JP2004534214A - 微生物毒素について流れ媒質をアッセイする方法 - Google Patents

Abstract

分離要素を含む流体容器内での全血インキュベーション及び媒介物質をアッセイすることによる微生物毒素について流動媒質の試験方法。

Description

【技術分野】
【０００１】
生物の健康は、接する生存環境の空気の質に大きく左右される。生活空間や仕事部屋、工場、公共の建物や輸送機関等の室内空気の質は、空調がない部屋でも同様であるが、特に空調されている部屋では主に、温度、湿度、塵の内容といった構成成分、および空気中の免疫活性化汚染物質により決定される。ここでは、例えばカビ及び細菌といった微生物のような環境病原菌、グラム陰性細菌のエンドトキシンまたはグラム陽性細菌の同等物・類似物ないしはそれら病原菌の毒素及び腐敗産物が中心的な役割を果たす。このような内部空気の汚染物は、体調不良、集中力低下、頭痛、呼吸困難に至る粘膜炎症および空気乾燥感、胸部圧迫感、ならびにアレルギー及び感染症に対する感受性の上昇を伴う「シックハウス症候群」の原因となる可能性がある。空調室内で働く多くのヒトがこれら症状に悩まされている。
【０００２】
居所では、建材内または上にある持続的な湿気が、細菌及びカビによる微生物汚染の主原因となっている。エネルギー節約を目的として建物の気密性をより高める傾向があることと、有機廃棄物を収集することにより、この問題はより深刻さを増している。将来、生活および労働空間において、微生物汚染は健康問題の原因として更に増加することが予想される。生活空間、労働空間および公共施設における空調設備を用いた強制換気は、ここに微生物病原菌がコロニーを形成してその毒素を広めることによって、更にその危険性を高めている。労働空間では、汚染された仕事環境が、病院、鉄鋼業のような工業分野の会社、印刷所、ペットショップ、動物舎、動物園、養鶏場又はゴミ処理場などでも見出されている。
【０００３】
水、水溶液、生物学的液体といった液体だけでなく、工業的液体についても、とりわけ人体と接触するようになる又は接触しているあらゆる液体およびそれらの蒸気は発熱物質のような細胞活性化成分で汚染される可能性がある。そして、その結果製造された製品の一部もそれらにより汚染されることがある。そのようなものとしては、例えば飲料水、輸液または注射液、血清、透析液、例えば医療材を洗浄するための消毒剤、例えば腹腔洗浄、手術中の臓器の空洞部分の洗浄、気管支洗浄液を得るための肺洗浄といった商業用途および医療用途の洗浄液、加湿を目的とした空調システム添加液、または例えば製鉄業での加工中の高温材を冷却するための混合液がある。現代技術の中で自分自身を維持する生命保護システムの果たす役割は増加しつつあり、例としては宇宙旅行又は潜水技術に於ける呼吸に適した空気のような気体、及び水のような液体がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
エンドトキシンを負荷し、その後、乾燥したフィルタ材料またはエアフィルタの汚染を評価することが試みられているが、その再現性は信頼できるほどには証明されていない。液体の場合、極めて小さな毒素汚染物が極めて低濃度で存在することが多いこと、及び妨害物質が存在することの問題もある。汚染レベルの検出、特性分析及び定量化に関する方法、ならびに評価基準は全体として満足できないことが分かっており、その改良が急務である。単純且つ明瞭で再現性のある結果を提供する、信頼できるアッセイ法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この問題は、本発明に従い、気体および液体については、分離法を用いてそれらの微生物毒素内容量を試験し、適用可能な場合には定量的にアッセイする方法によって回避される。本発明に係る分離法では、フロースルー容器内に含まれる分離要素を用いて気体又は液体から微生物毒素を分離し、この分離要素を有するフロースルー容器を免疫反応性細胞とインキュベーションする為のインキュベーション容器として用い、そして全血検出方法と共に用いる場合には、試験する気体又は液体が流入してから、それ自体既知である方法でインキュベーションした後に、毒素が存在する場合にはインキュベーション期間中に形成されるであろう媒介物質についてアッセイを行う。
【０００６】
本発明により規定される気体はあらゆるタイプのガス状の流動性媒質である。これら気体の具体例は、例えば上記に参照される生活空間および労働空間の空気であるが、塵及び霧といったエアロゾルも含む。本発明の方法に従い、試験できる気体及び気体混合物のその他の例は、麻酔ガス、保護ガスまたは反応に関し不活性である気体、及び産業、バイオテクノロジー、製薬そして食品関連の工程で、例えば発酵、細胞培養等に用いられる保護ガス混合体、二酸化炭素、窒素ならびにその他ガスとこれら気体との混合物などである。一般には、流動媒質、特に低粘度および中粘度の流動媒質、ニュートン液体ならびにゾルは、本発明により規定される液体の例に入る。特に好ましいのは、水（例えば飲料水処理システムに供給される水あるいは飲料水処理システムで処理された水）、水溶液、乳状液、分散液ならびに懸濁液である。例えば尿、血液、血清または血漿のような血液の液体成分、および代替血液といった生物学的液体は、試験可能な液体に含まれる。いちいち繰り返すことは避けるが、このことに関しては、上述の液体、特に食品関連、医学、および技術の分野に対しても応用できる。
【０００７】
例えばエンドトキシン、発熱物質、一般的な微生物汚染、生物学的兵器を含む免疫活性化又は細胞活性化物質及び成分（とりわけ人工の戦争兵器、ならびに上記のタイプの物質を形成する又はそれらを放出できる物質及び成分）並びに粒子が、本発明で言うところの微生物毒素の中に入る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
試験体中にいくらかの毒素が含まれているか又は少なくとも検出に十分である量含まれている場合には、各試験媒質、気体、または液体から微生物毒素を吸着して保持し、それによって分離できる。その一方で、気体および液体が実質的に通過できるような不活性物質および装置は、分離要素として使用できる。例えば収着（特には吸着であるが吸収でもよい）される気体および液体の状態は、凝集状態であることが好ましいが、必ずしも室温で凝集状態にある必要はない。その代わり、分離中には凝集状態になる。毒素との反応及び／または機械的手段、例えば、スクリーン濾過又は分離要素表面への析出によって、収着（特に吸着または吸収）により、その分離要素に接触する流動媒質から微生物毒素を分離できる分離要素が好適である。この分離を、例えば気体および液体から毒素を分離するということに関して、定量的な様式で行うこともできるが、特には各試験媒質の毒素汚染の定量的測定に関して行うことができる。
【０００９】
本発明は更に定量的検出のために、必要な毒素を定量的に分離することも包含する。非常に好ましい分離要素はフィルタであるが、通常の概念でのフィルタ（例えばセルロースまたはセルロースエステル、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカーボネート類又はポリテトラフルオロエチレン製の繊維を含むフィルタ）のような各種素材でできた濾紙、フィルタパッド又はフィルタフリースも好ましい。更に無機フィルタ材料、例えばフィルタ材料としてのガラス繊維、ならびにガラスおよび陶器製のフリットも、有機フィルタ材料をベースとする分離要素に追加、またはその代替物として用いることができる。更に極性、非極性、有機、無機、例えばイオン交換樹脂および珪藻土のような多孔性または微孔性の粒体、パーライト、活性炭、メラミン樹脂、タンパク質ならびに／あるいはポリアミドもまた分離要素として好適であり、そして担体上に配置される。好ましくは、分離要素は特にイオン交換樹脂のような多孔性の粒体、あるいは毒素反応性官能基または電荷を持つことである。このとき、試験媒質および毒素のタイプと予想量に特別に合わせた選択をすることができる。空気のような気体を試験媒質として用いる場合は、例えば濾紙またはフィルタパッドについてはその流量（濾過速度）の根拠が特に明らかにされており、それを分離要素として使用する。一方、毒素反応性官能基を提示しているイオン交換性の好適な孔サイズと層厚とを持つ粒子又は毒素反応性官能基を持つ上記のその他タイプの分離要素については、血液又は血液成分のような液性試験媒質から毒素を分離できる分離要素として確立されている。特別な例では分子篩も利用できる。一般のタンパク質、発熱物質、酵素およびウイルス分離用、および無菌生成物製造用のフィルタと共に用いる場合には精密濾過も好適であり、あるいは例えば孔サイズが０．２μｍから２０μｍであるメンブレンフィルタを用いて限外濾過する場合も好適である。圧力濾過を用いれば、濾過速度と分離効率を希望する割合に設定することができる。典型的なフィルタは、試験する媒質の粘度および予想される毒素のタイプと量に応じて、例えば１μｍから１０μｍ、特には３μｍから８μｍの孔サイズを有する。液体の場合、より大きな孔を持つフィルタもある程度利用されてきた。つまり、いずれの場合も、予想される毒素の粒子サイズも考慮に入れなければならないということである。
【００１０】
分離要素はフロースルー容器内に取り外し可能又は取り外し不可能な形で組み込まれる。フロースルー容器に取り外し可能な形で接続される分離要素の場合、フレーム内での不活性分離要素、例えばポリスチレン製分離要素の配置は自明である。
【００１１】
このタイプの挿入体の利用は、挿入体が交換できることによりフロースルー容器を繰り返し再使用できるという利点を有している。即ち、例えばＨＩＮ、ＤＩＮまたはＩＳＯ標準による空気収集装置を用いることができる。本発明のイオン交換樹脂の形状をした毒素反応性官能基を持つ取り外し可能な粒体の装置は、インキュベーション容器内でインキュベーションするために、フロースルー装置から取り外すことができる。そして、可能な場合には、フィルタケーキの結合能が消失した場合にこれを再生するこができるため、血液または血液成分のような液体媒質を扱う場合に特に好都合である。フロースルー容器自体は通常、楕円形、四角、円形、多角形の断面又はその他必要に応じて任意の断面を持つパイプ、漏斗または箱の形をしたプラスチック又は金属といった不活性材料からできている。また、分離要素領域の断面表面積は、とりわけ試験媒質の粘度、予想処理量、事前に設定される処理速度（濾過速度）、予想される毒素のタイプと考え得る濃度、または主流かもしくは副流か等により決まる。気流または液流の濾過速度および容積は、それらをポンピングまたは吸引する際の圧力濾過の原理に従って事前に決定できる。そして、液体の場合には、例えば分離要素の層またはフィルタケーキの断面積と厚みに依存する、重力を利用するフロースルー容器による圧力濾過の原理に従って事前に決定できる。従って、毒素の濃度が流動媒質における検出限界より低いか又は毒素が極端に低濃度である場合には、濃縮することで、毒素の検出が可能となるか、又は検出の信頼度が確保される。試験媒質（例えば血液又は血清中の微生物毒素）の濃度は、毒素を定量的に分離し（例えば微量濾過又は限外濾過により、あるいは毒素反応性官能基の付いた分離要素により分離し）、流量を測定することで決定できる。この方法は、毎分空気６リットル〜１８リットルである成人の平均呼吸量をベースにして、ヒトへの実際の汚染負荷量の決定にも利用できる。ここで言うところのフロースルー容器とは、例えば分離要素で隔てられた２つの部屋を持つ２室型収集タンクである。これらは特に、一方の部屋に負荷を加え、例えば重力（遠心力）を流れの補助として利用して液体を試験するのに用いることができる。従って、この方法の主題は、少なくとも２カ所の開口部（即ち試験対象となる流動媒質を採り入れる供給開口部及び排出開口）、並びに微生物毒素を分離するための付属の取り外し可能、又は取り外し不可能な分離要素を持つフロースルー容器である。ただし、分離要素は、供給開口部と排出開口部との間の流域内に配置される。
【００１２】
好ましくは、分離要素はフィルタケーキの形状を採り、そして流れの主方向に対して実質的に垂直であるように配置され、及び／又は、例えば分離要素が配置される部分のフロースルー容器の断面全体を分離要素が実質覆うように伸びて、分離要素を通過する強制流動が得られるように配置される。好ましいデザインでは、フロースルー容器は各開口部域（供給開口部、排出開口部）に、閉鎖性を確保するための、毒素に対し非透過性である密封要素（例えばキャップ又は同様のカバーロック）を有する。必要な場合には密封要素を備え、そして開口部に適合しているカバーを用いて開口部を密封する。
【００１３】
特段の利点は、免疫反応細胞とのインキュベーション、又は例えば血清または血漿を試験液として用いて毒素反応性粒体を分離要素として用いたときに、全血検出法によるインキュベーションを流動媒質由来の微生物毒素の担体となる分離要素を含むフロースルー容器の中で実施できることであり、そして更に、これがフロースルー装置からこの分離要素を取り出しして別のインキュベーション容器中でこの分離要素を全血インキュベーションすることを不可能にしないことである。一方、第１に記載の方法は特に単純であり、その後の研究のために分離要素を取り出したり、又は移し替えたり移動したりという、取扱いに起因する誤り又はアーチファクトを排除する。インキュベーションを分離操作なしに直ぐに実行できるという事実に加え、更にこの方法は、このタイプのフロースルー容器が簡単な密封、例えばこの目的のために提供されるカバーを用いることで、何らの苦もなしに研究室に送ることができ、免疫反応性の、全血インキュベーション法による微生物毒素を測定できるという利点も併せ持っている。本発明の方法は簡便で信頼性のある、明瞭で再現性のある結果をもたらす。
【００１４】
この文脈に於ける全血検出法またはインキュベーション法は、欧州特許第０ ７４１ ２９４ Ａ２号及び／又は欧州特許第０ ８５１ ２３１ Ａ２号に記載の方法および明示的な参照を通じて、ここでの説明の内容の一部となっている方法を意味していると理解される。
【００１５】
本発明によれば、フロースルー容器の分離要素は、流動媒質を通過させて微生物毒素を決定した後、全血を含む標本と接触させながらインキュベーションする。次に標本を、それ自体は周知である方法、例えばＥＬＩＳＡまたはＥＩＡを用いインキュベーションし、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＡ、プロスタグランジンＥ２等の媒介物質の形成について検査・検出が行われる。
【００１６】
例えば、健康供血体より新たに得、希釈してもよい血液のような動物またはヒトの全血を、工程の中で個々の成分に分離しないで、反応物として用いることができる。従って、白血球は自然の組成物と環境の中に留まっている。同時に、毒素の効力に影響を与えることもある全ての血清成分が存在する。全血はクエン酸のような凝固遅延または抗凝固成分を例えば最終濃度０．３８％含んでおり、あるいはＮａ−ヘパリン又はヘパリン分画においてヘパリンを含んでいる。ただし、ここで理解すべきことは、凝固遅延または抗凝固成分は、インキュベーション反応を妨害も誤らせもしないということである。全血標本の例えば等張液または細胞培養液、例えばＲＰＭＩ１６４０による希釈、または生理食塩水による２０％希釈が好都合である。用心のためにペニシリン又はストレプトマイシンのような抗生物質を加えても反応は妨害されない。インキュベーションは高い温度、好ましくは３５℃から３８℃の範囲で、約２時間から２４時間の間実施される。全血検出を行う場合は、作業は装置および試薬が汚染されない状態で行わなければならない。
【００１７】
方法は高感度であり、供与体から極めて独立的である（数ｐｇ／ｍｌの毒素によりサイトカインのような媒介物質の放出が起こる）。エンドトキシン及びリポタイコ酸のようなグラム陰性およびグラム陽性細菌壁の標本は、陽性コントロールとして利用できる（例えば、発熱物質を含まない生理学的食塩水は陰性コントロールとして利用できる）。
【００１８】
この方法は、一連の利点を有している。すなわち、微生物毒素に反応して媒介物質を形成する体そのものの一次反応を、研究に利用している。毒素と白血球との相互作用に必要と思われる全ての血液成分、例えばＬＰＳ結合タンパク質、殺菌剤透過性亢進タンパク質であるＢＰＩ、可溶性ＣＤ１４、ディフェンシン等が存在している。全血検出またはインキュベーションは、また影響を受けた当事者の全血だけでなく、当事者個人の周囲より得た流動試験媒質、気体または液体を使っても付随的に実施できる。このようにして個別の反応の能力を測定でき、過敏症の患者を特定することができる。
【００１９】
急速冷凍血液又は標準血液投与単位の形に急速冷凍された集合血液は、標準化を目的として一定期間の間、連続試験または比較試験に利用できることが証明されている（欧州特許第０ ９５１ ２３１ Ａ２号）。その中で説明されている方法は、ここでの説明の一部を成している。
【００２０】
本発明の方法を実行するために、作業は例えば８ｍｌの臨床品質の生理食塩水の全血と２ｍｌのヘパリン添加全血（Ｓａｒａｔｅｄｔ社製７．５ｍｌのヘパリン添加モノヴェット（ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｓ）を用い採取した）から調製された健康供血者より得た全血標本を用いて実行されなければならない。全血標本が負荷されたフロースルー容器を、インキュベータの中で、例えば３７℃、５％ＣＯ２で１晩（１８〜２４時間）インキュベーションする。インキュベーションした溶液を次にピペットを使ってよく混合し、滅菌したファルコンチューブに移し、例えば室温で２分間で４０００Ｇの遠心分離にかける。上清は冷所に保存でき、それからＥＬＩＳＡを使ってインターロイキン−１βを測定して光学的（ＯＤ）に定量し、よく用いられる標準的な方法でインターロイキン−１（ＩＬ−１）の量に変換する。未処理のフィルタを装備したフロースルー容器をコントロールとする（図１）。
【実施例１】
【００２１】
ヒツジ小屋または研究室の空気を、直径１２ｍｍのポリカーボネートフィルタを分離要素として含むフロースルー容器内を毎分空気１リットルの割合で１時間引き込み通過させた。そして、未処理フィルタ及び１ｎｇのエンドトキシンを塗布したフィルタとの比較を行った。分離要素の全血インキュベーションを、４００μｌの臨床生理食塩水と健康供血者より得た５０μｌのヘパリン化血を用いて１晩行った。放出されたインターロイキン−１βの量を、組換え体標準物質に用いるＥＬＩＳＡで定量した（図１）。
【実施例２】
【００２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のエンドトキシン１０ｐｇ／ｍｌを加えた生理食塩水を用いて液体を試験した。サンプルを検出限界より低い汚染物濃度まで１：１０の割合で希釈した。孔直径０．２μｍのポリエチレン・スチレンフィルタを備えたポリカーボネート・フロースルー容器を分離に用いた。真空を作り試験溶液を吸ってフィルタを通過させた（濾過容積１００ｍｌ、２５０ｍｌまたは５００ｍｌ）。フィルタ付きフロースルー容器を、４００μｌの生理（臨床）食塩水および８０μｌのヘパリン化血を加えた後、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下でインキュベーションしてから上清中のＩＬ−１βをＥＬＩＳＡで同定した。図２は、低エンドトキシン汚染サンプルが生理食塩水コントロールと同様のシグナルを与えることを示している。未処理フィルタを装備したフロースルー容器そのものはその中を通過するサンプル量に応じて増加する低いシグナル（０ｍｌ）を与える。従って定量可能な量のエンドトキシンが保持され、濃縮された。
【００２３】
本発明の分離要素を含むフロースルーまたは収集容器を図３に例示する。使用に好ましい容器に比べ約５倍〜約１０倍大きく描写されている例示のフロースルー容器１は、実質的に円筒であるケース２と底部の供給開口部と頂部に見ることができる排出開口部との間にある分離要素３、および毒素に対し不透過性の様式で密封するためのカバー４及び５を有する。流動媒質の流れの方向は、円筒軸に対し実質的に平行である。
【００２４】
空気を媒介する毒素（特に微生物毒素）は、上記の例についてのみ重要なのではなく、それらの全ての生活および労働環境を共にする人々にとっても重要であり、この新規試験方法により検出できる。液体についても同様にして微生物毒素による汚染を試験できる。生物兵器もまたこの方法で確認できる。本発明の特段の利点は、種関係、医療関係、広い検出範囲、及び環境の影響を受けた罹病患者の血液を直接試験できる可能性にある。この方法では、測定用のインキュベーションシステムとしても利用可能なフロースルー装置または収集装置を使って、１回の処置で死物質および生物質の両方について完全に記録することが可能である。同様にして液体から細胞活性化物質を分離し、必要に応じて濃縮することもできる。検出反応の感度は、このような汚染物質を濃縮することで有意に上げることができる。更にこのようにして妨害物質を分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る試験の結果を示す図である。
【図２】本発明に係る試験の別の結果を示す図である。
【図３】本発明に係るフロースルー容器の構成を示す図である。

Claims (10)

1. 気体または液体から微生物毒素を分離するためのフロースルー容器の内部にある分離要素を用いることと、分離要素を備えたフロースルー容器を全血インキュベーション処理のためのインキュベーション容器として使用することと、続いて、インキュベーションした標本を、産生された媒介物質についてアッセイすることと、を特徴とする、分離工程を用いた微生物毒素の内容に関する気体および液体の試験方法。
2. 定量的分離を特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 有機繊維または多孔性イオン交換樹脂を含む濾紙またはフィルタフリースを分離要素として用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. セルロース、セルロースエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート及び／またはガラス繊維を含む分離要素を用いることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
5. 毒素反応性反応基を持つ分離要素を用いることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
6. 毒素反応性官能基を持つ分離要素を、血液または血液成分のような生物学的液体を通過させた後にインキュベーション容器内にて全血インキュベーションにかけることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 抗凝血剤を含む全血標本を用いてインキュベーションを実施することを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
8. 空気を気体として、そして水性又は生物学的標本を液体として用いることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
9. 分離工程を採用して微生物毒素の内容について気体及び液体を試験する方法を実施するものとして、供給開口部と排出開口部を有するフロースルー容器（１）と、この２カ所の開口部の間の流れ域内に、流れの方向に対し略直角に配置される分離要素（３）と、を備えることを特徴とする、先行請求項のいずれかに記載の方法による試験工程実施用のフロースルー容器。
10. 請求項９に記載の方法に係るフロースルー容器において、前記供給開口部と前記排出開口部とが毒素に対して不透過性になるよう閉鎖できることを特徴とする装置。

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