JP2004520037A - 分泌タンパク質を発現する細胞の単離 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本出願は、2001年1月16日に出願された、米国仮特許出願番号60/261,999に対する優先権を主張する。この出願の全体を通じて、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が、本出願において参考として援用される。
【0002】
(発明の分野)
本発明の分野は、分泌タンパク質を産生する細胞を同定および単離するための方法である。この方法は、個々の細胞の表面上の分泌タンパク質を一時的に捕捉し、不均一な集団からの希少な細胞クローンの選択を可能にすることによる、分泌タンパク質の特定の特徴または発現レベルに基づく。この分野はまた、所望のレベルの分泌タンパク質または特定の特徴の分泌タンパク質を生じる細胞、ならびにこのような細胞を保有する生物を作製するための、この方法の使用を包含する。詳細には、この方法は、高発現組換え抗体産生細胞株の迅速な単離を可能にするか、あるいは特定のハイブリドーマの迅速な単離、または抗体産生トランスジェニック動物の単離に直接適用され得る。この方法は、タンパク質を分泌する任意の細胞に適用可能である。
【0003】
(導入)
本発明の方法は、タンパク質分泌細胞の単離および同定のための現在の方法を超える、かなりの利点を提供する。記載される方法は、より効率的であり、より正確であり、そしてより広範に適用可能である。詳細には、タンパク質を分泌する任意の細胞は、本発明の方法により単離され得る。この局面は、多くの治療用タンパク質が分泌される場合に、とくに重要である。さらに、分泌タンパク質産生細胞は、タンパク質の特徴に基づいて単離され得る。例えば、抗体を分泌する細胞は、所望の特異性、アビディティー、またはアイソタイプに基づいて、迅速かつ便利に単離され得る。さらに、産生される分泌タンパク質の量は、従来技術の多くの方法(ここで、分泌タンパク質の産生は、間接的に定量される)と異なり、直接定量され得る。
【0004】
従って、本発明は、タンパク質分泌細胞を系統的に単離するための、迅速、簡便、そして正確な方法を提供する。
【背景技術】
【0005】
(発明の背景)
潜在的に薬学的価値のある、多くのタンパク質は、分泌タンパク質であり、これらとしては、増殖因子、可溶性レセプタードメイン、および最も重要なものとしてモノクローナル抗体が挙げられる。これらのタンパク質および他のタンパク質を産生するための組換えDNA技術を用いる産生方法は、宿主細胞および発現ベクターを用いる遺伝子発現系を使用する。
【0006】
発現ベクターは、細胞に導入される、目的の遺伝子(GOI)を保有する。これらの発現ベクターは、GOIを含む遺伝子情報(これは、宿主細胞自身の遺伝物質へと組込まれる)を導入する。目的の遺伝子(GOI)の安定な組込みの後の、高発現細胞を単離するための標準的な方法は、細胞プールの収集、プレートからのコロニーの選別、限界希釈による単一細胞の単離、または当該分野で公知の他の方法を含み得る。次いで、プールまたは個別のクローンは、増殖され、そしてPOI活性の直接的な測定によってか、POIの免疫学的検出によってか、または他の適切な技術によって、目的のタンパク質(POI)の産生についてスクリーニングされる。これらの手順は、面倒であり、非能率的であり、高価であり、そして分析され得るクローンの数が、通常、数百個に制限される。
【0007】
安定な組込みの後の細胞によるタンパク質発現におけるより高い程度の不均一性は、たとえ安定な高発現産生細胞株が生じたとしても、稀な組込みを同定するための努力において、多くの個別のクローンがスクリーニングされることを要求する。この要求は、最も高いレベルのタンパク質産生を発現する細胞の迅速な同定および単離を可能にする方法を要求する。さらに、クローンプールの収集(すなわち、選別したコロニー)は、低発現細胞をより速く増殖させるために、高発現細胞(これは、頻繁に、より遅く増殖する)を損失する危険性がある。従って、分泌POIの高発レベル発現を可能にする個別の細胞の迅速なスクリーニングおよび単離を可能にする方法の必要性が存在する。
【0008】
安定な発現細胞株の単離のために用いられる方法に用いられる方法へのフローサイトメトリーの組込みは、多数の個別のクローンをスクリーニングし得る可能性を改善したが、現在利用可能な方法は、様々な理由のために、依然として不適切なままである。規定された特異性(Parksら(1979)PNAS 76:1662、およびPallavaciniら(1989),J.Immunol.Methods 117:99)、アイソタイプ(DanglおよびHerzenberg(1982)J.Immunol.Methods 52:1)、またはアビディティー(Jantscheffら(1988)J.Immunol.141:1624)を有するハイブリドーマの同定および単離に対するフローサイトメトリーの初期の適用は、全て、細胞表面に非特異的に結合された抗体の検出に依存していた。これらの方法は、表面結合の量と分泌された抗体の量との間の相関関係を仮定していた。異なる特徴の細胞間のPOIの拡散もまた問題であった。最近、フローサイトメトリーを利用する2つのさらなる方法が、安定な高発現細胞株の高スループット単離のために開発された。
【0009】
第1の方法は、GOI mRNAについての転写読出しを含むための、発現プラスミドの改変に関する。これは、最も頻繁には、内部リボゾームエントリー部位(IRES)、およびそのタンパク質産物がフローサイトメトリーにより容易にモニターされる遺伝子、最も頻繁には、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、GOIの停止コドンと末端ポリA部位との間に、挿入することにより達成される(Mengら、(2000)Gene 242:201)。IRESの存在は、POIおよびGFPが同じmRNAから転写されることを可能にする。従って、GFP遺伝子の発現レベルは、GOIについてのmRNAレベルに間接的に関連する。高いレベルでGFPを蓄積するクローンは、フローサイトメトリーにより単離され、次いで、POI産生についてのスクリーニングされる。この方法は、組換え構築物におけるIRESの使用による、レポーター遺伝子に対するGOI発現の連関に依存するので、ハイブリドーマの単離に対しては適用可能ではない。
【0010】
発現クローンの単離におけるフローサイトメトリーの使用は、高スループット形式において、多数のクローンの迅速な分析を可能にする。さらに、フローサイトメトリーの使用は、細胞の直接的な取り扱いを有意に減少させる。残念なことに、GFP産生のレベルは、POIの産生レベルの直接的な測定ではない。種々の機構が、選択したPOIの産生を、GFPの蓄積から分離し得る。POIとGFPレポーターとの産生における差異は、2つの遺伝子の翻訳効率、POIの分泌効率、または多シストロン性mRNAの安定性における差異から生じ得る。
【0011】
発現クローンを単離するためにフローサイトメトリーを用いる別の方法は、アガロースマイクロドロップ(microdrop)内への細胞のカプセル化に関する(Weaverら(1990)Methods Enzymol.2:234)。この方法において、POIに特異的なビオチン化抗体は、分泌されたPOIが、マイクロドロップ内に捕捉および保持されるように、ストレプトアビジンを介してビオチン化アガロースに結合される(Grayら(1995)J.Immunol.Methods 182:155)。捕捉されたPOIは、POIに特異的な抗体を用いる免疫染色により検出される。カプセル化しているアガロースが、隣接する細胞から分泌されたPOIを吸収することを減らすために、細胞は、低浸透性培地に置かれる。包埋しているアガロースにおいて、最も高い抗体染色のPOIを有する細胞は、フローサイトメトリーにより同定および単離される。ゲルマイクロドロップアプローチは、GOI mRNAの発現について間接的にスクリーニングするよりもむしろ、POIを分泌する能力について直接細胞をスクリーニングするが、分泌されたPOIを捕捉および染色するために適切な抗体のアベイラビリティーを必要とし、そしてこの手順は、アガロースゲルマイクロドロップを生成するための特別な装置を必要とする。さらに、いくつかの細胞は、カプセル化プロセスに対して感受性があり得る。
【0012】
この方法のバリエーションは、POIに対して特異的な抗体を、細胞表面に直接的に結合することにより、マトリクス中に細胞を包埋する必要性を回避する(Manzら、1995,PNAS 92:1921−1925)。この方法において、細胞表面タンパク質のビオチンヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる非特異的ビオチン化は、次いで、POIを結合し得るストレプトアビジン結合体化抗体と接触される。POIを分泌する細胞は、POIで飾られ、次いで、POIは、適切に標識された二次抗体を用いて検出される。しかし、隣接する細胞の間のPOIの拡散は問題であり、そしてこの方法はまた、発現細胞から離れたPOIの拡散を減少させるために、高粘度の培地を必要とする。これらの高粘度培地は、細胞を区別するために必要とされるので、細胞は、所望される場合、洗浄されそして細胞選別に適切な培地中に置かれなければならない。
【0013】
高発現組換え細胞株の同定および単離に関係する問題は、特に、目的の抗体を発現するハイブリドーマの単離に当てはまる。しかし、有用なハイブリドーマの同定は、いくつかのさらなる問題を含む:これらは、初めに、抗原結合活性についてスクリーニングされ、次いで、免疫グロブリンアイソタイプについてスクリーニングされなければならない。さらに、GFPベースの方法は、ハイブリドーマの同定および単離に適用可能ではない。なぜならば、ハイブリドーマの構築は、抗体遺伝子の発現が、GFPのような転写レセプターに関連し得るような組換え構築物を含まないからである。ハイブリドーマスクリーニングは、時間のかかる、骨の折れる努力である。このスクリーニングにおいて、スクリーニングされるクローンの数が既存の技術により制限される。
【0014】
同様の問題は、異なる抗体、ScFv、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを発現する細胞の不均一な集団からの、特定の抗原に対する、所望の特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する、抗体、ScFv、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを産生する希少な細胞の選択を含む。
【0015】
従って、細胞の大きな集団から、種々の分泌POIを発現する細胞を同定および単離する迅速かつ効率的な方法についての要求がある。最も望ましいのは、mRNAよりむしろタンパク質の発現レベルを測定する方法である。なぜならば、mRNAの測定は、しばしば最終的に産生されるタンパク質のレベルを正確には反映しないからである。さらに、特定の抗体を産生する細胞を同定するために、当該分野で現在利用可能である方法よりも、より効率的な方法についての要求がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0016】
(発明の要旨)
本発明は、POIについての直接的なスクリーニングによる、タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための、高スループットスクリーニング法を記載する。本発明はまた、製造プロセスの間に、単一細胞基準でのPOI発現の簡便なモニタリングを可能にする。さらに、この技術は、抗体産生細胞のスクリーニングに直接適用され得る。
【0017】
本発明は、種々の分泌されたPOIを結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株の構築、およびPOIを分泌する細胞を同定および単離するためのそれらの使用に関する。本発明の方法による細胞の単離は、POIの発現レベルまたはPOIの特定の特徴に基づき得る。このような細胞の構築または使用を介して、任意の分泌タンパク質は、分泌タンパク質と細胞表面捕捉分子との間に対応する親和性が存在する限り、細胞表面捕捉分子により捕捉され得る。
【0018】
さらに説明されるように、任意の分子は、細胞表面捕捉分子として使用され得るように操作され得る。従って、本発明は、タンパク質を分泌する任意の細胞を単離するために利用され得る。さらに、多くの細胞は、分泌タンパク質を産生するようにトランスフェクトされ得、従って、そのネイティブの状態ではタンパク質を分泌しない細胞でさえ、本発明の適用を通じて分泌タンパク質産生細胞(producer)として単離され得る。
【0019】
提示されたPOIを有する細胞の検出は、提示されたPOIを直接的または間接的に結合し得る任意の分子の使用を介して達成され得る。このような検出分子は、POIを提示する細胞の検出および/または単離を容易にし得る。1つの実施形態では、お互いに結合し、そして示差的に標識される、2つの分子が利用される。検出および/または単離は、当該分野で公知の標準的な技術お介して達成され得る。
【0020】
さらに、本発明は、抗体産生細胞の単離に適用され得る。詳細には、抗体産生細胞は、POIを結合する細胞表面捕捉分子(この場合において抗体である)を発現する固定された抗体に融合され得る。抗体産生細胞は、B細胞またはその誘導体(例えば、形質細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞)であり得る。本発明はまた、所望のレベル、詳細には、高レベルの、組換え抗体またはそのフラグメントを発現する、細胞の単離のために用いられ得る。本発明はまた、様々な結合特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する抗体遺伝子のライブラリーを発現する不均一な細胞の集団から、特定の抗原に対する、所望の特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する、抗体、ScFv、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを発現する希少な細胞の単離を可能にする。さらに詳細には、本発明は、所望の特異性およびアイソタイプの分泌抗体、ならびに所望のエピトープに特異的である抗体を発現する、抗体産生細胞の同定に関する。
【0021】
本発明の別の実施形態では、細胞表面捕捉分子を発現するトランスジェニック動物が、作製され得る。次いで、このようなトランスジェニック動物由来の細胞は、POIの産生について直接スクリーニングされ得る。
【0022】
本発明はまた、任意の分泌される目的のタンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
a)そのPOIに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でその細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)POIをコードする第2の核酸で、その細胞を同時にかその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなPOIが分泌される、工程;
c)そのPOIに結合する検出分子とその細胞を接触させることによって、表面に提示されるPOIを検出する工程;
d)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
【0023】
本発明は、さらに、任意の分泌されるPOIを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
a)そのPOIに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)その細胞表面捕捉分子を発現するa)からの細胞を検出する工程;
c)(b)において検出された細胞を単離および培養する工程;
d)その細胞を、POIをコードする第2の核酸で同時にかまたはその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなPOIが分泌される、工程;
e)表面に提示されるPOIを、その細胞を検出分子と接触させることにより検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がそのPOIに結合する、工程;
f)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
【0024】
本発明はなおさらに、任意の分泌されるPOIを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
a)細胞表面捕捉分子を一過性にかまたは安定に高収量で発現する細胞を検出する工程;
b)(a)において検出された細胞を、単離および培養する工程;
c)POIをコードする核酸で(b)における細胞をトランスフェクトする工程であって、そのようなタンパク質が分泌される、工程;
d)その細胞を検出分子と接触させることによって、表面に提示されるPOIを検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がそのPOIと結合する、工程;
e)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
【0025】
本発明はさらに、任意の分泌されるPOIを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
a)そのPOIと結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)その細胞表面捕捉分子を高収量で発現する(a)からの細胞を検出する工程;
c)(b)において検出された細胞を単離および培養し、そして十分な時間その細胞にそのPOIを分泌させる工程;
d)その細胞を検出分子と接触させることによって表面に提示されるPOIを検出する工程であって、その検出分子のうちの1つ以上がPOIと結合する、工程;
e)その検出分子に基づいて細胞を単離する工程;
を包含する。
【0026】
本発明は、これらの方法により生成される細胞を含む、非ヒト生物に関する。具体的には、そのような非ヒト生物は、抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を有する細胞を含み得る。
【0027】
さらに、本発明は、タンパク質に、そのタンパク質が細胞膜中に固定されたままであり、その細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能するように、膜アンカーを付加することを企図する。そのような膜アンカーは、膜貫通アンカーまたはGPIリンクであり得、そしてその細胞に対してネイティブであっても、組換え体であっても、または合成であってもよい。
【0028】
本発明はまた、タンパク質のアミノ末端に、そのタンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能するように、シグナル配列を付加することを具体化する。そのようなシグナル配列は、その細胞に対してネイティブであっても、組換え体であっても、または合成であってもよい。
【0029】
別の実施形態において、その細胞表面捕捉分子と結合するブロッキング分子が、POI発現細胞から近隣の細胞へのPOIの拡散を減少するために付加される。さらなる実施形態において、POI発現細胞から近隣細胞へのPOIの拡散および細胞へのPOIの接着は、培地の粘度を増加させることによって減少される。
【0030】
本発明はさらに、分泌タンパク質(リガンド、可溶性レセプター分子、増殖因子、および抗体を含む)を発現する細胞の同定および選択に関する。そのような分泌されるタンパク質は、組換え生成されてもまたは天然に存在してもよい。さらに、POIをコードする核酸は、ライブラリー(cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない)から選択され得る。
【0031】
1つの実施形態において、そのような増殖因子は、インターロイキン(IL−1)、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(CNTF)、エリスロポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン−γ、GM−CSF、TGF−β、TNFレセプター、融合タンパク質、ならびに動物細胞においてなされる承認されたすべての治療からなる群より選択され得る。
【0032】
別の実施形態において、その抗体は、IgM、IgG、IgA、IgD、またはIgE、ならびにこれらのうちの種々のサブタイプからなる群より選択される。
【0033】
なお別の実施形態において、本発明は、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、または抗体結合タンパク質を、POIに結合する細胞表面捕捉分子として使用する。そのような細胞表面捕捉分子は、組換え産生されてもまたは天然に存在するのであってもよい。
【0034】
1つの実施形態において、その細胞表面捕捉分子は、POIと結合する、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ScFv、それらのフラグメント、抗体の定常領域に融合された任意のもの、およびファージディスプレイライブラリーもしくはペプチドライブラリー由来のペプチド、ならびに誘導体である。別の実施形態において、その細胞表面捕捉分子は、Tie1、Tie2、VEGFR1(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、サイトカインレセプター成分、または2つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物からなる群より選択される。
【0035】
さらに、本発明は、所望の特異性、親和性、またはアイソタイプの分泌抗体を発現する、B細胞およびその誘導体、またはハイブリドーマの同定に関する。本発明はまた、所望のレベルの抗体または抗体フラグメントを発現する細胞の単離のために、使用され得る。
【0036】
本発明はさらに、抗イムノグロブリン抗体、抗イムノグロブリン、ScFv、プロテインA、プロテインL、プロテインG、またはFcレセプター(FcR)、を、POIと結合する細胞表面捕捉分子として使用することに関し、そのPOIは、分泌抗体である。
【0037】
(発明の詳細な説明)
本発明は、分泌タンパク質を生成する細胞を同定および単離する新規かつこれまで未知の方法を記載する。本発明は、細胞表面に位置した、POIに結合する分子を発現する細胞の生成に基づく。次いで、細胞表面に提示されたPOIは、種々の検出分子で標識されることにより検出され得る。特定の条件下で細胞表面に提示されたPOIの量は、分泌されたPOIの総量の直接的な尺度である。次いで、POI産生細胞は、非産生細胞から単離され得、生成レベルまたはPOI特徴が識別され得る。本発明の利点は、mRNAを間接的に測定するのではなく、分泌POIを直接定量することである。
【0038】
本発明は、POIを生成する同じ細胞における種々の分泌POIを結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞の構築またはその使用に関する。細胞がPOIを分泌すると、これらの細胞表面捕捉分子は、POIを結合するか、またはPOIと細胞表面捕捉分子との複合体が細胞内に形成し得、次いでこの複合体が分泌され得る。結合は、オートクライン様式にて結合し得るかまたは分泌されると同時に生じ得る。次いで、分泌POIを生成する細胞が、同定および単離され得る。このような同定および単離は、POIの特徴、POIの生成またはその欠如、あるいは特定された生成レベルに基づき得る。この細胞表面捕捉分子および/またはPOIは、ネイティブな状態で細胞により生成されてもよいし、細胞表面捕捉分子および/またはPOIが組換え生成されてもよい。細胞表面捕捉分子とPOIとの間に対応する親和性が存在するのであれば、このような細胞の構築または使用を通じて、任意の分泌タンパク質が、細胞表面捕捉分子により捕捉され得る。さらに説明すると、細胞表面捕捉分子として使用され得るように、任意の分子が操作され得る。従って、本発明は、タンパク質を分泌する任意の細胞を単離するために利用され得る。
【0039】
ほとんど全てのタンパク質は、本発明により記載されるような細胞表面捕捉分子として機能する能力を有する。必要なものは、所望のタンパク質が細胞膜に固定され、細胞外空間に露出される能力である。所望の細胞が、シグナル配列を有する場合、細胞表面捕捉分子が、細胞の外側に露出される細胞膜に固定されたままであるように、膜アンカー(膜貫通アンカーまたはGPI連結シグナルが挙げられるが、これらに限定されない)のみが、その細胞表面捕捉分子に付加される必要がある。さらに、所望のタンパク質がシグナル配列を欠く場合、所望のタンパク質分子が細胞表面に移行されるように、シグナル配列が所望のタンパク質のアミノ末端に付加され得る。シグナル配列および膜アンカーは、細胞に対してネイティブであってもよいし、組換えであってもよいし、合成であってもよい。
【0040】
細胞は、しばしば、内因的にまたは組換えDNAを導入した後に、広範な種々のタンパク質を分泌する。任意の分泌タンパク質が同定され得、この分泌タンパク質を生成する細胞が、本発明の方法に従って、単離され得る。このような分泌タンパク質としては、増殖因子、増殖因子レセプター、リガンド、可溶性レセプター成分、抗体、およびペプチドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。このような分泌タンパク質は、組換えタンパク質であっても、そうでなくてもよい。すなわち、所望の細胞に由来する目的のいくつかのタンパク質の分泌は、さらなるヌクレオチド配列の導入を必要としないかもしれない。例えば、B細胞またはプラスマ細胞からの抗体の分泌は、B細胞またはプラスマ細胞への組換えヌクレオチド配列の導入の結果ではない。組換え分泌タンパク質は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術により生成され得る(例えば、Sambrook,J.,E.F.FritschおよびT.Maniatis.Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第2版,第1巻、第2巻および第3巻,1989;Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編,Greene Publ.Assoc.,Wiley Interscience,NYを参照のこと)。これらの分泌タンパク質は、多くの商業目的および研究目的のために有用である。本発明は、本発明の方法論を通じてこのような分泌タンパク質を生成することを包含する。提示されたPOIを有する細胞の検出は、提示されたPOIを直接的または間接的に結合し得る任意の分子を使用することにより達成され得る。このような検出分子は、POIを提示する細胞の検出および/または単離を容易にし得る。
【0041】
本発明は、特に、a)細胞表面捕捉分子としてリガンド特異的レセプターを使用することによるリガンド産生細胞の単離、b)細胞表面捕捉分子として表面結合レセプター特異的リガンドを使用することによる可溶性レセプター産生細胞の単離、またはc)細胞表面捕捉分子として抗体結合タンパク質を使用することによる抗体産生細胞の単離、に適用可能である。
【0042】
1つの実施形態において、本発明は、細胞表面捕捉分子としてリガンド特異的レセプターを使用することによるリガンド産生細胞の単離に適用可能である。より具体的には、増殖因子またはサイトカインを結合し得る細胞表面捕捉分子を発現する細胞を使用または構築し得る。これらの細胞表面捕捉分子としては、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、サイトカインレセプター成分、または2以上のサイトカインレセプター成分の融合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。このようなレセプターは、POI(例えば、サイトカインまたは増殖因子)を結合し得る。そのサイトカインおよび増殖因子としては、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(Ciliary Neurotrophic Factor)(CNTF)、エリスロポエチン、脈管内皮細胞増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン-γ、GM−CSF、およびTGFβが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0043】
別の実施形態において、本発明は、細胞表面捕捉分子として抗体結合タンパク質を使用することによる抗体産生細胞の単離に適用可能である。1つの実施形態において、抗体産生細胞は、POI(この場合には、抗体である)を結合する細胞表面捕捉分子を発現する不死化細胞に融合され得る。このような抗体産生細胞としては、B細胞およびその誘導体(特にプラスマ細胞)、ハイブリドーマ(例えば、NS0)、骨髄腫細胞(例えば、SP2/0)、組換え細胞(例えば、組換え抗体を発現するCHO細胞)、または抗体フラグメント(例えば、IgG由来のFcフラグメント)からなる融合タンパク質を生成する他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。POIは、このような細胞から生成される抗体であり得る。このような抗体としては、IgM、IgG、IgA、IgDおよびIgE、ならびにこれらの種々のサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。抗体を結合するために使用され得る細胞表面捕捉分子としては、Fcレセプター(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIII)、抗免疫グロブリン抗体、プロテインA、プロテインL、プロテインG、およびプロテインH、またはこれらの機能的フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
抗体産生細胞の単離に適用される場合、本発明を使用して、所望の特異性、アイソタイプおよびアビディティを有する抗体を発現する細胞を同定および単離し得た。さらに、ペプチドまたはタンパク質フラグメントでの検出によって、所望のエピトープに対して特異的な抗体を発現する抗体産生細胞の同定および単離が可能になる。
【0045】
本発明の方法論に従って、細胞は、分泌型POIを結合し得る細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて、このような細胞表面捕捉分子が発現される条件下で、最初にトランスフェクトされる。次いで、このような細胞表面捕捉分子の適切な産生細胞であるトランスフェクト細胞は、検出および単離され、そしてこのような細胞は、培養される。これらの細胞は、POIを天然に産生し得るか、またはPOIが組み換え的に発現され得るかのいずれかである。これらの細胞が天然にPOIを産生する場合、これらの細胞は、検出および単離が可能である。POIが組み換え的に産生される場合、次いで、特定の細胞表面捕捉分子を発現する単離および培養された細胞は、分泌型POIをコードする第2のヌクレオチド配列を用いて、分泌型POIが発現される条件下でトランスフェクトされる。発現に際して、分泌型POIは、細胞表面捕捉分子に結合し、そして結合したPOIを提示する細胞は、検出および単離される。
【0046】
POIが細胞によって天然に産生される場合、細胞は、POIをコードするヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされない。ゆえに、本発明のこの局面は、POIを産生する細胞のいずれかまたは全てに適用可能である。さらに、細胞表面捕捉分子が、細胞によって天然に産生される場合、細胞は、細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされる必要がない。ゆえに、本発明のこの局面は、細胞表面捕捉分子を産生する細胞のいずれかまたは全てに対して適用可能である。
【0047】
トランスフェクションおよび発現は、異なる発現カセットおよびプロモーター(構成的かまたは調節型のいずれか)を含有する種々のベクターの使用を介してもたらされ、このベクターはまた、エンハンサー、転写ターミネーター、スプライシングドナー部位およびアクセプター部位、ならびに他のヌクレオチド配列を含み得る(Kaufmanら(1991)Meth.Enzymology 185:487)。
【0048】
これらのベクターは、一般に市販されているか、または当該分野において公知の標準的な技術によって容易に調製され得、そして、染色体外エレメントとしての維持または宿主ゲノムへの組み込みのいずれかによって宿主における発現を提供する。哺乳動物宿主について、ウイルス複製系(例えば、シミアンウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、エプスタインバーウイルス、レトロウイルスなど)に基づく広範な種々のベクターが、公知である。これらのベクターは、転写および翻訳の開始シグナルおよび終止シグナルが存在し、そして1つ以上の制限部位がGOIの単離に利用可能である場合、発現ベクターとして使用され得る。さらに、ベクターは、通常には1つ以上のマーカーを有し、このマーカーによって、発現ベクターを含む宿主細胞の選択が可能になる。このマーカーは、栄養要求性の宿主に対する原栄養;殺生物性耐性(例えば、抗生物質(例えば、G418)に対する耐性);または重金属(例えば、銅)などを提供し得る。所望ならば、発現ベクターは、種々の成分を連結することによって調製され得る。例えば、複製系、マーカー、そしてGOIと連結する転写調節の開始シグナルおよび終止シグナルならびに翻訳調節の開始シグナルおよび終止シグナル。しばしば、ベクターは、原核生物複製系を含み、これによって、所望のDNA配列のクローニング、操作、精製および伸長が可能になる。
【0049】
広範な種々の転写調節配列および翻訳調節配列が、宿主の特性に依存して使用され得る。転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス供給源(例えば、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど)由来であり得、ここで、この調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。あるいは、哺乳動物発現産物(例えば、アクチン、コラーゲンおよびミオシン)由来のプロモーターが、使用され得る。抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルが、選択され得、その結果、融合された遺伝子の発現が、調節され得る。調節シグナルは、天然の供給源由来であっても、調節シグナルを有する配列が異なる供給源由来であり得るキメラであってもよい。
【0050】
さらに、ベクターの調製に使用される核酸配列は、種々の供給源由来であり得る。これらの供給源としては、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAおよびこれらの組み合わせが挙げられる。ゲノムDNAは、天然に存在するイントロンを含んでも含まなくてもよい。天然の供給源から得られるDNA(ゲノムDNAまたはcDNAと呼ばれる)は、種々の方法で得られ得る。所望の配列をコードする宿主細胞が単離され得、ゲノムDNAが、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼによって都合よくフラグメント化され得、そして生じたフラグメントは、目的のポリペプチド配列をコードするDNA配列の存在についてのプローブを用いてクローニングおよびスクリーニングされ得る。一旦、所望のDNA配列を含むクローニングされたフラグメントが同定されると、このフラグメントはさらに、以下のために操作され得る:不要なDNAを除去する、
一端または両端を改変する、介在配列(イントロン)の全てまたは一部を除去するなど。
【0051】
一旦、ベクターが発現のために調製されると、ベクターは、適切な宿主中に導入され得る。種々の技術(以下が挙げられるがこれらに限定されない)を使用して、宿主細胞中に核酸分子を導入し得る:リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ポリブレン媒介トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、リポフェクション、DNAマイクロインジェクション、および微小弾(microprojectile)媒介遺伝子移入(Keownら(1990)Meth.Enzymology 185:527)。
【0052】
当業者は、GOIの安定な組込み、引き続くさらなる用途のために同定および単離されるべきタンパク質の発現を誘導する周知技術が当該分野において存在することを知っている。Kaufmanら((1991)Meth.Enzymology 185:537)は、いくつかの形質転換プロトコルを総説する。このような技術は、多くの異なる条件(当該分野において認識される種々のベクター、多くの細胞株および多様な培養条件が挙げられるがこれらに限定されない)を利用する。
【0053】
広範な種々の宿主細胞が、トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、真核生物起源または原核生物起源のいずれであってもよい。これらの細胞は、しばしば不死化された真核細胞であり、特に哺乳動物細胞(たとえば、サル腎細胞(COS)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎細胞(BHK)、ヒト胚性腎細胞(HEK293)、白血球、骨髄腫および胚性幹細胞である。これらの細胞はまた、非哺乳動物細胞であり得、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞(例えば、Escherichia coli、Bacillus subtilus、Aspergillus種、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisが挙げられるがこれらに限定されない)を含む。全ての細胞は、適切な条件下での培養トレイ媒体中、または相乗作用的宿主中で増殖し得る。最も所望される細胞は、培養し得る哺乳動物細胞である。
【0054】
細胞表面捕捉分子に結合した分泌型POIは、当該分野において公知の種々の技術によって検出および単離され得る。分泌型POIを提示する培養細胞は、分泌型POIを直接的または間接的に結合し得る分子と接触され得、ここで、このような検出分子は、色素形成標識、蛍光(fluorogenic)標識、着色標識、蛍光(fluorescent)標識または磁気標識のような検出標識を含み得る。検出分子に結合した標識が検出され得、そして種々の方法を使用して、細胞が単離され得る。最も好ましくは、細胞集団において、標識が検出され、そして、細胞が、フローサイトメトリーを利用して単離される。
【0055】
あるいは、検出分子は、POIを提示する細胞の直接的な単離のために使用され得る。これは、検出分子を、培養プレート、常磁性分子、または任意の他の粒子もしくは固体支持体に結合体化することによって達成され得る。さらに、提示されるPOIは、検出分子またはPOIの特性によって直接検出され得る。
【0056】
1つの実施形態において、互いに結合し差示的に標識されている2つの検出分子を使用して、相互作用をブロックする提示された分泌型POIを検出する。細胞が、第1の検出分子を結合しかつ第1の検出分子と第2の検出分子との間の相互作用をブロックする分泌型POIを提示する場合、その細胞は、その表面上での第1の検出分子のみの存在に基づいて単離され得る。他方では、細胞が、第1の検出分子を結合するが第1の検出分子と第2の検出分子との間の相互作用をブロックしない分泌型POIを提示する場合、その細胞は、その表面上での両方の検出分子の存在に基づいて単離され得る。例えば、レセプター−リガンド複合体の形成を特異的にブロックするかまたはブロックしない抗体を発現する抗体産生細胞が同定され得る。これらの検出分子がレセプターおよび差示的に標識されているそのリガンドである場合、次いで、レセプター−リガンド複合体が形成することをブロックする抗体を発現する抗体産生細胞は、その表面上での一方の標識の存在によって検出され得るが、レセプター−リガンド複合体が形成することをブロックしない抗体を発現する抗体産生細胞は、その表面上での両方の標識の存在によって検出され得る。
【0057】
実施形態のいずれかにおいて、および発現しない細胞またはほとんど発現しない細胞から発現細胞を単離する事に関して、POIが分泌型タンパク質である場合、基本的困難性の1つは、隣接細胞間にPOIが拡散することである。よって、細胞表面上に分泌型POIを捕捉するように設計されるいずれの系も、発現細胞から隣接細胞へのPOIの拡散、およびPOIの隣接細胞への接着を妨げるべきであることは、重要である。拡散が生じ得、そして隣接細胞が分泌型POIで装飾される場合、POI装飾の程度に基づく細胞の分離によって、高度に発現する細胞を、低い発現レベルを有する細胞から識別し損ない、そして発現しない細胞から発現する細胞を効率的に単離し損ない得る。
【0058】
従って、本発明の1つの局面は、隣接細胞間での分泌型POIの拡散をブロックすることである。これは、細胞表面捕捉分子またはPOIのいずれかを結合し細胞表面捕捉分子に対する分泌型POIの結合を妨げるブロッキング分子の添加によって達成され得る。この局面において、検出分子は、ブロッキング分子を結合しない。例えば、細胞表面レセプターがhFcγRIであり、そして分泌型POIがヒトIgG Fcフラグメントを有する場合、次いで、隣接細胞間での分泌型POIの拡散は、外因性ラットIgGの培養培地への添加によってブロックされ得る。分泌型POIを提示するがラットIgGを結合しない細胞の検出は、ラットIgGを認識しないヒトIgG Fcに対して特異的な抗体の使用によって達成される。
【0059】
本発明の別の局面において、隣接細胞間での分泌型POIの結合は、培地の粘性を増加させることにより低減される。
【0060】
本発明の別の局面において、分泌型POIは、媒体中に蓄積し得ない。これは、分泌型POIおよび/または細胞表面捕捉分子の発現を調節し、その結果、POIの短い発現は、細胞表面捕捉分子を結合するに十分であるが拡散するには十分ではない量のPOIを生じることにより達成され得る。
【0061】
本発明のなお別の局面において、細胞は、蓄積したPOIを含有する培地から取り出され得、この細胞に結合したPOIははがされ、そしてPOI発現は、制限された時間にわたって続き得、その結果、分泌型POIは、培地中に蓄積しない。タンパク質は、当該分野において公知の方法(例えば、低pH緩衝液での細胞の洗浄)によってはがされる。
【0062】
本発明に従って、ほとんどの検出分子を結合する細胞集団中のこれらの細胞はまた、ほとんどの分泌型POIを発現する。実際に、個々の細胞がPOIをより多く分泌するほど、より多くのPOIが細胞表面上に提示される。その細胞での表面提示POIの量とPOIの発現レベルとのこの相関は、所望の相対的発現レベルを有する細胞を細胞集団から迅速に同定することを可能にする。
【0063】
1つの実施形態において、DNAライブラリーを使用して、細胞表面捕捉分子によって細胞表面上に提示され得る分泌型タンパク質を発現し得る。例えば、DNAライブラリーはまた、免疫された動物から単離されたB細胞由来の抗体可変ドメインのコード領域から生成され得る。次いで、DNAライブラリーは、抗体に対して特異的な細胞表面捕捉分子を発現する細胞中に発現され得、その結果、所望の特異性、アイソタイプまたはアビディティのクローンが、本発明の方法によって同定および単離され得る。
【0064】
別の実施形態において、トランスジェニック哺乳動物が、作製され得る。この動物は、1つ以上の細胞型において特定の細胞表面捕捉分子を発現する。次いで、このようなトランスジェニック哺乳動物由来の細胞は、POIの産生について直接スクリーニングされ得る。例えば、プラズマ細胞において、抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を発現することが所望され得る。従って、免疫化したマウス由来のプラズマ細胞が回収され得、そして所望の抗原に特異的な抗体を産生する細胞が、本発明の方法によって単離され得る。
【0065】
本発明のさらなる実施形態において、抗体産生は、POIである特定の抗体を結合するヒトFcγR1レセプター(FcγR1)を発現するCHO細胞株の使用を介して測定される。
【実施例】
【0066】
(実施例1)
pTE084の構築:pTE084を、ヒトFcγRI(hFcγRI;GenBank受託番号M21091)をコードするpCAE100由来の1,436bp XbaIフラグメントを、pRG821のXbaI部位に連結することにより、構築した。連結から生じる所望のプラスミドにおけるhFcγRIの方向を、NotI、PstI、EcoRI、およびStuIを用いる制限マッピングにより試験した。pTE084をhFcγRI(ヒトIgGのFcドメインについての高親和性細胞表面レセプター)の高レベル発現のために設計した。それは、2つの独立した発現カセットを含む。1つのカセットは、CMV−MIEプロモーターにより駆動されるhFcγRI遺伝子であり、そして第二のカセットは、SV40後期プロモーターにより駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(npt)遺伝子(これは、G418に対する耐性を与える)である。
【0067】
hFcγRIを発現するCHO K1誘導体の構築:
CHO K1細胞(4×106)を、リポフェクタミンTM(Life Technologies;Rockville,MD)を用いて製造業者の示唆に従ってpTE084でトランスフェクトした。細胞を、500μg/ml G418(Life Technologies)を含有する培養培地(10%ウシ胎児血清、90% Ham’s F−12,2mM Lグルタミン;すべての試薬はLife Technologies,Rockville,MDから得た)中に15日間配置した。G418選択で生存した細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてFITC結合体化ヒトIgG,Fcフラグメント(FITC−hFc;Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)で染色した。簡単に説明すると、10cm培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム(Life Technologies)を含まないダルベッコ燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回洗浄した。0.25% トリプシン(Life Technologies)の3mlを各プレートに添加した。プレートを、細胞がプレートから脱離するまで旋回させた。10ml培養培地を、脱離した細胞の各プレートに即時に添加した。次いで、細胞を、1,000×gで4分間の遠心分離によって採集した。上清の除去後、細胞を、培養培地中に希釈した2μg/ml FITC−hFcの4ml中に再懸濁した。次いで、細胞をプラットフォームシェーカー上に配置し、そして室温で1時間染色した。未結合FITC−hFcを除去するために、細胞を20ml PBSで2回洗浄した。細胞に対するFITC−hFc標識の程度をMofloセルソーター(Cytomation;Fort Collins,CO)においてフローサイトメトリーによって測定した。FITC−hFcは、模擬トランスフェクト親CHO K1細胞を染色しなかった(図2Aおよび2B)が、G418耐性のpTE084トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた(図2C)。選択されたプール由来の上部の1%の最も蛍光のある細胞を、フローサイトメトリーにより1細胞/ウェルで96ウェルプレート中に配置した。9日後、96ウェルプレート中の88細胞クローンを、24ウェルプレートに増殖した。3日後、個々のウェル中の細胞を1ml PBSで1回洗浄し、0.5mlの2μg/ml FITC−hFcで1時間染色し、1ml PBSで2回洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で細胞表面染色について調べた。33の最も蛍光のあるクローンを選択し、増殖し、次いでフローサイトメトリーによってスクリーニングした。1つのこのようなクローンRGC3のFITC−hFc染色を図2Dに示す。
【0068】
細胞間の発現細胞と非発現細胞との間の分泌タンパク質の拡散は、IgGを添加することによりブロックされた:
hFcγRIクローナル細胞株中の全ての細胞が細胞表面hFcγRIを発現するので、それらは、全てIgGまたはIgGのFcドメインからなる融合タンパク質を結合する能力を有する。hFcγRIは、種々の種由来のIgGを結合する(van de WinkelおよびAnderson,1991)ので、動物IgGのパネルを、hFcγRI発現細胞へのヒトIgG1(hIgG1)Fcタグ(4SC622)を含むタンパク質の結合をブロックする能力について試験した。4SC622は、hIL−4Rγ細胞外ドメインに融合され、次いでhIG−1Fcドメインに融合されたIL−2Rγ細胞外ドメインからなるキメラ分子である。この実験において、RGC1の培養物、pTE084で安定にトランスフェクトしたCHO K1細胞から選択されたhFcγRI発現細胞株を、1μg/ml 4SC622と、37℃の組織培養インキュベーターにおいて、1mg/mlの異なる種由来のIgGの存在または不在下で、18時間、インキュベートした。4SC622の細胞表面結合を、洗浄細胞を、FITC−hFcでの細胞染色について概説された手順に従って、4SC622のhIL−2Rγ成分に特異的なフィコエリトリン結合体化マウスIgG1モノクローナルAG184(PE−AG184)(BD PharMingen;San Diego,CA)で染色した後、フローサイトメトリーにより決定した。図3は、hIgGが、4SC622がRGC1の表面上で発現したhFcγRIに結合することを完全にブロックしたことを示す。ラット、ウサギ、およびイヌに由来するIgGもまた結合を有効にブロックしたが、ウシおよびヒツジに由来するIgGはブロックしなかった。外因的に添加したラットIgGが、外因的に添加したhIgG1 Fc−タグ化タンパク質(4SC622)の細胞表面hFcγRIへの結合をブロックすることができる(図4)ことは、ラットIgGもまた、異なるレベルでhIgG1 Fcタグ化タンパク質を発現する細胞間の移動をブロックし得ることを示唆する。このことを試験するために、緑色蛍光タンパク質(EGFP)の存在または不在により区別され得る2つの細胞株を、RGC1から生成させた。簡単に説明すると、RGC1細胞をEGFPでマーキングするために、2×106のRGC1細胞を、0.5μg PTE073(これは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする)および5μg pRG816−EGFP(これは、CMV−MIEプロモーターにより駆動されるEGFP遺伝子をコードする)で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、200μg/mlハイグロマイシンB(Sigma;St.Louis,MO)で、2週間、選択した。緑色蛍光細胞をフローサイトメトリーによって単離した。1つのEGFPおよびhFcγRI発現クローン、RGC2を細胞混合実験において使用した。これらの実験において使用した他の細胞株RGC4は、プラスミドpEE14.1−622でのRGC1の安定なトランスフェクションにより生成した。pEE14.1−622は、4SC622の発現がCMV−MIEプロモーターにより駆動されるプラスミドであり、そして、グルタミンシンセターゼミニ遺伝子を含む。このグルタミンシンセターゼミニ遺伝子は、アナログメチオニンスルホキシイミン(MSX)に対する耐性を付与し、安定な組み込み事象の選択を可能にする。RGC4細胞は、細胞表面上にhFcγRIを発現させ、hIgG1 Fcタグ化タンパク質4SC622を分泌する。50%RGC2細胞および50%RGC4細胞で構成される混合細胞の1プレートを、18時間、1mg/mlラットIgGとインキュベートし、その後PE−AG184で染色し、次いでフローサイトメトリーによって調べた。図5Aは、RGC2細胞のEGFP蛍光を示し、そして図5Bは、RGC2細胞もまた、PE−AG184蛍光の増加により示されるように、外因的に添加された4SC622(1μg/ml)を結合することを示す。図5Cは、RGC4がEGFPゲートにおいて蛍光しなかったことを示す。有意には、外因的に添加されたラットIgGは、細胞表面4SC622についてポジティブに染色したRGC4細胞のパーセントを減少しなかった(図5D)。このことは、このタンパク質が細胞表面に移行中である間に、hFcγRIへの4SC622の結合が生じたことを示唆する。RGC2細胞およびRGC4細胞を混合した場合(図5E)、RGC4細胞から分泌された4SC622タンパク質が、培地中に蓄積し、そしてRGC2細胞のほとんどを結合した。しかしながら、1mg/mlラットIgGの添加は、4SC622を結合したRGC2細胞のパーセントを有意に減少した(図5F)。このことは、ラットIgGが発現細胞から非発現細胞への分泌hIgG1 Fcタグ化タンパク質の移動をブロックしたことを実証する。
【0069】
(実施例2)
細胞表面蛍光は4SC622の発現レベルと相関する:
RGC1細胞(4×106)をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクト体のプールを10%透析ウシ胎児血清、90%無グルタミンダルベッコ改変イーグル培地,1×GS補充,および25μM MSXで構成される培地中での2週間の選択後に得た(全ての試薬はJRH Biosciences,Lenexa,KSから得た)。ラットIgGを、免疫染色の18時間前に1mg/mlまで培養培地に添加した。細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、そして、1.5μg/mlのポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメント(Jackson ImmunoResearch Laboratories)で、室温で1時間、実施例1においてFITC−hFc染色について記載したような手順に従って染色した。次いで、細胞染色をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光の分布は、選択されたプールが広範な4SC622発現レベルを有する細胞を含有することを示唆した(図6)。それらの免疫蛍光に関して上部の3%(R3階層(bracket))、7〜11%(R5階層)、および15〜19%(R7階層)における細胞を、3つの異なるプールに分別し、そして9日間増殖させた。プールについての細胞当たりの平均4SC622産生を、免疫に基づくPandexアッセイ(Idexx;Westbrook,ME)により、製造者の推奨に従って、3日増殖後の培地中の細胞数および4SC622レベルを測定することにより決定した。Pandexアッセイにおいて、ヤギ抗ヒトIgG,γ鎖特異的抗体(Sigma)でコートしたフルオリコンポリスチレンアッセイ粒子を用いて、培地から4SC622を捕捉し、そしてFITC結合体化ヤギ抗ヒトIgG,Fc特異的(Sigma)を用いてビーズ結合4SC622を検出した。既知量の精製4SC622を、較正のためにアッセイ中に含ませた。上部の3%、7〜11%、および15〜19%プール中の細胞はそれぞれ、1.42pg/細胞/日、0.36pg/細胞/日、および0.22pg/細胞/日で4SC622を産生することが見出された。従って、細胞表面4SC622染色と特異的タンパク質産生との間には相関があった。この結果は、高レベルで4SC622を発現する個々の細胞が、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントにより最も明るく染色した細胞を単離することにより、得られ得ることを示唆する。
【0070】
(実施例3)
RGC1における発現クローンの単離:
IL−4トラップ。本発明者らの方法により高レベルの分泌タンパク質産生を伴うクローナル細胞株を生成することにおける効率を直接的に示すために、クローナル4SC622産生細胞株をRGC1から生成した。RGC1細胞(4×106)をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そし25μM MSXを用いて2週間選択し、安定なトランスフェクト体のプールを得た。MSX耐性細胞をプールし、PE−AG184での染色前に、18時間、1mg/ml ヒトIgGとインキュベートした。細胞表面4SC622染色のフローサイトメトリー分析により決定された上部の5%ゲート由来の6つの細胞を、単離し、そして増殖させた。6つのクローナル株からの4SC622産生を決定し、そして選択コロニーのハンドピッキング、次いで希釈クローニングおよび増幅により得られたクローンからの4SC622産生と比較した。1つのRGC1由来クローンRGC4は、12pg/細胞/日で4SC622を産生した(図7)。このレベルは、2,700クローンのハンドピッキングおよび分析により単離された最良の4SC622産生細胞のレベルに類似する。従って、コロニーのハンドピッキングと比較して、本発明において概説された方法は、高い産生細胞のスクリーニングおよびクローニングにおいてずっとより効率的であることがわかる。
【0071】
VEGFトラップ。プラスミドpTE080およびpTE081は、VEGFトラップであるhVEGFR1R2およびhVEGF−R1R3の遺伝子をコードする。hVEGF−R1R2は、hVEGFR1の第一のIgドメインが、hVEGFR2の第二のIgドメインに融合され、次いでhIg1FCドメインに融合されたものからなる、キメラ分子である。hVEGFR1R3は、hVEGFR1の第一のIgドメインが、hVEGFR3の第二のIgドメインに融合され、次いでhIg1FCドメインに融合されたものからなる、キメラ分子である。これらのプラスミドにおいては、VEGFトラップの遺伝子は、CMV−MIEプロモーターによって駆動され、そしてグルタミンシンセターゼミニ遺伝子(これは、MSXに対する耐性を付与する)は、安定な組み込み事象の選択のために発現される。RGC1細胞を、これらのプラスミドのいずれかでトランスフェクトし、そして25μM MSXを含有する培地中で2週間増殖させ、プラスミドが安定に組み込まれた細胞について選択した。MSX耐性細胞を0.1μg/ml Ig2aおよびマウスIgG3と18時間、インキュベートし、その後1.5μg/ml ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色した。細胞を、1時間染色し、次いでPBSで2回洗浄し、その後フローサイトメトリーを行った。シングル細胞を、その蛍光が最も高い1%にある細胞のプールから、96ウェル組織培養プレート中に分別した。個々のウェル中の細胞を増殖し、そしてそれらの産生性をPandexアッセイによって決定した。図7は、hVEGFR1R2およびhVEGFR1R3の両方を発現するRGC由来クローンが、より高い特異的生産性を有し、そして最高に発現するハンドピッキングされたMSX耐性コロニーに比較して、より少ないクローンをスクリーニングすることにより単離されたことを示す。
【0072】
(実施例4)
細胞表面結合hIgG1 Fcタグ化タンパク質は、RGC1によってインターナライズされる:
hFcγRIは、その細胞表面結合リガンドのインターナライゼーションを誘導することが知られている。RGC1細胞が細胞表面結合4SC622をインターナライズできるか否かを分析するために、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、この細胞を、PE−AG184での4SC622免疫染色およびフローサイトメトリー分析のために即時に加工した。細胞の93%が細胞表面4SC622についてポジティブに染色した(図8B)。あるいは、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いでこの細胞を洗浄し、そして4SC622を含まない培養培地中で、PE−AG184とともに、18時間、インキュベートした。4SC622についての免疫染色後のフローサイトメトリー分析は、細胞の9%が、細胞表面上に4SC622を保持することを示した(図8C)。表面結合4SC622の損失をさらに特徴付けるために、精製された4SC622タンパク質をRGC1および親CHO K1細胞の培地に添加し、次いで培地中の4SC622のレベルを経時的に測定した。図9は、2μg/mlまで10cmプレート中の培養培地に添加した4SC622が、3日のインキュベーション後、RGC1馴化培地において、CHO K1コントロールに比較して有意に低かったことを示す。これらの結果は、培養培地中の4SC622の濃度が細胞表面上のhFcγRIの存在によって減少されることを示す。これらの結果は、培地からの4SC622の涸渇が、hFcγRI−4SC622複合体のインターナライゼーションの結果であったことを示唆する。レセプター−リガンド複合体のこのインターナライゼーションは、18時間ブロッキング工程の間IgGのブロッキングの存在下で非発現細胞から全ての4SC622を有効に除去することを容易にし得る。
【0073】
(実施例5)
誘導性hFcγRI発現を有するCHO K1細胞株の構築:
hFcγRIを用いるフローサイトメトリーに基づく自系分泌トラップ法は、高発現クローンの迅速な単離を可能にする。しかし、hFcγRIがFcタグ化タンパク質のターンオーバーを媒介する場合、操作されたhFcγRI発現細胞による分泌タンパク質の実現産生は、hFcγRI発現が産生期の間に阻害され得る場合により高い。このために、hFcγRIの発現がテトラサイクリンまたはアナログのドキシサイクリンによって誘導されるCHO K1細胞株を構築した。この系において、まず、CHO K1細胞を、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)を発現するように操作し、そしてhFcγRIを、その活性がTetRによって調節されるプロモーターの転写制御下に配置した。2つの直列のTetRオペレーター(TetO)をpTE084においてCMV−MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置し、pTE158を生成した(図10)。pTE158におけるCMV−MIEプロモーターからのhFcγRIの転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の適切なインデューサーの不在下でTetRによってブロックされた。インデューサーの存在下では、TetRタンパク質は、TetOに結合し得ず、hFcγRIの転写が生じる。
【0074】
CHO K1細胞をpcDNA6/TRでトランスフェクトした。pcDNA6/TRは、ブラスチシジン(blasticidin)に対する耐性を付与するプラスミドであって、ここでは、TetRの発現がCMV−MIEプロモーターから生じる(Invitrogen;Carlsbad,CA)。2.5μg/mlブラスチシジン(Invitrogen)での選択の二週間後、安定なトランスフェクト体をプールした。次いで、このプールをpTE158でトランスフェクトした。pTE158は、G418に対する耐性を付与するプラスミドであって、ここでは、hFcγRIの発現がCMV−MIE/TetOハイブリッドプロモーターに依存する。pcDNA6/TRおよびpTE158で続けてトランスフェクトした細胞を、400μg/ml G418および2.5μg/mlブラスチシジンで12日間選択し、次いでプールした。このプールを、1μg/mlドキシサイクリンの添加により2日間誘導し、次いでFITC−hFcで染色し、hFcγRIを発現する細胞を同定した。hFcγRIを発現する細胞の上部の5%をプールとして採集し、ドキシサイクリンの不在下で6日間増殖させ、そしてhFcγRIの存在についてFITC−hFcで再度染色した。hFcγRIについて染色しなかった細胞を採集し、3日間、1μg/mlのドキシサイクリンを含有する培養培地中で増殖させた。次いで、このプールをhFcγRIの存在について染色し、そしてフローサイトメトリーによって単離した。最も高いレベルのhFcγRIを発現した細胞(上部の1%)を1ウェルあたり1細胞で96ウェルプレート上に分別した。これらの細胞は、おそらく、低い非誘導発現レベルのFcR1および高い誘導レベルのFcR1を有する細胞を含んだ。発現後、20クローン中のドキシサイクリンによるhFcγRIの誘導を、FITC−hFcでの免疫染色およびフローサイトメトリーにより確認した。1つのクローンを、さらなる特徴づけのために選択し、そしてこれをRGC10と名付けた。図11は、RGC10が、ドキシサイクリンの不在下では、検出可能なレベルのhFcγRIを発現しなかったが、1μg/mlのドキシサイクリンで3日間誘導した細胞においては、高レベルのhFcγRIが観察されたことを示す。RGC10細胞の平均蛍光は、ドキシサイクリンによる誘導後、1000倍より多く増大した。
【0075】
(実施例6)
RGC10からの4SC622産生細胞株の単離:
RGC10細胞をpEE14.1−622でトランスフェクトし、そしてMSX耐性細胞を、25μM MSXでの2週間の選択後プールした。hFcγRIの発現を、培養培地への1μg/mlのドキシサイクリンの3日間の添加により誘導した。1mg/mlラットIgGを、ドキシサイクリンを含有する培養培地に添加し、18時間後に、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。最も高いレベルの4SC622を発現した細胞(上部の1%)を、1ウェルあたり1細胞で96ウェルプレート中に分別した(図12C)。図12Bは、ドキシサイクリンによるhFcγRI発現の誘導なしでは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色は、細胞表面結合4SC622を検出できないことを示す。60クローンを、ドキシサイクリンの不在下で増殖させた。図13は、Pandexアッセイにより決定されたような13の最も高い産生細胞の特異的生産性を示す。クローン1C2の特異的生産性は、17.8pg/細胞/日であり、未調節のhFcγRI細胞株RGC1を用いて以前に単離された最良の4SC622細胞株について観察された12pg/細胞/日よりも有意に良好であった。
【0076】
(実施例7)
Sp2/0骨髄腫細胞は、細胞表面捕捉タンパク質を発現するように操作され得る:
本実施例では、Sp2/0−Agl4骨髄腫細胞株を、hFcγRIを安定に発現するように操作し、自系分泌トラップ法がCHO以外の細胞株に適用可能であることを実証した。hFcγRIの遺伝子をレトロウイルス感染により骨髄腫細胞に導入した。プラスミドpLXRN(Clontech;Palo Alto,CA)(これは、目的の遺伝子が上流Moloneyマウス肉腫ウイルス長末端反復(MoMuSV LTR)プロモーターから発現され得るレトロウイルスDNAベクターである)を用いて、hFcγRI遺伝子をコードするレトロウイルスを生成した。ヒトFcγRI遺伝子をコードする、pTE084由来の1,363bp XhoIフラグメントを、pLXRNのXhoI部位にクローニングした。hFcγRI cDNA発現がMoMuSV LTRに依存するプラスミドを選択し、そしてpTE255と名付けた(図14)。
【0077】
hFcγRIの発現のための汎親和性レトロウイルスを、製造者の指針に本質的に従って生成した。パッケージング細胞株GP−293(ウイルスgagタンパク質およびpolタンパク質を安定に発現するHEK293ベースの細胞株)(Clontech;Palo Alto,CA)を、各々10μgのpVSV−GおよびpTE255で同時トランスフェクトした。プラスミドpVSV−Gは、感染性粒子に対して広い宿主範囲を付与するウイルスエンベロープタンパク質VSV−Gの発現を可能にする。
【0078】
(Sp2−hFcγRI−4の構築)
汎親和性hFcγRIレトロウイルスを使用して、1×107のSp2/0−Ag14骨髄腫細胞(American Type Culture Collection;Manassas、VA)を、1細胞当たり約10の多重度の感染性粒子で感染させた。感染の3日後に、細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーで分析する前に、PBSで2回洗浄した。結合したFITC−hFcによって示されるようなhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによって、プールとして収集した。このプールを13日間増殖させ、次いでFITC−hFcで再び染色し、そしてhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによってプールとして収集した。これらの分別された細胞を10%ウシ胎仔血清、4.5g/l グルコースおよび4mM グルタミンを含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(D−MEM)中で3週間培養し、FITC−hFcで染色し、そして集団中の上位1%の平均蛍光を有する細胞を、単一細胞分別によってクローン化した。増殖後、24個のクローンをhFcγRIの発現についてフローサイトメトリーによって上記のように試験し、1つのクローン(Sp2−hFcγRI−4)を、さらなる特徴付けのために選択した(図15)。
【0079】
(4SC622タンパク質を発現するSp2−hFcγRI−4細胞の単離)
Sp2−hFcγRI−4細胞(1×107)を、pTE209(このプラスミドは、CMV−MIEプロモーターからの4SC622タンパク質の構成的発現を可能にし、そしてハイグロマイシンに対する耐性を付与する)でトランスフェクトした(図16)。トランスフェクトした細胞を、10%FCS、90%D−MEMおよび400μg/mlのハイグロマイシンを含有する培地中に14日間配置した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色の前に、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベートした。細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前に、PBSで2回洗浄した。標識細胞を、上記のように、フローサイトメトリーによってプールとして収集し、次いで5日間培養しそして分別した。次いで、最もFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントと結合した、増殖したプール由来の細胞(上位1%集団)を、単一細胞分別によってクローン化した(図17)。10個のクローンからの4SC622の産生を、ELISAによって分析し、そして10個全てのクローンが4SC622を発現することが見出された:クローン5H11は、1日当たり、0.5pg/細胞の4SC622を産生した。これらのデータは、4SC622を分泌するクローンが、自系分泌トラップ法によって、pTE209を用いたSp2−hFcγRI−4細胞の安定なトランスフェクションに由来する細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを示した。
【0080】
4SC622が、4SC622およびhFcγRIの両方を発現する骨髄腫細胞の表面上に自系的に提示されたことを確認するために、クローン5H11を、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベーションし、次いでFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色して、細胞表面4SC622を提示することを見出した。分泌タンパク質を、栄養共生がウサギIgGによってブロックされる条件下でディスプレイさせ、4SC622の自系ディスプレイを実証した。これらのデータは、上記の自系分泌トラップ法が、CHO細胞に限定されず、骨髄腫および他の細胞型にも同様に拡大され得ることを実証した。
【0081】
(実施例8)
プロテインGキメラタンパク質は、細胞表面捕捉タンパク質として機能し得る。
【0082】
hFcγRI以外の細胞表面捕捉タンパク質に対する自系分泌トラップ法の適用を実証するために、プロテインG発現細胞株を構築した。Streptococcus株G418由来のプロテインGは、全てのヒトおよびマウスのIgGサブクラスに結合し、そして抗体またはIgG Fc融合タンパク質を発現する組換え細胞の単離について有用性を有する。プロテインG IgG Fc結合ドメインが、全てのヒトおよびマウスのIgGサブクラスに結合し得る細胞表面捕捉タンパク質として使用され得ることを実証するために、本発明者らは、hFcγRIの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合したプロテインGのFc結合ドメインからなるキメラタンパク質を発現するCHO株を構築した(図18)。プロテインGのFc結合ドメインは、3個の55アミノ酸長の相同反復を含み(Gussら(1986)EMBO 5:1567およびSjobringら(1991)J.Biol.Chem.266:399)、そして各反復は、1つのIgG Fcを結合し得る。CHO細胞におけるこのキメラタンパク質の発現を改善するために、本発明者らは、マウスROR1遺伝子由来のシグナル配列が、プロテインG(登録番号X06173)のFc結合ドメイン(アミノ酸303〜497)に融合された合成DNAを構築した。この合成DNAを、オリゴヌクレオチドアニーリング、ギャップフィリングおよびPCR増幅の組み合わせによって作製した。次いで、この合成DNAを、PCRによって、hFcγRI(登録番号M21091)の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン(アミノ酸279〜374)をコードするDNAに融合させた。プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質をコードする得られたDNAを、CMV−MIEプロモーターの下流で、hFcγRIをコードする遺伝子を置換して、pTE158中にクローニングし、プラスミドpTE300を得た(図19)。
【0083】
無血清培地中での増殖のために適合されたCHO K1細胞株であるRGC14を、pTE300でトランスフェクトし、3日後に400μg/mlのG418を培養培地に添加して、pTE300の安定な組込みについて選択した。選択開始の2週間後、細胞をFITC−hFcで染色して、hFcγRIを発現する細胞を同定した。これらの細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、そしてhFcγRI発現細胞をプールとして収集した(図20)。細胞を10日間増殖させ、そしてhFcγRI発現細胞集団を、フローサイトメトリーによって再び単離した。細胞を再び増殖させ、FITC−hFcで染色し、高レベルのプロテインG/hFcγRIキメラタンパク質を発現する単一細胞を、フローサイトメトリーによって単離した。FITC−hFc結合についてポジティブに染色された単一細胞を、10%ウシ胎仔血清、90%Ham’s F12および400μg/mlのG418からなる培地中に分別した。2週間のインキュベーション後、48個のクローンを、培養培地中に存在するウシIgGに対する結合について、FITC結合体化抗ウシIgG F(ab’)2フラグメント(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA)で染色することによって試験した。この抗体によってポジティブに染色された1つのクローン(RGC18)を、さらなる特徴付けのために選択した。
【0084】
(RGC18における発現クローンの単離)
RGC18細胞(6×106)を、pTE209でトランスフェクトし、そして400μg/mlのハイグロマイシン中で18日間増殖させることによって、プラスミドの組込みについて選択した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントでの染色の前に、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベートした。細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前にPBSで2回洗浄した(図21)。最も蛍光の細胞(上位5%)を、単一細胞分別によって単離し、そして3週間増殖させた。10個のクローンを、4SC622分泌について試験した。試験した全てのクローンが、高レベルで4SC622を分泌し、そして最良のクローン(RGC19)は、一日当たり6.4pg/細胞の特異的生産性を有した。この結果は、4SC622発現細胞が、自系分泌トラップ法によって、pTE209でのRGC18の安定なトランスフェクション由来の細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを実証した。さらに、これらのデータは、プロテインGのフラグメントが、シグナル配列および膜貫通ドメインを含むように操作され得、そして細胞表面捕捉タンパク質として機能し得ることを明らかに実証した。
【0085】
4SC622が、プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質および4SC622を共に発現するRGC19細胞の表面上に、自系的にディスプレイされることを確認するために、RGC19を、1mg/mlのウサギIgGと共に18時間インキュベートし、次いでFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。RGC19細胞は、栄養共生がウサギIgGによってブロックされる条件下で、細胞表面4SC622を保有することが見出されており、このことは、4SC622の自系的ディスプレイを示唆する(図22)。ウサギIgGは、RGC18細胞に対する外因性4SC622タンパク質の結合を効果的にブロックしたが、4SC622発現細胞の細胞表面上の4SC622のディスプレイをブロックしなかった。これらのデータは、プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質の特性が、細胞表面捕捉タンパク質としてのhFcγRIの特性と類似することを実証し、そして自系分泌トラップ法が、細胞表面捕捉タンパク質として他のタンパク質を使用し得ることを示唆した。
【0086】
(実施例9)
(RGC10からの抗体産生細胞の単離)
組換え抗体を発現するCHO細胞の単離についての自系分泌トラップ法の有用性を実証するために、本発明者らは、KD5ハイブリドーマ由来の可変領域軽鎖遺伝子および可変領域重鎖遺伝子をコードするDNAをクローニングした。KD5は、ヒトTie−2レセプターに特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。
【0087】
マウスIgGの定常領域の遺伝子配列は、500ngのマウス脾臓ポリA+RNA(Clontech、Palo Alto、CA)からクローニングした。一本鎖cDNAを、RT−PCRのためにSuperScript First−Strand Synthesis Systemを使用して、50ngのランダムヘキサマー(Invitrogen Life Technolgies、Carisbad、CA)でプライムして合成した。マウスκ軽鎖定常領域DNA配列(登録番号Z37499)を、プライマー5’mCLK1(Z37499)(5’−CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC−3’)および3’mCLK1(Z37499)(5’−ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG−3’)を使用するPCRによって、このcDNAから増幅した。マウスIgG2a定常領域DNA配列(登録番号AJ294738)もまた、プライマー5’mCH2a(AJ294738)(5’−GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCAC−3’)および3’mCH2a(AJ294738)(5’−TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTCG−3’)を使用するPCRによって、このcDNAから増幅した。PCR産物を、TOPO TA Cloning kit(Invitrogen Life Technologies、Carisbad、CA)を使用して、pCR2.1−TOPO中にクローニングし、そしてこの定常領域の配列を確認した。
【0088】
KD5可変領域遺伝子を、KD5ハイブリドーマmRNAからRT−PCRによって増幅し、そしてAmersham−Pharmacia Biotech(Piscataway、NJ)の重鎖および軽鎖可変領域プライマー混合物を使用して、pCR2.1−TOPO中にクローニングした。可変重鎖遺伝子を、プライマー5’BspMI/KD5VH N−term(5’−GAGAGTACCTGCGTCATGCAGATGTGAAACTGCAGGAGTCTGGCCCT−3’)および3’BspMI/KD5VH C−term(5’−GAGAGACCTGCGTCAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT−3’)と共にテンプレートとしてpCR2.1−TOPOにクローニングされた可変領域を使用するしてPCR増幅し、BspMIで消化し、そしてBsaI消化した、プライマー5’BsaI/CH2a N−term(5’−GAGAGGGTCTCACAGCCAAAACAACAGCCCCATCG−3’)および3’BsaI/CH2a C−term(5’−GAGAGGGTCTCCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAA−3’)を用いて増幅したIgG2a定常重鎖遺伝子PCRフラグメントに連結した。次いで、このフラグメントを、pRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE317は、CMV−MIEプロモーター由来のmROR1シグナル配列に融合した、KD5組換え重鎖遺伝子を発現し得た。可変軽鎖遺伝子を、プライマー5’BsmBI/KD5VL N−term(5’−GAGAGCGTCTCATGCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA−3’)および3’BsmBI/KD5VL C−term(5’−GAGAGCGTCTCACAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC−3’)と共にテンプレートとしてpCR2.1−TOPOにクローニングされた可変領域を使用してPCR増幅し、BsmBIで消化し、そしてBsaI消化した、プライマー5’BsaI/CLK N−term(5’−GAGAGGGTCTCAGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC−3’)および3’BsaI/CLK C−term(5’−GAGAGGGTCTCAGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTGAC−3’)で増幅したκ定常軽鎖遺伝子PCRフラグメントに連結した。次いで、このフラグメントを、pRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE316は、CMV−MIEプロモーターから、mROR1シグナル配列に融合した、KD5組換え軽鎖遺伝子を発現し得た。
【0089】
KD5重鎖遺伝子をコードする、pTE317由来の1450bpのEcoRI−NotIフラグメントを、pRG980(これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与し、そしてUbCプロモーターについての組換え遺伝子の発現を可能にするベクターである)のEcoRI部位およびNotI部位にクローニングして、プラスミドpTE322を得た。同様に、KD5軽鎖遺伝子をコードする、pTE316由来の750bpのEcoRI−NotIフラグメントを、pRG985(これは、プロマイシンに対する耐性を付与し、そしてUbCプロモーターについての組換え遺伝子の発現を可能にするベクターである)のEcoRI部位およびNotI部位にクローニングして、プラスミドpTE324を得た。
【0090】
RGC10細胞(5×106)を、3μgのpTE322および3μgのpTE322でトランスフェクトし、そして20μgのプロマイシンおよび400μg/mlのハイグロマイシンを含む、10%ウシ胎仔血清を補充したF12培地中で14日間増殖させることによって、プラスミドの組込みについて選択した。hFcγRIの発現を、培養培地中に1μg/mlのドキシサイクリンを添加することによって、3日間誘導した。二重耐性細胞を、ヤギポリクローナルFITC結合体化抗マウスIgG(Fcγ)F(ab’)2フラグメント(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA)での染色の前に、1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートした。細胞を1時間染色し、次いでフローサイトメトリーで分析する前に、PBSで2回洗浄した。最も蛍光の細胞(上位5%)を、プールとして単離し、そして10日間増殖させ、その後、このプロトコルを繰り返したが、上位1%の最も蛍光の細胞を、プールとして単離した。このプールを10日間増殖させ、次いで上位0.1%の最も蛍光の細胞を、96ウェルプレート中に、単一細胞として単離した。クローンを、抗体発現についてELISAによって分析し、そして7個のクローンを、分析した53個のクローンから選択した。これらのクローンの平均特異的生産性は、35pg/細胞/日であり、最良のクローンは、54pg/細胞/日で組換えKD5モノクローナル抗体を発現した。
【0091】
上記発明は、例示および例によっていくらか詳細に記載されてきたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神からも範囲からも逸脱することなく、本発明の教示に対してなされ得ることが、当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1】図1は、上流CMV−MIEプロモーターからのヒトFcγRIの構成的発現のために設計された、pTE084の構築を示す。
【図2】図2Aは、非染色CHO K1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図2Bは、FITC−hFc染色CHO K1のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図2Cは、pTE084トランスフェクション後のFITC−hFc染色G418耐性CHO K1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図2Dは、FITC−hFc染色RGC3細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。
【図3】図3は、4SC622がRGC1細胞に結合するのをブロックするための、種々の動物種由来のIgGの能力をまとめる。
【図4】図4Aは、非染色RGC1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図4Bは、PE−AG184結合により示される、FcγR1発現RGC1細胞への4SC622結合のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図4Cは、PE−AG184結合の喪失により示される、RGC1細胞への4SC622の結合をブロックするラットIgGのフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。
【図5】図5Aは、PE−AG184で染色された、hFcγRI遺伝子およびGFP遺伝子を発現するRGC2細胞のフローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図5Bは、PE−AG184で染色される前に1μg/ml 4SC622とともに18時間インキュベートされた、hFcγRI遺伝子およびGFP遺伝子を発現するRGC2細胞のフローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図5Cは、PE−AG184で染色された、hFcγRI遺伝子およびGFP遺伝子を発現するRGC4細胞のフローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図5Dは、PE−AG184で染色される前に18時間ラットIgG(1mg/ml)とともにインキュベートされた、hFcγRI遺伝子および4SC622遺伝子を発現するRGC4細胞のフローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図5Eは、PE−AG184で染色される前に混合されそして一緒に18時間インキュベートされた、hFcγRI遺伝子およびGFP遺伝子を発現するRGC2細胞と、hFcγRI遺伝子および4SC622遺伝子を発現するRGC4細胞との混合物の、フローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図5Fは、PE−AG184で染色される前に混合されそして一緒に18時間1mg/mlのラットIgGとともにインキュベートされた、hFcγRI遺伝子およびGFP遺伝子を発現するRGC2細胞と、hFcγRI遺伝子および4SC622遺伝子を発現するRGC4細胞との混合物の、フローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。
【図6】図6は、pEE14.1−622でトランスフェクトされたRGC1細胞のMSX耐性プールのフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。トップ3%ゲート(R3)の細胞、7〜11%ゲート(R5)の細胞、および15〜19%ゲート(R7)の細胞を、収集し、増殖させ、そしてその4SC622の生産性を免疫染色により定量した。
【図7】4SC622発現細胞株である、pEE14.1−622で一過性トランスフェクトされたCHO K1、pEE14.1−622でトランスフェクトされたCHO K1の選択された安定なMSX耐性クローン、およびpEE14.1−622でのRGC1細胞のトランスフェクション後のMSX耐性4SC622産生クローンの比生産性の比較をまとめる。
【図8】図8Aは、PE−AG184で染色されたRGC1細胞のフローサイトメトリーの2パラメータヒストグラムを示す。図8Bは、PE−AG184で染色する前に1時間1μg/ml 4SC622とともにインキュベートされた、RGC1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図8Cは、PE−AG184で染色する前に1時間1μg/mlの4SC622とともにインキュベートされその後18時間、4SC622を含まない培地中でインキュベートされたRGC1細胞の、フローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。
【図9】培養培地からの4SC622の損失を生じるhFcγRI遺伝子の発現を示す。RGC1細胞またはCHO K1親細胞が、2μg/ml 4SC622を含む培地中でインキュベートされた。その培地中に残る4SC622の濃度が、24時間インキュベーションおよび72時間インキュベーションの後に、免疫染色により定量された。
【図10】ヒトFcγRIのTetR調節発現を可能にするように設計された、pTE158の構築を示す。tetオペレーター配列(TetO)の2回反復が、pTE158中のCMVプロモーターのすぐ下流に存在する。
【図11】図11Aは、FITC−hFcで染色したCHO K1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図11Bは、FITCで染色されたRGC10細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図11Cは、FITC−hFcで染色される前に3日間1μg/mlドキシサイクリンで誘導された、RGC10細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。
【図12】図12Aは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色された、CHO K1細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図12Bは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色される前に、pEE14.1−622でトランスフェクトされそして18時間ラットIgG(1mg/ml)とともにインキュベートされた、MSX耐性RGC10細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。図12Cは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色される前に、1μg/mlドキシサイクリンで3日間誘導されその後ラットIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートされた、MSX耐性RGC10細胞のフローサイトメトリーの1パラメータヒストグラムを示す。
【図13】図13は、pEE14.1−622細胞でトランスフェクトされたRGC10細胞の、安定なMSX耐性クローンの比生産性をまとめる。
【図14】図14は、上流MoMuSV LTRプロモーターからのヒトFcγRIの構成的発現のために設計された、pTE255の構築を示す。
【図15】図15Aは、染色していないSp2/0細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図15Bは、Cy5−hFc染色したSp2/0細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図15Cは、染色していないSp2/0−FcR−4細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図15Dは、Cy5−hFc染色したSp2/0−FcR−4細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図16】図16は、上流のCMV MIEプロモーターからの4SC622の構成的発現のために設計されたpTE209の構造を示す。
【図17】図17Aは、pTE209でトランスフェクトした、染色していないハイグロマイシンB耐性Sp2/0−FcR−4細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図17Bは、pTE209でトランスフェクトし、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、ウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした、ハイグロマイシンB耐性Sp2/0−FcR−4細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図17Cは、図4Bにおける上位1%の最も蛍光性の細胞から増殖した、染色していない細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図17Dは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、ウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした、図4Bにおける上位1%の最も蛍光性の細胞から増殖した細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図17Eは、染色していないクローン5H11細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。図17Fは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、ウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした、クローン5H11細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図18】図18は、pTE300においてコードされた、プロテインGおよびプロテインG/hFcγRI融合タンパク質のドメインの模式図を示す。
【図19】図19は、上流のCMV MIEプロモーターからの、RORIシグナル配列、プロテインGのFc結合ドメイン、ならびにhFcγRIの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、キメラタンパク質の発現のために設計されたpTE300の構築の概要である。
【図20A】図20Aは、染色していないRGC14細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図20B】図20Bは、FITC−hFc染色したRGC14細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図20C】図20Cは、pTE300でトランスフェクトした、染色していないG418耐性RGC14細胞プールのフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図20D】図20Dは、pTE300でトランスフェクトした、FITC−hFc染色したG418耐性RGC14細胞プールのフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図20E】図20Eは、染色していないRGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図20F】図20Fは、ポリクローナルFITC結合体化抗ウシIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、10%ウシ胎仔血清とともに2時間インキュベートした、RGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図21A】図21Aは、pTE209でのトランスフェクション後の、RGC18由来の、染色していないハイグロマイシンB耐性細胞プールのフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図21B】図21Bは、pTE209でトランスフェクションし、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、ウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした後の、RGC18細胞由来のハイグロマイシンB耐性細胞プールのフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22A】図22Aは、染色していないRGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22B】図22Bは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、4SC622(1μg/ml)とともに1時間インキュベートした、RGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22C】図22Cは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、4SC622(1μg/ml)およびウサギIgG(1mg/ml)とともに1時間インキュベートした、RGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22D】図22Dは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、4SC622(1μg/ml)とともに18時間インキュベートした、RGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22E】図22Eは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、4SC622(1μg/ml)とともに2時間インキュベートし、その後4SC622(1μg/ml)およびウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした、RGC18細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22F】図22Fは、pTE209でのトランスフェクションによるRGC18細胞に由来する、染色していないRGC19細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22G】図22Gは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色したRGC19細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
【図22H】図22Hは、ポリクローナルFITC結合体化抗ヒトIgG(H+L)F(ab’)2フラグメントで染色する前に、ウサギIgG(1mg/ml)とともに18時間インキュベートした、RGC19細胞のフローサイトメトリーの1パラメーターヒストグラムを示す。
Claims (86)
- 任意の目的の分泌タンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)該POIに結合する細胞表面捕捉分子を一過的もしくは安定的に発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)POIをコードする第二の核酸を用いて、該細胞を同時もしくは連続的にトランスフェクトする工程であって、ここで、このようなPOIは分泌される、工程;
c)該POIに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたPOIを検出する工程;
d)該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質または増殖因子である、請求項1に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、抗体、Fab、単鎖抗体(ScFv)、これらのフラグメント、または抗体定常領域と融合した全てのものである、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖因子が、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(CNTF)、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン−γ、GM−CSF、TGFβ、TNFレセプター、融合タンパク質、および動物細胞において作製される全ての認可された治療剤からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体が、IgM、IgG、IgA、IgDまたはIgE、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記POIをコードする核酸が、DNAライブラリーから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ScFv、これらのフラグメント、抗体定常領域と融合した全てのもの、ならびにファージディスプレイまたはペプチドライブラリー由来のペプチドおよび前記POIに結合する誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、Ang1、And2、VEGF、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、CNTF、CNTFR−α、サイトカインレセプター成分、2つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物、またはこれらの任意のフラグメントである、請求項7に記載の方法。
- 前記抗体結合タンパク質が、Fcレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンScFv、プロテインA、プロテインL、プロテインG、プロテインHまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項7に記載の方法。
- タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項7に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはGPI連結である、請求項10に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項10に記載の方法。
- シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項7に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項13に記載の方法。
- 請求項1の工程(d)に記載の単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体産生細胞が、B細胞またはその誘導体である、請求項15に記載の方法。
- 前記B細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された2つの分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子またはPOIに結合するブロッキング分子が、隣接細胞に対する該POIの結合を減少させるために添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散、および該POIの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
- 請求項1に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
- 任意の目的の分泌タンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)該POIに結合する細胞表面捕捉分子を一過的もしくは安定的に発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)該細胞表面捕捉分子を発現する、工程(a)由来の細胞を検出する工程;
c)工程(b)において検出された細胞を、単離および培養する工程;
d)POIをコードする第二の核酸を用いて、工程(c)の細胞を同時もしくは連続的にトランスフェクトする工程であって、ここで、このようなPOIは分泌される、工程;
e)該POIに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたPOIを検出する工程;
f)該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質または増殖因子である、請求項23に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、抗体、ScFv、これらのフラグメント、または抗体定常領域と融合した全てのものである、請求項23に記載の方法。
- 前記増殖因子が、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(CNTF)、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン−γ、GM−CSF、TGFβ、TNFレセプター、融合タンパク質、および動物細胞において作製される全ての認可された治療剤からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記抗体が、IgM、IgG、IgA、IgDまたはIgE、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記POIをコードする核酸が、DNAライブラリーから選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ScFv、これらのフラグメント、抗体定常領域と融合した全てのもの、ならびにファージディスプレイまたはペプチドライブラリー由来のペプチドおよび前記POIに結合する誘導体である、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、サイトカインレセプター成分または2つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体結合タンパク質が、Fcレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンScFv、プロテインA、プロテインL、プロテインG、プロテインHまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項29に記載の方法。
- タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項29に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはGPI連結である、請求項32に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項32に記載の方法。
- シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項29に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項35に記載の方法。
- 工程(f)における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗体産生細胞が、B細胞またはその誘導体である、請求項37に記載の方法。
- 前記B細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項38に記載の方法。
- 前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された2つの分子である、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散を減少させるために添加される、請求項23に記載の方法。
- 前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散、および該POIの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項23に記載の方法。
- 請求項23に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
- 請求項23に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
- POIを産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)該細胞表面捕捉分子を高収量で発現する細胞を検出する工程;
b)工程(a)で検出された細胞を単離および培養する工程;
c)工程(b)の細胞を、POIをコードする核酸を用いてトランスフェクトする工程であって、このようなPOIは分泌される、工程;
d)該POIに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたPOIを検出する工程;
e)該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質、増殖因子または抗体である、請求項45に記載の方法。
- 前記増殖因子が、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(CNTF)、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン−γ、GM−CSFおよびTGFβからなる群より選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記抗体が、IgM、IgG、IgA、IgDまたはIgE、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記POIをコードする核酸が、DNAライブラリーから選択される、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンドまたは抗体結合タンパク質である、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、サイトカインレセプター成分または2つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項50に記載の方法。
- 前記抗体結合タンパク質が、Fcレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンScFv、プロテインA、プロテインL、プロテインG、プロテインHまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項50に記載の方法。
- タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項45に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはGPI連結である、請求項53に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項53に記載の方法。
- シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項50に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項56に記載の方法。
- 工程(f)における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項45に記載の方法。
- 前記抗体産生細胞が、B細胞またはその誘導体である、請求項58に記載の方法。
- 前記B細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項59に記載の方法。
- 前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された2つの分子である、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散を減少させるために添加される、請求項45に記載の方法。
- 前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散、および該POIの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項45に記載の方法。
- 請求項45に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
- 請求項45に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
- 高レベルのPOIを産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程;
a)該POIに結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程;
b)該細胞表面捕捉分子を高収量で発現する、工程(a)由来の細胞を検出する工程;
c)工程(b)で検出された細胞を単離および培養し、そして該細胞が該POIを分泌するのに十分な時間放置する工程;
d)検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたPOIを検出する工程であって、1以上の該検出分子は、該POIに結合する、工程;
e)該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質、増殖因子または抗体である、請求項66に記載の方法。
- 前記増殖因子が、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、繊毛神経栄養因子(CNTF)、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン1、アンギオポイエチン2、TNF、インターフェロン−γ、GM−CSFおよびTGFβからなる群より選択される、請求項67に記載の方法。
- 前記抗体が、IgM、IgG、IgA、IgDまたはIgE、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項67に記載の方法。
- 前記POIをコードする核酸が、DNAライブラリーから選択される、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンドまたは抗体結合タンパク質である、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子が、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1)、サイトカインレセプター成分または2つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項71に記載の方法。
- 前記抗体結合タンパク質が、Fcレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンScFv、プロテインA、プロテインL、プロテインG、プロテインHまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項71に記載の方法。
- タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項71に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはGPI連結である、請求項74に記載の方法。
- 前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項74に記載の方法。
- シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項71に記載の方法。
- 前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項77に記載の方法。
- 工程(f)における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項66に記載の方法。
- 前記抗体産生細胞が、B細胞またはその誘導体である、請求項79に記載の方法。
- 前記B細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項66に記載の方法。
- 前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された2つの分子である、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散を減少させるために添加される、請求項66に記載の方法。
- 前記発現細胞から隣接細胞への前記POIの拡散、および該POIの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項66に記載の方法。
- 請求項66に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
- 請求項66に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
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