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JP2003523723A - ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法 - Google Patents

ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法

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JP2003523723A
JP2003523723A JP2000603356A JP2000603356A JP2003523723A JP 2003523723 A JP2003523723 A JP 2003523723A JP 2000603356 A JP2000603356 A JP 2000603356A JP 2000603356 A JP2000603356 A JP 2000603356A JP 2003523723 A JP2003523723 A JP 2003523723A
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JP
Japan
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hps
protein
polypeptide
complex
hpsip
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JP2000603356A
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Inventor
キリシュナン ナンダバラン，
メイジャ ヤン，
Original Assignee
キュラジェン コーポレイション
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 ＨＰＳポリペプチドおよびＨＰＳ相互作用ポリペプチド（ＨＰＳＩＰ）を含むポリペプチドの複合体が提供される。ＨＰＳＩＰポリペプチドとしては、１４−３−３タンパク質、Ｈｒｓ、アトロフィン−１、ＤＧＳ−Ｉ、核因子ＮＦ９０、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質が挙げられる。また、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、またその誘導体、フラグメント、およびアナログをコードする核酸が開示される。特定の疾患および障害（特に、アトピー疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、癌、色素沈着障害、血小板機能不全およびウイルス疾患）を処置および／または予防することにおける効果のための複合体またはタンパク質をスクリーニングする方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （助成金の援助） 本明細書中に開示される本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって交付される
助成金番号７０ＮＡＮＢ５Ｈ１０６６の下で米国政府の援助によってなされた。
従って、米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般に、ポリペプチドおよび核酸、およびより詳細には、ヘルマン
スキー−パドラック症候群関連ＨＰＳポリペプチドと相互作用するポリペプチド
、およびＨＰＳポリペプチドおよびＨＰＳ相互作用ポリペプチドに関する。
【０００３】 （発明の背景） ヘルマンスキー−パドラック症候群（ＨＰＳ）は、リソソーム関連オルガネラ
の欠損によって特徴付けられる遺伝障害である。ヒトでは、ＨＰＳに罹患した個
体は、白皮症、出血障害、肺障害および消化器障害を患う。肺障害は、例えば、
進行性の肺線維症を生じて、４０年または５０年で死に至り得る。
【０００４】 ＨＰＳにおける肺不全は、いくつかの細胞内オルガネラのうちの１以上におけ
る不全から生じると考えられている。これらのオルガネラとしては、例えば、リ
ソソーム、メラノソーム、および血小板が密な顆粒（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｎ
ｓｅ ｇｒａｎｕｌｅｓ）が挙げられ得る。ＨＰＳ患者における機能的なメラノ
サイトは、数が量的に減少し、そして／または質的に異常である。これは、組織
（例えば、皮膚および毛髪）の白皮症を生じると考えられている。
【０００５】 ＨＰＳと関連する出血障害は、出血時間の延長を含み得る。ＨＰＳと関連する
出血時間の延長は、貯蔵オルガネラである血小板が密な顆粒（これは、ＡＤＰ放
出および血小板の凝集に必要である）の欠損に起因すると考えられている。
【０００６】 ＨＰＳ患者と関連する肺障害および消化器障害（例えば、線維症および肉芽腫
性大腸炎）は、細網内皮細胞、骨髄マクロファージ、肺マクロファージ、胃腸管
粘膜細胞、および他の細胞型のリソソーム中のセロイド脂褐素の蓄積から生じる
と考えられている。
【０００７】 ＨＰＳを担う遺伝子は、罹患されたＨＰＳファミリーであることが同定された
。ＨＰＳ遺伝子は、Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃａｎ、Ｓｗｉｓｓ、Ｉｒｉｓｈおよび
ＪａｐａｎｅｓｅのＨＰＳ患者のＤＮＡにおいて変更されることが報告されてい
る。ＨＰＳポリペプチドのアミノ酸配列は、これが複数の細胞質オルガネラの成
分であるようである膜貫通タンパク質であることを示唆する。
【０００８】 マウスでは、蒼白な耳（ｐａｌｅ ｅａｒ）（ｅｐ）の遺伝子座での劣性変異
が、ヒトＨＰＳのマウスホモログであると報告されている。ｅｐ変異を保有する
マウスは、メラノソームおよび血小板が密な顆粒において、ヒトＨＰＳ患者と同
様の不全を示す。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、特定のタンパク質がヘルマンスキー−パドラック症候群（ＨＰＳ）
タンパク質に結合し、そしてこのヘルマンスキー−パドラック症候群（ＨＰＳ）
タンパク質と複合体を形成するという発見に部分的に基づく。従って、本発明は
、ＨＰＳタンパク質を認識しかつこれと相互作用するアミノ酸に結合された（す
なわち、このタンパク質と複合体化した）ＨＰＳタンパク質を含むタンパク質複
合体を開示する。ＨＰＳタンパク質と複合体を形成するタンパク質は、本明細書
中以降、ＨＰＳタンパク質相互作用タンパク質について「ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐ」と命名され；そしてＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰの複合
体を形成するタンパク質は、本明細書中以降、「ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタン
パク質−ＩＰ複合体」として命名される。本明細書中で使用される場合、「ＨＰ
ＳＩＰ」または「ＨＰＳＩＰポリペプチド」としては、１４−３−３ ｅｔａ、
Ｈｒｓ、ＢＭＫ１αキナーゼ、ＣＤＫ２、核因子ＮＦ９０、アトロフィン（ａｔ
ｒｏｐｈｉｎ）−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１、またはヒトＨＮ１ホモログポリ
ペプチドが挙げられる。
【００１０】 いくつかの実施形態において、本発明は、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモロ
グとの、ＨＰＳ複合体、ならびにＨＰＳタンパク質の誘導体の複合体、フラグメ
ントおよび／またはアナログ、ならびにこれらの前述のＨＰＳタンパク質−ＩＰ
の誘導体、フラグメントおよび／またはアナログに関する。
【００１１】 本発明はさらに、ＨＰＳタンパク質またはその誘導体、フラグメントおよび／
もしくはアナログと相互作用するタンパク質についてスクリーニングする方法を
開示する。好ましくは、スクリーニング方法は、酵母ツーハイブリッドアッセイ
系、またはそのバリエーションである。
【００１２】 本発明はさらに、ヒトＨＰＩＰ１（および他の種のホモログ）ならびにヒトＨ
Ｎ１ホモログ、ならびにその誘導体、フラグメントおよびアナログのヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を開示する。特定のヌクレオチド配列に相補的である
（すなわち、ハイブリダイズする能力を有する）核酸（すなわち、前述の配列の
逆相補体（ｉｎｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ））もまた、提供される。逆
相補体は、コード鎖に対して逆方向であり、その結果、逆相補体がこの核酸鎖に
ミスマッチすることなくハイブリダイズする、相補配列を有する核酸配列である
。従って、例えば、コード核酸鎖が、コード鎖とハイブリダイズ可能な鎖との間
にミスマッチを有さない核酸配列にハイブリダイズ可能である場合、ハイブリダ
イズ可能な鎖の逆相補体は、コード鎖に同一である。
【００１３】 本発明はまた、生物学的活性を保有する、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモロ
グの誘導体、フラグメントおよび／またはアナログを開示する（すなわち、それ
らは、野生型ＨＰＩＰ１またはヒトＨＮ１ホモログタンパク質の１以上の既知の
機能活性を示し得る）。このような生物学的活性としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：（ｉ）ＨＰＳタンパク質に結合する能力、またはＨＰＳ
タンパク質との相互作用に対して競合する能力；（ｉｉ）抗原性（すなわち、そ
れぞれ抗ＨＰＩＰ１抗体または抗ヒトＨＮ１ホモログ抗体への結合について、Ｈ
ＰＩＰ１またはヒトＨＮ１ホモログに結合する能力、またはそれらと競合する能
力）、ならびに（ｉｉｉ）免疫原性（すなわち、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホ
モログタンパク質に特異的であり、かつそれらに結合する抗体を生成する能力）
。
【００１４】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびにＨＰＩＰ１タンパ
ク質およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、ならびにこれらの個々のタンパク質
および／またはタンパク質複合体の誘導体およびアナログの産生のための方法は
（例えば、組換え手段によって）もまた、開示される。上記と同じものを含む薬
学的組成物もまた、本明細書中で提供される。
【００１５】 本発明はさらに、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の活性を
調節する（すなわち、阻害するか、または増強する）ための方法、ならびにＨＰ
ＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質を調節する方法を開示する。これら
の複合体の個々のタンパク質成分は、種々の細胞機能（例えば、生理学的プロセ
ス（例えば、小胞輸送、タンパク質輸送、色素沈着調節、および血小板形成）な
らびに病理学的プロセス（例えば、眼・皮膚白皮症、血小板機能不全、神経変性
疾患および肺繊維症）を含む）に関与している。
【００１６】 本発明はまた、特定のタンパク質またはタンパク質複合体をスクリーニングす
るための方法を開示する。この方法は、以下：（ｉ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１タンパク質およびヒトＨＮ１ホモログタン
パク質、ならびにＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の誘導体お
よびアナログについてスクリーニングする工程；（ｉｉ）ＨＰＩＰ１ ｍＲＮＡ
およびヒトＨＮ１ホモログｍＲＮＡについてスクリーニングする工程、ならびに
（ｉｉｉ）ＨＰＩＰタンパク質およびヒトＨＮ１ホモログを、細胞機能、特にＨ
ＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰが関与する細胞機能を変
化させるそれらの能力についてスクリーニングする工程、を含む。
【００１７】 本発明はさらに、以下に基づく、診断および予後のスクリーニング方法、なら
びに治療用組成物および予防用組成物を開示する：（ｉ）ＨＰＳタンパク質・Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰ複合体（複合体の形成に関与する個々のタンパク質をコー
ドする核酸を含む）および（ｉｉ）ＨＰＩＰ１タンパク質およびそれらをコード
する核酸。本発明の治療用組成物としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：（ｉ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体（ここで上記
複合体のうちの１つまたは両方のメンバーがＨＰＳタンパク質および／またはＥ
ＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメントまたはアナログである）；（ｉｉ
）ＨＰＩＰ１タンパク質およびヒトＨＮ１ホモログ、ならびにそれらの誘導体、
フラグメントまたはアナログ：（ｉｉｉ）このタンパク質、またはその誘導体、
フラグメントもしくはアナログに対する抗体、ならびに（ｉｖ）前述のタンパク
質、またはそれらの誘導体、フラグメントもしくはアナログをコードする核酸。
治療用化合物はまた、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ成分ならびに
ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の両方をコードするヌクレオチ
ド配列に特異的なアンチセンス核酸の生成を含む。さらに、診断キット、予後キ
ット、およびスクリーニングキットもまた、本明細書中に開示される。
【００１８】 さらなる局面において、本発明は、コードされたＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰタ
ンパク質が発現され、そして互いに結合するように、キメラＨＰＳ−ＨＰＳＩＰ
ポリペプチドを発現する核酸を含む組換え細胞を増殖させ、次いでこの発現され
た複合体を回収することによって、ＨＰＳタンパク質とＨＰＳ−ＩＰタンパク質
との複合体を産生する方法を含む。
【００１９】 また、これらのタンパク質のうちの一方または両方をコードする核酸を含む組
換え細胞を、コードされたタンパク質の発現を可能にする条件下で増殖させ、そ
してこの発現されたタンパク質を回収することによって、ＨＰＩＰ１またはヒト
ＨＮ１ホモログタンパク質を産生する方法が、本発明に含まれる。
【００２０】 本発明はさらに、ＨＰＳタンパク質および本明細書中に開示されたＨＰＳ−Ｉ
Ｐタンパク質の複合体の異常なレベルによって特徴付けられる疾患または障害の
発症を、診断する方法、またはこの発症の存在をスクリーニングする方法もしく
はこの発症に対する素因についてスクリーニングする方法を提供する。この方法
は、被験体に由来するサンプル中の、１以上の複合体のレベルを測定する工程（
例えば、この複合体中の１以上のポリペプチドのレベルを測定することによる）
、またはこの複合体のポリペプチドのメンバーをコードするＲＮＡを測定する工
程、あるいはこの複合体の機能活性を測定する工程、を包含する。疾患もしくは
障害、または疾患もしくは障害の発症に対する素因を有さない類似するサンプル
中に見出される、複合体、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰをコードするＲＮＡ、また
はこの複合体の機能活性のレベルに対する、サンプル中の複合体、ＨＰＳおよび
ＨＰＳ−ＩＰをコードするＲＮＡ、またはこの複合体の機能活性のレベルにおけ
る増加または減少は、疾患もしくは障害、またはこの疾患もしくは障害の発症に
対する素因の存在を示す。
【００２１】 また、１以上の容器中に、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰの複合体、この複合体に
対する抗体、ＨＰＳのＲＮＡおよびＨＰＳ−ＩＰのＲＮＡにハイブリダイズし得
る核酸プローブ、またはＨＰＳの遺伝子およびＨＰＳ−ＩＰの遺伝子の少なくと
も一部の増幅をプライムし得る核酸プライマーの対を含むキットが、本発明に含
まれる。
【００２２】 さらなる局面において、本発明は、被験体において、ＨＰＳおよびＨＰＳ−Ｉ
Ｐの複合体の異常なレベルに関与する疾患または障害を処置または予防する方法
を含む。この方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、複合体
の機能を調節する治療有効量の分子を投与する工程を包含する。
【００２３】 疾患または障害は、減少したレベルの複合体、ならびにＨＰＳおよびＨＰＳ−
ＩＰの複合体の機能を促進する分子を含む。この分子は、例えば、ＨＰＳおよび
ＨＰＳ−ＩＰの複合体；ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰの複合体の誘導体またはアナ
ログ（この複合体は、野生型複合体よりも安定または活性である）；ＨＰＳタン
パク質およびＨＰＳ−ＩＰタンパク質をコードする核酸、ならびに野生型複合体
よりも安定または活性である複合体を形成するＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰの誘導
体またはアナログをコードする核酸、であり得る。
【００２４】 あるいは、疾患または障害は、複合体の増加したレベルに関与し得、そして分
子は、この複合体の機能を阻害する。分子は、例えば、複合体またはその結合領
域を含むそのフラグメントもしくは誘導体に対する抗体；ＨＰＳアンチセンス核
酸およびＨＰＳ−ＩＰアンチセンス核酸；ならびに異種配列がＨＰＳ遺伝子およ
びＨＰＳ−ＩＰ遺伝子の生物学的活性を不活性化するように、ヌクレオチド配列
が挿入されているＨＰＳ遺伝子およびＨＰＳ−ＩＰ遺伝子の少なくとも一部を含
み、ここでＨＰＳ遺伝子およびＨＰＳ−ＩＰ遺伝子の一部が、ゲノムＨＰＳおよ
びＨＰＳ−ＩＰ遺伝子との相同組換えを促進するように異種配列に隣接している
、核酸、であり得る。
【００２５】 他の実施形態において、疾患または障害は、減少したレベルのＨＰＳ−ＩＰに
関する。この場合において、分子は、ＨＰＳ−ＩＰの機能を促進し、そして例え
ば、ＨＰＳ−ＩＰタンパク質、ＨＰＳを結合するに活性であるＨＰＳ−ＩＰの誘
導体またはアナログ、ＨＰＳ−ＩＰタンパク質をコードする核酸、あるいはＨＰ
Ｓを結合するに活性であるＨＰＳ−ＩＰの誘導体またはアナログをコードする核
酸であり得る。
【００２６】 他の実施形態において、疾患または障害は、増加したレベルのＨＰＳ−ＩＰに
関する。投与された分子は、ＨＰＳ−ＩＰ機能を阻害し、そして例えば、抗ＨＳ
Ｐ−ＩＰ抗体またはその結合領域を含むそのフラグメントもしくは誘導体、ＨＰ
Ｓ−ＩＰアンチセンス核酸、または異種ヌクレオチド配列が挿入されているＨＰ
Ｓ−ＩＰ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸であり得る。異種配列は、ＨＰＳ−
ＩＰ遺伝子の部分がゲノムＨＰＳ−ＩＰ遺伝子との相同組換えを促進するように
異種配列に隣接しているＨＰＳ−ＩＰ遺伝子の生物学的活性を不活性化する。
【００２７】 さらなる局面において、本発明は、疾患または障害の処置または予防における
活性について複合体の活性のモジュレーターを同定するために、ＨＰＳおよびＨ
ＰＳ−ＩＰと化合物との精製された複合体をスクリーニングするための方法を含
む。この方法は、疾患または障害のインジケーターをインビボで阻害する培養細
胞と、複合体、誘導体またはモジュレーターとを接触させる工程、およびこの複
合体、誘導体またはモジュレーターと接触された細胞におけるインジケーターの
レベルと、接触していない細胞におけるインジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）
のレベルとを比較する工程、を包含する。接触された細胞におけるより低い活性
は、複合体、誘導体またはモジュレーターが疾患または障害の処置または予防に
おける活性を有することを示す。代表的な疾患および障害としては、例えば、色
素沈着障害、血小板機能不全、神経変性疾患および線維性肺疾患が挙げられる。
【００２８】 いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害の症状を示す動物を試
験するために、あるいは疾患または障害の症状を発症する素因のある動物を試験
するために、ＨＳＰ−ＨＳＰＩＰ複合体、誘導体またはモジュレーターを投与す
る工程を包含する。次いで、複合体、誘導体またはモジュレーターの投与後の疾
患または障害の症状が、測定される。疾患もしくは障害の症状の重篤度における
減少、またはこの疾患もしくは障害の症状の予防は、この複合体、誘導体または
モジュレーターが疾患または障害の処置または予防における活性を有することを
示す。代表的な疾患および障害としては、例えば、色素沈着障害、血小板機能不
全、神経変性疾患および線維性肺疾患が挙げられる。
【００２９】 また、ＨＰＳ−ＨＰＳＩＰ複合体の活性のモジュレーターである化合物を同定
する方法が、本発明に含まれる。方法は、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰの精製され
た複合体と、試験化合物または因子とを接触させる工程、ならびにこの化合物ま
たは因子の存在下で、あるいはこの化合物または因子を接触させた後に、複合体
の活性を試験する工程、を包含する。化合物または因子との接触後の複合体の活
性の変化は、因子がＨＰＳ−ＨＰＳＩＰ複合体の活性のモジュレーターであるこ
とを示す。
【００３０】 ＨＰＳ−ＨＰＳＩＰの形成を（直接的または間接的に）調節する分子について
スクリーニングする方法の１つの実施形態は、複合体の形成を可能にする条件下
で分子の存在下で、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰタンパク質から形成された複合体
のレベルを測定する工程；ならびにこの複合体のレベルと、この分子の非存在下
で形成された複合体のレベルとを比較する工程を包含する。この分子の非存在下
でのより低いまたは高いレベルの複合体は、この分子が複合体の形成を調節する
ことを示す。
【００３１】 本発明はさらに、内因性ＨＰＳ遺伝子および内因性ＨＰＳＩＰ遺伝子の両方が
動物またはその祖先の相同組換えまたは挿入変異誘発によって欠失または不活性
化されている組換え非ヒト動物を含む。いくつかの場合、組換え非ヒト動物は、
ネイティブなＨＰＳ遺伝子プロモーターまたはネイティブなＨＰＳ−ＩＰ遺伝子
プロモーターではないプロモーターの制御下であるＨＰＳ−ＩＰ遺伝子を含む。
例えば、組換え非ヒト動物は、トランスジーン（例えば、キメラＨＰＳ−ＨＰＳ
ＩＰポリペプチドをコードする核酸配列）を含み得る。
【００３２】 また、ＨＰＳ、ＨＰＳをコードする核酸、ＨＰＳを免疫特異的に結合する抗体
、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントもしくは誘導体と細胞とを
、ＨＳＩＰポリペプチドのレベルを調節するに十分な量で接触させることによっ
て、細胞中のＨＰＳＩＰポリペプチドの活性またはレベルを調節する方法が、本
発明に含まれる。
【００３３】 また、複合体の形成を調節する分子と細胞とを接触させて、ＨＰＳおよびＨＳ
ＰＩＰポリペプチドの複合体の活性またはレベルを調節する方法が、本発明に含
まれる。
【００３４】 さらなる実施形態において、本発明は、ＨＰＳもしくはＨＰＳＩＰポリペプチ
ド、またはＨＰＳおよびＨＰＳＩＰの複合体の活性を調節する分子を同定するた
めの方法を含む。この方法は、１以上のポリペプチドの存在下で１以上の候補分
子とＨＰＳとを接触させる工程、ならびにＨＰＳとタンパク質との間で形成する
複合体の量を測定する工程を包含する。候補分子の非存在下で形成する量に対す
る、形成する複合体の量における増加または減少は、この分子がＨＰＳおよびそ
のタンパク質の活性またはＨＰＳおよびそのタンパク質の複合体の活性を調節す
ることを示す。
【００３５】 いくつかの実施形態において、方法は、ＨＰＳ遺伝子、ＨＰＳＩＰトランスジ
ーン、またはこの両方を含む組換え非ヒト動物に候補分子を投与して、そしてト
ランスジェニック哺乳動物の細胞において、ＨＰＳ活性もしくはＨＰＩＳＰ活性
またはその両方の活性を測定することによって行われる。
【００３６】 あるいは、方法は、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳＩＰタンパク質を発現して
いる細胞においてインビトロで行われ得る。
【００３７】 別の局面において、本発明は、生物学的活性についてＨＰＳの誘導体またはア
ナログをスクリーニングするための方法を含む。この方法は、ＨＰＳの誘導体ま
たはアナログとＨＰＳＩＰポリペプチドとを接触させる工程、ならびにＨＰＳお
よびタンパク質の誘導体またはアナログの間の複合体の形成を検出する工程を包
含する。複合体の形成は、ＨＰＳの誘導体またはアナログが生物学的活性を有す
ることを示す。
【００３８】 また、ＨＳＩＰポリペプチドの誘導体またはアナログを、ＨＳＰポリペプチド
と複合体を形成するその能力についてスクリーニングするための方法が、本発明
によって提供される。この方法は、タンパク質の誘導体またはアナログとＨＰＳ
とを接触させる工程、ならびにこのタンパク質の誘導体またはアナログとＨＰＳ
との間の複合体の形成を検出する工程を包含する。複合体の形成はタンパク質の
誘導体またはアナログが生物学的活性を有することを示す。
【００３９】 さらなる局面において、本発明は、被験体中のＨＰＳタンパク質およびＨＰＳ
−ＩＰタンパク質の複合体の異常なレベルによって特徴付けられる疾患または障
害の処置の効率をモニターする方法を提供する。この方法は、被験体に由来する
サンプルにおいて、複合体のレベル、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳ−ＩＰタン
パク質をコードするＲＮＡのレベル、またはこの複合体の機能活性のレベルを測
定する工程を包含する。サンプルは、処置の投与後に被験体から採取され、そし
て以下：（ｉ）処置の投与前に被験体から採取されたサンプルにおけるレベル、
または（ｉｉ）疾患または障害の前処置段階と関連する標準レベルに比較される
。処置の投与前に採取されたサンプルにおける、複合体のレベル、ＨＰＳおよび
ＨＰＳ−ＩＰをコードするＲＮＡのレベル、またはこの複合体の機能活性のレベ
ル（すなわち標準レベル）に対する、処置の投与後に採取されたサンプルにおけ
る、複合体のレベル、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰをコードするＲＮＡのレベル、
またはこの複合体の機能活性のレベルにおける変化、または変化の欠落は、投与
が疾患または障害の処置に効果的であるか否かを示す。
【００４０】 また、被験体（例えば、ヒト）のＨＰＳ症候群に関連する障害を処置または予
防する方法が、本発明によって提供される。この方法は、このような処置または
予防が所望される被験体に、ＨＰＳおよびＨＰＳ−ＩＰタンパク質の複合体の機
能を調節する治療有効量の分子を投与する工程を包含する。ＨＰＳ症候群関連障
害は、例えば、色素沈着障害、血小板機能不全、神経変性疾患、肺疾患（線維肺
疾患を含む）であり得る。
【００４１】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨＰＩＰ１タンパク
質の生物学的活性のモジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニストおよ
びインヒビター）のスクリーニングに関連する動物モデルおよび方法もまた、本
発明において提供される。同様に、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ
複合体の形成を阻害するか、または増加させる分子の同定に関連する方法もまた
、開示される。
【００４２】 他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術および科学用語は
本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明
細書中に記載される方法および材料と同様のまたはこれに等価な方法および材料
が本発明の実施および試験に使用され得るが、適切な方法および材料が以下に詳
細に記載される。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許および
他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合に
は、本明細書（定義を含む）が管理する。さらに、材料、方法および実施例は、
例示するのみであり、そして限定することが意図されない。
【００４３】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範
囲から明らかである。
【００４４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、相互作用ポリペプチドを同定するための酵母ベースの系を使用する
、ヘルマンスキー−パドラック症候群（ＨＰＳ）タンパク質（本明細書中以降、
「ＨＰＳタンパク質相互作用タンパク質」または「ＨＰＳＩＰＳ」と命名される
）と相互作用する種々のタンパク質の同定に基づく。ＨＰＳタンパク質相互作用
タンパク質は、生理学的条件下で、ＨＰＳタンパク質と複合体を形成することが
実証された。本明細書中以降、ＨＰＳタンパク質とＨＰＳタンパク質−ＩＰとの
複合体は、「ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体」と命名される
。この相互作用によるこれらのＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合
体は、ＨＰＳタンパク質およびその関連する結合パートナーの機能活性の調節に
関与する。
【００４５】 ＨＰＳ患者は、いくつかの深刻な医学的状態（眼・皮膚白皮症、出血体質、お
よびセロイド沈着を含む）（しばしば、重篤な線維性肺疾患および肉芽腫性大腸
炎により付随される）を患うことが報告されている。しかし、これらのＨＰＳ関
連症候群の認識にもかかわらず、治効性治療介入は、現在、この疾患に対して存
在しない。現在、症候性処置が提供され得る。困難性の１つの潜在的な領域は、
ＨＰＳタンパク質と他の細胞タンパク質との相互作用に関する理解の欠落に関与
する。これらの潜在的な相互作用の解明は、ＨＰＳおよびその関連疾患の診断ア
ッセイおよび／または治療様式をその後に開発するための手段を提供し得る。
【００４６】 本明細書中に開示されるＨＰＳＩＰは、シグナル伝達プロセスに関与するタン
パク質およびタンパク質輸送に関与するタンパク質（１４−３−３ ｅｔａ、Ｈ
ｒｓ、ＢＭＫ１α、ＣＤＫ２、ＮＦ９０）、神経変性障害および発生障害に関与
するタンパク質（アトロフィン−１、ＤＧＳ−１）ならびに以前に特徴付けられ
ていない新規なタンパク質（ＨＰＩＰ１、ＨＮ１ホモログ）に区別され得る。表
Ｉは、本明細書中に開示されるＨＰＳ相互作用タンパク質およびそれらの相互作
用ドメインの概説を提供する。
【００４７】 （（Ａ）シグナル伝達プロセスおよびタンパク質輸送に関与するタンパク質） （（ｉ）１４−３−３ ｅｔａ） １４−３−３タンパク質ｅｔａアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８
０５３６；Ｉｃｈｉｍｕｒａ−Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９２、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．Ｒｅｓ．３１：６００〜６０５）のｃａＨＰＳｏｘｙ末端領域（ヌクレオ
チド７６４で開始する）は、ＨＰＳタンパク質と相互作用することが見出された
。タンパク質の高度に保存された１４−３−３ファミリーは、広範な範囲の生物
および組織に見出され、そして多くの多様な生物学的機能（シグナル伝達、エキ
ソサイトーシスおよび細胞周期の調節を含む）に関与している。１４−３−３タ
ンパク質は、シグナル伝達、細胞周期の調節および／または腫瘍形成に関与する
、広範な範囲の細胞ポリペプチドおよびウイルスポリペプチドに関連することが
実証されており、それらが細胞増殖の調節に関与することを示唆する。例えば、
Ａｉｔｋｅｎ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：９５
〜９７を参照のこと。例えば、ｅｔａアイソフォームは、いくつかのキナーゼと
相互作用し、このことは、細胞内シグナル伝達カスケードおよび細胞タンパク質
のネットワークに１４−３−３ ｅｔａタンパク質を関連付ける。
【００４８】 さらに、透過性の腎傍クロム親和性細胞におけるカルシウム依存性エキソサイ
トーシスは、いくつかのタンパク質（例えば、１４−３−３タンパク質（例えば
、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｂｕｒｇｏｙｎｅ，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８３３
〜８３６を参照のこと）；α−ＳＮＡＰタンパク質（例えば、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｂ
ｕｒｇｏｙｎｅ，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：３２３〜２３９を参照のこと
）；およびプロテインキナーゼＣ（例えば、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｂｕｒｇｏｙｎｅ，
１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８３３〜８３６を参照のこと）を含む）によ
って媒介されることが実証されている。さらに、１４−３−３タンパク質は、エ
キソサイトーシス小胞について分泌小胞のアベイラビリティーの増大を可能にす
るように皮質アクチン障壁（ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｃｔｉｎ−ｂａｒｒｉｅｒ）
を認識することによって透過性細胞におけるカテコールアミンの放出を増強し得
る。例えば、Ｒｏｔｈ＆Ｂｕｒｇｏｙｎｅ，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ３７４：７７〜８１を参照のこと。
【００４９】 タンパク質の１４−３−３ファミリー（ｅｔａアイソフォームを含む）は、脳
組織においてトリプトファンおよびトリプトファンヒドロキシラーゼ（これは、
カテコールアミンおよびセロトニン神経伝達物質生合成における律速段階の１つ
である）を活性化する（例えば、Ｂａｎｉｋら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２；２６２１９〜２６２２５を参照のこと）。１４−３−３タンパク
質は、アルツハイマー病において観察される神経細線維もつれ内に示されている
。この付随は、τタンパク質の過剰リン酸化を引き起こすＭＡＰキナーゼシグナ
ル伝達に対する１４−３−３タンパク質の影響に起因し得る。このτタンパク質
の過剰リン酸化は、アルツハイマー病の犠牲者の脳中に観察される対になったヘ
リックス状フィラメントの形成を生じると考えられている。例えば、Ｌａｙｆｉ
ｅｌｄら、１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０９：５７〜６０を参照
のこと。さらに、１４−３−３タンパク質はまた、クロイツェフェルト−ヤコブ
病を患う患者の脳脊髄液中に示されている。例えば、Ｒｏｓｅｎｍａｎｎら、１
９９７，Ｎｅｕｒｏｌ．４９：５９３〜５９５を参照のこと。
【００５０】 これらのデータは、タンパク質の１４−３−３ファミリー（ｅｔａアイソフォ
ームを含む）が神経変性障害に関与することを示唆する。さらに、１４−３−３
ｅｔａは、シグナル伝達、細胞周期の調節および腫瘍形成における役割を果た
す。
【００５１】 （（ｉｉ）Ｈｒｓタンパク質） ＨＰＳタンパク質と相互作用することが見出された別のタンパク質は、Ｈｒｓ
（肝細胞増殖因子により調節されるチロシンキナーゼ基質）タンパク質（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号Ｄ８４０６４；Ｌｕら，１９９８．Ｇｅｎｅ ２１３：１２５
〜１３５）である。Ｈｒｓは、構造的に保存された推定ジンクフィンガー結合ド
メインおよびいくつかのプロリンに富む領域を有する１１５Ｋｄａｌ細胞質タン
パク質である。例えば、Ｋｏｍａｄａ ＆ Ｋｉｔａｍｕｒａ，１９９５，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６２１３〜６２２１を参照のこと。Ｈｒｓタン
パク質内のチロシン残基のリン酸化は、細胞を上皮増殖因子または血小板由来増
殖因子で処理することによって誘導され得る。従って、Ｈｒｓは、これらの前述
の増殖因子の細胞内シグナル伝達経路において役割を果たすようである。
【００５２】 Ｈｒｓは、ラットＨｒｓ−２（ＡＴＰａｓｅ触媒活性を有する酵素）と８０％
の相同性を示す。Ｈｒｓ−２は、ＳＮＡＰ−２５（小胞輸送（すなわち、小胞ド
ッキングおよび融合）に関与する原形質膜タンパク質）と相互作用する脳タンパ
ク質として特徴付けられた。シナプス小胞ドッキングおよびカルシウム依存性エ
キソサイトーシスは、種々のシナプス小胞膜タンパク質（例えば、ＶＡＭＰおよ
びシナプトガミン（ｓｙｎａｐｔｏｇａｍｉｎ）とそれらの原形質膜に局在化し
た対応物（例えば、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ））
との特異的な相互作用を必要とする。Ｓｏｌｌｎｅｒら、１９９３、Ｃｅｌｌ
７５：４０９〜４１８を参照のこと。次いで、Ｈｒｓ−２は、用量依存性の様式
で分泌を有意に阻害するように機能し、従ってエキソサイトーシスのモジュレー
ターであり得ることが実証された。詳細には、Ｈｒｓ−２のＳＮＡＰ−２５への
結合は、シナプス伝達を支持するに必要とされる濃度で、カルシウムによって阻
害される。従って、Ｈｒｓ−２（および相同なヒトタンパク質Ｈｒｓ）は、小胞
輸送タンパク質複合体（例えば、ＳＮＡＰ−２５）のカルシウム依存性調節およ
びヌクレオチド依存性調節を通じて、分泌プロセスのレギュレーターとして作用
し得る。例えば、Ｂｅａｎら、１９９７ Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８２６〜８２
９を参照のこと。
【００５３】 （（ｉｉｉ）ＢＭＫ１αキナーゼ） ＢＭＫ１αキナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ２９７２５）のｃａＨＰＳｏ
ｘｙ末端領域（ヌクレオチド２４３１で開始する）は、ＨＰＳタンパク質と相互
作用することが見出された。マイトジェン活性化プロテインキナーゼＢＭＫ１は
、細胞周期を介する増殖および進行に必要とされる異なるシグナル伝達経路の一
部である（例えば、Ｌｅｅら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１３（２）：７１５〜７２４を参照のこと）。
【００５４】 （（ｉｖ）ＣＤＫ２） 別のＨＰＳタンパク質−ＩＰは、細胞周期レギュレーターであるＣＤＫ２（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１６２２；Ａｌｌｅｇｅ ＆ Ｓｐｏｔｔｓｗｏｏｄ
，１９９１，ＥＮＢＯ Ｊ．１０：２６５３〜２６５９）である。哺乳動物細胞
周期において、Ｇ１期からＤＮＡ複製期への移行は、サイクリン依存性キナーゼ
（ＣＤＫ）によって調節される。ＣＤＫの活性化は、サイクリンと逆リン酸化反
応との結び付きによって制御される。調節のさらなるレベルは、ＣＤＫのインヒ
ビターによって提供される。ＣＤＫ２は、例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞癌、
および多数の細胞癌の大部分に発現される。より高いＣＤＫ２キナーゼ活性は、
細胞周期の進行の促進、および腫瘍細胞の拘束されない増殖のために重要である
。
【００５５】 （（ｖ）核因子ＮＦ−９０） 核因子ＮＦ９０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１０３２４；例えば、Ｋａｏら、
１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０６９１〜２０６９９を参照の
こと）のｃａＨＰＳｏｘｙ末端領域（ヌクレオチド１９３０で開始する）は、Ｈ
ＰＳタンパク質と相互作用することが見出された。活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の
核因子は、Ｔ細胞活性化の後に分泌されるリンホカインインターロイキン−２（
ＩＬ−２）の遺伝子発現を調節することが示されている。例えば、Ｍａｒｃｏｕ
ｌａｔｏら、１９９８、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ
．１８：３５１〜３５５を参照のこと。ＮＦＡＴの９０および４５Ｋｄａｌサブ
ユニット（すなわち、ＮＦ９０およびＮＦ４５）は、ＩＬ−２プロモーターの抗
原レセプター応答エレメントに特異的に結合する。ＮＦＡＴは、薬物であるシク
ロスポリンおよびＦＫ−５０６のＴ細胞刺激シグナルおよび免疫抑制活性の両方
の核標的である；一方、ＮＦ９０およびＮＦ４５は、インビトロでのＤＮＡ依存
性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）に対する基質である。さらに、組換えＮ
Ｆ９０は、ＤＮＡ−ＰＫのサブユニットとＤＮＡとの間の複合体の形成を促進す
ることが見出されている。例えば、Ｌｕら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７３：２１３６〜２１４５を参照のこと。
【００５６】 （（Ｂ）神経変性障害および発生障害タンパク質） （（ｉ）アトロフィン−１） アトロフィン−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３８５１；Ｍａｒｇｏｌｉｓ
ら、１９９６，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３６：２１
９〜２２６）のｃａＨＰＳｏｘｙ末端領域（ヌクレオチド２６４９で開始する）
は、ＨＰＳタンパク質と相互作用することが見出された。アトロフィン−１の正
確な機能は、未知であるが、アトロフィン−１は、稀で進行性の致死的な常染色
体優勢な神経学的障害である歯状核赤核淡蒼球萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒ
ａｌ ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ ａｔｒｏｐｈｙ）（ＤＲＰＬＡ；スミス
病）に関与する遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＤＲＰＬＡは、
特に、大脳歯状核におけるニューロン変性によって特徴付けられる。臨床的な症
状としては、ミオクローヌスてんかん、大脳失調症、舞踏病アテトーシスおよび
痴呆の種々の組合せが挙げられる。ＤＲＰＬＡは、アミノ酸であるグルタミンを
コードするＣＡＧの３個のヌクレオチド反復の伸長から生じることが示されてい
る。ＤＲＰＬＡ遺伝子産物は、インサイチュハイブリダイゼーションによるとニ
ューロンの細胞質内に主に局在しており（例えば、Ｙａｚａｗａら、１９９５，
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：９９〜１０３）、そして大脳領域および小脳領域に
わたって広範に広がっている（例えば、Ｋｎｉｇｈｔら、１９９７，Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４６：１９〜２６を参照のこと）。
【００５７】 複数のＷＷドメインを含むアトロフィン−１相互作用タンパク質（ＡＩＰ）が
、同定された（例えば、Ｗｏｏｄら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．１１：１４９〜６０を参照のこと）。これらのタンパク質のうちの２つ
は、多数のタンパク質間相互作用モジュールを含むマルチドメインタンパク質で
ある。他の３つのＡＩＰは、高度に相同性であり、各々は、ユビキチンリガーゼ
に特徴的な４つのＷＷドメインおよびＨＥＣＴドメインを有する。
【００５８】 （（ｉｉ）デイ−ジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群（ＤＧＳ）−Ｉタンパ
ク質） 本明細書中に開示されるさらなるＨＰＳタンパク質−ＩＰは、デイ−ジョージ
症候群（ＤＧＳ）−Ｉタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ７７５６６；例え
ば、Ｇｏｎｇら、１９９６，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：７８９〜８００
を参照のこと）である。４０００人の子供のうち１人が、第２２染色体欠失症候
群（デイ−ジョージ症候群）に罹患して誕生し、これは、子供において最も一般
的な遺伝子異常のうちの１つである。デイ−ジョージ症候群に罹患した患者は、
染色体領域２２ｑ１１．２の欠失を有する。ＤＧＳ−Ｉ遺伝子は、４７６アミノ
酸残基からなるタンパク質をコードする第２２染色体のＤＧＳに重要な領域に局
在している。ＤＧＳに関連する臨床的症状としては、心筋不全、胸腺発育不全、
異常な顔面特徴、免疫不全、口蓋裂および血中低カルシウムが挙げられる。
【００５９】 （Ｃ）新規遺伝子によってコードされるＨＰＳ タンパク質−ｌＰ （ｉ）ＨＰＩＰ１ これまで特徴づけされていない１つの遺伝子である、ＨＰＩＰ１と称するもの
が、ＨＰＳ相互作用ポリペプチドであると同定された。
【００６０】 （ｉｉ）ヒトＨＮ１ホモログ これまで特徴付けされていない別のヒト遺伝子（ＨＮ１ホモログと称する）が
、マウス遺伝子ＨＮ−１に対するヒトホモログであると同定された （Ｔａｎｇ
ら、１９９７．Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ８：６９５−６を参照のこと）。マウ
スＨｎ１は、多くの胎児および成体の組織において発現する。最高レベルの発現
は、造血細胞において見出される）（１０日齢の卵黄嚢、血液島由来の循環赤芽
球、１３日齢の胎児性肝臓、成体骨髄および脾臓を含む）。その発現はまた、１
７日齢胎児脳において非常に高く、他方、成体脳における発現は、かなり低い。
マウスＨＮ−１のヒトホモログについてのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が
本発明において開示される。
【００６１】 本発明は、ＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメインおよび本明細書にお
いて開示されるＨＰＳＩＰポリペプチドのＨＰＳ結合ドメインを含むポリペプチ
ドの複合体を包含する。これらの複合体は、例えば、ＨＰＳタンパク質−ＩＰ、
その誘導体、アナログおよびフラグメントを伴う、ＨＰＳタンパク質の誘導体、
アナログおよびフラグメントを包含し得る。１つの実施形態において、そのよう
な複合体は、抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ抗体を結合する。具
体的には、ヒトＨＰＳタンパク質と、ヒトＨＰＳタンパク質−ＩＰタンパク質と
の複合体が開示される。
【００６２】 本発明はまた、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を生成およ
び／または単離する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、組換
えＤＮＡ技術を使用して、ＨＰＳタンパク質およびその結合パートナー（または
、その複合体の一方もしくは両方のメンバーのフラグメント、誘導体もしくはホ
モログ）の両方を発現する方法を提供する。ここで、両方の結合パートナーは１
つの異種プロモーター（すなわち、その特定の複合体成分をコードするネイティ
ブ遺伝子に天然に随伴しないプロモーター）の制御下にあるか、または各々は別
個の異種プロモーターの制御下にあるかのいずれかである。
【００６３】 本発明はまた、それぞれ、部分的なＨＰＩＰ１遺伝子およびヒトＨＮ１ホモロ
グ遺伝子のヌクレオチド配列、ならびにそのそれぞれのコードされるアミノ酸配
列を提供する。本発明は、さらに、ＨＰＩＰ１タンパク質のカルボキシル末端領
域、およびＨＮ１ホモログタンパク質（それらの誘導体、フラグメント、ホモロ
グ、またはアナログ）、ならびにＨＰＩＰ１タンパク質およびＨＮ１ホモログタ
ンパク質またはその誘導体をコードする核酸に関する。本発明は、さらに、多く
の異なる種、好ましくは、脊椎動物、そしてより好ましくは哺乳動物からの、Ｈ
ＰＩＰ１タンパク質およびＨＮ１ホモログタンパク質、ならびにこれら上記タン
パク質をコードする核酸配列を提供する。例えば、１つの実施形態において、Ｈ
ＰＩＰ１タンパク質およびＨＮ１ホモログタンパク質および遺伝子は、ヒト起源
である。上記のタンパク質およびその誘導体、フラグメント、ホモログまたはア
ナログの産生を開示する方法もまた、本発明において提供される。
【００６４】 本発明はさらに、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログの誘導体またはアナロ
グに関し、これらは、生物学的に活性であり、すなわち、全長（野生型）ＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質に関連する、１つ以上の公知の機能的
活性を有する。そのような生物学的活性としては以下が挙げられるがそれらに限
定されない：（ｉ）ＨＰＳタンパク質に結合、またはそれとの相互作用と競合す
る能力；（ｉｉ）抗原性（すなわち、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログと、
結合するか、または、それぞれ、抗ＨＰＩＰ１および抗ヒトＨＮ１ホモログ抗体
に結合することについて、競合する能力；ならびに（ｉｉｉ）免疫原性（すなわ
ち、それぞれ、ＨＰＩＰ１タンパク質およびＨＮ１ホモログについて特異的であ
り、そして結合する抗体を生成する能力）。
【００６５】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびに／あるいはＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の異常レベルと関連する疾患および障
害についての、診断および予後に関連する方法、ならびにそれについてのスクリ
ーニングに関与するこれらの方法が提供される。本発明はまた、以下と関連する
疾患または障害を処置または予防することに関連する方法を提供する：（ｉ）異
常レベルのＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体；（ｉｉ）異常レ
ベルのＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、または（ｉｉｉ）異常
生物学的活性レベルの、その複合体の１つ以上の成分。これらの方法は好ましく
は、以下を包含する：（ｉ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体
を投与する工程；（ｉｉ）ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質を投
与する工程、または（ｉｉｉ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合
体形成または活性のモジュレーター（例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰ複合体、非複合体化ＨＰＳタンパク質、またはその結合パートナーも
しくはそのフラグメント（好ましくは、複合体形成に直接関与するＨＰＳタンパ
ク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの部分を含むフラグメント））に結合する抗
体、を投与する工程。本明細書において開示される方法はまた、以下を包含する
がそれに限定されない：（ｉ）ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ
の変異体であって、結合親和性を増加または減少させるもの；（ｉｉ）タンパク
質複合体形成の低分子インヒビターまたはエンハンサーあるいは（ｉｉｉ）タン
パク質複合体を安定化または中和のいずれかをさせる抗体。
【００６６】 治療剤または診断剤における使用のための生物学的活性を定量的に評価するた
めに、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒ
トＨＮ１ホモログタンパク質、またはモジュレーター（すなわち、インヒビター
、アゴニストおよびアンタゴニスト）の検出することに関連する方法もまた提供
される。
【００６７】 （（１）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびにＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログのタンパク質） 本発明は、ＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメインとＨＰＳＩＰポリペ
プチドのＨＰＳ結合ドメインとの複合体を提供する。
【００６８】 「ＨＰＳＩＰ結合ドメイン」とは、アミノ酸領域が存在するＨＰＳポリペプチ
ドがＨＰＳＩＰポリペプチドに特異的に結合することが可能になるに充分なアミ
ノ酸の領域を意味する。コードされたＨＰＳＩＰ結合ポリペプチドは、全長ＨＰ
Ｓポリペプチドに由来し得るか、またはＨＰＳポリペプチドの誘導体、フラグメ
ント、アナログ、ホモログまたはパラログに由来し得る。好ましくは、この誘導
体、フラグメント、アナログ、ホモログ、またはパラログは、以下の属性の１つ
以上を有する：（ｉ）機能的に活性である（すなわち、全長野生型ＨＰＳに関連
する１つ以上の機能的活性を示し得ること）；（ｉｉ）ＨＰＳＩＰタンパク質に
結合する能力を有する；（ｉｉｉ）免疫原性である、または（ｉｖ）抗原性であ
る。
【００６９】 いくつかの実施形態において、ＨＰＳポリペプチドのフラグメントは、少なく
とも１０、２０、３０、４０，または５０のアミノ酸残基（好ましくは、３５以
下、１００以下または９００以下のアミノ酸残基）のＨＰＳポリペプチドを含む
。コードされたＨＰＳポリペプチドの誘導体またはアナログは、例えば、以下の
ときに、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のア
ミノ酸同一性の、種々の実施形態におけるＨＰＳに対して実質的に騒動である領
域を包含する分子：（ｉ）同一なサイズのアミノ酸配列と比較するとき；（ｉｉ
）そのアラインメントが、当該分野において公知のコンピュータ相同性プログラ
ムによって行われるアラインメントされた配列と比較されるとき、または（ｉｉ
ｉ）以下に議論されるように、コード核酸がストリンジェント、中程度にストリ
ンジェント、または非ストリンジェントな条件下でそのＨＰＳタンパク質をコー
ドする配列とハイブリダイズし得るとき。
【００７０】 従って、いくつかの実施形態において、そのコードされたＨＰＳＩＰ結合ドメ
インは、タンパク質受託番号Ｕ６５６７６を有するアミノ酸配列を含むポリペプ
チドに対して、少なくとも９０％同一である配列を含む、ＨＰＳポリペプチドに
由来する。いくつかの実施形態において、そのドメインは、Ｕ６５６７６のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドと、少なくとも９５％、９８％、または９９％さえ
同一であるＨＰＳポリペプチドに由来する。
【００７１】 「ＨＰＳ結合ドメイン」とは、アミノ酸領域が存在するＨＰＳＩＰポリペプチ
ドがＨＰＳポリペプチドに特異的に結合することを可能にするに十分なアミノ酸
の領域を意味する。コードされるＨＰＳ結合ポリペプチドは、全長のＨＰＳＩＰ
ポリペプチド、またはＨＰＳＩＰポリペプチドの誘導体、フラグメント、アナロ
グ、ホモログもしくはパラログに由来し得る。好ましくは、この誘導体、フラグ
メント、アナログ、ホモログ、またはパラログは、１つ以上の以下の属性を有す
る：（ｉ）機能的に活性である（すなわち、全長野生型ＨＰＳＩＰに関連する１
つ以上の機能的活性を示し得ること）；（ｉｉ）ＨＰＳタンパク質に結合する能
力を有する；（ｉｉｉ）免疫原性である、または（ｉｖ）抗原性である。
【００７２】 いくつかの実施形態において、ＨＰＳ結合ドメインは、ＨＰＳＩＰポリペプチ
ドのフラグメントであるポリペプチド中に存在する。このフラグメントは、少な
くとも１０、２０、３０、４０，または５０のアミノ酸残基（好ましくは、３５
以下、１００以下または９００以下のアミノ酸残基）のＨＰＳポリペプチドを含
む。コードされたＨＰＳＩＰポリペプチドの誘導体またはアナログは、例えば、
以下のときに、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５
％のアミノ酸同一性の、種々の実施形態におけるＨＰＳに対して実質的に騒動で
ある領域を包含する分子：（ｉ）同一なサイズのアミノ酸配列と比較するとき；
（ｉｉ）そのアラインメントが、当該分野において公知のコンピュータ相同性プ
ログラムによって行われるアラインメントされた配列と比較されるとき、または
（ｉｉｉ）以下に議論されるように、コード核酸がストリンジェント、中程度に
ストリンジェント、または非ストリンジェントな条件下でそのＨＰＳＩＰタンパ
ク質をコードする配列とハイブリダイズし得るとき。
【００７３】 従って、いくつかの実施形態において、そのコードされたＨＰＰ結合ドメイン
は、表Ｉに示されるＨＰＳＩＰタンパク質受託番号を有するアミノ酸配列を含む
ポリペプチドに対して、少なくとも９０％同一である配列を含む、ＨＰＳＩＰポ
リペプチドに由来する。いくつかの実施形態において、そのドメインは、参照さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、少なくとも９５％、９８％、または９
９％さえ同一であるＨＰＳポリペプチドに由来する。
【００７４】 ＨＰＳ結合ドメインを提供するＨＰＳＩＰポリペプチドは、は、例えば、１４
−３−３ ｅｔａ，Ｈｒｓ，ＢＭＫ１αキナーゼ ＣＤＫ２，核因子ＮＦ９０、
アトロフィン−ｌ、ＤＧＳ−ｌ：ＨＰＩＰ１またはヒトＨＵＩホモログタンパク
質であり得る。ＨＰＳ結合領域を含むＨＰＳＩＰポリペプチドの例は、表Ｉ第４
欄（「ＨＰＳ−ＩＰのＯＲＦ」と称される）に示されるものである。いくつかの
実施形態において、ＨＰＳ結合ドメインは、そのポリペプチドのアミノ酸配列を
含むポリペプチドにおいて存在する。すなわち、その複合体におけるＨＰＳＴＰ
ポリペプチドは、全長ＨＰＳＴＰポリペプチド（例えば、ヒトまたは齧歯類（ラ
ットまたはマウス）のＨＰＳＩＰポリペプチド）で有り得る。あるいは、ＨＰＳ
ＩＰポリペプチドは、本明細書に記載されるＨＰＳＴＰポリペプチドのフラグメ
ント、ホモログ、またはアナログであり得る。
【００７５】 いくつかの実施形態において、ＨＰＳＴＰ結合ドメインは、ＨＰＳポリペプチ
ドの完全アミノ酸配列を含むポリペプチド中に存在する。すなわち、そのＨＰＳ
ポリペプチドは、全長ポリペプチド（例えば、ヒトまたは齧歯類（ラットまたは
マウス）のＨＰＳポリペプチド）であり得る。いくつの実施形態において、ＨＰ
ＳＩＰ結合ドメインは、受託番号Ｕ６５６７６を有するペプチドを含むＨＰＳポ
リペプチドに存在する。これは、例えば、以下のヌクレオチドによってコードさ
れるポリペプチドである：表Ｉ第２欄に示されるように１２７２−２３０６；１
２７１−２３５７；９１−１２９２；１２７２−２３０６。いくつかの実施形態
において、ＨＰＳＩＰ結合ドメインを含むＨＰＳポリペプチドは、ＨＰＳポリペ
プチドのフラグメント、ホモログまたはアナログである。
【００７６】 所望される場合、ＨＳＰＩＰ結合ドメインを提供するポリペプチドまたはＨＰ
Ｓ結合ドメインを提供するポリペプチド、あるいはその両方は、標識、すなわち
、１つ以上の検出可能な物質へと付着され得る。標識は、ポリペプチドを標識す
るために任意の当該分野において認識される方法を用いて実施され得る。検出可
能な物質の例としては、種々の酵素、置換基、蛍光物質、化学発光物質、生物発
光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはアセチ
ルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な置換基複合体の例としては、ストレプ
トアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の
例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルク
ロリド、またはフォコエリトリン；発光物質としては、ルミノールが挙げられ；
生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエアロキンが
挙げられ；そして適切な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3
Ｈが挙げられる。
【００７７】 従って、本発明はまた、以下を含む複合体に関する：（ｉ）ＨＰＳタンパク質
−ＩＰと相互作用するＨＰＳタンパク質の誘導体、フラグメントおよびアナログ
；（ｉｉ）ＨＰＳタンパク質−ＩＰと相互作用するＨＰＳタンパク質；および（
ｉｉｉ）ＨＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメントおよびアナログと相互
作用する、ＨＰＳの誘導体、フラグメント、およびアナログ。従って、本発明は
、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
ＩＮ１ホモログタンパク質、ならびにその種々の誘導体、フラグメントおよびア
ナログの、細胞機能（特に、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質
−ＩＰが相関付けられている細胞機能）を変更する能力についてスクリーニング
のための方法を提供する。そのような機能としては、以下が挙げられるがそれら
に限定されない：生理学的プロセス（例えば、ベシクル輸送、タンパク質トラフ
ィキング、色素沈着調節、および血小板機能）および病理的プロセス（例えば、
眼・皮膚白皮症、血小板機能不全、神経変性疾患および線維性肺疾患）。
【００７８】 細胞機能を変更する能力に加えて、これらのタンパク質複合体の他の機能とし
ては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体抗体への結合、および当該分野において記載される他の
活性。例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体またはアナ
ログであって、所望の免疫原性または抗原性を有するものは、免疫アッセイにお
いて、免疫のため、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体活性など
のために使用され得る。ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の誘
導体またはアナログであって、目的の特性（例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体における関与）を保持または増強、あるいは欠如または
阻害するものは、それぞれ、そのような特性および生理学的相関のインデューサ
ーまたはインヒビターとして使用され得る。特定の実施形態は、ＨＰＳタンパク
質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰタンパク質のフラグメントのＨＰＳタ
ンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体に関する。このフラグメントは、その
ようなフラグメントがＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体内に包
含されるときに、抗ＨＰＳタンパク質、抗ＨＰＳタンパク質−ＩＰ抗体によって
、あるいはＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体について特異的な
抗体によって結合され得る。
【００７９】 本発明に含まれるのはまた、例えば、ペプチド結合でＨＰＳＩＰポリペプチド
の領域へと共有結合したＨＰＳポリペプチドの領域を含むキメラポリペプチドで
ある。好ましくは、各々ＨＰＳおよびＨＰＳＩＰのポリペプチドから少なくとも
６つのアミノ酸がこのキメラポリペプチドに含まれる。ＨＰＳＩＰポリペプチド
は、例えば、１４−３−３ ｅｔａ，Ｈｒｓ，ＢＭＫＩαキナーゼ、ＣＤＫ２、
核因子ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１またはヒトＨＮ１
ホモログタンパク質の１つ以上であり得る。いくつかの実施形態において、ＨＰ
Ｓポリペプチドに由来するアミノ酸は、ＨＰＳＩＰ結合ドメインを含む。他の実
施形態において、このＨＰＳＩＰポリペプチドに由来するアミノ酸は、ＨＰＳ結
合ドメインまたは領域を包含する。
【００８０】 本発明はさらにＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、ならびにそ
れらの誘導体、ホモログおよびアナログに関する。ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１
ホモログタンパク質の、ネイティブタンパク質、フラグメント、誘導体またはア
ナログは、以下を含む、種々の供給源に由来し得る：例えば、ヒト、マウス、ラ
ット、ブタ、ウシ、イヌ、サル、ハエ、カエル、または植物。
【００８１】 ヒトＨＰＳタンパク質、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１αキナーゼ
、ＣＤＫ２、核因子ＮＦ９０、アトロフィン−１およびＤＧＳ−１をコードする
ＨＰＳヌクレオチド配列は公知である。ＨＰＳタンパク質および ＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰをコードする核酸は、当該分野において公知の任意の方法によって入
手され得る （例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーから、その遺伝子
配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いてクローニングすることによってその
配列の３'および５'の末端にハイブリダイズし得る合成プライマーを用いるＰＣ
Ｒ増幅による）。ホモログ（すなわち、ヒト以外の種に由来する、ＨＰＳタンパ
ク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰをコードする核酸）または他の関連する配列
（例えば、パラログ）は、低い、中程度、または高いストリンジェンシーのハイ
ブリダイゼーション条件下で、プローブとして特定のヒトヌクレオチド配列のす
べてまたは一部を使用すること、および続いてクローニングすることによって、
入手され得る。
【００８２】 ＨＰＳタンパク質および ＨＰＳタンパク質−ＩＰは、単独または複合体中の
いずれかで、タンパク質精製およびインビトロ転写／翻訳について当該分野にお
いて周知の方法によって入手され得る。１つ以上の上記のタンパク質の発現は、
適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写
および翻訳について必要なエレメントを有するベクター）中へと目的のタンパク
質をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む核酸の挿入によって
容易にされ得る。さらに、必要な転写および翻訳のシグナルもまた、ＨＰＳタン
パク質、任意のＨＰＳタンパク質−ＩＰ遺伝子、またはそれらの隣接領域につい
てのネイティブプロモータによって供給され得る。種々の宿主ベクター系を利用
して、このタンパク質コード配列を発現し得る。これらとしては以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：（ｉ）ウイルスに感染した哺乳動物系（例えば、ワ
クシニアウイルス、アデノウイルスなど）；（ｉｉ）ウイルスに感染した昆虫細
胞系（例えば、バキュロウイルス）；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母、ある
いは（ｉｖ）以下で形質転換された細菌：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミ
ドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ。これらのベクターの関連する発現エレメント
は、その強度および特異性において変動する。
【００８３】 １つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質−ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体
は、同じプロモーターまたは２つの別個のプロモーターのいずれかの制御下で、
ＨＰＳタンパク質配列全体およびＨＰＳタンパク質−ＩＰコード配列を同じ細胞
内で発現することによって得られる。別の実施形態において、ＨＰＳタンパク質
の誘導体、フラグメントまたはホモログおよび／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ
の誘導体、フラグメントまたはホモログは、組換え発現される。好ましくは、Ｈ
ＰＳタンパク質の誘導体、フラグメント、またはホモログ、あるいはＨＰＳタン
パク質−ＩＰタンパク質の誘導体、フラグメントまたはホモログは、結合アッセ
イによって同定された結合パートナーと複合体を形成し（例えば、改変された酵
母ツーハイブリッド系）、そしてより好ましくは、抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体抗体とも結合する複合体を形成する。
【００８４】 ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するために、当該分野において公知の任
意の方法が利用されて、タンパク質コード配列のみならず適切な転写／翻訳制御
シグナルをも有するキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築し得る。これらの方
法は、以下を含み得る：インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにｉ）
インビボ組換え（遺伝子組換え）。ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−
ＩＰをコードするヌクレオチド配列の発現は、第二のヌクレオチド配列によって
調節され得、その結果、その遺伝子またはその遺伝子のフラグメントが、目的の
組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現される。
【００８５】 そのタンパク質の発現は、当該分野で公知のプロモーター−エンハンサーによ
って制禦され得る。利用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるがそ
れらに限定されない：（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーター（例えば、Ｂｅｒｎｏｉ
ｓおよび Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１．Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３ １
０を参照のこと）；（ｉｉ）ラウス肉腫ウイルスの３'末端の長末端反復に含ま
れるプロモーター（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０．Ｃｅｌｌ ２２：
７８７−７９７を参照のこと）；（ｉｉｉ）単純ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーター（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５を参照のこと）；（ｉｖ）メタロ
チオネイン遺伝子の調節配列（（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２．Ｎａｔｕｒｅ
２９６：３９−４２を参照のこと）；（ｖ）原核生物発現ベクター（例えば、
βラクタマーゼプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９
７８．Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７
３１を参照のこと）またはｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら，１９
８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−９５を参
照のこと））；（ｖｉ）オパリンシンセターゼプロモーター（例えば、Ｈｅｒｒ
ａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，１９８４．Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−２１３
を参照のこと）またはカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター
（例えば、Ｇａｒｄｅｒら，１９８１．ＮＵＣ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８
７１−２８７９を参照のこと）を含む植物発現ベクター；（ｖｉｉ）光合成酵素
リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｃａＨＰＳｏｘｙｌａｓｅ）
（例えば、Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１０
−１１５−１２０を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）酵母および他の真菌からのプロ
モーターエレメント（例えば、ＧａｌＡプロモーター、アルコールデヒドロゲナ
ーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスフ
ァターゼプロモーター）ならびに（ｉｘ）組織特異性を示し、そしてトランスジ
ェニック動物において利用されてきている動物転写調節領域（例えば、膵臓腺房
細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域）（例えば、Ｓｗｉｆｔ
ら，１９８４．Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６を参照のこと）。
【００８６】 本発明の１つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタ
ンパク質−ＩＰまたはそれらのフラグメント、誘導体もしくはホモログをコード
するヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター、１つ以上の複製起点
、および必要に応じて１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）
を含むベクターが利用される。別の実施形態において、ＨＰＳタンパク質および
ＨＰＳタンパク質−ＩＰのコード配列またはその部分を、一緒にかまたは別個に
含む発現ベクターが市販のｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ発現ベクター；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の１つ
のＥｃｏＲＩ制限部位への上記遺伝子配列のサブクローニングによって作製され
る。例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ７：３１
−４０を参照のこと。これは、正確な読み枠で遺伝子産物を発現することを可能
にする。
【００８７】 目的の核酸配列を含む発現ベクターは、以下の３つの一般的方法によって同定
され得る：（ｉ）核酸ハイブリダイゼーション；（ｉｉ）マーカー遺伝子機能の
存在または非存在；ならびに（ｉｉｉ）挿入された配列の発現。第一の方法にお
いて、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの配列は、挿入された配
列に対して相同および相補的である配列を有するプローブとの核酸ハイブリダイ
ゼーションによって検出される。第二の方法において、組換えベクター／宿主系
は、そのベクターへの目的の配列の挿入によって引き起こされる特定のマーカー
機能（例えば、抗ＨＰＳタンパク質抗体、抗ＨＰＳＩＰ抗体、または抗ＨＰＳタ
ンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体抗体への結合；抗生物質への耐性、バ
キュロウイルスにおける閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成など）
の存在または非存在に基づいて、同定および選択され得る。第三の方法において
、組換え発現ベクターは、組換えベクターによって発現された、ＨＰＳタンパク
質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ産物についてアッセイすることによって同定さ
れ得る。そのようなアッセイは、インビトロアッセイ系における相互作用種の、
例えば、物理的特性または機能的特性（例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタン
パク質−ＩＰ複合体の形成、またはその他に対して特異的な抗体への免疫活性）
に基づき得る。
【００８８】 一旦組換えタンパク質分子が同定され、そしてその複合体または個々のタンパ
ク質が単離されると、当該分野において多数の方法を使用してそれらを増殖／増
幅させ得る。さらに、挿入された配列の発現を調節するように働くか、または特
定の所望の様式で発現されたタンパク質を改変またはプロセシングする宿主細胞
株が選択され得る。特定のプロモーターに由来する発現は、特定のインデューサ
ーの存在下で上昇し得、従って遺伝子操作されたＨＰＳタンパク質および／また
はＩＰＳタンパク質−ＩＰの発現を制御し得る。さらに、異なる宿主細胞は、タ
ンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変（修飾）（例えば、グリ
コシル化、リン酸化など）について特徴および特定の機構を有する。
【００８９】 他の実施形態において、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−
ＩＰ、あるいはそれらのフラグメント、ホモログまたは誘導体は、ペプチド結合
を介して異なるタンパク質の異種タンパク質配列に結合したペプチドを含む、融
合またはキメラタンパク質産物として発現され得る。そのようなキメラ産物は、
当該分野において周知の方法によって、互いに適切な読み枠で所望のアミノ酸を
コードする適切な核酸配列を連結すること、ならびに適切な宿主中のキメラ産物
を発現することによって生成され得る。あるいは、そのようなキメラ産物は、タ
ンパク質合成技術によって生成され得る（例えば、ペプチド合成器の使用による
）。ここで、任意の異種タンパク質をコードする配列に融合されたＨＰＳタンパ
ク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰを含むキメラ遺伝子が構築され得る
。特定の実施形態は、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ
の少なくとも６アミノ酸のフラグメントを含むキメラタンパク質に関する。
【００９０】 本明細書に開示された１つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質およびＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰの相互作用ドメインおよび／または、必要に応じて異種官能
性試薬（例えば、その２つのドメインの間のペプチドリンカー）を含む融合タン
パク質が生成される。ここで、その異種官能性試薬の使用は、ＨＰＳタンパク質
およびＨＰＳタンパク質−ＩＰの結合ドメインの相互作用を促進する。これらの
融合タンパク質は、相互作用の熱力学的安定性が所望される場合（例えば、ＨＰ
Ｓタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体に対して特異的な抗体の生成の場
合）に特に有用であり得る。さらに、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタ
ンパク質−ＩＰの誘導体は、そのそれぞれの配列を、保存的置換、付加または欠
失であって機能的に等価な分子を提供するものの使用によって変更することによ
って生成され得る。ヌクレオチドコード配列の縮重性に起因して、他のＤＮＡ配
列であって、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ遺伝子と実質的に
同じアミノ酸配列をコードするものもまた、本発明の実施において使用され得る
。本発明の特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質
−ＩＰの少なくとも６つの（連続する）のアミノ酸からなるタンパク質が提供さ
れる。他の実施形態において、そのフラグメントは、ＨＰＳタンパク質またはＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰの少なくとも約１０、２０、３０、４０または５０の連続
するアミノ酸からなる。
【００９１】 本発明のＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ誘導体およびアナロ
グ、当該分野において公知の種々の方法によって生成され得る。その産生を生じ
る操作は、遺伝子またはタンパク質のいずれかのレベルにおいて生じ得る。例え
ば、クローニングされたＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ遺伝子
配列は、当該分野で公知の多数の任意の戦略によって改変され得る（例えば、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら，１９８９．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｔ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｎ，Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。次いで、この配列を、制限エンドヌ
クレアーゼを用いて適切な部位で切断し得、単離し得、そしてインビトロで連結
し得る。さらに、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰをコ
ードするヌクレオチド配列は、インビトロまたはインビボで変異され得、以下の
ようにし得る：（ｉ）翻訳開始および／もしくは末端配列を作製ならびに／また
は破壊、あるいは（ｉｉ）コード領域において改変を作製および／または新たな
制限エンドヌクレアーゼ部位を作製または既存のものを破壊して、さらに、イン
ビトロ改変を容易にする。当該分野において公知の変異誘発のための任意の技術
が使用され得る。これには、例えば、化学変異誘発およびインビトロ部位特異的
変異誘発（例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉ
ｅｎｔ．２５３：６５５１−６５５８を参照のこと）；ＴＡＢＴＭＬｉｎｋｅｒ
ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｓａｌａｗ Ｓｗｅｄｅｎ）の使用などが含まれ
る。
【００９２】 一旦ＨＰＳタンパク質および／あるいはＨＰＳタンパク質−ＩＰ、またはその
フラグメントもしくは誘導体を発現する組換え細胞が同定されると、その個々の
遺伝子産物または複合体は単離および分析され得る。これは、そのタンパク質ま
たは複合体の物理的および／または機能的な特性に基づくアッセイの使用によっ
て容易になる。そのアッセイとしては、例えば、その産物の放射性標識に続いて
のゲル電気泳動分析、イムノアッセイ、マーカー標識産物への架橋などが挙げら
れる。
【００９３】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質は、当該分野において公知の標準的な方法によって単離
および精製され得る（天然供給源またはその複合体またはタンパク質を発現する
組換え宿主細胞から）。その方法としては、以下が挙げられる：（ｉ）カラムク
ロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、ゲル排除、逆相高圧
（逆相ＨＰＬＣ）、急速タンパク質液体（ＦＰＬＣ）など）；（ｉｉ）示差的遠
心分離；（ｉｉｉ）タンパク質の精製のために利用される示差的可溶性または他
の任意の標準的な技術。さらに、生物学的機能性は、当該分野において公知の任
意の適切なアッセイを用いて評価され得る。あるいは、一旦ＨＰＳタンパク質−
ＩＰまたはその誘導体が同定されると、そのタンパク質のアミノ酸配列は、それ
がコードされたキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定され得る。結果として
、そのタンパク質（またはその誘導体）は、当該分野において公知の標準的な化
学的方法によって合成され得る。例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，１９８４
．Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１を参照のこと。
【００９４】 ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ配列の操作は、タン
パク質レベルにおいて行われ得る。本発明の範囲内に含まれるのは、ＨＰＳタン
パク質、ＨＰＳタンパク質−ＩＰまたはそれらのフラグメント、誘導体もしくは
アナログの複合体の誘導体であって、翻訳の間またはその後に示差的に改変され
たもの（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護
基／ブロック基での誘導体化、タンパク質切断、抗体分子もしくは他の細胞リガ
ンドへの連結など）である。任意の多数の化学的改変が以下を含む公知の技術に
よって実施され得る：例えば、臭化シアノゲンでの特定の化学的切断、トリプシ
ン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、
ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝合成など。
【００９５】 特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質
−ＩＰの配列は、蛍光標識を含むように改変される。別の特定の実施形態におい
て、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰは、ヘテロ官能性
試薬を含むように改変される。これを使用して、そのタンパク質を、その複合体
の他のメンバーまたは他のＨＰＳ−ＨＰＳタンパク質−ＩＰへと架橋され得る。
さらに、ＨＰＳタンパク質、ＨＰＳタンパク質−ＩＰのアナログおよび誘導体、
またはそれらのアナログおよび誘導体は、化学的に合成され得る。例えば、ＨＰ
Ｓタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの一部に対応するペプチド
であって、所望のドメインを含むかもしくは所望インビトロ活性を媒介するもの
（例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成）は、ペプチ
ド合成器の使用によって合成され得る。さらに、そのようなことが所望される場
合、非古典的なアミノ酸または化学的アミン酸アナログが、ＨＰＳタンパク質お
よび／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰへの置換または付加として導入され得る。
【００９６】 標準的な配列決定技術に加えて、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ
の複合体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質は、親水性分析
によって分析され得る。例えば、Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏｏｄｓ，１９８１．Ｐｒｏ
ｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８を参照
のこと。二次構造分析をもまた行って、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳ
タンパク質−ＩＰの領域であって、特定の構造を推定するものを同定し得る。例
えば、Ｃｈｏｕ ＆ Ｆａｓｍａｎ，１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
３：２２２−２２３を参照のこと。操作、翻訳、二次構造予測、親水性および疎
水性のプロファイル、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング
、ならびに配列相同性の決定はすべて、現在当該分野において利用可能なコンピ
ュータソフトウェアプログラムを用いて達成され得る。構造分析の他の方法とし
ては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｘ線結晶学（例えば、Ｅｎｇ
ｓｔｒｏｍ．１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３を
参照のこと）；質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊ．ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９９７を参照のこと）；そしてコンピュータモデリング
（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ ＆ Ｚｏｌｌｅｒ，編 １９８６．Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）もまた使用され得
る。
【００９７】 （（２）ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質をコードする遺伝子
の同定および単離） 本発明は、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＩＮ１ホモログタンパク質ヲコードするヌ
クレオチド配列を開示する。特定の実施形態において、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログ核酸配列は、ぞれぞれ配列番号１および３またはその部分、あるい
は全体またはその部分で、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質 （
例えば、それぞれ配列番号２および４のアミノ酸またはその部分を含むタンパク
質）を含む。本発明はまた、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログ配列の少なく
とも８ヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズ可能な部分）からなる精製され
た核酸を提供する。他の実施形態において、その核酸は、ＨＰＩＰ１およびヒト
ＨＮ１ホモログ遺伝子配列の、少なくとも約２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチ
ド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド（連
続）、あるいは全長ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログ遺伝子配列からなる。
さらに別の実施形態において、その核酸は、３５ヌクレオチド、２００ヌクレオ
チドまたは５００ヌクレオチドよりも短い長さである。その核酸は、一本鎖また
は二本鎖であり得る。
【００９８】 本発明はまた、上記の核酸配列にハイブリダイズ可能または相補的な核酸に関
する。特に、本発明は、上記の配列に対してハイブリダイズ可能な核酸に対して
逆相補体を提供する。より詳細には、核酸の鎖の逆相補体は、その鎖の逆の方向
に走る相補的配列を有し、その結果、その逆相補体は、その核酸鎖に対してミス
マッチなくハイブリダイズする。１つの実施形態において、ＨＰＩＰ１およびヒ
トＨＮ１ホモログ遺伝子の、少なくとも約１０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド
、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドもしくは２００ヌクレオチドまたはそ
のコード領域全体に対して相補的な配列を含む（特に、その逆相補体である）核
酸が生成される。
【００９９】 １つの実施形態において、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログ核酸配列（例
えば、それぞれ配列番号１および４に示される配列を有するもの）、またはＨＰ
ＩＰ１およびヒトＨＮＴ１ホモログタンパク質誘導体をコードする核酸（または
その相補体）に対して、低ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な核酸
が開示される。例示のためでありそして限定ではなく、低ストリンジェンシー、
中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーの条件を用いる手順は
、以下に記載されるとおりであり得る：例えば、Ｓｈｉｌｏ ＆ Ｗｅｉｎｂｅ
ｒｇ １９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６７
８９−６７９２。低ストリンジェンシー、中程度のストリジェンシー、高ストリ
ンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件（例えば、種をまたぐハイブリダ
イゼーションについて使用されるような）は、当該分野において周知であり、そ
して利用され得る。
【０１００】 ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、またはＨＰＩＰ１およびヒ
トＨＮ１ホモログアンチセンス核酸の誘導体およびアナログをコードする核酸分
子もまた、さらに開示される。「ＨＰＩＰ１および ヒトＨＮ１ホモログタンパ
ク質のフラグメントまたは部分をコードする核酸」とは、ＨＰＩＰ１およびヒト
ＨＮ１ホモログタンパク質の示されるフラグメントまたは部分のみをコードする
核酸を意味し、連続配列としてＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログの他の連続
部分はいはない。
【０１０１】 所定のヌクレオチド配列内には、潜在的なオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）がＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒコンピュータプログラム
を用いて同定され得る。このプログラムは現在、市販されている。すべての公知
のタンパク質翻訳産物が少なくとも６０アミノ酸以上の長さを有する（例えば、
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９９２．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）という事実に起因して、６
０アミノ酸以上のタンパク質を潜在的にコードするこれらのＯＲＦのみが夾呂さ
れる。ＨＰＩＰ１をコードする核酸配列は、終止コドンを有する。ＨＰＩＰ１（
ヌクレオチド１から５１９、１７３アミノ酸）をコードするＯＲＦは、より長い
タンパク質のカルボキシ末端を推定する。ヒトＨＮ１ホモログ（ヌクレオチド１
０６から５６４、１５３アミノ酸リーディングフレーム、メチオニン開始コドン
で始まり、そして終止コドンで終わる）をコードするＯＲＦは、１５３アミノ酸
のタンパク質を予測する。これは、算出された分子量が１５９４６．４である。
【０１０２】 当該分野において利用可能な任意の方法を利用して、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質をコードする全長（すなわち、全長コード配列を含む）
ｃＤＮＡクローンを入手し得る。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用
して、ｃＤＮＡライブラリーからインシリコで配列増幅し得る。同定された配列
の３'末端および５'末端の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライ
マーを、プライマーとして使用して、核酸サンプル（ｃＤＮＡまたはＤＮＡ）、
好ましくはｃＤＮＡライブラリーから；適切な供給源（例えば、改変された酵母
ツーハイブリッドアッセイ融合物の集団についてのもともとのｃＤＮＡライブラ
リーが由来するサンプル）からの目的の配列のＰＣＲによる増幅を容易にし得る
。例えば、ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ
ＣｙｃｌｅｒおよびＴａｑポリメラーゼの使用によって実施され得る。増幅さ
れるＤＮＡは、任意の真核生物種から入手したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含
み得る。ＰＣＲ反応において使用するために、いくつかの異なる縮重プライマー
を合成することを選択し得、そしてＰＣＲ反応をプライミングすることにおいて
使用されるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変動して、核酸ホモ
ログを増幅すること（例えば、ヒト以外の種からのＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１
ホモログタンパク質配列、およびＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１タンパク質に対し
て相同性を有するヒト配列を入手すること、またはヒト配列を入手すること）も
また、公知のヌクレオチド配列と核酸ホモログとの間に、高い程度または低い程
度のヌクレオチド配列相同性を単離することによって、可能である。交叉種ハイ
ブリダイゼーションのために、低ストリンジェンシーが一般に好ましい。対照的
に、同じ種のハイブリダイゼーションのために、中程度のストリンジェント条件
が一般に好ましい。
【０１０３】 ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質配列のすべてまたは一部を含
む首尾良い増幅の後、それらの増幅された配列は、続いてクローニングおよび配
列決定され得る。そして所望な場合、プローブとして利用して完全なｃＤＮＡま
たはゲノムクローンを単離し得る。次いで、これは、機能的分析のために、その
遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析およびそのタンパク質
産物の産生を可能にする。このようにして、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモロ
グタンパク質のヌクレオチド配列は、同定され得る。
【０１０４】 任意の真核生物細胞は、潜在的に、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタン
パク質遺伝子のクローニングのための核酸供給源として働き得る。このＤＮＡは
、当該分野で公知の標準的な手順によって、クローニングされたＤＮＡ（例えば
、ＤＮＡ「ライブラリー」）から、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングによ
り、または所望の細胞から精製された、ゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメント
のクローニングによって、入手され得る（例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら，１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａ）−Ｃｌｏｚｌｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
ＮＹ）；１９８５．ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ．Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，第Ｉ
およびＩＩ卷）。ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コードエキソン性領域に
加えて調節性またはイントロン性のＤＮＡ領域を含み得る。他方、ｃＤＮＡに由
来するクローンは、エキソン性配列のみを含む。
【０１０５】 目的の配列（例えば、遺伝子）をゲノムＤＮＡからクローニングする際に、Ｄ
ＮＡフラグメントは、当該分野において周知の多数の方法によって精製され得る
。これらの方法としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）ＤＮ
Ａの１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた切断、（ｉｉ）マンガンの存在
下でのＤＮアーゼの使用によるＤＮＡの断片化、あるいは（ｉｉｉ）例えば、超
音波処理よりにょるＤＮＡの物理的剪断。次いで、直鎖状の二本鎖ＤＮＡフラグ
メントは、以下を含む標準的な技術によってサイズの関数として分離され得る：
例えば、アガロースおよび／またはポリアクリルアミドゲル電気泳動、勾配超遠
心分離、またはカラムクロマトグラフィー。
【０１０６】 一旦そのＤＮＡフラグメントが精製されると、所望の遺伝子を含む特定のＤＮ
Ａのフラグメントの同定は、種々の方法で達成され得る。例えば、ＨＰＩＰ１お
よびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の一部（例えば以下により生成される：ＰＣ
Ｒ増幅または公知のヌクレオチド配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチド
）またはその特定のｍＲＮＡあるいはそれらのフラグメントもしくは誘導体が精
製および標識され得る。次いで、精製されたＤＮＡフラグメントは、その標識さ
れたプローブ分子に対する核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニング
され得る （例えば以下を参照のこと：Ｂｅｎｔｏｎ Ｒ Ｄａｖｉｓ，１９７
７．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０−１８２；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ，１９７５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
７２：３９６１−３９６４）。制限酵素消化および公知の制限地図（そのような
ものが利用可能である場合）に従って予測されるものとのフラグメントサイズの
比較によるかまたはＤＮＡ配列分析およびＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログ
タンパク質の公知のヌクレオチド配列との比較によって適切なフラグメントを同
定することも可能である。さらなる選択は、目的の遺伝子またはあるいはその発
現された遺伝子産物の特定の特性に基づいて、その産物の物理的、化学的または
免疫学的な特性に基づいたアッセイによって行われ得る。例えば、ｃＤＮＡクロ
ーンまたは適切なｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンは、特定のタ
ンパク質産生に基づいて選択され得る（すなわち、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１
ホモログタンパク質について実証されたように、類似または同一の電気泳動移動
、等電点フォーカシングの挙動、タンパク質加水分解消化マップ、抗原性特性ま
たはＨＰＳタンパク質に結合する能力を産生するこれらのクローンの選択）。さ
らに、ＨＰＩＰ１タンパク質を推定的に産生するクローンは、ＥＬＩＳＡ（酵素
結合免疫ソルベントアッセイ）型の手順において、推定されたクローンに対して
、標識された（ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質について特異的
な）抗体の結合によって同定され得る。ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタ
ンパク質のｃＤＮＡの単離に対する代替方法としては以下が挙げられるがそれら
に限定されない：公知の配列由来の遺伝子配列自体を化学的に合成すること。他
の方法が可能であり、そして本発明の範囲内である。
【０１０７】 続いて、次いで、同定および単離された核酸を、適切なクローニングベクター
に連結し得る。大多数のベクター宿主系が当該分野において公知である。本発明
において利用され得るベクターの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定
されない：バクテリオファージベクター（例えば、λ誘導体）または細菌プラス
ミドもしくは酵母プラスミド （例えば、ｐＢＲ３２２）。目的のＤＮＡフラグ
メントのクローニングベクターへの挿入は、以下を含む種々の方法の使用により
達成され得る：（ｉ）相補的接着性末端の使用；（ｉｉ）酵素（ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメント）を使用して挿入物である末端「平滑末端」を作
製すること；（ｉｉｉ）挿入物ＤＮＡフラグメントに連結された「リンカー」ヌ
クレオチド配列の使用 （例えば、特異的、化学合成されたオリゴヌクレオチド
（ＲＥ配列を含む））、あるいは （ｉｖ）ベクターおよびＤＮＡ挿入物の両方
の相補的、ホモポリマーテールの使用など。
【０１０８】 目的の遺伝子配列の多数のコピーの産生を容易にするために、次いで、組換え
分子を、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、電気泳動などにより
宿主細胞に導入する。代替方法において、所望の遺伝子は、「ショットガン」ク
ローニングアプローチにおいて同定および単離され得る。このアプローチでは、
目的の遺伝子は、例えば、適切なクローニングベクターへのその挿入の前にサイ
ズ分画によって富化される。多量の目的の核酸は、以下を用いて宿主細胞の形質
転換によって生成され得る：（ｉ）ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパ
ク質ヲコードする配列（遺伝子）を有する組換えＤＮＡ分子；（ｉｉ）ＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のｃＤＮＡまたは（ｉｉｉ）化学的に合
成されたＤＮＡ配列。
【０１０９】 本発明によって提供されるＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質配
列は、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：（ｉ）ネイティブのＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質内に見出されるのと実質的に同じアミノ
酸配列；（ｉｉ）機能的に等価なアミノ酸置換物を有するアミノ酸配列、ならび
に（ｉｉｉ）ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の他の誘導体、フ
ラグメントまたはアナログ。
【０１１０】 （（３）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびに ＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のタンパク質に対して特異的な抗体） 本発明によって本明細書において開示されるように、ＨＰＳタンパク質・ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰ複合体またはそれらのフラグメント、誘導体、アナログもし
くはホモログ、あるいは、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、ま
たはそれらのフラグメント、誘導体、アナログもしくはホモログを免疫原として
利用して、上記の免疫原性分子に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。その
ような抗体としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、
およびＦａｂ発現ライブラリー。１つの実施形態において、ヒトＨＰＳタンパク
質およびヒトＨＰＳタンパク質−ＩＰの複合体に対して特異的な抗体が生成され
る。当該分野において公知の種々の方法は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク
質−ＩＰ複合体、またはその誘導体、ホモログもしくはアナログ、あるいはＨＰ
ＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、ホモログ、もしくはアナログに対するポリクローナル抗体の産生のために利用
され得る。抗体の産生のために、種々の宿主細胞は、ネイティブＨＰＳタンパク
質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタン
パク質、またはその合成バージョンもしくは誘導体（例えば、架橋ＨＰＳタンパ
ク質／ＨＰＳタンパク質−ＩＰ）を用いた注射によって免役され得る。
【０１１１】 本発明の実施形態において、抗原性ペプチドによって包含されるエピトープは
、ＨＰＳＩＰポリペプチドの領域であって、そのタンパク質の表面に位置するも
の（例えば、親水性領域）である。抗体産生を標的化するための手段として、親
水性および疎水性の領域を示す親水性疎水性プロットは、以下を含む当該分野に
おいて周知の任意の方法によって生成され得る：Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ
またはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓの方法、これらは、フーリエ変換を伴うかまたは伴
わない。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，１９８１
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；
Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１
５７：１０５−１４２、これらは各々、本明細書においてその全体が参考として
援用される。
【０１１２】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、ホモログもしく
はアナログに対して指向されるモノクローナル抗体の調製のために、連続的なイ
ンビトロ細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法が利用され得る。そ
のような方法としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）ハイブ
リドーマ技術 （以下を参照のこと：Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｆ
１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）；（ｉｉ）トリオーマ技
術 （以下を参照のこと：Ｒｏｓｅｎら，１９７７．Ｃｅｌｌ １１：１３９−
１４７）；（ｉｉｉ）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（以下を参照のこと：Ｋｏ
ｚｂｏｒ．ら，１９８３．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｔｏｄａｙ Ａ：７２８４）ならび
に（ｉｖ）ヒトモノクローナル抗体を産生するために利用されるＥＢＶハイブリ
ドーマ技術（以下を参照のこと：Ｃｏｌｅら，１９８５．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁））。
【０１１３】 本発明の１つの実施形態において、ヒトハイブリドーマを用いる（例えば、以
下を参照のこと：Ｃｏｌｅ．ら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）か、またはヒトＢ細胞のエプスタイ
ンバーウイルス（ＥＢＶ）でのインビトロ形質転換によって（例えば、以下を参
照のこと：Ｃｏｌｅら、１９８５．Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｐｓ
，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６））得られたヒトモノクローナル抗体。別の実施
形態において、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質に対して特異的なマウス抗体からの遺
伝子をスプライスすることによるキメラ抗体の産生のために開発された技術（例
えば、以下を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．ら、１９８４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｔａｋｅｄａら、
１９８５．Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）は、適切な特異性および生
物学的活性のヒト抗体分子をコードする遺伝子とともに、利用され得る。別の実
施形態において、単鎖抗体の産生のための方法（例えば、以下を参照のこと：米
国特許第４，９４６，７７８号）は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐ複合体特異的、かつＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質特異的な
、単鎖抗体を産生するために利用され得る。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリー
の構築のための方法 （例えば、以下を参照のこと：Ｈｕｓｅら１９８９．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１）は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタン
パク質−ＩＰ複合体または個別のＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク
質、誘導体ホモログ、もしくはアナログに対して所望の特異性を有するモノクロ
ーナルＦａｂフラグメント迅速かつ効率よい同定を可能にするように開示される
。非ヒト抗体は、当該分野において公知のいくつかの方法によって「ヒト化」さ
れ得る（例えば、以下を参照のこと：米国特許第５，２２５，５３９号）。
【０１１４】 同様に、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメン
トは、当該分野において公知の技術によって生成され得る。これには、例えば、
以下が含まれ得る：（ｉ）インタクト抗体分子のペプシン消化によるＦ （ａｂ
）2フラグメントの産生；（ｉｉ）Ｆ （ａｂ）2フラグメントのジスルフィド架
橋の産生によるＦabフラグメントの産生；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での
抗体分子の処置によるＦabフラグメント生成；ならびに（ｉｖ）Ｆvフラグメン
ト。
【０１１５】 本発明は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体のドメインに特
異的な抗体を含む。同様に、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の
特定のドメインに対して抗体も開示される。いくつかの実施形態において、その
複合体に対して惹起される抗体は、このメンバーがその複合体に存在しない場合
、その複合体の１つ以上のメンバーに対するよりも高い親和性で結合する。抗体
の産生において、所望の抗体特異性についてのスクリーニングは、当該分野にお
いて公知の任意の技術の使用によって達成され得る（例えば、酵素連結免疫ソル
ベントアッセイ、ＥＬＩＳＡ）。ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複
合体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の特定のドメインに
ついて特異的である抗体を選択するために、そのドメインを含む、ＨＰＳタンパ
ク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体のフラグメント、またはＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質に対して結合する抗体の産生についてハイブリド
ーマをスクリーニングし得る。上記の抗体は、本発明のＨＰＳタンパク質・ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰ 複合体、またはヒトＨＮ１ホモログタンパク質の局在化お
よび／または定量のために利用され得る（例えば、適切な生理的サンプルにおけ
るレベルの測定、診断方法におけるなど）。本発明の別の実施形態において、抗
ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体抗体、およびそのフラグメン
トもしくは誘導体、ならびにＨＰＩＰ１タンパク質およびそれらのフラグメント
もしくは誘導体であって結合ドメインを含むものに対して特異的な抗体が開示さ
れる。
【０１１６】 （（４）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ 複合体ならびにＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のタンパク質と関連するタンパク質お
よび核酸の診断および予後上の使用） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体は、通常の生理的プロセス
の「マーカー」として使用され得、それゆえ診断上の有用性を有する。これらの
プロセスとしては以下が挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）ベシクル輸
送、タンパク質トラフィキング、色素調節、および血小板機能のような生理的プ
ロセス、ならびに（ｉｉ）眼・皮膚（ｏｃｕｌｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ）機能不全
、神経変成疾患および線維性肺血小板疾患のような病理プロセス。さらに、上昇
レベルまたは欠失レベルのＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体な
らびにＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質を伴う特定の患者亜集団
の特徴付けは、新たな疾患分類を生じ得る。これは、従ってさらに診断能力を付
与する。さらに、上記タンパク質のレベルの検出、その関連ｍＲＮＡまたはそれ
らに指向される抗体はまた、アッセイ（例えば、免疫アッセイ）において利用さ
れて、種々の状態、疾患および障害、ならびにそれらの処置を、検出、予後、診
断またはモニターし得る。これらの状態などは、異常レベルのＨＰＳタンパク質
・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体または異常レベルのＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ
１ホモログタンパク質によって特徴づけられる。
【０１１７】 １つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質−ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体
またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質に対して特異的な抗体を
利用して、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨＰＩＰ１
タンパク質の存在について、患者組織または血清のサンプルをアッセイし得る。
ここで、異常レベルのそのタンパク質または複合体は、疾患状態の指標である。
「異常レベル」とは、実際に存在するレベル、または身体の一部に由来するかも
しくはその障害を有しない別の個体からのサンプルである、そのレベルを代表す
る標準的なレベルに対して、増加または減少したレベルと定義される。利用され
得る免疫アッセイとしては以下が挙げられるがそれらに限定されない：以下のよ
うな方法を用いる競合的または非競合的なアッセイ系：ウェスタンブロット、放
射免疫アッセイ；酵素連結免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；「サンドイ
ッチ」免疫アッセイ；免疫沈降アッセイ；沈降（ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ）反応；
ゲル拡散沈降反応；免疫拡散アッセイ；凝集アッセイ；補体固定アッセイ；免疫
放射分析アッセイ；蛍光免疫アッセイ；プロテインＡ免疫アッセイなど。
【０１１８】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の種々の成分をコードする
核酸、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質ならびに関連するヌクレ
オチド配列をコードする核酸、それらのサブ配列および相補配列（少なくとも８
ヌクレオチドの最低の長さを含む）はまた、プローブとしてハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおいて利用され得る。上記のように、そのようなハイブリダイゼ
ーションアッセイを使用して、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合
体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の成分をコードするｍ
ＲＮＡの異常レベルに関連する種々の状態、障害、または疾患状態を、検出、予
後、診断またはモニターし得る。１つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質・
ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の両方のメンバーの発現を同時に測定するために
、ハイブリダイゼーションアッセイを、ＨＰＳタンパク質に対し、およびＨＰＳ
タンパク質の結合パートナーに対してハイブリダイズし得る核酸プローブを用い
て実施する。同様に、別の実施形態において、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモ
ログタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が測定される。
【０１１９】 従って、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の異常レベルを関
与するかまたはそれによって特徴づけられる疾患および障害が診断され得、その
推定される存在は、スクリーニングされた手順によって確認され得、またはＨＰ
Ｓタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、非複合体化されるＨＰＳタンパ
ク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの異常レベルを定量することによっ
て、そのような障害の素因が検出され得る。さらに、機能的活性（例えば、ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰに結合すること、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタ
ンパク質−ＩＰ ＲＮＡにおける変異の検出；ＤＮＡまたはタンパク質（例えば
、トランスロケーション、短縮、野生型ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳ
タンパク質−ＩＰに対するヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列における変化で
あって、ＨＰＳタンパク質−ＨＰＳ・タンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＳタンパク
質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの発現もしくは活性における増加もし
くは減少を引き起こすものを含む）もまた利用され得る。
【０１２０】 さらに、当該分野において公知の種々の免疫アッセイを利用して、ＨＰＳタン
パク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク
質−ＩＰ複合体の非複合体化された成分（すなわち、目的の複合体におけるＨＰ
Ｓタンパク質および／または特異的なＨＰＳタンパク質−ＩＰ）に対する比率が
、特定の疾患もしくは障害に罹患するか、またはそのような疾患もしくは障害を
発生する素因を有する患者からのサンプル内で、そのような疾患もしくは障害を
有しない被検体からサンプル内での同一の比に比較して、増加または減少してい
るか否かを決定し得る。
【０１２１】 検出技術（特に、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨ
ＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質に対する抗体を含む技術）の使用
は、その複合体またはタンパク質を発現する特定の細胞を検出する方法を提供す
る。そのようなアッセイを用いて、特定の細胞型を決定し得る。ここでは、１つ
以上の特定のＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質が発現され、そしてその複合体または
タンパク質の存在が、その細胞生存度と相関づけられる。
【０１２２】 本明細書において具現されるのはまた、採集のためのこれらの上記タンパク質
を特徴付けまたは調製する目的のために、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質
−ＩＰ複合体、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質、あるいはその
誘導体を発現する、細胞培養モデル内でのＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質
−ＩＰ複合体、ならびにＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の検出
のために方法である。この実施形態は、以下を包含する方法を包含する：（ｉ）
原核生物の細胞ソーティング（例えば、以下を参照のこと：Ｄａｖｅｙ ＆ Ｋ
ｅｌｌ．１９９６．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：６４１−６９６）；（
ｉｉ）真核生物（例えば、以下を参照のこと：Ｓｔｅｅｌｅら，１９９６．Ｃｌ
ｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．３９：８０１−８１３）および連続細胞培養物（例えば、
以下を参照のこと：Ｏｒｆａｏ ＆ Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｅｓ，１９９６
．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：５−９）からの初代培養物および組織検体
。
【０１２３】 診断目的のためのキットの使用は、本明細書において開示される。１つの実施
形態において、このキットは、１つ以上の容器内に、抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰ複合体抗体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタン
パク質に対して特異的な抗体、ならびに必要に応じてその抗体に対して標識され
た結合パートナーを備える。この抗体は、以下を含む当該分野において公知の任
意の手段によって検出可能に標識され得る：例えば、化学発光、酵素、蛍光、呈
色、または放射性の標識。１つ以上の容器において、ＨＰＳタンパク質および／
またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ ｍＲＮＡに対してハイブリダイズし得る核酸プ
ローブを含む、第二のキット実施形態。具体的には、そのキットは、１対のプラ
イマー（各々は、そのサイズ範囲が約６から３０ヌクレオチド）を備え得、これ
らは、ＰＣＲ増幅（例えば、以下を参照のこと：Ｉｎｎｉｓ．ら、１９９０．Ｐ
ＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．．Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、離ガーゼ連鎖反応（以下を参照のこと：ＰＣＴ公開ＥＰ
３２０，３０８）または当該分野において公知の他の方法（例えば、Ｑβレプ
リカーゼ、環状プローブ反応など）をプライミングし得る。キットは、必要に応
じてさらに、所定量の精製されたＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複
合体、ＨＰＳタンパク質、またはＨＰＳタンパク質−ＩＰを、標準またはコント
ロールとして使用するために含み得る。
【０１２４】 （（５）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびにＨＰＩＰ
１およびヒトタンパク質ＨＮ１ホモログの治療上の使用） 本発明は、治療化合物の投与（本明細書以降「治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃｓ（大文字））と称する」）による、種々の疾患および障害の処置または予防
を提供する。そのような治療剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されな
い：ＨＰＳタンパク質ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体；ＨＰＳタンパク質および
個々のＨＰＳタンパク質−ＩＰタンパク質、ならびにそれらの誘導体、フラグメ
ントおよびアナログ；それらに対する抗体；ＨＰＳタンパク質および／またはＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰをコードする核酸；ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰのアンチセンス核酸およびＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰ複合体ならびにＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質モジ
ュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。
【０１２５】 上記第２節において概説したように、ＨＰＳタンパク質は、主に、ベシクル輸
送、タンパク質トラフィキング、色素沈着、生理的プロセス調節、および血小板
機能のようなものと相関づけられている。同様に、ＨＰＳタンパク質もまた、以
下を含むがそれらに限定されない病理的状態からの保護と強力に相関づけられて
いる：眼・皮膚白皮症、血小板機能不全、神経変成疾患および線維性肺疾患。
【０１２６】 特徴づけられたＨＰＳタンパク質−ＩＰ（特に、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒ
ｓ、ＢＭＫ１α、ＣＤＫ２およびＮＦ９０）の主要部は、本明細書において開示
されているように、シグナル伝達および分泌プロセスに関与する。連鎖が、シグ
ナル伝達障害と、細胞性アポトーシスとの間に示されており、これは、ＨＰＳタ
ンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰに関連し得る。本発明はまた、自己免疫
疾患および炎症において役割を果たすＨＰＳタンパク質−ＩＰ （例えば、１４
−３−３ ｅｔａ）を開示する。１４−３−３ファミリーのタンパク質は、自己
免疫疾患において重要であり、これは例えば、インスリンレセプター気質１との
相互作用による。さらに、ＨＰＳタンパク質、および本明細書において同定され
るような結合パートナー（例えば、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、アトロフィ
ン−１、およびＤＧＳ−Ｉ）は、神経変成の障害と有意に相関づけられている。
例えば、１４−３−３ ｅｔａは、アルツハイマー病、神経原繊維錯綜およびク
ロイツフェルトヤコブ疾患に罹患する患者の脳脊髄液内に存在することが示され
た。ＡＴＰアーゼであるＨｒｓは、カルシウム調節関連分泌に相関付けされた。
アトロフィン−１は、歯状核赤核淡蒼球（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ ｐａｌ
ｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ）萎縮症（ＤＲＰＬＡ；スミス病）に相関づけられた遺
伝子のタンパク質産物であり、そして神経組織に普遍的に発現する。ＤＧＳ−１
は、発生欠損ディジョージ症候群と関連するタンパク質である。
【０１２７】 ＨＰＩＰ１およびヒトＨん１ホモログタンパク質についでの遺伝子によってコ
ードされるＨＰＳタンパク質−ＩＰもまた、上記のように、ＨＰＳタンパク質お
よびＨＰＳタンパク質−ＩＰの相関づけられた機能に関連し得る。
【０１２８】 （（ａ）ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ
複合体の増加レベルを伴う疾患および障害の処置） 細胞内シグナル伝達、ベシクル輸送およびタンパク質トラフィキングによって
影響を受ける、広汎な細胞性疾患は、治療剤の投与によって処置または予防され
得る。この治療剤は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならび
に／またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の生物学的因子を調
節（すなわち、阻害、拮抗、増強または促進）する。同様に、異常なＨＰＳタン
パク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体のレベルまたは活性、あるいはＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の異常レベルに関連する疾患または障害
はまた、調節治療剤の投与によって処置され得る。特定の実施形態において、Ｈ
ＰＳタンパク質の活性またはレベルは、ＨＰＳタンパク質−ＩＰの投与によって
調節される。別の特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質−ＩＰの活性また
はレベルは、ＨＰＳタンパク質の投与によって調節される。
【０１２９】 （（ｂ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ 複合体形成または活性
の拮抗） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰレベルまたは活性の増加、あるい
はＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のレベルまたは活性の増加に
よって特徴づけられる疾患および障害は、治療剤によって処置され得る。この治
療剤は、これら上記のタンパク質またはタンパク質複合体のレベルまたは活性と
拮抗（すなわち、減少または阻害）する。利用され得る治療剤としては、以下が
挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタン
パク質−ＩＰ（またはそのアナログ、誘導体もしくはフラグメント）；（ｉｉ）
抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体抗体；（ｉｉｉ） ＨＰＳ
タンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰをコードする核酸；（ｉｖ）ＨＰＳタ
ンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰアンチセンス核酸、またはＨＰＩＰ１お
よびヒトＨＮ１歩もログたんぱく質アンチセンス核酸の同時投与；（ｖ）ＨＰＳ
タンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−、あるいはＨＰＩＰ１およびヒト
ＨＮ１ホモログタンパク質核酸であって、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰコード配列のコード配列内への異種（非ＨＰＳ関連）挿入（これは、
ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質―ＩＰｐの内因性機能を、相
同組換によって「ノックアウト」するために使用される）に起因して機能不全で
あるもの（例えば、以下を参照のこと：Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９．Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１９８８−１９９９）。
【０１３０】 本発明の特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタ
ンパク質−ＩＰ遺伝子の部分を含む核酸であって、これらの上記の配列が異なる
遺伝子配列に隣接するものは、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク
質−ＩＰのあんた語にストとして利用されるか、またはＨＰＳタンパク質および
／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの相同組換によって不活化を促進するように利
用される。例えば、Ｋｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９．Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊ
ｌｓｔｒａら，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８を参照のこと
。さらに、第一のＨＰＳタンパク質−ＩＰの変異体または誘導体であって、ＨＰ
Ｓタンパク質について、第二のＨＰＳタンパク質−ＩＰよりも高い親和性を有す
るものは、ＨＰＳタンパク質結合について、第二のＨＰＳタンパク質−ＩＰと競
合するように投与され得、それにより、第二のＨＰＳタンパク質−ＩＰを含むＨ
ＰＳタンパク質複合体のレベルを減少させる。他の治療剤であって、ＨＰＳタン
パク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモ
ログタンパク質の機能を阻害する治療剤は、公知のインビトロアッセイの使用に
より同定され得る。このアッセイは、例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰ結合を阻害するそれらの能力に基づく。
【０１３１】 さらなる特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐ複合体系性または活性、あるいはＨＰＩＰ１および人ＨＮ１ホモログタンパク
質の活性と競合する治療剤は、以下において治療的に（予防的を含む）投与され
る：（ｉ）ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、あるいはＨＰＩ
Ｐ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質のレベルの増加を含む、疾患または障
害、あるいは（ｉｉ）疾患または障害であって、インビトロまたはインビボでの
アッセイがＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ
１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質アンタゴニスト投与の有用性を示すもの
。ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質のレベルの増加は、当該分野において標準的な方
法によって容易に検出され得、これらは以下を包含するがそれらに限定されない
：ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質を検出および／または可視化するための免疫アッ
セイ（例えば、ウェスタンブロット免疫沈降に続いてドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動など）、ならびに／あるいはＨＰＳタ
ンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、または個々のＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質のｍＲＮＡの同時発現を検出するためのハイブリ
ダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロットアッセイ、ドットブロット
、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０１３２】 （（ｃ） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の発現の減少） １つの実施形態において、ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＰＳタンパク質・Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰ複合体発現（すなわち、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰ複合体の発現および／またはその複合体の形成）の減少、あるいはＨ
ＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質発現の減少は、これらのタンパク
質部分をコードするｍＲＮＡを標的化することによって達成される。ＲＮＡ治療
剤は、現在、３つのクラスに分類される：アンチセンス種、リボザイムまたはＲ
ＮＡアプタマー。例えば、以下を参照のこと：Ｇｏｏｄら、１９９７．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｎ ４：４５−５４。
【０１３３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最も広汎に利用されているほうほうであ
って、そして以下に説明される。リボザイム治療は、特定のＲＮＡを切断、結合
または他の方法で不活化して、特定のタンパク質の発現を減少もしくは除去する
低分子ＲＮＡの投与、誘導された発現などを包含する。例えば、以下を参照のこ
と：Ｇｒａｓｓｉ ＆ Ｍａｒｉｎｉ，１９９６．Ａｒｚｎａｌｓ ｏｆ Ｍｅ
ｄ．２８：４９９−５１０；Ｇｉｂｂｏｎ １９９６．Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１５：２８７−２９９。現在、「ヘアピン」お
よび「ハンマーヘッド」ＲＮＡリボザイムの生成は、特定のｍＲＮＡ（例えば、
ＨＰＳタンパク質をコードするｍＲＮＡ）を特異的に標的化するために必要であ
る。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質について特異的なＲＮＡ離岸度（例えば、
ＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ）である（例えば、以下を参照のこと：Ｇｏｏｄら
，１９９７．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｆ−ａｐｕ４：４５−５４）。これらは、その翻
訳を特異的に阻害し得る。
【０１３４】 本発明の別の実施形態において、ＨＰＳタンパク質の活性またはレベルは、Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰ、ＨＰＳタンパク質−ＩＰをコードする核酸、またはＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰに免疫特異的に結合する抗体もしくはその結合ドメインを含
む抗体のフラグメントもしくは誘導体の投与によって減少する。本発明のなお別
の局面において、ＨＰＳタンパク質または特定のＨＰＳタンパク質−ＩＰ（例え
ば、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質）の増加レベルに関連する
疾患もしくは障害は、その複合体形成がＨＰＳタンパク質もしくはその特定のＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰを、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形
成を通じて減少もしくは不活化するように作用する場合、ＨＰＳタンパク質・Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成を増加する治療剤の投与によって処置もしくは
予防され得る。
【０１３５】 （（ｄ）ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ
複合体のレベルの減少を伴う疾患および障害の処置） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＳタンパク質または
特定のＨＰＳタンパク質−ＩＰの過少発現に関連する疾患および障害は、ＨＰＳ
タンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体または機能を促進（すなわち、増加
または供給）する治療剤の投与によって処置または予防される。そのような治療
剤の例としては、以下があげられるがそれらに限定されない：ＨＰＳタンパク質
・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ならびにその誘導体、アナログおよびフラグ
メントであって、機能的に活性であるもの（例えば、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体を形成するに活性であるもの）、複合体化されていない
ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰタンパク質、ならびにその誘導
体、アナログ、およびフラグメント、ならびにＨＰＳタンパク質・タンパク質−
ＩＰ複合体、あるいはその機能的活性誘導体もしくはフラグメントのメンバーを
コードする核酸（例えば、遺伝子治療における使用のため）。
【０１３６】 （（ｅ）治療剤の生理学的効果の決定） 好ましくは、適切なインビトロまたはインビボアッセイを利用して、特定の治
療剤の効果を決定し、そしてその投与が離間した組織の処置のために適応される
か否かを決定する。種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイは、患
者の障害に関与する代表的細胞または細胞型を用いて実施して、治療剤がそのよ
うな細胞型に対する所望の効果を有するか否かを決定し得る。
【０１３７】 治療剤としての使用のための化合物は、ヒトでの試験の前に適切な動物モデル
系において試験し得る。この系は例えば、以下を包含し得る：ラット、マウス、
ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。インビボ試験について、ヒトに対する投与
の前に、当該分野において公知の任意の動物モデル系が使用され得る。
【０１３８】 （（６）ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質複合体に関連する疾患およ
び障害） （（ａ）色素沈着（ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）障害） ＨＰＳタンパク質は、目皮白皮症および色素低下症のような色素沈着障害に対
して強力に相関付けられている。本発明の治療剤、特に、ＨＰＳタンパク質・Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰ複合体活性を調節（または供給）するものは、色素沈着疾
患または障害を処置または予防するにおいて有効であり得る。ＨＰＳタンパク質
・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体のレベルまたは活性を調節する治療剤は、以下
を含む当該分野において公知の任意の方法によってアッセイされ得る：例えば、
細胞培養モデルを用いたインビトロアッセイおよび色素沈着疾患もしくは障害の
動物も出るを用いたインビボアッセイ。例えば、以下を参照のこと：ＭｃＧｅｏ
ｃｈ．ら、１９８６、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：８１３−８２５。
【０１３９】 従って、一旦色素沈着疾患または障害がＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質
−ＩＰ複合体活性の調節による処置を受け入れ得ることが示されると、色素沈着
疾患または障害は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成を調
節する（ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を供給することを包
含する）治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０１４０】 （（ｂ）血小板機能不全） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体活性の調節によって処置さ
れ得る血小板機能不全は、以下の２つの一般的クラスへと分類される：（ｉ）血
小板貯蔵プール欠損（例えば、ヘルマンスキー−パドラック症候群、チェディア
ック東症候群、グレー血小板症候群）と関連する疾患もしくは血小板減少；なら
びに（ｉｉ）血小板減少または増加した血栓傾向（例えば、心筋梗塞、深静脈血
栓症、心臓血管事故、一過性虚血性衝撃）。
【０１４１】 本発明の治療剤、特にＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体活性
を調節（または供給）するものは、血小板機能不全疾患または障害を処置または
予防するにおいて有効であり得る。治療剤は、コントロールに比較して動物モデ
ルにおいて例えば、血小板機能不全疾患または障害を減少し得る。従って、一旦
血小板機能う全疾患または障害がＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複
合体活性の調節による処置を受け入れ得ることが示されると、その血小板機能不
全疾患または障害は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成を
調節する（ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を供給することを
包含する）治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０１４２】 （（ｃ）神経変性障害） ＨＰＳタンパク質は、神経変性疾患において役割を果たすことと相関付けられ
ている。従って、本発明の治療剤（例えば、ＨＰＳタンパク質および／またはタ
ンパク質複合体を調節（または供給）するもの）は、神経変性疾患を処置または
予防するにおいて有効であり得る。神経変性障害に関与するＨＰＳタンパク質・
ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を調節する本発明の治療剤は、当該分野において
公知の任意の方法によって、そのような神経変性疾患および障害を処置または予
防するにおける効力について、アッセイし得る。そのようなアッセイとしては以
下が挙げられるがそれらに限定されない：制御された細胞分泌、タンパク質トラ
フィキング、および／またはフォールディング、またはアポトーシスの阻害、あ
るいは、神経変性疾患もしくは障害の動物モデルを用いたインビボアッセイイン
ビトロアッセイなど。治療剤としては、例えば、限定ではなく、制御された細胞
成熟を促進し得、そして培養物中の細胞アポトーシスを予防し得るか、またはコ
ントロールに比較して、動物モデルにおいて、神経変性を減少させ得る。
【０１４３】 （（ｄ）線維性肺疾患） ＨＰＳタンパク質はまた、重篤な線維性肺疾患の病因と強力に相関付けられて
いる。本発明の治療剤、特にＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体
のレベルまたは活性を調節するものは、線維性肺疾患の処置または予防するにお
いて有用であり得る。治療剤は、以下を含む線維性肺疾患を処置または予防する
における効力について、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイさ
れ得る：例えば、細胞培養モデルを用いるインビトロアッセイ、および線維性肺
疾患の動物も出るを用いたインビボアッセイ。
【０１４４】 一旦線維性肺疾患がＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の調節
による処置を受け入れ得ることが示されると、その線維性肺疾患は、ＨＰＳタン
パク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成を調節（ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体を供給することを包含する）治療剤の投与によって処置
または予防され得る。
【０１４５】 （（７）ＨＰＳ関連疾患の処置の方法） （（ａ）遺伝子治療） 遺伝子治療とは、被検体への公知の特定の配列の核酸分子の投与により実施さ
れる治療をいう。当該分野において現在公知の任意の方法が、本発明の実施にお
ける遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子治療の一般的概説については、例
えば、以下を参照のこと：Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｗｕ ＆ Ｗｕ，１９９１．Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５；Ｔｏｌｓ
ｔｏｓｈｅｖ，１９９３．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｙ１２：４８８−５
０５；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｖｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；Ｍｏｒｇａｎ
＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−
２１７．１９９３。
【０１４６】 本発明の１つの実施形態において．ＨＰＳタンパク質、ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐまたはそれらの機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療によ
り、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を調節するため、または
ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質機能を調節するために投与され
る。他の実施形態において、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰ、
その機能的誘導体またはキメラタンパク質の両方をコードする核酸（単数または
複数）は、遺伝子治療の使用により投与される。次いで、これらの実施形態にお
いて、その核酸分子は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を調
節すること、またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質機能を調節
することによって治療的効果を媒介するタンパク質をコードするそのタンパク質
を生成する。特に、この上記の核酸は、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳ
タンパク質−ＩＰコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを有し、その
プロモーターは、誘導性または構造的であり、そして必要に応じて、組織特異的
である。別の特定の実施形態において、核ＨＰＳタンパク質および／もしくはＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰコード配列またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタ
ンパク質、ならびに任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同組換
を促進する領域に隣接する核酸分子が使用され、従って、ＨＰＳタンパク質およ
びＨＰＳタンパク質−ＩＰの核酸の染色体内発現を提供する。例えば、以下を参
照のこと：Ｋｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９．Ｐｒｏｕｅ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｋｓｔｒ
ａら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８。さらに別の実施形態
において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード領域に作動可能に
連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、その核酸の発現は、転写の適
切なインデューサーの存在または非存在を制御することによって制御可能である
。
【０１４７】 その核酸の患者への送達は、直接（その患者がその核酸を有するベクターに直
接暴露される場合）、または間接（細胞がまずその核酸でインビトロ形質転換さ
れ、次いでその患者に移植される場合）のいずれかであり得るこれらの２つのア
プローチは、それぞれ、インビボおよびエキソビボの遺伝子治療として知られる
。特定の実施形態において、その核酸は、それがコードされた産物を産生するよ
うに発現する場合インビボで直接投与される。これは、以下を含む当該分野にお
いて公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る：例えば、（ｉ）適切な
核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、そしてそれを投与しその結果それ
が細胞内にあるようになることによる；（ｉｉ）欠失または減弱されたレトロウ
イルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染（例えば、米国特許代４，９８
０，２８６号を参照のこと）；（ｉｉｉ）裸のＤＮＡの直接注射によるか、また
は微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏ
ｎｔ）の使用；（ｉｖ）脂質または細胞表面レセプターあるいはトランスフェク
ト剤を用いたコーティング；（ｖ）リポソーム、微粒子または微小カプセルにお
けるカプセル化によるか、あるいは、核へ侵入することが知られるペプチドに連
結させてそれを投与すること；（ｖｉ）それをリガンドと連結させて投与して、
レセプター媒介されたエンドサイトーシスに供すること （例えば、以下を参照
のこと：Ｗｕ ＆ Ｗｕ．１９８７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２
９−４４３２）、これは、そのレセプターを発現する細胞型を標的化するために
使用され得る；など。別の実施形態において、核酸リガンド複合体が形成され、
ここで、そのリガンドは、融合原性ウイルスペプチドを含み、このペプチドは、
エンドソームを破壊し、その核酸のリソソーム破壊を妨害する。さらに別の実施
形態において、その核酸は、特定のレセプターを標的化することによる細胞特異
的な摂取および発現のためのインビボ標的化され得る（例えば、以下を参照のこ
と：米国特許第５，８４４，１０７号）。あるいは、その核酸は、細胞内に導入
され得および相同組換によって発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る
。たとえば、以下を参照のこと：Ｋｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８
９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３
５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８。
【０１４８】 特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質
−ＩＰコード核酸配列を含むウイルスベクターが利用される。例えば、ウイルス
ゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みのために必要ではな
いレトロウイルス配列を欠失するように改変されたレトロウイルスベクターが使
用され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３．Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９。遺伝子治療において使用されるべ
き、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ（好ましくは、Ｈ
ＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰの両方）をコードする核酸は、そ
のベクターにクローニングされ、これは、患者へのその遺伝子の送達を容易にす
る。例えば、以下を参照のこと：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｅｓｔ．９３、６４４−６５１；Ｋｉｅｍら：１９９４．Ｂｌｏｏｄ ８３：
１４６７−１４７３。
【０１４９】 本発明の別の実施形態において、アデノウイルスは、遺伝子治療におけるウイ
ルスベクターとして利用し得、そして遺伝子の呼吸器上皮への送達のために特に
魅力的な「ビヒクル」である。アデノウイルスは、天然に、呼吸器上皮に感染し
、そこで、そのウイルスは、緩和な疾患を引き起こすが、アデノウイルスベース
の送達系のための他の標的としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：
肝臓、中枢神経系、上皮細胞および筋肉。アデノウイルスは、非分割性細胞に感
染し得るさらなる利点を有する。例えば、以下を参照のことＫｏｚａｒｓｋｙ
＆ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３．Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．
３：４９９−５０３。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療におけ
る使用について提唱されている。例えば、以下を参照のこと：Ｗａｌｓｈら、１
９９３．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３０
０。
【０１５０】 本発明の実施における遺伝子治療に対する別のアプローチは、インビトロ細胞
培養物中の遺伝子を細胞へ移入することを包含する。通常、移入の方法は以下を
包含する：選択マーカーをその細胞へ移入して、移入される遺伝子を取り込みそ
してそれを発現するそれらの細胞の単離を容易にすること。この実施形態におい
て、その核酸は、以下を包含する当該分野において公知の任意の方法によって得
られた組換え細胞のインビトロ投与の前に細胞へ導入される：例えば、トランス
フェクション、エレクトロポレーション、微小注入、その核酸配列を含むウイル
スもしくはバクテリオファージベクターへの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子
移入、微小細胞媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、など。例えば、以下を
参照のこと：Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ＆ Ｂｅｈｒ，１９９３．Ｍｅｔｈ．Ｃｏｈｅ
ｎ，ｅｔａｌ．，１９９３．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１
８；２１７：６１８−６４４：ｃｌｉｎｅ，１９８５．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｈｅｒ．２９：６９−２２。この移入技術は、その核酸を安定に細胞へと移入し
、その結果、その核酸がその細胞によって発現され得、そしてその細胞の子孫に
よって遺伝可能でありかつ発現可能であるように、ならびにレシピエント細胞の
その必要な発生および生理学的機能が破壊されないことを確実にすることを提供
するように選択されるべきである。得られた、選択された、組換え細胞は、当該
分野において公知の種々の方法によって患者に送達され得る。１つの実施形態に
おいて、上皮細胞は、皮下注射されるか、または患者上の皮膚移植片として塗布
される。組換血球（例えば、造血幹細胞または子孫細胞）は、好ましくは、静脈
内に投与される。利用される細胞の総濃度および送達経路は、所望の効果、患者
の状態などに依存し、そしてそれら個々の当業者によって確認され得る。
【０１５１】 核酸が遺伝子治療の目的で導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞
型を包含し、そして以下が挙げられるがそれらに限定されない：上皮細胞、ケラ
チノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、
マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；ならびに種々の造血幹細胞
またはその子孫細胞（以下から得られる：骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓など
）好ましくは、遺伝子治療に用いられる細胞は、その患者に対して自己性である
。
【０１５２】 組換え細胞が遺伝子治療に使用される本発明の１つの実施形態において、ＨＰ
Ｓタンパク質をコードする核酸分子および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰをコ
ードする核酸分子（好ましくは、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐの両方をコードする核酸分子）は、その細胞へと導入され、その結果、遺伝子
（単数または複数）は、その細胞またはその子孫によって発現可能であり、そし
て次いでその組換え細胞は治療効果のためにインビボ投与される。１つの実施形
態において、幹細胞またはその子孫細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣを含む）
、上皮組織の幹細胞（例えば、皮膚および腸の内張り、胚性心臓筋肉細胞、肝臓
幹細胞（例えば、以下を参照のこと：ＰＣＴ 特許公開ＷＯ ９４／０８５９８
）、ならびに神経幹細胞（例えば、以下を参照のこと：Ｓｔｅｍｐｌｅ ＆ Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ．１９９２．Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５）が利用され得る
。上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、組織（例えば、皮膚および腸
の内張り）から公知の手順によって得られ得（例えば、以下を参照のこと：Ｒｈ
ｅｉｎｗａｌｄ，１９８０．Ｍｅｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１：２２９−２４
７）、そして組織培養物において増殖し得る（例えば、以下を参照のこと：Ｐｉ
ｔｔｅｌｋｏｗ ＆ Ｓｃｏｔｔ．１９８６．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏ
ｃ．６１：７７１）。ＥＳＣはドナーから提供される場合、対移植片宿主反応の
抑制のための方法（例えば、中程度の免疫抑制を促進するためのに照射、薬物ま
たは抗体投与）もまた利用され得る。
【０１５３】 造血幹細胞（ＨＳＣ）について、ＨＳＣのインビトロでの単離、増殖および維
持を提供する任意に技術が本発明のこの実施形態において使用され得る。これが
達成され得る技術としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）
将来の宿主またはドナーから単離された骨髄細胞のＨＳＣの単離および樹立、あ
るいは （ｉｉ）同種異系または異種性であり得る、すでに樹立されたＨＳＣ長
期培養物の使用。非自律ＨＳＣは、好ましくは、将来の宿主患者の移植免疫反応
を抑制する方法とともに用いられる。本発明の１つの特定の実施形態において、
ヒト骨髄細胞は、針吸引によって後腸骨稜から得られ得 （例えば、以下の文献
を参照のこと：Ｋｏｄｏら，１９８４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１
３７７−１３８４）そして、討議分野において公知の任意の技術によって、高度
に富化または実質的に純粋な形態にされ得る。骨髄細胞の長期培養は、例えば、
以下のものを使用することによって樹立および維持し得る：Ｄｅｘｔｅｒ細胞培
養技術（以下を参照のこと：Ｄｅｘｔｅｒら，１９７７．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ ９１．−３３５）またはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養技術（以下
を参照のこと：Ｗｉｔｌｏｃｋ ＆ Ｗｉｔｔｅ，１９８２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６０８−３６１２）． （（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチド） 本発明の実施形態において、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合
体形成および機能は、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ
のアンチセンス核酸の使用によって阻害され得、そして好ましくは、ＨＰＳタン
パク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰの両方を包含する。さらに、本発明は、（
少なくとも６ヌクレオチド長の）核酸の治療的または予防的な使用を開示する。
この核酸は、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰあるいは
その部分をコードするゲノム配列（遺伝子）またはｃＤＮＡである。そのような
アンチセンス核酸は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形成を
阻害する治療剤としての有用性を有し、そして治療的または予防的な様式におい
て利用され得る。
【０１５４】 本発明の別の特定の実施形態は、原核生物細胞または真核生物細胞内でのＨＰ
Ｓタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰ核酸配列の発現の阻害のための方法
を開示する。この方法は、その細胞に、治療的有効量のＨＰＳタンパク質および
ＨＰＳタンパク質−ＩＰのアンチセンス核酸またはその誘導体を提供する工程を
包含する。
【０１５５】 本発明のアンチセンス核酸は、オリゴヌクレオチドであり得、これは、細胞に
直接投与され得るか、または外因性の導入された配列の転写によってインビボで
産生され得る。さらに、このアンチセンス核酸は、ＨＰＳまたはＨＰＳタンパク
質−ＩＰのｍＲＮＡのコード（すなわち、エキソン）領域および／または非コー
ド（すなわちイントロン）領域のいずれかに相補的であり得る。ＨＰＳタンパク
質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰのアンチセンス核酸は、少なくとも、６ヌクレ
オチド長であり、そして好ましくは６〜２００ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌ
クレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、少なくとも１０ヌクレオチドであり、少なくとも１５ヌクレオチドであり、
少なくとも１００ヌクレオチドであり；または少なくとも２００ヌクレオチドで
ある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得（また
はそのキメラ混合物、誘導体もしくは改変体）、一本鎖または二本鎖のいずれか
であり得、そして塩基、糖またはリン酸の骨格部分で改変され得る。
【０１５６】 さらに、本発明のアンチセンスヌクレオチドは、他の関連する官能基（例えば
、ペプチド、オリゴヌクレオチドの細胞膜を横切る輸送を容易にするペプチド部
分、ハイブリダイゼーションが惹起する架橋剤、ハイブリダイゼーションが惹起
する開裂剤など）を有し得る。例えば、以下を参照のこと：Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３−６５５６；ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ８８／０９
８１０．。特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質
−ＩＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムを含
む。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｒｖｅｒら、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７：１２２２−１２２５。
【０１５７】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知の標準的
な方法によって合成され得る。そのような方法には以下が含まれる：（ｉ）自動
ホスホロチオエート媒介性オリゴヌクレオチド合成（例えば、以下を参照のこと
：Ｓｔｅｉｎら、１９８８．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）ま
たは（ｉｉ）メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された孔ガラスポ
リマー支持体の使用によって調製され得る （例えば以下を参照のこと、Ｓａｒ
ｉｎら，１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，４ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
５：７４４８−７４５１）。
【０１５８】 代替の実施形態において、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰア
ンチセンス核酸は、外因性配列の転写によって細胞内で産生される。例えば、（
細胞によりエキソサイトーシスされるときに）インビボに転写されるベクターが
生成され得る。これは従って、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）種を生成する。上記
のベクターは、それが所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る
限り、エピソーム性のままであり得るか、または染色体内に組み込まれ得る。本
発明の実施において利用されるベクターは、細菌、ウイルス、酵母または当該分
野における他の供給源に由来し得る。これは、哺乳動物細胞における複製および
発現のために利用される。ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰのア
ンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）細
胞において機能する当該分野において公知の任意のプロモーターによって容易に
され得る。そのようなプロモーターは、誘導性または構成性であり得、そして以
下が挙げられるがそれらに限定されない：（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーター領域
；（ｉｉ）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端長末端反復プロモーター；
（ｉｉｉ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターおよび（ｉｖ）メタ
ロチオネイン遺伝子の調節配列。
【０１５９】 ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰのアンチセンス核酸は、ＨＰ
Ｓタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体を発現（または好ましくは過剰発
現）する細胞型の障害を処置または予防するに置いて予防的または治療的に利用
され得る。ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰのＲＮＡを発現また
は過剰発現する細胞型は、以下を含むがそれらに限定されない当該分野において
公知の種々に方法によって同定され得る：ＨＰＳタンパク質特異的な核酸および
ＨＰタンパク質−ＩＰ特異的な核酸を用いたハイブリダイゼーション （例えば
、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、
インサイチュハイブリダイゼーション）あるいは特定の細胞型からのＲＮＡがイ
ンビトロでＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰへと、インビトロで
翻訳される能力を免疫組織化学によって観察することによるもの。例えば、患者
ｋらの初代組織を、例えば、免疫細胞化学またはインサイチュハイブリダイゼー
ションによる実際の処置の前に、ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパ
ク質−ＩＰ発現について、アッセイされ得る。
【０１６０】 薬学的に受容可能なキャリア内に含まれる有効量のＨＰＳタンパク質およびＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰアンチセンス核酸を含む、本発明の薬学的組成物は、ＨＰ
Ｓタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体のＲＮＡまたはタンパク質を発現
または過剰発現する型の疾患または障害を有する患者へと投与され得る。特定の
障害または状態の処置において有効であるＨＰＳタンパク質および／またはＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰのアンチセンス核酸の量は、その障害または状態の性質に依
存し、そして標準的な臨床技術によって決定され得る。可能な場合、インビトロ
でそのアンチセンスの細胞傷害性を判定することが所望され、次いで、ヒトにお
ける試験および使用の前に有用な動物モデルにおいて判定されることが所望され
る。特定の実施形態において、ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰ
アンチセンス核酸を含む薬学的組成物は、リポソーム、微粒子、または微小カプ
セルを介して投与され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｌｅｏｎｅｔｔｉら、
１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２４４
８−２４５１。
【０１６１】 （８．ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質ＩＰ複合
体アッセイ） ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホ
モログタンパク質、あるいはその誘導体、フラグメントおよびアナログの機能的
活性は、当該分野において公知の種々の方法によってアッセイされ得る。ＨＰＳ
タンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ
１ホモログタンパク質の活性の潜在的な機能的調節因子（例えば、インヒビター
、アゴニストおよびアンタゴニスト）（例えば、ＨＰＳタンパク質、ＨＰＳタン
パク質−ＩＰまたはＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体について特異的な抗体または
アンチセンス核酸）は、それがＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合
体形成および／または活性を調節する能力について、ならびにＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質活性についてアッセイされ得る。
【０１６２】 （（ａ）イムノアッセイ） 野生型ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰタンパク質と、結合、
あるいは上記のタンパク質またはタンパク質複合体について特異的な抗体への結
合について競合する能力についてアッセイする、本発明の１つの実施形態におい
て、当該分野において公知の種々の免疫アッセイ方法が使用され得る。これには
、例えば、以下が挙げられる：例えば、以下を使用する競合性アッセイシステム
および非競合性アッセイシステム：放射性免疫アッセイ、酵素連結免疫ソルベン
トアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッ
セイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ、ウェ
スタブロット、沈降反応、凝集アッセイ、競合固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ
、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイなど。
【０１６３】 （（ｂ）遺伝子発現アッセイ） ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの遺伝子の発現（内因性遺伝
子または組換えＤＮＡから発現されるもの）は、以下を含む当該分野において公
知の技術を用いて検出され得る：種々の細胞型において、ＨＰＳタンパク質およ
びＨＰＳタンパク質−ＩＰの遺伝子について特異的なプローブを用いた、サザン
ハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、制限エンドヌクレ
アーゼマッピング、ＤＮＡ配列分析、およびポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ
）、続いてサザンハイブリダイゼーションもしくはＲＮアーゼ保護（例えば、以
下を参照のこと：Ｃｔｒｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ Ｎｅｘ Ｙｏｒｋ、ＮＹ））。
【０１６４】 本発明の１つの特定の実施形態において、サザンハイブリダイゼーションは、
ＨＰＳタンパク質および／またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの遺伝子の変異の、生
理学的状態または病理状態への、遺伝子連鎖を検出するように使用され得る。種
々の発生段階における多数の細胞型は、そのＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタン
パク質−ＩＰのそれらの発現（特に、同じ細胞内でのＨＰＳタンパク質およびＨ
ＰＳタンパク質−ＩＰの同時発現）について特徴付けられ得る。ノーザンブロッ
トまたはサザンブロット分析についてのハイブリダイゼーション状態のストリン
ジェンシーを操作して、使用される特定のプローブへの関連性の所望の程度を有
する核酸の検出を確実にし得る。これらの上記の方法の改変および当該分野にお
いて周知の他の方法が本発明の実施において利用され得る。
【０１６５】 （（ｃ）結合アッセイ） ＨＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体（例えば、フラグメント）、アナログおよび
ホモログは、当該分野において公知の任意の方法によってそれらのＨＰＳタンパ
ク質に結合する能力についてアッセイされ得る。これには、例えば以下が挙げら
れる：改変された酵母ツーハイブリッドアッセイシステム、複合体におけるＨＰ
Ｓタンパク質に結合する抗体を用いた免疫沈降に続いてその免疫沈降したタンパ
ク質を、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるサイズ分画分
析、ウェスタン分析、非変性ゲル電気泳動および類似の方法。
【０１６６】 （（ｄ）生物学的活性アッセイ） 本発明の１つの実施形態は、ＨＰＳタンパク質の誘導体、アナログまたはホモ
ログの、生物学的活性についてのスクリーニングのための方法を提供する。この
方法は、そのＨＰＳタンパク質の誘導体、アナログ、またはホモログを、以下か
らなる群より選択されるタンパク質に接触させる工程：ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質、ならびにそのＨＰＳタンパク質の誘導体、アナログま
たはホモログとその他との間の複合体の引き続いての形成を検出する工程であっ
て、その複合体の形成を検出することは、そのＨＰＳタンパク質の誘導体、アナ
ログ、またはホモログが、生物学的（例えば、結合）活性を有することを示す、
工程、を包含する。
【０１６７】 さらなる実施形態は、以下からなる群より選択されるタンパク質の誘導体、ア
ナログ、またはホモログの、生物学的活性についてのスクリーニングのための方
法を開示する：１４−３−３タンパク質，Ｈｒｓ．ＢＭＫＩα，ＣＤＫ２，ＮＦ
９０，アトロフィン−１，、ＤＧＳ−Ｉ，またはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホ
モログタンパク質。ここでこの方法は、そのタンパク質の誘導体、アナログまた
はホモログをそのＨＰＳタンパク質に接触させる工程、およびそのタンパク質の
誘導体、アナログまたはホモログと、そのＨＰＳタンパク質との間の複合体の続
いての形成を検出する工程であって、その複合体の形成を検出することは、その
タンパク質の誘導体、アナログ、またはホモログが生物学的（例えば、結合）活
性を有することを示す、工程を包含する。
【０１６８】 （（ｅ）タンパク質の生物学的活性の調節） 本発明はまた、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰに関与し得る目的
のタンパク質の生物学的活性の調節のための方法を開示する。これは、その目的
のタンパク質の結合パートナーまたはその誘導体もしくはアナログを投与するこ
とによる。例えば、ＨＰＳタンパク質（および誘導体もしくはそのアナログ）が
ＨＰＳタンパク質−ＩＰの活性またはレベルを調節する能力は、細胞を接触させ
ること、動物に投与すること、ＨＰＳタンパク質またはＨＰＳタンパク質をコー
ドする核酸を用いてＨＰＳタンパク質−ＩＰ遺伝子を発現すること、またはＨＰ
Ｓタンパク質を免疫特異的に結合する工程、およびＨＰＳタンパク質−ＩＰレベ
ルまたは活性における変化を測定することような方法によって確認され得る。Ｈ
ＰＳタンパク質−ＩＰレベルまたは活性における変化は、ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐレベルまたは活性を調節する能力を有するＨＰＳタンパク質の指標である。
【０１６９】 本発明の代替の実施形態において、ＨＰＳタンパク質−ＩＰは、ＨＰＳタンパ
ク質の活性またはレベルを、以下により調節する能力についてアッセイされ得る
：細胞に以下を接触させること、以下を動物に投与すること、以下を有するＨＰ
Ｓタンパク質遺伝子を発現すること：（ｉ）ＨＰＳタンパク質−ＩＰ；（ｉｉ）
ＨＰＳタンパク質−ＩＰをコードする核酸または（ｉｉｉ）ＨＰＳタンパク質−
ＩＰに免疫特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含む、抗体のフラ
グメントもしくは誘導体、ここで、ＨＰＳタンパク質レベルまたは活性における
変化は、ＨＰＳタンパク質−ＩＰがＨＰＳタンパク質レベルまたは活性を調節し
得ることを示す。
【０１７０】 ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、またはＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質、またはその誘導体、アナログもしくはフラグメ
ントはまた、ＨＰＳタンパク質の活性およびタンパク質結合パートナー（すなわ
ち、ＨＰＳタンパク質−ＩＰ）（特にＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタン
パク質）の活性を調節するにおける活性についてスクリーニングされ得る。本発
明のタンパク質およびタンパク質複合体は、下記の如くＨＰＳタンパク質・ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰ複合体を調節する（すなわち、増加または減少させる）能力
についてスクリーニングされ得る。
【０１７１】 （（ｆ）色素沈着障害の処置についてのアッセイ） ＨＰＳタンパク質は、色素沈着障害の病因と相関付けられている。この障害に
は、眼・皮膚白皮症および過小色素沈着が挙げられる。従って、ＨＰＳタンパク
質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体ならびにその誘導体、アナログおよびフラグ
メント、ＨＰＳタンパク質遺伝子をコードする核酸、抗ＨＰＳタンパク質・ＨＰ
Ｓタンパク質−ＩＰ複合体、ならびに他の調節因子は、インビトロおよびインビ
ボのアッセイの両方において色素沈着障害の処置または予防における活性につい
て試験され得る。
【０１７２】 １つの実施形態において、治療剤は、以下によって、色素沈着障害を処置また
は予防するにおける活性についてアッセイされ得る：インビトロで色素沈着反応
の指標を示す培養された細胞を、その治療剤に接触させること、およびその治療
剤に接触している細胞における指標のレベルを、そのように接触していない細胞
におけるその指標のレベルとを比較すること、ここで、その接触している細胞に
おけるより低いレベルは、その治療剤が色素沈着障害の処置または予防において
活性を有することの指標である。そのようなアッセイのために使用され得る細胞
モデルとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：培養された白斑メ
タのサイトおよびケラチノサイトを用いるインビトロ研究 （例えば、以下を参
照のこと：Ｂｅｓｓｏｕら１９９７．Ｂｒ．Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｉ３７：８
９０−８９７）；ヌル遺伝子型ｐ （ｃｐ）／ｐ（２５Ｈ）のマウスからの不死
性重篤過小色素沈着メラノサイトおよびメラニン芽細胞の株（例えば、以下を参
照のこと：Ｓｖｉｄｅｒｓｋａｙａら１９９７．Ｊ．、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ
ａｔｏｌ．１０８：３０−３４）およびメラノサイト移動を研究するためのヒト
皮膚の有機型培養物 （例えば、以下を参照のこと：Ｌｅ Ｐｏｏｌｅら、Ｐｉ
ｇｍｅｎｔ．ＣｅｌｌＲｅｓ．７：３３−４３、１９９４）。
【０１７３】 （（ｇ）血小板機能不全の処置についてのアッセイ） ＨＰＳタンパク質は、血小板機能不全に相関付けられている。従って、ＨＰＳ
関連タンパク質およびタンパク質複合体は、インビトロおよびインビボのアッセ
イにおけるそのような血小板機能不全の処置または予防における活性について試
験され得る。
【０１７４】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、以下により、血小板機能不全の
処置または予防における活性についてアッセイされ得る：インビトロで色素沈着
反応の指標を示す培養された細胞を、その治療剤に接触させること、およびその
治療剤に接触している細胞における指標のレベルを、そのように接触していない
細胞におけるその指標のレベルとを比較すること。別の実施形態において、本発
明の治療剤は、以下により血小板機能不全の処置または予防における活性におい
てアッセイされ得る：血小板反応を示す試験動物または血小板反応を示さないが
後に血小板反応を惹起する薬剤によるチャレンジを受ける試験動物にその治療剤
を投与すること；およびその治療剤の投与後にその血小板反応における変化を測
定すること。
【０１７５】 正確に天然のヒト血小板機能不全を模倣する血小板機能不全の多数の動物モデ
ルが当該分野において知られている。特定のモデルの例としては以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：ラットモデルにおける皮膚出血時間試験 以下を参
照のこと：ＭａｃＤｏｎａｌｄら，１９９４．Ｔｉｚｒｏｍｂ Ｒｅｓ．７６：
５３５−５４０）；ラット実験モデルにおける血小板抑制薬剤の出血時間と抗血
栓効果との間の相関 （以下を参照のこと：Ｓｕｅｈｉｒｏら，１９９４．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８３：１５
７−１６３）ならびに他の類似のアッセイ。
【０１７６】 （（ｈ）神経変性疾患の処置についてのアッセイ） ＨＰＳは、種々の神経変性疾患に関連する。本発明の１つの実施形態において
、本発明の治療剤は、以下により神経変性疾患の処置または予防においてその活
性についてアッセイされ得る：神経変性疾患の指標（例えば、α−Ａ４ペプチド
のインビトロ過剰発現）を示す培養細胞にその治療剤を接触すること、およびそ
の治療剤と接触している細胞におけるその指標レベルを、そのようには接触して
いない細胞におけるその指標のレベルを比較すること。ここで、その接触してい
る細胞におけるより低いレベルは、その治療剤が神経変性疾患の処置または予防
において活性を有することの指標である。神経変性疾患についての細胞培養モデ
ルの特定の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：罹患した個体
および罹患していない個体からの培養ラット内皮細胞（例えば以下を参照のこと
：Ｍａｎｅｉｒｏら，１９９７．Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．１９：５−１２）；Ｐ１９マウス胚癌腫細胞（例えば以下を参
照のこと：Ｈｕｎｇら１９９２．Ｐｌｖｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８９：９４３９−９４４３）およびマイネルトの基底核からのコリン作用性
ニューロンの剥離した細胞培養物 （例えば以下を参照のこと：Ｎａｋａｊｉｍ
ａら，１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６３
２５−６３２９）。
【０１７７】 別の実施形態において、本発明の治療剤は、以下によって神経変性疾患の処置
または予防における活性についてアッセイされ得る：ａ＾−ＡＰＰを発現するト
ランスジェニック動物における認知欠損の未熟発達のような神経変性疾患の症状
を示すか、または神経変性疾患の症状を発症する素因を有する試験動物にその治
療剤を投与すること；およびその治療剤の投与後にその神経変性疾患の症状にお
ける変化を測定すること。特定の神経変性疾患動物モデルの例としては以下が挙
げられるがそれらに限定されない：部分的トリソミー１６マウス（以下を参照の
こと：ＨＨｏｌｚｍａｎら、１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９３：１３３３３−１３３３８）；双極性：両側基底核損傷ラット（
以下を参照のこと：Ｐｏｐｏｖｉｃら、１９９Ｇ．ｌｕｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．８６：２８１−２９９）；加齢ラット（Ｍｕｉｒ．１９９７．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．５６：６８７−６９６），アルツハイマ
ー疾患のＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスモデル（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏ
ｄら、１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１５５
０−１５５５）、および実験自己免疫痴呆（Ｏｒｏｎら，１９９７．Ｊ．Ｎｅｕ
ｒａｌＴｒａｎｓｍ．補遺４９：７７−８４）。
【０１７８】 （（ｉ）ＨＰＳタンパク質およびタンパク質複合体のアンタゴニストおよびア
ゴニストのスクリーニング） 本発明は、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体、ＨＰＳタンパ
ク質、またはＨＰＳタンパク質−ＩＰ核酸、タンパク質または誘導体に特異的に
結合する分子の検出についてのアッセイを提供する。例えば、ＨＰＳタンパク質
および／もしくはＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体核酸の両方またはＨＰＩＰ１お
よびヒトＨＮ１ホモログタンパク質核酸を発現するを発現する組換え細胞を使用
して、これらのアッセイにおいて使用されるその複合体またはそのタンパク質を
組換え産生して、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体に結合また
は阻害する分子、あるいはＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質の機
能を阻害する分子についてスクリーニングし得る。
【０１７９】 あるいは、調節因子は、ネイティブＨＰＳタンパク質のプロモーターでもネイ
ティブＨＰＳタンパク質−ＩＰプロモーターでもないプロモーターから、ＨＰＳ
タンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰの両方を発現するトランスジェニック
非ヒト動物に対して、候補分子を投与することによって同定される。ここで、好
ましくは、その候補分子はまた、トランスジェニック非ヒト動物において発現さ
れる。あるいは、そのような調節因子を同定するための方法は、インビトロで実
施され得、好ましくはＨＰＳタンパク質精製したＨＰＳタンパク質−ＩＰおよび
精製した候補分子を用いて行われ得る。スクリーニングされる薬剤はまた、すべ
ての形態の抗血清、アンチセンス核酸アドを含み得、これらは、ＨＰＳタンパク
質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体活性を調節し得るか、またはＨＰＩＰ１およ
びヒトＨＮ１ホモログタンパク質活性を調節し得る。
【０１８０】 例示ではあるが限定ではなく、多様なライブラリー（例えば、ランダムペプチ
ドまたはコンビナトリアルペプチド、または非ペプチドのライブラリー）が、Ｈ
ＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体またはＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質に特異的に結合する分子についてスクリーニングされ得
る。多くのライブラリーは、当該分野において知られる（例えば、化学合成ライ
ブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）
およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）。そのライブラリーをスクリーニ
ングすることは、任意の種々の一般に使用される公知の方法によって達成され得
る。例えば以下を参照のこと：Ｂｏｃｋら，１９９２．Ｎａｔｕｒｅ ３５５：
５６：３６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｒ１．Ｓｃｌ．Ｌ’Ｓ．ｄ ８９：６９８８−６９９２；米国特許第５，０９６
，８１５号；米国特許第５，２２３，４９８号；米国特許５，１９８，３４６号
；ＰＣＴ公開Ｎｏ．番号ＷＯ９４／１８３１８。
【０１８１】 １つの実施形態において、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体
活性を調節（すなわち、アンタゴナイズまたはアゴナイズ）する薬剤は、結合阻
害アッセイを用いてスクリーニングされ得る。ここで、薬剤は、それがＨＰＳタ
ンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の形成を、水性生理的結合条件下で阻
害する能力についてスクリーニングされる。ここで、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳ
タンパク質−ＩＰ複合体形成は、試験されるべき薬剤の非存在下で生じる。ＨＰ
Ｓタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の形成を阻害する薬剤は、複合体
形成のアンタゴニストと識別される。ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−Ｉ
Ｐ複合体の形成を除去する薬剤は、複合体形成のインヒビターと識別される。Ｈ
ＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の形成を増強する薬剤は、複合
体形成のアゴニストと識別される。
【０１８２】 スクリーニングについて本発明の実施において利用される方法は、以下を包含
し得る：以下を用いてその複合体タンパク質を標識すること：（ｉ）ｒａｄｉｏ
ｌｉｇａｎｄｓ （例えば、125Ｉまたは3Ｈ）；（ｉｉ）磁性リガンド （例え
ば、フォトビオチン（ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ）アセテートに共有結合した常磁
性ビーズ）；（ｉｉｉ）蛍光性リガンド（例えば、フルオレセインまたはローダ
ミン）、あるいは （ｉｖ）酵素リガンド（例えば、ルシフェラーゼ、またはβ
ガラクトシダーゼ）。次いで溶液中で結合する反応剤は、．当該分野において公
知の多くの技術のうちの１つによって単離され得る。それには以下が挙げられる
がそれらに限定されない：標識されていない結合パートナー（またはその標識部
分において使用されるものとは識別可能な標識で標識された結合パートナー）に
たいする抗血清を用いた標識された部分の免疫共沈；免疫親和性クロマトグラフ
ィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および密度勾配遠心分離。結合の際に、
標識された種は、そのフィルターを通過させないようにし、複合体血清の単純な
アッセイを提供する。
【０１８３】 代表的な結合アッセイは、例えば、限定ではなく、以下において実施され得る
：１０−２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５−５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ
５−８、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００ または他の界面活性剤で
あって相互作用の特異性を改善するものの水性塩溶液。金属キレート剤および／
または二価のカチオンを添加して結合を改善し得および／または加水分解を減少
させ得る。反応温度としては以下が挙げられる：４℃、１０℃、１５℃、２２℃
、２５℃、３５℃または４２℃、そしてインキュベート時間は、代表的には、ス
クリーニング１５秒間であるが、より長い時間が、結合平衡を生じさせるために
好ましい。特定のＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体は、慣用タ
ンパク質結合アッセイを用いてアッセイされた、再現性のよい結合についての指
摘結合条件を決定し得る。次いで、複合体形成の物理的パラメータは、利用され
る特定の標識について特異的なアッセイ方法（すなわち、放射能検出のための液
体シンチレーション分光学）を用いて複合体形成の定量によって分析され得る。
次いで、この反応結果は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｈｉｌｌ分析および他の一
般的に当該分野において公知の方法を用いて定量的に分析される。例えば、以下
を参照のこと：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．第２版（１９９３） Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編
（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
ＮＹ）。
【０１８４】 結合アッセイに対する第二の共通のアプローチにおいて、結合種の１つは、固
体状態のプラットフォーム（例えば、フィルター、マイクロタイタープレートウ
ェル、試験管、クロマトグラフィーマトリクスなど）に共有結合または非共有結
合的な手段のいずれかで固定される。１つの実施形態において、固定されたＨＰ
Ｓタンパク質を利用して、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体形
成を調節するその能力について試験される化合物の存在または非存在下で標識さ
れるＨＰＳタンパク質−ＩＰとの結合についてアッセイし得る。その結合パート
ナーは、水性の生理的条件下で（すなわち、もとの相互作用が検出された条件下
）で、結合させられる。逆に、さらに別の実施形態において、ＨＰＳタンパク質
−ＩＰが固定され、そして標識されたＨＰＳタンパク質、またはその誘導体と、
結合条件下で接触される。
【０１８５】 （（ｊ）タンパク質同士の相互作用についてのアッセイ） 本発明は、ＨＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメント、アナログおよび
ホモログを、ＨＰＳタンパク質との結合についてアッセイおよびスクリーニング
するための方法を開示する。ＨＰＳタンパク質と相互作用する、ＨＰＳタンパク
質−ＩＰの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、酵母ツーハイブ
リッドアッセイ系（例えば以下を参照のこと：Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ，１
９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）；または好ましくは、その改
変および改良の手段（以下に記載される：米国特許出願第０８／６６３，８２４
（１９９６年６月１１日出願）および同０８／８７４，８２５ （１９９７年
６月１３日出願）（これらはともに発明の名称「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ Ｏｃｃｕｒ ｉｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏ
ｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｔｈｅｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」（Ｎａｎｄａｂａｌａｎら）で
あり、その全体が本明細書において参考として援用される）によって同定され得
る。
【０１８６】 改善された酵母ツーハイブリッド系による相互作用タンパク質の同定は、レポ
ーター遺伝子（本明細書以後「レポーター遺伝子（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ
）」と称する）の発現の検出に基づく。レポーター遺伝子の転写は、転写調節因
子の半分に各々が融合した、２つのタンパク質の相互作用による転写調節因子の
再構成に依存する。ベイトＨＰＳタンパク質（または誘導体、フラグメント、ア
ナログもしくはホモログ）、およびプレイタンパク質（そのベイトタンパク質と
相互作用する能力について試験されるべきタンパク質）は、それぞれＤＮＡ結合
タンパク質および転写調節ドメインへの融合タンパク質として発現されるかまた
はその逆である。本発明の特定の実施形態において、プレイ集団は、ＨＰＳタン
パク質−ＩＰの変異体をコードする１つ以上の核酸であり得る（例えば、部位特
異的変異誘発またはヌクレオチド配列における変異を生成する別の方法による）
。好ましくは、そのプレイ集団は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡゲノムＤＮＡまた
は合成生成されたＤＮＡ）によりコードされるタンパク質である。例えば、その
集団は、哺乳動物ＲＮＡからのｃＤＮＡの集団の特徴づけされていないサンプル
に由来するｃＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子から発現され得る。別の特定の実施
形態において、ランダムなペプチドを発現する生物学的ライブラリーを、プレイ
核酸の供給源として使用し得る。
【０１８７】 本発明は、ＨＰＳタンパク質−ＩＰのインヒビターについてのスクリーニング
のための方法を開示する。手短には、タンパク質同士の相互作用アッセイを、１
つ以上の候補分子の存在下で、そのアッセイが行われることを除き本明細書上記
に記載したとおりに実施し得る。その１つ以上の候補分子が非存在のときに、存
在したものに比較した、レポーター遺伝子活性において生じる増加また減少は、
その候補分子が、相互作用対合に対する効果を発揮することを示す。１つの実施
形態において、そのタンパク質相互作用の阻害は、例えば、酵母細胞が生存する
のに必要であり、そこで、減弱化していないタンパク質相互作用が、ＵＲＡ３遺
伝子の活性化を生じ、これは、化学物質５−フルオロオロチン酸を含む培地中で
の酵母の死をもたらす。例えば、以下を参照のこと：Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９
８３．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１６７−１８０。
【０１８８】 一般に、ベイトおよびプレイの集団を含むタンパク質は、融合（キメラ）タン
パク質として提供され、好ましくはこれは、各々のタンパク質を予め選択した配
列に連続して含むキメラコード配列の組換え発現による。一方の集団について、
予め選択した配列ハイブリダイゼーション、そのドメインがプロモーター内のＤ
ＮＡ配列を特異的に認識する限り、任意のＤＮＡ結合ドメインであり得るＤＮＡ
結合ドメインである（例えば、転写アクチベーターまたはインヒビター）。他方
の集団について、予め選択された配列は、それぞれ、転写アクチベーターまたは
インヒビターのアクチベーターまたはインヒビターのドメインである。調節ドメ
イン単独（タンパク質配列に対する融合物としてではない）およびＤＮＡ結合ド
メイン単独（タンパク質配列に対する融合物としてではない）は好ましくは、検
出可能には相互作用せず、その結果、アッセイにおける擬陽性が回避される。そ
のアッセイ系は、転写アクチベーター（またはインヒビター）のＤＮＡ結合ドメ
インについての結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結されたレポーター
遺伝子をさらに包含する。従って、本発明の実施において、プレイ融合タンパク
質へのＨＰＳタンパク質融合タンパク質の結合は、転写アクチベーター（または
インヒビター）の再構成をもたらし、これは、同時に、レポーター遺伝子の発現
を活性化（または阻害）する。
【０１８９】 特定の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、１つ以上のタン
パク質同士の相互作用を検出するための方法を開示する：（ｉ）第一の接合型で
ありＨＰＳタンパク質配列およびＤＮＡ結合ドメインを含む第一の融合タンパク
質を有する酵母細胞の第一の集団中にＨＰＳタンパク質（またはその誘導体、フ
ラグメント、アナログもしくはホモログ）を組換え発現する工程であって、ここ
で、その酵母細胞の第一の集団は、そのＤＮＡ結合ドメインによって認識される
１つ以上のＤＮＡ結合部位によって「駆動される」プロモーターに作動可能に連
結される第一のヌクレオチド配列を含み、その結果、その第一のタンパク質の第
二の融合タンパク質（転写活性化ドメインを含む）への相互作用が、第一のヌク
レオチド配列の転写物の増加を生じる、工程；（ｉｉ）その第二の融合タンパク
質の非存在下で第一のヌクレオチド配列の転写の増加が生じる第一の集団におい
て、それら酵母細胞の除去するためにネガティブ選択を行う工程；（ｉｉｉ）第
一の接合型とは異なる第二の接合型の酵母細胞の第二の集団において、複数の第
二の融合タンパク質を組換え発現させる工程であって、その第二の融合タンパク
質は、ＨＰＳタンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモロ
グの配列および転写アクチベーターのの活性化ドメインを含み、ここで、その活
性化ドメインは、各々第二の融合タンパク質において同じである、工程；（ｉｖ
）酵母細胞のその第一の集団を、酵母細胞の第二集団と接合して、二倍体の酵母
細胞の第三の集団を形成する工程であって、二倍体酵母細胞の第三の集団は、Ｄ
ＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ結合部位によって「駆動」されるプ
ロモーターに作動可能に連結される第二のヌクレオチド配列を含み、その結果、
第一の融合タンパク質と、第二の融合タンパク質との相互作用は、その第二のヌ
クレオチド配列の転写の増加を生じ、そこで、その第一のヌクレオチド配列およ
びその第二のヌクレオチド配列は、同じであり得るかまたは異なり得る、工程、
ならびに（ｖ）その第一のおよび／またはその第二のヌクレオチド配列の転写の
増加を検出する工程であって、それによって、第一の融合タンパク質と第二の融
合タンパク質との間の相互作用を検出する、工程。
【０１９０】 １つの実施形態において、ベイト（ＨＰＳタンパク質配列）およびプレイ（キ
メラ遺伝子のライブラリー）は、その２つの酵母株を、およそ６〜８週間にわた
り固体培地上で接合することによって合わされる。あるいは、その接合は、液体
培地において行われる。その得られる二倍体は、キメラ遺伝子の両方の型を含む
（すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン融合物および活性化ドメイン融合物）。相互作
用性タンパク質が得られると、その相互作用性タンパク質の対をコードするＤＮ
Ａ配列が、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドまたは活性化ドメインハイブリッド
が別個の反応において増幅されるほうほうによって単離される。好ましくは、そ
の増幅は、そのＤＮＡ結合ｄドメインハイブリッドまたは活性化ドメインハイブ
リッドのいずれかについて特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの対を用いた
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、以下を参照のこと：Ｉｎｎｉｓら、１
９９０、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ
．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって実施される。ＰＣＲ増幅反応はまた、
相互作用するタンパク質対を発現するプールされた細胞において、好ましくは、
相互作用物のプールされたアレイの上において実施され得る。当該分野において
公知の他の増幅方法はまた、使用され、それらにはいかが挙げられる：例えば、
リガーゼ連鎖反応；Ｑβレプリカーゼなど。例えば、以下を参照のこと：Ｋｒｉ
ｃｋａら，１９９５．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｉｎａ Ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ，ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ．ＮＹ）。
【０１９１】 本発明のさらなる実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドおよび
活性化ドメインハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドもまた、当該分野に
おいて周知の方法のいずれかにより単離およびクローニングされ得る。例えば、
限定ではないが、シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉに対する酵母）ベクターを使用してそ
の融合タンパク質を発現する場合、その遺伝子は、続いて、その酵母ＤＮＡでＥ
．ｃｏｌｉを形質転換することおよびその細菌からそのプラスミドを回収するこ
とによって回収され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｆｆｍａｎら，１９
８７．Ｇｅｎｅ ５７：２６７−２７２。
【０１９２】 （（９）治療剤の薬学的組成物および投与） 本発明は、本発明の治療剤の薬学的有香料の被験体への投与による処置または
予防の方法を開示する。１つの実施形態において、その治療剤は、実質的に精製
され、そしてその被験体は、哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである
。
【０１９３】 その治療剤が核酸を含む場合に使用され得る処方物および投与方法は上記され
る。種々の送達系が公知であり、そしてこれを使用して本発明の治療剤を投与し
得る。これには、以下が挙げられる：例えば、（ｉ）リポソーム、微小粒子、微
小カプセルにおけるカプセル化；（ｉｉ）その治療剤を発現し得る組換え細胞；
（ｉｉｉ）レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、以下を参照のこと：
Ｗｕ ＆Ｗｕ，１９８７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２）；（ｉｖ）治療剤核酸を、レトロウイルスまたは他のベクターの一部として
の構築など。
【０１９４】 投与方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：皮内、筋肉内
、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路。本発明の治療剤は、
任意の簡便な経路によって投与され得（例えば、注入またはボーラス注射、上皮
または粘膜皮膚（例えば、経口粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）内膜を介した
吸収、そして他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は、全身性
または局所性であり得る。さらに、その治療剤を中枢神経系に、任意の適切な経
路（脳室内およびクモ膜下腔または硬膜下腔内を含む）によって投与することが
遊離であり得る。脳室内の注射は、リザーバに接続された脳室内のカテーテルに
よって容易にされ得る（例えば、Ｏｍｍｍａｙａリザーバ）。肺投与もまた、吸
入器または噴霧器（ネブライザ）の使用およびエアゾール化剤の処方によって使
用され得る。また、その治療剤を、処置の必要な領域に局所的に投与することが
所望され得る。これは、例えば、限定ではないが、手術の間の局所注入、局所塗
布、注射、カテーテルによる、坐剤による、または移植物によるものにより達成
され得る。特定の実施形態において、投与は、悪性腫瘍または新生物もしくは前
新生物組織の部位（または以前の部位）に直接注射することであり得る。。
【０１９５】 本発明の別の実施形態において、その治療剤は、ベシクル、特にリポソーム中
で到達され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｌａｎｇｅｒ，１９９０．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３。さらに別の実施形態において、その治
療剤は、徐放系中で送達され得る。これは例えば以下が挙げられる：送達ポンプ
（例えば以下を参照のこと：Ｓａｕｄｅｋら，１９８９．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３２１：５７４）および半透膜性ポリマー材料（例えば、以下を参照
のこと：Ｈｏｗａｒｄら，１９８９．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）
。さらに、徐放系は、治療標的（例えば、脳）の付近に配置され得る。従って、
全身性投与の一部のみを必要とする。例えば、以下を参照のこと：Ｇｏｏｄｓｏ
ｎ，Ｉｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９８４．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．Ｂｏｃｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ）。
【０１９６】 その治療剤がタンパク質をコードする核酸である本発明の特定の実施形態にお
いて、その治療剤核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築する
ことおよびそれを投与して細胞内にさせること（例えば、レトロウイルスベクタ
ー、直接注射、微小粒子ボンバードメントの使用、脂質または細胞表面レセプタ
ーでのコーティング、またはトランスフェクト剤による）、またはそれを核へ侵
入することが公知のホメオボックス様ペプチドに連結させて投与することによっ
て、そのコードされるタンパク質の発現を促進するようにインビボ投与され得る
（例えば、以下を参照のこと：Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８）など。あるいは、核
酸治療剤は細胞内に導入され得、そして相同組換えにより、発現のための宿主細
胞ＤＮＡ内に取り込まれる。
【０１９７】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、治療有効量の
治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書において利用される
場合、「薬学的に受容可能な」とは、連邦政府または州政府の規制当局によって
承認されること、または動物またはより特定するとヒトでの使用について、米国
薬局方もしくは他の承認された薬局方に掲載されることを意味する。用語「キャ
リア」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルであって、治療剤と
ともに投与されるものであり、そして水および油のような滅菌液体を含むがそれ
に限定されない。
【０１９８】 特定の障害または状態の処置において有効な本発明の治療剤の量は、その障害
または状態の性質に依存し、そして当業者によって標準的な臨床技術により判定
され得る。さらに、インビトロアッセイが必要に応じてしよす荒れて、最適投薬
量範囲の同定を補助する。処方物において使用される正確な用量はまた、投与の
経路および疾患または障害の全体の重篤さに依存する。そして、担当医の判断お
よび各患者の環境に従って決定されるべきである。しかし、本発明の治療剤の静
脈投与のための適切な投薬量範囲は、一般に、約２０〜５００マイクログラム（
μｇ）の活性化合物（体重１ｋｇあたり）である。鼻内投与のための適切な投薬
量範囲は、およそ０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効量は
、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から推定され得る
。坐剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲内で活性成分を含む、経口
処方物は、好ましくは１０％〜９５％の活性成分を含む。
【０１９９】 本発明はまた、薬学的パックまたはキットを提供し、これらには、１つ以上の
薬学的組成物の成分および本発明の治療剤が充填された１つ以上の容器を備える
。必要に応じて、そのような容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用ま
たは販売を規制する政府当局により規定された形式の通知書が伴い得る。この通
知書は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【０２００】 本発明は、さらに、以下の実施例に記載される。この実施例は、添付の特許請
求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２０１】 （実施例１：ＨＰＳタンパク質−ＩＰ複合体の同定） 改変され改良された酵母ツーハイブリッド系を利用して、ＨＰＳポリペプチド
相互作用物と相互作用するポリペプチドを同定した。２つのハイブリッドタンパ
ク質をコードする発現ベクターを構築した。「フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）」
スクリーニングのために、ＨＰＳタンパク質の一部に融合された一方のハイブリ
ッドは、酵母転写アクチベーターＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインからなる。他方
のハイブリッドは、哺乳動物 ｃＤＮＡライブラリーによってコードされる「プ
レイ」部分配列に対して融合されたＧａｌ４アクチベータードメインからなる。
「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」スクリーニングのために、ＨＰＳタンパク質の
部分を、Ｇａｌ４アクチベータードメインに融合し、そして哺乳動物ｃＤＮＡラ
イブラリーのそのプレイタンパク質配列を、ＤＮＡ結合ドメインに融合したが、
そのアッセイをそうでなければ同一に行った。
【０２０２】 次いで、上記のベクターの各々を、当該分野において公知の方法を用いて酵母
の補完接合型（ａおよびα）へ挿入した。例えば、以下を参照のこと：Ｃｈｉｅ
ｎ，ら、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９
５７８−９５８１。接合は、同じ酵母細胞内の両方の発現を容易にするために実
施し、これは、相互作用を生じさせる。ベイトドメインとプレイドメインとの間
の相互作用は、Ｇａｌ４についてのシス結合エレメントを含むレポーター遺伝子
の転写活性をもたらした。指標タンパク質βガラクトシダーゼならびにウラシル
およびヒスチジン栄養性のための代謝マーカーをコードするレポーター遺伝子を
、特定の様式で、接合において使用された酵母株の一方または他方において含ま
せた。この様式で、酵母を，首尾よい接合、両方の融合構築物の発現およびＨＰ
Ｓタンパク質またはＨＰＳタンパク質−ＩＰの発現について選択した。相互作用
するタンパク質を含んだ酵母クローンを選択肢、そしてマイクロタイタープレー
トの個々のウェル中で培養した。次いで、ＨＰＳタンパク質−ＩＰ配列を含むプ
ラスミドを単離および特徴付けした。
【０２０３】 プレイｃＤＮＡを、１×１０7の独立単離体のヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリ
ーから取得した（カタログ番号ＨＬ４０２９ＡＨ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。このライブラリーを、Ｘｈｏ−ｄＴ15プライム刺激した
胎児脳ｍＲＮＡ（５匹の雄性／雌性 １９〜２２週胎児由来）から合成した。次
いで、これらは、以下のいずれかに直接的にクローニングした：ｐＡＤ−ＧＡＬ
４（酵母Ｇａｌ４活性化ドメインクローニングベクターであって、ロイシン生合
成を欠損する酵母において選択するためのＬＥＵ遺伝子を含むもの）、またはｐ
ＢＤ−ＧＡＬ４（酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインクローニングベクターであ
って、トリプトファン生合成を欠損する酵母において選択するためのＴＲＰ１遺
伝子を含むもの）。
【０２０４】 フォワードスクリーニングを、一回利用して、プレイｃＤＮＡ産物の、ベイト
タンパク質のアレイに対する相互作用を試験した。このうち１つは、ヌクレオチ
ド２１０−１２９２（以下ベイトフラグメント２１０−１２９２と称する）のＨ
ＰＳタンパク質ヌクレオチド配列によってコードされていた（ＧｅｎＢａｎｋ登
録番号ｕ６５６７６）。次いで、ベイトフラグメント２１０−１２９２を、全長
ＨＰＳタンパク質ｃＤＮＡから、標準的な技術によるＰＣＲ増幅によって増幅し
た。この増幅されたフラグメントを、ｐＧＢＴ９ＢＳのＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩ制限部位に連結した（例えば、以下を参照のこと：Ｙａｎｇら、１９９５、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．ＲＥｓ。２３：１１５２−１１５６）。この配列を、核
酸配列決定によって、確認して、そのＰＣＲ増幅がその配列の正確なコピーを再
生したことを確認した。この試験は、予想されるように、配列がヒトＨＰＳタン
パク質と同一の相互作用ドメインをコードしたことを決定した。
【０２０５】 ３つのリバーススクリーニングを利用して、プレイｃＤＮＡ産物のベイトタン
パク質のアレイに対する相互作用を試験した。フラグメント２１０−１２９２、
１２７２−２３０６、および１２７２−２３５７はそれぞれ、標準的な技術によ
るＰＣＲ増幅によって全長ＨＰＳタンパク質 ｃＤＮＡから増幅した。次いで、
この増幅したフラグメントを、ベクターｐＧＡＤ−ＧＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に
クローニングした。この配列を、核酸配列決定によって確認して、そのＰＣＲ増
幅が配列の正確なコピーを再生したことを確認した。この試験は、予想されるよ
うに、その配列がヒトＨＰＳタンパク質に同一な相互作用ドメインをコードした
ことを決定した。
【０２０６】 フォワードスクリーニングにおいて、導入されたベイトをコードする核酸での
、酵母株ＹＵＬＨ （接合型 ａ．ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ｌｙｓ２，Ａｄｅ２，
ｔｒｐｌ，ｐｉｅｕ２，ｇａｌ４，ｇａｌ８０，ＧＡＬＲＡ３ＧＡＬｌ−ｌａｃ
Ｚ）（フォワードスクリーニング）の酢酸リチウム／ポリエチレングリコール形
質転換（例えば、以下を参照のこと：Ｉｔｏら、１９８３．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１５３：１６３−１６８）により発現した。他方、プレイ配列を、酵母株
Ｎ１０６ｒ（接合型ａ，ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ａｄｅ２ ；ｔｒｐｌ，ｌｅｕ２
，ｇａｌ４，ｇａ１８０，ｃｖｈr，Ｌｙｓ２：：ＧＡＬｌUAS−ＩＳ３TATA−Ｈ
ＩＳ３，ｕｒａ３：：ＧＡＬ１UAS−ＧＡＬTATA−ｌａｃＺ）中への形質転換に
より導入した。リバーススクリーニングについて、ベイトを、Ｎ１０６ｒ中に、
そしてプレイをＹＵＬＨ中に形質転換した。
【０２０７】 次いで、２つの形質転換された集団を、当該分野において公知の標準的な方法
を用いて接合させた例えば以下を参照のこと：Ｓｈｅｒｍａｎら，１９９１．Ｇ
ｅｔｔｉｎｇ Ｓｔａｒｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｙｅａｓｔ，第１９４版 （Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ））。手短には、細胞を、適
切なプラスミドの存在について選択する培地内で中期から後期の対数増殖器まで
増殖させた。次いで、この２つの接合株（αおよびａ）を、ニトロセルロース膜
上で濾過したＹＡＰＤ培地（上記を参照）に希釈し、そして３０℃で６〜８時間
インキュベートした。次いで、この細胞を、所望の二倍体（すなわち、βガラク
トシダーゼ、ウラシル自己栄養性およびヒスチジン自己栄養性についてレポータ
ー遺伝子を有し、そしてそのベイトおよびプレイをコードするベクターを発現す
る酵母）についての選択培地へと移した。接合産物を、アデニンおよびリジン（
首尾よい接合について選択するため）、ロイシンおよびトリプトファン（ベイト
およびプレイの両方のプラスミドによってコードされる遺伝子の発現について選
択するため）、およびヒスチジン（タンパク質相互作用を選択するため）を欠如
する合成完全（ＳＣ）培地にプレートした（以下を参照のこと：Ｋａｉｓｅｒ，
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ＆ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ．編，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｖ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
ＮＹ）。この培地を、本明細書以下、ＳＣ選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）培地とい
う意味のＳＣＳ培地と称する。
【０２０８】 選択されたクローンを、続いて、βガラクトシダーゼの発現について試験して
、ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ相互作用の形成を確認した。次い
で、βガラクトシダーゼのフィルターリフトアッセイをＢｒｅｅｄｅｎおよびＮ
ａｓｍｙｔｈのプロトコルの改変に従って行った（１９８５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：６４３−６５０）。コロ
ニーを、ＳＣＳプレート上にパッチプレートし、一晩増殖させ、そしてＷｈａｔ
ｍａｎ Ｎｏ．１フィルター上にレプリカプレートした。次いで、そのフィルタ
ーをβガラクトシダーゼ活性について試験した（すなわち、「陽性」であったコ
ロニーは、可視性の青色を呈した）。
【０２０９】 タンパク質相互作用について「陽性」であったコロニー内に含まれる細胞は、
ＤＮＡ結合プラスミドおよび活性化ドメインプラスミドの混合物を含んでいた。
これらの細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェル中で単
一の単離体として再増殖させた。およそ１０μｌの各々の選択された単離体を溶
解し、活性化ドメインプラスミドについてｐＡＤ−ＧＡＬ４ またはｐＧＡＤ−
ＧＨ内およびｐＢＤ−ＧＡＬ４またはｐＧＢＴ９ＢＳプラスミドの挿入物を、各
々のベクターの隣接配列について特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、そ
しておよそ３００ヌクレオチド（これは、翻訳後タンパク質のアミノ末端となる
）を、ＡＢＩ３７７配列決定機を用いて決定した。公知の配列との比較を、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎを通じて公に利用可能な「ＢＬＡＳＴ］プログラムを用いて行っ
た。ＨＰＳタンパク質およびＨＰＳタンパク質−ＩＰ相互作用ドメインのまとめ
および同定された単離体を以下の表Ｉに示す。
【０２１０】 フォワードのスクリーニングアッセイにおいて、２つの独特の単離体を、新規
配列として同定した。決定された核酸配列ならびに同一のＥＳＴ、ｃａ４９３６
８．ｂ１；ｃｇ４９３６７．ｈ１１ ；ｃｇ４９４２４．ｃ１０ （本明細書以
後ＨＰＩＰ１とする）およびｃｇ Ｈｓ２９５０＿０ （ＨＮ１ホモログとする
）の対応する推定アミノ酸配列をそれぞれ図１および２に示す。
【０２１１】 ３つのリバーススクリーニングアッセイにおいて、７つの単離体が、公開され
たタンパク質と同一であったことが見出された： １．ヌクレオチド１２７２−２３０６によってコードされるＨＰＳタンパク質
ドメインと相互作用する同定された配列ハイブリダイゼーション、以下と同一の
物を含む： （ｉ）１４−３−３タンパク質（ｅｔａ）配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８
０５３６）（７６４ヌクレオチドに始まる）（これは、ヌクレオチド１９２−９
３２から翻訳されるｃ末端領域に対応する）；ならびに （ｉｉ）核因子ＮＦ９０ （ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１０３２４）（ヌクレ
オチド１９３０に始まる）（ヌクレオチド２６５−２２８０から翻訳されるタン
パク質のＣ末端領域に対応する）。
【０２１２】 ２．ＨＰＳタンパク質ドメイン１２７２−２３５７と相互作用する２つの同定
された配列は、以下と同一であったことが実証された： （ｉ）１４−３−３タンパク質（ｅｔａ）配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８
０５３６）（ヌクレオチド７６４に始まる）（これは、ヌクレオチド１９２９３
２から翻訳されたタンパク質のＣ末端領域に対応する）；および （ｉｉ）ＣＤＫ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１６２２）（ヌクレオチ
ド４で始まる）（そのタンパク質は、ヌクレオチド１−８９７から翻訳される） ３．さらに、ＨＰＳタンパク質ドメイン２１０−１２９２と相互作用する４つ
の同定された配列が、以下と同一であることが実証された： （ｉ）ヒトＨｒｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８４０６４）（ヌクレオチド９
８および１００に始まる）（ヌクレオチド６２−２３９４から翻訳されたそのタ
ンパク質）。
【０２１３】 （ｉｉ）ＢＭＫ１α配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２９７２５）（ヌクレオ
チド４３１に始まる）（ヌクレオチド２２２−２６７２から翻訳されるタンパク
質のＣ末端領域に対応する）； （ｉｉｉ）アトロフィン−１配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３８５１）（
ヌクレオチド６４９に始まる）（ヌクレオチド７４−３６２８から翻訳されるタ
ンパク質のカル簿記死末端領域に対応する）；ならびに （ｉｖ）ＤＧＳ−１配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ７７５６６）（ヌクレオ
チド１６および２７に始まる）（タンパク質は、ヌクレオチド１−１６９８から
翻訳される）。 表Ｉ：酵母ツーハイブリッドスクリーンにより同定されたＨＰＳタンパク質との
タンパク質相互作用
【０２１４】
【表１】 **１９９８年４月３日に提出された米国特許出願番号または１９９９年３月に提
出されたＰＣＴ特許出願を参照のこと。
【０２１５】 （実施例２ ＨＰＳタンパク質・ＨＰＳタンパク質−ＩＰ相互作用の特異性の
検証） ベイト：プレイ相互作用の特異性の全体的な程度を確認するために、２つの一
般的なアッセイを、最初に行った。第１の例において、上記の遺伝子の結合ドメ
イン融合物をコードする個々のプラスミドを発現する酵母細胞を、作製した（表
Ｉを参照のこと）。これらの酵母細胞を、一晩増殖させ、そして増殖について試
験した。試験された全てのタンパク質について増殖は見出されなかった。これに
より、それらが、「自己活性化」タンパク質ではないこと、すなわち、これらの
タンパク質は、機能的活性化複合体に対して第２のタンパク質ドメインとの相互
作用を必要とすることが確認された。
【０２１６】 フォワードスクリーニングにおいて検出された相互作用をまとめ、そしてそれ
らの特異性をさらに実証するために、ＨＰＳについて単離されたベイトプラスミ
ドを使用して、酵母株ＹＵＬＨ（接合型ａ）を形質転換した。ＨＰＩＰ１および
ヒトＨＮ１ホモログタンパク質由来の相互作用ドメインを株Ｎ１０６ｒ（接合型
α）中に形質転換した。形質転換体を再増幅し、そして接合を行って、同定され
たＨＰＳ・ＨＰＳＩＰ相互作用をまとめた。ＨＰＳは、ＨＰＩＰ１およびヒトＨ
Ｎ１ホモログタンパク質との特異性に複合体化した。これは、ベクターと非特異
的に反応しなかった。
【０２１７】 第２の例において、ＨＰＩＰ１およびＨＮ１ホモログタンパク質インサートを
含むプラスミドを、株ＹＵＬＨ（接合型ａ）に形質転換し、そしてＨＰＳタンパ
ク質以外のタンパク質を発現する酵母株Ｎ１０６ｒ（接合型α）と接合させた。
無差別の結合体、すなわち、非特異的様式で多数の他のタンパク質と結合し得る
インサートは、非ＨＰＳタンパク質ドメインと非特異的に相互作用し、そして非
特異的相互作用体として廃棄される。相互作用体のいずれもが、ＨＰＳタンパク
質以外のタンパク質への結合を示さなかった。
【０２１８】 リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）スクリーニングにおいて検出された相互作用をま
とめ、そしてそれらの特異性をさらに実証するために、ＨＰＳについて単離され
たベイトプラスミドを使用して、酵母株Ｎ１０６ｒ（接合型α）を形質転換した
。ＨＰＳは、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１α、ＣＤＫ２、ＮＦ９０
、アトロフィン−１、ＤＧＳ−Ｉ由来の相互作用ドメインを、株ＹＵＬＨ（接合
型ａ）に形質転換した。この形質転換体を再増幅し、そして接合を行って、同定
された相互作用体をまとめた。ＨＰＳは、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭ
Ｋ１α、ＣＤＫ２、ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−Ｉと特異的に複合体
化した。これは、ベクターと非特異的に反応しなかった。
【０２１９】 第２の例において、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１α、ＣＤＫ２、
ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−Ｉインサートを含むプラスミドを、株Ｙ
ＵＬＨ（接合型ａ）に形質転換し、そしてＨＰＳ以外のタンパク質を発現する酵
母株Ｎ１０６ｒ（接合型α）と接合させた。無差別な結合剤、すなわち、非特異
的な様式で多数の他のタンパク質と結合し得るインサートは、非ＨＰＳタンパク
質ドメインと非特異的に相互作用し、そして非特異的相互作用体として廃棄され
る。相互作用体のいずれもが、ＨＰＳタンパク質以外のタンパク質への結合を示
さなかった。
【０２２０】 （（ｃ）新規配列の分析） ヒトＥＳＴをコードする配列の同一性検索についての一般的な手順を、公的に
利用可能なＥＳＴデータベース（例えば、Ｎａｔｉｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏ
ｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｎ．Ｃ．Ｂ．Ｉ．
）ＢｌａｓｔＮ２．０プログラム）を使用して行った。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１
９９０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照のこと。Ｂｌａ
ｓｔＮ２．０プログラムは、ＤＮＡ配列を６つのリーディングフレーム全てで翻
訳し、そしてこの翻訳されたタンパク質配列とタンパク質データベース中のタン
パク質配列とを比較する。統計学的な有意性を、問い合わせ配列における１つの
リーディングフレーム全体の等価物がタンパク質をコードするという仮定、およ
び有意な整列がコードリーディングフラグメントのみに関するという仮定の下で
評価する。ＢｌａｓｔＮ２．０プログラムの結果において高いスコアリングセグ
メントの対を生じる配列のみを示す。
【０２２１】 さらに、配列を、標準的な遺伝コードを使用する、（構築された）ＤＮＡ配列
の６個のリーディングフレーム全体でＤＮＡ配列を翻訳する特許（ｐｒｏｐｒｉ
ｅｔａｒｙ）ソフトウェアを使用して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）について分析した。相互作用性ＥＳＴを、指向的にクローニングされたライブ
ラリーから入手し、これによって構築されたＥＳＴの翻訳の方向は、５’〜３’
の方向であることがわかる。入手した翻訳中に、フレーム１〜３において見出さ
れた全てのＯＲＦを分析した。以下を含むＯＲＦ（（ｉ）開始コドンに続く５０
個よりも多いアミノ酸のアミノ酸配列、または（ｉｉ）５’末端に開始メチオニ
ンを含まないＯＲＦ）について、潜在的なタンパク質産物であることを決定し、
そしてＢｌａｓｔＰプログラムを使用してタンパク質データベース中の配列に比
較した。
【０２２２】 （（ｉ）ＨＰＩＰ１） ３つの同一のクローン（ｃｇ４９３６８．ｂ１、ｃｇ４９３６８．ｈ１１、お
よびｃｇ４９４２４．ｃ１０）を、本発明におけるＨＰＳ相互作用体として同定
した。６１９個のヌクレオチドの同定されたプレイ配列（本明細書中でＨＰＩＰ
１といわれる）は、ｓｏａｒｅｓ黒色腫ＥＳＴ ＡＡ４２５６４（ヌクレオチド
２８７で開始する）に９８％同一であり、そしてＥＳＴ３８４１１４（ヌクレオ
チド１４９で開始する）に９７％同一であった。しかし、これらのＥＳＴのいず
れかの５’伸長は、推定ＨＰＩＰ１タンパク質のＯＲＦを変化させないことから
、ＨＰＩＰ１は、いずれかの方向に伸長されなかった。ＨＰＳタンパク質とのＨ
ＰＩＰ１の相互作用は、ヌクレオチド１で開始する。
【０２２３】 １７３個のアミノ酸（ヌクレオチド１〜５１９）のオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）を、翻訳させ得、そして得られたタンパク質を、ＨＰＩＰ１と命
名した。ＨＰＩＰ１アミノ酸配列とのＢｌａｓｔＰ検索は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの１００７個のアミノ酸のＥＧ０００３．５タン
パク質のｃ末端（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ Ｅ１３３１６５３）と６２％の
類似性を示した。ＯＲＦは、メチオニン開始コドンを有さないことから、これは
、より長い新規タンパク質のｃａＨＰＳｏｘｙ末端部分を示すようである。ＨＰ
ＩＰ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図１（それぞれ、配列番号１
および配列番号２）に示す。
【０２２４】 （（ｉｉ）ＨＮ１ホモログタンパク質） ７２９個のヌクレオチドの同定されたプレイ配列（ｃｇＨｓ２９５０ ０；本
明細書中ＨＮ１ホモログタンパク質といわれる）は、マウスＨＮ１（Ｈｎ１）ｍ
ＲＮＡに８２％同一であった。Ｔａｎｇら、１９９７、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇ
ｅｎｏｍｅ ８：６９５〜６９６を参照のこと。ＨＰＳタンパク質とのＨＮ１ホ
モログタンパク質の相互作用は、ヌクレオチド２２で開始する。
【０２２５】 １５３個のアミノ酸（ヌクレオチド１０６〜５６４）のオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を翻訳させ得、そして得られたタンパク質を、ＨＮ１ホモロ
グと命名した。アミノ酸配列を用いるＢｌａｓｔＰ検索は、マウスの血液学的お
よび神経学的に発現される配列１（ｍｏｕｓｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ １
）（ＨＮ１、１５４アミノ酸；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｐ９７８２５；Ｔａ
ｎｇら、１９９７、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ８：６９５〜６９６を
参照のこと）に８３％の類似性および７９％の同一性を示した。従って、このＨ
ＰＳタンパク質相互作用体は、マウスＨＮ１タンパク質のヒトホモログを示す。
１２６位のアミノ酸は、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｌｅｕ（ＴＴＧ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ
）、またはＬｅｕ（ＣＴＧ）であり得る。
【０２２６】 マウスＨｎ１は、多くの胎児組織および成体組織で発現される。最高レベルの
発現は、１０日齢の卵黄嚢血液島由来循環赤血球芽細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａ
ｓｔ）、１３日齢の胎児肝臓、成体の骨髄および脾臓を含む造血細胞中に見出さ
れる。この発現はまた、１７日齢の胎児脳で非常に高く、一方成体の脳における
発現は、かなり低い（Ｔａｎｇら、１９９７、Ｍａｍｍａｌａｎ Ｇｅｎｏｍｅ
８：６９５〜６９６を参照のこと）。ＨＮ１ホモログタンパク質のヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列は、図２（それぞれ、配列番号３および配列番号４）
に例示される。
【０２２７】 本発明は、本明細書中に開示される特定の実施形態によって範囲を制限される
べきではない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の種々の改
変は、前述の記載および添付の図面から、関連する分野の当業者に容易に明らか
となる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
さらに、種々の刊行物が、本明細書中に引用され、そしてそれらの開示は、それ
らの全体において本明細書によって参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＨＰＩＰ１の核酸配列（配列番号１）、およびコードされるアミノ酸
配列（配列番号２）を示す。
【図２】 図２は、ヒトＨＮ１ホモログの核酸配列（配列番号３）、およびコードされる
アミノ酸配列（配列番号４）を示す。１２６位を占めるアミノ酸残基は、Ｍｅｔ
（ＡＴＧ）、Ｌｅｕ（ＴＴＧ）、ＶＡＬ（ＧＴＧ）、またはＬｅｕ（ＣＴＧ）で
あり得る。
【図３】 図３は、ＨＰＳタンパク質相互作用を実証する酵母ツーハイブリッド系アッセ
イから得られた結果を示す。ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質としてＨＰＳタンパ
ク質を利用するアッセイの結果は、上記の列に示される。ＨＰＳタンパク質を、
フォワード（ＨＰＳタンパク質）スクリーニングに使用した。プレイ（ｐｒｅｙ
）タンパク質１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１αキナーゼ、ＣＤＫ２、
核因子ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１、ヒトＨＮ１ホモ
ログ、網膜芽細胞腫、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ＲＧＬ−２およびベクターコントロ
ールは、列の左に示される。示されたベイトタンパクとプレイタンパク質との間
の陽性の相互作用は、特定のベイトタンパク質とプレイタンパク質との間の区画
を形成する囲いにおける「＋」の符号として示され、特定のベイトタンパク質と
プレイタンパク質との間の相互作用の欠落は、「−」の符号と命名される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/04 ４Ｂ０６５ 7/02 9/04 ４Ｃ０８４ 7/04 9/10 ４Ｃ０８５ 9/04 11/00 ４Ｈ０４５ 9/10 17/00 11/00 25/00 17/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 BA63 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 HA17 4B050 CC03 DD11 LL01 4B063 QA01 QQ03 QQ43 QR32 QR48 QR55 QS02 QS34 4B064 AG01 CA06 CC24 DA01 DA13 4B065 AA72X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 BA23 CA17 CA53 CA56 DB01 NA14 ZA01 ZA38 ZA40 ZA51 ZA53 ZA54 ZA59 ZA89 ZC54 4C085 AA13 AA14 BB11 DD01 DD62 DD63 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 CA45 DA01 FA74

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメインおよびＨＰＳ
    ＩＰポリペプチドのＨＰＳ結合ドメインの精製された複合体であって、ここで該
    ＨＰＳＩＰポリペプチドが、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１ αキナ
    ーゼ、ＣＤＫ２、核因子ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１
    およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質からなる群より選択される、複合体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の複合体であって、前記ＨＰＳ結合ドメイン
    は、１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１ αキナーゼ、ＣＤＫ２、核因子
    ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモロ
    グタンパク質からなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリ
    ペプチドに存在する、複合体。
  3. 【請求項３】 前記ＨＰＳＩＰ結合ドメインが、ＨＰＳポリペプチドのアミ
    ノ酸配列を含むポリペプチドに存在する、請求項１に記載の複合体。
  4. 【請求項４】 前記ＨＰＳポリペプチドが、ヒトＨＰＳポリペプチドのアミ
    ノ酸配列を含む、請求項３に記載の複合体。
  5. 【請求項５】 前記ＨＰＳ結合ドメインがヒトＨＰＳＩＰポリペプチドのア
    ミノ酸配列を含むポリペプチドに存在する、請求項１に記載の複合体。
  6. 【請求項６】 前記ＨＰＳポリペプチドが、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６５
    ６７６において開示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２１０〜１２９２、
    １２７２〜２３０６、または１２７２〜２３５７によってコードされるポリペプ
    チドのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
  7. 【請求項７】 前記ＨＰＳＩＰポリペプチドが、表Ｉ第４欄に列挙されるオ
    ープンリーディングフレームによりコードされるＨＰＳＩＰポリペプチドのアミ
    ノ酸配列を含む、請求項１に記載の複合体。
  8. 【請求項８】 前記ＨＰＳＩＰ結合ドメインを含むポリペプチドが、ＨＰＳ
    ポリペプチドのフラグメントである、請求項１に記載の複合体。
  9. 【請求項９】 ＨＰＳ結合ドメインを含むポリペプチドが、ＨＰＳＩＰポリ
    ペプチドのフラグメントである、請求項１に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】 ＨＰＳＩＰ結合ドメインを含むポリペプチドが標識される
    、請求項１に記載の複合体。
  11. 【請求項１１】 ＨＰＳ結合ドメインを含むポリペプチドが標識される、請
    求項１に記載の複合体。
  12. 【請求項１２】 ＨＰＳＩＰポリペプチドの６個以上のアミノ酸に共有結合
    されたＨＰＳポリペプチドの６個以上のアミノ酸を含むキメラポリペプチドであ
    って、該ＨＰＳＩＰポリペプチドが１４−３−３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１
    αキナーゼ、ＣＤＫ２、核因子ＮＦ９０、アトロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰ
    ＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質からなる群より選択される、キメラ
    ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 前記ＨＰＳポリペプチドのアミノ酸が、ＨＰＳＩＰ結合ド
    メインを含む、請求項１２に記載されるキメラポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 前記ＨＰＳＩＰポリペプチドのアミノ酸が、ＨＰＳ結合ド
    メインを含む、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記ＨＰＳＩＰポリペプチドのアミノ酸が、ＨＰＳ結合ド
    メインを含む、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の複合体を特異的に結合する抗体。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の抗体であって、該抗体は、前記複合体
    の一部ではないＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメイン、または該複合体
    の一部ではないＨＰＳＩＰポリペプチドのＨＰＳ結合ドメインに対して結合する
    よりも、請求項１に記載の複合体に対してより大きい親和性で結合する、抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項１２に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸
    。
  19. 【請求項１９】 ＨＰＩＰ１ポリペプチドおよびヒトＨＮ１ホモログポリペ
    プチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単
    離された核酸。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の核酸であって、該核酸は前記ポリペプ
    チドのＨＰＳ結合ドメインをコードする、核酸。
  21. 【請求項２１】 請求項１９に記載の核酸であって、該核酸は配列番号１ま
    たは配列番号３のヌクレオチド配列を含む、核酸。
  22. 【請求項２２】 請求項１８または請求項１９に記載の核酸を含むベクター
    。
  23. 【請求項２３】 請求項２１に記載のベクターを含む細胞。
  24. 【請求項２４】 ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログタンパク質からなる
    群より選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド
    。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
    ドがヒトＨＰＩＰ１またはヒトＨＮ１ホモログポリペプチドのアミノ酸配列を含
    む、ポリペプチド。
  26. 【請求項２６】 請求項２４に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
    ドが配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む
    、ポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 請求項２４に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
    ドがＨＰＳ結合ドメインを含む、ポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 治療的または予防的有効量の治療剤および薬学的に受容可
    能なキャリアを含む薬学的組成物であって、ここで該治療剤が以下： 請求項１に記載の複合体； 請求項１２に記載のキメラポリペプチド； 請求項１６に記載の抗体、あるいは該抗体の、フラグメントまたは誘導体； 請求項１８または請求項１９に記載の核酸；および 請求項２３に記載のポリペプチド からなる群より選択される、薬学的組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項１に記載のＨＰＳ−ＨＰＳＩＰポリペプチド複合体
    を産生する方法であって、該方法は以下： ＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメインをコードする核酸およびＨＰＳ
    ＩＰポリペプチドのＨＰＳ結合ドメインをコードする核酸を含む、細胞を提供す
    る工程； 該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程であって、
    その結果、複合体がＨＰＳポリペプチドのＨＰＳＩＰ結合ドメインとＨＰＳＩＰ
    ポリペプチドのＨＰＳ結合ドメインとの間で形成する工程；および 該複合体を回収する工程、 を包含し、 それによって該ＨＰＳ−ＨＰＳＩＰ複合体を産生する、方法。
  30. 【請求項３０】 サンプル中のＨＰＳタンパク質およびＨＰＳＩＰタンパク
    質の複合体の異常なレベルによって特徴付けられる障害の存在またはその障害の
    素因を診断またはスクリーニングする方法であって、該方法は、以下： 被験体から試験サンプルを調達する工程； 該試験サンプル中の該複合体のレベルを測定する工程；および 該試験サンプル中の該複合体レベルを、ＨＰＳ関連障害の細胞特性を含まない
    参照サンプル中の該複合体のレベルと比較する工程、を包含し、 ここで該サンプルのレベルの変化が、該被験体における該障害に対する存在また
    は素因を示す、方法。
  31. 【請求項３１】 キットであって、ＨＰＳおよびＨＰＳＩＰの複合体、該複
    合体に対する抗体、該ＨＰＳのＲＮＡおよび該ＨＰＳＩＰのＲＮＡに対してハイ
    ブリダイズ可能な核酸プローブ、または該ＨＰＳの遺伝子および該ＨＰＳＩＰの
    遺伝子の少なくとも１部分の増幅をプライム可能な核酸プライマーの対からなる
    群から選択される物質を１つ以上の容器に含み、ここで該ＨＰＳＩＰが１４−３
    −３ ｅｔａ、Ｈｒｓ、ＢＭＫ１ αキナーゼ、ＣＤＫ２、核因子ＮＦ９０、ア
    トロフィン−１、ＤＧＳ−１、ＨＰＩＰ１およびヒトＨＮ１ホモログからなる群
    から選択される、キット。
  32. 【請求項３２】 被験体において、請求項１に記載の複合体の異常なレベル
    に関係する疾患または障害を処置または予防する方法であって、該方法は、この
    ような処置または予防が所望される被験体に、該複合体の機能を調節する治療的
    有効量の分子を投与する工程を包含する、方法。
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