【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗酸化能を有し、高いメラニン生成抑制効果による皮膚美白効果に優れた化粧料（化粧水）に関し、特にケフィア（ｋｅｆｉａ）粒の培養により得られる新規な化粧料に係る。
【０００２】
【従来の技術】
従来、皮膚美白効果を有する化粧料（化粧水）としては、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン及びその配糖体等、動植物からの抽出物を成分とするものであったが、人体への悪影響や肌荒れ等の心配もあった。
また、充分に美白効果が得られるものではなかった。
【０００３】
一方、日焼け等による肌の色黒化、シミ、ソバカス等は、黒褐色無定形の色素であるメラニンの生成によるものと考えられている。
このメラニンは、表皮基底層に存在するメラノサイトと呼ばれる色素細胞内のメラノソームにおいて、チロシナーゼによってチロシンから各種メラニン中間代謝産物を経て、酸化重合して生成されると考えられている。
そして、紫外線等により生成された活性酸素がこの反応系を活性化させるためにメラニンが過剰に生成され、皮膚への色素沈着を促進していると考えられている。
【０００４】
また、活性酸素は、皮膚の過酸化脂質を増大させることにより、肌の柔軟性及び弾力性を低下させ、肌のいわゆる、しっとり感が失われる原因の１つとも考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性が高く、活性酸素に対する高い抗酸化能を有し、メラニン生成抑制効果に優れ、皮膚美白効果が高い化粧料の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
コーカサス地方が発祥の地と考えられている伝統的な乳酸菌と酵母の複合醗酵乳ケフィア（ｋｅｆｉａ）は、そのスタータであるケフィア粒を牛乳にて培養して製造される。
【０００７】
本発明者らは、ケフィア粒を牛乳ではなく、緑茶のエキスにて培養すると、その培養液が優れた皮膚美白効果を有することを見い出したものである。
従って、本発明の技術的要旨は、ケフィア（ｋｅｆｉａ）粒を、緑茶エキスを含有する培地にて所定時間培養し、得られた培養液から菌体を除去することで得られる培養液を化粧料（化粧水）として使用する点にある。
【０００８】
ここで、緑茶エキスとは、茶葉をミキサーで粉末にして水に溶かしたものや、温水に茶葉を入れて抽出した液等、何らかの方法で緑茶の成分を水に溶かしたものをいう。
また、緑茶の種類は特に限定されるものでな無く、各種茶の若葉を焙炉の上で揉みやわらげ、緑色を保有させたものをいう。
【０００９】
【発明の実施の形態】
緑茶の茶葉をミキサーで粉末にしたものを約０．５〜２ｇ程度を、水５０〜２００ｍＬに溶かして緑茶エキスとした。
これに水５００〜１５００ｍＬ程度加え、はちみつを２５〜１００ｍＬ添加したものを培地として使用した。
ここで、はちみつを添加したのは、糖分の供給を目的とする趣旨である。
従って、はちみつに限定されるものでは無いが、はちみつを用いるとケフィア粒を培養した後の培養液をそのまま、化粧料として使用出来るという利点がある。
【００１０】
上記培地にケフィア粒を５〜２０ｇ添加し、５〜２０℃にて２４〜４８時間培養後に遠心分離機にて菌体を除去した。
これを滅菌フィルターを用いて滅菌処理をするか、あるいは加熱処理にして滅菌処理をして化粧料を得る。
【００１１】
上記の方法にて得られた化粧料の抗酸化能及びメラニン生成抑制試験評価を実施した。
【００１２】
抗酸化能試験は次のように実施した。
上述したように、緑茶エキスと、はちみつの培地にてケフィア粒を活性化、４８時間培養した培養液を遠心分離機（１０００ｒｐｍ，５分）にかけて、その上清を０．４５μｍフィルターで滅菌したものを試験体として用いた。
この試験体を容積濃度が１／６４，１／３２，１／１６，１／８になるように調整したものと、ブランク試験体として培養液を入れないものを準備した。
この試験体（サンプル）２５μＬに対して、４０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞５０μＬを植菌し、活性酸素発生源としてメチル ビオロゲン（Ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ）２５μＬを加えた。
これをＣＯ２ インキュベーターにて３７℃，４８時間保温放置した。
これにより、本発明に係る化粧料であるこの培養液に抗酸化能があればその分、細胞の生存率が高いことになる。
生存細胞率の割合を測定するのに、ＭＴＳ（テトラゾリウム塩）溶液とＰＭＳ（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）溶液とを２０：１の割合で混合したものをそれぞれのサンプルに２０μＬ加えて生存細胞による蛍光反応をおこさせた。
ＣＯ２ インキュベーターにて３７℃，２時間放置後に１０％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を２５μＬ加えて反応を停止させた。
その後に、所定量サンプリングして各サンプルの４９０ｎｍ吸光度を測定した。
その結果を図１（グラフ１）に示す。
培養時間及び培養液の濃度に比例して抗酸化能（細胞の生存率）の増大が認められる。
特に、培養開始後２４時間以内で抗酸化能の大幅な増大が確認された。
なお、培養液を添加しないものより１／６４濃度の培養液添加のものの方が抗酸化能が低下しているのは培養液のｐＨ３．４〜３．２で無添加のもののｐＨ４．８より低くなったためと推定される。
【００１３】
メラニン生成抑制評価は、マウスのＢ１６メラノーマ株（Ｂ１６ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を用いたメラニン生成抑制試験にて実施した。
Ｂ１６メラノーマ細胞２０万個／ｗｅｌｌになるように１０％血清含有培地に入れ、ＣＯ２ インキュベーターにて３７℃，２４時間培養した。
次に、１％血清含有培地をメンテナンス培地として換えて試験体（サンプル）をこの培地９に対して１の割合で添加して、ＣＯ２ インキュベーターにて３７℃，４日間培養した。
試験に用いたサンプルは、ケフィア粒培養２４時間、４８時間のものと、比較のために１００μｇ／ｍＬコウジ酸添加したものである。
次に、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（０．２ｍＬ Ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．８ｍＬ ＥＤＴＡ）で細胞をはがし、１％ＦＣＳ−ＰＢＳ［Ｆｅｔａｌ Ｃｏｗ Ｓｅｒｕｍ（子牛胎児血清）をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に溶解したもの］を所定量加えて細胞数をカウントした。
次に、１０％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）−ＩＮ ＮａＯＨを加えて、メラニンを溶出し、その上清の４７０ｎｍ吸光度を測定した。
サンプルを添加しないものと、サンプルを添加したものの吸光度差からメラニン生成抑制率（％）を求めた結果を図２（グラフ２）に示す。
従来のコウジ酸より、本発明に係るケフィア粒を培養して得られた培養液（化粧料）の方が優れたメラニン生成抑制効果を示した。
【００１４】
次に、本発明に係る化粧料を得ることが出来たケフィア粒の菌株の同定を試みた。
ケフィア粒を緑茶エキス培地にて４８時間活性化培養したものから１ｍＬを無菌的にサンプリングして希釈平板法にて分離した結果、図３（表１）に示すように６種類に分離された。
なお、培養条件は、
栄養寒天培地 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）：３０℃、好気条件、寒天培地 ＹＭ Ａｇａｒ（Ｙｅａｓｔ Ｍａｌｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）：２５℃、好気条件、
寒天培地 ＭＲＳ Ａｇａｒ（ＤｅＭａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ ｂｒｏｔｈ）（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）：３７℃、嫌気条件とした。
【００１５】
分離された菌株の性状観察及び塩基配列解析を実施した。
【００１６】
２ｂは桿菌で、グラム染色陰性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、生育時のグルコース要求性、グルコースからの酸産生、コロニー観察レベルで色素非産生の性状を示した。
これらの性状は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に帰属する菌種の性状に類似する。
また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図４に示し、アセトバクター アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）に対して、９７．５１％の相同性を示した。
２ｂは、菌の性状及び系統樹からアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）に属するものと推定される。
【００１７】
３ｂは桿菌で、グラム染色陰性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、生育時のグルコース要求性、グルコースからの酸産生、コロニー観察レベルで色素非産生の性状を示した。
これらの性状は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に帰属する菌種の性状に類似する。
また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図５に示し、
グルコノバクター オキシダンス オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｏｘｙｄａｎｓ）に９９．２６％の相同性を示した。
以上のことから３ｂは、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）に属すると推定される。
【００１８】
６ｂは、グラム染色陽性、非運動性、カタラーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性、ブドウ糖の醗酵性陽性を示し、ＭＲＳ培地で良好に生育する無芽胞の桿菌であることが示された。
これらの性状は、乳酸菌の一般性状に一致する。
また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図６に示すように、ラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）に９５．２０％の相同性を示した。
以上より６ｂは、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属すると推定される。
【００１９】
次に、酵母として分離された１ｙ、４ｙ、５ｙの同定を２８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析により試みた。
その系統図を図７、図８、図９にそれぞれ示す。
その結果、１ｙは ピピアメンブラニ ファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎｉ ｆａｃｉｅｎｓ）あるいは、ピピア（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）あるいは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）と推定された。
４ｙは、サッカロマイセス セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）あるいは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）あるいは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）と推定された。
５ｙは、ピピア アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）と推定された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明においては、ケフィア粒を緑茶エキスを用いて培養するだけでメラニン生成抑制効果により、優れた皮膚美白効果を有する化粧料が得られる。
また、本発明に係る化粧料を使用することにより、優れた抗酸化能によるメラニン生成抑制効果のみならず、皮膚の過酸化脂質の増大を防止し、肌のみずみずしさを維持し、老化を抑えることが期待される。
なお、数人の女性に実際にモニタリング試験を依頼し、片手にのみ本発明に係る化粧水を塗っていただき、数日間後に他の手と比較すると明らかに美白効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】（グラフ１）抗酸化能試験結果を示す。
【図２】（グラフ２）メラニン生成抑制試験結果を示す。
【図３】（表１）ケフィア粒を緑茶エキスにて培養した際の菌種の分離結果を示す。
【図４】菌種２ｂの１６Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図５】菌種３ｂの１６Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図６】菌種６ｂの１６Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図７】菌種１ｙの２８Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図８】菌種４ｙの２８Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図９】菌種５ｙの２８Ｓ ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cosmetic (lotion) having an excellent antioxidant ability and an excellent skin whitening effect due to a high melanin production inhibitory effect, and particularly to a novel cosmetic obtained by culturing kefir grains. .
[0002]
[Prior art]
Conventionally, cosmetics (skin lotions) having a skin whitening effect have been composed of extracts from animals and plants, such as kojic acid and its derivatives, ascorbic acid and its derivatives, hydroquinone and its glycosides, as components. In addition, there were concerns about adverse effects on the human body and rough skin.
Further, the whitening effect was not sufficiently obtained.
[0003]
On the other hand, darkening of skin due to sunburn and the like, spots, freckles, and the like are considered to be due to the production of melanin, a black-brown amorphous pigment.
It is thought that this melanin is generated by oxidative polymerization of tyrosinase from tyrosine via various melanin intermediate metabolites in melanosomes in pigment cells called melanocytes present in the basal layer of the epidermis.
It is considered that active oxygen generated by ultraviolet rays or the like activates this reaction system, so that melanin is excessively generated and promotes pigmentation on the skin.
[0004]
In addition, active oxygen is considered to be one of the causes of a decrease in skin softness and elasticity by increasing the lipid peroxide of the skin, and a loss of so-called moist feeling of the skin.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a cosmetic having high safety, high antioxidant activity against active oxygen, excellent melanin production inhibitory effect, and high skin whitening effect.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Traditional fermented milk kefir of lactic acid bacteria and yeast, which is believed to have originated in the Caucasus region, is manufactured by culturing kefir grains, which are the starters, in milk.
[0007]
The present inventors have found that, when kefir grains are cultured not with milk but with an extract of green tea, the culture solution has an excellent skin whitening effect.
Therefore, the technical gist of the present invention is that a culture solution obtained by culturing kefia grains in a medium containing a green tea extract for a predetermined time and removing cells from the obtained culture solution is used as a cosmetic. (Lotion).
[0008]
Here, the green tea extract refers to one obtained by dissolving green tea components in water by any method, such as powdered tea leaves dissolved in water with a mixer, or a liquid extracted by adding tea leaves to warm water.
In addition, the type of green tea is not particularly limited, and refers to tea leaves obtained by rubbing and softening young leaves of various teas on a roasting furnace to retain green color.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
About 0.5 to 2 g of powdered green tea leaves mixed with a mixer was dissolved in 50 to 200 mL of water to obtain a green tea extract.
About 500 to 1500 mL of water was added thereto, and 25 to 100 mL of honey was used as a medium.
Here, the purpose of adding honey is to supply sugar.
Therefore, it is not limited to honey, but using honey has the advantage that the culture solution after culturing kefir grains can be used as a cosmetic as it is.
[0010]
5-20 g of kefir grains were added to the above medium, and after culturing at 5-20 ° C. for 24-48 hours, the cells were removed by a centrifuge.
This is subjected to a sterilization treatment using a sterilization filter, or a heat treatment to perform a sterilization treatment to obtain a cosmetic.
[0011]
The antioxidant ability and melanin production inhibition test evaluation of the cosmetic obtained by the above method were performed.
[0012]
The antioxidant ability test was performed as follows.
As described above, the kefir grains are activated in the green tea extract and the honey medium, and the culture solution cultured for 48 hours is centrifuged (1000 rpm, 5 minutes), and the supernatant is sterilized with a 0.45 μm filter. Was used as a specimen.
The test specimen was prepared so that the volume concentration was 1/64, 1/32, 1/16, 1/8, and the blank specimen was prepared without a culture solution.
40 × 10 4 with respect to 25 μL of this test body (sample) 50 μL of Jurkat cells adjusted to cells / mL were inoculated, and 25 μL of methyl viologen (Methyl viologen) was added as a source of active oxygen.
This was left standing at 37 ° C. for 48 hours in a CO 2 incubator.
As a result, if the culture solution, which is the cosmetic according to the present invention, has an antioxidant ability, the survival rate of the cells is correspondingly higher.
To measure the ratio of viable cells, 20 μL of a mixture of MTS (tetrazolium salt) solution and PMS (phenazine methosulfate) solution at a ratio of 20: 1 was added to each sample, and a fluorescent reaction by viable cells was performed. I let it.
After standing at 37 ° C. for 2 hours in a CO 2 incubator, the reaction was stopped by adding 25 μL of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS).
Thereafter, a predetermined amount was sampled, and the absorbance at 490 nm of each sample was measured.
The result is shown in FIG. 1 (graph 1).
The antioxidant capacity (cell viability) increases in proportion to the culture time and the concentration of the culture solution.
In particular, a significant increase in the antioxidant capacity was confirmed within 24 hours after the start of the culture.
It should be noted that the antioxidant ability of the medium with the 1/64 concentration added was lower than that of the medium without the medium added than that of the medium without the medium added at pH 3.4 to 3.2. It is estimated that it has become lower.
[0013]
The melanin production inhibition evaluation was performed by a melanin production inhibition test using a B16 mouse melanoma cell strain.
B16 melanoma cells were placed in a 10% serum-containing medium at 200,000 cells / well and cultured at 37 ° C. for 24 hours in a CO 2 incubator.
Next, the medium containing 1% serum was replaced with a maintenance medium, and a test sample (sample) was added at a ratio of 1 to the medium 9 and cultured at 37 ° C. for 4 days in a CO 2 incubator.
The samples used for the test were those obtained by culturing kefir grains for 24 hours and 48 hours, and those obtained by adding 100 μg / mL kojic acid for comparison.
Next, the cells were detached with trypsin (trypsin) -ethylenediamine tetraacetic acid (0.2 mL Trypsin + 0.8 mL EDTA), and 1% FCS-PBS [Fetal Cow Serum (fetal calf serum) was added to PBS (phosphosphere buffer). Was dissolved in a predetermined amount) and the number of cells was counted.
Next, 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) -IN NaOH was added to elute melanin, and the absorbance of the supernatant at 470 nm was measured.
FIG. 2 (Graph 2) shows the results of determining the melanin production inhibition rate (%) from the difference in absorbance between the sample not added and the sample added.
Compared with the conventional kojic acid, the culture solution (cosmetic) obtained by culturing the kefir grains according to the present invention exhibited a superior melanin production inhibitory effect.
[0014]
Next, identification of a strain of kefir grains from which the cosmetic according to the present invention could be obtained was attempted.
As a result of aseptically sampling 1 mL of the kefir grains that had been activated and cultured in a green tea extract medium for 48 hours and separating them by a dilution plate method, they were separated into six types as shown in FIG. 3 (Table 1).
The culture conditions were as follows:
Nutrient agar medium Nutrient Agar (Oxoid, England, UK): 30 ° C, aerobic conditions, agar medium YM Agar (Yeast Malt peptone) (Becton Dickinson, NJ, USA): 25 ° C, aerobic conditions,
Agar medium MRS Agar (DeMan, Rogosa, Sharp broth) (Oxoid, England, UK): 37 ° C. under anaerobic conditions.
[0015]
The properties of the isolated strain were observed and the nucleotide sequence was analyzed.
[0016]
2b is a bacillus, which was negative for Gram staining, positive for catalase reaction, negative for oxidase reaction, required for glucose during growth, produced acid from glucose, and showed no pigment at the level of colony observation.
These properties are similar to those of the bacterial species belonging to Acetobacter and Gluconobacter.
In addition, in the 16S rDNA nucleotide sequence analysis, the phylogenetic tree is shown in FIG. 4, and showed 97.51% homology to Acetobacter aceti.
2b is presumed to belong to the genus Acetobacter from the properties and phylogenetic tree of the fungus.
[0017]
3b is a bacillus, negative for Gram staining, positive for catalase reaction, negative for oxidase reaction, required for glucose during growth, acid production from glucose, and non-pigmenting at the colony observation level.
These properties are similar to those of the bacterial species belonging to Acetobacter and Gluconobacter.
In the 16S rDNA nucleotide sequence analysis, the phylogenetic tree is shown in FIG.
Gluconobacter oxydans oxydans showed 99.26% homology to Gluconobacter oxydans oxydans.
From the above, it is presumed that 3b belongs to the genus Gluconobacter sp.
[0018]
6b showed gram staining positive, non-motile, negative for catalase reaction, negative for oxidase reaction, and positive for fermentation of glucose, indicating that it is a spore-free bacillus that grows well in MRS medium.
These properties correspond to the general properties of lactic acid bacteria.
In the 16S rDNA nucleotide sequence analysis, the phylogenetic tree showed 95.20% homology to Lactobacillus mari as shown in FIG.
From the above, it is presumed that 6b belongs to the genus Lactobacillaceae.
[0019]
Next, identification of 1y, 4y, and 5y isolated as yeast was attempted by 28S rDNA nucleotide sequence analysis.
The system diagrams are shown in FIGS. 7, 8, and 9, respectively.
As a result, 1y was estimated to be Pichiamembrani faciliens, Pichia sp., Or Candida sp.
4y was estimated to be Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Or Candida sp.
5y was presumed to be Pichia anomala.
[0020]
【The invention's effect】
In the present invention, a cosmetic having an excellent skin whitening effect can be obtained only by culturing kefir grains using a green tea extract, due to a melanin production inhibitory effect.
Further, by using the cosmetic according to the present invention, not only the melanin production inhibitory effect due to the excellent antioxidant ability, but also the increase of lipid peroxide in the skin is prevented, the freshness of the skin is maintained, and aging is suppressed. It is expected.
In addition, several women were actually requested to perform a monitoring test, and the lotion according to the present invention was applied to only one hand, and the whitening effect was clearly confirmed when compared with the other hands several days later.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (Graph 1) shows the results of an antioxidant capacity test.
FIG. 2 (Graph 2) shows the results of a melanin production inhibition test.
FIG. 3 (Table 1) shows the results of separating bacterial species when kefir grains were cultured with green tea extract.
FIG. 4 shows a phylogenetic tree obtained by 16S rDNA analysis of strain 2b.
FIG. 5 shows a phylogenetic tree obtained by 16S rDNA analysis of strain 3b.
FIG. 6 shows a phylogenetic tree obtained by 16S rDNA analysis of strain 6b.
FIG. 7 shows a phylogenetic tree obtained by 28S rDNA analysis of strain 1y.
FIG. 8 shows a phylogenetic tree obtained by 28S rDNA analysis of strain 4y.
FIG. 9 shows a phylogenetic tree obtained by 28S rDNA analysis of strain 5y.