JP2003526374A - ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸配列、及び前記ポリペプチドに関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んでなる、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞にも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： 発明の分野： 本発明は、転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
配列、及び前記ポリペプチドに関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成
る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞にも関する。本発明はさらに、転写活性
化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿
主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法にも関する。

【０００２】 関連技術の記載： 異種タンパク質の発現における組換え宿主細胞の使用は、最近、それらの天然
源からの精製によってのみ得られる多量の市販のタンパク質の生成を単純化した
。最近、ユーバクテリア及び真核生物宿主を包含する、いずれかの所定のタンパ
ク質の生成のために選択される発現システムの種々の選択が存在する。適切な発
現システムの選択はしばしば、活性状態でのタンパク質の適切な収量を生成する
宿主細胞の能力に依存するのみならず、また、かなりの程度、タンパク質の意図
される最終使用によっても支配され得る。

【０００３】 しばしば遭遇する１つの問題は、所定の宿主細胞により生成されるか又は培養
培地に存在する、高いレベルのタンパク質分解酵素である。１つの提案は、特定
のタンパク質分解化合物を生成する能力を奪われた宿主生物を提供することであ
った。例えば、WO90/00192号（Genecor, Inc.）は、酵素的活性のアスパラギン
酸プロテイナーゼを分泌することができない糸状菌宿主を記載している。ヨーロ
ッパ特許第574347号（Ciba Geigy AG）は、スブチリシン−型のセリンプロテア
ーゼを欠いているアスペルギラス宿主を記載している。WO98/12300号（Novo Nor
disk A/S）はメタロプロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼを欠いている宿主を
記載している。WO97/12045号（Genencor, Inc.）は、プロテアーゼ遺伝子の調節
に関与するプロモーター配列の破壊をもたらす、プロテアーゼ欠失にされている
酵母及び細菌宿主システムを記載している。

【０００４】 Mattern, I.E., など., (1992, Mol. Gen. Genet. 234: 332-336) は、明らか
に、少なくとも２種のプロテアーゼ、すなわちアスペルギロペプシンA及びアス
ペルギロペプシンBの欠失のために、親株の細胞外プロテアーゼ活性のわずか１
〜２％を有することが示された、アスペルギラス・ニガーの変異体株を記載する
。プロテアーゼ欠失の表現型が両プロテアーゼをコードする遺伝子の発現に影響
を及ぼす調節突然変異に起因することが示唆された。

【０００５】 特異的プロモーター又はプロモーター組みでの真核転写の開始は、ポリペプチ
ドであるが、しかしRNAポリメラーゼのそれ自体の部分ではない真核転写活性化
因子を必要とする。多くの転写活性化因子は、ポリペプチドコード配列の転写の
開始のために必要な機能的プロモーターを形成するためにプロモーター上の特定
部位に結合する。しかしながら、転写活性化因子はまた、他のポリペプチドの存
在下でのみ、開始複合体中に組み込まれ得る。転写活性化活性を有するポリペプ
チドが菌類において記載されており、そしてそのようなポリペプチドの一覧表は
公開されている（Dhawale, S. S., and Lane, A.C. 1993, Nucleic Acid Resear
ch 21: 5537-5546）。 発明により提供される解決法： プロテアーゼ生成の調節に関与する転写活性化因子の活性が変更されている、
宿主細胞におけるポリペプチドの生成を高めるための改良された方法を提供する
ことが、本発明の目的である。

【０００６】 発明の要約： 本発明の第１の観点は、 （ａ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する
核酸配列； （ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に
、低ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低スト
リンジェント条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性
されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイ
ゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×
SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され； （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写
活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列
番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択
された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関する。

【０００７】 配列番号１に示す核酸配列は、さらに以下に、そして実施例中に記載するよう
に、配列番号２に示す転写因子をコードするアスペルギラス・ニガーprtT遺伝子
である。 配列番号48に示す核酸配列は、配列番号49に示す転写因子をコードするアスペ
ルギラス・オリザエIFO4177 prtT遺伝子である。このA. oryzae prtT遺伝子は、
795位から始まり、そして2931位に終わるコーディング領域をもつ。このprtT遺
伝子は、1028〜1135位、1538〜1591位、2018〜2066位、そして2297〜2347位に、
４つのイントロンをもつ。これを、以下に、そして実施例中にさらに説明する。 もう１つの観点においては、本発明はまた、核酸配列を含んで成る、核酸構造
体、ベクター及び宿主細胞、及び前記核酸配列によりコードされるポリペプチド
にも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている
、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成す
るための方法に関する。

【０００８】 発明の詳細な説明： 転写活性化因子をコードする核酸配列： 本発明の第１の観点は、 （ａ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する
核酸配列； （ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に
、低ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低スト
リンジェント条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性
されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイ
ゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×
SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され； （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写
活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列
番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； から成る群から選択された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関
する。

【０００９】 用語“転写活性化因子”とは、本明細書において使用される場合、それが連結
されているポリペプチドコード配列の転写の開始のために必要な特異的プロモー
ター又はプロモーター組を活性化する能力を有するポリペプチドを言及する。 用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、他の核
酸配列を実質的に有さない核酸配列、例えば、アガロース電気泳動により決定さ
れる場合、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より
好ましくは少なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の
純度、最も好ましくは少なくとも約90％の純度の核酸配列を言及する。例えば、
単離された核酸配列は、その核酸配列を、その天然の位置から、それが再生され
るであろう異なった部位に再配置されるために遺伝子工学に使用される標準のク
ローニング方法により得られる。そのクローニングの方法は、ポリペプチドをコ
ードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、その
フラグメントのベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数コピー又はクロー
ンが複製されるであろう宿主細胞中への前記組換えベクターの組み込みを包含す
る。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成起源のもの、合成起源のもの、又
はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。

【００１０】 好ましい態様においては、核酸配列は、活性ポリペプチドをコードする、配列
番号１又は配列番号48に示される核酸配列に対して、少なくとも約70％、好まし
くは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましく
は少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％、最も好ましくは少なく
とも約97％、そしてさらにより好ましくは少なくとも99％の同一性の程度を有す
る。本発明のためには、２種の核酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギ
ャップペナルティ及び10のギャップ長さペナルティーを有するClustal方法（Hig
gins, 1989, CABIOS 5:151-153）により決定される。

【００１１】 さらにより好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は
、配列番号１又は配列番号48に示されるような核酸配列を有する。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、前記ポリペプチドに実
質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。ポリペプチドに“実質
的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらの
ポリペプチドは、その生来の源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構
築された手段において異なる。例えば、比活性、結合特異性及び/又は親和性、
又は同様のものにおいて異なる、ポリペプチドの変異体を、例えば特定部位の突
然変異誘発を用いて合成することは、興味あることである。類似配列が、配列番
号１又は配列番号48のポリペプチド部分として表される核酸配列、例えばその副
配列に基づいて、及び/又は核酸配列によりコードされるポリペプチドのもう１
つのアミノ酸を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物
のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ
酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。
ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、例えば、Fordなど., 1991, Prote
in Expression and Purification 2: 95-107 を参照のこと。

【００１２】 もう1つの好ましい態様においては、本発明は、ポリペプチドの転写活性化活
性を定性的に保持する、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、好ま
しくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらにより好まし
くは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％、最も好ましくは少な
くとも約97％、そしてさらにより好ましくは少なくとも99％の程度の配列番号２
又は配列番号49に示されるアミノ酸配列に対する同一性を有するアミノ酸配列を
有するポリペプチド（以下、“相同ポリペプチド”という。）をコードする単離
された核酸配列に関する。

【００１３】 好ましい態様においては、相同ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号49に
示されるアミノ酸とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ま
しくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好まし
くは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。本発明のためには、２
種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギャップペナルティー及
び10のギャップ長さのペナルティーを有するClustal 方法（Higgins, 1989, 前
記）により決定される。

【００１４】 ハイブリダイゼーションは、標準のサザンブロット方法によれば、核酸配列が
、配列番号１に示される核酸配列のポリペプチドコード部分に対応するオリゴヌ
クレオチドブローブに対して、低ストリンジェント条件（すなわち、５×SSPE、
0.3％のSDS, 200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25，35
，又は50％のホルムアミド（それぞれ、低、中及び高ストリンジェンシー）にお
ける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下で、
ハイブリダイズすることを示す。配列番号１又は配列番号48と相同であるクロー
ン又はDNAを同定するためには、ハイブリダイゼーション反応は、２×SSC、0.2
％のSDSを用いて、好ましくは少なくとも50℃、より好ましくは少なくとも55℃
、より好ましくは少なくとも60℃、より好ましくは65℃、さらにより好ましくは
少なくとも70℃及び最も好ましくは少なくとも75℃で、それぞれ30分間、３度、
洗浄される。

【００１５】 配列番号１又は配列番号48の核酸配列又はその副配列、及び配列番号２又は配
列番号49のアミノ酸配列又はその部分配列、又は配列番号３のアミノ酸配列が、
当業界において良く知られている方法に従って、いずれかの属又は種の相同遺伝
子を同定し、そして単離し又はクローン化するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブを企画するために使用され得る。

【００１６】 特に、そのようなプローブは、対応する遺伝子を同定し、そして単離するため
に、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAと
のハイブリダイゼーションのために使用され得る。そのようなブローブは、完全
な配列よりもかなり短いが、しかし少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個
、及びより好ましくは少なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。
より長いプローブがまた使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る
。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（例え
ば、³²P、³H, ³⁵S, ビオチン又はアビジンによる）。例えば、³²P-, ³H-又は³⁵S
-ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、X線フ
ィルムの使用により検出され得る。

【００１７】 従って、そのような他の生物から調製されるゲノム、cDNA又はコンビナトリア
ル・ケミカル・ライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズし、そして転写
活性化活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る
。そのような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーか
らのDNA又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料
に移行され、そして固定され得る。次に、配列番号１又は配列番号48に対して相
同であるクローン又はDNAは、標準のサザンブロット方法に従って同定され得る
。

【００１８】 対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める、複数の他の形の遺伝子の
いずれかを示す。対立遺伝子変動は天然においては、突然変異を通して生じ、そ
して集団内での表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイ
レントであり（すなわち、コードされたポリペプチドにおける変化は存在しない
）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができ
る。

【００１９】 用語“ポリペプチドの対立遺伝子変異体”は、遺伝子の対立遺伝子変異体によ
りコードされるポリペプチドである。好ましい態様においては、本発明の転写活
性化因子をコードする核酸配列は、（ａ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列
と少なくとも70％の同一性を有し、（ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸
配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードし、（ｃ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列又はその相補的鎖と、低い
緊縮条件下でハイブリダイズし、そして（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードする核酸配列から成る群から選択された核酸配列の対立
遺伝子変異体である。

【００２０】 本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１又は配列番号48とは異な
る核酸配列も包含する。本発明はまた、配列番号１又は配列番号48の副配列にも
関し、ここで配列番号１又は配列番号48の副配列は、配列番号１又は配列番号48
により包含される核酸配列であるが、但しその5’及び3’末端からの１又は配列
番号48又は複数のヌクレオチドが欠失されている。好ましくは、配列番号１又は
配列番号48の副配列は、転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコ
ードする。より好ましい態様においては、配列番号１又は配列番号48の副配列は
、配列番号３に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列を少なくとも含
む。

【００２１】 ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用
される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDN
Aからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの
本発明の核酸配列のクローニングは、例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は
共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために
発現ライブラリーの抗体スクリーニングに基づく方法を用いることによってもた
らされ得る。（例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Appl
ication; Academic Press, New York を参照のこと）。他の核酸増幅方法、例え
ばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく
増幅（NASBA）が使用され得る。核酸配列は、微生物、又は他の又は関連する生
物からクローン化され得、そして従って、核酸配列のポリペプチドコード領域の
対立遺伝子又は種変異体であり得る。

【００２２】 配列番号１又は配列番号48の核酸配列、その相補鎖、又は配列番号１又は配列
番号48の対立遺伝子変異体及び副配列、又は転写活性化因子の対立遺伝子変異体
及びフラグメントとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズする核酸配列によりコードされる転写活性化因子は、いずれかの属の微生
物から得られる。 好ましい態様においては、転写活性化因子は、菌類細胞から得られる。“菌類
（Fungi）”とは、本明細書において使用される場合、子嚢菌門（Ascomycota）
、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）及び接合菌門（
Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the
Fungi, 8^th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridg
e, UKにより定義される）、及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth など., 1995,
前記、171ページに引用される）、並びに全ての栄養胞子菌（mitosporic fungi
）（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。

【００２３】 好ましい態様においては、菌類源は、糸状菌株である。“糸状菌”とは、真菌
門（Eumycota）及び卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawkswor
thなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロー
ス、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁
により特徴付けられる。生長は菌糸の延長によってであり、炭素異化は絶対好気
性である。糸状菌株は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない
：アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオ
バシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバ
シジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola
）、マグナポルス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myce
liophthora）、ネオカリマスチクス（Neicakkunastux）、ネウロスポラ（Neuros
pora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピ
ロミセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Tala
romyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリ
ポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）。

【００２４】 より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列
が、アスペルギラスの株、例えばA.アワモリ（A. awamori）又はA.ニジュランス
（A. nidulans）から得られる。さらにより好ましくは、核酸配列、例えば配列
番号１で示される核酸配列が、A.ニガー（A. niger）の株の単離物、すなわちDS
M12298から得られ、又は配列番号48に示す核酸配列が、A.オリザエ（A. oryzae
）IFO4177から得られる。

【００２５】 もう１つのより好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードす
る核酸配列は、フサリウムの株、例えばF.オキシスポラム（F. oxysporum）から
得られる。好ましくは、前記株は、F. ベネナタム（F. venenatum）の株（Niren
berg sp. nov.）である。 もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核
酸配列は、酵母株、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyverom
yces）、シゾサッカロミセス（Schixosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowi
a）株から得られる。好ましくは、前記株は、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア
（Pichia）又はサッカロミセス（Saccharomyces）の株である。

【００２６】 前述の短いに関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学
的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、
包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解
するであろう。例えば、ポリペプチドは、Raper, k.D. and Fennel, D.I. (1965
. The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore MD) により定義さ
れるように、アスペルギラスの分類学的同等物である微生物から、それらが知ら
れている種名称にかかわらず、得られる。アスペルギラスは、小柄又は鉢状態と
して種々に言及される、同時に形成される特殊化された細胞、及び分生子として
言及される、無性生殖的に形成された胞子の１又は２つの層を担持する小嚢で終
結する既知のテレオモルフ状態を有さない分生子柄から構成されるアスペルギラ
スにより特徴づけられる栄養胞子菌類である。アスペルギラスの既知のテレオモ
ルフは、ユーロチウム（Eurotium）、ネオサルトリヤ（Neosartorya）及びエメ
リセラ（Emericella）を包含する。アスペルギラスの株及びそのテレオモルフは
、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Coll
ection (AtCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm
bH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), 及びAgricultural R
esearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Ce
nter (NRRL)。

【００２７】 さらに、そのような転写活性化因子は、他の源、例えば天然源（例えば、土壌
、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され
、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良
く知られている。次に、核酸配列は、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブ
ラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。転写活性化因子
をコードする核酸配列がプローブにより検出されると、配列は当業者に知られて
いる技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J.
Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A La
boratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor, New York を参照のこと）
。

【００２８】 もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、転写活性化活性
を有する、配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド
又はそのフラグメントをコードする。 もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、配列番号３のア
ミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする。

【００２９】 本発明はまた、菌類における転写活性化因子であるポリペプチドフラグメント
をコードする、配列番号１又は配列番号48に示される核酸配列又はその相補鎖、
又は配列番号１又は配列番号48の対立遺伝子変異体及び副配列と同じ条件下でハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブに、低ストリンジェント条件、よ
り好ましくは中ストリンジェント条件、及び最も好ましくは高ストリンジェント
条件下で、上記の標準サザンブロット方法（例えば、Sambrook, など., 1989,
前記）を用いてハイブリダイズする、本発明の転写活性化因子をコードする単離
された核酸配列にも関する。

【００３０】 もう１つのさらに好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含
まれるプラスミドpEESに含まれるDNA結合活性を有するポリペプチドをコードす
る核酸配列である。 核酸構造体： 本発明のもう1つの観点は、適切な発現宿主における転写活性化因子の生成を
指令する１以上の制御配列に操作可能的に（作用可能な状態で）連結される本発
明の転写活性因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体に関する。好ま
しい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに
含まれるポリペプチドをコードするか、又は配列番号49に示すポリペプチドをコ
ードする配列番号48に示す核酸配列である。

【００３１】 発現は、ポリペプチドの生成に関与する次のいずれかの段階を包含することが
理解されているが、但しそれらだけには限定されない：転写、後−転写修飾、翻
訳、後−翻訳修飾及び分泌。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプチドをコー
ドする核酸配列の操作が、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要であ
る。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業者においてよく知
られている。

【００３２】 “核酸構造体”は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在
しない態様で組み合わされ、そして並置される核酸のゼグメントを含むよう修飾
されている、一本鎖又は二本鎖の核酸分子として、本明細書において定義される
。用語“核酸構造体”とは、その核酸構造体がコード配列の発現のために必要と
されるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カッセト”と類似語である。用
語“コード配列”とは、本明細書において使用される場合、mRNAに転写され、そ
して本発明の転写活性化因子に翻訳される配列である。コード配列の境界は一般
的に、mRNAの5’末端でのATG開始コドン、及びmRNAの3’末端での読み取り枠の
すぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、
DNA、cDNA及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない
。

【００３３】 用語“制御配列”は、ポリペプチドの発現のために必要であるか又はそのため
に好都合であるすべての成分を含むよう本明細書においては定義される。個々の
制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものでも外来性
のものでもあり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、
プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含
するが、但しそれらだけには限定されない。最少、制御配列はプロモーター、及
び転写及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核
酸配列コード領域と共に、制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入する
ためにリンカーと共に提供され得る。用語“操作可能に（作用可能な状態で）連
結される”とは、制御配列がポリペプチドの生成を方向づけるように、DNA配列
のコード配列に対する位置で適切に配置される配置として、本明細書においては
定義される。

【００３４】 制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主
細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチド
の発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異、切断された及び
ハイブリッドプロモーターを包含する、細胞において転写活性を示すいずれかの
核酸配列であり得、そして細胞に対して相同の又は非相同の細胞外又は細胞内ポ
リペプチドをコードする遺伝子から得られる。

【００３５】 制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するた
めに糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポ
リペプチドをコードする核酸配列の3’末端に操作可能的に連結される。細胞に
おいて機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る
。

【００３６】 糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTA
KAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニ
ジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダ
ーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼをコードす
る遺伝子から得られる。

【００３７】 制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち糸状菌細胞による翻訳のため
に重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドを
コードする核酸配列の5’末端に操作可能的に連結される。細胞において機能的
であるいずれかのリーダー配列が本発明において使用され得る。 糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミ
ラーゼ及びアスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼをコー
ドする遺伝子から得られる。

【００３８】 制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に操作可
能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基
を付加するためにシグナルとして糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る
。細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が本発明において使
用され得る。

【００３９】 糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザ
エTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス
・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グル
コシダーゼをコードする遺伝子から得られる。 制御配列はまた、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路中に振り向ける
ことができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする
、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’末端
は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取
り枠を整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に
含むことができる。他方では、コード配列の5’末端は、そのコード配列に対し
て外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。外来性シグナ
ルペプチドコード領域は、そのコード配列が通常、シグナルペプチドコード領域
を含まない場合に必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域
は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコー
ド領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペ
ルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、又はリゾムコル種か
らのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、糸状菌細
胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプ
チドコード領域が、本発明において使用され得る。

【００４０】 糸状菌細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス
−オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝
子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はヒューミ
コラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域で
ある。

【００４１】 制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ酸末端に位置するアミノ酸配列をコー
ドするプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵
素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られる。プロ
ポリペプチドは一般的に、不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペ
プチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。プ
ロペプチドコード領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ
遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子から得られる（WO
95/33836号）。

【００４２】 シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に
存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そ
してシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。 発現ベクター： 本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳終止シグ
ナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列
は、１又は複数の便利な制御部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成
するために一緒に連結され得、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸
配列の挿入又は置換が可能にされ得る。他方では、ポリペプチドをコードする核
酸配列は、前記配列又はその配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切
なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場
合、コード配列はベクターに位置し、その結果、そのコード配列は発現及びたぶ
ん分泌のための適切な制御配列と操作可能的に連結される。

【００４３】 組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そしてポリペ
プチドをコードする核酸配列の発現を引き起こすことができるいずれかのベクタ
ー（例えば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的に
は、ベクターが挿入される糸状菌細胞とベクターとの適合性に依存するであろう
。ベクターは線状又は閉環プラスミドであり得る。ベクターは自己複製するベク
ター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外実在物として存在
するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体で
あり得る。ベクターは、自己複製を確保するためのいずれかの手段を含むことが
できる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組
み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであ
り得る。ベクターシステムは、糸状菌細胞のゲノム中に導入される完全なDNA又
はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベ
クター又はプラスミドであり得る。

【００４４】 ベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１以上
の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウィルス耐
性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、及び同様のものを提供
する遺伝子である。糸状菌細胞への使用のための選択マーカーは、amdS（アセト
アミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホ
スフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホ
トランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−5’−
リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）及びtrpC
（アントラニル酸シンターゼ）、並びに他の種からの同等物を包含する群から選
択され得る。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのam
dS及びpyrG遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、
アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。

【００４５】 ベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、
又は細胞のゲノムに関係なく細胞におけるベクターの自己複製を可能にする要素
を含む。 宿主細胞： 本発明のもう１つの観点は、本発明の核酸構造体又は発現ベクターを含んで成
る宿主細胞に関する。

【００４６】 本発明の方法における宿主細胞の選択は、興味あるポリペプチドをコードする
核酸配列の源に、かなりの程度、依存するであろう。 糸状菌細胞中への発現ベクター又は核酸構造体の導入は、プロトプラスト形成
、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体既知の態様での細胞壁の差異性から
成る方法を包含することができる。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための
適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023及びYeltonなど., 1984, Proceedings o
f the National of sciences USA 81: 1470-1474に記載される。フサリウム種を
形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene 78; 147-156,
及びWO96/00787号により記載される。

【００４７】 “導入”とは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクターを糸
状菌細胞中に導入することを意味し、その結果、前記ベクターは染色体組み込み
体として、又は自己複製染色体ベクターとして維持される。組み込みは一般的に
、核酸配列が細胞中に安定して維持される場合、好都合であると思われる。染色
体中へのベクターの組み込みは、相同組換え、非相同組換え又はトランスポジシ
ョンにより起こる。

【００４８】 宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組
換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリ
ペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、
ベクターは、糸状菌細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するた
めの追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体におけ
る正確な位置でのゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置で
の組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの
可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、た
とえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ま
しくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲ
ノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。それらの核酸配
列は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得
、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得る。

【００４９】 自律複製のためには、ベクターはさらに、宿主細胞におけるベクターの自律的
複製を可能にする複製の起点を含むことができる。 組換え発現ベクターを構成するために本明細書に記載される要素を連結するた
めに使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、 Sambrook,など
., を参照のこと）。

【００５０】 好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラ
ス、フサリウム、ヒューミコラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニ
シリウム、チエラビア、トリポクラジウム又はトリコダーマの種の細胞であるが
、但しそれらだけには限定されない。 より好ましい態様においては、糸状菌細胞はアスペルギラス細胞である。もう
１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はアクレモニウム細胞である。
もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はフサリウム細胞である。
もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はヒューミコラ細胞である
。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はムコル細胞である。も
う１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はミセリオプソラ細胞である
。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はネウロスポラ細胞であ
る。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はペニシリウム細胞で
ある。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はチエラビア細胞で
ある。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリポクラジウム
細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリコダー
マ細胞である。

【００５１】 最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ
（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidu
s）、アスペルギラス・ジャポニカ（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス
・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergil
lus niger）又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である
。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バ
クトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusa
rium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense
）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネア
ラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum
）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネ
グンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxyspor
um）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロ
ゼウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum
）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スル
フレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulo
seam）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）又は
フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）細胞である。さらに最も好まし
い態様においては、糸状菌親細胞は、フサリウム・ベネナタム（Nirenberg sp.
nov.）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ヒ
ューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はヒューミコラ・ラヌギノ
サ（Humicola lanuginosa）である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸
状菌宿主細胞は、ムコル・ミエヘイ（Mucor meihei）細胞である。もう1つの最
も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィリ
ア（Myceliopthora thermophilum）細胞である。もう1つの最も好ましい態様に
おいては、糸状菌宿主細胞は、ネウロスポラ・クラサ（Neurospona crassa）細
胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ペニシ
リウム・プルプロゲナム（Penicillium Purpurogenum）細胞である。もう1つの
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレストリス（
Thielavia terrestris）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、
トリコダーマ細胞は、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）
、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンジブ
ラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセイ（Trichod
erma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。

【００５２】 転写活性化活性を有するポリペプチド： 本発明のもう１つの観点は， （ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列、（ii）その相補的鎖，又
は（iii）転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列
番号１又は配列番号48の副配列に、低ストリンジェント条件下でハイブリダイズ
する核酸配列にコードされるポリペプチド、ここで前記低ストリンジェント条件
は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA
及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイ
ブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSに
おける50℃での30間により定義され； （ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
有するアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｃ）（ａ）又は（ｂ)の対立遺伝子変異体； （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント、ここで前記フラグメントは
転写活性化活性を有し；及び （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又はその対立遺
伝子変異体から成る群から選択された、単離されたポリペプチドに関する。

【００５３】 転写活性化因子は、本明細書に記載されるような技法を用いて単離され得る。
本明細書において定義されるように、“単離された”ポリペプチドは、他のポリ
ペプチドを実質的に有さない、例えばSDS−PAGEにより測定される場合、少なく
とも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％
の純度、さらにより好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度及び
さらに最も好ましくは約95％の純度であるポリペプチドである。

【００５４】 本発明はまた、転写活性化活性を有する配列番号２又は配列番号49のアミノ酸
配列に対して、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約55％、好ましくは少
なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約70％、
好ましくは少なくとも約75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少な
くとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なく
とも約95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％、さらにより好ましく
は少なくとも99％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリ
ペプチドにも関する。

【００５５】 より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、配列番号２又は配
列番号49のアミノ酸配列、又は転写活性化活性を保持するそのフラグメントを含
んで成る。最も好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号２又は配列番
号49のアミノ酸配列を有する。配列番号２又は配列番号49のフラグメントは、こ
のアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシ末端から欠失された１又は複数の
アミノ酸を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号２又は配列番号49
のフラグメントは、配列番号３に示されるポリペプチド配列を少なくとも含む。

【００５６】 相同ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠
失、及び/又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換に
より、配列番号２又は配列番号49又は配列番号３のアミノ酸配列又はその成熟ポ
リペプチドと異なることができる。好ましくは、アミノ酸変更は、マイナーな性
質のもの、すなわちタンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼ
さない保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小
さなアミノ−又はカルボキシ−末端−、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基
の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷
又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメイ
ンを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。

【００５７】 保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、
酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン
及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、
芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さ
なアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグル
ープ内である。一般的に、非活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知
られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill（1979, The Proteins
, Academic Press, New York）により記載されている。最も通常生じる交換は次
のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser
/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Le
u/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly並びにそれらの逆。

【００５８】 より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、アスペルギラス・
ニガー株、より好ましくはアスペルギラス・ニガーAB4.1（van Haringsveldt, W
.,など., 1987, Mol. Gen. Genet. 206: 71-75）、及び最も好ましくはDSM12298
としてDSMに寄託されているアスペルギラス・ニガー13PAP2，又はその変異体株
（配列番号２又は配列番号49又は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを有する）から得られる。

【００５９】 もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、E.コリDSM1
2294に含まれるプラスミドpEESに含まれる核酸配列、又は配列番号49に示すポリ
ペプチドをコードする配列番号48に示す核酸配列にコードされるポリペプチドで
ある。 本発明はさらに、（ａ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含ん
で成る核酸構造体又は発現ベクターを有する宿主細胞を、ポリペプチドの生成の
助けとなる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含
んで成る、本発明の転写活性化因子を生成するための方法に関する。 変更された転写活性化活性を有する宿主細胞： 本発明のもう１つの観点は、ポリペプチドの生成のために有用な親菌類細胞の
変異体である宿主細胞に関し、個々で前記親細胞はプロテアーゼをコードする１
又は複数の核酸配列を含んで成り、その転写が本発明の転写活性化因子により活
性化され、そして変異体細胞は、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりも低
く転写活性化因子及びプロテアーゼを生成する。

【００６０】 突然変異体細胞は、当業界においてよく知られている方法を用いて、例えば転
写活性化因子をコードする遺伝子の１又は複数のヌクレオチド挿入又は欠失によ
り構成され得る。 好ましい態様においては、変異体細胞は、細胞に存在し、そして転写活性化因
子の発現のために必要な核酸配列の修飾又は不活性化により得られる。

【００６１】 さらに好ましい態様においては、核酸配列は、（ａ）配列番号１又は配列番号
48の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；（ｂ）配列番号２又は
配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有する
ポリペプチドをコードする核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の
核酸配列、又は（ii）その相補的鎖と、低ストリンジェント条件下でハイブリダ
イズする核酸配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；（ｅ
）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化
活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び（ｆ）（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択される。

【００６２】 もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞における転写活性化因子の低
められた発現は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制御配列の修飾又
は不活性化により得られる。用語“制御配列”は、“核酸構造体”のセクション
において定義されている。より好ましい態様においては、変異体細胞における制
御配列は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわち核酸配列の発現に影
響を及ぼすのに十分である部分である。可能性ある修飾のための他の配列は、リ
ーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列及び転写ターミ
ネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００６３】 遺伝子の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にゆだね、そして遺伝子
の発現が低められるか又は排除されている変異体細胞についてスクリーンするこ
とによって行われ得る。特異的であるか又はランダムであり得る突然変異誘発は
、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオ
チドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることに
よって行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれ
かの組み合わせの使用により行われ得る。

【００６４】 本発明のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外（UV）線
、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNN
G）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS
）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。 そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異
誘発剤の存在下で突然変異誘発される親細胞を、適切な条件下でインキュベート
し、そして低められた又は遺伝子の発現を示すか又は発現を示さない変異体細胞
について選択することによって行われる。

【００６５】 遺伝子の修飾又は不活性化はまた、遺伝子における１又は複数のヌクレオチド
、又はその転写又は翻訳のために必要とされる調節要素の挿入、置換又は除去に
より達成され得る。たとえば、ヌクレオチドが、停止コドンの導入、開始コドン
の除去又は読み取り枠の変更をもたらすために、挿入され又は除去され得る。そ
のような修飾又は不活性化は、当業界において知られている方法に従って、特定
部位の突然変異誘発又はPCR生成突然変異誘発により達成され得る。原則的に、
修飾はインビボで、すなわち修飾される遺伝子を発現する細胞に対して直接的に
行われ得るが、好ましくは、修飾は下記に例示されるように、インビトロで行わ
れ得る。

【００６６】 選択の糸状菌細胞により上記遺伝子を不活性化するか又はその発現を低下させ
る便利な手段の例は、遺伝子置換又は遺伝子破壊の技法に基づかれている。たと
えば、遺伝子破壊方法においては、興味ある内因性遺伝子又は遺伝子フラグメン
トに対応する核酸配列が、欠陥遺伝子を生成するために、親細胞中に形質転換さ
れる欠陥核酸配列の生成のためにインビトロで突然変異誘発される。相同組換え
により、欠陥核酸配列により、内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントが置換され
る。所望には、欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントはまた、核酸配列が修飾され
ているか又は破壊されている形質転換体の選択のために使用され得るマーカーを
コードする。

【００６７】 他方では、遺伝子の修飾又は不活性化は、遺伝子の核酸配列に対して相補的な
ヌクレオチド配列を用いて、確立されているアンチセンス技法により行われ得る
。より特定には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞において転写され得、
そして細胞において生成されるmRNAに対してハイブリダイズすることができる、
遺伝子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、
低められるか又は排除され得る。相補的アンチセンスヌクレオチド配列のmRNAへ
のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量が
低められるか、又は排除される。

【００６８】 配列番号１又は配列番号48の核酸配列に対して相補的な核酸配列は、いずれか
の微生物源から得られる。好ましい源は、菌類源、例えば上記のような酵母及び
糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペル
ギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）
、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Mucor）、ネウロスポラ（Neuro
spora）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、
チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダー
マ（Trichoderma）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ま
しい酵母源は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミ
セス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）
、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）及びヤロウィア（Yarrowia）の
種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらに、核酸配列は、糸状
菌細胞に対して生来のものであり得る。

【００６９】 もう１つの好ましい態様においては、親細胞は、配列番号２又は配列番号49の
アミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードする核酸配列を有する遺伝子を含む。 他の好ましい態様においては、親細胞は、配列番号１又は配列番号48の核酸配
列と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を有する遺伝子を宿す。 もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞は、上記方法のいずれかによ
り修飾されているか又は不活性化されている核酸を有し、そして同一の条件下で
培養される場合、親細胞よりも低く、プロテアーゼ又はその組み合わせを生成す
る。変異体細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも、好ましくは
少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少
なくとも約75％、及びさらにより好ましくは少なくとも約95%低く、プロテアー
ゼ又はその組み合わせを生成する。

【００７０】 さらにより好ましい態様においては、変異体細胞は、同一の条件下で培養され
る場合、親細胞よりも実質的に検出できない量のプロテアーゼ又はその組み合わ
せを生成する。 プロテアーゼは、既知方法を用いてアッセイされ得る。そのような方法におい
ては、48時間の培養培地のアリコートが³H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビ
ンと共にpH4.0でインキュベートされ、そしてTCA−可溶性画分における放射能が
測定される（van Noort, J.M., など., 1991. Anal. Biochem 198:385-390）。
他の方法は、例えばA.ニガーのアスパラギン酸プロテイナーゼA（Takahashi, K.
, 1991, Meth. In Enzymol. 248: 146-155）、エンドペプチダーゼ（Morihara,
k., 1995. Meth. In Enzymol. 248: 242-253）、カルボキシペプチダーゼ（Remi
nton, J., and Breddam, X., 1994. Meth. In Enzymol. 244: 231-248）、ジペ
プチジルペプチダーゼ（Ikehara, Y., など., 244: 125-227）及びアミノペプチ
ダーゼ（Little, G., など., 1976. Meth. In Engymol. 45: 495-503）を同定す
るために記載されている。

【００７１】 もう1つの好ましい態様においては、変異体細胞は、着目のポリペプチドをコ
ードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。 本発明のもう1つの観点は、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成
のために有用な宿主細胞に関し、ここで前記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養
される場合、親細胞に比較して、本発明の転写活性化因子をより多く生成し；そ
して（ｂ）その転写が前記転写活性化因子により活性化されるポリペプチドをコ
ードするDNA配列を含んで成る。

【００７２】 好ましい態様においては、宿主細胞は、（ｉ）転写活性化因子をコードする核
酸配列、（ii）転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体、
又は（iii）“発現ベクター”のセクションにおいて定義されたような発現ベク
ターの１又は複数のコピーを、親細胞中に導入することによって、同じ条件下で
培養される場合、親細胞よりも転写活性化因子をより生成する。

【００７３】 本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体はまた
、ポリペプチドの発現を方向づけるために好都合である１又は複数の因子、例え
ば転写活性化因子（例えば、トランス−作用因子）、シャペローン（chaperone
）及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで
成る。選択の糸状菌細胞において機能的であるいずれかの因子が本発明において
使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、ポリペプチドを
コードする核酸と必ずしも一列に並んで存在する必要はない。

【００７４】 活性化因子は、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパ
ク質である（Kudla など., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai and Buxt
on, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297
）。活性化因子をコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエヘム活
性化因子タンパク質（hap1）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトース代謝
タンパク質４（gal4）、アスペルギラス・ニジュランスアンモニア調節タンパク
質（areA）及びアスペルギラス・オリザエα−アミラーゼ活性因子 (amyR) をコ
ードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Verdier, 1990, 前記、
及びMackenzie など., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-230
7を参照のこと）。

【００７５】 シャペローンは、もう１つのポリペプチドの適切な折りたたみ（folding）を
助けるタンパク質である (Hartl など., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron など
., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder など., 1994, Journal of Biotechnolog
y 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook
, 1992, Nature 355: 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological
Chemistry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 151
5-11157; Robinson など., 1994, Bio/Technology 1: 381-384; Jacobs など.,
1993, Molecular Microbiology 8: 957-966)。シャペローンをコードする核酸配
列は、アスペルギラス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はサッ
カロミセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロミセス・セレビシアエBiP/GR
P78, 及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする遺伝子から得られる
。さらなる例のためには、Gething and Sambrook, 1992, 前記、及びHartl など
., 1994, 前掲を参照のこと。

【００７６】 プロセッシングプロテアーゼは、生化学的に活性な成熟ポリペプチドを生成す
るためにプロペプチドを分解するプロテアーゼである（Enderlin and Ogrydziak
, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller など., 1989, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius など., 1984, Cell 37: 107
5-1089; Julius など., 1983, Cell 32: 839-852; 米国特許第5,702,934号）。
プロセッシングプレテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビ
シアエジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセス・セレビシアエKex2,
ヤロウェア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）ニ塩基性プロセッシングエン
ドプロテアーゼ（xpr6）及びフサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum
）メタロプロテアーゼ（p45遺伝子）をコードする遺伝子から得られる。

【００７７】 より好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は、親細
胞のその対応するプロモーターよりも強いプロモーター又はその機能的部分に操
作可能的に連結される。さらにより好ましい態様においては、プロモーター又は
その機能的部分は、細胞外プロテアーゼ、例えばアスペルギラス・オリザエアル
カリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエ中性メタロプロテアーゼ、アスペ
ルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテアーゼ、フサリウム・オキシスポ
ラムトリプシン−様プロテアーゼ又はフサリウム・ベネナタムトリプシンをコー
ドする遺伝子の発現を仲介する。

【００７８】 本発明はまた、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成のために有用
な宿主細胞にも関し、ここで前記変異体は、 ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及び ｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連結
される誘導プロモーター、及び（ii）前記ポリペプチドをコードする核酸配列に
操作可能的に結合された、それに前記転写活性化因子が結合することができると
ころのプロモーター配列（ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入さ
れ得る）を含んで成る。

【００７９】 上記（ａ）における転写活性化因子の不活性形は、前記のいずれかの方法に従
って、細胞に存在し、そして生来の転写活性化因子の発現のために必要な核酸配
列の不活性化又は修飾により得られる。好ましい態様においては、不活性化又は
修飾は、１又は複数のヌクレオチド挿入、欠失又は置換、特異的又はランダム突
然変異誘発又は遺伝子中断、及び転写活性化因子の核酸配列に対して相補的なヌ
クレオチド配列を用いてのアンチセンス技法を包含する（但し、それらだけには
限定されない）方法により得られる。もう１つの好ましい態様においては、生来
の転写活性化因子の不活性形は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制
御配列の不活性化又は修飾により得られる。

【００８０】 もう１つの好ましい態様においては、生来の転写活性化因子をコードする核酸
配列は、配列番号１又は配列番号48に示される配列を有する。もう1つの好まし
い態様においては、転写活性化因子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを含んで成る。 上記（ｂ）における誘発性プロモーター配列は、プロモーターの転写開始活性
が発酵条件に従って誘発され得るいずれかのプロモーター配列又はその機能的部
分であり得る。好ましくは、誘発は炭素又は窒素代謝物により仲介される。好ま
しい態様においては、プロモーターは、アスペルギラス・ニジュランス又はアス
ペルギラス・オリザエのamdSプロモーター、アスペルギラス・ニジュランス、ア
スペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーのniaD7プロモーター、ア
スペルギラス種のniiAプロモーター、アスペルギラス種のアルカリホスファター
ゼプロモーター、アスペルギラス種の酸性ホスファターゼプロモーター、又はア
スペルギラス・ニガーのalcAプロモーターである。

【００８１】 もう1つの好ましい態様においては、宿主細胞はさらに、プロモーター配列を
含んで成り、ここで前記プロモーターは転写活性化因子により活性化され、そし
てポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に連結される。 本発明の転写活性化因子により活性化されるプロモーター配列は、アスペルギ
ラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイ
ナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー
酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモ
リグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス
・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸
イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺
伝子から得られるプロモーター、NA2−tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガ
ー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びそれらの変
異体、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する（但し、それらだけ
には限定されない）群から選択されたいずれかのプロモーター、又はその機能的
部分であり得る。糸状菌細胞に使用するための特に好ましいプロモーターは、プ
ロテアーゼ遺伝子、例えばフサリウム・オキシスポラムメリプシン−様プロテア
ーゼ遺伝子（米国特許第4,288,627号）、アスペルギラス・オリザエアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子（alp）、アスペルギラス・ニガーpacA遺伝子、アスペルギラ
ス・オリザエアルカリプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・オリザエ中性メタ
ロプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテア
ーゼ遺伝子、又はフサリウム・ベネナタムトリプシン遺伝子からのプロモーター
、又はその機能的部分である。

【００８２】 もう１つの好ましい態様においては、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする
核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。 もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子を発現する宿主
細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも１又は複数の生来のプロ
テアーゼを少なく生成する。プロテアーゼは、上記方法のいずれかを用いてアッ
セイされ得る。より好ましい態様においては、48時間培養培地からのアリコート
が³H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンと共にpH4.0でインキュベートされ
、そしてTCA−可溶性画分における放射能が測定される（van Noort, J.M., など
., 前掲）。

【００８３】 本明細書に記載される核酸構造体は、ポリペプチドの生成のために有用な宿主
細胞を得るために、“宿主細胞”のセクションに記載のような方法のいずれかに
従って、親菌類細胞中に導入され得る。好ましい態様においては、核酸構造体は
細胞の染色体中に組み込まれる。もう1つの好ましい態様においては、核酸構造
体は、自己複製染色体外ベクターとして維持される。

【００８４】 本発明の方法が、変異体菌類細胞を得るために特定の順序に制限されないこと
は理解されるであろう。第２核酸配列の修飾は、ポリペプチドの生成のために細
胞の構成におけるいずれかの段階で親細胞中に導入され得る。 ポリペプチドの生成： 本発明のもう１つの観点は、（ａ）ポリペプチドをコードする遺伝子を有する
宿主細胞を、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養し：そし
て（ｂ）前記宿主細胞の栄養培地からポリペプチドを回収することを含んで成る
、本発明の宿主細胞におけるポリペプチドを生成するための方法に関する。

【００８５】 １つの態様においては、その転写が本発明の転写活性化因子により活性化され
るプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る親菌類細胞の変
異体である宿主細胞に関し、そして前記変異体細胞は、同じ条件下で培養される
場合、親細胞によりも転写活性化因子及びプロテアーゼを低く生成する。 もう１つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前
記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、本発明の
転写活性化因子をより生成し；そして（ｂ）ポリペプチドをコードするDNA配列
を含んで成り、その転写は本発明の転写活性化因子により活性化される。

【００８６】 もう1つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前
記変異体は、ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、
及びｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連
結される誘導プロモーター、及び（ii）前記転写活性化因子が前記ポリペプチド
をコードする核酸配列に操作可能的に結合することができるプロモーター配列（
ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る）を含んで成る。

【００８７】 本発明の宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて、興味あるポ
リペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は
、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする適切な培地において、及び条
件下で行われる実験用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又
は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固相発酵を包含する）により培
養される。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源
、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行われる（例えば、Bennett,
J.W. and LaSure, L., eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic P
ress, CA, 1991を参照のこと）。適切な培地は、市販されており、又は公開され
た組成物（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）
を用いて調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプ
チドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それ
は細胞溶解物から回収される。

【００８８】 得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により単離され得
る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、抽出、スプレード
ライ、蒸発又は沈殿により、栄養培地から単離され得る。次に単離されたポリペ
プチドはさらに、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラ
フィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサ
イズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、溶解度差による
分別（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（但し、それらだけには限定
されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson
and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 を参照のこと）
。

【００８９】 ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知
られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、酵素
生成物の形成、酵素基質の消出又はSDS−PAGEの使用を包含することができる。
例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。
多くの酵素についての酵素活性を決定するための方法は、当業界において知られ
ている。

【００９０】 本発明の方法においては、宿主細胞は、同じ条件下で培養される場合、対応す
る親細胞よりも、少なくとも約20％多く、好ましくは少なくとも約50％多く、よ
り好ましくは少なくとも約100％多く、さらにより好ましくは少なくとも約200％
多く、そして最も好ましくは少なくとも約300％多く、ポリペプチドを生成する
。

【００９１】 ポリペプチドは、変異体糸状菌細胞に対して天然のものでも、又は異種のもの
でも、いずれのポリペプチドでもあり得る。用語“異種ポリペプチド”とは、細
胞により生成されないポリペプチドとして、本明細書において定義される。用語
“ポリペプチド”は、特定の長さのコードされた生成物の言及を意味せず、そし
て従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。ポリペプチド
はまた、ポリペプチドの生成に関与する、核酸配列に対して外来性の１又は複数
の制御配列を含んで成る核酸配列によりコードされる、細胞に対して生来のポリ
ペプチドである組換えポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、野生型ポリペ
プチド又はその変異体であり得る。ポリペプチドはまた、１又は複数のポリペプ
チドが細胞に対して異種である、少なくととも２つの異なったポリペプチドから
得られる部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含むハイブリッドポリ
ペプチドでもあり得る。ポリペプチドはさらに、上記ポリペプチドの天然に存在
する対立遺伝子及び構築されたバリエーションを包含する。

【００９２】 好ましい態様においては、ポリペプチドは、抗体又はその部分、抗原、血餠因
子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその部分、調節タンパク質
、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である。 より好ましい態様においては、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェ
ラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。

【００９３】 さらにより好ましい態様においては、酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラー
ゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キ
チナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステ
ラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α
−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーター
ゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペク
チン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、
タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナ
ーゼである。

【００９４】 もう１つのさらにより好ましい態様においては、ポリペプチドは、ヒトインス
リン又はその類似体、ヒト成長ホルモン、エリトロポエチン又はインスリノトロ
ピンである。 異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核、真核又は他の源
から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関
して本明細書においては使用される場合、ポリペプチドがその源により、又はそ
の源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろ
う。

【００９５】 本発明の方法においては、変異体糸状菌細胞はまた、その細胞に対して天然の
あるポリペプチドの組換え生成のためにも使用され得る。天然ポリペプチドは、
ポリペプチドの発現を増強するために、シグナル配列の使用により、興味ある生
来のポリペプチドの細胞外への輸送を促進するために、及び細胞により通常生成
されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を高めるために、異なったプ
ロモーターの制御下でポリペプチドをコードする遺伝子を置換することによって
、組換え的に生成され得る。本発明はまた、細胞に対して生来であるポリペプチ
ドのそのような組換え生成を、そのような発現が、細胞に対して天然ではない遺
伝子要素の使用、又は糸状菌細胞に通常存在しない状態で機能するよう操作され
ている生来の要素の使用を包含する程度まで、用語“異種ポリペプチド”の範囲
内に包含する。異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン
化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDN
Aからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのよう
なゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメ
ラーゼ鎖反応（PCR）を用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど
., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Pre
ss, New York を参照のこと。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする
核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、前記フラグメン
トのベクターへの挿入、及び核酸配列の複数のコピー又はクローンが置換される
であろう変異体菌類細胞への前記組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配
列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの
組み合わせのものであり得る。

【００９６】 本発明の方法においては、異種ポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチド
が前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている融
合された又はハイブリッドポリペプチドも包含することができる。融合されたポ
リペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、
他のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによっ
て生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知ら
れており、そしてポリペプチドをコードする配列を、それらが整合して存在し、
そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの
制御下にあるよう、連結することを包含する。ハイブリッドポリペプチドは、少
なくとも２種の異なったポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド
配列の組み合わせを含んで成り、ここで１又は複数のポリペプチドは、変異体菌
類細胞に対して異種であり得る。興味ある異種ポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得
る。発現は、ポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階、例えば転写、後−
転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）
を包含することが理解されるであろう。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプ
チドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又
は必要である。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業界にお
いて良く知られている。

【００９７】 本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定
するものではない。

【００９８】 実施例 実施例： 材料： 緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製
品であった。 株： AB4.1：株ATCC9029のcspA pyrG1誘導体であるアスペルギラス・ニガーの株（v
an Hartingsveldt, W., など., 1987. Mol. Gen. Genet. 206: 71-75; Bos, C.J
., など., Curr. Genet. 14: 437-443）。

【００９９】 AB1.13: AB4.1のUV突然変異誘発に由来するアスペルギラス・ニガーのプロテ
アーゼ欠失株（Mattern, I.E., など., 1992. Mol. Gen. Genet. 234: 332-336
）。 13PAP2：A.ニガーのpepAプロモーター（Jarai G. and Buxton F. 1994. Curr.
Genet. 26: 238-244）の制御下で、A. ニジュランスamdS遺伝子（Corrick, R.
A., など., 1987. Gene 53: 63-71）の複数コピーを含むAB1.13誘導体。この株
は、プロテアーゼ欠失表現型を有し、そして単一の窒素源としてアセトアミドを
含む培地上で増殖することができない。株13PAP2は、DSM No.12298としてDSMに
寄託されている。

【０１００】 4PAP6：A.ニガーのpepA プロモーターの制御下でA. ニジュランスandS 遺伝子
の複数コピーを含むAB4.1誘導体。前記株は、プロテアーゼ欠失表現型を有さず
、そして単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上で増殖することができる
。 N402：ATCC No.64974としてATCC (Manassas VA, USA) に寄託されているアス
ペルギラス・ニガーの株。

【０１０１】 MC1046：ATCC No.35467としてATCCに寄託されているE.コリの株。 A. oryzae IFO4177：Institute for Fermentation, Osaka; 17-25 Juso Hamma
chi 2-chome Yodogawa-ku, Osaka, Japanから入手可能である。 HowB101：WO97/35956中に記載されている。 プラスミド： pPAP: 下記実施例１に記載され、そして図１に示されるようにして構成される
。 PAopyrGcosArp1: 下記実施例１に記載され、そして図２に示されるようにして
構成される。

【０１０２】 pEES1: 下記実施例１に記載され、そして図３に示されるようにして構成され
る。 p3SR2: C.M. Corrick, A.P. Twomey, and M. J. Hynes (1987. Gene 53: 63-7
1) により記載されるように、A. ニジュランスamdS 遺伝子を含む。 pABPYRG^*−Not：Verdoes, J.C., など. (1994. Gene 145: 179-187) により記
載されるように、不活性化されたpyrG遺伝子を含む。

【０１０３】 pHelp1：Gems, D., など. (1991. Gene 98: 61-67) により記載されるように
、選択マーカーとしてのA. オリザエからのpyrG遺伝子、及びE.コリベクターpIC
20R中にクローン化された、A.ニガーにおいて自己複製できるAMA１配列を含む。 pAnscos1：Osiewacz, H.D. (1994, Curr. Genet. 26: 87-90) により記載され
るように、２個のcos部位を含む。

【０１０４】 pAO4−２：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 15
9-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。 pAO4−13：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 15
9-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。 pUC19：Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messig, J. (1985. Gene 33: 1
03-119) により記載の通りである。 pDV8：実施例８に記載され、そして図７に示される。 pJaL554：実施例８に記載され、そして図８に示される。 生物学的材料の寄託 次の生物学的材料を、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkult
uren GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 braunschweig, germanyに、ブダペス
ト条件に基づいて寄託し、そして次に受託番号が付与された： 受託物 受託番号 受託日 エスシェリシア・コリpEES DSM12294 1998-07-14 アスペルギラス・ニガー13PAP2 DSM12298 1998-07-14 菌株は、培養物が、本特許出願の審査中、入手できることを保証する条件下で
寄託された。寄託物は、寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を提供する。寄
託物は、本出願の対象物が出願される国々の外国特許法により必要とされる場合
、利用できる。しかしながら、寄託物の有用性は、政府指令により許される特許
権を損いながら本発明を実施する許可を構成しないことは理解されるべきである
。 実施例 実施例１ A. ニガーからのprtT転写活性化因子のクローニング prtT遺伝子を、13PAP2, すなわちpepA プロテアーゼ遺伝子プロモーターによ
り調節されるamdS遺伝子を発現することができず、そしてプロテアーゼ欠失表現
型（prt^-）を有するA.ニガー変異体株からクローン化した。 A.ニガー13PAP2レポーター株の構成： プラスミドpPA1を、次の３種のフラグメントの連結により構成した： １）EcoR1及びKpnIにより消化されたE.コリベクターpBlueScript II SK (Stra
tagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA); ２）PCRにより増幅された、開始コドン〜内部BamHI部位までの約130bpのamdS
コード配列に連結されるpepA遺伝子の1.2kbプロモーター領域を含む1.4kbのEcoR
I/Bam HI制限フラグメント；及び ３）A.ニジュランスamdS遺伝子のほとんどを含むp3SR2からの2.1kbのBam HI/K
pnI フラグメント。

【０１０５】 フラグメント２を次の２段階で構成した。第１段階においては、下記“コスミ
ドライブラリーの構成”のセクションに記載のようにして、プロトプラストから
調製されたA.ニガーN402からのゲノムDNAを、鋳型として使用し、そして下記に
示される２種のオリゴヌクレオチド、すなわちpepApr 及びpepA/amdSをプライマ
ーとして使用した： pepApr：CGG AAT TCG CAT GCT GGA GGT GCT TCT AA（配列番号６） pepA/amdS：TTC CCA GGA TTG AGG CAT TTT GAC CAC GAG AAT（配列番号７） 次に、この反応から得られる1200bpのPCR生成物を、下記に示されるオリゴヌ
クレオチドMBL1213及び鋳型としてのプラスミドp3SR2と共に、第２PCR反応にお
いてプライマーとして使用した： MBL1213：TAA CTT CCA CCG AGG TC（配列番号８） 続いて、下記の３種のフラグメントの連結により得られる生成物を、E.コリDH
5α中にトランスフェクトした。

【０１０６】 最終構成方法においては、pPA1をNotIにより消化し、pABPYRG^*−Notからの3.8
kbのNotIフラグメントに連結し、図１に示されるプラスミドpPAPをもたらした。
pPAPを用いて、A.ニガーAB1.13を形質転換し、そして複数コピーでpyrG遺伝子座
中に組み込まれたpPAPを有する形質転換体を単離した。pyrG遺伝子により補充さ
れたこの形質転換体の、自発的５フッ素酸（FOA）耐性で、ウリジン−要求性変
異体を、13PAP2と命名した。 pAopyrGcosArp1の構成： プラスミドpAopyrGcosArp1を、次の３種のフラグメントのE.コリDH5α中への
連結及び続くトランスフェクションにより構成した： １）Acc65I及びBamHIにより切断されたE.コリベクターpHelp1； ２）２つのcos部位を含むpAnscos1からの3.0kbのBamHI/HindIIIフラグメント
；及び ３）A.オリザエpyrG遺伝子を含むpAO4-2からの3.2kbのAcc65I/HindIIIフラグ
メント。

【０１０７】 得られるプラスミドpAopyrGcosArp1は、アスペルギラスにおいて自己複製し、
そしてウリジンを欠いている培地上での増殖により選択され得る。PAopyrGcosAr
p1は図２に示される。 コスミドライブラリーの構築： アスペルギラス・ニガーのコスミドライブラリーを、“SuperCas1コスミドベ
クターキット”（Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA）を用いて、
その供給者の説明書に従って構築した。

【０１０８】 A.ニガーN402からのゲノムDNAを、標準の方法により製造されたプロトプラス
トから調製した。 単離の後、プロトプラストを、Beckman GS-6Rにおいて2000rpmでの10分間の遠
心分離によりペレット；次のそのペレットを、22.5mMのトリス−イソナフタレン
スルホン酸、275mMのパラ−アミノサリチル酸、0.2Mのトリス−HCl（pH8.5）、0
.25MのNaCl及び50mMのEDTAを含む緩衝液に懸濁し、すぐに１体積のフェノール/
クロロホルム（１：１）を添加した。注意して混合し、そして3000rpmでの20分
間の遠心分離した後、水性相をデカントし、そしてDNAを標準の方法を用いて沈
殿せしめた。

【０１０９】 ゲノムDNAのサイズを、４℃で30ボルトで20時間、運転される0.3％のアガロー
スゲル上での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染色されたゲルは
、回収されたDNAが50〜100kb以上のサイズの範囲であることを示した。DNAを、M
boIを用いて一部消化した。その消化されたDNAのサイズは、上記と同じタイプの
ゲル分析により決定される場合、30〜50kbであった。QIAGEN（Venlo, The Nethe
rlands）からのキットを用いて、製造業者の説明書に従って精製されたpAopyrGc
osArp1ベクターを、BamHIにより消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製した。
連結及びパッケージングを、標準の方法に従って行った。

【０１１０】 ライブラリーの滴定の後、単一の連結物及びパッケージングからのパッケージ
ング混合物のすべてを、宿主細胞MC1046中にトランスフェクトし、そして50μg/
mlのアンピシリンLBプレート上にプレートした。約40,000のコロニーを得た。10
のコロニーからのコスミド調製物は、それらがすべて、予測されるサイズの挿入
体を有したことを示した。次に、40,000のコロニーを、LB培地にソーキングし、
そしてプレートから剥離し、次に貯蔵のために−80℃で15％グリセロールにアリ
コートした。これは、A.ニガーゲノムの約40倍の増幅を示す。A. niger prtTクローンの選択： コスミドDNAをライブラリーから調製し、そしてP.J. Punt and C.A.M.J.J. Va
n Den Hondel (1992. Methods Enzymol. 216: 447-457) に記載される形質転換
方法に従って、13PAP２中に導入した。pyrG マーカーを選択するための反復され
た努力は、4,000〜30,000の形質転換体の回収をもたらした。pyrGマーカーにつ
いての二重選択、及び単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上での増殖は
、５回の異なった実験から合計65の一次形質転換体をもたらした。

【０１１１】 個々の一次形質転換を、プロテアーゼ活性、単一の窒素源としてアセトアミド
を含む培地上での増殖、及びそれらの２つの特徴の不安定性についてスクリーン
ンした。アセトアミドを含む培地上での増殖によりスクリーンされたアセトアミ
ダーゼ⁺表現型は、pepAプロモーターがamdSコード配列に連結されるレポーター
カセットにおけるpepAプロモーターの活性化に起因するアセトアミダーゼ活性の
表示である。プロテアーゼ⁺表現型を、単一の窒素源として透析された脱脂乳を
含む最少培地プレートを用いてスクリーンした（Mattern, I.E.,など., 1992. M
ol. Gen. Genet. 234: 332-336）。それらのプレート上で、野生型AB4.1株は、
透明な光輪を製造し、そしてAB1.13変異体は非常に小さな後輪を製造する。この
差異は、pepA 欠失株がまた、それらのプレート上で大きな光輪を生成すること
ができるので、pepAの活性にはよらない。従って、脱脂乳プレート上での大きな
光輪は、他の細胞外プロテアーゼの活性化を示す。

【０１１２】 ウリジン含有培地上で、希釈された胞子ストックを増殖することによって不安
定性を試験した。単一の胞子由来のコロニーを、それらのプレートから採取し、
そしてプロテアーゼ活性及びアセトアミド上での増殖について試験した。スクリ
ーニング結果は、70％以上のコロニーにおいて、両特徴が失われたことを示した
。従って、それらの２種の表現型は共に失われたか、又は保持されており、この
ことは、pepAプロモーター及び他のプロテアーゼプロモーターの活性化が調和し
て調節され、そしてpyrGマーカーの存在に連結されることを示唆する。この表現
型を担当する遺伝子は、prtTとして命名された。次に、12種のアセトアミダーゼ ⁺ 、プロテアーゼ⁺形質転換体を単離した。A. niger prtT遺伝子の単離： 13PAP2のアセトアミダーゼ⁺、プロテアーゼ⁺形質転換体からprtT遺伝子を開放
するために、DNAを、前記のようにして最小培地中で増殖された菌糸体から調製
した。このDNAを、コンピテントE.コリDH5ａ細胞を形質転換する試みに使用した
。数百のアンピシリン−耐性コロニーを得た。DNA分析は、それらがすべて、pHe
lp1プラスミドに起因する配列を含んだことを示した。E.コリのコロニーから単
離されたコスミドDNAを用いて、13PAP2を再形質転換した。２種のDNAサンプルは
、アセトアミド含有培地上での増殖及び高められたプロテアーゼ活性の両者を示
す形質転換体を生ぜしめた。次に、コスミドの１つのACR１からのDNAを、いくつ
かの制限酵素により消化した。次に、得られたフラグメント及びpAopyrGcosArp1
を用いて、13PAP2株を同時形質転換した。ACR１のEcoRI，PstI, BamHI及びKpnI
制限は、アセトアミド上で増殖でき、そして高いプロテアーゼ活性を有する形質
転換体を付与し、ところがSalI及びHindIII消化物は、そうではなかった。EcoRI
消化は最も単純なパターンを付与するので、別のEcoRIフラグメントをゲル単離
し、そしてpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した。わずか１つの
フラグメント、すなわち15kbのEcoRIフラグメントが、アセトアミド含有培地上
で増殖できる形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、上記コスミドから
prtTをサブクローン化するために、pBlueScript II SKにおいてサブクローン化
した。このクローンの挿入体はまだかなり大きいので、別のPstIバンドをゲル単
離し、そしてその個々及びpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した
。わずか１つのバンド、すなわち2.5kbのPstIフラグメントは、アセトアミド含
有培地上で増殖する形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、pBlueScrip
tII SKにおいてサブクローン化した。４種のサブクローン、すなわちClE0.7, Cl
E1.8, NcE1.1及びNcE1.4を、制限地図に基づいてこのプラスミドから構築した。
さらに、2.5kbのPst1フラグメントを含む6.5kbのSstI/EcoRIフラグメントをサブ
クローン化し、pEES1（図３に示される）をもたらした。

【０１１３】 AB4.1からのゲノムDNAのサザンブロット分析は、prtTのわずか1つのコピーの
存在を示した。実施例２ A. niger prtT遺伝子の配列決定及びその配列の分析 すべての配列反応は、dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kits又はBig
Dye（商標）Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer Corporation, B
ranchburg, NJ, USAからの)を用いて調製された。反応は、ABI PRISM（商標）37
7 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corporation) 上で、製造業者の説明書に従っ
て行われる。

【０１１４】 prtT遺伝子を、ゲノムクローンClE0.7, ClE1.8, NcE1.1, NcE1.4及びpEES1か
ら配列決定した。使用される配列特異的プライマーは下記に列挙される： 122958：CGA TCG ATG ACT GCC TGT（配列番号９） 122956：AGA GAC ACA TAG TGC CTT（配列番号10） 122959：GCT TAT AGT CGA TAG CGC（配列番号11） 122960：CCT CTC TCC AGC GAT GGT（配列番号12） 122962：ATG GAA TAC ATA CTG CTT（配列番号13） 122961：ATG AAA CCC ACT GTA GCT（配列番号14） 122963：TGC TCG ATA AGC GGG TCC（配列番号15） 122964：AAT CTT ATG GAC CCG CTT（配列番号16） 124289：CCC CGG GAA ACA AGA ACA GG（配列番号17） 124290：GTT GGC GGA CCT TGA CTA TG（配列番号18） 125112：ACA GCT ACA GTG GGT TTC ATC T（配列番号19） 125111：AGT CAA CGG GGG AAG TCT C（配列番号20） 128330：CTA GCA GCG TAT CGG TCA GC（配列番号21） 130887：CTT GGA AAA GAA ACG ATA G（配列番号22） 130888：AAC GTA CGC TTT CCT CCT T（配列番号23） 134135：GGG TCC GTC CAG TCC GTT CTT（配列番号24） −48逆方向：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA（配列番号25） −40普遍性：GTT TTC CCA GTC ACG AC（配列番号26） 遺伝子の変異体対立遺伝子を、次のプライマーを用いて、変異体株AB1.13から
単離されたゲノムDNAのPCR増幅により得た： PstI：TC ATC CCT GGT GTT ACT GC（配列番号27） PstII: C ATG GAT TGG CTG GCC G（配列番号28） prtT遺伝子の完全なDNA配列は、配列番号１に示される。変異体対立遺伝子のP
CRフラグメントの配列は、配列番号４に示される。

【０１１５】 コンピューターソフトウェアNetgene 2 (S. M. Hebsgaard, P. G. Korning, N
. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, S. Brunak (1996. Nucleic Acids Res
earch 24: 3439-3452)) を用いてのDNA配列（配列番号１）の分析は、５個のエ
キソンの存在を示した（配列番号１の注釈を参照のこと）。A. niger prtT cDNAの分析： mRNAを、プロテアーゼ生成のために好ましい条件下で増殖されたA.ニガーの培
養物から、市販のポリ (A)⁺RNA単離されたキット（Pharmacia, uppsala SE）を
用いて、全RNA（上記実施例１に記載されるDNA単離方法に従って単離された）か
ら精製した（J.P.T.W. Van Den Hombergh, など., 1997, Eur. J. Biochem. 247
: 605-613）。二本鎖cDNAを、標準の方法を用いて調製し、そして次のプライマ
ーとのPCR反応のために使用した： オリゴ−dTプライマー：T₂₀N Prt270n：TACTCTCCAGATTGCCTG（配列番号29） Prt1420r：TGAGATACCACTCAGCAG（配列番号30） Prt1350n：TGCACTTCTCTGTCTCTG（配列番号31） Prt2365r：GACTTCTGGCATCAGTTG（配列番号32） Prt2320n：CTCATGGATGGCATGATC（配列番号33） プライマーPrt270n及びPrt1420rとのPCR反応は、約1.0kbのフラグメントを生
成した。このフラグメントを、pGEM-Tベクター（Promega Corp., Madison WI, U
SA）中にクローン化し、そしてその得られるプラスミドの挿入体を、プライマー
に122958, 122960, −40普遍性及び−48逆方向を用いて配列決定した。その結果
は、遺伝子のこの部分における２個のイントロンの存在を確かめた。

【０１１６】 プライマーPrt1350n及びPrt2365rとの第２のPCR反応は、約0.9kbのフラグメン
トを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクター中にクローン化し、
そして得られるプラスミドにおける挿入体を、プライマー124289, 124290, -40
普遍性及び-48逆方向を用いて配列決定した。その結果は、遺伝子のこの部分に
おける単一のイントロンの存在を確かめた。

【０１１７】 オリゴ−dTプライマー及びPrt2320nとのもう1つのPCR反応は、約350bpのフラ
グメントを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクターにおいてクロ
ーン化した。プライマー−40普通性及び−48逆方向を用いての挿入体の配列決定
は、そのフラグメントがprtTの3’部分を含み、そしてもう1つのイントロンの存
在を確かめたことを示した。

【０１１８】 翻訳されたprtT遺伝子の推定されるタンパク質配列は、配列番号２に示される
。翻訳された変異体対立遺伝子prt13の推定されるタンパク質配列は、配列番号
５に示される。配列番号２及び５の比較は、それらの２種の間の唯一の差異が、
翻訳されたprtT遺伝子におけるロイシン残基が翻訳されたprt13遺伝子における
プロリンにより置換される位置112に存在することを示す。

【０１１９】 推定されるPrtTタンパク質配列の分析は、Zinc(II)2Cys6二核クラスターDNA結
合モチーフ（配列番号２、残基47−81）の存在を示す。このモチーフは、GAL4ク
ラスの菌類転写活性化因子を定義する（Reece, M.J., and Ptashne, M. 1993, S
cience 261: 909-911）。prtT遺伝子におけるこのモチーフの存在は、prtTが転
写活性化因子であることを示す。

【０１２０】実施例３ 野生型A.ニガー株におけるprtT遺伝子の破壊 prtT遺伝子の上流及び下流の配列がA.オリザエpyrG遺伝子により分離されてい
るプラスミドを構成した。プラスミドpEES1を、MunI及びNheIにより消化し、prt
Tのコード配列のほとんどを含む2.1kbのフラグメントを除去した。A.オリザエpy
rG遺伝子を含むpAO4-13からの2.3kbのEcoRI/NheIフラグメントを、pEES1のMunI
及びNheI部位にクローン化した。図４に示されるプラスミドをpDprtと命名した
。次に、その構造体を用いて、A.ニガー株AB4.1を形質転換し、ウリジン原栄養
性形質転換体を、脱脂乳含有プレート上でのプロテアーゼ活性について分析した
。それらのうち５個はそれらのプレート上でハローを生成せず、このことは、プ
ロテアーゼ活性が非常に低かったことを示唆する。破壊されたprtT遺伝子を有す
る株及び変異体AB1.13株の比較は、プロテアーゼ活性又は表現型においていずれ
の差異も示さなかった。

【０１２１】実施例４ A. niger prtTの過剰発現 A.ニガーgpd遺伝子のプロモーターに融合されるprtTのコード領域及び3’側非
コード配列を含むプラスミドpGPprt（図５）を構成した。gpd遺伝子は、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及び一次代謝に関係する構成的に
発現された酵素をコードする。使用されるプロモーターは、コード領域の上流の
フラグメントであった。プラスミド及びpyrG選択プラスミドpAO4-13を用いて、
同時形質転換により、A.ニガーAB4.1を性質転換した。サザンブロット分析によ
り決定される場合、高められたprtT転写を有する形質転換体を、高められたプロ
テアーゼ発現について分析した。

【０１２２】 実施例５ A. oryzae prtT遺伝子からのZn²⁺フィンガーの単離 A. niger prtT遺伝子を配列番号１に示す。prtTのDNA配列から演繹されるタン
パク質配列（配列番号２）は、prtTによりコードされる転写活性化因子のDNA結
合に責任を負うと予想されるいわゆるZn²⁺フィンガー・モチーフを含む。このZn ²⁺ フィンガー・モチーフは、以下のアミノ酸配列：Met Thr Ala Cys His Thr Cy
s Arg Lys Leu Lys Thr Arg Cys Asp Leu Asp Pro Arg Gly His Ala Cys Arg Ar
g Cys Leu Ser Leu Arg Ile Asp Cys（配列番号34）を有する。 上記モチーフからアミノ酸配列をコードすることができる縮重プライマーを、
DNA Technology A/S Forskerparken, Gustav Wieds vej 10, DK-8000 Aarhus C,
Denmarkにより消化し、そして合成した。プライマーは以下の配列をもっていた
： 137396: ATGACC/TGCC/TTGC/TCAC/TACC/TTG（配列番号35） 137397: AA/GA/GCAA/G/C/TCGA/G/C/TCGA/GCAA/GGCA/GTG（配列番号36） 上記プライマーを、テンプレートとしてのゲノムA. oryzae IFO4177 DNAとのP
CR反応において使用した。反応を、154pmolのプライマー137396と10164pmolのプ
ライマー137397を含有する全容量100μl中で行った。アニーリング温度として56
℃、そして30秒間の伸長時間をもって30PCRサイクルを走らせた。A. nigerのゲ
ノムDNA、並びにプライマー137394: ATGACTGCCTGTCACACATG（配列番号37）及び1
37395: AGACAGCGACGGCACGCATG（配列番号38）であってA. niger prtT遺伝子に特
異的なものを用いた他のPCR反応も走らせた。この反応において、10pmolの各プ
ライマーを、100μl反応において使用した。上記２反応のアリコートを、３％ア
ガロース・ゲルに適用した。電気泳動後、３つのほぼ等しい強度のバンドが、A.
oryzae反応において、そして２つのバンドが、A. niger反応において見られた
。A. niger反応における上記バンドの中の１は、他のものよりも強く、そしてさ
らに予想されるサイズをもっていた。A. oryzaeバンドの中の１は、最大強度のA
. nigerバンドと同じサイズをもち、そして上記ゲルから単離された。断片を、
ベクターpCR2.1（Invitrogen（商標））内にクローニングした。２つの個々のコ
ロニーからのプラスミドを配列決定した。配列を図１に示す。２つの配列は、異
なる縮重プライマー内のそれらの起源を反映する末端において相違する。それら
は、中央の40bpにおいて同一であり、それらは、ゲノムDNAから増幅される。こ
の40塩基対は、A. niger prtT遺伝子のZn²⁺フィンガーの一部に同一であるポリ
ペプチドをコードする。

【０１２３】 実施例６ A. oryzae prtT遺伝子のＮ−末端の単離 逆PCR法を、A. oryzae prtT遺伝子を単離するために使用した。プライマー144
428: CACCGAGTTTTAAGCTTGCGG（配列番号39）と144429: GCGATCTTGATCCACGAGGG（
配列番号40）を、DNA Technology A/S (Denmark) により合成した。ゲノムDNAを
、多数の制限酵素で切断し、そして再ライゲートした。このライゲーション混合
物を、プライマー144428/144429を用いたPCR反応においてテンプレートとして使
用した。テンプレートとしてのBamHI制限酵素処理され及び再ライゲートされたD
NAとの反応において、アガロース・ゲル上での電気泳動後に、約2.5kbの断片が
観察された。この断片を、ランダム・プライミング法により³²Pで標識し、そし
てゲノムA. oryzae DNAのグリッド・コスミド・ライブラリーを含有するフィル
ターに対してプローブとして使用した。上記ライブラリーの構築はWO98/01470中
に記載されている。コスミド11F8は、上記プローブにより陽性ハイブリダイゼー
ション・シグナルを示した。11F8からのDNA、及びBamHI, EcoRI, PstI又はXhoI
による制限酵素処理されたゲノムDNAを含有するサザン・ブロットを、2.5kb逆PC
R断片でプローブした。ゲノムDNAからのハイブリダイズするバンドのサイズを、
上記コスミドDNAからのものと比較した。明らかに、上記コスミドのいくらかの
再配置が生じていた。なぜなら、上記ゲノムDNAからのバンドの中のほんの僅か
のものだけが、上記コスミド内に相当物をもっていたからである。上記コスミド
からの２つのハイブリダイジング断片、1.2kbのEcoRI断片、及び1.0kbのPstI断
片は、ハイブリダイジング・ゲノム断片に、サイズが等しく見えた。上記２つの
断片を、上記コスミドからサブクローニングし、そして配列決定した。上記配列
データの分析は、上記断片が重複していることを示した。全部で1497bpの配列が
得られた。Zn²⁺フィンガーをコードするオリゴヌクレオチドは、上記配列内に含
まれていなかった。BamHI部位は、EcoRIサブクローンによってのみカバーされる
領域内で上記配列の１端の近くにあることが発見され、このようにして、Zn²⁺フ
ィンガーに対する配列決定されたゲノム断片の位置を決定することができた。プ
ライマー153468: CGGGATGAATTGTAGAGAGGC（配列番号41）は、DNA Technology A/
S (Denmark）により調製された。上記プライマー配列は、上記1497bp断片内に含
まれる。それは、上記Zn²⁺フィンガーに最も近い末端にあり、そしてその方向を
指示していた。両者prtT Zn²⁺フィンガー特異的配列であり、かつ、下流（14035
8）又は上流（140359）のいずれかを指示するところの２つのプライマーも、DNA
Technology A/S (Denmark）により調製された。上記２つのプライマーの配列を
以下に示す：140358: CGCAAGCTTAAAACTCGGTGCGATC（配列番号42）、及び140359:
CCTCGTGGATCAAGATCGCA（配列番号43）。２つのPCR反応、それぞれ、上記プライ
マー153468と140358を用いた反応と、153468と140359を用いた反応を、テンプレ
ートとしてゲノムDNAを用いて行った。アガロース・ゲル上で分析したとき、153
468と140359を用いた反応は、約1.1kbのバンドを与え、他の反応は、目に見える
バンドを与えなかった。この1.1kb断片を、pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) 内に
クローニングし、そして配列決定した。上記断片は、Zn²⁺フィンガーの一部を含
み、そして上記1497bp断片と重複する。上記配列の翻訳は、Zn²⁺フィンガーの直
上流領域が、A. nigerからのprtTのＮ末端へのホモロジーをもってポリペプチド
をコードすることを示した。

【０１２４】 実施例７ 全A. oryzae prtT遺伝子の単離 上記遺伝子の残りの部分を、逆PCRの２つの連続ラウンドによりクローン化し
た。第１の逆PCR反応において、ゲノムDNAを、EcoRVで制限酵素処理し、そして
再ライゲートした。PCR反応を、プライマー175653: GATGAAAAGAATAATCGGCGAG（
配列番号44）と175654: CGCGGCACACTACCCCCGTTG（配列番号45）を用いて走らせ
た。この反応は、1.9kb断片の合成をもたらし、これをpCR4Blunt-TOPOベクター
内にクローニングし、そして配列決定した。上記配列データの分析は、上記断片
が、A. niger prtT遺伝子にホモロジーをもつ遺伝子を含み、そして上記遺伝子
の３′末端がなくなっていたことを示した。それ故、第２の逆PCR反応を行った
。プライマーは、B0403G08: ATCTAGCTCAAGCATTAGCGGC（配列番号46）とB0403G09
: AATTTCGGCCCTTTAGTGTCC（配列番号47）であった。BglII制限酵素処理され、そ
して再ライゲートされたゲノムDNAをテンプレートとして使用した。2.4kb断片を
得、そしてpCR4Blunt-TOPOベクター内にクローニングし、そして配列決定した。
上記配列の分析は、全A. oryzae prtT遺伝子が得られていることを示した。A. o
ryzae prtT遺伝子のDNA配列を、配列番号48に示し、そしてそのコードされたタ
ンパク質の演繹アミノ酸配列を配列番号49に示す。

【０１２５】 実施例８ アスペルギラス・オリザエprtT遺伝子の破壊 A. oryzae prtT遺伝子を、陽性／陰性選択法を用いて破壊した。その中央にpy
rG遺伝子が挿入された２kbのA. oryzae prtT遺伝子（配列番号48）から成る破壊
カセットを、真菌発現シグナルに隣接して単純ヘルペスＩ型チミジン・キナーゼ
遺伝子（HSV-tk）を含むベクター（pDV8）内にクローニングした。このチミジン
・キナーゼ遺伝子の発現は、その宿主を、５−フルオロ−２−デオキシウリジン
に感受性にする。破壊された株は、pyrGマイナス宿主におけるpyrG遺伝子につい
ての陽性選択、及び５−フルオロ−２−デオキシウリジン上での上記チミジン・
キナーゼ遺伝子の脱選択により、単離されうる。チミジン・キナーゼ遺伝子とpy
rG遺伝子は同一のDNA断片内に存在するので、２重交差事件が生じている形質転
換体について選択が行われる。この系は、破壊カセットだけによる形質転換より
も、DNAμg当りより少ない形質転換体を与えるが、望ましい相同組換え事件が生
じているところの形質転換体の頻度はより高い。ここで使用したpyrG遺伝子は、
反復により隣接され、５−フルオロオロチン酸耐性についての選択によるその後
の除去が可能となる。pyrG遺伝子は、プラスミドpJaL554から単離される。

【０１２６】 pDV8プラスミド： pDV8は、Matthew S. Sachs, University of Oregon, PO Box 91000, Portland
, OR 97291-1000, USAの好意により提供された。pDV8（図７）は、A. nidulans
gpdプロモーターの1.0kb XhoI/BglII断片と、A. nidulans trpC転写ターミネー
ターを含む0.8kb BamHI/HindIII断片の間に挿入された1.2kb BglII/BamHI断片上
にHSV-tk遺伝子を含む、pSP65（Promega（商標））ベースのプラスミドである。 A. nidulans gpdプロモーターとtrpC転写ターミネーターは、プラスミドpAN51
-2 (Punt et al., (1990), Gene 93, p.101-109) から得られる。HSV-tk遺伝子
は、Mcknight S.L., (1980), Nucleic Acids Res. 8: 5949-5964、データベース
・アクセス番号EMBL v 00470、位置252-1479により記載されている。pDV8の構築
は、Vaught-Alexander D (論文), Neurospora crassa内での単純ヘルペス・ウイ
ルス１型チミジン・キナーゼ遺伝子の発現、(1994), Oregon Graduate Institut
e of Science & Technology, University of Portland, PO Box 91000, Portlan
d, OR 97291-100, USA中に記載されている。pDV8の配列は、配列番号50として本
願に含まれる。pDV8のシングル−、ダブル−及びマルチ−コピーA. oryzae形質
転換体を、A. oryzae niaD突然変異体内に、A. oryzae niaD遺伝子を含むpDV8誘
導体を形質転換させることにより単離した。HSV-tk遺伝子のコピー数を、サザン
分析により測定した。上記形質転換体と形質転換されていない宿主を、各種濃度
の５−フルオロ−２′−デオキシウリジンを含有するプレート上に接種した。上
記プレート上での増殖検査から、将来の陽性／陰性選択実験のために、上記プレ
ート内で５−フルオロ−２′−デオキシウリジンを６μM使用することを決定し
た。この濃度においては、pDV8形質転換体はいずれも増殖しなかった。一方、形
質転換されていない宿主は、ほんの僅かにのみ阻害された。

【０１２７】 pJaL554の説明： （WO97/35956中に記載された）pyrG含有プラスミドpSO2からの5336bpのSpeI-S
spBI断片に、316bpのAsp718-NheI断片をライゲートすることにより、pJaL554を
構築した。従って、pJaL554は、316bpリピートに隣接して、A. oryzae pyrG遺伝
子を宿す。構築物を図８に示す。

【０１２８】 pDV8ベクター内でのprtT破壊プラスミドの構築： PCR反応を、プライマーB1042E05とB1450E07を用いて染色体A. oryzae IFO4177
DNA上で行った。 B1042E05: CGCGCGTATCCTATTGCC（配列番号51） B1450E07: GCCGGAAATGTTGTACCTAC（配列番号52）。 2078塩基対の断片を得、そしてpCR4Blunt-TOPO（Invitrogen（商標））ベクタ
ー内にクローニングした。正しい断片が得られていることを保証するため、得ら
れたプラスミドを、標準M13前進（-40）プライマーと後退プライマーを用いてシ
ークエンシングした。このPCR断片を、上記断片内で内部を２回切断する制限酵
素EcoRVにより、上記ベクターから切り出した。切断部位は、配列番号48内の１
位と1964位にある。この1964bp断片を、HindIIIで切断され、そしてE. coliから
のDNAポリメラーゼＩのKlenow断片及びdNTPでその末端を充填することによりブ
ラント末端化されているpDVベクターとライゲートした。得られたプラスミドを
、配列番号48内の962位にある（Zr²⁺フィンガーをコードする部分内の）prtT断
片内にあるHindIIIで切断し、脱リン酸化し、そして2.5kb HindIII断片としてpJ
aL554から単離したpyrG遺伝子とライゲートした。

【０１２９】 prtT破壊株の選択： 上記の破壊プラスミドを、NotIにより線状化し、そして（WO97/35956中に記載
された）A. oryzae How B101、IFO4177のpyrGマイナス誘導体内に形質転換した
。この形質転換を、本質的にEP 0 238 023中に記載されたように行う。形質転換
体を、Coves塩溶液（Cove DJ, (1966), Biochim.Biophys.Acta. 113: 51-56）、
浸透圧安定化のための１Ｍスクロース、及び炭素源として、20g/L寒天、10mM Na
NO₃、及び６μMの５−フルオロ−２−デオキシウリジン（Sigma）を含有するプ
レート上で選択する。形質転換体を、同一タイプのプレート上で１回単離する。
破壊されたprtT遺伝子を担持する形質転換体を、サザン・ブロット分析により同
定する。 prtT破壊を担持する株を、（米国特許第5,879,664号中に記載された）発現プ
ラスミドpCaHj445上に宿された、切断PDI遺伝子（Protein Disulfideイソメラー
ゼ遺伝子）の発現のための宿主として使用する。pCaHj445を、A. nidulans amdS
遺伝子を含むプラスミドp3SR2による同時形質転換によるA. oryzae prtT破壊株
内に形質転換する。アセトアミド上での形質転換及び選択を、本質的にEP 0 238
023中に記載されたように行う。再単離の後、上記形質転換体を、振とうフラス
コ又は発酵槽内で発酵させ、そしてPDIタンパク質を、上記発酵ブロスから精製
する。

【０１３０】 本明細書において記載され、そして請求された発明は、本明細書に開示される
特定の態様により制限されず、それらの態様は、本発明のいくつかの観点を例示
するものである。いずれかの同等の態様は、本発明の範囲内にあるものと意図さ
れる。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に本発明の種々の
修飾は当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた、本発明の範囲内
に存在する。

【０１３１】 種々の文献が本明細書において引用されており、それらの開示はすべて、引用
により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、プラスミドpPAPの制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される
。

【図２】 図２は、プラスミドpAopyrGcosArp1の制限地図を示し、その構成は実施例１に
記載される。

【図３】 図３は、プラスミドpEES1の制限地図を示し、その構成は実施例１に記載され
る。

【図４】 図４は、プラスミドpDprtの制限地図を示し、その構成は実施例３に記載され
る。

【図５】 図５は、プラスミドpGPprtの制限地図を示し、その構成は実施例4に記載され
る。

【図６】 図６は、A. Oryzae prtT Zn²⁺フィンガーのPCR断片を含む２つのプラスミド内
の挿入配列を示す。ICA217は上記プラスミドの中の１からの配列であり、そして
ICA218は他からの配列である。

【図７】 図７は、A. nidulans gpdプロモーターの1.0kb XhoI/BglII断片と、A. nidula
ns trpC転写ターミネーターを含む0.8kb BamHI/HindIII断片の間に挿入された1.
2kb BglII/BamHI断片上のHSV-tk遺伝子を含むpSP65（Promega（商標））ベース
のプラスミド、pDV8プラスミドを示す。

【図８】 図８は、実施例８に記載のpJaL554の構築を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:66 Ｃ１２Ｐ 21/02 1:77 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 1:78 Ｃ１２Ｒ 1:66） 1:84 (Ｃ１２Ｐ 21/02 1:885 Ｃ１２Ｒ 1:77） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:885） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 プント，ペー．イェー． オランダ国，エヌエル−3994 イックステ ー ホーテン，ブークドゥッケルスギルデ (72)発明者 シューレン，エフ．ハー．イェー． オランダ国，エヌエル−3906 ゼットカー フェーネンダール，バッハラーン 34 (72)発明者 クリステンセン，トーベ デンマーク国，デーコー−2800 リュング ビュー，ネッデベンゲト ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA06 DA11 EA04 FA02 GA11 HA08 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA19 CC24 DA01 DA10 DA11 DA13 DA16 DA20 4B065 AA01X AA26X AA62X AA62Y AA63X AA63Y AA65X AA65Y AA67X AA67Y AA70X AA70Y AA76X AA76Y AA77X AA77Y AB01 AC14 AC15 BA02 CA24 CA60 4H045 AA10 AA20 BA09 CA10 EA01 EA20 EA50 EA60 FA74

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列と少なくとも70
   ％同一性を有する核酸配列； （ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
   有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列； （ｃ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列、又は（ii）その相補鎖と
   、低ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低スト
   リンジェント条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性
   されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイ
   ゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×
   SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間の洗浄により定義され； （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写
   活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列
   番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする； から成る群から選択される、転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする
   単離された核酸配列。
2. 【請求項２】 配列番号１又は配列番号48の核酸配列と、少なくとも70％、
   好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好まし
   くは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、そしてさらに最も好まし
   くは少なくとも97％の同一性を有する、請求項１記載の核酸配列。
3. 【請求項３】 配列番号１又は配列番号48の核酸配列を有する、請求項１記
   載の核酸配列。
4. 【請求項４】 配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と、少なくとも50
   ％、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少
   なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、そして最も好ましくは少
   なくとも95％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、請求
   項１〜３のいずれか１項記載の核酸配列。
5. 【請求項５】 前記核酸配列が菌類（fungal）細胞又は酵母細胞から得られ
   る、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸配列。
6. 【請求項６】 前記菌類細胞が糸状菌細胞である、請求項５記載の核酸配列
   。
7. 【請求項７】 前記糸状菌細胞が、アスペルギラス（Aspergillus）、フサ
   リウム（Fusarium）、ペニシリウム（Penicillium）又はトリコダーマ（Trichod
   erma）細胞である、請求項６記載の核酸配列。
8. 【請求項８】 前記アスペルギラス細胞が、アスペルギラス・ニガー（Aspe
   rgillus niger）又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、又は
   それらのシノニム又はテレオモルフの菌株である、請求項７記載の核酸配列。
9. 【請求項９】 前記アスペルギラス細胞が、アスペルギラス・ニガーDSM122
   98又はアスペルギラス・オリザエIFO4177の菌株である、請求項８記載の核酸配
   列。
10. 【請求項１０】 前記フサリウム細胞が、フサリウム・ベネナタム（Fusari
    um venenatum）、又はそのシノニム又はテレオモルフの菌株である、請求項７記
    載の核酸配列。
11. 【請求項１１】 前記酵母細胞が、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pic
    hia）又はサッカロミセス（Saccharomyces）細胞である、請求項５記載の核酸配
    列。
12. 【請求項１２】 転写活性化活性を有する、配列番号２又は配列番号49のア
    ミノ酸配列を含むポリペプチド又はそのフラグメントをコードする、請求項１〜
    １１のいずれか１項記載の核酸配列。
13. 【請求項１３】 配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
    る、請求項１〜１１のいずれか１項記載の核酸配列。
14. 【請求項１４】 （ｉ）配列番号１又は配列番号48に示される核酸配列、又
    は（ii）その相補鎖又は副配列に、低、好ましくは中の及びより好ましくは高ス
    トリンジェント条件下でハイブリダイズする、請求項１〜１３のいずれか１項記
    載の核酸配列。
15. 【請求項１５】 前記低ストリンジェント条件が５×SSPE、0.3％のSDS、20
    0μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミド中42
    ℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され
    、そして洗浄条件が２×SSC、0.2％のSDS中50℃での30分間により定義され；中
    位の緊縮条件が５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性され
    たサケ精子DNA及び35％のホルムアミド中42℃でのプレハイブリダイゼーション
    及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件が２×SSC、0.2％
    のSDS中60℃での30分間により定義され；そして高い緊縮条件が５×SSPE、0.3％
    のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び50％のホルム
    アミド中42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションによ
    り定義され、そして洗浄条件が２×SSC、0.2％のSDS中70℃での30分間により定
    義される、請求項１４記載の核酸配列。
16. 【請求項１６】 エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）DSM12294に含
    まれるプラスミドpEESに含まれる転写活性化活性を有するポリペプチドをコード
    する核酸配列又は配列番号49に示すポリペプチドをコードする配列番号48に示す
    DNA配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の核酸配列。
17. 【請求項１７】 好適な発現宿主におけるポリペプチドの生成を指令する１
    以上の制御配列に操作可能的に連結される、請求項１〜１６のいずれか１項記載
    の核酸配列を含む核酸構造体。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の核酸構造体、プロモーター、並びに転写
    及び翻訳終止シグナルを含む発現ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１７記載の核酸構造体又は請求項１８記載の発現ベ
    クターを含む宿主細胞。
20. 【請求項２０】 （ａ）（ｉ）配列番号１又は配列番号48の核酸配列、（ii
    ）その相補鎖、又は（iii）転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメント
    をコードする配列番号１又は配列番号48の副配列に、低ストリンジェント条件下
    でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、ここで前記低
    ストリンジェント条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして
    変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミド中42℃でのプレハイブリダイゼ
    ーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SS
    C、0.2％のSDS中50℃での30分間により定義され； （ｂ）配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を
    有するアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｃ）（ａ）又は（ｂ)の対立遺伝子変異体； （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント、ここで前記フラグメントは
    転写活性化活性を有し；及び （ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその対立遺伝子変
    異体、 から成る群から選択される単離されたポリペプチド。
21. 【請求項２１】 配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列と、少なくとも
    50％、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは
    少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なく
    とも95％、さらにより好ましくは97％、そして最も好ましくは99％の同一性を有
    するアミノ酸を含む、請求項２０記載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 配列番号２又は配列番号49のアミノ酸配列又は転写活性化
    活性を保持するそのフラグメントを含む請求項２０又は２１記載のポリペプチド
    。
23. 【請求項２３】 エスシェリシア・コリDSM12294に含まれるプラスミドpEES
    に含まれる核酸配列又は配列番号48に示すDNA配列によりコードされる、請求項
    ２０〜２２のいずれか１項記載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２３のい
    ずれか１項記載のポリペプチド。
25. 【請求項２５】 請求項２０〜２４のいずれか１項記載のポリペプチドを生
    成するための方法であって、（ａ）請求項１９記載の宿主細胞を、前記ポリペプ
    チドの生成を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収す
    る、 を含む方法。
26. 【請求項２６】 ポリペプチドの生成のために有用な菌類宿主細胞であって
    、前記細胞が、 ａ）プロテアーゼをコードする１以上のDNA配列を含む親菌類細胞の突然変異
    体であり、その転写が請求項１〜１６のいずれか１項記載の核酸配列によりコー
    ドされる転写活性化因子により活性化され；そして ｂ）同じ条件下で培養されるとき、上記親細胞よりも少ない転写活性化因子及
    びプロテアーゼを生成する、 ことを特徴とする宿主細胞。
27. 【請求項２７】 前記転写活性化因子の低下した生成が、細胞に存在し、か
    つ、転写活性化因子の発現のために必要な核酸配列の修飾又は不活性化により得
    られる、請求項２６記載の宿主細胞。
28. 【請求項２８】 前記転写活性化因子の低下した生成が、ポリペプチドの発
    現のために必要とされる制御配列の修飾又は不活性により得られる、請求項２６
    又は２７記載の宿主細胞。
29. 【請求項２９】 前記制御配列がプロモーター配列又はその機能的部分であ
    る、請求項２８記載の宿主細胞。
30. 【請求項３０】 前記修飾されるか又は不活性化される核酸配列が請求項１
    〜１６のいずれか１項記載の配列である、請求項２６〜２９のいずれか１項記載
    の宿主細胞。
31. 【請求項３１】 前記修飾又は不活性化が、特異的又はランダム突然変異誘
    発、部位特異的突然変異誘発、PCR生成突然変異誘発、ヌクレオチド挿入及び/又
    は置換、遺伝子中断又は遺伝子置換技術、アンチセンス技法、又はそれらの組み
    合わせにより行われる、請求項２６〜３０のいずれか１項記載の宿主細胞。
32. 【請求項３２】 親細胞の突然変異体である、ポリペプチドの生成のために
    有用な菌類宿主細胞であって、前記変異体が、 ａ）同じ条件下で培養されるとき合、親細胞によりも多量の、請求項１〜１６
    のいずれか１項記載の核酸配列によりコードされる転写活性因子を生成し、そし
    て ｂ）その転写が前記転写活性因子により活性化されているところのポリペプチ
    ドをコードするDNA配列を含む、 を特徴とする宿主細胞。
33. 【請求項３３】 前記宿主細胞が、（ｉ）請求項１〜１６のいずれか１項記
    載の核酸配列、（ii）請求項１７記載の核酸構造体、又は（iii）請求項１８記
    載の発現ベクターの中の１以上のコピーを、親細胞中に導入することによって、
    親細胞よりも転写活性化因子をより多量に生成し、それにより、前記宿主細胞が
    、同じ条件下で培養されるとき、親細胞よりもポリペプチドをより多量に生成す
    る、請求項３２記載の宿主細胞。
34. 【請求項３４】 前記転写活性化因子をコードする核酸配列が、親細胞の対
    応プロモーターよりも強いプロモーターに操作可能的に連結される、請求項３２
    又は３３記載の宿主細胞。
35. 【請求項３５】 前記プロモーターが、細胞外プロテアーゼ、好ましくはア
    スペルギラス・オリザエのアルカリプロテアーゼ、A. オリザエの中性メタロプ
    ロテアーゼ、A. ニガーのアスペルギロペプシンプロテアーゼ、フサリウム・オ
    キシスポラムのトリプシン−様プロテアーゼ又はF. ベネナタムのトリプシンを
    コードする遺伝子の発現を仲介する、請求項３４記載の宿主細胞。
36. 【請求項３６】 親細胞の突然変異体である、ポリペプチドの生成のために
    有用な菌類宿主細胞であって、前記変異体が、 ａ）請求項１〜１６のいずれか１項記載の天然核酸配列によりコードされる転
    写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及び ｂ）（ｉ）請求項１〜１６のいずれか１項記載の核酸配列に操作可能的に連結
    される誘導性プロモーター、及び（ii）請求項１〜１６のいずれか１項記載の核
    酸配列によりコードされる転写活性化因子が結合することができる、前記ポリペ
    プチドをコードする核酸配列に操作可能的に連結されるプロモーター配列（ここ
    で、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る） を含む、宿主細胞。
37. 【請求項３７】 前記天然核酸配列又はその調節配列が、特異的又はランダ
    ム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、PCR生成突然変異誘発、ヌクレオチ
    ド挿入及び/又は置換、遺伝子中断又は遺伝子置換技術、アンチセンス技法、又
    はそれらの組み合わせにより修飾されるか又は不活性化される、請求項３６記載
    の宿主細胞。
38. 【請求項３８】 前記誘導性プロモーターが、その誘導が炭素又は窒素異化
    代謝物により仲介されるところの群から選択される、請求項３６又は３７記載の
    宿主細胞。
39. 【請求項３９】 前記転写活性化因子により活性化され得、そして前記ポリ
    ペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に連結されるプロモーター配列をさ
    らに含む、請求項３３〜３８のいずれか１項記載の宿主細胞。
40. 【請求項４０】 前記プロモーター配列又はその機能的部分がプロテアーゼ
    遺伝子からのものである、請求項３３〜３９のいずれか１項記載の宿主細胞。
41. 【請求項４１】 前記プロテアーゼ遺伝子が、フサリウム・オキシスポラム
    のトリプシン−様プロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・オリザエのアルカリプ
    ロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガーのpacA遺伝子、アスペルギラス・オ
    リザエのアルカリプロテアーゼ遺伝子、A. オリザエの中性メタロプロテアーゼ
    遺伝子、A. ニガーのアスペルギロペプシンプロテアーゼ遺伝子、又はF. ベネナ
    タムのトリプシン遺伝子である、請求項３３〜４０のいずれか１項記載の宿主細
    胞。
42. 【請求項４２】 前記宿主細胞が、前記ポリペプチドをコードする核酸配列
    の少なくとも１のコピーを含む、請求項２６〜４１のいずれか１項記載の宿主細
    胞。
43. 【請求項４３】 前記宿主細胞が、同一の条件下で培養されるとき、親細胞
    よりも、天然のプロテアーゼ又は天然プロテアーゼの組み合わせ物を少量生成す
    る、請求項２６〜４２のいずれか１項記載の宿主細胞。
44. 【請求項４４】 前記プロテアーゼの活性がpH4での³H−ラベルされたクジ
    ラ精子ミオグロビンの分解によりアッセイされる、請求項２６〜４３のいずれか
    １項記載の宿主細胞。
45. 【請求項４５】 ポリペプチドの生成方法であって： （ａ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子を宿す、請求項２６〜４４のいず
    れか１項記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成のために好適な栄養培地中
    で培養し；そして （ｂ）前記突然変異体細胞の栄養培地から前記ポリペプチドを回収する を含む方法。
46. 【請求項４６】 前記ポリペプチドが前記親細胞にとって天然である、請求
    項４５記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記ポリペプチドが前記親細胞に対して異種である、請求
    項４５記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記ポリペプチドが、抗体又はその部分、抗原、血液凝固
    因子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその部分、調節タンパク
    質、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である、請求項４５記載
    の方法。
49. 【請求項４９】 前記酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、
    ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである、請求項４８記載の
    方法。
50. 【請求項５０】 前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒ
    ドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、ク
    チナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−
    ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダ
    ーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカー
    ゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素
    、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分
    解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである、
    請求項４９記載の方法。