色であるＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）などがあるが、これに限定されない。通例的に用いられる２６０ｎｍでのその吸光度の決定によるＤＮＡ濃度測定とは対照的に、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）は夾雑ヌクレオチドと干渉せず、そしてより高い感受性を示す。従って、６塩基までのヌクレオチドおよび短いオリゴヌクレオチドは検出されないので、これは本発明により得られた１本鎖ＤＮＡの定量のための良い理由になる。このようにＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）は、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる２本鎖ＤＮＡの消化、または直鎖状１本鎖ＤＮＡ特異的エクソヌクレアーゼによる直鎖状１本鎖ＤＮＡの消化に由来する遊離のヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチドとは干渉しない。しかしながら、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）は２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの相互作用による蛍光増強を呈する。

１本鎖ＤＮＡの鎖特異的調製のための方法はこの分野における多くの技術および適用を必要とする。従って本発明は高品質な１本鎖ＤＮＡの調製のための手段および当業者に公知の適用におけるその使用を包含する。

当業者に公知の技術により、異なる化学的または酵素的反応によりＤＮＡ配列を決定することができる。これらの研究法の全ては、１本鎖ＤＮＡが相補鎖の合成のための鋳型として機能するヌクレオチド特異的化学反応、または酵素反応の基質である１本鎖ＤＮＡ鋳型を利用する。Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出、参照することにより本明細書に組み込む）は当業者に公知のＤＮＡシークエンシングのための標準的な研究法について記載した。

１本鎖ＤＮＡは点変異を導入するための鋳型として通例用いられる。優先的には、プラスミドまたはファージミドに由来するＤＮＡを環状１本鎖ＤＮＡに変換し、そして望ましい変異を宿すオリゴヌクレオチドを環状１本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイズさせ、そしてプライマーとして用いて当業者に公知の、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載された技術により第２鎖を合成する。

［検出方法］
複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子における個々のクローンの検出および単離のために１本鎖ＤＮＡをさらに使用し、非限定例としては、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのいわゆるＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ陽性選択系（カタログ番号１０３５６−０２０、これは現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）の一部である）の使用などがあり、その取扱説明書は参照することにより本明細書に組み込む。

ハイブリダイゼーション実験または当業者に公知のその他の研究法に用いられる、修飾されたまたは標識されたＤＮＡプローブの調製のために１本鎖ＤＮＡをさらに使用する。このような適用には、ウラシルの組み込み、放射活性ヌクレオチドまたは、ビオチンおよびジゴキシゲニンなどの非放射活性標識の使用などがあるが、これらに限定されない。
分析用の１つの鎖の鎖特異的調製に依存するゲノムまたは転写されたＤＮＡにおけるＳＮＰの検出のためのアッセイにおいて１本鎖ＤＮＡをさらに使用する。このような研究法には非限定例としてはいわゆるＤＡＳＨ ＳＮＰ検出系、米国特許出願第２００１０４６６７０号（前出）などがある。

［定方向切断］
１本鎖ＤＮＡをさらに使用して、エンドヌクレアーゼのための特異的切断部位を創る。このような適用の１つでは、切断に望ましい部位に対する規定の配列相補性を有するオリゴヌクレオチドを１本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡに結合する領域では、制限エンドヌクレアーゼに関する認識部位を含む２本鎖ＤＮＡの伸長を形成する。従って、たとえ最初に１本鎖ＤＮＡ鋳型の調製に用いられた２本鎖ＤＮＡ鋳型が、選択された制限エンドヌクレアーゼのための多くの認識部位を含有したとしても、１本鎖ＤＮＡ内の特異的領域を切断のために選択することができる。制限エンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡ内の規定の認識部位の存在に依存するので、ＤＮＡ鋳型の配列非依存的切断が可能になるのが望ましい。本発明のこの実施形態では、切断点のために選択される望ましい配列を有するオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、そしてオリゴヌクレオチドおよび鋳型ＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの伸長を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより切断する。本発明の好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮである。本発明のさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。なおさらに好ましい本発明の実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮであり、これを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。従って、本発明は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる１本鎖ＤＮＡ鋳型の部位特異的切断のための手段を提供する。

［サブトラクティブＰＣＲ］
この実施形態では、本発明により複数の核酸および分子でのサブトラクティブＰＣＲ反応の実施がさらに可能になる。このサブトラクティブＰＣＲでは、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドが核酸分子の大きなプール内の核酸のサブセットを標的化するように設計する。サブセットの標的核酸分子は包括的にテスターと称し、そして過剰量の１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを包括的にドライバーと称する。オリゴヌクレオチドはいずれかのゲノムＤＮＡまたはＤＮＡまたは転写された領域としてのＲＮＡから選択された配列を有することができ、そしてイントロンまたはエクソンに由来する領域を含むことができる。また、宿主からのゲノム情報をクローニングする場合、例えば寄生体に由来する転写体を除去するのが望ましいこともあり得るので、無関係の生物または供給源からの配列をここで含めることもできる。従って、オリゴヌクレオチド配列を実験的必要性および標的核酸分子に基づいて選択して大きなプールから除去する。

必要な特異性を達成するために、当業者に公知の特定のバイオインフォーマティクス手段を適用して標的配列内の代表的なモチーフを選択することができる。市場の多くの提供者により日常的に提供されるような化学合成により、選択された配列を含むオリゴヌクレオチドを入手することができる。

本発明のこの実施形態を実施するために、特異的なオリゴヌクレオチドの形態で与えられたドライバーを１本鎖ＤＮＡの形態で与えられたテスターと共にインキュベートして、相補的領域のハイブリダイゼーションを可能にする。オリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応を実施するために用いたプライマーによりフランキングされるようにＰＣＲ反応の標的配列内に結合し、そしてドライバーからの特異的オリゴヌクレオチドはテスター配列内の、フランキングプライマー部位によりマークされた増幅された領域内に存在する部分に結合する。従って、オリゴヌクレオチドのその標的配列への結合の後、分解のために選択された鋳型が２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより切断され、そして２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはテスター内の配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを含む２本鎖ＤＮＡ領域のみを切断できる。対照的に、対合するオリゴヌクレオチドがドライバーに存在しないテスターの配列は完全な１本鎖ＤＮＡとして残り、そして従って、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼでの処理から無傷のまま残る。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを用いる反応工程を実施した後、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼをＤＮＡ鋳型から除去し、そして鋳型を当業者に公知の標準的な手段による増幅に供する。増幅ステップの間、双方のプライマー部位を含む鋳型のみを増幅し、一方２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの標的であるテスター配列はもはや増幅に利用されない。

本発明の好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮである。本発明のさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。本発明のなおさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮであり、そしてこれを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。従って、本発明は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる１本鎖ＤＮＡ鋳型の部位特異的切断のための手段を提供する。さらに、本発明は複数の核酸分子内の核酸分子のサブセットを標的切断するための手段を提供し、ここで自由選択の核酸分子を標的化することができ、そして配列非依存的様式で切断することができる。本発明の手段により切断されるので、これらの標的分子はもはやＰＣＲ反応の鋳型としては使用されず、従って、サブトラクティブＰＣＲ反応における本発明の適用が可能になる。

［マイクロアレイ］
１本鎖ＤＮＡをさらに、１本鎖ＤＮＡの使用が特異的標的配列の検出に必須であるｃＤＮＡマイクロアレイの調製に用いる。当業者に公知の種々の技術によりマイクロアレイを調製することができる。

さらに別の実施形態では、マイクロアレイに付着したプローブは１本鎖標識、または２本鎖標識１本鎖オリゴヌクレオチドを含むことができる。このような適用では、アレイに存在する各々のオリゴヌクレオチドが検出系のシグナルを生じる。サンプルにより提示される相補的核酸分子がアレイ上のこのような標識オリゴヌクレオチドに特異的結合した後、２本鎖ＤＮＡの伸長がアレイ上で形成される。これらの２本鎖ＤＮＡの伸長を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより切断して標識オリゴヌクレオチドを破壊し、そして従ってアレイ上のシグナルを破壊することができる。本発明の好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮである。本発明のさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。本発明のなおさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮであり、そしてこれを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。従って、本発明はマイクロアレイ上の特異的シグナルを検出するための手段を提供する。

本発明のさらに別の実施形態では、マイクロアレイ上で形成された２本鎖ハイブリッドを２本鎖特異的色素のインターカレーションにより検出することができる。マイクロアレイ上のシグナルの特異性を確認するために、色素で標識した２本鎖ＤＮＡの伸長を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる消化に供することができる。本発明の好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮである。本発明のさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。本発明のなおさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼはＤＳＮであり、そしてこれを１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で使用する。従って、本発明はマイクロアレイ上の特異的シグナルを検出するためのちょうど別の手段を提供する。

さらに複数の核酸分子の調製の間のサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのためのテスターおよびドライバーの調製のようなハイブリダイゼーション実験において１本鎖ＤＮＡを用いる。このような技術は当業者に公知であり、Ｃ．Ｇ．Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｅｍら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６巻：７５１−７８３頁（１９９７）にさらに記載されており、これを参照することにより本明細書に組み込む。

［規準化］
このような実施形態の１つでは、このようなサンプルの複雑性が、高度に反復した配列の除去または同一配列を有する高頻度発生分子の除去により低減される場合、本発明をサンプルの規準化に適用することができる。この適用では、例えば熱処理または当業者に公知のいずれか別の方法により、既定の複数の２本鎖核酸分子を変性させて２つの鎖を互いに分離させる。変性の後、サンプル内の１本鎖核酸分子を再会合させて相補的配列の２つの核酸鎖を含む２本鎖核酸分子を形成することが可能になる。再会合の動態はサンプル内の相補的核酸分子の濃度に直接依存するので、高いまたはより高い濃度で存在する核酸分子が低いまたは非常に低い濃度で存在する核酸分子よりも速く、またはさらに速く再会合する。従って、既定の時間の後、豊富な核酸分子が優先的に２本鎖核酸分子を形成し、一方稀な核酸分子は依然１本鎖核酸分子として存在する。実験的必要性に適合させるために選択または確立された時点で、ハイブリダイゼーション反応を終止させて、そして１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下または不在下で、サンプルを２本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理して、サンプル内の豊富な核酸分子により形成された２本鎖ＤＮＡ分子を消化する。従って、本発明は酵素活性によるいずれかの複数の核酸分子の規準化のための手段を提供し、部分的または完全な２本鎖核酸を含む特異的ハイブリッド分子を除去する。

［サブトラクション］
さらに別の実施形態では、本発明をテスターと称するサンプルからのサブトラクションに適用することができる。テスターの核酸分子のいくつかに共通する特定の核酸分子はいわゆるドライバーに存在する。高度に関連したまたは同一の配列を有する、ドライバーおよびテスターに共通する核酸分子はテスターから完全にまたは部分的に除去されているかまたは「サブトラクトされている」。このような適用では、本発明によるかまたは当業者に公知のいずれかの別の方法により調製された２つの既定の複数の１本鎖核酸分子を混合して、１本鎖核酸分子の会合を可能にし、相補的配列の２つの核酸鎖を含む２本鎖核酸分子を形成する。既定の時点で、関連する核酸分子が優先的に２本鎖核酸分子を形成し、一方ドライバーに相補的核酸分子が存在しない核酸分子は１本鎖核酸分子として残る。実験的必要性に適合させるために選択または確立された時点で、ハイブリダイゼーション反応を終止させて、そして１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下または不在下で、サンプルを２本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理して、テスターおよびドライバーに共通する核酸分子から成る２本鎖ＤＮＡ分子を消化する。従って、本発明は酵素活性によるいずれかの複数の核酸分子のドライバーでのサブトラクションのための手段を提供し、部分的または完全な２本鎖核酸を含む特異的ハイブリッド分子を除去する。

別の実施形態では、本発明は、複数の核酸分子内の核酸分子が、そのホモ二量体およびヘテロ二量体などのいずれかの可能な組み合わせでリボ核酸分子またはデオキシリボ核酸分子を含むことができるいずれかの複数の核酸分子の規準化またはサブトラクションに関する。

さらに、本発明は、いずれかの１本鎖ＤＮＡ、部分的１本鎖および部分的２本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖ＤＮＡなどのこのような複数の核酸のアリコートが複数の核酸から取り出され、そして２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる２本鎖ＤＮＡの消化に供される、２本鎖ＤＮＡの存在下での１本鎖ＤＮＡの検出および測定に関する。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのみにより、または２本鎖特異的エンドヌクレアーゼおよび１本鎖ＤＮＡ結合物質との組み合わせ使用によりこのような反応を実施することができる。酵素活性が複数の核酸内の２本鎖ＤＮＡを消化するので、１本鎖ＤＮＡは溶液に残り、そしてそれを当業者に公知の方法による検出および測定に供することができる。このような研究法には、非限定例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ（Ｅｕｇｅｎｅ、米国（カタログ番号Ｏ−７５８２およびＯ−１１４９２））から市販により入手可能な、鋭敏な蛍光核酸染色であるＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）などがある。前記で概要を記したように、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）は２本鎖ＤＮＡの消化後に反応混合物へ放出された短いポリヌクレオチドまたは単一のヌクレオチドを検出しない。従って、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）の使用により、反応混合物から短いポリヌクレオチドまたは単一のヌクレオチドを除去する必要がなく、１本鎖ＤＮＡが元来の目的である反応生成物の直接的な測定が可能になる。また別の研究法はさらにＤＮＡ鋳型に組み込まれ、そして２本鎖ＤＮＡの消化に適用された放射活性標識を利用することができ、そしてこのような反応混合物から得られた１本鎖ＤＮＡの量をサンプルに組み込まれた放射活性標識の量に関して分析する。さらに当業者に公知の、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載された標準的な技術を適用して、ゲル電気泳動および反応生成物の染色により反応生成物を分析することができる。

従って、本明細書に開示する方法により調製した１本鎖ＤＮＡのいずれかのこのような適用は本発明の範囲内であり、そして本発明はいずれかのこのような適用において使用する１本鎖ＤＮＡを調製するための必要な手段を提供する。

［ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド］
別の実施形態では、本発明は、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖から成る２本鎖ハイブリッド分子におけるＤＮＡ鎖の消化に関する。１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、および完全な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るか、または２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに加えて部分的１本鎖ＲＮＡもしくは１本鎖ＤＮＡの領域を含有するハイブリッドなどのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るハイブリッド分子を包含するいずれかの複数の核酸では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを適用してＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの一部としてＤＮＡ鎖を消化することができる。２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのみにより、または１本鎖ＤＮＡ結合物質と組み合わせた２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの組み合わせ使用によりこのような反応を実施することができる。

さらに正確には、本発明は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる、いずれかの１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、および完全な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るか、または２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに加えて部分的１本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡの領域を含有するハイブリッドなどのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るハイブリッド分子を含むいずれかの複数の核酸からのＲＮＡの単離に関し、ここでこのような反応は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのみにより、または２本鎖特異的エンドヌクレアーゼおよび１本鎖ＤＮＡ結合物質の組み合わせ使用により実施することができる。当業者に公知であるか、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載されるエクソヌクレアーゼによりこのような反応混合物からの１本鎖ＤＮＡを消化することができる。次いで当業者に公知であるか、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載される標準的な方法により残りのＲＮＡを単離、分析およびクローニングすることができる。

さらに正確には、本発明は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる、いずれかの１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、および完全な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るか、または２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに加えて部分的１本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡの領域を含有するハイブリッドなどのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドから成るハイブリッド分子を含むいずれかの複数の核酸からの１本鎖ＤＮＡの単離に関し、ここでこのような反応は２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのみにより、または１本鎖ＤＮＡ結合物質と組み合わせた２本鎖特異的エンドヌクレアーゼの組み合わせ使用により実施することができる。当業者に公知であるか、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載されるリボヌクレアーゼによりこのような反応混合物からのＲＮＡを消化することができる。次いで当業者に公知であるか、またはＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）に記載される標準的な方法により残りの１本鎖ＤＮＡを単離、分析およびクローニングすることができる。

さらに、本発明は部分的１本鎖および部分的２本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから成る複数の核酸から１本鎖ＤＮＡをクローニングする方法に関する。本発明のこの実施形態では、このような複数の核酸における２本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより消化する。本発明の好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを独立した酵素活性に用いる。本発明のなおさらに好ましい実施形態では、２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを１本鎖ＤＮＡ結合物質と組み合わせて使用する。当業者に公知の標準的な方法により反応混合物から回収した１本鎖ＤＮＡを単離し、そしてクローニングすることができる。この実施形態では、本発明はゲノムＤＮＡからのゲノム領域のクローニングに関し、ここでゲノムは部分的または完全１本鎖ＤＮＡを含む。より好ましい実施形態では、本発明は複数の核酸からのいずれかの１本鎖ＤＮＡのクローニングに関し、ここで２本鎖核酸分子を２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより消化する。なおさらに好ましい実施形態では、本発明は複数の核酸からのいずれかの１本鎖ＤＮＡのクローニングに関する。２本鎖核酸分子を１本鎖ＤＮＡ結合物質の存在下で２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより消化する。従って、本発明は概して１本鎖ＤＮＡのクローニングのための方法に関する。

なおさらに、本発明は本明細書に開示するさらなる１本鎖ＤＮＡ結合物質を伴うかまたは伴わない２本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる１本鎖ＤＮＡの調製に関与するかまたはそれに依存する方法、および開発、製造、市販、販売、いずれかのこのような酵素活性を含むかもしくは商業上の理由のためにこのような酵素活性の使用を可能にするキットの使用または適用のためのその使用に関する。従って、本発明は、サービス、生成、および製造における商業用使用のための、本明細書に開示するさらなる１本鎖ＤＮＡ結合物質を伴うかまたは伴わない２本鎖特異的エンドヌクレアーゼのいずれかの酵素活性の使用を包含する。

概してバイオテクノロジーおよび分子生物学の分野における１本鎖ＤＮＡの広範な適用を鑑みて、本明細書に開示する本発明は、試薬、キット、および検索におけるサービス、バイオテクノロジーおよび診断用市場のための１本鎖ＤＮＡの調製および適用のための新規手段を提供するのに商業上の価値が非常に高い。

［実施例］
本発明をここで以下の実施例に関してより詳細にさらに説明する。本明細書において本発明を記載するのに用いた全ての名称および略語は当業者に公知の意味を有する。

１本鎖ＤＮＡの調製のための鋳型ＤＮＡは自然状態で既に１本鎖または２本鎖になっている環状または直鎖状ＲＮＡまたはＤＮＡでよく、そして当業者に公知のいずれかの方法により入手、調製または修飾され得る。従って、本発明はＤＮＡまたはＲＮＡの特定の供給源には限定されない。

この実施例の目的のために、メラノーマ細胞培養物から調製し、ベクター系ラムダＦＬＣにクローニングされ、特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０１６６７（これは参照することにより本明細書に組み込む）に開示されたｃＤＮＡライブラリーを用いて本発明を実施した。Ｐ．Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７７巻：７９−９０頁（２００１）（これは参照することにより本明細書に組み込む）により記載された標準的なプロトコルにより前記したｃＤＮＡライブラリーのアリコートからプラスミドＤＮＡを単離した。得られた複数のプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化することにより特徴づけし、ゲル電気泳動によりｃＤＮＡインサートの大きさを測定した。本発明を実施するために、全ｃＤＮＡライブラリーまたはそれが由来する個々のクローンを含む複数のプラスミドＤＮＡを以下に開示するように使用した。本明細書に開示する個々の反応のために、個々のクローンからのＤＮＡまたは全ｃＤＮＡライブラリーを含むＤＮＡサンプルを、本発明を実施するために適用したかどうかは問題ではない。従って、個々の反応は用いたＤＮＡの特性に依存しないが、既定の反応混合物中に存在するＤＮＡの量に依存して調整されるべきである。

個々のクローンからのプラスミドＤＮＡまたは全ｃＤＮＡライブラリーを形質転換し、そして細菌株ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）で増幅し、そしてプラスミドＤＮＡ単離用のＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ、カタログ番号２７１０４）を用いて、実施例で使用するためのプラスミドＤＮＡをＬＢ培地（Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出））中で成長させた細菌培養物から精製した。

２本鎖プラスミドＤＮＡから環状１本鎖ＤＮＡを調製するために、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのいわゆるＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ陽性選択系（カタログ番号１０３５６−０２０、これは現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）の一部である）を製造者の指示書に従って適用し、その取扱説明書は参照することにより本明細書に組み込む。

本発明の１つの実施形態では、前記したｃＤＮＡライブラリーに由来する無作為に単離したｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡを、実験条件をうまく検証するために使用した。簡単に説明すると、キットで提供されるＧｅｎｅ ＩＩ酵素溶液全量２０μｌまたは１μｌを、キットで提供される１ＸＧｅｎｅＩＩ反応バッファー中プラスミドＤＮＡ５μｇに適用した。反応混合物を３０℃で４５分間、水浴中でインキュベートした後、反応を６５℃で５分間終止させ、続いて即座にサンプルを氷中に置いた。次いでニックの入ったＤＮＡをキットで提供されるＥｘｏＩＩＩでの処置に供した。前記した反応混合物１９μｌに、キットで提供されるＥｘｏＩＩＩ酵素溶液２μｌを加え、そして反応混合物をさらに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、反応混合物２０μｌを同一容量のフェノール：クロロホルムで抽出した。水相をクロロホルムで再抽出した後、５Ｍ ＮａＣｌ ０．５μｌおよび無水エタノール５０μｌを添加して上澄からＤＮＡを沈殿させた。２０℃で３０分間のインキュベーションの後、１５０００ｒｐｍで１５分間の遠心によりＤＮＡを収集した。ペレットを８０％エタノールで２回洗浄し、そして前記したように遠心することにより入手した。最後にＤＮＡを水５０μｌに溶解した。

調製の間中、各工程で１μｌアリコートを採取し、調製の進行をゲル電気泳動によりモニター観察した。各工程からの対照サンプルを０．８％アガロースゲルにロードすることにより前記した反応をモニター観察し、そして対照として未処理ベクターの存在下で分析した。Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（前出）により記載されるようにアガロースゲル電気泳動を実施し、そしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、米国、部分コード５０５２３）で染色することによりＤＮＡを可視化した。このような実験の一例を図４に示す。アガロースゲル分析が対照と比較して明確なパターンの変化を示したサンプルのみをさらなる処理に供した。アガロースゲル電気泳動によりスーパーコイル化ＤＮＡ、解けたＤＮＡ、および１本鎖ＤＮＡ間の区別が可能になるが、２本鎖ＤＮＡのバックグラウンドがしばしば同時に可視化される。

１本鎖ＤＮＡの調製物から２本鎖ＤＮＡを除去するために、さらなる精製工程を実施した。前記した反応混合物を最初に６５℃で５分間インキュベートして、１本鎖ＤＮＡ分子において形成されていたかもしれない２次構造を解離させた。熱処理の後、サンプルを即座に氷上に置いた。ＤＳＮで消化するために、サンプル２０μｌを１０Ｘ ＤＳＮバッファー（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）２．５μｌおよび１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質Ｔ４ ｇｅｎｅ−３２（４．５μｇ／μｌ、ＵＳＢ（Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、米国））１μｌと混合した。溶液を水で最終容量２４μｌに調整した後、ＤＳＮ酵素ストック（μｌあたり１単位、Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）１μｌを加え、そして反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴＡストック溶液１μｌを添加して反応を終止させた後、容量を水で５０μｌに調整し、そして１０％ＳＤＳ １μｌを添加した。プロテイナーゼＫ酵素溶液（２０μｇ／μｌ、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）カタログ番号１９１３１）２μｌを添加するプロテイナーゼＫ処理により、残留したＤＳＮ活性を破壊し、そして反応混合物を４５℃で２時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ処理の後、標準的な条件下で等量のフェノール：クロロホルムおよびクロロホルムで反応混合物を抽出した。２μｇ／μｌ グリコーゲン溶液１μｌ、５Ｍ ＮａＣｌ ２．５μｌおよび無水エタノール１５０μｌを添加することにより、水相から１本鎖ＤＮＡを沈殿させた。２０℃で３０分間のインキュベーションの後、前記したように遠心によりＤＮＡを収集した。ＤＮＡペレットを８０％エタノールで２回洗浄した後、最終的にＤＮＡを水４０μｌに溶解した。

環状１本鎖ＤＮＡから直鎖状１本鎖ＤＮＡを除去するために、サンプルをさらにエクソヌクレアーゼと共にインキュベートした。前記したＤＮＡ調製物からサンプル４０μｌをＥｘｏＩ １０Ｘ反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国））５μｌおよびＥｘｏＩ酵素溶液（２単位／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国）、カタログ番号Ｎ０２９３Ｓ）１μｌと混合し、最終容量５０μｌを得た。３７℃で１時間インキュベートした後、前記したプロテイナーゼＫ処理により反応を終止させ、そしてフェノール：クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により環状１本鎖ＤＮＡを単離した。最終的にＤＮＡを水２０μｌに溶解した。

放射活性で標識した、サンプルとして前記したライブラリーＧ２から調製した１本鎖ＤＮＡの使用により、１本鎖ＤＮＡに対するＤＳＮの活性を試験した。「ＤＮＡ Ｍｉｃｏｒａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ」Ｄ．Ｂｏｗｔｅｌｌら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）（これは参照することにより本明細書に組み込む）に記載されるように、サンプルＤＮＡを□Ｐ３２−ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国））で標識した。この実施例では、異なる１本鎖ＤＮＡ結合物質の効果を試験し、そしてそれをＤＳＮ活性および１本鎖ＤＮＡの保護に及ぼす効果に関して比較した。実験を実施するために、放射活性サンプルを４つの等量のアリコートに分け、その各々は水７μｌ中１本鎖ＤＮＡ ２５０ｎｇプラス１０ｘ ＤＳＮバッファー（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）１μｌを含有した。サンプルを６５℃で５分間熱処理した後、最終容量１０μｌで以下の反応を実施した。第１：さらに添加しない対照サンプル、第２：０．２５単位のＤＳＮ（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）１μｌをプラス、第３：０．２５単位のＤＳＮ（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）１μｌをプラス、Ｔ４−ｇｅｎｅ ３２タンパク質（ＵＳＢ（Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、米国）、カタログ番号７４０２９Ｙ）をプラス、および第４：０．２５単位のＤＳＮ（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）１μｌをプラス、大腸菌タンパク質ＳＳＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）カタログ番号Ｍ３０１１）１μｌをプラス。３７℃で１時間インキュベートした後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １μｌを全サンプルに加えて反応を終止させた後、サンプルをゲル電気泳動用のアルカリ性ロードバッファー（３００ｍＭ ＮａＯＨ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロム・フェノール・ブルー）３μｌと混合した。次いでサンプルを０．８％アルカリ性アガロースゲル（Ｄｏｊｉｎｄｏ（Ｍａｓｈｉｋｉ、日本）、カタログ番号３４４−０００７３）にロードし、そして１Ｘ ＴＢＥバッファーで２５Ｖで１０時間流した。Ｐ^３２標識ラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーを適用したので（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、米国）、カタログ番号Ｎ３０１２Ｓ）、オートラジオグラフィーによりサンプルを直接可視化できた。翌日ゲルを１０％酢酸で洗浄し、そしてゲルドライヤー（Ｂｉｏ Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、米国））で乾燥させた。乾燥したゲルを約１．５時間暴露して放射活性サンプルを画像化し、そしてＢＡＳ−５０００画像分析器（富士フィルム（東京、日本））を用いてシグナルをさらに分析した。この実施例で提示した実験により、本発明を実施するために異なる１本鎖ＤＮＡ結合物質を独自に用いることができることが実証された。

前記したＧ２ ｍＲＮＡサンプルから調製された、放射活性で標識された直鎖状１本鎖ＤＮＡの使用により、直鎖状１本鎖ＤＮＡに対するＤＳＮの活性を試験した。「ＤＮＡ Ｍｉｃｏｒａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ」Ｄ．Ｂｏｗｔｅｌｌら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）（これは参照することにより本明細書に組み込む）に記載されるように、直鎖状１本鎖ＤＮＡを合成し、そして□Ｐ３２−ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、英国））で標識した。サンプルを６５℃で５分間熱処理した後、０．２５単位のＤＳＮ（Ｅｖｒｏｇｅｎ（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）、カタログ番号ＥＡ００１）を用いて実施例２に開示したように反応を実施し、そして大腸菌タンパク質ＳＳＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）カタログ番号Ｍ３０１１）１μｌを必要とした。３７℃または６５℃で１時間インキュベートした後、反応を終止させ、そしてサンプルをゲル電気泳動用のアルカリ性ロードバッファー（３００ｍＭ ＮａＯＨ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロム・フェノール・ブルー）３μｌと混合した。その後、サンプルを０．８％アルカリ性アガロースゲル（Ｄｏｊｉｎｄｏ（Ｍａｓｈｉｋｉ、日本）、カタログ番号３４４−０００７３）にロードし、そして１Ｘ ＴＢＥバッファーで２５Ｖで１０時間流した。翌日ゲルを１０％酢酸で洗浄し、そしてゲルドライヤー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、米国））で乾燥させた。乾燥したゲルを約１．５時間暴露して、ＢＡＳ−５０００画像分析器（富士フィルム（東京、日本））で放射活性サンプルを画像化した。この実施例で提示した実験により、ＤＳＮの特異性は１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の不在下で温度依存的であることが実証された。しかしながら、ＳＳＢの添加により、３７℃と６５℃の間のいずれかの温度で１本鎖ＤＮＡの存在下、２本鎖ＤＮＡの特異的消化が可能になった。

異なる条件下でＤＳＮを用いる１本鎖および２本鎖ＤＮＡの消化を示す図式である。示すように３つの異なる反応条件を提示する。Ａ；３７℃でｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の存在下でのＤＳＮによるｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の消化、この場合ｓｓＤＮＡは２次構造を形成でき、そしてこのような２次構造はＤＳＮにより切断される。従ってｓｓＤＮＡは低温でＤＳＮの基質になることが示された。Ｂ；６５℃でｓｓＤＮＡの存在下でのＤＳＮによるｄｓＤＮＡの消化、この場合ｓｓＤＮＡは数個の２次構造のみを形成することができる。従って、ＤＳＮは高温でｄｓＤＮＡに関して優先的な特異性を示したが、一方ｓｓＤＮＡは主に未消化のままであった。Ｃ；ＤＳＮおよびＳＳＢの存在下でのＤＳＮによるＤＮＡの消化。ＳＳＢはｓｓＤＮＡに結合し、そしてｓｓＤＮＡ内で２次構造を妨害する。従って、ＤＳＮは３７℃から６５℃の間のいずれの反応温度でもｄｓＤＮＡに高い特異性を示すが、一方ｓｓＤＮＡは未消化のままである。

異なる条件下でのＤＳＮの使用に関与するサンプルに関する電気泳動の可視化した結果を示す。ｍＲＮＡサンプルから調製した直線１本鎖ＤＮＡを実施例で開示するように「Ｇ２」と称した。異なる反応条件からのサンプルをゲル電気泳動に適用し、そしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色によりＤＮＡを可視化した。レーン１：ラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカー、レーン２：３７℃でインキュベートしたＧ２−ｓｓＤＮＡ、レーン３：３７℃でＤＳＮと共にインキュベートしたＧｓ−ｓｓＤＮＡ、レーン４：３７℃でＤＳＮおよびＳＳＢと共にインキュベートしたＧｓ−ｓｓＤＮＡ、レーン５：６５℃でインキュベートしたＧ２−ｓｓＤＮＡ、レーン６：６５℃でＤＳＮと共にインキュベートしたＧｓ−ｓｓＤＮＡ、レーン７：６５℃でＤＳＮおよびＳＳＢと共にインキュベートしたＧｓ−ｓｓＤＮＡ。

環状１本鎖ＤＮＡの調製のための原理を説明する図式を示す。図で表すように、１本鎖ＤＮＡをインビトロで異なる酵素活性により調製し、そして副産物のためのさらなる処理を示す。

ＤＳＮに関する反応動態に関する反応式を示す。ＤＳＮは図で示すように１本鎖および２本鎖ＤＮＡと反応することができるが、一方これは、ここではＳＳＢとして示される１本鎖ＤＮＡ結合物質と、１本鎖ＤＮＡに対する結合に関して競合している。

１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下および不在下でのＤＳＮによる１本鎖ＤＮＡの消化に関する、オートラジオグラフィーにより撮像されたゲル電気泳動分析の結果を示す。「Ｇ２」と称する、異なる大きさの複数の１本鎖ＤＮＡ分子を異なる条件下でＤＳＮと処理し、そしてそれに由来するサンプルをゲル電気泳動に適用し、そしてオートラジオグラフィーにより撮像する：レーン１：ラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカー、レーン２：Ｇ２、レーン３：Ｇ２プラスＤＳＮ、レーン４：Ｇ２プラスＴ４Ｇｅｎｅ３２生成物プラスＤＳＮ、レーン５：Ｇ２プラスＳＳＢプラスＤＳＮ。

本発明による個々のベクターからの１本鎖ＤＮＡの調製に関するゲル電気泳動分析の結果を示す。実施例に開示するように、環状２本鎖ＤＮＡの鋳型から環状１本鎖ＤＮＡを調製した。調製の異なる工程からのサンプルをゲル電気泳動に適用し、そしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色によりＤＮＡを可視化した。レーン１：ラムダＳｔｙ Ｉサイズマーカー、レーン２：ベクターｐＧ２−１、レーン３：ｐＧ２−１プラスＧｅｎｅＩＩ、レーン４：ｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩプラスＥｘｏＩＩＩ、レーン５：レーン１で示したサイズマーカー、レーン６：精製後のｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩ、レーン７：ｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩプラスＤＳＮ、レーン８：ｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩプラスＴ４Ｇｅｎｅ３２生成物およびＤＳＮ。

本発明により調製された１本鎖ＤＮＡに関するゲル電気泳動分析の結果を示す。本発明により調製され、そして図４で示される１本鎖ＤＮＡサンプルをプロテイナーゼＫ処理に供して、ＤＳＮおよび１本鎖ＤＮＡ結合物質および１本鎖ＤＮＡにより形成された複合体を破壊した。サンプルをゲル電気泳動に適用し、そしてＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色により可視化した。レーン１：ラムダＳｔｙ Ｉサイズマーカー、レーン２：プロテイナーゼＫ処理の前のｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩ／１本鎖ＤＮＡ結合物質／ＤＳＮ ＤＮＡタンパク質複合体、レーン３：プロテイナーゼＫ処理の後のｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩ／１本鎖ＤＮＡ結合物質／ＤＳＮ ＤＮＡタンパク質複合体。

本発明により調製された１本鎖ＤＮＡに関するゲル電気泳動分析の結果を示す。本発明により調製され、そして図５で示される環状１本鎖ＤＮＡサンプルをＥｘｏ Ｉ処理に供して調製物中に存在する直鎖状１本鎖ＤＮＡを除去した。サンプルをゲル電気泳動に適用し、そしてＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色により可視化した。レーン１：ラムダＳｔｙ Ｉサイズマーカー、レーン２：処理の前のｐＧ２−１／ＧｅｎｅＩＩ／ＥｘｏＩＩＩ／１本鎖ＤＮＡ結合物質／ＤＳＮ／プロテイナーゼＫプラスＥｘｏ Ｉ。

Claims (37)

1. １本鎖ＤＮＡと、部分的２本鎖ＤＮＡ、完全２本鎖ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとの混合物から１本鎖ＤＮＡを精製するための方法であって、
   １本鎖ＤＮＡ分子に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質を、１本鎖ＤＮＡを保護するために１本鎖ＤＮＡ分子に付着させるステップと、
   ２本鎖ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ−ＲＮＡ分子を特異的に切断するが、１本鎖ＤＮＡを切断せずに消化生成物を生成する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより２本鎖ＤＮＡ分子を消化するステップと、
   保護された１本鎖ＤＮＡ分子を消化生成物から分離するステップと
   を含む方法。
2. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡ分子が有し得る２次構造を妨害する請求項１に記載の方法。
3. １本鎖ＤＮＡが、保護された１本鎖ＤＮＡ分子から実質的に分離される請求項１に記載の方法。
4. １本鎖ＤＮＡ結合物質および２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを組み合わせて使用して、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む複数の核酸中における、１本のＲＮＡ鎖と１本のＤＮＡ鎖から成るハイブリッド分子からＤＮＡ鎖を除去する請求項１に記載の方法。
5. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、タンパク質である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項５に記載の方法。
7. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれらのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
8. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、カニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（二本鎖特異的）ヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 環状１本鎖および２本鎖ＤＮＡの混合物、または環状２本鎖ＤＮＡから環状１本鎖ＤＮＡを調製するための方法であって、
   ニッキング活性を有する酵素により環状２本鎖ＤＮＡを切断して環状２本鎖ＤＮＡを構成する２本のＤＮＡ鎖のうちの１本にニックを導入するステップと、
   ニッキング酵素により切断された１本の鎖をエクソヌクレアーゼで消化して環状１本鎖ＤＮＡ分子を生成するステップと、
   １本鎖ＤＮＡ分子に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質を、１本鎖ＤＮＡ分子を保護するために１本鎖ＤＮＡ分子に付着させるステップと、
   ２本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより残存する２本鎖ＤＮＡ分子を消化するステップと、
   エクソヌクレアーゼにより環状１本鎖ＤＮＡ分子から直鎖状１本鎖ＤＮＡを除去するステップと
   を含む方法。
10. １本鎖ＤＮＡ結合物質と２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを組み合わせて使用して、直鎖状または環状１本鎖ＤＮＡの調製物から２本鎖ＤＮＡを除去する請求項９に記載の方法。
11. １本鎖ＤＮＡ結合物質と２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを組み合わせて使用して、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む複数の核酸中における１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖から成るハイブリッド分子からＤＮＡ鎖を除去する請求項９に記載の方法。
12. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、タンパク質である請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
13. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項１２に記載の方法。
14. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれらのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
15. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、カニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項９から１４のいずれかに記載の方法。
16. ２本鎖および１本鎖ＤＮＡ分子の混合物から２本鎖ＤＮＡ分子を除去するための方法であって、
    １本鎖ＤＮＡ分子に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質を混合物に添加するステップと、
    ２本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを混合物に添加するステップと
    を含む方法。
17. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、タンパク質である請求項１６に記載の方法。
18. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項１７に記載の方法。
19. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれらのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項１６に記載の方法。
20. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、カニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項１６から１９のいずれかに記載の方法。
21. 特定の核酸配列を有しかつテスターに属する核酸分子を除去するための方法であって、
    特定の核酸配列を有しかつテスターに属する核酸分子にハイブリダイズすることができるドライバーオリゴヌクレオチド分子を調製するステップと、
    テスターを含有するサンプルに、特定の核酸配列を有する核酸分子の量と比較して過剰量のドライバーオリゴヌクレオチド分子を添加するステップと、
    ドライバーオリゴヌクレオチド分子と特定の核酸配列を有する核酸分子との間で形成される２本鎖分子を消化するために、サンプルに２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを添加するステップと
    を含む方法。
22. その後、サンプルを、
    サンプルから２本鎖特異的エンドヌクレアーゼを除去するステップと
    テスターに属しかつサンプル中に残留する核酸分子を増幅するステップと
    に供する請求項２１に記載の方法。
23. １本鎖ＤＮＡ結合物質を添加し、一方２本鎖特異的エンドヌクレアーゼにより消化する請求項２１または２２に記載の方法。
24. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、タンパク質である請求項２１または２２に記載の方法。
25. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項２４に記載の方法。
26. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項２１に記載の方法。
27. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、カニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項２１から２６のいずれかに記載の方法。
28. １本鎖ＤＮＡと、部分的２本鎖ＤＮＡ、完全２本鎖ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとの混合物から１本鎖ＤＮＡを精製するためのキットであって、
    １本鎖ＤＮＡ分子を保護するために１本鎖ＤＮＡ分子に付着した１本鎖ＤＮＡ分子に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質と、
    ２本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断しかつ１本鎖ＤＮＡを切断せずに消化生成物を生成する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと
    を含むキット。
29. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、タンパク質である請求項２８に記載のキット。
30. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が、１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項２８に記載のキット。
31. １本鎖ＤＮＡ結合物質が、大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれらのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項２８に記載のキット。
32. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼがカニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項２８から３１のいずれかに記載のキット。
33. 環状１本鎖および２本鎖ＤＮＡの混合物または環状２本鎖ＤＮＡから環状１本鎖ＤＮＡを調製するためのキットであって、
    環状２本鎖ＤＮＡを構成する２本のＤＮＡ鎖のうちの１本にニックを導入するニッキング活性を有する酵素と、
    ニックの入った鎖を消化して環状１本鎖ＤＮＡ分子を生成するエクソヌクレアーゼと、
    １本鎖ＤＮＡ分子を保護するために１本鎖ＤＮＡ分子に付着した１本鎖ＤＮＡ分子に結合する１本鎖ＤＮＡ結合物質と、
    ２本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断しかつ１本鎖ＤＮＡを切断せずに消化生成物を生成する２本鎖特異的エンドヌクレアーゼと
    を含むキット。
34. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質がタンパク質である請求項３３に記載のキット。
35. １本鎖特異的ＤＮＡ結合物質が１本鎖ＤＮＡに対する抗体である請求項３４に記載のキット。
36. １本鎖ＤＮＡ結合物質が大腸菌から得ることができるＳＳＢ、ファージＴ４ Ｇｅｎｅ ３２の生成物、アデノウイルスＤＢＰ、１本鎖ＤＮＡ分子に対する抗体、ウシ胸腺ＵＰ１、またはそれのいずれかの混合物からなる群から選択されるタンパク質である請求項３３に記載のキット。
37. ２本鎖特異的エンドヌクレアーゼがカニ肝膵臓から得ることができるＤｕｐｌｅｘ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃヌクレアーゼまたは２本鎖ＤＮＡ分子内の４塩基の構成ヌクレオチドを含む認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである４塩基対カッターの混合物である請求項３３から３６のいずれかに記載のキット。

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