【０００１】
本出願は、引用によりその全容を組み込む２００１年９月２９日に出願された仮特許出願出願番号第６０／２３６，８８７号から、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基き優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、および子宮平滑筋腫の形成を予防する方法、Ｃｙｒ６１遺伝子の誘導を刺激する化合物および組成物ならびにＣｙｒ６１の活性を増す化合物に関する。本発明は、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現を調節するリガンドをスクリーニングする方法にも関する。本発明はさらに、Ｃｙｒ６１の発現のダウンレギュレーションに伴う子宮筋腫を有する患者の診断法に関する。本発明は、それらに関連する抗体および医薬組成物をも開示する。トランスジェニック動物も、本発明により企図される。
【０００３】
（発明の背景）
子宮平滑筋腫、または類繊維腫は、３０−５５歳の年齢にある女性を苦しめる生殖系の最も一般的な腫瘍である。平滑筋腫の病因および病原メカニズムに関してはほとんど知られていない。子宮平滑筋腫は、典型的には、子宮筋層の平滑筋組織の良性腫瘍と定義されている。平滑筋腫細胞は、加速した増殖（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の結果として高まった有糸分裂活性を示す、子宮筋層中の脱分化した平滑筋細胞から生じると考えられている（Ｒｅｉｎ ａｎｄ Ｎｏｗａｋ， Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １９９２， １０： ３１０−３１９）。良性疾患と考えられているが、子宮平滑筋腫は、合衆国で行われた全子宮摘出の３０％以上の原因であり、女性の間に大きな健康上の重要性を提示する（Ｃｒａｍｅｒ， Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １９９２， １０： ３２０−３２４）。
【０００４】
発生、細胞増殖、および腫瘍形成において役割を果たす成長因子調節前初期遺伝子の新たな群は、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ／Ｃｙｒ６１／Ｃｅｆ１０／ＮＯＶＨ）ファミリーに属する。全ＣＣＮタンパク質は、（１）ファミリーのメンバーの間で、および種を超えて、高い程度の保存を示し、（２）システインに富み、そして細胞外マトリックス関連分子に構造上類似し、（３）多機能分子ドメインから成り、および（４）細胞接着、細胞移動、有糸分裂誘発、細胞の生存および分化などの様々な細胞機能を媒介することが示されている（Ｌａｗ ａｎｄ Ｌａｍ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， １９９９， ２４８：４４）。
【０００５】
Ｃｙｒ６１は、細胞表面および細胞外マトリックスに結合する、分泌性の、システインに富むヘパリン結合ＣＣＮタンパク質である。詳細には、Ｃｙｒ６１は脈管形成および軟骨形成を含む、発生において調節されるプロセスに関与していることが知られている。Ｃｙｒ６１タンパク質は、Ｗｎｔ−１タンパク質および他の成長因子に似た多くの生化学的特徴を有する（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｌａｗ， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆ， １９９１， ２：３５１）。ヒトのＣｙｒ６１タンパク質は、３８１アミノ酸長であり、約４２キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。図１およびＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３３９９５０号を参照されたい。ヒトのＣｙｒ６１遺伝子は、染色体１の短腕（ｌｐ２２−３１）に位置しており（Ｃｈａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９９１， ８：２３； Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９９７， １４： １７５３）、そして、該遺伝子は血清刺激したＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングにより同定された（図２およびＬａｗ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． １９８７， ８４： １１８２を参照されたい）。ヒトおよびネズミのＣｙｒ６１配列の比較により、それらが９１％類似していることが示されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３９９５０号）。Ｃｙｒ６１タンパク質の発現が、ステージＩＩの浸潤性乳管癌においてアップレギュレートされることが既に示されている（２０００年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／２１３，１８２号）。
【０００６】
インテグリンは、二価のカチオンの存在下で非共有結合するα：βヘテロダイマーの膜貫通レセプターである。全てではないがいくつかのインテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質のサブセットに存在する標準的なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）結合モチーフの認識を通じて接着性リガンドと相互作用し、そして、成長因子またはサイトカインと共通するシグナリング経路を開始することができる。ＲＧＤモチーフを欠くＣｙｒ６１は、２つのインテグリン：αｖβ３およびαＩＩｂβ３に対して直接結合することが示されている（Ｋｉｒｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ２７３： ３０９０； Ｂａｂｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９９， １９： ２９５８； Ｊｅｄｓａｄａｙａｎｍａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ２７４： ２４３２１）。インテグリンαＶβ３は、インビボでの脈管形成に直接関与していること、および腫瘍の転移を調節することが示されている。それゆえ、脈管形成因子としてのＣｙｒ６１の効果が一部、αｖβ３により媒介されることが提案される。近年の研究により、ヒトの血小板がαＩＩｂβ３による活性化依存様式にてＣｙｒ６１に結合することが示されている（Ｊｅｄｓａｄａｙａｎｍａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ネズミのＣｙｒ６１も、繊維芽細胞で主として発現されるインテグリンであるα６β１、およびヘパリンスルフェートプロテオグリカンに、コ−レセプター様式で結合することが知られている（Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００， ２７５： ２４９５３）。両レセプターに対する結合は、インビトロでの繊維芽細胞の接着に重要である。突然変異誘発試験により、Ｃ−末端ドメイン（ａ．ａ２５０−３５４）がα６β１に結合するのに必ず必要とされると同定されている。つまり、Ｃｙｒ６１は、細胞外マトリックス内のその所在および、それらに直接結合するその能力に基き、インテグリンリガンドであることは明らかである。
本願発明者らは、Ｃｙｒ６１の発現および活性の検出および調節が、子宮平滑筋腫の予防、診断、および治療に有用であることを見出した。
【０００７】
（発明の概要）
本発明により、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。方法は、平滑筋腫組織において、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡのレベルを増すこと、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳を増すこと、ＣｙＲ６１タンパク質の発現をアップレギュレートすること、Ｃｙｒ６１タンパク質の活性を増すこと、またはＣｙｒ６１タンパク質のレベルを増すことを含み得る。本発明は、正常な子宮筋層組織における子宮筋腫を予防するための方法も提供する。方法は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡ、Ｃｙｒ６１の翻訳活性、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、Ｃｙｒ６１タンパク質の活性、または塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１のアフィニティの、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含み得る。
【０００８】
これらの方法には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞への送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および治療的有効量の、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）への結合を調節する化合物の投与が含まれる。
【０００９】
Ｃｙｒ６１タンパク質の部分または全てを認識する抗体も提供される。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、キメラまたはヒト化したもの、および／または抗イディオタイプであってよい。好ましくは、これらの抗体はＣｙｒ６１と同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質を認識または結合しない。
【００１０】
本発明により、子宮平滑筋腫を診断する方法がさらに提供される。方法には、疑わしい組織中の細胞におけるＣｙｒ６１のレベルを、疑わしい組織に対して自系の正常平滑筋層組織におけるＣｙｒ６１のレベルと比較することを含むものが含まれる。疑わしい組織における正常組織におけるよりも低レベルのＣｙｒ６１は、疑わしい組織における子宮平滑筋腫の存在を示す。この方法におけるＣｙｒ６１のレベルは、疑わしい組織と正常な組織を、Ｃｙｒ６１タンパク質を認識するＣｙｒ６１抗体へ曝し、次いで各組織に結合した抗体の量を比較することにより決定することができる。疑わしい組織において、正常組織におけるものと比較して結合抗体のレベルが低ければ、疑わしい組織における子宮平滑筋の存在を示す。
【００１１】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害または予防する化合物をスクリーニングするための方法も提供される。これらの方法には、化合物に曝した平滑筋腫細胞により発現されたＣｙｒ６１の量を、化合物に曝していない子宮平滑筋腫により発現されたＣｙｒ６１の量と比較することが含まれる。化合物に曝していない細胞と比較して、化合物に曝した細胞において発現されたＣｙｒ６１のレベルが高ければ、化合物が子宮平滑筋腫を阻害または予防し得ることを示す。
【００１２】
子宮を有し、そして例えば誘導されて子宮においてＣｙｒ６１を過剰発現することができるヒトＤＮＡなどのＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物も、本発明により企図される。
子宮平滑筋腫の存在を検出する方法も、本発明において企図される。これらの方法には、疑わしい子宮平滑筋腫組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、正常な子宮筋層組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することが含まれる。正常な子宮筋層組織と比較して、疑わしい子宮平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが低ければ、子宮平滑筋腫の存在を示す。
【００１３】
子宮平滑筋腫を診断するためのキットが本発明により企図される。キットには、Ｃｙｒ６１を認識する、またはＣｙｒ６１に結合する抗体が含まれる。
本発明には、発現コントロール配列と操作可能な状態で結合した、図６に示す核酸を含む発現ベクターがさらに企図される。特定の具体例において、発現コントロール配列は、エストロゲン応答エレメントまたは塩基性繊維芽細胞成長因子応答エレメントであってよい。ヘパリン結合表皮成長因子もＣｙｒ６１の発現を調節する。該ベクターまたはタンパク質を含む医薬組成物および該医薬組成物を用いて子宮平滑筋腫の増殖を予防および阻害する方法も企図される。
【００１４】
本発明により、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。方法は、治療を必要とする対象に、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１の発現、またはＣｙｒ６１タンパク質の活性を刺激するのに有効な量の化合物を投与することを含み得る。本発明は、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１タンパク質のトータルのレベルを増すことも企図する。所定の具体例において、子宮平滑筋腫を阻害する化合物は、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩｍＲＮＡの合成、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩｍＲＮＡの翻訳、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩタンパク質の発現、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩの活性、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子タンパク質の翻訳、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子タンパク質の発現、または塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子の活性をダウンレギュレートをもする。
【００１５】
本発明により、子宮筋層組織において子宮平滑筋腫を予防する方法がさらに提供される。方法には、子宮筋層組織における子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、子宮筋層組織における、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡ、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳活性、Ｃｙｒ６１の発現、またはＣｙｒ６１タンパク質の活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものが含まれる。所定の具体例において、化合物はエストロゲンレセプターの活性を減じる。
【００１６】
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を予防する方法であって、塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１タンパク質のアフィニティを増すのに有効な量の化合物を対象に投与することを含むものが提供される。
【００１７】
子宮平滑筋腫を予防する方法には、子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩｍＲＮＡの合成、ＩＦＧ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩｍＲＮＡの翻訳、ＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦ ＩＩタンパク質の発現、またはＩＧＦ Ｉおよび／またはＩＧＦＩＩの活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものも含まれる。子宮平滑筋腫を予防する方法には、子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはへパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの翻訳、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはへパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの発現、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子の活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものが含まれる。特定の具体例において、ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成を、アンチセンス核酸によりダウンレギュレートする。
本願は、インテグリンレセプターに対するＣｙｒ６１の結合を調節する化合物を対象に投与することにより子宮平滑筋腫の増殖を阻害または予防するための方法をさらに開示する。
【００１８】
（図面の簡単な記載）
図１（Ａ）−（Ｄ）。ＲＡＤＥ法によるＣｙｒ６１の同定およびノーザン分析による確認。（Ａ）倍化（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）平滑筋腫（Ｌ）および同調（ｍａｔｃｈｅｄ）子宮筋層（Ｍ）組織（ｎ＝４）から抽出した全ＲＮＡから作製された３５Ｓ−放射能標識ｃＤＮＡの典型的なオートラジオグラフ。（Ｂ）平滑筋腫（Ｌ）および同調子宮筋層（Ｍ）組織から単離された全ＲＮＡの典型的なノーザンブロット。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１転写産物および３．５ｋｂの少ない方のＣｙｒ６１転写産物を示す。（Ｃ）膜を２．０ｋｂの放射能標識したマウスグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）で再プローブして、等量のサンプルローディングを確証した。（Ｄ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒおよび画像診断ソフトウェア（ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＣｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの密度分析。＊子宮筋層コントロールと比較した、レベルの有意な低下。
【００１９】
図２（Ａ）−（Ｃ）。平滑筋腫におけるＣｙｒ６１タンパク質の発現の分析。（Ａ）平滑筋腫および同調子宮筋層組織から作製された組織タンパク質抽出物の典型的なウェスタンブロット。（Ｂ）タンパク質ブロットを次いで抗−アクチン単一特異的抗体で再プローブして、等量のタンパク質ローディングを確認した。（Ｃ）Ｂｉｏｒａｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒを用いる密度分析により定量されたＣｙｒ６１タンパク質レベル。値は、１０人の患者に関する平均±ＳＤを示す。＊子宮筋層コントロールと比較したレベルの有意な低下。
図３（Ａ）−（Ｂ）。多様なヒト組織（Ａ）およびヒト筋肉組織（Ｂ）におけるＣｙｒ６１のディファレンシャル発現。矢印は、分子量マーカーをｋｂで示す。
【００２０】
図４（Ａ）−（Ｆ）。インサイチュハイブリダイゼーションにより決定される、子宮平滑筋細胞におけるＣｙｒ６１の発現の抑制。典型的な黒のフィールド（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および明るいフィールド（ＣおよびＤ）は、子宮筋層（Ａ、ＣおよびＥ）および平滑筋腫（Ｂ、ＤおよびＦ）組織セクションの顕微鏡写真である。矢印は、Ｃｙｒ６１転写産物を発現する典型的な子宮平滑筋細胞を示す（Ｃ）。センス放射能標識ｃＲＮＡプローブは、バックグラウンドより高いシグナルを示さなかった（ＥおよびＦ）。倍率＝２００×（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および６３０×（ＣおよびＤ）、バー＝１５μｍ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および５μｍ（ＣおよびＤ）。
【００２１】
図５（Ａ）−（Ｇ）。１７β−エストラジオールおよび塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によるＣｙｒ６１の、エキソビボ、平滑筋腫における調節欠如。図（Ａ）−（Ｃ）は、採取したての子宮筋層を表し、および図（Ｄ）−（Ｆ）は、エタノールビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール（Ｅ２）、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＭ５０２０の組み合わせ、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０、または１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１８２，７８０の組み合わせのいずれかの存在下、エキソビボで培養した平滑筋腫組織標本を示す。膜を、ＧＡＰＤＨｃＤＮＡで再プローブし、サンプルローディングＣおよびＦの等量を説明した。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１および６．２ｋｂのＥＲα転写産物を示す。（Ｇ）は、算定されたデータを示す。値は、８人の患者に関する±ＳＤを示す。＊非処置の子宮筋層組織と比較した、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの有意な増加。
【００２２】
図６ Ｃｙｒ６１の核酸配列を示す（配列番号：１）。
図７ 図６の核酸配列によりコードされるＣｙｒ６１のアミノ酸配列を示す（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＡＢ５８３１９）。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、子宮平滑筋腫の形成を予防する、子宮平滑筋腫を診断する、および子宮平滑筋腫を阻害または予防する化合物をスクリーニングする方法を開示する。これらの方法は、目的のサンプルにおけるＣｙｒ６１の転写ならびに翻訳、およびＣｙｒ６１タンパク質のレベルの、ステロイドおよび成長因子媒介性の調節を評価する、またはこれらに対するものである。本発明により、スクリーニングアッセイおよびキットも都合よく提供される。本発明のアッセイ系は、高処理量スクリーニングに、例えばアッセイ当たり数千の化合物をスクリーニングするのに適している。
【００２４】
本発明により、Ｃｙｒ６１−特異的抗体、および、Ｃｙｒ６１タンパク質の存在を検出するために、ならびに子宮平滑筋腫に関するＣｙｒ６１のアゴニストのスクリーニングにおいてこれらの物質を用いる方法に関する。
【００２５】
一般的な定義
「単離された」なる用語は、言及される物質が通常見出される環境から取り出されることを意味する。つまり、単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわち、物質が見出されるもしくは産生される細胞の構成成分から自由であり得る。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限フラグメントが含まれる。他の具体例においては、単離された核酸は、それが見出され得る染色体から好ましくは切り出され、およびより好ましくは染色体中に見出される場合に単離された核酸分子により包含される遺伝子の上流または下流に位置する非調節、非コーディング領域または他の遺伝子にはもはや結合しない。さらに別の具体例では、単離された核酸は１またはそれ以上のイントロンを欠いている。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれる。すなわち、特定の具体例において、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞中でそれが結合する他のタンパク質もしくは核酸、またはその両方と結合していてよく、または膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてよい。単離された細胞小器官、細胞または組織は、生物体中に見出される解剖学的構造上の部位から取り出される。単離された物質は、精製される必要はないが、精製されてよい。
【００２６】
「精製された」なる用語は、関連のない物質、すなわち、物質が得られる本来の物質を含め、汚染物質の存在を減じるもしくは排除するような条件下で単離された物質を意味する。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、細胞中でそれが結合している他のタンパク質または核酸分子から実質上遊離しており、精製された核酸分子は好ましくは、細胞内で共に見出されることができるタンパク質または他の関連する核酸分子から好ましくは実質上遊離している。精製は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法により評価することができる。
【００２７】
「サンプル」なる用語は、Ｃｙｒ６１タンパク質またはＣｙｒ６１核酸の存在に関して試験することができる生物学的物質を意味する。そのようなサンプルは、ヒトおよび非ヒト動物などの対象から得ることができ、および、組織、特に子宮腺、バイオプシー、血液および血液産物；複数の滲出液（ｐｌｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ）；脳脊髄液（ＣＳＦ）；腹水液；および細胞培養物が含まれる。
【００２８】
「非−ヒト動物」なる用語には、制限されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなどの実験動物、イヌおよびネコなどのペット、およびヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの牧畜が含まれる。
「反応を誘発する能力」なる用語には、リガンドの、レセプターの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力が含まれる。
【００２９】
「形質転換細胞」なる用語は、目的のタンパク質をコードしているベクターから発現される機能タンパク質を発現する、変更された宿主細胞を意味する。いずれの細胞をも用いることができるが、好ましい細胞は、哺乳動物の細胞である。
「アッセイ系」なる用語は、例えばマイクロウェルプレートまたはいくらかの他の培養系におけるそのような細胞の１またはそれ以上の集まりである。細胞における試験化合物の効果の評価を可能とするために、単一アッセイ系における細胞の数は、調節されるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の検出可能な量を発現するのに十分なものである。本発明の方法は、Ｃｙｒ６１遺伝子の転写および翻訳を調節するリガンドを試験するアッセイ系における使用に特に適している。
【００３０】
「試験化合物」は、Ｃｙｒ６１の発現および／または活性を調節するその能力を試験することができるあらゆる分子、例えばエストロゲン化合物などである。
「平滑筋腫」なる用語は、平滑筋および繊維性結合組織から成る良性腫瘍を意味する。特定の具体例において、平滑筋腫は子宮平滑筋腫である。平滑筋腫は、繊維性腫瘍、繊維筋腫、繊維腫、繊維平滑筋腫（ｆｉｂｒｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ）、類繊維腫、または筋腫とも呼ばれる。「良性」なる用語は、非癌腫瘍を意味する。
「子宮筋層（ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ）」または「子宮筋層（ｍｙｏｍｅｔｒｉａｌ ｌａｙｅｒ）」なる用語は、子宮の筋肉層を意味する。
【００３１】
生物体または細胞中のＣｙｒ６１のレベルを増すことに関連して本明細書中になされる記載には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１ＤＮＡの転写を刺激する方法、Ｃｙｒ６１タンパク質の翻訳を刺激する方法、Ｃｙｒ６１タンパク質のプロセシングを刺激する方法、細胞質タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）に対するＣｙｒ６１タンパク質の結合を変更する方法、外来Ｃｙｒ６１タンパク質の添加、またはＣｙｒ６１タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの添加が含まれる。
【００３２】
本発明のＣｙｒ６１は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌおよびニワトリを含む種々の哺乳動物源において単離、存在または検出されてよい。本発明の好ましい源はヒトである。
「子宮平滑筋腫の増殖を阻害する」なる用語は、子宮平滑筋腫の増加の速度を減じること、またはその増加を完全に停止させることを意味する。好ましい具体例において、平滑筋腫の増加の低下は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、およびより好ましくは少なくとも８０％である。
【００３３】
「子宮平滑筋腫を予防するレベル」なる用語は、正常の平滑筋腫組織における子宮平滑筋腫の形成を阻害するのに必要とされる量を意味する。
「レベル」なる用語は、活性の、ユニット（例えば、細胞）当たりのトータルの量、または速度を意味する。
イタリック体の使用は、一般に核酸分子（例えば、Ｃｙｒ６１ ｃＤＮＡ、遺伝子など）を示し、標準テキストは一般に、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。別に、核酸分子またはタンパク質を示しているかどうかは、内容により決定することができる。
【００３４】
ＤＮＡの「増幅」なる用語は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増すことを意味する。ＰＣＲの記載に関しては、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７， １９８８を参照されたい。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」なる用語は、Ｃｙｒ６１遺伝子における対立変種または変異を検出するのに用いることができるオリゴヌクレオチドの関連するセットを意味する。
【００３５】
「核酸分子」なる用語は、リボヌクレオシド（ＲＮＡ分子）またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ分子）のリン酸エステル形態、または一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかの形態の、いずれかのリン酸エステル類似体を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスが可能である。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子なる用語は、分子の一次および二次構造のみを意味し、いずれかの特定の三次形態にそれを制限するものではない。つまりこの語には、とりわけ鎖状で見出される二本鎖のＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体が含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じるにつき、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡに対して相同の配列を有する鎖）にそって５’から３’の方向の配列のみを与える通常の慣例に従って記載されてよい。「組換えＤＮＡ分子」は、分子の生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。分子生物学的操作の無制限の例には、酵素的リン酸化、酵素的脱リン酸化、酵素消化、およびライゲーションが含まれる。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」なる用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中のヌクレオチド塩基（いわゆる「ヌクレオチド」）の連続であり、および２またはそれ以上のヌクレオチドのあらゆる鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的に、タンパク質および酵素を作製する細胞機構により用いられる情報を含む、遺伝子情報を有する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、いずれかの合成および遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、およびセンスおよびアンチセンス両ポリヌクレオチドが含まれる。これには、一本鎖および二本鎖分子、即ち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにアミノ酸骨格に対して塩基を結合することにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには、例えば、チオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルなどの変更された塩基を含む核酸が含まれる。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、本来の調節（発現コントロール）配列に隣接していてよく、またはプロモーター、リボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’非コーディング領域などを含む異種構造配列と結合していてよい。核酸は当該分野で公知の多くの手段により変更されてもよい。そのような変更の無制限の例には、メチル化、「キャップ」、１またはそれ以上の天然に生じるヌクレオチドの類似体での置換、およびヌクレオチド内での変更、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いるものなどが含まれる。ポリヌクレオチドは、１またはそれ以上のさらなる共有結合部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射能活性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などを含んでよい。ポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホールアミデート結合の形成により誘導されてよい。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドは、検出可能なシグナルを提供することができるラベルで直接的または関節的に変更されてもよい。典型的なラベルには、ラジオアイソトープ、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。
【００３８】
「宿主細胞」なる用語は、細胞による物質の産生、例えば遺伝子またはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現などのための、いずれかの方法で、選択した、変更した、形質転換した、増加した、または用いた、または操作したあらゆる生物体のあらゆる細胞を意味する。宿主細胞はさらにまた、以下に記載するスクリーニングまたは他のアッセイに用いることができる。
【００３９】
一般には、特定のタンパク質または酵素に関する指令を有するＤＮＡ配列が、ＲＮＡの対応する配列に「転写」される。ＲＮＡ配列は次いで、タンパク質または酵素を形成するアミノ酸の配列に「翻訳」される。「アミノ酸配列」は、２またはそれ以上のアミノ酸から成るいずれかの鎖である。各アミノ酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、１またはそれ以上の三つ組のヌクレオチドにより表現される。各三つ組は、アミノ酸に対応するコドンを形成する。遺伝子コードはいくつかの、いわゆる縮重とも呼ばれる重複を有するが、これはほとんどのアミノ酸が１以上の対応するコドンを有することを意味する。
【００４０】
「コーディング配列」、またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などの発現産物を「コードしている」配列は、発現された場合にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列であり、すなわち、該ヌクレオチド配列は、ポリペプチド、タンパク質または酵素に関するアミノ酸配列をコードする。
【００４１】
「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」なる用語は、１またはそれ以上のタンパク質または酵素の全部または部分を含むアミノ酸の特定の配列をコードする、またはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件などを決定する、調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列を含んでも含まなくてもよい。構造遺伝子でないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへ転写され得るが、アミノ酸配列へは翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子のレギュレーター、またはＤＮＡの転写のレギュレーターとして機能し得る。
【００４２】
「プロモーター配列」は、細胞内にある第二の分子に結合することができ、そしてコーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。
コーディング配列は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡへと転写する場合、転写および翻訳調節配列のコントロール下にあるか、またはそれらと操作可能な状態で結合しており、これは次いでトランスＲＮＡスプライスされ（イントロンを含む場合）、そして、コーディング配列によりコードされたタンパク質へと翻訳される。
【００４３】
「発現する」および「発現」なる用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列内の情報を表現すること、または表現させること、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を作製することを意味する。ＤＮＡ配列は細胞内で、または細胞により発現されて、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、生じたタンパク質はまた、細胞により「発現される」と言ってよい。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌性のものとして特徴づけることができる。「細胞内」なる用語は、細胞内にあるものを意味する。「細胞外」なる用語は、細胞外にあるものを意味する。物質は、かなりの程度で細胞外に現れる場合、細胞により、細胞のどこかから、または細胞内から「分泌されて」いる。
【００４４】
「トランスフェクション」なる用語は、外来核酸の細胞内への導入を意味する。「形質転換」なる用語は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素を産生するよう、「外来」（即ち、外部のまたは細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞へ導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン化された」または「外来」遺伝子または配列であってもよく、調節またはコントロール配列、例えばスタート、ストップ、プロモーター、シグナル、分泌配列または、細胞の遺伝子機構により用いられる他の配列を含んでよい。遺伝子または配列は、非機能配列または公知の機能を持たない配列を含んでよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容および発現する宿主細胞は、「形質転換されて」おり、および「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞へ導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞、または異なる属または種の細胞を含むあらゆる源から得ることができる。
【００４５】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」なる用語は、それによって、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（即ち、転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞内へ導入することができるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。
【００４６】
ベクターの一般的なタイプは、二本鎖ＤＮＡの、通常細菌起源の、容易に追加の（外来）ＤＮＡを受容することができ、そして適当な宿主細胞へ容易に導入することができる完全独立の分子である「プラスミド」である。プラスミドベクターはコーディングＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含むことが多く、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１またはそれ以上の制限部位を有する。プラスミドおよび真菌ベクターを含む多数のベクターが、種々の真核および原核宿主における複製および／または発現のために記載されている。無制限の例には、本明細書に開示される、または引用されるか、またはさもなくば当業者に公知の他の方法を用いるｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｏｓｎ， ＷＩ）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）および多くの適当な宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターには、クローニングまたは発現のための１またはそれ以上の複製系、宿主中での選択のための、例えば抗生物質抵抗性の１またはそれ以上のマーカー、および１またはそれ以上の発現カセットが含まれることが多い。
【００４７】
「カセット」は、規定された制限部位にてベクターに挿入されることができる、発現産物をコードするＤＮＡコーディング配列またはＤＮＡのセグメントを意味する。カセット制限部位は、適当なリーディングフレームにおいてカセットの挿入を確保するべく設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１またはそれ以上の制限部位にて挿入され、次いでベクターにより、伝達可能なベクターＤＮＡと共に宿主細胞へと運ばれる。挿入または追加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列、発現ベクターなどは、「ＤＮＡ構築物」とも呼ぶことができる。
【００４８】
「発現系」なる用語は、ベクターにより運ばれ、そして宿主細胞へ導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適当な条件下に適合し得る（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ベクターを意味する。一般的な発現系には、イー．コリ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、および哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。
【００４９】
「異種構造」なる用語は、天然には存在しないエレメントの組み合わせを意味する。例えば、異種構造ＤＮＡなる用語は、細胞中、または細胞の染色体部位において天然にはないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種構造ＤＮＡには、細胞に対して外来の遺伝子が含まれる。異種構造発現調節エレメントは、本来、それが操作可能な状態で結合しているものとは異なる遺伝子に操作可能な状態で結合しているエレメントなどである。
【００５０】
「自系の」なる用語は、同じ個体から得られる標本を意味する。例えば、自系組織は、同じ個人から得られた異なる組織標本を意味する。特定の具体例において、疑わしい子宮平滑筋腫と自系正常子宮筋層は、同じ個体から得られた異なる子宮組織標本を意味する。
【００５１】
「変異体」および「変異」なる用語は、遺伝子物質、例えばＤＮＡにおけるいずれかの検出可能な変化、またはそのような変化のいずれかのプロセス、メカニズムまたは結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化した遺伝子変異、いずれかの変異プロセスから生じるあらゆる遺伝子またはＤＮＡ、および変更された遺伝子またはＤＮＡ配列により発現されるあらゆる発現産物（例えば、タンパク質または酵素）が含まれる。「変異体」なる用語は、変更または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、即ち、あらゆる種類の変異体を含んでよい。
【００５２】
核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの他の核酸分子に対し、一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子に適当な温度条件および溶液イオン強度下でアニールすることができる場合、「ハイブリダイズできる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， 既出を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ホモロガスな核酸の予備スクリーニングのためには、５５℃のＴｍ（融点）に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルクを用い、ホルムアミドは含まない；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いることができる。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応し、例えば４０％ホルムアミドを５×または６×ＳＣＣと用いる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最高のＴｍに対応し、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣを用いる。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ−シトレートである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。ハイブリダイズしている核酸の適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当業者に周知の変化に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性またはホモロジーの程度が大きいほど、それらの配列を有している核酸のハイブリッドのためのＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さにして１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドに関して、Ｔｍを算出する等式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 既出、９． ５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要となり、そして、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 既出、１１．７−１１．８を参照されたい）。ハイブリダイズ可能な核酸に関して最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、およびより好ましくはその長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００５３】
特定の具体例において、「通常のハイブリダイゼーション条件」なる用語は、５５℃のＴｍを意味し、および前記の条件を用いるものである。好ましい具体例において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい具体例においては、Ｔｍは６５℃である。特定の具体例において、「高ストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣ中６８℃にて、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃にて、またはこれらの２つの条件のいずれかの下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションのレベルを提供する条件下でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を意味する。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド」なる用語は、一般に、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸をコードしているゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００以下のヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば３２Ｐ−ヌクレオチドまたは、ビオチンなどのラベルを共有結合したヌクレオチドで標識することができる。一具体例において、標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。他の具体例において、オリゴヌクレオチド（その１または両方を標識してよい）は、Ｃｙｒ６１の全長またはフラグメントのクローニングのために、またはＣｙｒ６１をコードしている核酸の存在を検出するために、ＰＣＲプライマーとして用いることができる。一般にオリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザーにて人工的に調製する。
【００５５】
本発明により、細胞中でのＣｙｒ６１の発現を阻害するため、またはＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはＤＮＡを位置付けるために用いられてよいアンチセンス核酸（リボザイムを含む）が提供される。「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子中の相補的な塩基と細胞質条件下でハイブリダイズする際に、後者の役割を阻害する一本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆転写産物またはｍＲＮＡ−干渉相補的核酸である。現在用いられているように、「アンチセンス」には、広くＲＮＡ−ＲＮＡの相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡの相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ介在性の抑制（ａｒｒｅｓｔ）が広く含まれる。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現のための組換え遺伝子によりコードされることができ（例えば、米国特許第５，８１４，５００号および５，８１１，２３４号）、または別法として、それらは人工的に調製することができる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。
【００５６】
平滑筋腫
前記のように、「平滑筋腫」なる用語は、平滑筋および繊維性結合組織から構成される腫瘍を意味する。平滑筋腫は、単細胞の体細胞変異から生じると考えられている。子宮平滑筋腫は、子宮に関連する腫瘍を意味する。子宮平滑筋腫は、腫瘍および侵されている子宮層の位置に基いて分類することができる。子宮平滑筋腫の位置は、（ａ）頚部、（ｂ）峡部、または（ｃ）体部と類別し得る。子宮頚部の平滑筋腫は一般に膣へと進行し、および洞瘻（ｓｉｎｕｓｉｏｒｒａｇｉａ）および感染を引き起こす可能性がある。峡部子宮平滑筋腫は、痛みや泌尿器の問題をしばしば引き起こす。最も一般的な位置の体部子宮平滑筋腫は、無症候性であることが多い。子宮平滑筋腫は、（ａ）漿膜下、（ｂ）粘膜下、または（ｃ）子宮層内壁を冒す可能性がある。内壁平滑筋腫はこの腫瘍の最も一般的な形態であり、子宮壁内に生じる。
【００５７】
疫学研究は、子宮平滑筋腫が３０歳を越す女性の約３０％に存在することを示している。平滑筋腫を有する女性のほとんどは無症候性であり、罹患している患者の３５−５０％のみが問題を感じている。子宮平滑筋腫に伴ういくつかの問題には、制限されるものではないが、異常な子宮の出血、痛み、不妊、泌尿器の症状、腸の症状、および静脈の鬱血が含まれる。急速に増大している平滑筋腫は、良性腫瘍から悪性腫瘍へ変化しているのしるしとなり得る。
【００５８】
ウイルスおよび非ウイルスベクター
特にインビトロおよびインビボでの細胞アッセイに好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスベクター、および所望の細胞親和性を有する他の組換えウイルスである。つまり、機能タンパク質または変異タンパク質またはそのポリペプチドドメインフラグメントをコードしている遺伝子を、ウイルスベクターを用いてインビボ、エキソビボ、またはインビトロで、またはＤＮＡの直接導入により導入することができる。標的組織における発現は、トランスジェニックベクターを、ウイルスベクターまたはレセプターリガンドを用いるなどして特定の細胞へ標的することにより、または組織特異的プロモーターを用いることにより、またはその両方により成し遂げることができる。標的遺伝子送達は、ＰＣＴ公開第９５／２８４９４号に開示されている。
【００５９】
インビボまたはエキソビボでのターゲッティングおよび治療法に一般に用いられるウイルスベクターは、ＤＮＡに基くベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築する、および用いる方法は、当該分野で公知である（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９２， ７： ９８０−９９０を参照されたい）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損である、すなわち、それらは標的細胞中で自律的に複製することができない。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小の（ｍｉｎｉｍａｌ）ウイルスであり、すなわちそれは、ゲノムをカプセルに入れてウイルス粒子を作製するのに必要なそのゲノムの配列のみを保持する。
【００６０】
ＤＮＡウイルスベクターには、制限されるものではないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピロマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などの弱毒化もしくは欠損ＤＮＡウイルスが含まれる。ウイルス遺伝子を完全にもしくはほぼ完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞への導入後に伝染しない。欠損ウイルスベクターの使用により、ベクターが他の細胞を感染し得る懸念なく、特定の、局部領域における細胞へ投与することが可能となる。つまり、特定の組織を特異的に標的することができる。特定のベクターの例には、制限するものではないが、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １９９１， ２： ３２０−３３０）、糖タンパクＬ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２１８０７号および第ＷＯ９２／０５２６３号）；およびＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌにより開示される（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９９２， ９０： ６２６−６３０； Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２５９： ９８８−９９０も参照されたい）ベクターなどの弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｏｌ．， １８９７， ６１： ３０９６−３１０１； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＶＩｒｏｌ．， １９８９， ６３： ３８２２−３８２８； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ８： ３９８８− ３９９６）が含まれる。
【００６１】
制限されるものではないが、Ａｖｉｇｅｎ， Ｉｎｃ． （Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ； ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ； レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ， Ｉｎｃ． （Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ， ＰＡ； アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ； アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ； レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ （Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ， Ｆｒａｎｃｅ； アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含む種々の会社がウイルスベクターを工業的に製造している。
【００６２】
アデノウイルスベクター． アデノウイルスは、種々の細胞タイプへと本発明の核酸を有効に送達するために変更することができる、真核生物のＤＮＡウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型の中で、タイプ２またはタイプ５ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２６９１４号を参照されたい）を用いるよりも好ましいものが、本発明の範囲内で与えられる。本発明の範囲内で用いることができる動物起源のこれらのアデノウイルスには、イヌ、ウシ、ネズミ（例： Ｍａｖ１， Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９０， ７５−８１）、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌのアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株、ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）である。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが開示されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２６９１４号、第ＷＯ９５／０２６９７号、第ＷＯ９４／２８９３８号、第ＷＯ９４／２８１５２号、第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９５／０２６９７号、第ＷＯ９６／２２３７８号）。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当該分野の専門家に公知のいずれかの方法により調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９９１， １０１： １９５； 欧州公開第ＥＰ１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９８４， ３： ２９１７； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， １９７７， ３６：５９）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の常套の分子生物学的方法を用いて回収および精製する。
【００６３】
アデノ関連ウイルス
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は、安定かつ部位特異的方法で、それらが感染する細胞のゲノムへと統合することができる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の生育、組織形成、または分化にいかなる影響をも誘発することなく、広範囲の細胞に感染することができ、およびそれらはヒトの病気には関与しないと考えられる。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、および特徴づけられている。インビトロおよびインビボで遺伝子を輸送するためのＡＡＶ由来のベクターの使用が開示されている（ＰＣＴ公開第９１／１８０８８号、および第ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号；欧州公開第ＥＰ４８８，５２８号を参照されたい）。本発明による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆末端繰り返し（ＩＴＲ）領域に隣接する目的の核酸配列を含んでいるプラスミド、およびＡＡＶエンキャプシデーション遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）で感染した細胞系統に同時感染することにより調製することができる。作製されたＡＡＶ組換え体は、次いで常套法により精製する。
【００６４】
レトロウイルスベクター． 他の具体例において、遺伝子は、例えば米国特許第５，３９９，３４６号； Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９８３， ３３： １５３； 米国特許第４，６５０，７６４号および第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９８８， ６２： １１２０； 米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許第ＥＰ４５３２４２号および第ＥＰ１７８２２０号；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ．， １９８５， ７： ２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９８５， ３： ６８９； ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９３， ８２： ８４５に開示されているような、レトロウイルスベクター中に導入することができる。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染する完全ウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ）である。レトロウイルスゲノムは２つのＬＴＲ、エンキャプシデーション配列および３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクター中、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は全部または部分的に欠失しており、および目的の異種構造核酸配列で置きかえられる。これらのベクターは、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「ネズミＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス」ＭＳＶ（「ネズミＭｏｌｏｎｅｙ肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス」；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＡＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびＦｒｉｅｎｄウイルスなどの異なるタイプのレトロウイルスから構築することができる。適当なパッケージング細胞系統が当該分野で開示されており、特に細胞系統ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系統（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系統（ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１５０号）が開示されている。加えて、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するために、ＬＴＲ内に変更ならびにｇａｇ遺伝子の部分を含んでよい拡張エンキャプシデーション配列を含むことができる（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９８７， ６１： １６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の常套法により精製する。
【００６５】
レトロウイルスベクターを構築して、感染粒子として機能させ、または単一のラウンドのトランスフェクションを行うことができる。前者の場合、発癌性のトランスフェクション特性の原因であるものを除くその遺伝子の全てを保持するよう、そして異種構造遺伝子を発現するようウイルスを変更する。非感染性のウイルスベクターを操作して、ウイルスパッケージングシグナルは破壊し、しかし、異種構造遺伝子およびパッケージングシグナルを含むよう操作された、同時導入されるウイルスをパッケージするのに必要とされる構造遺伝子はそのままにしておく。従って、作製されるウイルス粒子は、更なるウイルスを作製することができない。
レトロウイルスの複製の１サイクルを可能にし、そしてトランスフェクション効率を増すＤＮＡウイルスにより、レトロウイルスベクターを導入することもできる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２２６１７号、第ＷＯ９５／２６４１１号、第ＷＯ９６／３９０３６号、および第ＷＯ９７／１９１８２号を参照されたい）。
【００６６】
レンチウイルスベクター． 他の具体例では、レンチウイルスベクターを、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む種々の組織タイプの移入遺伝子の直接送達および持続発現のための作用因として用いることができる。ベクターはこれらの組織において効率的に分裂細胞および非分裂細胞を形質導入し、そして、目的の遺伝子の長期発現を維持することができる。概説としては、Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９８， ９： ４５７−６３を参照されたい；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｏｌ．， １９９８， ７２： ９８７３−８０も参照されたい）。レンチウイルスパッケージング細胞系統が入手可能であり、および当該分野で一般に公知である。それらにより、遺伝子治療のための高タイターのレンチウイルスベクターの産生が容易になる。例には、少なくとも３から４日間１０６ＩＵ／ｍｌより大きいタイターでウイルス粒子を作製することができるテトラサイクリン誘導性のＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスパッケージング細胞系統がある（Ｋａｆｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｒｏｌ．， １９９９， ７３： ５７６−５８４）。誘導性細胞系統により作製されたベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を有効に形質導入するのに必要とされる程度に濃縮することができる。
【００６７】
非ウイルスベクター． 他の具体例において、ベクターはインビボで、リポフェクションにより裸のＤＮＡとして、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて導入することができる。合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードしている遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８７， ８４： ７４１３−７４１７； Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ３３７： ３８７−３８８； Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５： ８０２７−８０３１； Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２５９： １７４５−１７４８を参照されたい）。核酸を輸送するための有用な脂質化合物および組成物がＰＣＴ特許公開第９５／１８８６３号および第ＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に開示されている。脂質はターゲッティングのために他の分子と化学結合させてよい（Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ｌａ．， 既出を参照されたい）。標的ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学結合させることができる。
【００６８】
他の分子、例えばカチオン性オリゴペプチド（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９６／２５５０８号）またはカチオン性ポリマー（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９５／２１９３１号）なども、インビボでの核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。
【００６９】
インビボで、裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは所望の宿主細胞に、当該分野で公知の方法、例えばエレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９２， ２６７： ９６３−９６７； Ｗｕ ａｎｅ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８８， ２６３： １４６２１−１４６２４； カナダ特許出願第２，０１２，３１１号； Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９１， ８８： ２７２６−２７３０を参照されたい）。レセプター媒介性のＤＮＡ送達法も用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １９９２， ３： １４７−１５４； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８７， ２６２： ４４２９−４４３２）。米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号は、外来ＤＮＡ配列の、トランスフェクション促進剤を用いずに行う、哺乳動物における送達を開示する。近年、比較的低電圧の、高効率のインビボＤＮＡ輸送法であって、電子輸送と呼ばれるものが開示された（Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃ．Ｐ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８８， ３２１： ８９３； ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０１１５７号；第ＷＯ９９／０１１５８号；第ＷＯ９９／０１１７５号）。
【００７０】
抗体およびアンチセンス構築物
本発明は、細胞、特に子宮平滑筋腫などの平滑筋腫細胞におけるＣｙｒ６１の存在を検出するのに用いることができる抗体を開示する。さらに、該抗体（例えば、抗−イディオタイプ抗体）を用いて、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、またはその形成を予防することができる。治療法において用いられる抗体は、医薬活性化合物に結合していてよい。
【００７１】
本発明に従い、組換えにより、または化学合成により作製されたＣｙｒ６１ポリペプチドおよびフラグメントまたは他の誘導体を免疫原として用いて、Ｃｙｒ６１ポリペプチドまたはその部分を認識する抗体を作製してよい。免疫原として用いられるポリペプチドの部分を特異的に選択して、開発された抗体の免疫原性を変更してよい。そのような抗体には、制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。ヒトＣｙｒ６１に特異的な抗体は、Ｃｙｒ６１の野生型または変異体を認識し得る。好ましくは、抗体は、Ｃｙｒ６１と同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質を認識せず、またはそれに結合しない。特定の具体例において、抗体は少なくとも８アミノ酸、好ましくは８−１０アミノ酸、およびより好ましくは１５−３０アミノ酸から成る。好ましい抗体は、制限されるものではないが、（図７に記載されている）Ｃｙｒ６１のアミノ酸３７１−３８１に対して作製される。好ましくは、抗体は連続しているＣｙｒ６１ポリペプチドに関するアミノ酸を認識し、またはそれに結合する。
【００７２】
当該分野で公知の種々の方法を、ポリペプチド、誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の作製に用いてよい。抗体の作製のために、制限されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む種々の宿主動物を、ポリペプチドまたは誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）での注射により免疫化することができる。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫原性のキャリア、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合ことができる。宿主種により、制限されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）の、水酸化アルミニウムなどのミネラルジェル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどの界面活性剤を含む種々のアジュバントを用いて免疫反応を増してよい。
【００７３】
Ｃｙｒ６１ポリペプチド、フラグメント、その類似体または誘導体に対するモノクローナル抗体は、用いられてよい培地中の継代細胞系統による抗体分子の作製を提供するあらゆる技術により調製されてよい。これらには、制限されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７， １９７５）によりオリジナルに開発されたハイブリドーマ法、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２， １９８３； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０： ２０２６−２０３０， １９８３）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ ７７−９６， １９８５）が含まれる。「キメラ抗体」を、ポリペプチドに特異的な非ヒト抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることにより作製してよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９： ８７０， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８， １９８４； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４， １９８５）。
【００７４】
抗体の作製および使用において、所望の抗体をスクリーニングすること、またはそれを用いて試験することは、当該分野で公知の方法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、（例えば、コロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープラベルを用いる）インサイチュイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどにより達成することができる。
【００７５】
前述の抗体を、ポリペプチドの位置および活性に関する当該分野で公知の方法において、例えばウェスタンブロッティング、ポリペプチドをインサイチュで画像処理すること、適当な生理学的サンプルにおけるそのレベルを測定することなどのために、前記または当該分野で公知の検出法のいずれかを用いて用いることができる。そのような抗体は、例えば米国特許第５，６７９，５８２号に開示されているようなリガンドの結合のためのアッセイに用いることもできる。抗体の結合は一般に生理学的条件、例えば約７と８の間のｐＨ、および生理学的イオン強度の下で最も容易におこる。バッファー溶液中にキャリアタンパク質が存在するとアッセイが安定化する。例えばイオン強度、温度またはｐＨを増すことまたは減じること、または洗剤またはカオトロピック塩を添加することなど、最適条件の変動に関してある程度の許容度があるが、そのような変動により結合の安定性は減るであろう。
【００７６】
特定の具体例において、Ｃｙｒ６１ポリペプチドの活性をアゴナイズする抗体を作製することができる。特に、細胞内一本鎖Ｆｖ抗体を用いてＣｙｒ６１を調節することができる。そのような抗体は、リガンドを同定することに関する以下に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【００７７】
他の特定の具体例において、本発明の抗体は、抗−イディオタイプ抗体である。これらの抗体は、系に存在する他の抗体を認識し、およびまたはそれに結合する。抗−イディオタイプ抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化のものであってよい。さらに、抗体は、医薬上活性な化合物に結合してよい。特定の具体例において、医薬活性化合物はカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）である。
【００７８】
他の特定の具体例において、制限されるものではないが、抗−イディオタイプなどの抗体を、例えば小分子、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの二次成分に結合する。結合物は、抗体を二次成分に結合させる抗体の化学的変更により作製し得る。結合した抗体により、例えば抗生物質などの二次成分の、目的の部位に対する標的化が可能となる。二次成分は、いかなるサイズまたは長さであってもよい。特定の具体例において、二次成分は医薬活性化合物である。医薬活性化合物は、制限されるものではないが、抗−平滑筋腫剤またはカリケアマイシンであり得る。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、既に論じたように、医薬化合物またはＣｙｒ６１ペプチドを標的するための抗体の使用に関する。この具体例において、腫瘍細胞に対して特定の化合物を提示するのに、Ｃｙｒ６１に対する抗体を用いる。化合物、好ましくは抗腫瘍剤は、抗体と結合させる場合、標的化合物または標的剤と呼ばれる。そのような標的化合物および標的剤を作製する方法は、当該分野で公知である。標的化合物およびその調製における典型的な開示は、米国特許第５，０５３，９３４号；５，７７３，００１号；および第６，０１５，５６２号に記載されている。
【００８０】
癌細胞に対する活性を有するあらゆる所望の剤を、標的剤の作製に用いてよい。そのような化合物の例は、米国特許第６，０１５，５６２号に開示されている。特に、米国特許第４，９７１，１９８号；５，０７９，２３３号；４，５３９，２０３号；４，５５４，１６２号；４，６７５，１８７号；および４，８３７，２０６号を参照されたい。これらの公開文献は、標的の医薬化合物として用いられてよい抗腫瘍剤および抗生物質について言及している。
【００８１】
本発明により、抑制タンパク質、特に、細胞増殖におけるＣｙｒ６１の効果を抑制するタンパク質によりＣｙｒ６１の発現を阻害または予防するのに用い得るアンチセンス核酸（リボザイムを含む）が提供される。Ｃｙｒ６１のトータルのレベルを増すアンチセンス核酸を用いて、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えばインテグリンレセプター）への結合を調節してもよい。さらに、アンチセンス核酸を診断ツールとして用いて、子宮平滑筋腫を含んでいる疑いのあるサンプルにおいて、Ｃｙｒ６１の転写および／または翻訳の変化を測定してもよい。
【００８２】
「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子中の相補的な塩基と細胞質条件下でハイブリダイズすることにおいて、後者の役割を阻害する一本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。好ましい具体例において、アンチセンス核酸は少なくとも約１０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、およびより好ましくはその長さは、少なくとも約２０ヌクレオチドである。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆転写産物またはｍＲＮＡ−干渉相補的核酸である。現在用いられているように、「アンチセンス」は、広く、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ媒介性の抑制を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現のための組換え遺伝子によりコードされ得（例えば、米国特許第５，８１４，５００号および第５，８１１，２３４号）または別法として、それらは人工的に調製することができる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。これらのオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物を含むベクターも企図される。
【００８３】
化合物
卵巣ステロイド
「卵巣ステロイド」は、制限するものではないが、エストロゲンおよびプロゲステロンを含む、生殖器官、特に卵巣から分泌されるホルモン物質の１クラスを言う。
エストロゲン化合物は、例えば、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｔｏｎ Ｎ．Ｈ．からの「ステロイド」第１１版において記載されている。その中に開示されている非ステロイド性のエストロゲンも含まれる。他の化合物には、誘導体、代謝物、およびプレカーサーが含まれる。１以上の化合物の混合物も含まれる。そのような混合物の例は、米国特許第５，５５４，６０１号の表ＩＩ（コラム６を参照されたい）に提供される。単独または他の剤と組み合わせたエストロゲンの例が、米国特許第５，５５４，６０１号に提供されている。
【００８４】
β−エストロゲンは、エストロゲン化合物のβ−異性体である。α−エストロゲンは、エストロゲン成分のα−異性体である。「エストラジオール」なる用語は、特記しない場合、α−またはβ−エストラジオールのいずれかである。
「Ｅ２」なる用語は、１７β−エストラジオールと同義である。
【００８５】
プロゲステロン化合物は、例えば、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．からの「治療に関する薬理学的基礎」の第９版において記載されている。プロゲスチン化合物には、例えば、２１の炭素骨格および１９の炭素（１９−ノルテストステロン）骨格を含むプロゲスチンが含まれる。非ステロイド性のプロゲスチン化合物、誘導体、プレカーサー、および代謝産物も、本明細書中に企図される。
【００８６】
好ましくは、非−女性エストロゲン化合物が、本明細書中に用いられる。非−女性エストロゲン化合物は、対象に女性的な特徴をもたせる効果を生じない化合物を意味する。そのような化合物は、子宮肥大および他の望ましくない副作用を引き起こさないという利点を有し、ゆえに、より高い有効投与量にて用いることができる。非−女性エストロゲンの例には、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ； Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ； Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、および他の選択的エストロゲンレセプターモジュレーターが含まれる。
【００８７】
成長因子
成長因子は、細胞分裂の刺激に関与しているタンパク質の１クラスである。これらのタンパク質は細胞表面レセプターと相互作用して、細胞の生存を助長する転写因子を誘導する。成長因子レセプターは、高度に保存されたシグナル変換経路であるＲａｓ経路を経てシグナルを出す。Ｒａｓ経路は、放射能治療において細胞の生存を助長するのに機能し、そして、活性化された細胞内生存経路を構造的に生じるこの経路の遺伝子変化は、癌の進行と関連していることが多い。
【００８８】
成長因子には、例えば成長因子レセプターと相互作用して、成長因子ペプチドを用いて認められるものと同じ効果を生じる小分子化合物も含まれる。含まれる他の化合物は、内在性成長因子の誘導体、代謝物、およびプレカーサーである。本発明の特定の具体例において、用いられる特定の成長因子には、制限されるものではないが、表皮成長因子、ヘパリン結合表皮成長因子、および塩基性繊維芽細胞成長因子が含まれる。
【００８９】
アッセイ系
Ｃｙｒ６１アゴニストまたはアンタゴニスト、ステロイド、非ステロイドおよび成長因子レセプターアゴニストおよびアンタゴニストの機能活性を評価するのを可能とするあらゆる細胞アッセイ系が、本発明により企図される。特定の具体例においては、アッセイを用いてステロイドレセプターの特定の異性体形態と相互作用してＣｙｒ６１の転写および翻訳を調節する化合物を同定することができるが、これは、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの転写、Ｃｙｒ６１の翻訳、またはＣｙｒ６１の活性を調節する試験化合物の効果を評価することにより評価することができる。
【００９０】
いずれかの常套法により、発現される生成物の検出が可能となる。例えば、本発明には、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡ産物を検出するためのノーザンブロット分析が包含される。方法は、例えば、アガロースゲル上に全細胞内ＲＮＡを分別し、ＲＮＡを固体の支持膜へと写し、次いで標識したＤＮＡプローブ、ここでＤＮＡプローブは、サンプル中のＤＮＡプローブとＲＮＡ成分間に安定な複合体を形成することができる条件下にてＣｙｒ６１の特定の核酸配列に特異的である、でＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を検出することから成るステップを含む。そのような複合体は、当該分野で公知のいずれかの適当な方法、例えば、ＥＣＬおよび蛍光を用いることにより検出してよく、ここにおいて、複合体の検出により、サンプル中のＣｙｒ６１の存在が示される。
【００９１】
典型的には、イムノアッセイは、標識された抗体か、（例えば、抗体に対する結合に関して、サンプル中の抗原と競合する）標識された抗原性の成分のいずれかを用いる。適当な標識には制限されるものではないが、酵素に基くもの、蛍光、化学ルミネッセント、放射能活性、または色素分子が含まれる。例えば、ビオチンおよびアビジンを用いるもの、およびＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識イムノアッセイなど、プローブからシグナルを増幅するアッセイも公知である。
【００９２】
インビトロスクリーニング法
候補化合物を、当該分野で公知の方法により調製した宿主細胞のインビトロ細胞培養物中に添加し、継いでＣｙｒ６１ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定する。種々のインビトロ系を用いて、Ｃｙｒ６１の転写および翻訳における新規化合物の効果を分析することができる。好ましくは、各実験は、１回以上、化合物の多様な異なる希釈の３つ組で行う。
【００９３】
本発明の宿主細胞スクリーニング系により、２種のアッセイ：直接活性アッセイ（アゴニストスクリーン）および阻害アッセイ（アンタゴニストスクリーン）が可能となる。アゴニストスクリーンは、試験化合物と接触した宿主細胞による遺伝子の発現のレベルの変化、一般的には、遺伝子の発現の増加を検出することを含む。Ｃｙｒ６１遺伝子が発現されたら、試験化合物がレセプターの相互作用によりＣｙｒ６１の転写を刺激している。
【００９４】
アンタゴニストスクリーンは、Ｃｙｒ６１の発現を調節する化合物と接触させた場合の宿主細胞によるレポーター遺伝子の発現を検出することを含む。Ｃｙｒ６１の発現が低下したなら、試験化合物は候補アンタゴニストである。レポーター遺伝子の発現に、変化も増加もない場合、試験化合物は有効なアンタゴニストではない。
【００９５】
本明細書中に開示されるアッセイ系は、アゴニストおよびアンタゴニストの高処理量一次スクリーニングに用いられてよく、または、例えばレセプターと相互作用し、そしてＣｙｒ６１の転写に影響を与える化合物を同定する結合アッセイスクリーニングなどの別個の一次スクリーニングにより同定される候補化合物の二次機能スクリーニングとして用いられてよい。
【００９６】
トランスジェニック動物を用いるインビボ試験
トランスジェニック動物、および好ましくは哺乳動物を、Ｃｙｒ６１の分子機構を評価するために調製することができる。好ましくは、ヒトの治療に用いる化合物を評価するために、動物をＣｙｒ６１に対して「ヒト化」する。そのような哺乳動物は、薬物候補をスクリーニングまたは試験するための優れたモデルを提供する。「トランスジェニック」なる用語は、通常、生殖系および体細胞が目的の移入遺伝子、すなわちＣｙｒ６１を含む動物を意味する。しかし、トランジェントなトランスジェニック動物を、本発明の発現ベクターの、エキソビボまたはインビボでの誘導により作製することができる。両タイプの「トランスジェニック」動物が、本発明における使用、例えば、試験化合物のＣｙｒ６１またはＣｙｒ６１の活性における効果を評価するために企図される。
【００９７】
つまり、この系の分子生物学を、ヒトの対象を用いて可能である以上に詳細に評価するために、ヒトのＣｙｒ６１、「ノック−イン」哺乳動物を調製することができる。「ノックアウト」動物において化合物または疾患を評価すること、例えばＣｙｒ６１またはＣｙｒ６１の活性の欠損を補い得る化合物を同定することも可能である。両技術により、細胞ゲノム中のその天然の位置において遺伝子情報の単一ユニットの操作、および最終的に分化した生物体の背景におけるその操作の結果を決定することが可能となる。
【００９８】
ラットおよびマウスならびにウサギは、特にインビボでのタンパク質の機能および遺伝子の調節に関する研究室における試験のためにトランスジェニック動物として最もよく用いられるが、本発明の実施においては、あらゆる動物を用いることもできる。
【００９９】
「ノックイン」哺乳動物は、内在遺伝子が異種構造遺伝子で置換された哺乳動物である（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ３： ３３１， １９９１）。好ましくは、異種構造遺伝子または調節系は、異種構造遺伝子の発現または機能の評価の対象である、目的の位置に「ノック−イン」され（この場合、遺伝子はレポーター遺伝子であってよい。Ｅｌｅｆａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５： １１８９７， １９９８を参照されたい。）、それにより、異種構造遺伝子の発現が適当なプロモーターからの転写と関連づけられる。これは、相同組換え、トランスポゾン（Ｗｅｓｔｐｈａｌ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７： ５３０， １９９７）により、変異組換え部位（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５： ８６８， １９９７）またはＰＣＲ（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５： ７８４， １９９８）を用いて達成することができる。Ｃｏｆｆｍａｎ， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １７： ４０４， １９９７； Ｅｓｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４： ９５３， １９９６， Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｕｐｐｌ． ２： ３６， １９９６も参照されたい。
【０１００】
「ノックアウト哺乳動物」は、そのゲノム内に、遺伝子ターゲッティング法により不活性化された特異的遺伝子を含む哺乳動物（例えば、マウス）である（例えば、米国特許第５，７７７，１９５号および第５，６１６，４９１号を参照されたい）。ノックアウト哺乳動物には、ヘテロ接合ノックアウト（即ち、一の欠損対立遺伝子および一の野生型対立遺伝子）およびホモ接合変異体の両方が含まれる。ノックアウト哺乳動物の調製には、まず、特定の遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸構築物を、胎児幹細胞と呼ばれる未分化の細胞タイプに導入することが必要である。この細胞を次いで哺乳動物の胎児に注入する。組み込まれた細胞を有する哺乳動物の胎児を継いで、妊娠期間の維持のためのフォスターマザーへ着床させる。Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ９： ２６２３−３４， １９９５）は、ＰＰＣＡノックアウトマウスを開示する。
【０１０１】
「ノックアウト」なる用語は、細胞中の内在ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的もしくは完全な抑制を意味する。「ノックアウト構築物」なる用語は、細胞中の内在ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を減じるもしくは抑制するために設計された核酸配列を意味する。ノックアウト構築物として用いられる核酸配列は、典型的には、（１）抑制されるべき遺伝子のいくつかの部分からのＤＮＡ（エキソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）および（２）細胞中でのノックアウト構築物の存在を検出するのに用いられるマーカー配列から典型的に成る。ノックアウト構築物を細胞へ挿入し、そして、本来のＤＮＡ配列の転写を防ぐまたは妨害するような位置に細胞のゲノムＤＮＡと統合させる。そのような挿入は、相同組換えにより起こることが多い（即ち、ノックアウト構築物が細胞内ＤＮＡの対応する位置に組み込まれるようにノックアウト構築物を細胞内に挿入し、そして再度結合させた場合、内在ＤＮＡ配列に対して相同なノックアウト構築物の領域が互いにハイブリダイズする）。ノックアウト構築物の核酸配列は、（１）抑制されるべき遺伝子の１またはそれ以上のエキソンおよび／またはイントロンの完全または部分配列、（２）抑制されるべき遺伝子の完全または部分的プロモーター配列、または（３）その組み合わせを含んでよい。典型的には、ノックアウト構築物を胎児幹細胞（ＥＳ細胞）へ挿入し、継いでＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに、通常、相同組換え法により組み込む。このＥＳ細胞を発生中の胎児へ次いで注入し、そして組み込む。しかし、本発明は、トランスジェニック動物を調製するための特別な方法は全く必要としない。
【０１０２】
一般的には、相同組換えのために、ＤＮＡは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）の長さおよび好ましくは３−４ｋｂの長さであり、それにより、構築物が導入された場合に、組換えのために十分な相補配列が提供される。トランスジェニック構築物は、ＥＡ細胞のゲノムＤＮＡへ、受精した卵母細胞の雄性生殖核へマイクロインジェクションにより、または例えば米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒにより開示されているような、当該分野で公知のいずれかの方法により導入することができる。トランスジェニック初代動物を用いて、他のトランスフェニック動物を作り出すこともでき、別法として、トランスジェニック初代動物をクローン化して、他のトランスジェニック動物を作製してもよい。
【０１０３】
２またはそれ以上の遺伝子がノックアウトされたか、またはノックインされた哺乳動物、またはその両方がなされた哺乳動物が、本発明の範囲内に含まれる。そのような動物は、各ノックアウト構築物を作製するために本明細書中に記載した方法を反復することにより、またはノックアウトされた単一の遺伝子をそれぞれ有する哺乳動物を飼育し、次いで、ダブルノックアウトゲノタイプでそれらをスクリーニングすることにより作製することができる。
【０１０４】
調整されたノックアウト動物は、ｔｅｔ−レプレッサー系（米国特許第５，６５４，１６８号を参照されたい）またはＣｒｅ−Ｌｏｘ系（米国特許第４，９５９，３１７号および５，８０１，０３０号を参照されたい）などの種々の系を用いて調製することができる。
【０１０５】
Ｃｙｒ６１のクローニングおよび発現
本発明は、いずれかの源、好ましくはヒトからのＣｙｒ６１のいずれかの抗原性フラグメントの分析および単離を企図する。さらに、評価、診断、または治療のための機能または変異ＣＹｒ６１タンパク質の発現も企図する。
当該分野の技術範囲内にある常套の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法を、本発明の使用に用いてよい。そのような方法は、完全に文献の中に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （本明細書中、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（ Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｍｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）］； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）を参照されたい。
【０１０６】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法
本発明に従い、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のアップレギュレーションを用いて、例えば子宮平滑筋腫などのＣｙｒ６１に関連する疾患の増大を阻害することができる。本発明により、対象に、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激する化合物の治療的有効量を投与することにより、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。本発明により、細胞中のＣｒｙ６１タンパク質のトータルのレベルを増すことにより、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法がさらに提供される。これらの方法には、制限されるものではないが、細胞へのＣｙｒ６１タンパク質の送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）に対するＣｙｒ６１の結合を調節する化合物の治療的有効量の投与が含まれる。化合物は、対象への投与のための医薬組成物（以下に示す）へと処方されてよい。本発明により、対象に、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または組換えＣｙｒ６１タンパク質を刺激する組換えＤＮＡの治療的有効量を投与することにより子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。特定の具体例において、子宮平滑筋腫の増殖の阻害は、増殖が少なくとも２０％まで、好ましくは少なくとも４０％まで、およびより好ましくは少なくとも８０％まで低下する場合に、認められる。
【０１０７】
ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦのレベルは、平滑筋腫、例えば、子宮平滑筋腫などにおいてアップレギュレートされる。平滑筋腫におけるＣｙｒ６１の低下は、ＩＧＦおよび成長因子の活性を増し、およびゆえに、これらの分子が細胞の増殖を刺激するのにより効果的である可能性がある。それゆえ、本発明のさらなる具体例は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激するための、およびＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦまたはそのいずれかの組み合わせのｍＲＮＡの合成、ｍＲＮＡの翻訳、発現または活性を減じるための方法を企図する。
【０１０８】
本発明の化合物の有効量は、個人の症状、体重、性および年齢、および投与様式などの種々の要因により変化し得る。化合物のこの量は、投与量および頻度の行列を確立し、次いで実験対象群を行列中の各ポイントへ割り当てることによるなどの、当該分野で周知の方法により、実験的に決定することができる。
【０１０９】
子宮平滑筋腫の形成を予防する方法
本発明によれば、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現は、子宮平滑筋組織と比較して、自系子宮筋層組織においてより高い。本発明により、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現またはＣｙｒ６１の活性を刺激する化合物の対象に治療的有効量を投与することにより、子宮平滑筋腫瘍の形成を予防する方法が提供される。本発明によりさらに、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞中でのトータルのレベルを増すことにより、子宮平滑筋腫の形成を予防する方法がさらに提供される。これらの方法には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞への送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）への結合を調節する化合物の治療的有効量の投与が含まれる。化合物は、対象への投与のために、医薬組成物（以下に示す）へと処方されてよい。本発明により、対象に、治療的有効量の組換えＤＮＡを投与して、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または組換えＣｒ６１タンパク質を刺激することにより、子宮平滑筋腫の形成を予防する方法が提供される。
【０１１０】
これまでの報告で示されているように、ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦのレベルは平滑筋腫、例えば子宮平滑筋腫などにおいてアップレギュレートされる。Ｃｙｒ６１の平滑筋腫における低下は、ＩＧＦおよび成長因子の活性を増し得、およびこのゆえ、これらの分子は、細胞増殖を刺激するのにより効果的である可能性がある。それゆえ、本発明のさらなる具体例は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激するための、および／またはＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ、ｂＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦまたはそのいずれかの組み合わせのｍＲＮＡの合成、ｍＲＮＡの翻訳、発現、または活性を減じるための方法を企図する。これらの化合物の有効量は、個人の症状、体重、性ならびに年齢、および投与様式などの種々の要因により変化してよい。試験化合物のこの量は、投与量および頻度の行列を確立すること、および行列中の各ポイントへ実験対象群を割り当てることによるなどして、当該分野で周知の方法により、実験的に決定することができる。
【０１１１】
診断法
本発明に従い、子宮筋層組織において通常発現されるレベルと比較して低下したＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出して、子宮平滑筋腫などのＣｙｒ６１関連疾患を診断することができる。本発明において、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、同じ個人から得られた正常の平滑筋層組織（自系子宮筋層組織）に存在するＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較する。正常組織と比較した、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１タンパク質およびＣｙｒ６１ｍＲＮＡのより低いレベルが、子宮平滑筋腫の存在を示す。好ましくは、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルまたはＣｙｒ６１タンパク質のレベルは、正常組織と等しいか、またはそれより３倍以上低い。より好ましくは、該レベルは、正常組織よりも約９〜約１０倍低い。低いレベルを用いて、本明細書に開示するＣｙｒ６１関連治療に加えて少なくとも２の治療法をさらに含む治療法を開発してよい。疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡおよびＣｙｒ６１タンパク質のレベルは、細胞中に存在する追加したｍＲＮＡおよびタンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨなどの）のレベルを正規化することにより、正常組織と比較する。
【０１１２】
Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のそのような低下したレベルを検出するための種々の方法には、制限されるものではないが、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション試験、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープラベルを用いる）、沈降反応、補体固定アッセイ、イムノフルオレセンスアッセイ、タンパク質Ａアッセイ、およびイムノエレクトロフォーレシスアッセイなどが含まれる。
【０１１３】
核酸アッセイ
ＤＮＡは、あらゆる細胞源から得てよい。ＤＮＡは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかを用いて、細胞源または体液から抽出する。ＤＮＡを抽出するのに用いられる特定の方法は、源の性質に依存するであろうことが理解されるであろう。一般に、本発明における使用のために抽出される最小量のＤＮＡは、約２５ｐｇ（４×１０９塩基対のゲノムサイズに相当する約５細胞に対応する）である。配列決定法は、既に詳細に前に記載してある。
【０１１４】
他の別の具体例において、ＲＮＡは、例えば、グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２： １５６， １９８７）などの当業者に公知の方法を用いて、生検組織から単離する。単離されたＲＮＡを次いで、ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による一対の逆転写および増幅に、選択される部位に特異的な特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて供する。プライマーのアニーリングのための条件を選択して、特定の逆転写および増幅を確保する。つまり、増幅産物の様相が、特定の遺伝子の変化の存在を診断的に示す。他の具体例においては、ＲＮＡを逆転写および増幅し、その後、増幅された配列を、例えば直接配列決定により同定する。さらに別の具体例においては、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローン化し、次いで配列決定して、変異を同定することができる。
【０１１５】
タンパク質アッセイ
別の具体例においては、組織を対象から得る。Ｃｙｒ６１に対して特異的に結合することができる抗体を次いで、組織のサンプルと接触させて、抗体により特定されるＣｒｙ６１ポリペプチドの存在または不在を決定する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよいが、好ましくはモノクローナルである。細胞に結合している特異的抗体の測定は、例えば、定量フローサイトメトリー、酵素結合または蛍光結合イムノアッセイ、ウェスタン分析などのいずれかの公知の方法により行われてよい。一般には、本発明における使用のための、イムノアッセイのために抽出されるべきタンパク質の最少量は、約２０μｇである。
例えば、米国特許第５，７４７，２７４号および第５，７４４，３５８号に開示されているようなイムノアッセイ技術、および特に、固相「クロマトグラフィー」型のイムノアッセイが、血液または血液フラクション中のタンパク質を検出するのに好ましい。
【０１１６】
医薬組成物
試験化合物、その塩、抗体、タンパク質、発現ベクターおよびアンチセンス構築物を、医薬組成物中に処方してよい。医薬組成物は、前記の少なくとも一つの治療または刺激有効量を含む。これは、標的細胞内でのＣｙｒ６１の発現または活性、Ｃｙｒ６１遺伝子の転写、またはＣｙｒタンパク質を増すのに有効な量であり得る。組成物は、Ｃｙｒ６１タンパク質または該タンパク質のフラグメントを含み得る。Ｃｙｒ６１タンパク質のフラグメントは好ましくは、全長のタンパク質に伴う機能活性を保持する。特定の具体例において、Ｃｙｒ６１タンパク質のＣ末端領域を、変更、削除、または変異して、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または機能を増加もしくは低下させてよい。
【０１１７】
医薬組成物は、典型的には、エタノール、グリセロール、水などの医薬上許容されるキャリア（または投与ビヒクル）をさらに含む。そのようなキャリアの例および処方の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９９０）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに開示されている。
【０１１８】
医薬組成物は、他の添加剤、例えば風味剤、甘味剤、保存剤、色素、結合剤、懸濁剤、着色料、崩壊剤、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、可塑剤、または前記のいずれかのあらゆる組み合わせをさらに含んでよい。適当な結合剤には、制限されるものではないが、スターチ、ゼラチン、天然シュガー、例えばグルコースおよびベータ−ラクトースなど；トウモロコシの甘味剤；天然および合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント、およびナトリウムアルギネート；カルボキシメチルセルロース；ポリエチレングリコール；ワックスなどが含まれる。適当な潤滑剤には、制限されるものではないが、ナトリウムオレエート、ナトリウムステアレート、マグネシウムステアレート、ナトリウムベンゾエート、ナトリウムアセテート、ナトリウムクロライドなどが含まれる。適当な崩壊剤には、制限されるものではないが、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。
【０１１９】
試験化合物の適当な塩には、制限されるものではないが、酸付加塩、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、カルボン酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、および２−アセトキシ安息香酸などと作製されるもの、およびサッカリンを用いて作製される塩が含まれる。化合物の他の適当な塩には、制限されるものではないが、アルカリ金属塩、例えばナトリウムおよびカリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩など；および有機リガンドと形成される塩、例えば第四アンモニウム塩などが含まれる。
【０１２０】
典型的な塩には、制限されるものではないが、本発明の化合物のアセテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタートレート、ボレート、ブロマイド、カルシウムエデテート、カムシレート、カルボネート、クロライド、クラブラネート、シトレート、ジヒドロクロライド、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルタメート、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾシネート、ヒドラバミン、ヒドロブロマイド、ヒドロクロライド、ヒドロキシナフトエート、ヨーダイド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、メチルブロマイド、メチルニトレート、メチルスルフェート、ムケート、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、ニトレート、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレエート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクトウロネート、サリチレート、ステアレート、スルフェート、サブアセテート、スクシネート、タンネート、タートレート、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、およびバレレート塩が含まれる。
【０１２１】
本発明には、試験化合物のプロドラッグが含まれる。プロドラッグには、制限されるものではないが、本発明の化合物へとインビボで容易に変換され得る本発明の試験化合物の機能性誘導体が含まれる。適当なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための常套の方法は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｈ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」，ｅｄ． Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５に開示されている。
【０１２２】
医薬組成物は、経口、非経口、鼻腔内、眼、粘膜、経皮、口内、局所、舌下、または直腸用に、錠剤、ピル、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌Ｉ．Ｖ．溶液、滅菌Ｉ．Ｍ．溶液、滅菌腹腔内溶液、エリキシル、チンキ、計量エアゾールまたは液体スプレー、ドロップス、アンプル、自己注射器または坐薬などの単位投与製剤として処方されてよい。単位投与製剤は、持続または遅延放出に適した形態、例えば、筋肉内注射のためのデポ調製を提供するべく適合された化合物の不溶塩、例えばデカノエート塩などであってよい。
【０１２３】
固体単位投与製剤は、医薬上許容されるキャリアおよび固体前処方組成物を形成するためのいずれかの他の所望される添加剤と本発明の化合物を混合することにより調製されてよい。固体単位投与製剤に適した添加剤の例には、制限されるものではないが、スターチ、例えばコーンスターチ；ラクトース；スクロース；ソルビトール；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；ジカルシウムホスフェート；ガム、例えば植物性のガム；および医薬希釈剤、例えば水が含まれる。固体前調製組成物は典型的には、組成物が平等に有効な単位投与製剤へと容易に細分できるように、本発明の化合物および添加剤の均一混合物が形成されるまで、すなわち、化合物が組成物全体に均等に分散するまで、混合する。固体の前調製組成物は次いで、前記のタイプの単位投与製剤に細分する。
【０１２４】
錠剤またはピルはコートされ、またはそうでなければ配合されて、例えば時間放出および持続放出単位投与製剤など、長期活性を有する単位投与製剤を形成することもできる。例えば、錠剤またはピルは、内部投与成分および外部投与成分を含むことができ、後者が前者を包む形態となる。２つの成分は、胃での崩壊に抵抗するのに役立つ腸溶層により分離されて、内部成分が十二指腸へとそのまま通過すること、または放出が遅延すること可能となる。化合物は、投与後すぐに放出されてよく、または化合物が、特定のタイムコース、例えば２−１２時間以上持続する様式で放出されるように処方されてよい。
【０１２５】
液体単位投与製剤には、制限されるものではないが、水溶液、適当に風味付けられたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油で風味付けられたエマルジョン、例えば綿実油、ゴマ油、ココナッツオイルまたはピーナッツオイル、ならびにエリキシルおよび同様の医薬ビヒクルが含まれる。水性懸濁液に適した分散および懸濁剤には、制限されるものではないが、トラガカント、アカシア、アルギネート、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニル−ピロリドンおよびゼラチンなどの合成および天然ゴムが含まれる。
【０１２６】
局所製剤に適した医薬上許容されるキャリアには、制限されるものではないが、アルコール、アロエべラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥオイル、ミネラルオイル、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどが含まれる。そのような局所製剤は、液体水薬、アルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、皮膚のゲル、皮膚のローション、およびクリームまたはゲル処方（制限するものではないが、水溶液および懸濁液を含む）のシャンプーであってよい。典型的には、これらの局所製剤は、懸濁剤、例えばベントナイト、および任意に泡止め剤を含む。一般に、局所製剤は、局所製剤の１００％のトータルの重量に基いて約０．００５〜約１０重量％の、および好ましくは約０．０１〜約５重量％の化合物を含む。
【０１２７】
非経口投与のための、および特に注射による本発明の医薬組成物には、典型的には、水などの不活性液体キャリア、制限されるものではないが、ピーナッツオイル、綿実油、ゴマ油などを含む植物性油、およびソルケタール、グリセロールホルマールなどの有機溶媒が含まれる。好ましい液体キャリアは、植物油である。これらの医薬組成物は、本発明の化合物を液体キャリアに溶解または懸濁することにより調製されてよい。一般には、非経口投与のための医薬組成物は、トータルの医薬組成物の１００％重量に基いて、約０．００５〜約１０重量％の本発明の化合物を含む。
【０１２８】
本発明の化合物は、小さな単層ビヒクル、大きな単層ビヒクル、および多層ビヒクルなどのリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどから作製することができる。
【０１２９】
本発明の化合物は、化合物分子が結合する個々のキャリアとしてモノクローナル抗体を用いることにより送達されてもよい。本発明の化合物は、標的可能な薬物キャリアとしての水溶性ポリマーと結合してもよい。そのようなポリマーには、制限されるものではないが、パルミトイル基で置換された、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、およびポリエチレンオキシドポリリジンが含まれる。さらに、本発明の化合物は、化合物の放出をコントロールするための生物分解可能なポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合してもよい。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、Ｃｙｒ６１の転写または発現を刺激することを必要とする動物、好ましくはヒトに投与して、例えばステロイドまたは成長因子レセプターなどの活性化によるなどして、Ｃｙｒ６１の転写または発現を刺激することができる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の活性剤および活性剤の活性代謝物の有効量は、個人の症状、体重、性および年齢および投与様式などの種々の要因によって変化してよい。試験化合物のこの量は、投与量と頻度の行列を確立すること、および行列中の各ポイントへ実験対象群を割り当てることによるなど、当該分野で周知の方法により実験的に決定することができる。
【０１３２】
本発明の化合物は、潜在的な毒性はいずれも最小に抑えつつ最適の活性を得るために、通常の試験により決定される適当な投与量にて単独で投与されてよい。加えて、他の活性剤の同時投与または連続投与も望まれる。
【０１３３】
本発明の化合物の毎日投与量は、広い範囲で変化してよい。経口投与のためには、医薬組成物は好ましくは、治療される患者に対する投与量の症状に基く調整のために、スコアまたは非スコア錠剤の形態で提供される。所望の効果を達成するために前記のような他の活性剤と組み合わせる場合、投与量は調整されてよい。他方、これらの種々の活性剤の単位投与形態を独立に最適化して、および組み合わせて、いずれかの活性剤が単独で用いられる場合よりも病因を低下させる共同効果を達成してよい。
【０１３４】
都合よくは、医薬組成物は、単一毎日投与にて投与してよく、またはトータルの毎日投与を、一日２、３、または４回に分割投与してよい。
活性剤が別個の投与製剤である１以上の活性剤との組み合わせ治療に関しては、活性剤は、同時投与してよく、またはそれらはそれぞれ別個に時間をずらして投与してよい。
【０１３５】
遺伝子治療
平滑筋腫におけるＣｙｒ６１の発現の欠損は、遺伝子が位置する染色体ｌｐ２２−ｐ３１の対立遺伝子欠損または変更、エストロゲンまたは成長因子シグナリング経路の排除、および／またはＥＲおよびプロモーター領域内に含まれるＥＲおよび成長因子応答エレメントの変異による可能性もある。Ｃｙｒ６１の別のコピーを宿主に提供することにより、天然に生じている可能性のあるあらゆる遺伝子変異を克服できる可能性がある。
【０１３６】
特定の具体例において、本発明のＣｙｒ６１をコードしている配列を含んでいるベクターを投与して、機能性Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または変異Ｃｙｒ６１の発現の欠損に伴う疾患または病気が治療もしくは予防される。
当該分野で利用できる遺伝子治療のための方法のいずれも、本発明に従い用いることができる。典型的な方法を以下に示す。
【０１３７】
遺伝子治療法に関する概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９９３， １２： ４８８−５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｂｉｏｔｈｅｒｐｙ， １９９１， ３： ８７−９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９９３， ３２： ５７３−５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２６０： ９２６−９３２； ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９３， ６２： １９１−２１７； Ｍａｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ， １９９３， １１： １５５−２１５を参照されたい。用いることができる組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； およびＣｈａｐｔｅｒ １２および１３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹに開示されている。遺伝子治療に適したベクターは、前に記載されている。
【０１３８】
一態様において、治療ベクターは、適当な宿主中でＣｙｒ６１を発現する核酸を含む。特に、そのようなベクターは、Ｃｙｒ６１のコーディング配列に操作可能な状態で結合したプロモーターを有する。プロモーターは、誘導性または構造性であり得、および任意に組織特異的であり得る。本発明の特定の具体例において、プロモーターはエストロゲン応答エレメントまたは繊維芽細胞成長因子応答エレメントである。他の具体例において、抗体コーディング配列およびいずれかの他の所望の配列に、ゲノムの所望の位置での相同組換えを助長する領域が隣接している核酸分子を用いて、Ｃｙｒ６１の染色体内での発現を提供する（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６： ８９３２−８９３５； Ａｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ４３５−４３８）。
【０１３９】
患者へのベクターの送達は、患者をベクターまたは送達複合体へ直接曝す直接的なものであっても、または細胞をまずインビトロでベクターで形質転換し、次いで患者へ移植する間接的なもののいずれかであってよい。これらの２つの手段はそれぞれ、インビトロおよびエキソビボ遺伝子治療として知られている。
【０１４０】
特定の具体例において、ベクターをインビボで直接投与し、その場合、それはその生物体にて細胞へ入り、そしてＣｙｒ６１の発現を媒介する。これは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかにより、例えば、それを適当な発現ベクターの部分として構築し、およびそれをそれが細胞内のものとなるよう、例えば欠損または弱毒化されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または裸のＤＮＡを直接注入することにより、または微粒子ボンバード（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）の使用；または脂質または細胞表面レセプターまたは形質転換剤でコーティングすること、バイオポリマー（例えば、ポリ−＊−１−＊４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリサッカライド；米国特許第５，６３５，４９３号を参照されたい）のカプセル化、リポソーム、微粒子、またはミクロカプセル中のカプセル化により；核へ入ることが公知のヘプチドまたは他のリガンドへ結合させてそれを投与することにより；または、レセプター媒介エンドサイトーシスを受けやすいリガンドに結合させてそれを投与することにより（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８７， ６２： ４４２９−４４３２を参照されたい）、達成することができる。他の具体例では、核酸−リガンド複合体を作製することができ、ここでリガンドは、エンドソームを崩壊し、核酸がリソソームによる崩壊を受けるのを回避させる外来ウイルスペプチドから成る。さらに他の具体例では、核酸は、細胞の特異的取りこみおよび発現のために、特異的レセプターをターゲッティングすることによりインビボで標的することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号、第ＷＯ９２／２２６３５号、第ＷＯ９２／２０３１６号、および第ＷＯ９３／１４１８８号を参照されたい）。別法として、核酸は、相同組換えによる発現のために、細胞内へ導入し、そして宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Ｋｏｏｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８９， ８６： ８９３２−８９３５； Ｚｉｊｌｓｔｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ４３５−４３８）。これらの方法は、「Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」と共に前記で論じたものに追加するものである。
【０１４１】
別法として、例えば、標的細胞集団内で一本鎖の抗体をコードしている核酸配列を、例えばＭａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０： ７８８９−７８９３に開示されているものなどの方法を用いて発現させることにより、投与することもできる。
使用が想定される治療用核酸の形態および量は、疾患のタイプおよび所望の効果の強さ（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、患者の状態などに依存し、そして当業者が決定することができる。
【０１４２】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろうが、例として提供されるものであり、制限するものではない。
材料：抗−Ｃｙｒ６１ポリクローナル抗血清を、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ， ＬＡ）において、ヒトＣｙｒ６１（図７；配列番号２）タンパク質のアミノ酸３７１−３８１（ＲＬＦＮＤＩＨＫＦＲＤ；配列番号３）に対して作製した。システインを、キャリアタンパク質に対するカップリングのためにＮ−末端に付加した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応（ＰＥ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９０５０＋）を用いて、自動相ペプチドシンセサイザーを用いて合成した。フォトヨーダイドアレイディテクターを備えたＣ１８Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（２５０×２１．２０ｍｍ、１０μの直径）と共にＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ４００予備クロマトグラフィーシステムを用いて、ペプチドを精製した。１００ｍＬ／分を越すカラムを通す流速により、約４００−５００ｍｇのペプチドが精製される。抗原性ペプチドの同定および精製は、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＥ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメーターを用いて評価した。ペプチドを次いでキーホールリンペットヘモシアニンに結合し、次いで等容積の完全および不完全フレンドアジュバントと混合した。
【０１４３】
混合物を次いで、雌のニュージーランド白ウサギに注射した（２００μｇ抗原およびアジュバント混合物／ウサギ）。１４および２８日目に、最初の注射と同サイズのブースター注射を施した。３８日目、ウサギからの血液を、抗体の存在に関してＥＬＩＺＡ（ストレプトアビジン／ビオチンシステムを用いて）を用いて試験した。強い抗体タイターが必要な場合、ウサギに初期の注射と同じサンプルサイズのブースター注射を４２日目に施した。血清を５２日目にウサギから回収し、次いで凍結した。ポリクローナル抗体を、抗原を結合相（Ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ， Ｐｉｅｒｃｅ）に、システインの側鎖を用いて結合することによりアフィニティ精製した。約３０ｍＬの血清をカラムに乗せ、次いで洗浄して非結合タンパク質を除去した。抗体を、３．５ＭのＭｇＣｌ２／エチルグリコールで溶離した。溶離されたタンパク質を透析し、次いで約１ｍｇ／ｍＬへと濃縮した。濃度は２８０ｍｍのＯＤで決定した。
【０１４４】
１７β−エストラジオール（Ｅ２）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入し、プロゲステロンレセプターアゴニスト、Ｒ５０２０はＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｉｎｃ． （Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から得、ｂＦＧＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入し、そしてＥＲアンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０はＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄｅｌａｗａｒｅ）により豊富に提供された。
【０１４５】
研究対象および組織の獲得 子宮平滑筋腫および同調させた平滑筋腫標本を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓにより許可されたプロトコールに従い、Ｄｅｐａｔｒｍｅｎｔｏ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｈｏｓｐｉｔａｌでの通常の子宮摘出後に得た。組織サンプルは、ホルモン置き換え治療も、規定のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストも受けていない３８歳〜５３歳（平均年齢＝４５）の患者から提供された（ｎ＝３８）。一人を除く全ての患者は、手術前、正常の月経周期を体験していた。全ＲＮＡの単離のために、子宮摘出後に液体窒素に組織標本を迅速に凍結し、またはインサイチュハイブリダイゼーションのために、１０％の中性緩衝処理されたホルマリンに固定した。エキソビボ培養のための組織は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢをファンギゾンとして含むフェノールレッド不含ＤＮＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２媒質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）に入れ、次いで氷上に移した。
【０１４６】
ディファレンシャル発現の迅速分析（ＲＡＤＥ）を用いる、調節遺伝子の同定
ＲＡＤＥをすでに報告されているように行った（Ｌｉａｎｇ Ｐ， Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ． １９９７． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐａｇｅ １５０）。簡単には、同調平滑筋腫および子宮筋層組織から単離した全ＲＮＡ（ｎ＝４）をＲＡＤＥ分析のために用い、そして各ＲＮＡサンプルは対で分析した。ｃＤＮＡの合成を、Ａ、Ｇ、またはＣのいずれかで終わっているｐ（ｄＴ）１８オリゴヌクレオチドを用いることにより行った。ｃＤＮＡの合成後、遺伝子をランダムオリゴマー、適当なｐ（ｄＴ）１８下流プライマー、および３５Ｓ標識ｄＡＴＰの組み合わせを用いて増幅した。生じた生成物を二倍に増幅し、ＳＤＳポリアクリルアミド配列決定ゲル上で分離し、次いでオートラジオグラフィーにより検出した。処理を繰り返した後、候補のｃＤＮＡフラグメントをポリアクリルアミドゲルスライスから抽出し、次いで適当なプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、ｐＢＲ３２２へとサブクローニングし、ＡＢＩ３７７／３７３シークエンサーを用いて配列決定し、次いでＢＬＡＳＴＮソフトウェアを用いて分析した（Ａｌｔｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ２５： ３３８９−３４０２）。
全ＲＮＡのＲＡＤＥ分析により、同調子宮筋層コントロールと比べて、４の平滑筋腫標本の中の４つにおいて、４１０ヌクレオチドのｃＤＮＡフラグメントの低下した発現が立証された。ＢＬＡＳＴＮソフトウェアを用いる配列分析により、該ｃＤＮＡフラグメントがヒトのＣｙｒ６１のＣ末端部分に対して９６％相同であることが立証された。
【０１４７】
Ｃｙｒ６１およびＥＲαのノーザンブロッティング 全細胞質ＲＮＡを、グアニジウムイソチオシアネート分解の後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことにより、子宮筋層および平滑筋組織ホモジェネートから単離した。次いで、全細胞内ＲＮＡ（２０μｇ）を、１Ｍのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル中で電気泳動に供した。分離したＲＮＡ転写産物を、キャピラリー電気泳動によりナイロン膜上に移し、次いでＲａｐｉｄＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）中で、６０℃にて前ハイブリダイズさせた。０．４１ｋｇのヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡフラグメントを［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、ランダムプライマー法（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて放射能標識し、そして、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。放射能標識プローブ（１×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を、４時間、６０℃にて膜へハイブリダイズした。膜を２回、１×ＳＳＰＥ（０．１５ＭのＮａＣｌ、１μＭのＥＤＴＡ、および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）および０．１％のＳＤＳにて１５分間２５℃で洗浄し、次いで０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにて５分間６０℃にて最終洗浄した。エストロゲンレセプターα（ＥＲα）の発現に関しては、膜を、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射能標識した１．９６ｋｂのヒトＥＲαｃＤＮＡ（１．９６ｋｂの全長コーディング領域）で再度プローブし、ハイブリダイズさせ、次いで前記のように洗浄した。Ｃｙｒ６１の相対的なレベルを、３２Ｐで放射能標識したオリゴヌクレオチドを製造業者のプロトコル（末端ラベリングキット、ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）に従い用いて膜を再度プローブした後、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。
【０１４８】
１０人の患者から単離された全ＲＮＡを用いてノーザン分析を行った。Ｃｙｒ６１転写産物は、試験した１０人の患者のうちの１０人（図１Ｂ）において、自系子宮筋層と比較して、平滑筋腫標本において懸著に低下した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化したＣｙｒ６１ｍＲＮＡの低下は、自系子宮筋層に存在する高い基本レベルと比較して９倍を越した（図１Ｄ）。
【０１４９】
Ｃｙｒ６１に関するタンパク質抽出およびイムノブロッティング 組織タンパク質抽出物を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１．０％のトライトン−Ｘ１００、２％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコレート、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１０μｇ／ｍｌのペプスタチン、アプロチニン、およびロイペプチン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含むプロテアーゼインヒビターカクテル中での均質化により、平滑筋腫、および同調子宮筋層組織標本から調製した。タンパク質抽出物（２０μｇ）を、１０％のビス−アクリルアミド中の還元条件下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いでポリビニルジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ， Ｂｉｏｒａｄ， Ｒｅｄｄｉｎｇ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に電気泳動により移した。膜を５％の乾燥ミルクでＴＢＳ／０．１％トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）上にブロックし、次いで抗−Ｃｙｒ６１ｐＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。結合している一次抗体を、ロバのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた抗−ウサギＩｇＧ抗体および高機能化学ルミネセンス検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。タンパク質レベルを正規化するために、Ｃｙｒ６１ウェスタンブロットを次いでパン−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）で再度プローブし、次いで、ＨＲＰに結合させたロバの抗マウス二次抗体で検出した。
平滑筋腫および同調子宮筋層コントロールから生じた全細胞溶解物のイムノブロット分析は、試験した１０人の患者のうちの１０人において、Ｃｙｒ６１タンパク質の１０倍以上の低下を示した（図２ＡおよびＣ）。
【０１５０】
インサイチュハイブリダイゼーション リボプローブ合成のために、０．２８ｋｂのヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ａｆプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に位置クローニングして、ｐＧＥＭ４Ｚｆ／Ｃｙｒ６１を作製した。放射能標識した３５Ｓ−ＵＴＰセンスおよびアンチセンスｃＲＮＡ転写産物をインビトロでＴ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いて、Ｇｅｍｉｎｉ Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写した。インサイチュハイブリダイゼーションを、前記のように、ホルマリンに固定した平滑筋腫および同調子宮筋腫標本を用いて行った。簡単には、加工したスライドを一晩、１００−１５０μｌのアンチセンスまたはセンス（コントロール）リボプローブを、５％デキストランスルフェートおよび２００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５０％のホルムアミドハイブリダイゼーション混合液中４．７×１０６ＤＰＭ／スライドにて、５５℃にて、５０％のホルムアミド／６００ｍＭのＮａＣｌを含む加湿チャンバー中でハイブリダイズさせた。スライドを室温で、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）／１０ｍＭのＤＴＴ中で３回洗浄した後、ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）処理を３０分間３７℃で行い、次いで１５分間０．１×ＳＳＣ中で、室温にて洗浄した。スライドをさらに６５℃にて０．１×ＳＳで洗浄し、次いでアルコール：酢酸アンモニウム（７０％、９５％、および１００％）の勾配シリーズで脱水した。空気乾燥したスライドをＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に３日間、予備試験のために暴露し、次いで、６００ｍＭの酢酸アンモニウムで１：１に希釈したＮＴＢ２原子核エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に浸した。スライドを次いで３１日間光を通さない、暗い乾燥箱に入れ、感光処理し、クレシルバイオレットにて染色し、次いでカバーグラスをかぶせた。
【０１５１】
子宮と比較して相対的に高いレベルのＣｙｒ６１の発現が脾臓で認められた（図３Ａ）。さらに、子宮筋層に加えて、他のヒト筋肉組織の分析により、骨格筋、心臓および膀胱において高い基本的発現が示されたが、結腸、小腸、胃および前立腺においては相対的に低いレベルが検出された（図３Ｂ）。それゆえ、Ｃｙｒ６１の高い構造性の発現は、平滑筋および骨格筋細胞から主として構成される心臓、膀胱および子宮などの器官の特徴的な態様であると考えられる。Ｃｙｒ６１が子宮で発現されるまさにその細胞タイプを決定するために、さらなるインサイチュハイブリダイゼーション実験を行った。６人の患者のうちの６人において、高レベルのＣｙｒ６１ｍＲＮＡが子宮筋層細胞で検出された（図４ＡおよびＣ）。しかし、Ｃｙｒ６１転写産物は、同じ６人の患者からの平滑筋腫細胞で劇的に低下した（図４ＢおよびＤ）。センスプローブとハイブリダイズした対照のスライドからのシグナルは、明らかなシグナルを示さなかった（図４ＥおよびＦ）。高い基本レベルのＣｙｒ６１転写産物がストロマでも認められたが、子宮の血管内皮または腺上皮細胞では認められなかった（データは示していない）。Ｃｙｒ６１の高い基本的発現は、健康な子宮筋層の子宮平滑筋細胞に対して主に確認されたが、平滑筋腫では認められなかった。
【０１５２】
性ステロイドおよび成長因子を用いた組織の処置 前記のように得た組織標本を１−２ｍｍ片へと、滅菌メスおよびピンセットを用いてすぐに細分し、次いで抗真菌剤および構成物質剤のみを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２に入れた。標本をエキソビボで、１０ｎＭのＥ２、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＲ５０２０、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０（ＩＣＩ）、１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦの組み合わせ、１０％のチャコールを除いた血清（ＣＳＳ）またはエタノールビヒクルのいずれかで１時間３７℃にて、９５％空気／５％ＣＯ２下でエキソビボ処理した。処理した組織標本を回収し、次いでＲＮＡの単離およびノーザンブロッティングの前に液体窒素中ですばやく凍結した。
【０１５３】
新たに得た平滑筋腫および同調平滑筋層エクスプラント（ｎ＝８）をエキソビボで１０ｎＭのＥ２、１０ｎＭのＲ５０２０、または１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＲ５０２０の組み合わせで処理した。ポジティブコントロールとして、エクスプラントは、ネズミおよびヒトの繊維芽細胞などの細胞タイプにおいてＣｙｒ６１を誘導する１０ｎｇ／ｍｌのｂＧＦＧで刺激した（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ５３： ８９３−９００）。Ｅ２処理により、子宮筋層組織において１時間以内にＣｙｒ６１転写物のレベルが２倍以上増したが、合成プロゲステロンレセプターアゴニスト、Ｒ５０２０はＣｙｒ６１の発現に影響を持たず、それはＥ２とも共働しなかった（図５ＡおよびＧを参照されたい）。Ｃｙｒ６１のＥ２媒介性の誘導は、それは完全に純粋なＥＲアンタゴニスト、ＩＣＩ１８２，７８０により阻害されるので、ＥＲ依存性であった（図５Ａ）。さらに、Ｃｙｒ６１の発現は、子宮筋層エクスプラントをｂＦＧＦ（図５ＡおよびＧ）または血清（データは示していない）で１時間処理した場合に３倍高まった。しかし、Ｅ２もｂＦＧＦも、子宮筋層コントロールにおいて認められるようには、平滑筋腫組織ではＣｙｒ６１をアップレギュレートすることができなかった（図５ＤおよびＧ）。後者の現象は、自系子宮筋層と比較した場合に、平滑筋腫エクスプラントにおいて一貫して２倍高いＥＲαの発現の欠如によるものではなかった。ゆえに、ｂＦＧＦおよび血清に加えて、Ｃｙｒ６１は、平滑筋腫においてではなくヒト子宮筋層組織において１７β−エストラジオールによって急速に誘導される。
【０１５４】
組換えヒトＣｙｒ６１の合成および精製のためのプロトコル 全オープンリーディングフレームを含むヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡのＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ヌクレオチド１００−１６４９）を、ｐＢｌｕｅＢａｃ４バキュロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えバキュロウイルスクローンを得、プラーク精製し、次いで既に記載されているようにＳＦ９昆虫細胞の感染物の培養により増幅した（Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｔｅｘ． Ａｇｒｉｃ． Ｅｘｐ． Ｓｔｎ． Ｂｕｌｌ．： １５５５： １−５５ （１９９７））。Ｓｆ細胞を、血清を含まないｓｆ９００−ＩＩ媒質に２−３×１０６細胞／Ｐ１５０にて単層培養物として播種し、次いで、細胞当たり５プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）の組換えウイルスで感染した。条件培地（組換えヒトＣｙｒ６１タンパク質を含む）を感染４８および９６時間後に回収し、遠心分離（１５，０００×ｇにて５分間）により精製し、次いで５０ｍＭのモルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ＝６．０、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）および１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８へと調整した。培地をローディングバッファー（５０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０、 １ｍＭのＰＭＳＦ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化したセファロースＳビーズと５ｍｌのセファロースＳ／５００ｍｌの条件培地にて混合し、次いでタンパク質をセファロースＳに、バッチにて、４℃にて一晩、穏やかに攪拌しながら結合させた。セファロースＳビーズを沈降により、攪拌せずに２０分間回収し、次いでカラムに入れた。カラムを、０．３ＭのＮａＣｌへと調整した６倍のローディングバッファーで洗浄し、次いで結合したタンパク質をカラムから、ローディングバッファー中のＮａＣｌ（０．４−０．８Ｍ）の段階希釈で溶離した。
【０１５５】
統計学的分析 ノーザンブロットにて検出されるＲＮＡのバンドの密度測定から得られた値を、ＳＡＳ統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用い、有意性のために一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を要因配置実験のために用いて分析した。変動の一元配置分散分析の多重比較の有意なレベルは０．０５であった。有意性が一元配置分析により達成された場合、平均のポスト−ＡＮＯＶＡ比較を、Ｓｃｈｅｆｆｅ’Ｆ試験（Ｎｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｔｈｅ Ｖａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ： Ｍｏｓｂｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４， ５８ｐｐ）を用いて行った。
【０１５６】
本明細書中に示す特許、出願、試験法、および公開文献は、本明細書中にその全容を引用により組み込む。
本発明の多くの変化は、前記の詳細な記載を考慮して、当業者には示唆されるであろう。全てのそのような明らかな変化は、添付の請求項の全企図範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）−（Ｄ）は、ＲＡＤＥ法によるＣｙｒ６１の同定およびノーザン分析による確認を示す。（Ａ）倍化した平滑筋腫（Ｌ）および同調した子宮筋層（Ｍ）組織（ｎ＝４）から抽出した全ＲＮＡから作製された３５Ｓ−放射能標識ｃＤＮＡの典型的なオートラジオグラフ。（Ｂ）平滑筋腫（Ｌ）および同調した子宮筋層（Ｍ）組織から単離された全ＲＮＡの典型的なノーザンブロット。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１転写産物および３．５ｋｂの少ない方のＣｙｒ６１転写産物を示す。（Ｃ）膜を２．０ｋｂの放射能標識したマウスグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）で再プローブして、等量のサンプルローディングを証明した。（Ｄ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒおよび画像診断ソフトウェア（ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＣｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの密度分析。＊子宮筋層コントロールと比較した、レベルの有意な低下。
【図２】図２（Ａ）−（Ｃ）は、平滑筋腫におけるＣｙｒ６１タンパク質の発現の分析を示す。（Ａ）平滑筋腫および同調した子宮筋層組織から作製された組織タンパク質抽出物の典型的なウェスタンブロット。（Ｂ）タンパク質ブロットを次いで抗−アクチン単一特異的抗体で再プローブして、等量のタンパク質ローディングを確認した。（Ｃ）Ｂｉｏｒａｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒを用いる密度分析により定量されたＣｙｒ６１タンパク質レベル。値は、１０人の患者に関する平均±ＳＤを示す。＊子宮筋層コントロールと比較したレベルの有意な低下。
【図３】図３（Ａ）−（Ｂ）は、多様なヒト組織（Ａ）およびヒト筋肉組織（Ｂ）におけるＣｙｒ６１のディファレンシャル発現を示す。矢印は、分子量マーカーをｋｂで示す。
【図４】図４（Ａ）−（Ｆ）は、インサイチュハイブリダイゼーションにより決定される、子宮平滑筋細胞におけるＣｙｒ６１の発現の抑制を示す。典型的な黒のフィールド（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および明るいフィールド（ＣおよびＤ）は、子宮筋層（Ａ、ＣおよびＥ）および平滑筋腫（Ｂ、ＤおよびＦ）組織セクションの顕微鏡写真。矢印は、Ｃｙｒ６１転写産物を発現する典型的な子宮平滑筋細胞を示す（Ｃ）。センス放射能標識ｃＲＮＡプローブは、バックグラウンド上にはシグナルを示さなかった（ＥおよびＦ）。倍率＝２００×（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および６３０×（ＣおよびＤ）、バー＝１５μｍ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および５μｍ（ＣおよびＤ）。
【図５】図５（Ａ）−（Ｇ）は、１７β−エストラジオールおよび塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によるＣｙｒ６１の、エキソビボ、平滑筋腫における調節欠如を示す。図（Ａ）−（Ｃ）は、新しい子宮筋層を表し、および図（Ｄ）−（Ｆ）は、エタノールビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール（Ｅ２）、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＭ５０２０の組み合わせ、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０、または１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１８２，７８０の組み合わせのいずれかの存在下、エキソビボで培養した平滑筋腫組織標本を示す。膜を、ＧＡＰＤＨｃＤＮＡで再プローブし、サンプルローディングＣおよびＦの等量を説明した。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１および６．２ｋｂのＥＲα転写産物を示す。（Ｇ）は、算定されたデータを示す。値は、８人の患者に関する±ＳＤを示す。＊非処置の子宮筋層組織と比較した、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの有意な増加。
【図６】図６は、Ｃｙｒ６１の核酸配列を示す（配列番号：１）。
【図７】図７は、図６の核酸配列によりコードされるＣｙｒ６１のアミノ酸配列を示す（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＡＢ５８３１９）。[0001]
No. 60 / 236,887, filed Sep. 29, 2001, which is incorporated herein by reference in its entirety. S. C. Claim priority based on §119.
[0002]
(Field of the Invention)
The present invention relates to methods of inhibiting the growth of uterine leiomyomas and preventing the formation of uterine leiomyomas, compounds and compositions that stimulate the induction of the Cyr61 gene, and compounds that increase the activity of Cyr61. The present invention also relates to a method of screening for a ligand that regulates the expression of Cyr61 protein. The invention further relates to a method of diagnosing patients with uterine fibroids associated with down-regulation of Cyr61 expression. The present invention also discloses antibodies and pharmaceutical compositions related thereto. Transgenic animals are also contemplated by the present invention.
[0003]
(Background of the Invention)
Uterine leiomyomas, or fibroids, are the most common tumors of the reproductive system that afflict women at the age of 30-55. Little is known about the pathogenesis and pathogenic mechanisms of leiomyomas. Uterine leiomyomas are typically defined as benign tumors of the smooth muscle tissue of the myometrium. Leiomyoma cells are believed to arise from dedifferentiated smooth muscle cells in the myometrium, which exhibit increased mitotic activity as a result of accelerated proliferation (Rein and Nowak, Sem. Reprod. Endocrinol., 1992, 10: 310-319). Although considered a benign disease, uterine leiomyomas account for more than 30% of total hysterectomy performed in the United States and represent great health importance among women (Cramer, Sem. Reprod. Endocrinol., 1992, 10: 320-324).
[0004]
A new group of growth factor immediate early genes that play a role in development, cell proliferation, and tumorigenesis belongs to the CCN (CTGF / Cyr61 / Cef10 / NOVH) family. All CCN proteins (1) show a high degree of conservation among family members and across species, (2) are cysteine-rich and structurally similar to extracellular matrix-related molecules, (3) It has been shown to consist of multifunctional molecular domains and (4) mediate various cellular functions such as cell adhesion, cell migration, mitogenesis, cell survival and differentiation (Law and Lam, Experimental Cell Res) , 1999, 248: 44).
[0005]
Cyr61 is a secreted, cysteine-rich, heparin-binding CCN protein that binds to the cell surface and extracellular matrix. In particular, Cyr61 is known to be involved in developmentally regulated processes, including angiogenesis and cartilage formation. The Cyr61 protein has many biochemical features similar to the Wnt-1 protein and other growth factors (Yang and Law, Cell Growth & Diff, 1991, 2: 351). The human Cyr61 protein is 381 amino acids long and has a molecular weight of about 42 kilodaltons (kDa). See FIG. 1 and PCT Application No. WO 97/339950. The human Cyr61 gene is located on the short arm (lp22-31) of chromosome 1 (Charles et al., Oncogene, 1991, 8:23; Jay et al., Oncogene, 1997, 14: 1753), and The gene was identified by differential hybridization screening of a cDNA library of serum-stimulated BALB / c3T3 fibroblasts (see FIG. 2 and Law and Nathans, PNAS 1987, 84: 1182). Want). Comparison of the human and murine Cyr61 sequences show that they are 91% similar (PCT Publication No. WO 97/339950). Cyr61 protein expression has previously been shown to be up-regulated in stage II invasive ductal carcinoma (US Provisional Patent Application No. 60 / 213,182, filed June 21, 2000). .
[0006]
Integrins are transmembrane receptors for α: β heterodimers that bind non-covalently in the presence of divalent cations. Some, but not all, integrins interact with adhesive ligands through recognition of the standard Arg-Gly-Asp (RGD) binding motif present on a subset of extracellular matrix proteins, and interact with growth factors or cytokines. A common signaling path can be started. Cyr61, which lacks the RGD motif, has two integrins: αvβ3And αIIbβ3(Kireeva et al., J. Biol. Chem., 1998, 273: 3090; Babic et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19: 2958; Jedsadaya nmata). et al., J. Biol. Chem., 1999, 274: 24321). Integrin alphaVβ3Has been shown to be directly involved in angiogenesis in vivo and to regulate tumor metastasis. Therefore, the effect of Cyr61 as an angiogenic factor is partially due to αvβ3It is proposed to be mediated by Recent studies have shown that human plateletsIIbβ3Have been shown to bind to Cyr61 in an activation-dependent manner (Jedsadayanata et al., 1999). Murine Cyr61 is also an integrin, mainly expressed in fibroblasts, α6β1And heparin sulfate proteoglycans are known to bind in a co-receptor fashion (Chem et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 24953). Binding to both receptors is important for fibroblast adhesion in vitro. By mutagenesis test, the C-terminal domain (aa 250-354)6β1Have been identified as being required for binding. Thus, it is clear that Cyr61 is an integrin ligand based on its location in the extracellular matrix and its ability to bind directly.
The present inventors have found that detection and modulation of Cyr61 expression and activity is useful for prevention, diagnosis, and treatment of uterine leiomyoma.
[0007]
(Summary of the Invention)
The present invention provides a method for inhibiting the growth of uterine leiomyoma. The method includes increasing the level of mRNA encoding Cyr61, increasing the translation of Cyr61 mRNA, up-regulating the expression of CyR61 protein, increasing the activity of Cyr61 protein, or increasing the activity of Cyr61 protein in leiomyoma tissue. Increasing the level of The present invention also provides a method for preventing uterine fibroids in normal myometrial tissue. The method comprises treating mRNA encoding Cyr61, translational activity of Cyr61, expression of Cyr61 protein, activity of Cyr61 protein, or affinity of Cyr61 for basic fibroblast growth factor or heparin-binding epidermal growth factor, uterine leiomyoma. This may include maintaining a level to prevent.
[0008]
These methods include, but are not limited to, delivery of the Cyr61 protein to cells, administration of an expression vector encoding the Cyr61 protein, and a therapeutically effective amount of a Cyr61 intracellular protein (eg, an integrin). Administration of a compound that modulates binding to a receptor.
[0009]
Antibodies that recognize part or all of the Cyr61 protein are also provided. These antibodies can be polyclonal or monoclonal, chimeric or humanized, and / or anti-idiotype. Preferably, these antibodies do not recognize or bind to proteins belonging to the same protein family as Cyr61.
[0010]
The present invention further provides a method of diagnosing uterine leiomyoma. The methods include those comprising comparing the level of Cyr61 in cells in the suspect tissue to the level of Cyr61 in normal smooth muscle layer tissue of the autologous to the suspect tissue. A lower level of Cyr61 in suspicious tissue than in normal tissue indicates the presence of uterine leiomyoma in suspicious tissue. The level of Cyr61 in this method can be determined by exposing suspicious and normal tissues to Cyr61 antibodies that recognize the Cyr61 protein, and then comparing the amount of antibody bound to each tissue. A lower level of binding antibody in the suspicious tissue compared to that in normal tissue indicates the presence of uterine smooth muscle in the suspicious tissue.
[0011]
Also provided are methods for screening for compounds that inhibit or prevent the growth of uterine leiomyomas. These methods include comparing the amount of Cyr61 expressed by leiomyoma cells exposed to the compound with the amount of Cyr61 expressed by uterine leiomyomas not exposed to the compound. A higher level of Cyr61 expressed in cells exposed to the compound as compared to cells not exposed to the compound indicates that the compound can inhibit or prevent uterine leiomyoma.
[0012]
Transgenic non-human animals having a uterus and containing DNA, such as human DNA, that can be induced to overexpress Cyr61 in the uterus, are also contemplated by the present invention.
Methods for detecting the presence of uterine leiomyoma are also contemplated in the present invention. These methods include comparing the level of Cyr61 mRNA or protein from suspected uterine leiomyoma tissue to the level of Cyr61 mRNA or protein from normal myometrial tissue. A low level of Cyr61 mRNA or protein in suspected uterine leiomyoma tissue compared to normal myometrial tissue indicates the presence of uterine leiomyoma.
[0013]
Kits for diagnosing uterine leiomyomas are contemplated by the present invention. The kit includes an antibody that recognizes or binds to Cyr61.
The present invention further contemplates an expression vector comprising the nucleic acid shown in FIG. 6 operably linked to an expression control sequence. In certain embodiments, the expression control sequence may be an estrogen response element or a basic fibroblast growth factor response element. Heparin-binding epidermal growth factor also regulates Cyr61 expression. Pharmaceutical compositions containing the vectors or proteins and methods of using the pharmaceutical compositions to prevent and inhibit the growth of uterine leiomyomas are also contemplated.
[0014]
The present invention provides a method for inhibiting the growth of uterine leiomyoma. The method comprises administering to a subject in need of treatment an amount of a compound effective to stimulate the synthesis of mRNA encoding Cyr61, translation of Cyr61 mRNA, expression of Cyr61, or activity of Cyr61 protein. obtain. The present invention also contemplates increasing the total level of Cyr61 protein in leiomyoma tissue. In certain embodiments, the compound that inhibits uterine leiomyoma is IGF I and / or IGF II mRNA synthesis, IGF I and / or IGF II mRNA translation, IGF I and / or IGF II protein expression, IGF I and / or IGF II protein expression. Or activity of IGFII, synthesis of basic fibroblast growth factor and / or heparin-binding epidermal growth factor mRNA, translation of basic fibroblast growth factor and / or heparin-binding epidermal growth factor protein, basic fibroblast growth It also down-regulates the expression of factor and / or heparin-binding epidermal growth factor protein, or the activity of basic fibroblast growth factor and / or heparin-binding epidermal growth factor.
[0015]
The present invention further provides a method for preventing uterine leiomyoma in myometrial tissue. The method includes providing a subject in need of preventing uterine leiomyoma in myometrial tissue with mRNA encoding Cyr61, translational activity of Cyr61 mRNA, expression of Cyr61, or activity of Cyr61 protein in myometrial tissue. And administering a compound in an amount effective to maintain a level that prevents uterine leiomyoma. In certain embodiments, the compound reduces estrogen receptor activity.
[0016]
The present invention provides a method for preventing the growth of uterine leiomyoma, comprising administering to a subject an amount of a compound effective to increase the affinity of Cyr61 protein for basic fibroblast growth factor or heparin-binding epidermal growth factor. Are provided.
[0017]
Methods for preventing uterine leiomyoma include providing a subject in need of prevention of uterine leiomyoma with the synthesis of IGF I and / or IGF II mRNA, translation of IFG I and / or IGF II mRNA, IGF I and / or IGF II protein. And administering an effective amount of a compound to maintain a level of IGF I and / or IGFII activity that prevents uterine leiomyoma. Methods for preventing uterine leiomyoma include methods for synthesizing basic fibroblast growth factor and / or heparin-binding epidermal growth factor mRNA, basic fibroblast growth factor and / or Or translation of heparin binding epidermal growth factor mRNA, expression of basic fibroblast growth factor and / or heparin binding epidermal growth factor mRNA, activity of basic fibroblast growth factor and / or heparin binding epidermal growth factor, Includes administering a compound in an amount effective to maintain a level that prevents uterine leiomyoma. In certain embodiments, the synthesis of IGF I, IGF II, basic fibroblast growth factor and / or heparin-binding epidermal growth factor mRNA is down-regulated by antisense nucleic acids.
The present application further discloses methods for inhibiting or preventing uterine leiomyoma growth by administering to a subject a compound that modulates the binding of Cyr61 to the integrin receptor.
[0018]
(Brief description of drawings)
FIG. 1 (A)-(D). Identification of Cyr61 by RADE method and confirmation by Northern analysis. (A) Made from total RNA extracted from duplicate leiomyoma (L) and matched myometrial (M) tissue (n = 4)35Typical autoradiograph of S-radiolabeled cDNA. (B) Typical Northern blot of total RNA isolated from leiomyoma (L) and synchronized myometrium (M) tissue. Arrows indicate the higher 2.4 kb Cyr61 transcript and the lower 3.5 kb Cyr61 transcript. (C) The membrane was reprobed with 2.0 kb radiolabeled mouse glutaraldehyde dehydrogenase (GAPDH) to confirm equal sample loading. (D) Density analysis of Cyr61 mRNA levels using Molecular @ Dynamics @ phosphorimager and image quantification software.*Significant reduction in level compared to myometrial control.
[0019]
FIG. 2 (A)-(C). Analysis of Cyr61 protein expression in leiomyomas. (A) Typical western blot of tissue protein extracts made from leiomyoma and synchronized myometrial tissue. (B) The protein blot was then reprobed with an anti-actin monospecific antibody to confirm equal protein loading. (C) Cyr61 protein levels quantified by density analysis using a Biorad \ molecular \ imager. Values represent the mean ± SD for 10 patients.*Significant reduction in level compared to myometrial control.
FIG. 3 (A)-(B). Differential expression of Cyr61 in various human tissues (A) and human muscle tissues (B). Arrows indicate molecular weight markers in kb.
[0020]
FIG. 4 (A)-(F). Inhibition of Cyr61 expression in uterine smooth muscle cells as determined by in situ hybridization. Typical black fields (A, B, E and F) and bright fields (C and D) are micrographs of myometrium (A, C and E) and leiomyoma (B, D and F) tissue sections It is. Arrows indicate typical uterine smooth muscle cells expressing Cyr61 transcript (C). The sense radiolabeled cRNA probe did not show a signal above background (E and F). Magnification = 200 × (A, B, E and F) and 630 × (C and D), bar = 15 μm (A, B, E and F) and 5 μm (C and D).
[0021]
FIG. 5 (A)-(G). Lack of regulation of Cyr61 by 17β-estradiol and basic fibroblast growth factor (bFGF) in ex vivo, leiomyoma. Figures (A)-(C) represent freshly harvested myometrium, and Figures (D)-(F) show ethanol vehicle, 10 nM 17β-estradiol (E).2), 10 nM R5020, 10 ng / ml bFGF, 10 nM E2And 10 nM M5020, 1 μM ICI182,780, or 10 nM E21 shows leiomyoma tissue specimens cultured ex vivo in the presence of any of the combinations of ICI182 and 780 at 1 μM. The membrane was reprobed with GAPDH cDNA to account for sample loading C and F equivalents. Arrows indicate the higher 2.4 kb Cyr61 and 6.2 kb ERα transcripts. (G) shows the calculated data. Values represent ± SD for 8 patients.*Significant increase in Cyr61 mRNA levels compared to untreated myometrial tissue.
[0022]
FIG. 6 shows the nucleic acid sequence of Cyr61 (SEQ ID NO: 1).
7 shows the amino acid sequence of Cyr61 encoded by the nucleic acid sequence of FIG. 6 (SEQ ID NO: 2; GenBank accession number AAB58319).
[0023]
(Detailed description of the invention)
The present invention discloses methods for inhibiting the growth of uterine leiomyomas, preventing the formation of uterine leiomyomas, diagnosing uterine leiomyomas, and screening for compounds that inhibit or prevent uterine leiomyomas. These methods evaluate or transcribe and translate Cyr61 in a sample of interest and steroid and growth factor mediated regulation of Cyr61 protein levels. The present invention also advantageously provides screening assays and kits. The assay system of the present invention is suitable for high-throughput screening, for example, to screen thousands of compounds per assay.
[0024]
The present invention relates to Cyr61-specific antibodies and methods of using these substances to detect the presence of Cyr61 protein and in screening for agonists of Cyr61 for uterine leiomyoma.
[0025]
General definition
The term "isolated" means that the referenced material is removed from the environment where it is normally found. That is, the isolated biological material may be free of cellular components, ie, components of the cell in which the material is found or produced. In the case of a nucleic acid molecule, an isolated nucleic acid includes a PCR product, an isolated mRNA, a cDNA or a restriction fragment. In other embodiments, the isolated nucleic acid is preferably excised from the chromosome where it can be found, and more preferably the gene of the gene encompassed by the isolated nucleic acid molecule when found in the chromosome. It no longer binds to unregulated, non-coding regions or other genes located upstream or downstream. In yet another embodiment, the isolated nucleic acid lacks one or more introns. Isolated nucleic acid molecules include sequences inserted into plasmids, cosmids, artificial chromosomes, and the like. That is, in certain embodiments, the recombinant nucleic acid is an isolated nucleic acid. An isolated protein may be associated with other proteins or nucleic acids to which it binds in a cell, or both, or, if it is a membrane-bound protein, with the cell membrane. Isolated organelles, cells or tissues are removed from anatomical sites found in the organism. An isolated substance need not be, but may be, purified.
[0026]
The term "purified" refers to unrelated materials, ie, materials that have been isolated under conditions that reduce or eliminate the presence of contaminants, including the original material from which the material is obtained. For example, the purified protein is preferably substantially free from other proteins or nucleic acid molecules to which it is bound in the cell, and the purified nucleic acid molecule is preferably found together in the cell. Preferably, it is substantially free from proteins or other related nucleic acid molecules. Purification can be assessed by chromatography, gel electrophoresis, immunoassay, composition analysis, biological assay, and other methods known in the art.
[0027]
The term "sample" refers to a biological substance that can be tested for the presence of a Cyr61 protein or Cyr61 nucleic acid. Such samples can be obtained from subjects such as humans and non-human animals, and include tissues, especially uterine glands, biopsies, blood and blood products; multiple effusions; cerebrospinal fluid (CSF) Ascites fluid; and cell cultures.
[0028]
The term "non-human animal" includes, but is not limited to, laboratory animals such as mice, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, pets such as dogs and cats, and sheep, goats, pigs, horses and cattle. Such as livestock.
The term "ability to elicit a response" includes the ability of a ligand to agonize or antagonize the activity of a receptor.
[0029]
The term "transformed cell" refers to an altered host cell that expresses a functional protein expressed from a vector encoding the protein of interest. Although any cells can be used, preferred cells are mammalian cells.
The term “assay system” is, for example, one or more collections of such cells in a microwell plate or some other culture system. The number of cells in a single assay system is sufficient to express a detectable amount of regulated Cyr61 mRNA or protein expression to allow for the assessment of the effect of the test compound on the cells. The method of the present invention is particularly suitable for use in assay systems that test for ligands that regulate transcription and translation of the Cyr61 gene.
[0030]
A "test compound" is any molecule that can test its ability to modulate Cyr61 expression and / or activity, such as an estrogen compound.
The term "leiomyoma" refers to a benign tumor consisting of smooth muscle and fibrous connective tissue. In certain embodiments, the leiomyoma is a uterine leiomyoma. Leiomyomas are also called fibrous tumors, fibroids, fibromas, fibroleiomyomas, fibroids, or fibroids. The term "benign" refers to a non-cancerous tumor.
The term "myometrium" or "myometrial layer" refers to the muscle layer of the uterus.
[0031]
The description provided herein in connection with increasing the level of Cyr61 in an organism or cell includes, but is not limited to, a method of stimulating transcription of Cyr61 DNA, stimulating translation of Cyr61 protein. A method that stimulates processing of the Cyr61 protein, a method that alters the binding of the Cyr61 protein to a cytoplasmic protein (eg, an integrin receptor), the addition of a foreign Cyr61 protein, or the addition of a vector containing a nucleic acid sequence encoding a Cyr61 protein. It is.
[0032]
Cyr61 of the present invention may be isolated, present or detected in a variety of mammalian sources including mammals, for example, humans, cows, pigs, dogs and chickens. The preferred source of the present invention is human.
The term "inhibits the growth of uterine leiomyoma" means to reduce the rate of growth of uterine leiomyoma or to stop the growth completely. In a preferred embodiment, the reduction in leiomyoma growth is at least 20%, preferably at least 40%, and more preferably at least 80%.
[0033]
The term "a level that prevents uterine leiomyoma" refers to the amount required to inhibit uterine leiomyoma formation in normal leiomyoma tissue.
The term "level" refers to the total amount, or rate, of activity per unit (eg, cell).
The use of italics generally indicates a nucleic acid molecule (eg, Cyr61ΔcDNA, gene, etc.), and standard text generally indicates a polypeptide or protein. Alternatively, whether a nucleic acid molecule or protein is indicated can be determined by context.
[0034]
The term "amplification" of DNA refers to increasing the concentration of a particular DNA sequence in a mixture of DNA sequences using the polymerase chain reaction (PCR). For a description of PCR, see Saiki et al. , Science, 239: 487, 1988.
The term "sequence-specific oligonucleotide" refers to an associated set of oligonucleotides that can be used to detect allelic variants or mutations in the Cyr61 gene.
[0035]
The term "nucleic acid molecule" refers to a phosphate ester form of a ribonucleoside (RNA molecule) or deoxyribonucleoside (DNA molecule), or any single- or double-stranded helix ester Mean analog. Double-stranded DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA helices are possible. The term nucleic acid molecule, and particularly the DNA or RNA molecule, refers only to the primary and secondary structure of the molecule, and does not limit it to any particular tertiary forms. Thus, the term includes, inter alia, double-stranded DNA (eg, restriction fragments) or circular DNA molecules, plasmids and chromosomes found in linear form. In discussing the structure of a particular double-stranded DNA molecule, the sequence provides only a sequence in the 5 'to 3' direction along the non-transcribed strand of DNA (ie, a strand having a sequence homologous to mRNA). It may be described in accordance with normal practice. A “recombinant DNA molecule” is a DNA molecule that has undergone a biological manipulation of the molecule. Non-limiting examples of molecular biological manipulations include enzymatic phosphorylation, enzymatic dephosphorylation, enzymatic digestion, and ligation.
[0036]
The term "polynucleotide" or "nucleotide sequence" is a contiguous sequence of nucleotide bases (so-called "nucleotides") in DNA and RNA, and refers to any strand of two or more nucleotides. Nucleotide sequences typically carry genetic information, including information used by cellular machinery to make proteins and enzymes. These terms include double- or single-stranded genomic and cDNA, RNA, any synthetic and genetically engineered polynucleotide, and both sense and antisense polynucleotides. This includes single- and double-stranded molecules, ie, DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA hybrids, and “protein nucleic acids” (PNA) formed by attaching bases to an amino acid backbone. Is included. This includes, for example, nucleic acids containing altered bases such as thio-uracil, thio-guanine and fluoro-uracil.
[0037]
The polynucleotide may be flanked by native regulatory (expression control) sequences or may include promoters, internal ribosome recognition sites (IRES) and other ribosome binding site sequences, enhancers, response elements, suppressors, signal sequences, polyadenylation sequences. , Introns, 5'- and 3 'non-coding regions and the like. Nucleic acids may be modified by a number of means known in the art. Non-limiting examples of such changes include methylation, "cap", replacement of one or more naturally occurring nucleotides with analogs, and changes within the nucleotides, such as uncharged bonds (e.g., methyl phosphonate , Phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.) and those using charged bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.). A polynucleotide may comprise one or more additional covalently attached moieties, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), intercalators (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating agents (eg, , Metals, radioactive metals, iron, metal oxides, and the like), and alkylating agents. Polynucleotides may be derived by the formation of a methyl or ethyl phosphotriester or alkyl phosphoramidate linkage. Further, the polynucleotides herein may be directly or articulated with a label capable of providing a detectable signal. Typical labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin, and the like.
[0038]
The term "host cell" refers to a selected, altered, transformed, or increased, in any way, for the production of a substance by a cell, such as the expression of a gene or RNA sequence, protein or enzyme by the cell. Or any cell of any organism used or manipulated. Host cells can also be used in screening or other assays described below.
[0039]
Generally, a DNA sequence with instructions for a particular protein or enzyme is "transcribed" into the corresponding sequence in RNA. The RNA sequence is then "translated" into a sequence of amino acids that forms a protein or enzyme. An "amino acid sequence" is any chain of two or more amino acids. Each amino acid is represented in DNA or RNA by one or more triplets of nucleotides. Each triad forms a codon corresponding to an amino acid. The genetic code has some overlap, also called so-called degeneracy, which means that most amino acids have one or more corresponding codons.
[0040]
A “coding sequence” or sequence that “encodes” an expression product such as an RNA, polypeptide, protein, or enzyme is a nucleotide sequence that, when expressed, results in the production of that RNA, polypeptide, protein, or enzyme. That is, the nucleotide sequence encodes an amino acid sequence for a polypeptide, protein or enzyme.
[0041]
The term "gene", also called "structural gene", refers to a DNA sequence that encodes or corresponds to a particular sequence of amino acids, including all or part of one or more proteins or enzymes, for example, where the gene is expressed. It may or may not include a regulatory DNA sequence, eg, a promoter sequence, that determines the conditions to be performed. Some non-structural genes can be transcribed from DNA to RNA, but are not translated into amino acid sequence. Other genes can function as regulators of structural genes or regulators of DNA transcription.
[0042]
A “promoter sequence” is a DNA regulatory region capable of binding a second molecule inside a cell and initiating transcription of a coding sequence.
The coding sequence is under the control of, or is operably linked to, transcriptional and translational regulatory sequences when the RNA polymerase transcribes the coding sequence into mRNA in the cell, which is then trans-RNA It is spliced (if it contains introns) and translated into the protein encoded by the coding sequence.
[0043]
The terms "express" and "expression" refer to the expression or expression of information in a gene or DNA sequence, for example, to activate a cellular function involved in transcription and translation of the corresponding gene or DNA sequence. This means that a protein is produced. DNA sequences are expressed in or by cells to form "expression products" such as proteins. The expression product itself, for example, the resulting protein, may also be said to be "expressed" by the cell. Expression products can be characterized as intracellular, extracellular, or secreted. The term "intracellular" means something that is inside a cell. The term "extracellular" means something that is extracellular. A substance is "secreted" by a cell, from somewhere in the cell, or from within a cell when it appears to a large extent outside the cell.
[0044]
The term "transfection" refers to the introduction of a foreign nucleic acid into a cell. The term "transformation" refers to "foreign" such that the host cell expresses the introduced gene or sequence to produce a desired substance, typically a protein or enzyme encoded by the introduced gene or sequence. It means introducing a gene (ie, external or extracellular), DNA or RNA sequence into a host cell. The gene or sequence to be introduced may be a “cloned” or “foreign” gene or sequence, and may have regulatory or control sequences, such as start, stop, promoter, signal, secretory sequences, or the genetic machinery of the cell. It may include other sequences used. A gene or sequence may include non-functional sequences or sequences that have no known function. Host cells that receive and express the introduced DNA or RNA are "transformed" and are "transformants" or "clones." The DNA or RNA introduced into the host cell can be obtained from any source, including cells of the same genus or species as the host cell, or cells of a different genus or species.
[0045]
The terms "vector," "cloning vector," and "expression vector" are used to refer to a DNA or RNA sequence (such as a cell) that transforms a host and facilitates expression (ie, transcription and translation) of the introduced sequence. (For example, a foreign gene) can be introduced into a host cell. Vectors include plasmids, phages, viruses, and the like.
[0046]
A common type of vector is a completely independent vector that can easily receive additional (foreign) DNA, usually of bacterial origin, of double-stranded DNA, and can be easily introduced into a suitable host cell. A "plasmid" that is a molecule. Plasmid vectors often contain coding DNA and promoter DNA, and have one or more restriction sites suitable for inserting foreign DNA. Numerous vectors, including plasmid and fungal vectors, have been described for replication and / or expression in various eukaryotic and prokaryotic hosts. Non-limiting examples include pKK plasmids (Clonetech), pUC plasmids, pET plasmids (Novagen, Inc.) disclosed herein or cited or otherwise using other methods known to those of skill in the art. , Madiosn, WI), pRSET or pREP plasmids (Invitrogen, San Diego, CA), or pMAL plasmids (New England Biolabs, Beverly, MA) and many suitable host cells. Recombinant cloning vectors include one or more replication systems for cloning or expression, one or more markers for selection in a host, eg, antibiotic resistance, and one or more expression systems. Cassettes are often included.
[0047]
"Cassette" means a DNA coding sequence or segment of DNA encoding an expression product that can be inserted into a vector at defined restriction sites. The cassette restriction site is designed to ensure insertion of the cassette in the appropriate reading frame. Generally, foreign DNA is inserted at one or more restriction sites of the vector DNA, and is then carried by the vector into the host cell along with the transmissible vector DNA. DNA segments or sequences having inserted or added DNA, expression vectors, etc., can also be referred to as "DNA constructs."
[0048]
The term "expression system" refers to a vector compatible with the host cell and appropriate conditions for the expression of the protein encoded by the foreign DNA carried by the vector and introduced into the host cell. I do. Common expression systems include e. E. coli host cells and plasmid vectors, insect host cells and baculovirus vectors, and mammalian host cells and vectors.
[0049]
The term "heterologous structure" refers to a combination of elements that do not occur in nature. For example, the term heterologous DNA refers to DNA that is not naturally occurring in the cell or at the chromosomal site of the cell. Preferably, the heterologous DNA includes a gene foreign to the cell. A heterologous expression regulatory element is an element operably linked to a different gene from that to which it is operably linked.
[0050]
The term "autologous" refers to a specimen obtained from the same individual. For example, autologous tissue refers to different tissue specimens obtained from the same individual. In certain embodiments, the suspected uterine leiomyoma and autologous normal myometrium refer to different uterine tissue specimens obtained from the same individual.
[0051]
The terms "variant" and "mutation" refer to any detectable change in genetic material, for example, DNA, or any process, mechanism or result of such a change. This includes genetic mutations in which the structure (eg, DNA sequence) of the gene has been altered, any gene or DNA resulting from any mutation process, and any expression products (eg, protein or DNA) expressed by the altered gene or DNA sequence. Enzymes). The term “variant” may include altered or modified genes, DNA sequences, enzymes, cells, etc., ie, all types of variants.
[0052]
A nucleic acid molecule can be annealed to another nucleic acid molecule, such as cDNA, genomic DNA, or RNA, if the single-stranded form of the nucleic acid molecule can anneal to the other nucleic acid molecule under appropriate temperature conditions and solution ionic strength. Can hybridize "(see Sambrook et al, supra). The conditions of temperature and ionic strength determine the "stringency" of the hybridization. For preliminary screening of homologous nucleic acids, a 55 ° C TmLow stringency hybridization conditions corresponding to (melting point), eg using 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk and no formamide; or 30% formamide, 5 × SSC, 0.5% SDS can be used. Moderate stringency hybridization conditions result in higher TmFor example, 40% formamide is used with 5 × or 6 × SCC. High stringency hybridization conditions provide the best TmFor example, 50% formamide, 5 × or 6 × SCC is used. SCC is 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-citrate. Hybridization requires that the two nucleic acids contain complementary sequences, but base mismatches can occur, depending on the stringency of the hybridization. The appropriate stringency of a hybridizing nucleic acid depends on the length of the nucleic acid and the degree of complementation, changes well known to those skilled in the art. The greater the degree of similarity or homology between two nucleotide sequences, the greater the T for hybrids of nucleic acids having those sequences.mIs large. The relative stability of nucleic acid hybridization (higher Tm) Decreases in the following order: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. For hybrids greater than 100 nucleotides in length, TmEquations have been derived (see Sambrook et al., Supra, 9.50-9.51). For hybridizations with shorter nucleic acids, i.e., oligonucleotides, the location of mismatches becomes more important, and the length of the oligonucleotide determines its specificity (Sambrook et al., Supra, 11.7-11. 8). The minimum length for a hybridizable nucleic acid is at least about 10 nucleotides; preferably at least about 15 nucleotides, and more preferably the length is at least about 20 nucleotides.
[0053]
In certain embodiments, the term “normal hybridization conditions” refers to a 55 ° C. TmAnd using the above conditions. In a preferred embodiment, TmIs 60 ° C., and in a more preferred embodiment, TmIs 65 ° C. In certain embodiments, “high stringency” is recognized at 68 ° C. in 0.2 × SSC, 50% formamide at 42 ° C. in 4 × SSC, or under any of these two conditions. Hybridization and / or washing conditions under conditions that provide the same level of hybridization as is possible.
[0054]
The term "oligonucleotide" generally refers to at least 10, preferably at least 15, and more, that hybridizes to a genomic DNA, cDNA, or mRNA molecule encoding a gene, mRNA, cDNA or other nucleic acid of interest. Preferably, it means a nucleic acid of at least 20 nucleotides, preferably 100 nucleotides or less. Oligonucleotides are, for example,32It can be labeled with a nucleotide such as a P-nucleotide or a covalently bound label such as biotin. In one embodiment, labeled oligonucleotides can be used as probes to detect the presence of nucleic acids. In other embodiments, the oligonucleotides (one or both of which may be labeled) are PCR primers for cloning the full length or fragment of Cyr61 or for detecting the presence of nucleic acid encoding Cyr61. Can be used as Generally, oligonucleotides are prepared artificially, preferably on a nucleic acid synthesizer.
[0055]
The present invention provides antisense nucleic acids (including ribozymes) that can be used to inhibit Cyr61 expression in cells or to position Cyr61 mRNA or DNA. An “antisense nucleic acid” is a single-stranded nucleic acid molecule or oligonucleotide that inhibits the latter role when hybridizing under cytoplasmic conditions to complementary bases in an RNA or DNA molecule. Where the RNA is a messenger RNA transcript, the antisense nucleic acid is a reverse transcript or an mRNA-interfering complementary nucleic acid. As currently used, "antisense" broadly includes RNA-RNA interactions, RNA-DNA interactions, ribozymes and RNase-H mediated arrest. The antisense nucleic acid molecule can be encoded by a recombinant gene for expression in a cell (eg, US Pat. Nos. 5,814,500 and 5,811,234), or, alternatively, They can be prepared artificially (eg, US Pat. No. 5,780,607).
[0056]
Leiomyoma
As mentioned above, the term "leiomyoma" refers to a tumor composed of smooth muscle and fibrous connective tissue. Leiomyomas are thought to arise from single-cell somatic mutations. Uterine leiomyoma refers to a tumor associated with the uterus. Uterine leiomyomas can be classified based on the location of the tumor and the affected uterine layer. The location of uterine leiomyomas can be categorized as (a) cervical, (b) isthmus, or (c) body. Cervical leiomyomas generally progress to the vagina and can cause sinusiorrgia and infection. Iris uterine leiomyomas often cause pain and urological problems. Body uterine leiomyomas in the most common location are often asymptomatic. Uterine leiomyomas can affect (a) subserosal, (b) submucosal, or (c) the inner lining of the uterus. Inner wall leiomyomas are the most common form of this tumor and occur within the uterine wall.
[0057]
Epidemiological studies have shown that uterine leiomyomas are present in about 30% of women older than 30 years. Most women with leiomyomas are asymptomatic, with only 35-50% of affected patients experiencing problems. Some problems associated with uterine leiomyoma include, but are not limited to, abnormal uterine bleeding, pain, infertility, urinary symptoms, bowel symptoms, and venous congestion. A rapidly growing leiomyoma can be an indication that it has changed from a benign tumor to a malignant tumor.
[0058]
Viral and non-viral vectors
Particularly preferred vectors for in vitro and in vivo cell assays are viral vectors such as lentivirus, retrovirus, herpes virus, adenovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus, baculovirus, and other sets with the desired cell tropism. It is a replacement virus. That is, a gene encoding a functional protein or mutant protein or polypeptide domain fragment thereof can be introduced in vivo, ex vivo, or in vitro using a viral vector, or by direct introduction of DNA. Expression in a target tissue can be achieved by targeting the transgenic vector to specific cells, such as by using a viral vector or receptor ligand, or by using a tissue-specific promoter, or both. Targeted gene delivery is disclosed in PCT Publication No. 95/28494.
[0059]
Viral vectors commonly used for in vivo or ex vivo targeting and therapy are DNA-based and retroviral vectors. Methods for constructing and using viral vectors are known in the art (see Miller and Rosman, Bio Technologies, 1992, 7: 980-990). Preferably, viral vectors are replication-deficient, ie, they are unable to replicate autonomously in target cells. Preferably, the replication deficient virus is a minimal virus, ie, it retains only the sequences of the genome necessary to encapsulate the genome and create a virus particle.
[0060]
DNA virus vectors include, but are not limited to, attenuated or defective DNA viruses such as herpes simplex virus (HSV), papilloma virus, Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus, and adeno-associated virus (AAV). Is included. Defective viruses that completely or almost completely lack viral genes are preferred. The defective virus does not transmit after introduction into the cell. The use of a defective viral vector allows for administration to cells in specific, localized areas without concern that the vector may infect other cells. That is, a specific tissue can be specifically targeted. Examples of particular vectors include, but are not limited to, a defective herpesvirus 1 (HSV1) vector (Kaplit et al., Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2: 320-330) and a glycoprotein L gene. Defective herpesvirus vectors lacking or other defective herpesvirus vectors (PCT Publication Nos. WO94 / 21807 and WO92 / 05263); and Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest., 1992, 90). : 626-630; also see La Salle et al., Science, 1993, 259: 988-990); attenuated adenovirus vectors, such as vectors; and defective adeno-associated viruses. Vectors (Samulski et al., J. Viol., 1897, 61: 3096-3101; Samulski et al., J. VIrol., 1989, 63: 3822-3828; Lebkowski et al., MoI. 1988, 8: 3988-3996).
[0061]
Without limitation, Avigen, Inc. (Alameda, CA; AAV vector), Cell Genesys (Foster City, CA; retrovirus, adenovirus, AAV vector, and lentivirus vector), Clontech (retrovirus and baculovirus vector), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; adenovirus and AAV vectors), Genvec (adenovirus vectors), IntroGene (Leiden, Netherlands; adenovirus vectors), Molecular Medicine (retrovirus, adenovirus, AAV, and herpes virus vectors), Norgen ( Various companies, including adenovirus vectors), Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom; lentivirus vectors), and Transgene (Strasbourg, France; adenovirus, vaccinia, retrovirus, and lentivirus vectors), commercialize virus vectors industrially. Manufacturing.
[0062]
Adenovirus vector. Adenoviruses are eukaryotic DNA viruses that can be modified to effectively deliver the nucleic acids of the invention to a variety of cell types. There are different serotypes of adenovirus. Of these serotypes, those that are preferred over using type 2 or type 5 human adenovirus (Ad2 or Ad5) or adenoviruses of animal origin (see PCT Publication No. WO 94/26914) Is given within the range. These adenoviruses of animal origin that can be used within the scope of the present invention include dogs, cows, rats (eg, Mav1, Beard et al., Virology, 1990, 75-81), sheep, pigs, chickens, And adenoviruses of monkey (eg, SAV) origin. Preferably, the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus (e.g., Manhattan or strain A26 / 61, ATCC VR-800). Various replication deficient adenovirus and minimal adenovirus vectors have been disclosed (PCT Publication Nos. WO94 / 26914, WO95 / 02697, WO94 / 28938, WO94 / 28152, WO94 / 12649, WO95 / 02697, WO96 / 22378). The replication-defective recombinant adenovirus according to the present invention can be prepared by any method known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene, 1991, 101: $ 195; EP 185573; Graham). , EMBO J., 1984, 3: 2917; Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36:59). Recombinant adenovirus is recovered and purified using conventional molecular biology methods well known to those skilled in the art.
[0063]
Adeno-associated virus
Adeno-associated viruses (AAVs) are relatively small-sized DNA viruses that can integrate in a stable and site-specific manner into the genome of the cells they infect. They can infect a wide range of cells without inducing any effects on cell growth, tissue formation, or differentiation, and they are not thought to be involved in human disease. The AAV genome has been cloned, sequenced, and characterized. The use of AAV-derived vectors to transfer genes in vitro and in vivo has been disclosed (PCT Publication Nos. 91/18088 and WO93 / 09239; U.S. Pat. Nos. 4,797,368 and 5, 139,941; see EP-A-488,528). The replication-defective recombinant AAV according to the present invention comprises a plasmid containing the nucleic acid sequence of interest flanked by two AAV inverted terminal repeat (ITR) regions, and a plasmid having AAV encapsidation genes (rep and cap genes). , A cell line infected with a human helper virus (eg, adenovirus). The produced AAV recombinant is then purified by a conventional method.
[0064]
Retrovirus vector.に お い て In other embodiments, the gene is, for example, as described in US Patent No. 5,399,346; Mann et al. U.S. Pat. Nos. 4,650,764 and 4,980,289; Markowitz et al., Cell, 1983, 33: 153; , J. et al. Virol. U.S. Pat. No. 5,124,263; European Patents EP453242 and EP178220; Bernstein et al., 1988, 62: 1120; , Genet. Eng. , 1985, 7: 235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3: 689; PCT Publication No. WO 95/07358; and Kuo et al. , Blood, 1993, 82: 845, can be introduced into a retroviral vector. Retroviruses are integrating viruses that infect dividing cells. The retroviral genome contains two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env). In the recombinant retroviral vector, the gag, pol, and env genes are completely or partially deleted, and replaced with the heterologous nucleic acid sequence of interest. These vectors include HIV, MoMuLV ("Murine Moloney leukemia virus" MSV ("Mice Moloney sarcoma virus"), HaSV ("Harvey sarcoma virus"; SNV ("Spleen necrosis virus"); RAV ("Rous sarcoma virus")). And suitable types of retroviruses, such as Friend virus, etc. Suitable packaging cell lines have been disclosed in the art, especially cell line PA317 (US Pat. No. 4,861,719), PsiCRIP cells Lines (PCT Publication No. WO90 / 02806) and GP + envAm-12 cell line (PCT Publication No. WO89 / 07150) In addition, the recombinant retroviral vector has a LTR to suppress transcriptional activity. Change within (Bender et al., J. Virol., 1987, 61: 1639) .Recombinant retroviral vectors known to those skilled in the art can include extended encapsidation sequences that may include portions of the gag gene. Purify by conventional methods.
[0065]
Retroviral vectors can be constructed to function as infectious particles, or to perform a single round of transfection. In the former case, the virus is modified to retain all of its genes except those responsible for the oncogenic transfection properties and to express the heterologous structural gene. Manipulating non-infectious viral vectors destroys the viral packaging signal, but the structure required to package the co-transfected virus, engineered to contain the heterologous structural gene and the packaging signal. Leave the gene intact. Therefore, the virus particles produced cannot produce further virus.
Retroviral vectors can also be introduced by a DNA virus that allows one cycle of retroviral replication and increases transfection efficiency (PCT Publication Nos. WO95 / 22617, WO95 / 26411, WO96 / 39036). And WO 97/19182).
[0066]
Lentiviral vector. In other embodiments, lentiviral vectors can be used as agents for direct delivery and sustained expression of transgenes in various tissue types, including brain, retina, muscle, liver and blood. Vectors can efficiently transduce dividing and non-dividing cells in these tissues, and maintain long-term expression of the gene of interest. For a review, see Naldini, Curr. Opin. Biotechnol. , 1998, 9: 457-63; Zufferey, et al. , J. et al. Viol. , 1998, 72: 9873-80). Lentiviral packaging cell lines are available and generally known in the art. They facilitate the production of high titer lentiviral vectors for gene therapy. An example is the tetracycline-inducible VSV-G pseudotype lentivirus packaging cell line that is capable of producing virus particles at a titer greater than 106 IU / ml for at least 3 to 4 days (Kafri, et al., J. Am. Birol., 1999, 73: 576-584). Vectors produced by inducible cell lines can be enriched in vitro and in vivo to the extent required to effectively transduce non-dividing cells.
[0067]
Non-viral vectors. In other embodiments, the vector can be introduced in vivo, by lipofection, as naked DNA, or using other transfection enhancing agents (peptides, polymers, etc.). Synthetic cationic lipids can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of a gene encoding a marker (Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 1987, 84: 7413-7417; Felgner and Ringold, Science, 1989, 337: 387-388; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Scad. 8031; Ulmer et al., Science, 1993, 259: 1745-1748). Useful lipid compounds and compositions for transporting nucleic acids are disclosed in PCT Patent Publication Nos. 95/18863 and WO 96/17823, and in US Pat. No. 5,459,127. Lipids may be chemically linked to other molecules for targeting (see Mackey et al., Supra). Target peptides, eg, hormones or neurotransmitters, and proteins, such as antibodies, or non-peptide molecules can be chemically coupled to liposomes.
[0068]
Other molecules, such as cationic oligopeptides (eg, PCT Patent Publication No. WO 95/21931), peptides derived from DNA binding proteins (eg, PCT Patent Publication No. WO 96/25508) or cationic polymers (eg, PCT Patent Publication No. WO95 / 21931) are also useful for facilitating transfection of nucleic acids in vivo.
[0069]
It is also possible to introduce the vector in vivo as a naked DNA plasmid. Naked DNA vectors for gene therapy can be added to the desired host cells by any method known in the art, such as electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of a gene gun, or a DNA vector transporter. (E.g., Wu et al., J. Biol. Chem., 1992, 267: 963-967; Wuane Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263: 14621-14624; See Canadian Patent Application No. 2,012,311; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88: 2726-2730). Receptor-mediated DNA delivery methods can also be used (Curier et al., Hum. Gene Ther., 1992, 3: 147-154; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432). ). U.S. Patent Nos. 5,580,859 and 5,589,466 disclose delivery of a foreign DNA sequence in a mammal without the use of a transfection-enhancing agent. Recently, a relatively low voltage, highly efficient method of in vivo DNA transport, called electron transport, has been disclosed (Mir et al., CP Acad. Sci., 1988, 321: 893; PCT). Published WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).
[0070]
Antibodies and antisense constructs
The present invention discloses antibodies that can be used to detect the presence of Cyr61 in cells, especially leiomyoma cells such as uterine leiomyomas. Furthermore, the antibodies (eg, anti-idiotype antibodies) can be used to inhibit the growth of uterine leiomyoma or prevent its formation. Antibodies used in therapeutic methods may be conjugated to a pharmaceutically active compound.
[0071]
In accordance with the present invention, recombinantly or chemically synthesized Cyr61 polypeptides and fragments or other derivatives may be used as immunogens to generate antibodies that recognize Cyr61 polypeptides or portions thereof. The portion of the polypeptide used as the immunogen may be specifically selected to alter the immunogenicity of the developed antibody. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, humanized, chimeric, single chain, Fab fragments, and Fab expression libraries. An antibody specific for human Cyr61 may recognize a wild-type or variant of Cyr61. Preferably, the antibody does not recognize or bind to a protein belonging to the same protein family as Cyr61. In certain embodiments, the antibody consists of at least 8 amino acids, preferably 8-10 amino acids, and more preferably 15-30 amino acids. Preferred antibodies are raised against, but not limited to, amino acids 371-381 of Cyr61 (described in FIG. 7). Preferably, the antibody recognizes or binds to amino acids for a contiguous Cyr61 polypeptide.
[0072]
Various methods known in the art may be used for generating polyclonal antibodies against the polypeptide, derivative or analog. For the production of antibodies, various host animals, including but not limited to rabbits, mice, rats, sheep, goats, and the like, are immunized by injection with a polypeptide or derivative (eg, a fragment or a fusion protein). Can be The polypeptide or fragment thereof can be conjugated to an immunogenic carrier, such as bovine serum albumin (BSA) or keyhole limpet hemocyanin (KLH). Depending on the host species, but not limited to, Freund's adjuvant (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, KLH, dinitrophenol, and BCG ( A variety of adjuvants may be used to enhance the immune response, including surfactants, such as potentially useful human adjuvants, such as Bacille Calmette-Guerin and Corynebacterium parvum.
[0073]
Monoclonal antibodies to Cyr61 polypeptides, fragments, analogs or derivatives thereof, may be prepared by any technique which provides for the production of antibody molecules by subcultured cell lines in media that may be used. These include, but are not limited to, the hybridoma method originally developed by Kohler and Milstein (Nature 256: 495-497, 1975), as well as the trioma method and the human B cell hybridoma method (Kozbor et al., Immunology). Today 4: 72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, 1983), and the EBV-hybridoma method (Cole) for producing human monoclonal antibodies. et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96, 1985). A “chimeric antibody” may be made by splicing a gene from a non-human antibody molecule specific for a polypeptide with a gene from a human antibody molecule of appropriate biological activity (Morrison et al., J. Bacteriol). 159: 870, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314: 452-454, 1985).
[0074]
In making and using antibodies, screening for, or testing with, a desired antibody can be accomplished by methods known in the art, such as radioimmunoassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, Immunoradiometric assay, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, in situ immunoassay (eg, using colloidal gold, enzyme or radioisotope label), western blot, sedimentation reaction, agglutination assay (eg, gel agglutination assay, blood agglutination assay) Assays), complement binding assays, immunofluorescence assays, protein A assays, immunoelectrophoresis assays, and the like.
[0075]
The aforementioned antibodies can be used in methods known in the art for the location and activity of the polypeptide, e.g., for Western blotting, imaging the polypeptide in situ, measuring its level in a suitable physiological sample, and the like. And any of the detection methods described above or known in the art. Such antibodies can also be used in assays for ligand binding, for example, as disclosed in US Pat. No. 5,679,582. Antibody binding generally occurs most readily under physiological conditions, eg, pH between about 7 and 8, and physiological ionic strength. The presence of carrier protein in the buffer solution stabilizes the assay. Although there is some tolerance for variations in optimal conditions, such as increasing or decreasing ionic strength, temperature or pH, or adding detergents or chaotropic salts, such variations may reduce the stability of the bond. There will be.
[0076]
In certain embodiments, antibodies can be generated that agonize the activity of a Cyr61 polypeptide. In particular, Cyr61 can be regulated using intracellular single-chain Fv antibodies. Such antibodies can be tested using the assays described below for identifying ligands.
[0077]
In another particular embodiment, the antibodies of the invention are anti-idiotype antibodies. These antibodies recognize and / or bind to other antibodies present in the system. Anti-idiotype antibodies may be monoclonal, polyclonal, chimeric, humanized. Further, the antibodies may be conjugated to a pharmaceutically active compound. In certain embodiments, the pharmaceutically active compound is calicheamicin.
[0078]
In other specific embodiments, antibodies, such as, but not limited to, anti-idiotypes, are conjugated to a secondary component, such as, for example, a small molecule, polypeptide or polynucleotide. Conjugates can be made by chemical modification of the antibody, which binds the antibody to a secondary component. Bound antibodies allow targeting of secondary components, such as antibiotics, to a site of interest. The secondary component can be of any size or length. In certain embodiments, the secondary component is a pharmaceutically active compound. The pharmaceutically active compound can be, but is not limited to, an anti-leiomyoma or calicheamicin.
[0079]
A further aspect of the invention relates to the use of an antibody to target a pharmaceutical compound or Cyr61 peptide, as already discussed. In this embodiment, an antibody against Cyr61 is used to present a particular compound to tumor cells. A compound, preferably an anti-tumor agent, when conjugated to an antibody, is called a target compound or agent. Methods for making such targeting compounds and agents are known in the art. Exemplary disclosures of target compounds and their preparation are described in U.S. Patent Nos. 5,053,934; 5,773,001; and 6,015,562.
[0080]
Any desired agent that has activity on cancer cells may be used in making the targeted agent. Examples of such compounds are disclosed in U.S. Patent No. 6,015,562. In particular, see U.S. Patent Nos. 4,971,198; 5,079,233; 4,539,203; 4,554,162; 4,675,187; and 4,837,206. I want to. These publications refer to antitumor agents and antibiotics that may be used as targeted pharmaceutical compounds.
[0081]
The present invention provides antisense nucleic acids (including ribozymes) that can be used to inhibit or prevent Cyr61 expression with suppressor proteins, particularly proteins that suppress the effect of Cyr61 on cell growth. Antisense nucleic acids that increase the total level of Cyr61 may be used to modulate the binding of Cyr61 to intracellular proteins (eg, integrin receptors). In addition, antisense nucleic acids may be used as a diagnostic tool to measure changes in Cyr61 transcription and / or translation in a sample suspected of containing uterine leiomyoma.
[0082]
An "antisense nucleic acid" is a single-stranded nucleic acid molecule or oligonucleotide that inhibits the latter role in hybridizing under cytoplasmic conditions with complementary bases in an RNA or DNA molecule. In a preferred embodiment, the antisense nucleic acid is at least about 10 nucleotides, preferably at least about 15 nucleotides, and more preferably, the length is at least about 20 nucleotides. Where the RNA is a messenger RNA transcript, the antisense nucleic acid is a reverse transcript or an mRNA-interfering complementary nucleic acid. As currently used, "antisense" broadly includes RNA-RNA interactions, RNA-DNA interactions, ribozymes and RNase-H mediated suppression. Antisense nucleic acid molecules can be encoded by recombinant genes for expression in cells (eg, US Pat. Nos. 5,814,500 and 5,811,234) or, alternatively, they can be engineered. (Eg, US Pat. No. 5,780,607). Vectors containing these oligonucleotides or antisense constructs are also contemplated.
[0083]
Compound
Ovarian steroids
"Ovarian steroids" refers to a class of hormone substances secreted from the reproductive tract, particularly the ovaries, including, but not limited to, estrogen and progesterone.
Estrogen compounds are described, for example, in Stellaloids Inc. , Wilton N., et al. H. "Steroids" from Eleventh Edition. Also included are the non-steroidal estrogens disclosed therein. Other compounds include derivatives, metabolites, and precursors. Also included are mixtures of one or more compounds. Examples of such mixtures are provided in Table II of US Pat. No. 5,554,601 (see column 6). Examples of estrogens, alone or in combination with other agents, are provided in US Pat. No. 5,554,601.
[0084]
β-estrogens are β-isomers of estrogen compounds. α-Estrogen is the α-isomer of the estrogen component. The term "estradiol", unless stated otherwise, is either α- or β-estradiol.
The term “E2” is synonymous with 17β-estradiol.
[0085]
Progesterone compounds are described, for example, in McGraw-Hill, New York, NY. In the 9th edition of the "Pharmacological Foundation for Treatment". Progestin compounds include, for example, progestins containing a 21 carbon skeleton and a 19 carbon (19-nortestosterone) skeleton. Non-steroidal progestin compounds, derivatives, precursors, and metabolites are also contemplated herein.
[0086]
Preferably, non-female estrogen compounds are used herein. Non-female estrogen compound means a compound that does not produce an effect that imparts feminine characteristics to a subject. Such compounds have the advantage of not causing uterine hypertrophy and other undesirable side effects, and therefore can be used at higher effective doses. Examples of non-female estrogens include raloxifene (Evista; Eli Lilly), tamoxifen (Nolvadex; Astra Zeneca), and other selective estrogen receptor modulators.
[0087]
Growth factor
Growth factors are a class of proteins involved in stimulating cell division. These proteins interact with cell surface receptors to induce transcription factors that promote cell survival. Growth factor receptors signal via the Ras pathway, a highly conserved signal transduction pathway. The Ras pathway functions to promote cell survival in radiotherapy, and genetic alterations in this pathway that structurally result in an activated intracellular survival pathway are associated with cancer progression There are many.
[0088]
Growth factors also include small molecule compounds that interact with growth factor receptors, for example, to produce the same effects as seen with growth factor peptides. Other compounds included are derivatives, metabolites, and precursors of endogenous growth factors. In certain embodiments of the present invention, the particular growth factors used include, but are not limited to, epidermal growth factor, heparin-binding epidermal growth factor, and basic fibroblast growth factor.
[0089]
Assay system
Any cell assay system that allows for assessing the functional activity of Cyr61 agonists or antagonists, steroids, non-steroids and growth factor receptor agonists and antagonists is contemplated by the present invention. In certain embodiments, assays can be used to identify compounds that interact with specific isomeric forms of the steroid receptor and modulate the transcription and translation of Cyr61, including the transcription of Cyr61 mRNA, the transcription of Cyr61. The evaluation can be performed by evaluating the effect of a test compound which modulates the activity of translation or Cyr61.
[0090]
Any conventional method allows the detection of the expressed product. For example, the invention includes Northern blot analysis to detect Cyr61 mRNA product. Methods include, for example, sorting total intracellular RNA on an agarose gel, transferring the RNA to a solid support membrane, and then labeling the DNA probe, where the DNA probe is stable between the DNA probe and the RNA component in the sample. Detecting a DNA-RNA complex that is specific for a particular nucleic acid sequence of Cyr61 under conditions capable of forming a complex. Such a complex may be detected by using any suitable method known in the art, for example, ECL and fluorescence, wherein detection of the complex indicates the presence of Cyr61 in the sample. It is.
[0091]
Typically, immunoassays use either a labeled antibody or a labeled antigenic component (eg, that competes with the antigen in the sample for binding to the antibody). Suitable labels include but are not limited to those based on enzymes, fluorescent, chemiluminescent, radioactive, or dye molecules. Assays that amplify signals from probes are also known, such as those using biotin and avidin, and enzyme-labeled immunoassays such as ELISA assays.
[0092]
In vitro screening method
Candidate compounds are added to in vitro cell cultures of host cells prepared by methods known in the art and subsequently measured for Cyr61 mRNA and / or protein levels. A variety of in vitro systems can be used to analyze the effects of the novel compounds on Cyr61 transcription and translation. Preferably, each experiment is performed one or more times in triplicate with a variety of different dilutions of the compound.
[0093]
The host cell screening system of the present invention allows for two assays: a direct activity assay (agonist screen) and an inhibition assay (antagonist screen). Agonist screens involve detecting a change in the level of expression of a gene by a host cell that has been contacted with a test compound, generally an increase in expression of the gene. When the Cyr61 gene is expressed, the test compound is stimulating Cyr61 transcription through receptor interaction.
[0094]
Antagonist screens involve detecting the expression of a reporter gene by a host cell when contacted with a compound that modulates expression of Cyr61. If Cyr61 expression is reduced, the test compound is a candidate antagonist. If there is no change or increase in reporter gene expression, the test compound is not an effective antagonist.
[0095]
The assay systems disclosed herein may be used for high-throughput primary screening of agonists and antagonists, or binding assays that identify compounds that interact with, for example, the receptor and affect Cyr61 transcription. It may be used as a secondary function screen for candidate compounds identified by a separate primary screen, such as a screen.
[0096]
In vivo studies using transgenic animals
Transgenic animals, and preferably mammals, can be prepared to assess the molecular mechanism of Cyr61. Preferably, animals are "humanized" against Cyr61 to evaluate compounds for use in treating humans. Such mammals provide an excellent model for screening or testing drug candidates. The term "transgenic" usually refers to animals whose germline and somatic cells contain the transgene of interest, ie, Cyr61. However, transient transgenic animals can be generated by ex vivo or in vivo induction of the expression vectors of the invention. Both types of “transgenic” animals are contemplated for use in the present invention, eg, to evaluate the effect of a test compound on Cyr61 or the activity of Cyr61.
[0097]
Thus, human Cyr61, "knock-in" mammals can be prepared to evaluate the molecular biology of this system in more detail than is possible with human subjects. It is also possible to evaluate a compound or disease in a "knockout" animal, for example to identify a compound that can compensate for a defect in Cyr61 or Cyr61 activity. Both techniques allow the manipulation of a single unit of genetic information at its natural location in the cell genome and the consequences of that manipulation in the context of a terminally differentiated organism.
[0098]
Rats and mice and rabbits are most often used as transgenic animals, especially for laboratory tests on the regulation of protein function and genes in vivo, but any animal can be used in the practice of the present invention. .
[0099]
"Knock-in" mammals are those in which the endogenous gene has been replaced by a heterologous structural gene (Roemer et al., New Biol. 3: 331, 1991). Preferably, the heterologous structural gene or regulatory system is "knocked-in" at the location of interest where the expression or function of the heterologous structural gene is to be evaluated (in which case the gene may be a reporter gene. Elefanty et al. al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 11897, 1998), thereby linking the expression of the heterologous structural gene with transcription from a suitable promoter. This is based on homologous recombination, transposon (Westphal and Leder, Curr Biol 7: 530, 1997), and mutation recombination site (Araki et al., Nucleic Acids Res 25: 868, 1997) or PCR (Zhang and Henderson, England). 25: 784, 1998). Coffman, Semin. Nephrol. 17: 404, 1997; Esther et al. , Lab. Invest. 74: 953, 1996, Murakami et al. , Blood Press. Suppl. 2:36, 1996.
[0100]
A “knockout mammal” is a mammal (eg, a mouse) that contains, in its genome, a specific gene that has been inactivated by gene targeting (eg, US Pat. Nos. 5,777,195 and 5). , 616,491). Knockout mammals include both heterozygous knockouts (ie, one defective and one wild-type allele) and homozygous mutants. Preparation of a knockout mammal requires first the introduction of a nucleic acid construct used to suppress the expression of a particular gene into an undifferentiated cell type called fetal stem cells. The cells are then injected into a mammalian fetus. The mammalian fetus with the integrated cells is transferred and implanted in a Foster mother for maintenance of gestation. Zhou, et al. (Genes and Development, 9: 2623-34, 1995) disclose PPCA knockout mice.
[0101]
The term "knockout" refers to a partial or complete suppression of expression of at least a portion of a protein encoded by an endogenous DNA sequence in a cell. The term "knockout construct" refers to a nucleic acid sequence designed to reduce or suppress the expression of a protein encoded by an endogenous DNA sequence in a cell. Nucleic acid sequences used as knockout constructs typically contain (1) DNA (exon, intron, and / or promoter sequences) from some portion of the gene to be repressed and (2) cells in the cell. Typically comprises a marker sequence used to detect the presence of the knockout construct. The knockout construct is inserted into the cell and integrated with the genomic DNA of the cell in a location that prevents or prevents transcription of the native DNA sequence. Such insertions often occur by homologous recombination (ie, when the knockout construct is inserted into a cell such that the knockout construct is integrated into the corresponding position of the intracellular DNA and religated, the endogenous DNA Regions of the knockout construct that are homologous to the sequence hybridize to each other). The nucleic acid sequence of the knockout construct may be (1) the complete or partial sequence of one or more exons and / or introns of the gene to be suppressed, (2) the complete or partial promoter sequence of the gene to be suppressed, or ( 3) The combination may be included. Typically, the knockout construct is inserted into fetal stem cells (ES cells) and subsequently integrated into the genomic DNA of ES cells, usually by homologous recombination. The ES cells are then injected and integrated into the developing fetus. However, the present invention does not require any special methods for preparing transgenic animals.
[0102]
Generally, for homologous recombination, the DNA is at least about 1 kilobase (kb) in length and preferably 3-4 kb in length, so that when the construct is introduced, Provide sufficient complementary sequences for The transgenic constructs can be obtained by microinjection into the genomic DNA of EA cells, into the male germ nucleus of fertilized oocytes, or as described, for example, in US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009 and Hogan et al. , Transgenic Animals: A Laboratory Manual, 1986, Cold Spring Harbor, can be introduced by any method known in the art. Transgenic primary animals can be used to create other transgenic animals, or alternatively, the transgenic primary animals may be cloned to produce other transgenic animals.
[0103]
Mammals in which two or more genes have been knocked out or knocked in, or both, are included within the scope of the invention. Such animals can be produced by repeating the methods described herein to make each knockout construct, or by breeding mammals each having a single knocked out gene, and then double knockout genotypes By screening them.
[0104]
Modulated knockout animals are derived from the tet-repressor system (see U.S. Patent No. 5,654,168) or the Cre-Lox system (U.S. Patent Nos. 4,959,317 and 5,801,030). See, for example).
[0105]
Cloning and expression of Cyr61
The present invention contemplates the analysis and isolation of any antigenic fragment of Cyr61 from any source, preferably human. In addition, expression of a functional or mutant CYr61 protein for evaluation, diagnosis, or therapy is also contemplated.
Conventional molecular biology, microbiology, and recombinant DNA techniques within the skill of the art may be used in the present invention. Such methods are explained fully in the literature. See, for example, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Carbourne Laboratories, 1989. A Practical Approach, Volumes I and II (DN Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); D. Hames & S.M. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S.M. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); M. Ausubel et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
[0106]
How to inhibit the growth of uterine leiomyoma
In accordance with the present invention, upregulation of Cyr61 mRNA or protein can be used to inhibit an increase in a disease associated with Cyr61, such as, for example, uterine leiomyoma. According to the present invention, a subject is administered a therapeutically effective amount of a compound that stimulates the synthesis of mRNA encoding Cyr61, the translation of Cyr61 mRNA, the expression of Cyr61 protein, or the activity of Cyr61 in leiomyoma tissue, thereby increasing uterine activity. Methods are provided for inhibiting the growth of leiomyomas. The present invention further provides a method of inhibiting the growth of uterine leiomyomas by increasing the total level of Cry61 protein in the cells. These methods include, but are not limited to, delivering Cyr61 protein to cells, administering an expression vector encoding the Cyr61 protein, and regulating the binding of Cyr61 to an intracellular protein (eg, an integrin receptor). Administration of a therapeutically effective amount of the compound. The compounds may be formulated into pharmaceutical compositions (shown below) for administration to a subject. The invention provides a method of inhibiting uterine leiomyoma growth by administering to a subject a therapeutically effective amount of Cyr61 protein expression or recombinant DNA that stimulates recombinant Cyr61 protein. In certain embodiments, inhibition of uterine leiomyoma growth is observed when growth is reduced by at least 20%, preferably by at least 40%, and more preferably by at least 80%.
[0107]
IGF I, IGF II, bFGF, and HB-EGF levels are up-regulated in leiomyomas, such as uterine leiomyomas. Reduction of Cyr61 in leiomyomas increases the activity of IGF and growth factors, and therefore these molecules may be more effective at stimulating cell proliferation. Therefore, further embodiments of the present invention are directed to synthesis of mRNA encoding Cyr61, translation of Cyr61 mRNA, expression of Cyr61 protein, or stimulating Cyr61 activity, and IGFＩI, IGF II, bFGF, and Methods for reducing the synthesis, translation, expression or activity of mRNA of HB-EGF or any combination thereof are contemplated.
[0108]
An effective amount of a compound of the present invention may vary depending on various factors such as the condition, weight, sex and age of the individual, and the mode of administration. This amount of the compound can be determined experimentally by methods well known in the art, such as by establishing a matrix of dosages and frequencies, and then assigning groups of subjects to each point in the matrix.
[0109]
How to prevent the formation of uterine leiomyoma
According to the present invention, the expression of Cyr61 protein is higher in autologous myometrial tissue as compared to uterine smooth muscle tissue. According to the present invention, the formation of uterine smooth muscle tumors is achieved by administering to a subject a therapeutically effective amount of a compound that stimulates the synthesis of mRNA encoding Cyr61, translation of Cyr61 mRNA, expression of Cyr61 protein or activity of Cyr61. A method for preventing is provided. The present invention further provides a method for preventing the formation of uterine leiomyomas by increasing the total level of Cyr61 protein in the cells. These methods include, but are not limited to, delivery of the Cyr61 protein to cells, administration of an expression vector encoding the Cyr61 protein, and binding of Cyr61 to an intracellular protein (eg, an integrin receptor). And the administration of a therapeutically effective amount of a compound that modulates The compounds may be formulated into pharmaceutical compositions (shown below) for administration to a subject. The present invention provides a method for preventing uterine leiomyoma formation by administering to a subject a therapeutically effective amount of recombinant DNA to stimulate expression of Cyr61 protein or recombinant Cr61 protein.
[0110]
As shown in previous reports, IGF I, IGF II, bFGF, and HB-EGF levels are up-regulated in leiomyomas, such as uterine leiomyomas. Reduction of Cyr61 in leiomyomas may increase IGF and growth factor activity, and therefore these molecules may be more effective at stimulating cell proliferation. Therefore, a further embodiment of the present invention is directed to synthesis of mRNA encoding Cyr61, translation of Cyr61 mRNA, expression of Cyr61 protein, or stimulating Cyr61 activity, and / or IGF I, IGF II, bFGF. A method for reducing the synthesis, translation, expression, or activity of mRNA of HB-EGF or any combination thereof is contemplated. Effective amounts of these compounds may vary depending on various factors such as the condition, weight, sex and age of the individual, and the mode of administration. This amount of the test compound is determined experimentally by methods well known in the art, such as by establishing a matrix of doses and frequencies and assigning a group of subjects to each point in the matrix. Can be.
[0111]
Diagnostic method
In accordance with the present invention, Cyr61 mRNA or protein levels that are reduced as compared to levels normally expressed in myometrial tissue can be detected to diagnose Cyr61-related diseases such as uterine leiomyoma. In the present invention, the level of Cyr61 mRNA or protein in the suspect tissue is compared to the level of Cyr61 mRNA or protein present in normal smooth muscle layer tissue (autologous myometrial tissue) obtained from the same individual. Lower levels of Cyr61 protein and Cyr61 mRNA in suspect tissue compared to normal tissue indicate the presence of uterine leiomyoma. Preferably, the level of Cyr61 mRNA or Cyr61 protein in the suspect tissue is equal to or more than three times lower than normal tissue. More preferably, the level is about 9 to about 10 times lower than normal tissue. Using low levels, therapies may be developed that further include at least two therapies in addition to the Cyr61-related treatments disclosed herein. The levels of Cyr61 mRNA and Cyr61 protein in the suspicious tissue are compared to normal tissue by normalizing the levels of additional mRNA and protein (eg, such as GAPDH) present in the cells.
[0112]
Various methods for detecting such reduced levels of Cyr61 mRNA or protein expression include, but are not limited to, Northern blots, in situ hybridization tests, Western blots, ELISAs, radioimmunoassays, "sandwiches" Immunoassay, immunoradiometric assay, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, in situ immunoassay (eg using colloidal gold, enzyme or radioisotope label), sedimentation reaction, complement fixation assay, immunofluorescence assay, protein A Assays and immunoelectrophoresis assays.
[0113]
Nucleic acid assays
DNA may be obtained from any cell source. DNA is extracted from cell sources or body fluids using any of a number of methods known in the art. It will be appreciated that the particular method used to extract the DNA will depend on the nature of the source. Generally, the minimum amount of DNA extracted for use in the present invention is about 25 pg (4 × 109(Corresponding to about 5 cells corresponding to the genome size of base pairs). The sequencing method has already been described in detail above.
[0114]
In another alternative embodiment, the RNA is purified using methods known to those skilled in the art, such as, for example, guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction (Chomocyznski et al., Anal. Biochem., 162: 156, 1987). , Isolated from biopsy tissue. The isolated RNA is then subjected to a pair of reverse transcription and amplification by polymerase chain reaction (RT-PCR), using specific oligonucleotide primers specific for the site selected. The conditions for primer annealing are selected to ensure specific reverse transcription and amplification. That is, the appearance of the amplification product diagnostically indicates the presence of a particular gene change. In other embodiments, the RNA is reverse transcribed and amplified, and the amplified sequence is then identified, for example, by direct sequencing. In yet another embodiment, cDNA obtained from RNA can be cloned and then sequenced to identify the mutation.
[0115]
Protein assays
In another embodiment, the tissue is obtained from a subject. An antibody capable of binding specifically to Cyr61 is then contacted with a sample of tissue to determine the presence or absence of the Cry61 polypeptide specified by the antibody. Antibodies can be polyclonal or monoclonal, but are preferably monoclonal. The measurement of the specific antibody bound to the cell may be performed by any known method such as, for example, quantitative flow cytometry, enzyme-linked or fluorescent-linked immunoassay, Western analysis and the like. Generally, for use in the present invention, the minimum amount of protein to be extracted for an immunoassay is about 20 μg.
For example, immunoassay techniques such as those disclosed in U.S. Patent Nos. 5,747,274 and 5,744,358, and in particular, immunoassays of the solid-phase "chromatographic" type have been used to analyze proteins in blood or blood fractions. Is preferred for detecting
[0116]
Pharmaceutical composition
Test compounds, salts thereof, antibodies, proteins, expression vectors and antisense constructs may be formulated into a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition comprises at least one therapeutically or stimulatively effective amount as described above. This can be an amount effective to increase Cyr61 expression or activity, Cyr61 gene transcription, or Cyr protein in target cells. The composition can include a Cyr61 protein or a fragment of the protein. Fragments of the Cyr61 protein preferably retain the functional activity associated with the full-length protein. In certain embodiments, the C-terminal region of the Cyr61 protein may be altered, deleted, or mutated to increase or decrease the expression or function of the Cyr61 protein.
[0117]
Pharmaceutical compositions typically further include a pharmaceutically acceptable carrier (or administration vehicle) such as ethanol, glycerol, water and the like. Examples of such carriers and methods of prescribing are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition (1990), Mack Publishing Company.
[0118]
The pharmaceutical composition may contain other additives, such as flavoring agents, sweetening agents, preservatives, dyes, binders, suspending agents, coloring agents, disintegrants, excipients, diluents, lubricants, plasticizers, or the like. And any combination of the above. Suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose and beta-lactose; corn sweeteners; natural and synthetic gums such as acacia, tragacanth, and sodium alginate; Methylcellulose; polyethylene glycol; wax and the like. Suitable lubricants include, but are not limited to, sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like. Suitable disintegrants include, without limitation, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum and the like.
[0119]
Suitable salts of test compounds include, but are not limited to, acid addition salts such as hydrochloric, hydrobromic, hydroiodic, perchloric, sulfuric, nitric, phosphoric, acetic, Propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, carboxylic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid Using hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, cyclohexanesulfamic acid, salicylic acid, p-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, and 2-acetoxybenzoic acid, and saccharin. And salts prepared by the method. Other suitable salts of the compounds include, but are not limited to, alkali metal salts such as sodium and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium salts; and salts formed with organic ligands , For example, quaternary ammonium salts.
[0120]
Typical salts include, but are not limited to, acetate, benzenesulfonate, benzoate, bicarbonate, bisulfate, bitartrate, borate, bromide, calcium edetate, camsylate, carbonate, chloride, clavula of the compounds of the present invention. Nate, citrate, dihydrochloride, editate, edisylate, estrate, esylate, fumarate, gluceptate, gluconate, glutamate, glycolyl arsanilate, hexyl resosinate, hydravamin, hydrobromide, hydrochloride, hydroxynaphthoate, iodide, Isothionate, lactate, lactobionate, laurate, malate, maleate, mandelate, mesylate, methyl bromide, methyl nitrate , Methyl sulfate, mukate, napsylate, nitrate, N-methylglucamine ammonium salt, oleate, pamoate (embonate), palmitate, pantothenate, phosphate / diphosphate, polygalacturonate, salicylate, stearate, sulfate, Includes sub-acetates, succinates, tannates, tartrate, theolate, tosylate, triethiodide, and valerate salts.
[0121]
The present invention includes prodrugs of the test compounds. Prodrugs include, but are not limited to, functional derivatives of the test compounds of the invention that can be readily converted in vivo to the compounds of the invention. Conventional methods for the selection and preparation of suitable prodrug derivatives are described, for example, in "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.
[0122]
The pharmaceutical compositions may be for oral, parenteral, nasal, ocular, mucosal, transdermal, buccal, topical, sublingual or rectal use, tablets, pills, capsules, pills, powders, granules, sterile parenteral solutions or suspensions. Suspension, sterile V. Solution, sterile M. Solutions, sterile intraperitoneal solutions, elixirs, tinctures, metered aerosol or liquid sprays, drops, ampules, self-injection or suppositories may be formulated as unit dosage forms. The unit dosage form can be in a form suitable for sustained or delayed release, for example, an insoluble salt of the compound adapted to provide a depot preparation for intramuscular injection, such as the decanoate salt.
[0123]
Solid unit dosage formulations may be prepared by mixing a compound of the present invention with a pharmaceutically acceptable carrier and any other desired excipients to form a solid preformulation composition. Examples of suitable excipients for solid unit dosage formulations include, but are not limited to, starch, such as corn starch; lactose; sucrose; sorbitol; talc; stearic acid; magnesium stearate; dicalcium phosphate; Sex gums; and pharmaceutical diluents, such as water. Solid pre-prepared compositions typically comprise a homogeneous mixture of a compound of the present invention and excipients, i.e., the compound is dispersed so that the composition can be readily subdivided into equally effective unit dosage formulations. Mix until evenly dispersed throughout the composition. The solid preparatory composition is then subdivided into unit dose formulations of the type described above.
[0124]
The tablets or pills can be coated or otherwise compounded to form a unit dosage form with extended activity, for example, time release and sustained release unit dosage forms. For example, a tablet or pill can contain an internally administered component and an externally administered component, the latter being in a form wrapping the former. The two components are separated by an enteric layer that helps resist disintegration in the stomach, allowing the internal components to pass through the duodenum as is or to delay release. The compound may be released immediately after administration, or the compound may be formulated to be released in a manner that lasts for a specified time course, for example, 2-12 hours or more.
[0125]
Liquid unit dosage forms include, but are not limited to, aqueous solutions, suitably flavored syrups, aqueous or oily suspensions, and edible oil flavored emulsions such as cottonseed oil, sesame oil, coconut oil or Includes peanut oil, and elixirs and similar pharmaceutical vehicles. Suitable dispersing and suspending agents for aqueous suspensions include, but are not limited to, synthetic and natural gums such as tragacanth, acacia, alginate, dextran, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, polyvinyl-pyrrolidone and gelatin. It is.
[0126]
Pharmaceutically acceptable carriers suitable for topical formulation include, but are not limited to, alcohol, aloe vera gel, allantoin, glycerin, vitamin A and E oils, mineral oil, PPG2 myristyl propionate, and the like. . Such topical formulations include liquid drenches, alcoholic solutions, topical cleansers, cleansing creams, skin gels, skin lotions, and cream or gel formulations (including but not limited to aqueous solutions and suspensions). It may be a shampoo. Typically, these topical formulations include a suspending agent, such as bentonite, and optionally an antifoam. Generally, topical formulations will contain from about 0.005% to about 10%, and preferably from about 0.01% to about 5%, by weight of the compound, based on 100% total weight of the topical formulation.
[0127]
Pharmaceutical compositions of the present invention for parenteral administration, and particularly by injection, typically include an inert liquid carrier such as water, but are not limited to peanut oil, cottonseed oil, sesame oil and the like. Vegetable oils and organic solvents such as solketals and glycerol formal are included. Preferred liquid carriers are vegetable oils. These pharmaceutical compositions may be prepared by dissolving or suspending the compound of the invention in a liquid carrier. In general, pharmaceutical compositions for parenteral administration will contain from about 0.005 to about 10% by weight of the compound of the invention, based on 100% by weight of the total pharmaceutical composition.
[0128]
The compounds of the present invention can also be administered in the form of liposome delivery systems, such as small unilamellar vehicles, large unilamellar vehicles, and multilamellar vehicles. Liposomes can be made from various phospholipids, such as cholesterol, stearylamine or phosphatidylcholine.
[0129]
The compounds of the present invention may be delivered by using a monoclonal antibody as the individual carrier to which the compound molecule binds. The compounds of the present invention may be conjugated to water-soluble polymers as targetable drug carriers. Such polymers include, but are not limited to, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer, polyhydroxypropyl methacrylamide phenol, polyhydroxyethyl aspartamide phenol, and polyethylene oxide polylysine, substituted with palmitoyl groups. . In addition, the compounds of the invention may be biodegradable polymers to control the release of the compound, such as polylactic acid, polyepsilon caprolactone, polyhydroxybutyric acid, polyorthoesters, polyacetals, polydihydropyrans, polycyanoacrylates and hydrogels Or an amphiphilic block copolymer.
[0130]
A pharmaceutical composition of the invention is administered to an animal, preferably a human, in need of stimulating Cyr61 transcription or expression, such as by activating a steroid or growth factor receptor, such as by activating a Cyr61. Expression can be stimulated.
[0131]
The effective amount of the active agent and the active metabolite of the active agent of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on various factors such as the condition, weight, sex and age of the individual and the mode of administration. This amount of test compound can be determined empirically by methods well known in the art, such as by establishing a matrix of dose and frequency, and assigning groups of subjects to each point in the matrix.
[0132]
The compounds of the present invention may be administered alone at appropriate dosages determined by routine trials to achieve optimal activity with minimal potential toxicity. In addition, simultaneous or sequential administration of other active agents is desired.
[0133]
The daily dosage of the compounds of the invention may vary within wide limits. For oral administration, the pharmaceutical compositions are preferably presented in the form of scored or non-scored tablets for symptomatic adjustment of the dosage to the patient to be treated. When combined with other active agents as described above to achieve the desired effect, the dosage may be adjusted. On the other hand, the unit dosage forms of these various active agents may be independently optimized and combined to achieve a synergistic effect that lowers the etiology than when either active agent is used alone.
[0134]
Conveniently, the pharmaceutical compositions may be administered in a single daily dose, or the total daily dose may be divided into two, three or four times daily.
For combination therapy with one or more active agents, where the active agents are in separate dosage formulations, the active agents may be co-administered, or they may each be administered separately and staggered.
[0135]
Gene therapy
Deficiency in expression of Cyr61 in leiomyomas can result from allelic deletion or alteration of chromosome lp22-p31 where the gene is located, elimination of estrogen or growth factor signaling pathways, and / or ER and growth factor responses contained within the ER and promoter regions. It may be due to mutation of the element. By providing another copy of Cyr61 to the host, it is possible to overcome any genetic mutation that may occur in nature.
[0136]
In certain embodiments, a vector comprising a sequence encoding a Cyr61 of the invention is administered to treat or prevent a disease or condition associated with loss of functional Cyr61 protein expression or mutant Cyr61 expression. .
Any of the methods for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. A typical method is shown below.
[0137]
For a review on gene therapy, see Goldspiel et al. , Clinical Pharmacy, 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherpy, 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev .. Pharmacol. Toxicol. , 1993, 32: 573-596; Mulligan, Science, 1993, 260: 926-932; and Morgan and Anderson, Ann. Rev .. Biochem. , 1993, 62: 191-217; May, TIBTECH, 1993, 11: 155-215. Methods generally known in the art of recombinant DNA technology that can be used are described in Ausubel et al. , (Eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene transfer, N. a.r., N. a. , (Eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY. Suitable vectors for gene therapy have been described previously.
[0138]
In one aspect, a therapeutic vector comprises a nucleic acid that expresses Cyr61 in a suitable host. In particular, such vectors have a promoter operably linked to the coding sequence of Cyr61. Promoters can be inducible or constitutive, and can optionally be tissue-specific. In certain embodiments of the invention, the promoter is an estrogen response element or a fibroblast growth factor response element. In other embodiments, the antibody coding sequence and any other desired sequences are flanked within the Cyr61 chromosome using nucleic acid molecules flanked by regions that facilitate homologous recombination at the desired location in the genome. (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 8932-8935; Aijlstra et al., Nature, 1989, 342: 435-438).
[0139]
Delivery of the vector to the patient can be either direct, exposing the patient directly to the vector or delivery complex, or indirect, by first transforming the cells with the vector in vitro and then transplanting the patient. It may be. These two approaches are known, respectively, as in vitro and ex vivo gene therapy.
[0140]
In certain embodiments, the vector is administered directly in vivo, where it enters cells in the organism and mediates the expression of Cyr61. This can be accomplished by any of a number of methods known in the art, for example, by constructing it as part of a suitable expression vector and making it intracellular, e.g., deleted or attenuated. By infection with a retrovirus or other viral vector (see US Pat. No. 4,980,286), or by direct injection of naked DNA, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolistic, Dupont). Or coating with lipids or cell surface receptors or transforming agents, biopolymers (eg, poly-*-1-*4-N-acetylglucosamine polysaccharide; see U.S. Patent No. 5,635,493), by encapsulation in liposomes, microparticles, or microcapsules; a peptide or other known to enter the nucleus. Or by administering it to a ligand susceptible to receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1987, 62: 4429-4432). In another embodiment, a nucleic acid-ligand complex can be made, wherein the ligand consists of a foreign viral peptide that disrupts endosomes and prevents the nucleic acid from undergoing lysosomal degradation. In yet other embodiments, nucleic acids can be targeted in vivo by targeting specific receptors for specific uptake and expression of cells (eg, PCT Publication Nos. WO92 / 06180, WO92 / 22635, WO92 / 20316, and WO93 / 14188). Alternatively, nucleic acids can be introduced into cells and incorporated into host cell DNA for expression by homologous recombination (Kooler and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 1989, 86: 8932-8935; Zijlstra, et al., Nature, 1989, 342: 435-438). These methods are in addition to those discussed above with "Viral and Non-virtual Vectors."
[0141]
Alternatively, for example, a nucleic acid sequence encoding a single-chain antibody in a target cell population can be prepared as described, for example, in Marasco et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993, 90: 7889-7893, and can be administered by expression using methods such as those disclosed in US Pat.
The form and amount of therapeutic nucleic acid envisaged for use will depend on the type of disease and the severity of the desired effect, the condition of the patient, etc., and can be determined by one skilled in the art.
[0142]
Example
The present invention will be better understood by reference to the following examples, which are provided by way of example and not limitation.
material: Anti-Cyr61 polyclonal antiserum was ligated to the Louisiana State University Medical Center Core Facilities (Baton Rouge, LA) with amino acids 371-381 (RLFDNHIK) for human Cyr61 (FIG. 7; SEQ. Produced. Cysteine was added to the N-terminus for coupling to the carrier protein. Peptides were synthesized using a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) chemistry (PE biosystems 9050+) using an automated phase peptide synthesizer. The peptide was purified using a Waters Delta Prep400 pre-chromatography system with a C18 Phenomenex Jupiter column (250 × 21.20 mm, 10 μ diameter) equipped with a photoiodide array detector. A flow rate through the column of over 100 mL / min will purify about 400-500 mg of peptide. The identification and purification of the antigenic peptide was evaluated using a PE Biosystem DE-MALDI mass spectrometer. The peptide was then coupled to keyhole limpet hemocyanin and then mixed with equal volumes of complete and incomplete friend adjuvant.
[0143]
The mixture was then injected into female New Zealand white rabbits (200 μg antigen and adjuvant mixture / rabbit). On days 14 and 28, booster injections of the same size as the first injection were given. On day 38, blood from rabbits was tested for the presence of antibodies using ELIZA (using the streptavidin / biotin system). If strong antibody titers were required, rabbits received a booster injection of the same sample size as the initial injection on day 42. Serum was collected from rabbits on day 52 and then frozen. Polyclonal antibodies were affinity purified by binding the antigen to the binding phase (Sulfo-Link Resin, Pierce) using the side chain of cysteine. About 30 mL of serum was loaded on the column and then washed to remove unbound protein. The antibody was treated with 3.5M MgCl2/ Ethyl glycol. The eluted protein was dialyzed and then concentrated to about 1 mg / mL. The concentration was determined at an OD of 280 mm.
[0144]
17β-estradiol (E2) Was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri) and the progesterone receptor agonist, R5020, was NEN Life Science Product, Inc. (Boston, Massachusetts) and bFGF was obtained from R & D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota) and the ER antagonist ICI182,780 was abundantly provided by Zeneca Pharmaceuticals (Wilmington, Del.).
[0145]
Acquisition of research subjects and organizationsUterine leiomyomas and synchronized leiomyoma specimens were routinely removed from the uterus at Depatmento of Obstetrics and Gynecology, Pennsylvania Hospital according to the protocol approved by the Institutional Review Boards. Tissue samples were provided (n = 38) from patients aged 38 to 53 years (mean age = 45) who did not receive hormone replacement therapy or prescribed gonadotropin releasing hormone agonists. All but one patient had experienced a normal menstrual cycle before surgery. Tissue specimens were quickly frozen in liquid nitrogen after hysterectomy for isolation of total RNA, or fixed in 10% neutral buffered formalin for in situ hybridization. Tissues for ex vivo culture were prepared in phenol red-free DNEM / Ham's F12 medium (Gibco BRL, Rockville, Maryland) containing 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, and 250 ng / ml amphotericin B as fungizone. And then transferred to ice.
[0146]
Identification of regulatory genes using rapid differential expression analysis (RADE)
RADE was performed as previously reported (Liang P, Pardee AB. 1997. Methods In Molecular Biology. Humana Press, page 150). Briefly, total RNA (n = 4) isolated from synchronized leiomyomas and myometrial tissue was used for RADE analysis, and each RNA sample was analyzed in pairs. p (dT) ending cDNA synthesis with either A, G, or C18This was done by using oligonucleotides. After cDNA synthesis, the gene is replaced with a random oligomer, appropriate p (dT)18Downstream primer, and35Amplification was performed using a combination of S-labeled dATP. The resulting products were amplified two-fold, separated on SDS polyacrylamide sequencing gels and then detected by autoradiography. After repeated treatment, candidate cDNA fragments were extracted from polyacrylamide gel slices and then amplified by PCR using appropriate primer pairs. Amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis, subcloned into pBR322, sequenced using an ABI 377/373 sequencer, and then analyzed using BLASTN software (Altchul et al. Nucleic Acids Research, 1997, 25: 3389). -3402).
RADE analysis of total RNA demonstrated reduced expression of a 410 nucleotide cDNA fragment in four of the four leiomyoma specimens compared to synchronized myometrial controls. Sequence analysis using BLASTN software demonstrated that the cDNA fragment was 96% homologous to the C-terminal portion of human Cyr61.
[0147]
Northern blotting of Cyr61 and ERαTotal cytoplasmic RNA was isolated from myometrium and smooth muscle tissue homogenate by phenol / chloroform extraction after guanidinium isothiocyanate degradation. Next, total intracellular RNA (20 μg) was subjected to electrophoresis in a 1% agarose gel containing 1 M formaldehyde. Separated RNA transcripts were transferred onto nylon membranes by capillary electrophoresis and then prehybridized at 60 ° C. in RapidHyb hybridization solution (Amersham, Arlington Heights, Illinois). 0.41 kg of the human Cyr61 cDNA fragment [α-32Using [P] -dCTP (3,000 Ci / mmol), radiolabeling was performed using the random primer method (Rediprime II, Amersham), and the resultant was used as a hybridization probe. Radiolabeled probe (1 × 106cpm / ml) was hybridized to the membrane at 60 ° C. for 4 hours. The membrane was washed twice with 1 × SSPE (0.15 M NaCl, 1 μM EDTA, and 0.01 M sodium phosphate, pH 7.4) and 0.1% SDS for 15 minutes at 25 ° C. A final wash for 5 minutes at 60 ° C. in 0.1 × SSPE and 0.1% SDS. For the expression of estrogen receptor α (ERα), the membrane was [α-32It was reprobed with a 1.96 kb human ERα cDNA (1.96 kb full length coding region) radiolabeled with [P] -dCTP (3,000 Ci / mmol), hybridized, and then washed as described above. The relative level of Cyr6132Oligonucleotides radioactively labeled with P were reprobed into membranes according to the manufacturer's protocol (Terminal Labeling Kit, GibcoBRL, Rockville, Maryland) and then normalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). .
[0148]
Northern analysis was performed using total RNA isolated from 10 patients. Cyr61 transcripts were markedly reduced in leiomyoma specimens in 10 of the 10 patients tested (FIG. 1B) as compared to autologous myometrium. The decrease in Cyr61 mRNA normalized to GAPDH mRNA levels was more than 9-fold compared to the higher basal levels present in autologous myometrium (FIG. 1D).
[0149]
Protein extraction and immunoblotting for Cyr61Tissue protein extract was prepared using 50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1.0% Nonidet P-40, 1.0% Triton-X100, 2% SDS, 0.5% deoxycholate, Prepared from leiomyoma and synchronized myometrial tissue specimens by homogenization in a protease inhibitor cocktail containing 1 mM EDTA and 10 μg / ml pepstatin, aprotinin, and leupeptin (Sigma, St. Louis, Missouri). The protein extract (20 μg) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions in 10% bis-acrylamide, and then electrophoresed on a polyvinyl difluoride membrane (Immobilon-P, Biorad, Redding, California). Transferred by The membrane was blocked with 5% dry milk on TBS / 0.1% Tween 20 (TBST) and then incubated with anti-Cyr61pAb (10 μg / ml). Bound primary antibody was detected using an anti-rabbit IgG antibody conjugated to donkey horseradish peroxidase (HRP) and a highly functional chemiluminescence detection system (Amersham). To normalize protein levels, Cyr61 western blots were then reprobed with a pan-actin monoclonal antibody (Sigma) and then detected with a donkey anti-mouse secondary antibody conjugated to HRP.
Immunoblot analysis of whole cell lysates arising from leiomyomas and synchronized myometrial controls showed a 10-fold or greater decrease in Cyr61 protein in 10 of the 10 patients tested (FIGS. 2A and C). ).
[0150]
In situ hybridizationFor riboprobe synthesis, a 0.28 kb human Cyr61 cDNA fragment was position cloned into the EcoRI and HindIII sites of the pGEM4Af plasmid (Promega Corp, Madison, Wis.) To create pGEM4Zf / Cyr61. Radiolabeled35S-UTP sense and antisense cRNA transcripts were transcribed in vitro using T3 and T7 RNA polymerases, respectively, using the Gemini Riboprobe system (Promega). In situ hybridization was performed using leiomyoma and synchronized uterine fibroid specimens fixed in formalin as described above. Briefly, the processed slides were treated overnight with 100-150 μl of antisense or sense (control) riboprobes in a 50% formamide hybridization mixture containing 5% dextran sulfate and 200 mM dithiothreitol (DTT). Medium 4.7 × 106Hybridized on DPM / slide at 55 ° C. in a humidified chamber containing 50% formamide / 600 mM NaCl. The slides were washed three times in 2 × SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0) / 10 mM DTT at room temperature, and then treated with RNase A (20 μg / ml) for 30 minutes for 37 minutes. C. and then washed for 15 minutes in 0.1 × SSC at room temperature. Slides were further washed with 0.1 × SS at 65 ° C. and then dehydrated in a gradient series of alcohol: ammonium acetate (70%, 95%, and 100%). The air-dried slides were exposed to X-ray film (Amersham) for 3 days for preliminary testing, and then immersed in NTB dinuclear emulsion (Eastman Kodak, Rochester, New York) diluted 1: 1 with 600 mM ammonium acetate. did. The slides were then placed in a dark dry box, opaque for 31 days, sensitized, stained with cresyl violet, and covered with a coverslip.
[0151]
Higher levels of Cyr61 expression were observed in the spleen compared to the uterus (FIG. 3A). In addition, analysis of other human muscle tissues, in addition to myometrium, showed high basal expression in skeletal muscle, heart and bladder, but relatively low levels in colon, small intestine, stomach and prostate. Detected (FIG. 3B). Therefore, the highly constitutive expression of Cyr61 is thought to be a characteristic aspect of organs such as the heart, bladder and uterus, which are mainly composed of smooth muscle and skeletal muscle cells. Further in situ hybridization experiments were performed to determine the exact cell type in which Cyr61 is expressed in the uterus. In six of the six patients, high levels of Cyr61 mRNA were detected in myometrial cells (FIGS. 4A and C). However, Cyr61 transcripts were dramatically reduced in leiomyoma cells from the same six patients (FIGS. 4B and D). Signal from control slides hybridized with the sense probe showed no apparent signal (FIGS. 4E and F). High basal levels of Cyr61 transcripts were also found in stroma, but not in uterine vascular endothelial or glandular epithelial cells (data not shown). High basal expression of Cyr61 was mainly confirmed on uterine smooth muscle cells in healthy myometrium, but not in leiomyomas.
[0152]
Tissue treatment with sex steroids and growth factorsThe tissue specimen obtained as above is immediately subdivided into 1-2 mm pieces using a sterile scalpel and tweezers and then placed in phenol red-free DMEM / Ham's F12 containing only antifungal and constituent agents. Was. Specimens were ex vivo, 10 nM E2R5020 at 10 nM, E at 10 nM2And 10 nM R5020, 1 μM ICI 182,780 (ICI), 10 nM E2And 1 μM ICI 10 ng / ml bFGF in combination with either 10% charcoal-free serum (CSS) or ethanol vehicle for 1 hour at 37 ° C., 95% air / 5% CO 2.2Ex vivo treatment below. Treated tissue specimens were collected and then snap frozen in liquid nitrogen prior to RNA isolation and Northern blotting.
[0153]
Freshly obtained leiomyomas and synchronized smooth muscle layer explants (n = 8) were ex vivo at 10 nM E2, 10 nM R5020, or 10 nM E2And 10 nM R5020 combination. As a positive control, Explant was stimulated with 10 ng / ml bGFG, which induces Cyr61 in cell types such as murine and human fibroblasts (Nathans et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1988, 53). : 893-900). E2Treatment increased the level of Cyr61 transcript more than 2-fold within 1 hour in myometrial tissue, but the synthetic progesterone receptor agonist, R5020, had no effect on Cyr61 expression,2(See FIGS. 5A and 5G). E of Cyr612The mediated induction was ER-dependent, as it was inhibited by a completely pure ER antagonist, ICI182,780 (FIG. 5A). In addition, expression of Cyr61 was increased 3-fold when myometrial explants were treated with bFGF (FIGS. 5A and G) or serum (data not shown) for 1 hour. But E2Neither nor bFGF was able to upregulate Cyr61 in leiomyoma tissue as seen in myometrial controls (FIGS. 5D and G). The latter phenomenon was not due to a consistently 2-fold higher lack of ERa expression in leiomyoma explants when compared to the autologous myometrium. Thus, in addition to bFGF and serum, Cyr61 is rapidly induced by 17β-estradiol in human myometrial tissue but not in leiomyomas.
[0154]
Protocol for synthesis and purification of recombinant human Cyr61ヒ ト The SmaI-HindIII fragment (nucleotide 100-1649) of human Cyr61 cDNA containing the entire open reading frame was cloned into the pBlueBac4 baculovirus expression vector (Invitrogen). Recombinant baculovirus clones were obtained, plaque purified, and then amplified by culture of infections of SF9 insect cells as previously described (Summers and Smith, Tex. Agric. Exp. Stn. Bull .: 1555: 1). -55 (1997)). Sf cells were plated in 2-3 x 10 cells in sf900-II medium without serum.6Cells were seeded as a monolayer culture at P150 and then infected with 5 plaque forming units (PFU) of recombinant virus per cell. The conditioned medium (containing the recombinant human Cyr61 protein) is harvested 48 and 96 hours post-infection, purified by centrifugation (5 min at 15,000 xg), and then 50 mM morpholineethanesulfonic acid (MES), pH = 6.0, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) and 1 mM EDTA, pH = 8. The medium was mixed with Sepharose S beads equilibrated with loading buffer (50 mM MES, pH 6.0, 1 mM PMSF, 150 mM NaCl) in 5 ml Sepharose S / 500 ml conditioned medium, and then the protein was added to Sepharose S. The batch was combined overnight at 4 ° C. with gentle agitation. Sepharose S beads were collected by sedimentation without agitation for 20 minutes and then loaded onto the column. The column was washed with a 6-fold loading buffer adjusted to 0.3 M NaCl, then the bound protein was eluted from the column with a serial dilution of NaCl (0.4-0.8 M) in the loading buffer.
[0155]
Statistical analysisThe values obtained from the density measurements of the RNA bands detected in the Northern blots were analyzed using SAS Statistical Software (SAS Inc., Cary, North Carolina), using a one-way analysis of variance (ANOVA) for significance. It was used for placement experiments and analyzed. The one-way ANOVA for variance had a significant level of multiple comparisons of 0.05. If significance was achieved by one-way analysis, mean post-ANOVA comparisons were performed using the Scheffe'F test (Norman and Strainer Biostatistics The Valley Essentials. St. Louis, Missouri, 94, Mob. Was.
[0156]
The patents, applications, test methods, and published references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Many modifications of the present invention will be suggested to those skilled in the art in light of the above detailed description. All such obvious variations are within the full intended scope of the appended claims.
[Brief description of the drawings]
1 (A) to 1 (D) show identification of Cyr61 by the RADE method and confirmation by Northern analysis. (A) Made from total RNA extracted from doubled leiomyomas (L) and synchronized myometrium (M) tissue (n = 4)35Typical autoradiograph of S-radiolabeled cDNA. (B) Typical Northern blot of total RNA isolated from leiomyoma (L) and synchronized myometrium (M) tissue. Arrows indicate the higher 2.4 kb Cyr61 transcript and the lower 3.5 kb Cyr61 transcript. (C) The membrane was reprobed with 2.0 kb radiolabeled mouse glutaraldehyde dehydrogenase (GAPDH) to demonstrate equal sample loading. (D) Density analysis of Cyr61 mRNA levels using Molecular @ Dynamics @ phosphorimager and image quantification software.*Significant reduction in level compared to myometrial control.
FIG. 2 (A)-(C) shows an analysis of Cyr61 protein expression in leiomyomas. (A) Typical western blot of tissue protein extracts made from leiomyomas and synchronized myometrial tissue. (B) The protein blot was then reprobed with an anti-actin monospecific antibody to confirm equal protein loading. (C) Cyr61 protein levels quantified by density analysis using a Biorad \ molecular \ imager. Values represent the mean ± SD for 10 patients.*Significant reduction in level compared to myometrial control.
FIGS. 3 (A)-(B) show the differential expression of Cyr61 in various human tissues (A) and human muscle tissues (B). Arrows indicate molecular weight markers in kb.
FIGS. 4 (A)-(F) show suppression of Cyr61 expression in uterine smooth muscle cells as determined by in situ hybridization. Typical black fields (A, B, E and F) and bright fields (C and D) are micrographs of myometrium (A, C and E) and leiomyoma (B, D and F) tissue sections . Arrows indicate typical uterine smooth muscle cells expressing Cyr61 transcript (C). The sense radiolabeled cRNA probe showed no signal above background (E and F). Magnification = 200 × (A, B, E and F) and 630 × (C and D), bar = 15 μm (A, B, E and F) and 5 μm (C and D).
FIG. 5 (A)-(G) shows the lack of regulation of Cyr61 in ex vivo, leiomyoma by 17β-estradiol and basic fibroblast growth factor (bFGF). Figures (A)-(C) represent the new myometrium, and Figures (D)-(F) show the ethanol vehicle, 10 nM 17β-estradiol (E).2), 10 nM R5020, 10 ng / ml bFGF, 10 nM E2And 10 nM M5020, 1 μM ICI182,780, or 10 nM E21 shows leiomyoma tissue specimens cultured ex vivo in the presence of any of the combinations of ICI182 and 780 at 1 μM. The membrane was reprobed with GAPDH cDNA to account for sample loading C and F equivalents. Arrows indicate the higher 2.4 kb Cyr61 and 6.2 kb ERα transcripts. (G) shows the calculated data. Values represent ± SD for 8 patients.*Significant increase in Cyr61 mRNA levels compared to untreated myometrial tissue.
FIG. 6 shows the nucleic acid sequence of Cyr61 (SEQ ID NO: 1).
FIG. 7 shows the amino acid sequence of Cyr61 encoded by the nucleic acid sequence of FIG. 6 (SEQ ID NO: 2; GenBank accession number AAB58319).