JP2005069902A - 前処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】手動で行われている誘導体化法等の前処理を，自動化することで多試料を再現性良く処理可能とする。
【解決手段】遠心分離機を装置内の略中心部に設置し，前記遠心分離機には傾斜機構を有する複数のホルダユニットと，前記ホルダユニットは遠心力に応じて傾斜し，かつ加振機構及び温度調節機構等を有し，前記遠心分離機の周辺にそれぞれの処理機能「１）前記ホルダユニットにセットされた容器ホルダ内の容器に溶媒等を注入・排出する注入・排出機能，２）前記容器ホルダの搬送機能」を有するロボットが配置され，更に周辺にそれぞれ加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットで構成した前処理装置。
【選択図】図４

Description

本発明は，タンパク質レベルで病態を解明する網羅的なプロテオミクスに利用可能な前処理装置に関する。

ヒトゲノム配列の決定により，癌を代表とする様々なヒト疾患の原因遺伝子群が解明され，これらに対する合理的な治療法や予防法の開発が可能となることが期待されている。しかし，ゲノム情報からは直ちに治療や，予防に結びつくものではないことから，ある疾患に対する合理的な治療や予防法を開発するためには，詳細な疾患発症メカニズムと，治療や予防を施そうとする対象の生物学的な個性と，その時点での病態とその進行状況を正確に把握して，最も適した標的や方法論が模索されている。

この解決法として，その疾患の原因遺伝子だけではなくて，その遺伝子が作るタンパク質と，それに関連して細胞内で時間と共に変動しているタンパク質群が織りなす細胞内クロストークや，機能発現状態を翻訳後修飾情報を含めて詳細に解析し，系統的に分析する疾患のプロテオーム，即ちゲノム研究に対応したタンパク質レベルでの組織細胞の網羅的研究がクローズアップされている。

癌の研究においてはここ１８年ほど，発癌に関連する遺伝子の発見に集中していた。 その結果，ある組織のある特定の細胞内でのみ特に重要であり，その欠失や変異でその機能が破綻することが，特定の組織・細胞の癌化の原因となる，いわゆるゲートキーパー（門番）と呼ばれる腫瘍関連遺伝子群や細胞周期チェックポイント調節分子群が現在注目されている。これらの遺伝子が作るタンパク質は，一般的にリン酸化やプロテオリシスのような翻訳後修飾によって，さらには細胞内で様々な腫瘍関連タンパク質同士や生理活性タンパク質群，核酸群らとのシークエンシャルな結合・相互作用等の複雑なクロストークネットワークによって機能制御されている。

従って，今後のポストゲノム時代における癌の研究は，このような生理的な細胞現象を，一つ一つの分子を別々に調べて分子の側から説明するのではなく，全ての細胞内発現タンパク質を網羅的に時間軸を追って解析し，如何なる細胞内タンパク質のどの様な変化がおきて正常の細胞活動が破綻し，癌を形成させて行くのか，という網羅的な情報を得ること，そしてその情報を癌の臨床医学に応用すること，即ちこれらを全て含むプロテオーム解析とその実用化を目指した方法論の開発が，今後の癌研究および癌治療・予防・診断に最も重要な課題となることが予想される。

現在のプロテオーム解析は，二次元電気泳動を中心とした，タンパク質のディファレンシャルディスプレイおよび手動あるいはロボットによるオフラインのタンパク質断片化後のプロテインシークエンス，または質量分析による同定といった過程で行われている。しかし，一般に癌に関連する生理活性分子は細胞内量が非常に低いものが多く，それらを同定するには非常に高い検出感度と，アミノ酸配列決定精度，及び分解能が要求される。

最近，異なるイオン源装置(MOLDIやESI)が簡単に交換可能で，検出部もQuadropoleとTOFがハイブリッドになっているような工夫をこらした質量分析計も市場に現れ，その感度と分解能を競っている。また，近年プロテインチップを中心とした，機能タンパク質の高感度検出方が開発され，これがプロテオーム解析の一環として構造解析へと進展している。

しかしながら，未だ高感度，且つ高精度の構造解析へとはつながっていない。このような状況をふまえ，高感度，且つ高精度の構造解析が可能な誘導体化法（タグ法）を用い，タンパク質をハイスループットに，迅速且つ網羅的に，確実な構造解析とタンパク質の同定が可能な高感度質量分析装置の前処理装置が望まれている。現在前記した前処理は，主に手動で実施されているため多量な処理には限界があり，網羅的に解析するには前処理装置の自動化が必要となる。

前処理装置の自動化の実現により，世界的視野においてプロテオーム研究を推進できるシステムを社会に提供出来，格段のタンパク質の構造解析の進展により，バイオインフォマティクスによる，タンパク質の相互作用・立体構造・機能等データバンクの構築に寄与し，ひいては癌研究，病態診断，臨床医学への応用，創薬分野への進展等が期待される。
特開平１１−２８１５４４公報

解決しようとする問題点は，タンパク質レベルで病態を解明する網羅的なプロテオーム解析手法の１つである誘導体化法（Isotope Coded Affinity Tag:ICAT）の前処理（概要を図１に示す）は，１検体あたり，３０〜４８時間費やしており，これらは現在手作業で処理されている。したがって，ハイスループットで網羅的解析を行うには，これらの前処理の自動化が必須となる。

本発明は，前述のように網羅的解析のため数多くの処理を行う事と，処理工程の中に遠心分離工程が数多使用されるので，遠心分離機構を中心に処理を行う構成を特徴とする。

現在プロテオーム解析には二次元電気泳動装置，質量分析装置，表面プラズモン共鳴測定装置等多種類の分析装置が用いられているが，多量のプロテオーム解析には精度・スループット等の点で十分なものではない。また，いっそうの高精度化，迅速化，自動化の要求が多い。本発明の前処理装置は，高感度でハイスループットな網羅的解析を行うことができる微量多連自動前処理装置であり，プロテオームの網羅的解析の研究成果を出すためには，このような自動前処理装置を使用し，大量のサンプルを網羅的に解析することハイスループット・スクリーニングが可能となり，バイオインフォマティクスによりタンパク質のデータベース構築の加速化にも寄与し，コンピュータ上で病気の原因物質に作用する薬のデザインをも可能とし，癌研究，診断の高速化のみならずゲノム創薬市場ヘも飛躍的に貢献する。

また，本発明の前処理装置では，現在，手動で行われている誘導体化法の前処理を，この本装置用いることで，短時間で多試料を再現性良く処理可能となる。現状でボトルネックとなっている再現性とスループットに問題がある二次元電気泳動を用いない質量分析までのオンライン化された確実な構造解析とタンパク質同定システムが確立するものと期待され市場のニーズに適応する。

本発明は，前述のように網羅的解析のため数多くの処理を行う事と，処理工程の中に遠心分離工程が数多使用されるので，遠心分離機構を中心に処理を行う構成としている。したがって，遠心分離機を装置内の略中心部に設置し，前記遠心分離機には傾斜機構を有する複数のホルダユニットと，前記ホルダユニットは遠心力に応じて傾斜し，かつ加振機構及び温度調節機構等を有し，前記遠心分離機の周辺にそれぞれの処理機能「１）前記ホルダユニットにセットされた容器ホルダ内の容器に溶媒等を注入・排出する注入・排出機能，２）前記容器ホルダの搬送機能」を有するロボットが配置され，更に周辺にそれぞれ加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットで構成した。また，複数のホルダユニットは，低速回転から高速回転時においても容器ホルダ内の試料が容器内から飛び出さないように，遠心分離機の回転機構の回転数に応じた角度で傾斜する傾斜機構を有している。更に，注入・排出機能は，容器ホルダ内の容器内で試料が遠心分離された上澄を排出時に，前記上澄の濁度又は伝導度を検知し，濁度又は伝導度の値が変化した時点を，上澄排出の終点とすることで自動的に上澄を分離することが出来る。

図２〜図１２は，誘導体化法に使用可能な本発明の前処理装置の一実施例を示した説明図である。図中１は遠心分離機を，２（２Ａ，２Ｂ）及び３（３Ａ，３Ｂ）はホルダユニットを，４及び５はロボットを，６〜８は加振機構及び温度調節機構等を有した各種ユニットを，９はホモジナイザを，１０はタンパク定量ユニットを，１１はロボット４，５が移動する軌跡をそれぞれ示す。

図２に示す実施例において，６は温度調節機の設定温度を３７℃に設定した第一のユニット（インキュベータ）を，７は加振機構に超音波振動を用い，温度調節は−２０℃に設定した第二のユニットを，８は加振・温度調節・注入・排出機能を有した第三のユニットをそれぞれ示し，本前処理装置の原点位置の状態を示している。

図３において１２は容器ホルダを示し，容器１３が図示したようにセットされ第三のユニット８にセットされている状態を示す。なお，図３以降図２と同一の機能を有するものには同一の番号を付している。加振・温度調節・注入・排出機能を有した第三のユニット８にセットされた容器ホルダ１２内の容器１３内の試料は，ホモジナイザ９で攪拌されるその後，タンパク定量ユニット１０で，それぞれの試料ホルダのタンパク量が測定される。図３の加振・温度調節・注入・排出機能を有した第三のユニット８とホモジナイザ９及びタンパク定量ユニット１０では，加振・温度調節・注入・排出機能を有した第三のユニット８にセットされた複数の試料ホルダ１２内の試料のタンパク量は同量になるように調整される。

図４〜図６は脱塩処理の一例を示した図で遠心分離機１のホルダユニット２Ａ及び２Ｂに，容器ホルダ１２が第三のユニット８からロボット４及び５で搬送されホルダユニット２Ａ及び２Ｂにセットされた状態を示している。図４では主に遠心分離と遠心分離された試料の上澄除去工程を示す。遠心分離工程では，ホルダユニット２にセットされた容器ホルダ１２内の容器１３は自動化処理を容易に行うため蓋を使用しないために，遠心分離を行う場合にホルダユニット２を遠心分離機の回転数に応じて傾斜させる機構を有している。また，回転開始及び停止時には容器１３内の試料がこぼれないようにスロースタートとスローストップの制御を行う。

更に，上澄除去工程ではロボット４及び５に設置された注入・排出機能で容器１３から上澄を排出する際に上澄の濁度又は伝導度等を測定し，上澄と遠心分離された試料から分離することが出来る。なお，上澄分離に関しての詳細は後述する。また，注入・排出においてはディスポチップを使用するが，これらは第三のユニット８に格納されている。

図５は図４で遠心分離と遠心分離された試料の上澄除去を行った後，超純水を容器１３に注入した後，第二のユニット７（加振に超音波振動を用い，温度調節は−２０℃に設定）に容器ホルダ１２をセットし，周囲温度が−２０℃の環境で一定時間毎に超音波振動を容器ホルダ１２に与え容器１３を振動させる。なお，本工程の時間は凡そ一試料あたり３０分程度の処理時間を要す。

図６は図５で処理した試料を再度遠心分離する工程を示し，容器ホルダ１２は第二のユニット７からロボット４及び５で搬送されホルダユニット２Ａ及び２Ｂにセットされる。ホルダユニット２Ａ及び２Ｂにセットされた容器１３は図４で説明したように遠心分離と遠心分離された試料の上澄除去が行われる。

更に上澄除去された容器１３内の試料には，それぞれ更に試薬の注入・排出・加振（攪拌）・インキュベートなど処理が行われる。これらの処理はホルダユニット２Ａ及び２Ｂにセットされた容器ホルダ１２内で，注入・排出機能を有するロボット４及び５で行われる。なお，本工程で行われる短時間のインキュベート処理は，後述する酵素消化の工程と同様に行われる。

図７は酵素消化の工程において，容器１３内の試料を長時間インキュベートする状態を示している。温度調節機の設定温度を３７℃に設定して第一のユニット（インキュベータ）６に容器ホルダ１２をセットすることで，容器１３内の試料をインキュベート出来る。本工程では凡そ１２〜１６時間程度要する。

図８は，図７で示した酵素消化の工程（温度調節機の設定温度を３７℃に設定して第一のユニット（インキュベータ）６に容器ホルダ１２をセット）と，図４で示した遠心分離と遠心分離された試料の上澄除去工程の処理を並行して実施している一例を示している。図中，図４においてホルダユニット２Ａ及び２Ｂにセットされていた容器ホルダ１２は第一のユニット（インキュベータ）６にセットされた状態を示し，更に遠心分離機１は図４に示した状態から９０度右に回転し，ロボット４及び５でホルダユニット３Ａ及び３Ｂに新たな容器ホルダ１２がセットされた状態を示している。

以上のように，容器ホルダ１２は第一のユニット６とホルダユニット３Ａ及び３Ｂに，それぞれセットされるために異なる処理を並行して実施できるために多数の試料を処理可能である。

図９は遠心分離機１に設置されたホルダユニット２の一実施例を示したものである。本ホルダユニットは遠心分離機の回転機構の回転数に応じた角度で傾斜する傾斜機構を有している。図中１４，１５及び１６はホルダユニット２の回転機構を構成し，本実施例では１４はホルダユニット２に取り付けられた歯車を，１５は歯車１４の駆動用歯車を，１６は歯車１４の中心軸を示している。したがって，駆動用歯車１５が回転するとホルダユニット２は歯車１４が中心軸１６を中心にして回転するために，ホルダユニット２は傾斜する。この結果ホルダユニット２セットされた容器ホルダ１２及び容器１３も同時に傾斜する。したがって，駆動用歯車１５が遠心分離機の回転機構の回転数に応じて，回転する様に制御することによりホルダユニット２を任意に傾斜させることが可能である。

図中１７はホルダユニット２の温調ユニットを示し，必要に応じて容器１３の温度調節を行うことが出来る。

図１０は遠心分離機１で遠心分離された試料の上澄を除去する一例を示した説明図で，ａ）は容器１３内に上澄１８と遠心分離された試料１９をそれぞれ示している。１）から４）は上澄が除去されていく状況を示している。ｂ）は分注用ノズル２０とディスポチップ２１で容器１３から上澄を吸引し廃液容器２４に廃棄する状態を示している。
２２は漏斗を２３は濁度計を示し，上澄が廃液容器に流れ落ちる際に上澄の汚れ具合を測定する。

図１０ｃ）は濁度計２３で上澄の濁度を測定した結果で，図の下部に記した数字は図１０ａ）記した数字と対応している。図において１）〜３）の濁度は殆ど変化していないが，４）では濁度が大きくなっていることが解る。したがって，濁度が大きくなった時点で，上澄が除去を停止することで，自動的に容器内から上澄を除去することが可能となる。なお，本実施例では検知手段として濁度計を使用した一例を示したが，伝導度等の変化を観察することも可能である。

図１１は加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットにセットされた容器ホルダ内の容器に薄膜を介して蓋をする機構の説明図である。図中６，７は加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットを，１２は容器ホルダを１３は容器をそれぞれ示している。本実施例では効率がよい自動化のために容器１３にはそれぞれ個別の蓋は使用しないため，例えば，ユニット６のインキュベータでは長時間の処理を行うために，処理中は容器ホルダ内の容器全体に蓋をすることで，試料の蒸発等を防ぐことが出来る。

なお，蓋を繰り返し使用するとお互いにコンタミが生じるために，図１１ ｂ）の２６で示す様に薄膜を容器ホルダの上に被せ，ｃ）の２８で示すように蓋をすることで，コンタミの問題が無く容器１３にそれぞれ蓋をすることが可能となる。また，薄膜２６はディスポラップとして使用できるために，２７に示すようにロール状に保管しておくと使い勝手が向上する。

本発明により，大量のサンプルを網羅的に解析することが可能となり，バイオインフォマティクスによりコンピュータ上で病気の原因物質に作用する薬のデザインを可能とし，ゲノム創薬市場ヘ飛躍的に貢献する。

誘導体化法のプロトコルを示す。 遠心分離機を用いた前処理装置の説明図である。 遠心分離機を用いた前処理装置の説明図である。 脱塩処理の一例を示した説明図である。 脱塩処理の一例を示した説明図である。 脱塩処理の一例を示した説明図である。 前処理装置の説明図である。 前処理装置の説明図である。 前処理装置の説明図である。 上澄除去の一実施例の説明図である。 第一のユニット（インキュベータ）での一実施例の説明図である。

符号の説明

１ 遠心分離機
２，３ ホルダユニット
４，５ ロボット
６ 第一のユニット（インキュベータ）
７ 第二のユニット（加振・温調）
８ 第三のユニット（加振・温調・注入・排出）
９ ホモジナイザ
１０ タンパク定量ユニット
１１ ロボット移動軌跡
１２ 容器ホルダ
１３ 容器
１４ 歯車
１５ 歯車
１６ 歯車の中心軸
１７ 温調ユニット
１８ 上澄
１９ 遠心分離された試料
２０ 分注用ノズル
２１ ディスポチップ
２２ 廃液漏斗
２３ 濁度計
２４ 廃液容器
２５ しきい値
２６ 薄膜
２７ ロール状の薄膜
２８ 蓋

Claims (4)

1. 遠心分離機を装置内の略中心部に設置し，前記遠心分離機には傾斜機構を有する複数のホルダユニットと，前記ホルダユニットは遠心力に応じて傾斜し，かつ加振機構及び温度調節機構等を有し，前記遠心分離機の周辺にそれぞれの処理機能「１）前記ホルダユニットにセットされた容器ホルダ内の容器に溶媒等を注入・排出する注入・排出機能，２）前記容器ホルダの搬送機能」を有するロボットが配置され，更に周辺にそれぞれ加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットで構成した前処理装置。
2. 前記複数のホルダユニットは，低速回転から高速回転時においても容器ホルダ内の試料が容器内から飛び出さないように，遠心分離機の回転機構の回転数に応じた角度で傾斜する傾斜機構を有したことを特徴とする請求項１に記載の前処理装置。
3. 前記注入・排出機能は，容器ホルダ内の容器内で試料が遠心分離された上澄の排出時に，前記上澄の濁度又は伝導度を検知し，濁度又は伝導度の値が変化した時点を，上澄排出の終点とすることで自動的に上澄を分離することが可能な請求項１に記載の前処理装置。
4. 前記加振機能及び温度調節機能等を有した複数のユニットにおいて，前記ユニットにセットされた容器ホルダ内の容器に薄膜を介して蓋をする機構を有することを特徴とする請求項１に記載の前処理装置。

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