JP2004229547A - Method for screening acylated homoserine lactone inhibitor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a substance to inhibit the biological activity of an acylated homoserine lactone. <P>SOLUTION: The method for screening an acylated homoserine lactone inhibitor comprises culturing animal cells with a test specimen in the presence of an acylated homoserine lactone represented by formula I [R is a 4-30C straight-chain or branched acyl group which may be substituted] and detecting the inhibition of Akt activity in the cells or the inhibition of survival signal communication channel in which Akt participates. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害又はＡｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法。
（２）アポトーシスを検出することによって、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出する（１）に記載の方法。
（３）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質。
（４）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法により同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤。
（５）（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化４】

〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表されるアシル化ホモセリンラクトン、
ｂ）動物細胞、及び
ｃ）Ａｋｔ活性測定手段
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトンとは、式Ｉ：
【化５】

で表される化合物を意味する。
【００１３】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数４〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基、メチル基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、及び３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。また、直鎖状であることが好ましい。
【００１４】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、ブチリル基、３−オキソブチリル基、３−ヒドロキシブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、デカノイル基、３−オキソデカノイル基、ウンデカノイル基、３−オキソウンデカノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、トリデカノイル基、３−オキソトリデカノイル基、テトラデカノイル基、３−オキソテトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、３−オキソペンタデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ヘプタデカノイル基、３−オキソヘプタデカノイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ノナデカノイル基、３−オキソノナデカノイル基、イコサノイル基、３−オキソイコサノイル基、トリアコンタノイル基、３−オキソトリアコンタノイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基及びピルボイル基等が挙げられる。
【００１５】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトンの具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−バレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソバレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ピバロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソペンタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソパルミトイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソステアロイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イコサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイコサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリアコンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリアコンタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソミリストイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ピルボイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。
【００１６】
特に、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００１７】
本発明のアシル化ホモセリンラクトンは、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトンは、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ， Ｓ． Ｒ．， Ｐ． Ｓｔｅａｄ， Ｎ． Ｊ． Ｂａｉｎｔｏｎ， Ｇ． Ｐ． Ｃ． Ｓａｌｍｏｎｄ， Ｇ． Ｓ． Ａ． Ｂ． Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｐ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｂ． Ｗ． Ｂｙｃｒｏｆｔ， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ４６， ４４１−４５４， １９９３、Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｐ．Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ． Ｋｅｒｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｅ． Ｔａｔｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２， ４４６−４４８， １９９３、ＳｃｈａｅｆｅｒＡ．Ｌ．， Ｂ． Ｌ． Ｈａｎｚｅｌｋａ， Ａ． Ｅｂｅｒｈａｒｄ， ａｎｄ Ｅ． Ｐ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ２８９７−２９０１， １９９６、Ｇａｏ， Ｊ． Ｇ． ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｍｅｉｇｈｅｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， ３８５６−３８６２， １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１８】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトンは微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００１９】
本発明は、アシル化ホモセリンラクトンが動物細胞におけるＡｋｔ活性を阻害するという知見に基づくものである。
【００２０】
従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＡｋｔ活性の阻害を検出することによりアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＡｋｔ活性阻害効果が見られなくなれるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２１】
Ａｋｔ活性の検出は、当技術分野で通常用いられる方法を用いて実施することができ、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体（例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０７， ２０２−２０７， （２０００）、Ｈｏｌｌａｎｄ ＥＣ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５， ５５−５７， （２０００）を参照されたい）、すなわち抗−活性化Ａｋｔ抗体を用いるウェスタンブロットにより検出することができる。この抗体は、抗原であるリン酸化Ａｋｔに対する反応性及び特異性が高いことから、これを用いることにより非常に効果的にリン酸化Ａｋｔを検出することができる。
【００２２】
Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼ）の下流で活性化され、生存シグナル伝達経路において重要な役割を担っている。細胞の生死は、アポトーシスシグナル伝達と生存シグナル伝達との拮抗によって制御されている。Ａｋｔはリン酸化されることにより活性型となり、活性型Ａｋｔが細胞におけるアポトーシスを阻害することが報告されている（特表２００２−５２８３９０参照）。
【００２３】
活性型Ａｋｔは、様々な基質を介して細胞の生存を促進することが知られている（実験医学 Ｖｏｌ １９、Ｎｏ．１３（増刊）、ｐ．１１６、２００１年、羊土社）。また、Ａｋｔによる生存促進メカニズムには、１）アポトーシス誘導にかかわる分子を直接リン酸化してアポトーシス誘導能を抑制する経路と、２）転写因子を直接又は間接のターゲットとして、アポトーシス促進分子又は抑制分子の転写を調節することにより生存促進に働く経路とがあることが明らかとなってきている。Ａｋｔは様々な基質を介してアポトーシスを阻害しているため、Ａｋｔ活性の阻害は、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路を担うその他の分子にも影響を及ぼし、最終的に細胞のアポトーシスをもたらすこととなる。
【００２４】
従って、本発明の別の実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害を検出することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害は、この経路に関与する分子、その活性及び構造、又はその他の分子との結合等を検出することによって行いうる。Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路に関与する分子は、Ａｋｔ活性の阻害によって何らかの影響を受ける分子であれば特に制限されないが、例えば、ｃａｓｐａｓｅ、Ｂａｄ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＧＳＫ−３等が挙げられる。
【００２５】
ｃａｓｐａｓｅとは、アポトーシスの誘導、決定、実行に決定的な働きをする一群のシステインプロテアーゼファミリーである。ｃａｓｐａｓｅの不活性型前駆体が限定分解により活性化されることで、細胞内においてプロテアーゼのカスケードが形成され、アポトーシスのシグナル伝達が行われる。すなわち、ｃａｓｐａｓｅの活性化はアポトーシスをもたらす。従って、ｃａｓｐａｓｅの活性化は、Ａｋｔによる生存シグナル伝達経路の阻害を意味する。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのｃａｓｐａｓｅ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２６】
ｃａｓｐａｓｅのうちｃａｓｐａｓｅ−３は最も高い酵素活性をもち、ＤＮＡ断片化因子のほか、細胞を構築する様々なタンパク質を基質としてアポトーシスを実行する。ｃａｓｐａｓｅ−９は、アポトーシス誘導刺激により障害を受けたミトコンドリアからチトクロームｃが放出されＡｐａｆ−１・チトクロームｃ・ｐｒｏ ｃａｓｐａｓｅ−９の多量体化が促されることにより活性化される。ｃａｓｐａｓｅ−９がＡｋｔによって直接リン酸化され、その活性化が阻害されることも報告されている。ｃａｓｐａｓｅ活性は、当技術分野で通常用いられる方法によって測定でき、例えば、ウェスタンブロットにより測定することができる。
【００２７】
また、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーのうちＪＮＫ及びｐ３８は、アポトーシスを誘導する様々な物理化学的ストレスによって活性化されることが明らかとなっており、ＭＡＰキナーゼがアポトーシスに関与することが示唆されている。ＭＡＰキナーゼとは、細胞が細胞増殖因子などの外界刺激を受けたとき、トレオニン残基とチロシン残基の両アミノ酸残基のリン酸化によって活性化されるセリン−トレオニンキナーゼの一群であり、酵母から高等動物まで真核生物に普遍的に存在する。本酵素は、単量体の触媒サブユニットからなるタンパク質キナーゼ分子である。そのアミノ酸配列は進化的に高度に保存されており、細胞増殖及び分子を制御する細胞内シグナル伝達の中枢の一翼を担っている。本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトンによってＭＡＰキナーゼの活性化、すなわちリン酸化が促進されることを見出した。従って、本発明の一実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養し、該細胞におけるＭＡＰキナーゼの活性を測定することにより、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることもできる。本発明においては、ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーのうち、ＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫの活性を検出するのが好ましい。ＭＡＰキナーゼの活性は、例えば、Ａｋｔと同様に活性化ＭＡＰキナーゼ（リン酸化ＭＡＰキナーゼ）をウェスタンブロット等で測定することによって検出できる。すなわち、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を培養した場合に、被検物質なしで培養したときに見られたアシル化ホモセリンラクトンのＭＡＰキナーゼ活性化効果が見られなくなるかあるいは減少すれば、当該被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００２８】
Ａｋｔ活性の阻害は、最終的にアポトーシスをもたらすことから、本発明において「Ａｋｔが関与する生存シグナル伝達経路の阻害の検出」には、アポトーシスの検出も包含される。
【００２９】
本発明において、アポトーシスとは当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスの形態は、細胞核の染色体凝集、ＤＮＡの断片化、細胞表層微絨毛の消失、クロマチンの凝縮を特徴とする。細胞は萎縮し、細胞の内容物が細胞外に放出されずにマクロファージなどの周囲の細胞にすみやかに取り込まれるので、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えない。一方、環境の悪化から引き起こされるネクローシス（壊死）は、細胞の内容物が放出される点でアポトーシスとは大きく異なる。
【００３０】
本発明において動物細胞におけるアポトーシスを検出する方法としては、当技術分野で通常用いられるものを使用することができ、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ結合性蛍光色素アミノベンズイミド（ヘキスト３３３４２、３３５８２及び３３３２５８など）などによる染色後に蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察する方法、断片化したＤＮＡを遠心などにより抽出分離してアガロースゲル電気泳動及び比色法などによって定量する方法、断片化したＤＮＡを組織化学的に検出するＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ）法、並びにＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色により細胞生存率を測定する方法などが挙げられる。
【００３１】
本発明において、アシル化ホモセリンラクトン阻害物質とは、アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞、特に動物細胞及び微生物に対する作用を阻害する物質、該作用に対する拮抗物質、アシル化ホモセリンラクトンの分泌を阻害する物質及びアシル化ホモセリンラクトンを分解する物質のいずれをも意味する。アシル化ホモセリンラクトンの各種細胞に対する作用としては、特に限定されないが、例えば、Ａｋｔ活性を阻害する作用、アポトーシスを誘導する作用、細胞による病原因子の発現を誘導する作用及び微生物によるバイオフィルムの生成を誘導する作用などが含まれる。
【００３２】
本発明はまた、動物細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする。細菌などの微生物を用いてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、細菌自体がアシル化ホモセリンラクトンを産生するためバイアスがかかるが、動物細胞はアシル化ホモセリンラクトンを産生しないため、信頼性の高いスクリーニングを実施できる。本発明において用いることができる動物細胞は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物、鳥類由来の細胞を使用することができ、哺乳動物、特にヒト由来の細胞を使用するのが好ましい。また、上皮組織、特に腸管粘膜上皮組織由来の細胞（例えば、ＣａＣｏ−２：ヒト大腸癌カルチノーマ細胞）、内皮細胞、特に血管内皮細胞（例えば、ＰＥＣ：ブタ胸部大動脈由来内皮細胞）及び線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３：マウス胎児由来線維芽細胞）を使用するのが好ましい。また、パイエル板をはじめとする腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を覆う腸管粘膜上皮層には、特殊に分化したＭ細胞と呼ばれる粘膜上皮細胞が点在し、食餌性抗原や腸内細菌などを積極的に取り込んで免疫組織に提供することにより、腸管局所及び全身の免疫応答調節に重要な役割を果たしている。従って、腸上皮は微生物産生物質との接触が想定される場であり、腸管粘膜上皮組織由来細胞を用いてアシル化ホモセリンラクトンの直接的作用を検討することは、実際の動物生体内で起こりうる現象として捉えることができる。また、動物細胞のなかでも癌細胞を用いるのが好ましい。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下、動物細胞を被検物質とともに培養することにより、アシル化ホモセリンラクトンによる刺激を行う。刺激のための培養時間は、アシル化ホモセリンラクトンの濃度、使用する検出方法及び動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜７２時間程度である。
【００３４】
Ａｋｔ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態では、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、Ａｋｔ活性は、培養開始から数時間減少するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例１（３）参照）。従って、本発明のスクリーニング方法においては、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型Ａｋｔが減少を示す培養時間を測定し、続いて、該時間の範囲内で、被検物質の存在下アシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜２時間時間程度である。
【００３５】
ｃａｓｐａｓｅ活性を測定することによってスクリーニングを行う実施形態においても、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で動物細胞を培養すると、ｃａｓｐａｓｅ活性は培養開始から数時間増加するが、その後基底レベルまで戻ることが示されている（実施例５参照）。従って、この場合も同様に、予め対照として被検物質の不在下でアシル化ホモセリンラクトンとともに動物細胞を培養し、活性型ｃａｓｐａｓｅが減少を示す培養時間を測定することが好ましい。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、１〜８時間程度である。
【００３６】
アシル化ホモセリンラクトンによるＭＡＰキナーゼの活性化においても同様に、アシル化ホモセリンラクトンの存在下で培養を行うと、ＭＡＰキナーゼは一度活性化された後で時間の経過とともに基底レベルに戻る。この場合の培養時間もアシル化ホモセリンラクトンの濃度及び使用する動物細胞の種類に依存するが、通常、２分〜６時間程度である。
【００３７】
アポトーシスを検出することによってスクリーニングを行う場合の培養時間は、通常、６〜７２時間程度である。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法において、共存させるアシル化ホモセリンラクトンの濃度は、通常、１〜５００μＭ、好ましくは２０〜２００μＭ、より好ましくは３０〜１００μＭである。
【００３９】
より具体的には、ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、Ａｋｔ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２分〜２時間、好ましくは２〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。そして、この培養時間の範囲内で本来見られるはずのＡｋｔ活性阻害がみられなかったときあるいはその活性阻害が減少したときは、その被検物質はアシル化ホモセリンラクトン阻害物質であると同定できる。
【００４０】
ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ＥＲＫ活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を２〜３０分、好ましくは５〜１５分程度培養するのが好ましいと考えられる。ヒト由来腸管粘膜上皮細胞を用い、ｐ３８活性を指標にしてアシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする場合は、１０μＭ以上、好ましくは３０〜２００μＭのアシル化ホモセリンラクトンの存在下、被検物質とともに動物細胞を５分〜６時間、好ましくは５〜６０分程度培養するのが好ましいと考えられる。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法においては、動物細胞の培養において通常用いられる培地を使用することができ、特に制限されない。例えば、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地等があげられる。その他の培養条件も、動物細胞の培養において通常用いられる条件を使用することができる。
【００４２】
本発明では、上記時間にわたって動物細胞を培養した後、例えば培養細胞を急冷することによって反応を停止する。その後、上記のような方法により動物細胞におけるＡｋｔ活性、ｃａｓｐａｓｅ活性及びアポトーシス等を検出する。反応をすぐに停止するために、溶媒を除去してもよい。
【００４３】
本発明によってスクリーニングされる被検物質が含まれうる試料としては、特に限定されないが、動物（カビ、放射菌等の微生物を含む）及び植物の抽出物、並びに人工合成物が挙げられる。
【００４４】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法によって同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質に関する。このような物質としては、特に限定されず、天然物及び合成物の双方が含まれる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、単独で、又は従来の抗菌剤とともに抗菌剤として使用することができる。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質は、バイオフィルムの生成を阻害できることから、薬剤耐性を獲得した細菌に対しても、抗菌作用を増強できる点において有利である。本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害物質とともに用いることができる公知の抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ペニシリン（ペナム）系抗生物質、セファロスポリン（セフェム）系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質、サルファ剤、パラアミノサリチル酸製剤、イソニコチン酸ヒドラジド製剤及びキノロン系合成抗菌剤などを挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、バイオフィルム阻害剤、並びにフィルター及びパイプにおける目詰まり防止剤として使用できる。また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン阻害剤は、微生物における病原因子の発現を阻害することから、感染症治療剤として使用することもできる。
【００４６】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。該キットは、例えば、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン、動物細胞及び該動物細胞におけるＡｋｔ活性測定手段を含む。Ａｋｔ活性測定手段とは、例えば、抗−リン酸化Ａｋｔ抗体と該抗体に対する標識２次抗体などである。標識２次抗体としては、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体などを使用できる。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例において実験材料は、特に他に記載がない限り、以下に記載のものを使用した。
【００４８】
細胞培養に用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）はＳＩＧＭＡ社から購入した。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の溶媒として用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬工業株式会社のものを使用した。キナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入した。タンパク質の定量には、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。抗体については以下の会社のものを使用した。抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ 抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３） 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３ 抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｄ３３０）抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ（Ｄ２１４）抗体、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社。ｃ−Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体、ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体はＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社。抗−α−チューブリン抗体（Ａｂ−１）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社。
【００４９】
実施例１ Ａｋｔ 活性のウェスタンブロットによる解析
（１）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化
ヒト大腸癌カルチノーマ細胞株ＣａＣｏ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、１０％ ＦＣＳ、１％ ＮＥＡＡ、１％ Ｐ／Ｓ（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で培養した。
【００５０】
６ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１ ディッシュ当たりＣａＣｏ−２細胞を６×１０^５個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。なお、精製されたアシル化ホモセリンラクトンは、目的とする終濃度の４００倍になるようＤＭＳＯに溶解し、フィルター滅菌（φ０．２２μｍ）を行ったものを使用した。対照として終濃度０．２５ ％のＤＭＳＯを使用した。また、内部標準としてα−チューブリンを用いた。
【００５１】
反応後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。氷上で細胞を融解し、溶解バッファー（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％ グリセリン、１０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１００ ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）を２００μｌ加え、スクレーパーで細胞を剥ぎ取った。これを氷上で２０分間静置し、その後１４０００ ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質の濃度を測定し、５０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。リン酸化ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔを測定する場合は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む５％ スキムミルク／Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水でブロッキングを行い、１次抗体にそれぞれ、抗−リン酸化−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ抗体、抗−リン酸化−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体、抗−リン酸化−Ａｋｔ （Ｓｅｒ４３７） 抗体を、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いた。内部標準として使用したα−チューブリンは、ブロッキングを５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ−Ｔで行い、１次抗体は抗−α−チューブリン（Ａｂ−１）、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた。バンドの検出にはＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ^ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ２５５８６１ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ社）又は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使用した。結果を図１に示す。なお以下で言及する図中において、３−ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬとは、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを意味する。
【００５２】
ＭＡＰキナーゼ活性に関しては、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加した場合のみ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化が促進された。一方、ＣａＣｏ−２細胞においてＡｋｔは通常リン酸化（活性化）された状態にあるが、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによりＡｋｔのリン酸化レベルが著しく低下した。
【００５３】
以上から、アシル化ホモセリンラクトンがＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの活性化を促進し、一方、Ａｋｔの活性化を阻害することが明らかとなった。
【００５４】
（２）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化
細胞培養後、終濃度０μＭ（０．２５％ ＤＭＳＯ）、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソ−ドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加して、１０分間反応させること以外は、（１）と同様にして、ＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性をウェスタンブロットにより解析した（図２）。
【００５５】
図２のバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果をそれぞれ図３、図４に示す。１０μＭ以上の濃度でＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化レベルが有意に増大した。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭでは、それぞれＥＲＫ活性が１．５、７．７、９．８倍に、ｐ３８活性が３．２、４．４、５．４倍になった。ＪＮＫ活性については濃度依存的な有意差が認められなかった。Ａｋｔの活性阻害についても同様に１０μＭから起こり、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭではそれぞれ無刺激時の７９％、３１％、１４％にまで活性が低下した。
【００５６】
以上から、ＣａＣｏ−２細胞では、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上で、Ａｋｔの活性が有意に阻害されることがわかる。また、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上でＥＲＫ、ｐ３８及びＪＮＫが活性化されることがわかる。
【００５７】
（３）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化
細胞培養後、終濃度３０μＭ及び１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、それぞれアシル化ホモセリンラクトンによる刺激時間を０、５、１０、３０、６０分の短いタイムコース（図５）、０、１０分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間の長いタイムコース（図６）で行った他は、（１）と同様にして、ウェスタンブロットによりＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性を測定した。３０μＭ刺激ではＥＲＫ、ｐ３８活性はともに１０分をピークに上昇したが、ＥＲＫ活性が３０分で基底レベルに戻ったのに対し、ｐ３８は４時間までその活性が持続した。３０μＭ刺激時のＡｋｔの活性阻害は５分をピークに６０分まで持続し、２時間で基底レベルに戻った。１００μＭ刺激ではＥＲＫ活性化が２段階で起こった。すなわち、１段階目は５分をピークにして２時間で基底レベルに戻り、２段階目は４時間から活性が上昇しはじめ、８時間をピークにして１０時間で基底レベルに戻るというものであった。この２段階目のＥＲＫ活性化はＤＮＡ損傷後のものと考えられる。一方、１００μＭ刺激時のｐ３８活性化は、５分をピークにしてその活性が８時間まで持続し、Ａｋｔ活性阻害は５分をピークにして６時間まで持続した。
【００５８】
実施例２ Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ 染色による生存率の評価
３．５ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０^５ 個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。各種薬剤 ［終濃度１〜１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、１２時間培養した。対照として０．２５％ ＤＭＳＯを使用した。その後、上清及びトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）でディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心後、上清を取り除き、２００μｌのＤＭＥＭにて希釈した。うち５０μｌをエッペンチューブにとり、等量のＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色液を加え、細胞数を血球計測盤にて測定した。このとき、測定対象とする死細胞数と生細胞数の合計を２００個以上とした。
【００５９】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的に生存率の有意な低下が認められた。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンにより、生存率がそれぞれ９０％、５５％、５１％にまで低下した（図７）。この３０μＭ以上の濃度において有意に生存率を低下させるという結果は、ウェスタンブロット解析においてＭＡＰキナーゼ活性増加及びＡｋｔ活性阻害が３０μＭ前後で顕著に見られたこととも一致する。また対照及び０．２５％ ＤＭＳＯ添加時の生存率はともに９４％であり、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激時の生存率が９４ ％であることからＤＭＳＯの生存率への影響は無視できるものと考えられる。
【００６０】
実施例３ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ 染色によるクロマチン凝縮の観察とアポトーシスの判定
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定すべく、クロマチン染色の蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて形態学的に評価した。
【００６１】
８ウェル培養スライド（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｅｌｌ ｗａｒｅ ｂｉｏｃｏａｔ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０^４個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。３−オキソ−ドデカノイルホモセリンラクトンを各濃度（１〜１００μＭ）にて添加し１２時間培養後、細胞を４％ パラホルムアルデヒド−３％ スクロース／ＰＢＳにて固定し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を用いてクロマチン染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。倍率４００倍にて５視野をランダムに選び、アポトーシス細胞と正常細胞を計数、アポトーシス細胞の割合を算出し、これをｎ＝１として３回以上試行した。
【００６２】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン１０μＭ以上の濃度で、クロマチン凝縮を起こしたアポトーシス細胞が観察された。しかし０．２５％ ＤＭＳＯ、１μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでは正常細胞のみが観察された（図８）。クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果を図９に示す。全細胞数に対するアポトーシス細胞の割合は、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでそれぞれ１５％、３９％、５０％であった。この値は生存低下率とも一致する。したがって、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによるＣａＣｏ−２の細胞死はアポトーシスによるものと判定された。
【００６３】
実施例４ ＤＮＡ 断片化によるアポトーシスの評価
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するための別法として、ＤＮＡの断片化を評価した。
【００６４】
ＣａＣｏ−２細胞を５×１０^６個／１５ ｃｍ ディッシュ（ＮＵＮＣ社）にまき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％ ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを１μＭ〜１００μＭの各濃度で添加後１２時間培養した。その後、上清及びＴＥでディッシュから剥がした細胞を、室温、８００ ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を３００ μｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度４℃、２５００ ｒｐｍで５分間遠心して上清を取り除いた。細胞を細胞溶解バッファー ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］ ３００μｌを加えて細胞溶解させ、氷上に１０分置いてＤＮＡ断片を抽出した。これを４℃、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清にＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１時間温置した。さらにプロテイナーゼＫを加え、５０℃で３０分間温置した。ＤＮＡ断片抽出液をエタノール沈澱によって濃縮し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲルをエチジウムブロミドで染色後、ＵＶトランスイルミネーター下でＤＮＡ断片化を検出した。
【００６５】
それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン存在下で１２時間培養したＣａＣｏ−２細胞において、ＤＮＡラダーを検出したところ、３０μＭ以上の濃度にてラダーが確認された（図１０）。
【００６６】
この結果からも、ＣａＣｏ−２細胞においては、アシル化ホモセリンラクトン３０μＭ以上の濃度でスクリーニングを行うのが好ましいと考えられる。
【００６７】
実施例５ ｃａｓｐａｓｅ 活性の測定
ｃａｓｐａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ−ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性を、ウェスタンブロット解析により抗−活性型（Ｃｌａｖｅｄ型）ｃａｓｐａｓｅ抗体すなわち、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（Ｄ３３０）、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ 抗体 （Ｄ２１４）をそれぞれ用いて、実施例１と同様に測定した。
【００６８】
培養したＣａＣｏ−２細胞に、終濃度３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、経時的に０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間培養後のｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９、ＰＡＲＰ活性をウェスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。３０μＭでは活性型ｃａｓｐａｓｅ−３は刺激１時間後から検出され、その活性が４時間まで持続したのに対し、１００μＭでは活性が刺激６時間後をピークにして１０時間まで持続した。各メンブレンをリプローブしてＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰを検出した。ｃａｓｐａｓｅ−９活性は３０μＭ刺激では１、２、４時間で活性が強く、微弱な活性が８時間まで持続したのに対し、１００μＭ刺激では強い活性が８時間まで持続した。Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰに関してもＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９と同様の挙動を示した。
【００６９】
次に、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンとの３時間の反応を、０、１、１０、３０、１００μＭの各濃度にて行い、ｃａｓｐａｓｅ、ＰＡＲＰ活性を測定した。図１２に示すように、３０μＭ、１００μＭの濃度においてのみＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰが検出された。この結果はウェスタンブロット解析によるＭＡＰキナーゼ活性化、Ａｋｔ活性阻害、生存率低下やアポトーシス細胞出現が３０μＭ以上で顕著に起こったこととも一致した。
【００７０】
実施例６ ＣａＣｏ−２ 細胞における Ｎ−（３− オキソドデカノイル ）−Ｌ− ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ ＰＤ９８０５９ 、 ＳＢ２０３５８０ ）の効果
ＣａＣｏ−２細胞を３．５ｃｍ ディッシュ当たり２×１０^５個まいて１０％血清存在下で１２時間培養後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、無血清培地にて２４時間同調培養を行った。各種阻害剤（５０μＭ ＰＤ９８０５９、２０μＭ ＳＢ２０３５８０）又はＤＭＳＯによる前処理を３０分間行い、３０μＭ Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン又はＤＭＳＯを添加して１２時間培養後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色により生存率を測定した。結果を図１３に示す。
【００７１】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（３０μＭ）により生存率が９６％から４９％にまで低下した。ＥＲＫ経路の阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＭＥＫ阻害剤）の前処理では、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを単独で添加した場合の生存率とほぼ同じ値を示し、ＰＤ９８０５９の前処理による生存率への影響は認められなかった。一方、ｐ３８活性阻害剤であるＳＢ２０３５８０の前処理で、生存率がさらに３５％にまで減少した。
【００７２】
以上の結果より、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン依存的な生存率の低下には、ＥＲＫ、ｐ３８のいずれの経路も関与しないといえる。またｐ３８に関してはむしろ、アポトーシスを誘導するＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンという負の因子に対抗するシグナルとして働くことが示唆された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によって、アシル化ホモセリンラクトンが各種細胞に与える作用を阻害する物質、及び微生物によるバイオフィルムの生成を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、同定されたアシル化ホモセリンラクトン阻害物質を従来の抗菌剤と同時に使えば、バイオフィルムの生成を阻害することにより抗菌剤の効果を数倍〜数十倍高められるため、薬剤耐性を有する細菌に対する抗菌効果を高めることができる。さらにそれによって、難治性感染症をも効果的に治療することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン阻害剤により微生物による病原因子の発現をも阻害することができるため、強力な治療効果が期待できる。一方、工業用途においても、本発明の方法によってスクリーニングされたアシル化ホモセリンラクトン阻害剤によって、フィルターパイプの目詰まりを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣａＣｏ−２細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図２】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＭＡＰキナーゼ及びＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図３】図２のＭＡＰキナーゼのバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図４】図２のＡｋｔのバンド強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図５】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図６】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＭＡＰキナーゼ活性及びＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図７】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞生存率をＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色によって評価した結果である。
【図８】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞のアポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色によるクロマチン凝縮で判定した結果である。
【図９】クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果である。
【図１０】ＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するために、ＤＮＡの断片化を評価した結果である。
【図１１】アシル化ホモセリンラクトン存在下におけるｃａｓｐａｓｅ活性の培養時間依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１２】ｃａｓｐａｓｅ活性のアシル化ホモセリンラクトン濃度依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１３】ＣａＣｏ−２細胞におけるアシル化ホモセリンラクトン依存的なアポトーシスに対する各種キナーゼ阻害剤（ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０）の効果を表す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for screening a substance that inhibits biological activity such as expression of a pathogenic factor in a microorganism and formation of a biofilm.
[0002]
[Prior art]
In nature, microorganisms must survive in various environments. In addition to poor nutrition, low and high temperatures, and changes in pH, the living organisms must survive in an environment where phagocytes or antibacterial humoral factors (complements, antibodies, lysozyme, etc.) are present in vivo. Under these circumstances, bacteria have gained a mechanism to sensitively detect changes in their environment. One such mechanism is that microorganisms sense their concentration in the environment through specific messengers, and clearly control their various biological activities in response to that concentration. It has become. Such a mechanism of transmitting information between cells is called a quorum sensing system.
[0003]
The quorum sensing system is basically borne by three genes, I-gene, R-gene and target gene, the I-gene encodes an autoinducer (AI) synthase, and the R-gene Coding factor (see Non-Patent Document 1). The AI synthase synthesizes a group of substances called autoinducers, ie, acylated homoserine lactones. Acylated homoserine lactone is a molecule that can freely pass through the outer membrane of bacteria and, when the concentration of bacteria in the environment is low, is diluted and shows no biological activity, but the growth of bacteria increases and the density of bacteria in the environment increases When the concentration of the acylated homoserine lactone inside and outside the bacterium increases and reaches a certain threshold, the binding between the acylated homoserine lactone and the R-gene product (transcription activator) is accelerated. This complex binds to the transcription control region of the target gene and promotes the expression of the target gene, whereby various biologically active substances are expressed.
[0004]
So far, it has been reported that acylated homoserine lactone promotes the expression of virulence factors through the above quorum sensing system in clinically important bacteria such as Vibrio spp., Pseudomonas aeruginosa, Serratia, and Enterobacter. Have been. Furthermore, acylated homoserine lactone is used to generate biofilms from microorganisms.
It has also been clarified that it is involved in the following (see Patent Document 1).
[0005]
Biofilms can form in water environments, especially on the inner walls of conduit material in industrial equipment, the inner walls of domestic plumbing systems, interfaces on medical implants, or as the focus of chronic infectious diseases and the film of living organisms that survive. It is. Biofilms consist of an organic gel-like structure composed of a substrate polymer secreted by the resident microorganism and a microorganism embedded therein. Biofilm formation can limit or completely block the flow of the piping system, and can also reduce the life of the material due to the corrosive effects of embedded bacteria. Conditioning and removal of biofilms from pipes and conduit surfaces has traditionally been accomplished through corrosive chemicals, such as chlorine or strong alkaline solutions, or through mechanical means. Such procedures are generally harsh for both the piping system and the environment. Microbial resistance to antimicrobial agents is largely due to the protective properties of biofilm matrix polymers. Medical care has required the use of high doses of antibiotics for treatment when biofilms are thought to be involved. This is thought to be due in part to the extra protection of biofilm bacteria by extracellular matrix polymers. Therefore, there is a need to control biofilm formation in the medical, environmental and industrial fields.
[0006]
As described above, expression of a pathogenic factor and formation of a biofilm are serious problems, and a method for screening a substance that inhibits acylated homoserine lactone involved in these biological activities in microorganisms has been desired. Was. Since acylated homoserine lactone controls various activities in microorganisms, it may be possible to screen for an acylated homoserine lactone inhibitor using the survival of the microorganism as an index. However, since the microorganism itself produces acylated homoserine lactone, a bias occurs, which is not preferable as a screening method. Therefore, a more effective method for screening an acylated homoserine lactone inhibitor has been desired.
[0007]
On the other hand, regarding the effect of acylated homoserine lactone molecules on animal cells, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone stimulates IL-8 production in human alveolar epithelial cells (Non-Patent Document 2). Only), it has been reported that this substance promotes the production of TNF-α and IL-12 in a mouse macrophage culture system (see Non-Patent Document 3). Both reports relate to inflammatory and immune responses. It was not known at all that acylated homoserine lactone inhibits Akt activation in animal cells, and that acylated homoserine lactone induces apoptosis of animal cells.
[0008]
[Patent Document 1]
Special table 2002-514092
[Non-patent document 1]
See Marvin Whiteloy et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 96, 13904-13909, (1996)
[Non-patent document 2]
Richard P. Philips, J.A. Immunol. , 167, 366-374 (2001).
[Non-Patent Document 3]
Gary Telford et al. , Infect. Immun. , 66, 36-42, (1998).
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for screening a substance that inhibits the biological activity of acylated homoserine lactone.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above-mentioned object. As a result, the acylated homoserine lactone represented by the following formula I inhibits the activity of Akt in animal cells, thereby inhibiting apoptosis in animal cells. It was found to induce. The present inventors have found that the above-mentioned problem can be solved by culturing animal cells together with a test substance in the presence of acylated homoserine lactone and detecting the inhibition of Akt activity or the inhibition of Akt-related survival signaling pathway in the cells. Thus, the present invention has been completed.
[0011]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30 carbon atoms]
By culturing animal cells together with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone represented by, the inhibition of Akt activity in the cells or the inhibition of Akt-related survival signal transduction pathway is detected. A method for screening for inhibitors.
(2) The method according to (1), wherein the detection of Akt-related survival signaling pathway is detected by detecting apoptosis.
(3) An acylated homoserine lactone inhibitor identified by the screening method according to (1) or (2).
(4) An acylated homoserine lactone inhibitor identified by the screening method according to (1) or (2).
(5) A kit for use in the screening method according to (1) or (2), comprising:
a) Formula I:
Embedded image

[Wherein, R is as defined above]
Acylated homoserine lactone represented by
b) animal cells, and
c) Akt activity measuring means
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, acylated homoserine lactone refers to a compound of formula I:
Embedded image

Means a compound represented by
[0013]
In the formula I, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30, preferably 8 to 20, and more preferably 10 to 14 carbon atoms. Examples include a hydroxyl group, an oxo group, and a methyl group. An unsubstituted saturated aliphatic acyl group and a saturated aliphatic acyl group having an oxo group at the 3-position are preferred. Moreover, it is preferable that it is linear.
[0014]
Specific examples of R are not particularly limited, and include, for example, a butyryl group, a 3-oxobutyryl group, a 3-hydroxybutyryl group, an isobutyryl group, a valeryl group, a 3-oxovaleryl group, an isovaleryl group, and a 3-oxoisovaleryl group. Pivaloyl group, hexanoyl group, 3-oxohexanoyl group, heptanoyl group, 3-oxoheptanoyl group, octanoyl group, 3-oxooctanoyl group, nonanoyl group, 3-oxononanoyl group, decanoyl group, 3-oxodecanoyl group, Undecanoyl group, 3-oxoundecanoyl group, lauroyl group, 3-oxododecanoyl group, tridecanoyl group, 3-oxotridecanoyl group, tetradecanoyl group, 3-oxotetradecanoyl group, pentadecanoyl group, 3-oxopentadecanoyl group, palmitoyl group, 3 Oxopalmitoyl group, heptadecanoyl group, 3-oxoheptadecanoyl group, stearoyl group, 3-oxostearoyl group, nonadecanoyl group, 3-oxononadecanoyl group, icosanoyl group, 3-oxoicosanoyl group, triacontanoyl group , 3-oxotricontanoyl, myristoyl, 3-oxomyristoyl, pyruvoyl and the like.
[0015]
Specific examples of the acylated homoserine lactone represented by the formula I include, but are not particularly limited to, N-butyryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxobutyryl) -L-homoserine lactone, N- (3- (Hydroxybutyryl) -L-homoserine lactone, N-isobutyryl-L-homoserine lactone, N-valeryl-L-homoserine lactone, N- (3-oxovaleryl) -L-homoserine lactone, N-isovaleryl-L-homoserine lactone; N- (3-oxoisovaleryl) -L-homoserine lactone, N-pivaloyl-L-homoserine lactone, N-hexanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone, N -Heptanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxoheptano L) -L-homoserine lactone, N-octanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxooctanoyl) -L-homoserine lactone, N-nonanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxononanoyl) -L -Homoserine lactone, N-decanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N-undecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxoundecanoyl) -L-homoserine lactone , N-lauroyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N-tridecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxotridecanoyl) -L-homoserine lactone, N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone, N (3-oxotetradecanoyl) -L-homoserine lactone, N-pentadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxopentadecanoyl) -L-homoserine lactone, N-palmitoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxopalmitoyl) -L-homoserine lactone, N-heptadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxoheptadecanoyl) -L-homoserine lactone, N-stearoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxostearoyl) -L-homoserine lactone, N-nonadecanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxononanodecanoyl) -L-homoserine lactone, N-icosanoyl-L-homoserine lactone, N- (3 -Oxoicosanoyl) -L-homoserine lactone, N -Triacontanoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxotriacontanoyl) -L-homoserine lactone, N-myristoyl-L-homoserine lactone, N- (3-oxomyristoyl) -L-homoserine lactone and N -Pyruvoyl-L-homoserine lactone and the like.
[0016]
Particularly, N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxoundecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone, N- (3 -Oxotridecanoyl) -L-homoserine lactone and N- (3-oxotetradecanoyl) -L-homoserine lactone are preferred.
[0017]
The acylated homoserine lactone of the present invention can be synthesized, for example, by forming an amide bond between an aliphatic carboxylic acid or an ester thereof and a cyclic amino acid. Acylated homoserine lactone is described in, for example, Chhabra, S. et al. R. , P .; Stead, N.W. J. Bainton, G .; P. C. Salmond, G .; S. A. B. Stewart, P .; Williams, and B.W. W. Bycroft, J. et al. Antibiot. , 46, 441-454, 1993; Zhang, L .; , P .; J. Murphy, A .; Kerr, and M.S. E. FIG. Tate, Nature, 362, 446-448, 1993, Schaefer A .; L. , B. L. Hanzelka, A .; Eberhard, and E.H. P. Greenberg, J .; Bacteriol. 178, 2897-2901, 1996; Gao, J .; G. FIG. and E. A. Meighen. J. Bacteriol. , 175, 3856-3862, 1993 and the like.
[0018]
Further, since the acylated homoserine lactone of the present invention is biosynthesized by a microorganism, it can be separated and purified from a culture obtained by culturing the microorganism by a method generally used in the art.
[0019]
The present invention is based on the finding that acylated homoserine lactone inhibits Akt activity in animal cells.
[0020]
Therefore, in one embodiment of the present invention, an animal cell is cultured with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone, and the inhibition of Akt activity in the cell is detected to screen for an acylated homoserine lactone inhibitor. That is, when animal cells are cultured together with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone, the Akt activity inhibitory effect of the acylated homoserine lactone found when cultured without the test substance is not observed or If it decreases, the test substance can be identified as an acylated homoserine lactone inhibitor.
[0021]
Detection of Akt activity can be performed using methods commonly used in the art, for example, anti-phosphorylated Akt antibodies (eg, Baumann CA et al., Nature, 407, 202-207, (2000) ), Holland EC et al., Nat. Genet., 25, 55-57, (2000)), ie, Western blots using anti-activated Akt antibodies. Since this antibody has high reactivity and specificity to phosphorylated Akt as an antigen, phosphorylated Akt can be detected very effectively by using this antibody.
[0022]
Akt is activated downstream of PI3K (phosphatidylinositide 3-OH kinase) and plays an important role in survival signaling pathways. Cell viability is controlled by antagonism of apoptotic and survival signaling. It has been reported that Akt becomes active by phosphorylation, and that active Akt inhibits apoptosis in cells (see JP-T-2002-528390).
[0023]
Activated Akt is known to promote cell survival through various substrates (Experimental Medicine Vol 19, No. 13 (extra number), p. 116, 2001, Yodosha). In addition, the survival promotion mechanism by Akt includes 1) a pathway for directly phosphorylating a molecule involved in apoptosis induction to suppress the ability to induce apoptosis, and 2) an apoptosis promoting or suppressing molecule using a transcription factor as a direct or indirect target. It has been clarified that there is a pathway that acts on the promotion of survival by regulating the transcription of E. coli. Because Akt inhibits apoptosis through various substrates, inhibition of Akt activity also affects other molecules responsible for the survival signaling pathway involving Akt, and ultimately leads to cell apoptosis. It becomes.
[0024]
Therefore, in another embodiment of the present invention, an acylated homoserine lactone is inhibited by culturing an animal cell together with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone and detecting the inhibition of a survival signaling pathway involving Akt. Substances can also be screened. Inhibition of the survival signaling pathway involving Akt can be performed by detecting molecules involved in this pathway, their activities and structures, or binding to other molecules, and the like. The molecule involved in the survival signal transduction pathway involving Akt is not particularly limited as long as it is a molecule that is affected in some way by the inhibition of Akt activity, and examples include caspase, Bad, Forkhead trascription factor, and GSK-3.
[0025]
Caspases are a family of cysteine protease families that play a critical role in inducing, determining and executing apoptosis. When the inactive precursor of caspase is activated by limited degradation, a cascade of proteases is formed in the cell, and apoptosis is signaled. That is, activation of caspase results in apoptosis. Thus, activation of caspase means inhibition of the survival signaling pathway by Akt. That is, when animal cells are cultured together with the test substance in the presence of the acylated homoserine lactone, the caspase activation effect of the acylated homoserine lactone observed when cultured without the test substance is lost or reduced. Then, the test substance can be identified as an acylated homoserine lactone inhibitor.
[0026]
Among the caspases, caspase-3 has the highest enzymatic activity, and executes apoptosis by using various proteins constituting cells as substrates in addition to DNA fragmentation factors. The caspase-9 is activated by the release of cytochrome c from the mitochondria damaged by the apoptosis-inducing stimulus, thereby promoting the multimerization of Apaf-1 / cytochrome c / pro caspase-9. It has also been reported that caspase-9 is directly phosphorylated by Akt and its activation is inhibited. The caspase activity can be measured by a method commonly used in the art, for example, by Western blot.
[0027]
In addition, JNK and p38 among the MAP kinase superfamily members have been shown to be activated by various physicochemical stresses that induce apoptosis, suggesting that MAP kinase is involved in apoptosis. . MAP kinase is a group of serine-threonine kinases that are activated by phosphorylation of both amino acid residues, threonine and tyrosine, when cells are subjected to external stimuli such as cell growth factors. Even eukaryotes are universally present in higher animals. This enzyme is a protein kinase molecule consisting of a monomeric catalytic subunit. Its amino acid sequence is highly conserved in evolution and plays a pivotal role in intracellular signaling that regulates cell growth and molecules. The present inventors have found that acylated homoserine lactone promotes activation of MAP kinase, that is, phosphorylation. Therefore, in one embodiment of the present invention, an acylated homoserine lactone inhibitor is screened by culturing an animal cell together with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone and measuring the MAP kinase activity in the cell. You can also. In the present invention, it is preferable to detect the activity of ERK, p38 and JNK in the MAP kinase superfamily. The MAP kinase activity can be detected, for example, by measuring activated MAP kinase (phosphorylated MAP kinase) in the same manner as Akt by Western blot or the like. That is, when animal cells are cultured with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone, the MAP kinase activating effect of the acylated homoserine lactone observed when cultured without the test substance is not observed or If it decreases, the test substance can be identified as an acylated homoserine lactone inhibitor.
[0028]
Since the inhibition of Akt activity ultimately results in apoptosis, "detection of inhibition of Akt-related survival signaling pathway" in the present invention includes detection of apoptosis.
[0029]
In the present invention, apoptosis has the meaning commonly used in the art, that is, cell death actively caused by cells themselves under physiological conditions. Apoptotic morphology is characterized by nuclear chromosome aggregation, DNA fragmentation, loss of cell surface microvilli, and chromatin condensation. The cells atrophy, and the contents of the cells are not released outside the cells but are immediately taken up by surrounding cells such as macrophages, so that no inflammation is caused and the surrounding cells are not affected. On the other hand, necrosis (necrosis) caused by deterioration of the environment is significantly different from apoptosis in that the contents of cells are released.
[0030]
In the present invention, as a method for detecting apoptosis in animal cells, those commonly used in the art can be used, and without particular limitation, for example, a DNA-binding fluorescent dye aminobenzimide (Hoechst 33342, 33582 and 333258, etc.), a method of observing chromatin condensation with a fluorescence microscope after staining, a method of extracting and separating fragmented DNA by centrifugation and quantifying by agarose gel electrophoresis and a colorimetric method, and a method of histochemistry of fragmented DNA. TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) method for detecting cells, and a method for measuring cell viability by Trypan Blue staining.
[0031]
In the present invention, the acylated homoserine lactone inhibitor is a substance that inhibits the action of acylated homoserine lactone on various cells, particularly animal cells and microorganisms, an antagonist against the action, a substance that inhibits the secretion of acylated homoserine lactone, and Any substance that degrades acylated homoserine lactone is meant. The action of acylated homoserine lactone on various cells is not particularly limited, and examples thereof include an action of inhibiting Akt activity, an action of inducing apoptosis, an action of inducing the expression of a virulence factor by cells, and a biofilm formation by a microorganism. Inducing action is included.
[0032]
The present invention is also characterized in that an acylated homoserine lactone inhibitor is screened using animal cells. When using a microorganism such as a bacterium to screen for an acylated homoserine lactone inhibitor, the bacterium itself produces an acylated homoserine lactone, which is biased.However, animal cells do not produce an acylated homoserine lactone. High screening can be performed. Animal cells that can be used in the present invention are not particularly limited. For example, cells derived from mammals and birds can be used, and cells derived from mammals, particularly humans, are preferably used. In addition, cells derived from epithelial tissues, particularly intestinal mucosal epithelial tissues (eg, CaCo-2: human colon cancer carcinoma cells), endothelial cells, particularly vascular endothelial cells (eg, PEC: porcine thoracic aorta-derived endothelial cells) and fibroblasts (For example, NIH3T3: mouse embryo-derived fibroblasts) is preferably used. Specially differentiated mucosal epithelial cells called M cells are scattered in the intestinal mucosal epithelial layer covering the intestinal tract-associated lymphoid tissue (GALT) including Peyer's patch, and actively promote dietary antigens and intestinal bacteria. It plays an important role in the regulation of the intestinal local and systemic immune response by being taken up and provided to the immune system. Therefore, the intestinal epithelium is a place where contact with microorganism-producing substances is assumed, and it is possible to examine the direct action of acylated homoserine lactone using cells derived from intestinal mucosal epithelial tissue in actual animal organisms It can be understood as a phenomenon. In addition, it is preferable to use cancer cells among animal cells.
[0033]
In the screening method of the present invention, stimulation with acylated homoserine lactone is performed by culturing animal cells together with a test substance in the presence of acylated homoserine lactone. The culture time for stimulation depends on the concentration of acylated homoserine lactone, the detection method used and the type of animal cell, but is usually about 2 minutes to 72 hours.
[0034]
In embodiments where screening is performed by measuring Akt activity, culturing animal cells in the presence of acylated homoserine lactone shows that Akt activity decreases for several hours from the start of culture, but then returns to basal levels. (See Example 1 (3)). Therefore, in the screening method of the present invention, animal cells are cultured with acylated homoserine lactone in the absence of a test substance in advance as a control, and the culture time during which active Akt shows a decrease is measured. Within the range, it is preferable to culture the animal cells together with the acylated homoserine lactone in the presence of the test substance. The culture time in this case also depends on the concentration of the acylated homoserine lactone and the type of animal cell used, but is usually about 2 minutes to 2 hours.
[0035]
In an embodiment in which screening is carried out by measuring caspase activity, when animal cells are cultured in the presence of acylated homoserine lactone, caspase activity increases for several hours from the start of culture, but is shown to return to basal levels thereafter. (See Example 5). Therefore, in this case as well, it is preferable that animal cells are cultured with acylated homoserine lactone in the absence of a test substance as a control in advance, and the culture time during which active caspase decreases is measured. The culturing time in this case also depends on the concentration of the acylated homoserine lactone and the type of animal cell used, but is usually about 1 to 8 hours.
[0036]
Similarly, when MAP kinase is activated by acylated homoserine lactone, when culturing is performed in the presence of acylated homoserine lactone, MAP kinase returns to the basal level over time after activation once. The culturing time in this case also depends on the concentration of the acylated homoserine lactone and the type of animal cell used, but is usually about 2 minutes to 6 hours.
[0037]
The cultivation time for screening by detecting apoptosis is usually about 6 to 72 hours.
[0038]
In the screening method of the present invention, the concentration of acylated homoserine lactone coexisting is usually 1 to 500 μM, preferably 20 to 200 μM, more preferably 30 to 100 μM.
[0039]
More specifically, when screening for an acylated homoserine lactone inhibitor using Akt activity as an index using human-derived intestinal mucosal epithelial cells, in the presence of 10 μM or more, preferably 30 to 200 μM of acylated homoserine lactone, It is considered preferable to culture the animal cells together with the test substance for 2 minutes to 2 hours, preferably for about 2 to 60 minutes. Then, when Akt activity inhibition, which should be originally observed within the culture time, is not observed or when the activity inhibition decreases, the test substance can be identified as an acylated homoserine lactone inhibitor.
[0040]
When screening for an acylated homoserine lactone inhibitor using ERK activity as an index by using human-derived intestinal mucosal epithelial cells, animal cells may be used together with the test substance in the presence of 10 μM or more, preferably 30 to 200 μM of acylated homoserine lactone. Is preferably cultured for 2 to 30 minutes, preferably for about 5 to 15 minutes. When screening for an acylated homoserine lactone inhibitor using p38 activity as an index using human-derived intestinal mucosal epithelial cells, animal cells are used together with the test substance in the presence of 10 μM or more, preferably 30 to 200 μM of acylated homoserine lactone. Is preferably cultured for 5 minutes to 6 hours, preferably for about 5 to 60 minutes.
[0041]
In the screening method of the present invention, a medium usually used for culturing animal cells can be used, and is not particularly limited. For example, a DMEM medium, a BME medium and the like can be mentioned. As other culture conditions, those usually used for culturing animal cells can be used.
[0042]
In the present invention, after culturing animal cells for the above time, the reaction is stopped by, for example, rapidly cooling the cultured cells. Thereafter, Akt activity, caspase activity, apoptosis and the like in the animal cells are detected by the method as described above. To stop the reaction immediately, the solvent may be removed.
[0043]
Samples that can contain a test substance to be screened by the present invention include, but are not particularly limited to, extracts of animals (including microorganisms such as molds and radioactive bacteria) and plants, and artificially synthesized products.
[0044]
The present invention also relates to an acylated homoserine lactone inhibitor identified by the above-described screening method. Such a substance is not particularly limited, and includes both natural products and synthetic products. The acylated homoserine lactone inhibitor of the present invention can be used alone or together with a conventional antibacterial agent as an antibacterial agent. Since the acylated homoserine lactone inhibitor of the present invention can inhibit the formation of a biofilm, it is advantageous in that it can enhance the antibacterial action against bacteria that have acquired drug resistance. Known antibacterial agents that can be used with the acylated homoserine lactone inhibitor of the present invention are not particularly limited, and include, for example, penicillin (penam) antibiotics, cephalosporin (cephem) antibiotics, and oxacephem antibiotics. Substance, penem antibiotic, carbapenem antibiotic, monobactam antibiotic, aminoglycoside antibiotic, macrolide antibiotic, chloramphenicol antibiotic, tetracycline antibiotic, glycopeptide antibiotic, fosfomycin antibiotic Substances, lincomycin antibiotics, sulfa drugs, paraaminosalicylic acid preparations, isonicotinic acid hydrazide preparations, and quinolone synthetic antibacterial agents.
[0045]
The acylated homoserine lactone inhibitors screened by the method of the present invention can be used as biofilm inhibitors and as anti-clogging agents in filters and pipes. In addition, the acylated homoserine lactone inhibitor of the present invention can be used as a therapeutic agent for infectious diseases because it inhibits the expression of pathogenic factors in microorganisms.
[0046]
The present invention also relates to a kit for use in the above-described screening method. The kit includes, for example, an acylated homoserine lactone represented by the formula I, an animal cell, and a means for measuring Akt activity in the animal cell. The Akt activity measuring means includes, for example, an anti-phosphorylated Akt antibody and a labeled secondary antibody against the antibody. As the labeled secondary antibody, those commonly used in the art, for example, HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody, HRP-labeled anti-mouse IgG antibody and the like can be used.
[0047]
【Example】
In the following Examples, the experimental materials described below were used unless otherwise specified.
[0048]
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), non-essential amino acids (NEAA), and penicillin / streptomycin (P / S) used for cell culture were purchased from SIGMA. Dimethyl sulfoxide (DMSO) used as a solvent for N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) was obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. The kinase inhibitors PD98059 and SB203580 were purchased from CALBIOCHEM. For protein quantification, PICA BCA Protein Assay Reagent was used. Antibodies from the following companies were used. Anti-phosphorylated-p44 / 42 MAP kinase antibody, anti-phosphorylated-p38 MAP kinase antibody, anti-phosphorylated-SAPK / JNK antibody, anti-phosphorylated-Akt (Ser473) antibody, anti-Cleared-type caspase-3 Antibodies, anti-Cleared caspase-9 (D330) antibody, anti-Cleared PARP (D214) antibody, and HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody are from Cell Signaling. c-Myc mouse monoclonal antibody and HRP-labeled anti-mouse IgG antibody are from SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY. Anti-α-tubulin antibody (Ab-1) was from CALBIOCHEM.
[0049]
Example 1 Akt Analysis of activity by Western blot
(1) Changes in MAP kinase activity and Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone
The human colon cancer carcinoma cell line CaCo-2 was purchased from American Type Culture Collection (ATCC) and contained 10% FCS, 1% NEAA, 1% P / S (100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) in DMEM medium. At 37 ° C, 5% CO₂Cultured in the presence.
[0050]
Using a 6 cm dish (NUNC), 6 × 10 CaCo-2 cells per dish⁵After seeding and washing twice with phosphate buffered saline (PBS) (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. Thereafter, homoserine lactone hydrochloride and N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone were added at a final concentration of 100 μM, and reacted for 10 minutes. The purified acylated homoserine lactone was dissolved in DMSO so as to be 400 times the desired final concentration and used after filter sterilization (φ0.22 μm). DMSO at a final concentration of 0.25% was used as a control. Also, α-tubulin was used as an internal standard.
[0051]
After the reaction, the plate was washed twice with cold PBS (-) and frozen at -80 ° C. Thaw cells on ice and add lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1.5 mM MgCl₂1% Triton X-100, 10% glycerin, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 100 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin), and the cells were scraped off with a scraper. This was allowed to stand on ice for 20 minutes, and then centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes to collect the supernatant. The concentration of the recovered protein was measured, and the equivalent of 50 μg was subjected to SDS-PAGE. After the electrophoresis, blotting was performed on a PVDF membrane. When measuring phosphorylated ERK, JNK, p38, and Akt, blocking was performed with 5% skim milk / Tris buffered saline containing 0.1% Tween 20 (TBS-T), and the primary antibody was subjected to anti- Phosphorylated-p44 / 42 MAP kinase antibody, anti-phosphorylated-SAPK / JNK antibody, anti-phosphorylated-p38 MAP kinase antibody, anti-phosphorylated-Akt (Ser437) antibody, and HRP-labeled anti- Rabbit IgG antibody was used. Α-tubulin used as an internal standard was blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) / TBS-T, and the primary antibody was anti-α-tubulin (Ab-1) and the secondary antibody was HRP. A labeled anti-mouse IgG antibody was used. Renaissance for band detection^TM  Western Blot Chemiluminescence 2555861 Reagent Plus (NEN) or Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology) was used. The results are shown in FIG. In the figures referred to below, 3-oxo-C12-HSL means N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone.
[0052]
Regarding the MAP kinase activity, the activation of ERK, p38, and JNK was promoted only when N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was added. On the other hand, in CaCo-2 cells, Akt is usually phosphorylated (activated), but the phosphorylation level of Akt was significantly reduced by N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone.
[0053]
From the above, it was revealed that acylated homoserine lactone promotes the activation of ERK, p38, and JNK, while inhibiting the activation of Akt.
[0054]
(2) Changes in N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone concentration-dependent MAP kinase and Akt activity in CaCo-2 cells
After the cell culture, N- (3-oxo-dodecanoyl) -L-homoserine lactone at a final concentration of 0 μM (0.25% DMSO), 1 μM, 10 μM, 30 μM, and 100 μM was added and reacted for 10 minutes. MAP kinase activity and Akt activity were analyzed by Western blot in the same manner as in (1) (FIG. 2).
[0055]
FIGS. 3 and 4 show the results of quantitatively and numerically quantifying the intensity of the band in FIG. 2 using LAS-1000. At a concentration of 10 μM or more, the phosphorylation level of ERK and p38 was significantly increased. At 10 μM, 30 μM, and 100 μM, ERK activity increased 1.5, 7.7, and 9.8 times, and p38 activity increased 3.2, 4.4, and 5.4 times, respectively. No significant concentration-dependent difference was observed for JNK activity. Inhibition of Akt activity also started at 10 μM, and at 10 μM, 30 μM, and 100 μM, the activity was reduced to 79%, 31%, and 14%, respectively, when not stimulated.
[0056]
From the above, it can be seen that in CaCo-2 cells, the activity of Akt is significantly inhibited at 10 μM or more of acylated homoserine lactone. In addition, it can be seen that ERK, p38 and JNK are activated by 10 μM or more of acylated homoserine lactone.
[0057]
(3) Time-dependent changes in MAP kinase activity and Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone
After the cell culture, N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone at a final concentration of 30 μM and 100 μM was added, and the stimulation time with the acylated homoserine lactone was shortened by 0, 5, 10, 30, and 60 minutes, respectively. Course (Figure 5), 0, 10 minutes, 60 minutes, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 10 hours Long time course (Figure 6) MAP kinase activity and Akt activity were measured by Western blot. At 30 μM stimulation, both ERK and p38 activities peaked at 10 minutes, but ERK activity returned to basal levels at 30 minutes, whereas p38 continued its activity up to 4 hours. The inhibition of Akt activity upon stimulation at 30 μM peaked at 5 minutes, lasted up to 60 minutes, and returned to basal levels in 2 hours. With 100 μM stimulation, ERK activation occurred in two stages. That is, the first stage peaks at 5 minutes, returns to the basal level in 2 hours, and the second stage peaks in activity from 4 hours, and returns to the basal level in 10 hours, peaking at 8 hours. Was. This second step of ERK activation is considered to be after DNA damage. On the other hand, p38 activation upon stimulation at 100 μM peaked at 5 minutes and maintained its activity for up to 8 hours, and Akt activity inhibition peaked at 5 minutes and continued for up to 6 hours.
[0058]
Example 2 Trypan blue Evaluation of survival rate by staining
CaCo-2 cells were placed in a 3.5 cm dish (NUNC) at 2 × 10⁵  After seeding and washing twice with PBS (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. Various drugs [N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone having a final concentration of 1 to 100 µM was added and cultured for 12 hours. 0.25% DMSO was used as a control. Thereafter, the supernatant and cells detached from the dish with trypsin-EDTA (TE) were centrifuged at room temperature for 5 minutes at 800 rpm, the supernatant was removed, and diluted with 200 μl of DMEM. 50 μl of the solution was placed in an Eppendorf tube, an equal volume of Trypan blue stain was added, and the number of cells was measured using a hemocytometer. At this time, the total number of dead cells and living cells to be measured was 200 or more.
[0059]
A significant decrease in the survival rate was observed depending on the concentration of N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone. 10 μM, 30 μM, and 100 μM of N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone reduced the viability to 90%, 55%, and 51%, respectively (FIG. 7). The result of significantly reducing the survival rate at the concentration of 30 μM or more is also consistent with the fact that the increase in MAP kinase activity and the inhibition of Akt activity were remarkably observed at around 30 μM in Western blot analysis. In addition, the survival rate of both control and 0.25% DMSO was 94%, and the survival rate of 1% M- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was 94%. The impact on rates is considered negligible.
[0060]
Example 3 Hoechst33342 Observation of chromatin condensation by staining and judgment of apoptosis
In order to determine whether the CaCo-2 cell death observed in Example 2 was apoptosis or necrosis, it was morphologically evaluated using the chromatin-stained fluorescent dye Hoechst 33342.
[0061]
CaCo-2 cells were placed on 8-well culture slides (Collagen I cellware biocoat Becton Dickson) at 2 × 10⁴After seeding and washing twice with PBS (-), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours. After adding 3-oxo-dodecanoyl homoserine lactone at each concentration (1 to 100 μM) and culturing for 12 hours, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde-3% sucrose / PBS and chromatin using the fluorescent dye Hoechst 33342. The cells were stained and observed under a fluorescence microscope. Five fields of view were randomly selected at a magnification of 400 ×, apoptotic cells and normal cells were counted, the ratio of apoptotic cells was calculated, and this was repeated three or more times with n = 1.
[0062]
At a concentration of N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone of 10 μM or more, apoptotic cells that caused chromatin condensation were observed. However, only normal cells were observed with 0.25% DMSO and 1 μM N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone (FIG. 8). FIG. 9 shows the results of quantifying apoptosis by counting apoptotic cells in which chromatin condensation was observed. The ratio of apoptotic cells to the total number of cells was 15%, 39%, and 50% with N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone at 10 μM, 30 μM, and 100 μM, respectively. This value is consistent with the survival rate. Therefore, cell death of CaCo-2 by N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was determined to be due to apoptosis.
[0063]
Example 4 DNA Evaluation of apoptosis by fragmentation
As an alternative to determine whether the CaCo-2 cell death observed in Example 2 was apoptosis or necrosis, DNA fragmentation was evaluated.
[0064]
5 × 10 CaCo-2 cells⁶Seeds / 15 cm dish (NUNC), washed twice with PBS (-), cultured in a serum-free DMEM medium containing 1% NEAA for 24 hours, and N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine After adding lactone at each concentration of 1 μM to 100 μM, the cells were cultured for 12 hours. Thereafter, the supernatant and the cells detached from the dish with TE were centrifuged at room temperature at 800 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. The cells were suspended in 300 μl of PBS (−) and centrifuged again at 4 ° C. and 2500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. The cells are lysed by adding 300 μl of a cell lysis buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.5% Triton X-100], and placed on ice for 10 minutes. To extract a DNA fragment. This was centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, RNase A was added to the supernatant, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, proteinase K was added and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. The DNA fragment extract was concentrated by ethanol precipitation, and electrophoresed on a 2% agarose gel. After staining the gel with ethidium bromide, DNA fragmentation was detected under a UV transilluminator.
[0065]
DNA ladder was detected in CaCo-2 cells cultured for 12 hours in the presence of 0 μM, 1 μM, 10 μM, 30 μM, and 100 μM N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone. As a result, a ladder was confirmed (FIG. 10).
[0066]
From these results, it is considered preferable to perform screening at a concentration of 30 μM or more of acylated homoserine lactone in CaCo-2 cells.
[0067]
Example 5 caspase Activity measurement
The activity of caspase (caspase-3, caspase-9) and PARP (poly-ADP ribose polymerase) was determined by Western blot analysis using an anti-active caspase-3 antibody, that is, an anti-Clasped caspase-3 antibody, an anti-caspase-3 antibody, and an anti-caspase-3 antibody. The measurement was carried out in the same manner as in Example 1 using a cleaved caspase-9 antibody (D330) and an anti-Cleaved PARP antibody (D214), respectively.
[0068]
N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone having a final concentration of 30 μM and 100 μM was added to the cultured CaCo-2 cells, and the mixture was sequentially added for 0 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, and 6 hours. After 8 hours and 10 hours of culture, caspase-3, caspase-9 and PARP activities were analyzed by Western blot. The results are shown in FIG. At 30 μM, activated caspase-3 was detected 1 hour after stimulation, and its activity lasted up to 4 hours, whereas at 100 μM, activity peaked at 6 hours after stimulation and lasted up to 10 hours. Each membrane was reprobed to detect Cleared-type caspase-9 and Cleared-type PARP. The caspase-9 activity was strong at 1, 2, and 4 hours with 30 μM stimulation, and weak activity lasted up to 8 hours, whereas strong activity lasted up to 8 hours with 100 μM stimulation. The behavior of the cleaned-type PARP was the same as that of the cleared-type caspase-9.
[0069]
Next, a 3-hour reaction with N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone was carried out at concentrations of 0, 1, 10, 30, and 100 μM, respectively, and the caspase and PARP activities were measured. As shown in FIG. 12, Cleaved caspase and Cleaved PARP were detected only at the concentrations of 30 μM and 100 μM. This result was consistent with the fact that MAP kinase activation, Akt activity inhibition, viability reduction and appearance of apoptotic cells significantly occurred at 30 μM or more by Western blot analysis.
[0070]
Example 6 CaCo-2 In cells N- (3- Oxododecanoyl ) -L- Kinase inhibitors for homoserine lactone-dependent apoptosis ( PD98059 , SB203580 ) Effect
CaCo-2 cells were grown at 2 × 10 5 per 3.5 cm dish.⁵After individually culturing in the presence of 10% serum for 12 hours, the cells were washed twice with PBS (-) and subjected to synchronous culture in a serum-free medium for 24 hours. Pretreatment with various inhibitors (50 μM PD98059, 20 μM SB203580) or DMSO is performed for 30 minutes, 30 μM N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone or DMSO is added, and after culturing for 12 hours, Trypan blue staining is performed. Viability was measured. FIG. 13 shows the results.
[0071]
N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone (30 μM) reduced the viability from 96% to 49%. In the pretreatment with PD98059 (MEK inhibitor), which is an inhibitor of the ERK pathway, the survival rate was almost the same as that when N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone was added alone. The pretreatment did not affect the survival rate. On the other hand, pretreatment with SB203580, a p38 activity inhibitor, further reduced the survival rate to 35%.
[0072]
From the above results, it can be said that neither the ERK nor p38 pathway is involved in the reduction of N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone-dependent survival rate. In addition, it was suggested that p38 rather acts as a signal against a negative factor called N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone which induces apoptosis.
[0073]
【The invention's effect】
By the screening method of the present invention, a substance that inhibits the action of acylated homoserine lactone on various cells and a substance that inhibits biofilm formation by a microorganism can be screened. In addition, if the identified acylated homoserine lactone inhibitor is used together with a conventional antibacterial agent, the effect of the antibacterial agent can be increased several to several tens times by inhibiting the formation of biofilm, so that bacteria having drug resistance can be used. The antibacterial effect on the skin. Furthermore, it can also effectively treat intractable infections. In addition, the acylated homoserine lactone inhibitor can also inhibit the expression of pathogenic factors by microorganisms, so that a strong therapeutic effect can be expected. On the other hand, also for industrial applications, clogging of the filter pipe can be prevented by the acylated homoserine lactone inhibitor screened by the method of the present invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing changes in MAP kinase activity and Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by DMSO, homoserine lactone hydrochloride and N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone.
FIG. 2 is a graph showing changes in N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone concentration-dependent changes in MAP kinase and Akt activity in CaCo-2 cells.
FIG. 3 is a graph showing the results of quantifying and digitizing the intensity of the MAP kinase band in FIG. 2 by LAS-1000.
FIG. 4 is a diagram showing the results of quantifying and digitizing the band intensity of Akt in FIG. 2 by LAS-1000.
FIG. 5 is a graph showing time-dependent changes of MAP kinase activity and Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone.
FIG. 6 is a graph showing changes over time in MAP kinase activity and Akt activity in CaCo-2 cells stimulated by N- (3-oxododecanyl) -L-homoserine lactone.
FIG. 7 shows the results of evaluating cell viability in the presence of acylated homoserine lactone by Trypan blue staining.
FIG. 8 shows the results of determining apoptosis of cells in the presence of acylated homoserine lactone by chromatin condensation using Hoechst 33342 staining.
FIG. 9 shows the results of quantification of apoptosis by counting apoptotic cells in which chromatin condensation was observed.
FIG. 10 shows the results of evaluating DNA fragmentation to determine whether cell death of CaCo-2 is apoptosis or necrosis.
FIG. 11 shows the results of a measurement of the culture time dependence of caspase activity in the presence of acylated homoserine lactone, as measured by Western blot.
FIG. 12 shows the results obtained by measuring the dependence of the activity of acylamine on the concentration of acylated homoserine lactone by Western blot.
FIG. 13 is a graph showing the effects of various kinase inhibitors (PD98059, SB203580) on acylated homoserine lactone-dependent apoptosis in CaCo-2 cells.

Claims (5)

Formula I:

[Wherein, R is a linear or branched optionally substituted acyl group having 4 to 30 carbon atoms]
By culturing animal cells with a test substance in the presence of an acylated homoserine lactone represented by the formula: A method for screening for inhibitors. 2. The method of claim 1, wherein the detection of Akt involves the inhibition of a survival signaling pathway by detecting apoptosis. An acylated homoserine lactone inhibitor identified by the screening method according to claim 1 or 2. An acylated homoserine lactone inhibitor identified by the screening method according to claim 1 or 2. A kit comprising the following components for use in the screening method according to claim 1 or 2.
a) Formula I:

[Wherein, R is as defined above]
Acylated homoserine lactone represented by
b) animal cells, and c) Akt activity measuring means

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