JP2003523166A - 幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞の集団を拡張し、同時に細胞の分化を阻害する方法であって、細胞が増殖し同時に遷移金属を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を前記細胞に与えるステップを有する方法を提供する。この方法は、インビボ（生体内）および半ビボの両方で実施できる。細胞の集団の分化を誘発する方法であって、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤であって細胞分化を誘発するのに有効なキレート化剤を細胞に与えるステップを有する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野および発明の背景 本発明は幹細胞と前駆細胞の増殖と分化を制御する方法に関する。一つの側面
においては、本発明は、遷移金属のキレート化剤で細胞を処理して遷移金属の有
効性を低下させることによって、幹細胞と前駆細胞の増殖を強制するが分化を抑
制する方法に関する。他の側面においては、本発明は遷移金属のキレート化剤で
細胞を処理して細胞が遷移金属を利用する性能を増大させる、細胞の分化を誘発
する方法に関する。更に他の側面においては、本発明は遷移金属の特定のキレー
ト化剤が分化を制限するか又は誘発を起こすかを確認する検定法に関する。

【０００２】細胞の分化と増殖 血液細胞の通常の産生（造血）および他の細胞型の通常の産生は、しっかりと
組み合わされた増殖と分化のプロセスによって行われる。大部分の造血細胞にお
いて、分裂に続いて、娘細胞は、一連の漸進的な変化を受けて、最終的に、完全
に分化した（成熟した）機能的血液細胞になり、その血液細胞はほとんどの場合
、増殖することができない。したがって、分化のプロセスは、細胞分裂を制限し
、最終的に停止させる。幹細胞として知られている造血細胞の少数のみが、細胞
分裂を行い、親細胞と類似のまたは同一の子孫が生成する。自己複製として知ら
れているこの種の細胞分裂は、幹細胞の固有の特性であり、最も分化していない
状態の幹細胞の小プールを維持するのに役立つ。いくらかの幹細胞は、その自己
複製能力を失い、細胞分裂に続いて、最終的に成熟細胞を生じる各種の系統の拘
束前駆細胞（committed progenitor）を提供する。その成熟細胞は血液細胞系の
機能的性能を提供するが、幹細胞は、アポトーシス（プログラムされた細胞死）
によって一層分化した細胞を連続的に失いおよび／または細網内皮系によって老
化成熟細胞が積極的に除去されるにもかかわらず、一生を通じて造血の維持に関
与している。これらのプロセスが、いろいろの方式で多細胞生物の他のすべての
細胞系を特徴づけることが分かるであろう。なぜならば、死んだ細胞の補充はか
ような生物の生活環中で起こるからである。

【０００３】 通常の造血は、コロニー刺激因子類（ＣＳＦ）などの糖タンパク質類およびレ
チノイド類などの小分子を含む各種の調節因子が調整している。これら調節因子
は、始原細胞および前駆細胞の生存（例えばアポトーシスを阻害することによる
）、増殖および分化、ならびに成熟細胞の活性化状態を調節する。 急性白血病の場合、例えば、細胞の分化にブロック（block）がある。その結
果、白血病細胞はその増殖性を維持する。白血病細胞は、各種の調節因子に対し
て通常応答しない（文献５４）。したがって、急性骨髄性白血病の患者から得た
細胞は、培養中、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）による刺激に応答して、正常な造
血細胞のクローン化に続いて発生する顆粒球とマクロファージの大きいコロニー
に比べて小さい未分化細胞のコロニーを発生する。

【０００４】 以下にさらに詳細に述べるように、幹細胞およびその外の特定のリンパ−造血
細胞のサブ集団の半ビボ（ex-vivo)培養による拡張（expansion）は重要な臨床
用途をもっている。

【０００５】 このような集団を豊富化する（enrich）ための各種のプロトコルが提案されて
実験されている。採用されている主な実験戦略としては、ＣＤ_３４ ^＋の選択あり
またはなしで（８）；初期および後期の増殖因子の異なるカクテルで（１７）；
血清ありまたはなしで（７）；静置培養、迅速に培地を交換する培養（１８）ま
たは連続的な潅流下（バイオリアクター）で（６）；ならびに樹立された、支質
細胞層ありまたはなしで（１９）行われる単核細胞のインキュベーションがある
。

【０００６】 中期前駆細胞と後期前駆細胞の有意な拡張は、７−１４日間の半ビボ培養で得
られることが多かったが、増殖の可能性が高い初期造血（ＣＤ_３４ ^＋ＣＤ_３８ ⁻ ）幹細胞の量は通常、減少した（６，２０−２２）。

【０００７】 したがって、これらの培養では、真の幹細胞の拡張が行われず、むしろ、幹細
胞が増殖してプレ前駆細胞（pre-progenitor cell）に分化し、原幹細胞のプー
ルの減少が付随して起こる。

【０００８】 幹細胞の最大の半ビボ拡張を達成するには、以下の条件を満たさねばならない
。すなわち（ｉ）分化は、可逆的に妨害もしくは遅延されねばならず、そして（
ii）自己複製は最大限に時間延長されねばならない。 同様に、細胞拡張に伴って、拡張した細胞集団を成熟した機能的細胞又は組織
に変換するために、拡張した細胞集団の分化の誘発を起こさせる方法を有するこ
とが重要である。

【０００９】細胞の分化における銅の役割 造血細胞の発生への銅の関与の可能性は、以下の知見から推測できる。

【００１０】銅欠乏症の臨床症状 銅欠乏症は、遺伝性欠陥、例えばメンケス症候群もしくは小児脂肪便症、また
は後天的条件から起こる。後者の場合は、一般に栄養失調が関連している。銅欠
乏症は、銅を補充しない全非経口栄養摂取（例えば腸の切除による）、高レベル
の亜鉛の消費〔低体重のおよび／または牛乳（不充分な銅供給源）を与えられた
新生児の銅の利用を阻害し、重篤な症例ではShwanchman症候群になる〕によって
起こる。また、ウイルソン病などの銅の過剰負荷の症例に、銅キレート化剤でか
たよった治療を行うと、銅欠乏症をもたらすことがある。

【００１１】 銅欠乏症の臨床症候群としては、成長、脳の発達、骨の強さと形態、心筋の収
縮性、コレステロールとグルコースの代謝、宿主防護（免疫）の機構などの欠陥
がある。

【００１２】 この研究に特に関連して重要なことは、銅欠乏症が貧血、好中球減少症および
血小板減少症を含む、血液異常と関連していることが多いことである。これらの
病的発現はすべて、鉄分による治療に対して反応が鈍いが銅の補充によって迅速
にもとに戻る（２７−２８）。

【００１３】 銅欠乏症が好中球減少症をもたらす機序は分かっていない。可能性がある原因
としては、以下の原因の単独または組み合わせたものがある。すなわち（ｉ）骨
髄（ＢＭ）中の前駆細胞の早期死；（ii）ＢＭ中の前駆細胞からの好中球の生成
の障害；(iii)ＢＭ内での細胞成熟速度の低下；（iv）ＢＭからの循環系への好
中球の放出の障害；（ｖ）循環中の好中球の消失速度の増大である。

【００１４】 好中球が減少する銅欠乏症の患者のＢＭを検査すると、成熟した細胞が欠除し
ていること（“成熟停止”）を示す。このようなＢＭ由来の細胞は、銅欠乏血清
を含有する半固形培地中にコロニーを形成せず、銅を含有する血清中には正常な
コロニーを形成する性能を保持していることが報告されている。これらの試験結
果は、患者のＢＭ中に無傷の前駆細胞が存在していることを示し、かつ発生の遮
断が前駆細胞の段階の末端で起こることを示唆している（２９−３０）。

【００１５】細胞系内での銅の作用 銅のこの作用も、インビトロで樹立された細胞系で研究されている（３１−３
４）。このような細胞系の一つ（ＨＬ−６０）は、急性前骨髄球性白血病が見ら
れる患者由来のものであった。骨髄芽球および前骨髄球の特性を有するこれらの
細胞は、培養で無限に増殖できる。各種の薬剤、例えばレチノイン酸（ＲＡ）を
培地に添加すると、上記細胞は、分化して、成熟した顆粒球のすべてではないが
いくつかの特徴を示す細胞になる。

【００１６】 これらの細胞の銅の状態（Copper status）の研究結果は、１細胞当たり細胞
質が含有する銅含量は、ＲＡで処理した細胞の場合、未処理の細胞に比べて有意
差はないが、タンパク質含量に対する銅含量は２倍であることを示した。このこ
とは、ＲＡで処理した細胞は、タンパク質含量が、未処理の対応物と比べて約１
／２であるためである。^６７Ｃｕを使用して、銅摂取速度が、ＲＡ処理の最初の
２日間は有意に速いが後期には速くないことが報告されている。^６７Ｃｕの細胞
内分布は、高分子量（ＭＷ）の画分（＞１００ｋＤ）および約２０ｋＤの低分子
量の画分に、顕著であり、ＲＡで処理された細胞の高ＭＷ画分に、より高い比率
の銅が存在していることが見出された。

【００１７】 通常の血清を補充した増殖培地に過剰の銅を添加すると、ＲＡが誘発する分化
が若干増大した。ＲＡで処理したＨＬ−６０細胞は、必ずしも正常な細胞発育を
示さないが、これらの試験結果は、好中球の分化が銅を必要とする可能性を指摘
している。

【００１８】 他の実験で、ＨＬ−６０細胞は、銅のキレート化剤で処理することによって銅
を欠乏させることができ、そしてこのような処理の後、その生存度と増殖速度は
変化しないことが示されている。

【００１９】 これらの現象はすべて銅が原因であったが、いくつかの臨床作用と生物学的作
用が銅と他の遷移金属によって共有されていることが報告されている。

【００２０】 例えば、銅欠乏症に観察されるのと類似の臨床症候群は、高レベルの亜鉛を消
費した後にも見られるが（４０−４２）、この現象は、銅の利用を妨げることが
知られている（例えば４３）。

【００２１】 ヒト肝細胞癌の研究で、腫瘍組織中の銅と亜鉛両者の濃度が、組織の分化度と
ともに低下していることが発見された（４４）。

【００２２】 別の研究で、ラットの肝細胞の初代培養物に、銅、亜鉛および鉄を添加すると
、細胞の複製および管状構造の生成を誘発したことが報告された。それらの管を
内張りする細胞は、胆管細胞の形態学的および生化学的特徴になった（４５）。

【００２３】 各種の遷移金属は、分化に関連する多種類の酵素と転写因子の産生と活性に影
響することが知られている。その例としては、Ｃｕ／Ｚｎを含有するスーパージ
スムターゼ（４６）；メタロチオネイン類およびその転写調節因子類（例えばＭ
ＴＦ−１）（４７−４９）；７０ＫＤａの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）
（５０）；角質細胞が分化中に、ｒａｓ−ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質と会合
するｐ６２タンパク質（５１）；ＨＬ−６０細胞の分化が誘発されている間に活
性化される中性のスフィンゴミエリナーゼ（５２）；およびウシの水晶体のロイ
シンアミノペプチダーゼ（５３）がある。 天然かまたは合成のオリゴペプチド類も銅を捕捉できる。したがってグリシル
−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リシン−Ｃｕ^２＋（ＧＨＬ−Ｃｕ）は、ヒト血漿から単
離されたトリペプチド−銅の錯体である。この錯体は、ナノモルの濃度で、生体
外と生体内の両方で各種の生物学的作用を有していることが分かっている。この
錯体は、最初、各種の分化した細胞に対する成長因子として記述された（５５）
。各種のグループからよせられたその後のデータは、上記錯体が、創傷の治癒過
程の効力のある活性化因子のいくつもの特性を示すことを指摘した。上記錯体は
、単球／マクロファージおよびマスト細胞に対し効力がある走化剤（chemotacti
c agent）であった（５６〜５７）。前記錯体は、神経組織の再生を刺激し（５
８）、そして生体内での脈管形成プロセスをトリガーすることが報告された（５
９）。前記錯体は、いくつもの線維芽細胞株内のコラーゲンの合成を刺激した（
６０）。前記錯体は、動物の体表創傷に注射すると創傷の閉鎖を加速し（６１〜
６２）、かつコラーゲンとプロテオグリカン類の蓄積を加速した（６３）。また
、上記錯体は、フェリチンによる脂質の過酸化の阻害などの代謝作用も発揮した
（６４）。ＧＨＬ−金属イオンの組合せは、培養中の腫瘍形成性肝細胞癌（ＨＴ
Ｃ_４）細胞における単層の生成と細胞の粘着性を促進して、基本（増殖制限）条
件下での細胞の生存と増殖が著しく高まることが分かった（６５）。ＧＨＬの作
用・様式は分かっていない。ＧＨＬがヒト血漿内および生理学的ｐＨの緩衝液体
内で銅および鉄とキレートを生成することが報告されている。

【００２４】 本発明を実施化している間に、遷移金属の特に銅に結合する（銅をキレート化
する）一連の化学薬剤が、幹細胞および中期と後期の前駆細胞の分化のプロセス
を阻害（遅延）して、活性細胞増殖の相を、半ビボで刺激し延長できることが発
見された。銅などの遷移金属の減少（部分的または完全な減少）のこの新しく発
見された作用を、以下に更に詳細に説明するように各種の造血細胞の半ビボ拡張
を最大にするために使用した。しかし、本発明を実施化している間に一連の他の
遷移金属キレート化剤、特に銅キレート化剤が例えば正常なおよび白血病の細胞
の両方の半ビボでの分化プロセスを誘発することができることも見出された。

【００２５】発明の要約 本発明の一つの目的は、細胞の集団を拡張し、同時に細胞の分化を阻害する方
法を提供することである。 本発明の他の目的は、造血細胞の移植方法を提供することである。 本発明の更に他の目的は、幹細胞を外来遺伝子で遺伝的に改変する方法を提供
することである。 本発明の更に他の目的は、養子免疫療法の方法を提供することである。 本発明の付加的な目的は、骨髄幹細胞をドナーの末梢血液中に可動化させて該
細胞を収穫する方法を提供することである。 本発明の更なる付加的な目的は、赤血球前駆細胞の成熟／分化を減速させてβ
−異常ヘモグロビン症の患者を治療する方法を提供することである。 本発明の更なる付加的な目的は、幹細胞を保存する方法を提供することである
。 本発明の更なる目的は、幹細胞収集バッグを提供することである。 本発明の更なる目的は、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、分化の阻害を
起こすかまたは分化の誘発を起こすかを確認する方法を提供することである。 本発明の更なる目的は、細胞集団の分化を誘発する方法を提供することである
。 本発明の更なる目的は、急性白血病細胞の末端分化を誘発する方法を提供する
ことである。 本発明の更なる目的は、非白血病の造血前駆細胞の分化を誘発する方法を提供
することである。 本発明の更なる目的は、正常な幹細胞を、細胞系譜に分化拘束された前駆細胞
に半ビボで分化させる方法を提供することである。 本発明の更なる目的は、幹細胞を、樹状細胞に分化拘束された前駆細胞に半ビ
ボで分化させる方法を提供することである。 本発明の更なる目的は、細胞集団に分化を誘発する医薬組成物を提供すること
である。

【００２６】 したがって、本発明の一つの側面によれば、細胞が増殖し同時に遷移金属を利
用する前記細胞の性能を低下させる条件を細胞に与えるステップを含んでなる、
細胞集団を拡張させながら同時にそれら細胞の分化を阻害する方法が提供される
。

【００２７】 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、
細胞は生体内にあり（インビボ）、生体内で、細胞増殖の条件を自然に与えられ
、一方、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤を投与することによって、遷移金属
を利用する細胞の性能が低下する。 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、細胞の、銅を利
用する前記性能は、亜鉛を投与することによってさらに低下される。 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、細胞が生体内に
あるので、細胞が増殖する前記条件は生体内で自然に提供されるが、銅を利用す
る前記細胞の前記性能は、亜鉛を投与することによって低下される。 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、銅を利用する前
記細胞の前記性能は、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤を投与することによっ
てさらに低下される。 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、銅を利用する前
記細胞の前記性能は、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤によって低下される。

【００２８】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、遷移金属キ
レート化剤は、ポリアミンキレート化剤類、エチレンジアミン、ジエチレントリ
アミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペン
タミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチ
レンヘキサミン、トリエチレンテトラミン−塩酸、テトラエチレンペンタミン−
塩酸、ペンタエチレンヘキサミン−塩酸、テトラエチルペンタミン、キャプトプ
リル（captopril）、ペニシラミン、Ｎ，Ｎ′−ビス（３−アミノプロピル）−
１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，ビス（２アミノエチル）１，３プロパンジ
アミン、１，７−ジオキサ−４，１０−ジアザシクロドデカン、１，４，８，１
１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン、１，４，７−トリアザシ
クロノナントリ塩酸、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン、１
，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、１，４，７，１０−テトラア
ザシクロドデカンからなる群から選択される。

【００２９】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は半ビ
ボの細胞である。

【００３０】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞に、細
胞増殖のための条件を付与することには、細胞に栄養素とサイトカイン類を提供
することが含まれる。

【００３１】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、上記サイトカイ
ン類は初期に作用するサイトカイン類である。

【００３２】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記の初期
に作用するサイトカイン類は、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキ
ン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択され
る。

【００３３】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記サイト
カイン類は後期に作用するサイトカイン類である。

【００３４】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記の後期
に作用するサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ
コロニー刺激因子およびエリスロポエチンからなる群から選択される。

【００３５】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、造
血細胞、神経細胞とオリゴデンドロサイト細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞
、植物細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞および支質細胞か
らなる群から選択される。

【００３６】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、骨
髄、末梢血液および新生児の臍帯血からなる群から選択される起源から得られる
。

【００３７】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、造
血ＣＤ_３４ ^＋細胞が豊富化されている。

【００３８】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、細胞は、非
分化幹細胞および拘束前駆細胞（committed progenitor cells）からなる群から
選択される。

【００３９】 本発明の他の側面にしたがって、（ａ）移植すべき造血細胞を、ドナーから得
て；（ｂ）前記細胞が増殖し同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条
件を前記細胞に半ビボで与えて、前記細胞の集団を拡張させ同時にその細胞の分
化を阻害し；次いで（ｃ）その細胞を患者に移植するステップを含んでなる造血
細胞を移植する方法が提供される。

【００４０】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、ドナーと患
者は単一の個体である。

【００４１】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞は
、末梢血液、骨髄、新生児の臍帯血および胚性幹細胞からなる群から選択される
起源から得られる。

【００４２】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞を
得るのに、さらにその細胞を幹細胞について豊富化することが含まれている。

【００４３】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、造血細胞を
得るのに、さらにその細胞を前駆細胞について豊富化することが含まれる。

【００４４】 本発明のさらに他の側面にしたがって、（ａ）遺伝的に改変すべき幹細胞を得
て；（ｂ）前記細胞が増殖し同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条
件を前記細胞に半ビボで与えて、細胞の集団を拡張させ、同時にその細胞の分化
を阻害し、次いで（ｃ）その細胞を外来遺伝子（exogene）で遺伝的に改変する
ステップを含んでなる、幹細胞を外来遺伝子で遺伝的に改変する方法が提供され
る。好ましくは、遺伝的改変は外来遺伝子を含有するベクターによって行われる
。

【００４５】 本発明のさらに他の側面にしたがって、（ａ）患者から造血前駆細胞を得て、
（ｂ）前記細胞が増殖し同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を
前記細胞に半ビボで与えて、その細胞の集団を拡張させ、同時にその細胞の分化
を阻害し、次いで（ｃ）その細胞を患者に移植するステップを含んでなる養子免
疫療法が提供される。

【００４６】 本発明の付加的な側面にしたがって、（ａ）ドナーに、細胞の、銅を利用する
性能を低下させる薬剤を投与して、幹細胞の集団を拡張し、同時に、幹細胞の分
化を阻害し、次いで（ｂ）その細胞を白血球分離法で収穫するステップを含んで
なる、骨髄幹細胞を、ドナーの末梢血液中に可動化させて（mobilize）その細胞
を収穫する方法が提供される。

【００４７】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、前記方法は
ドナーにサイトカインを投与するステップを更に含む。

【００４８】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、サイトカイ
ンは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチ
ン、インターロイキン−３、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ
コロニー刺激因子およびエリスロポエチンから選択される。

【００４９】 本発明のさらに付加的な側面にしたがって、赤芽球前駆細胞の成熟／分化を減
速させて、β−異常ヘモグリン症の患者を治療する方法であって；その患者に、
その細胞の、銅を利用する性能を低下させて幹細胞の集団を拡張し、同時に、幹
細胞の分化を阻害する薬剤を投与し、その結果、その薬剤が身体から自然に除去
されると、その細胞は成熟が加速されて、胎児ヘモグロビンの産生が増大するス
テップを含んでなる方法が提供される。

【００５０】 本発明のさらに付加的な側面にしたがって、細胞の、銅を利用する性能を低下
させて、細胞の集団を拡張させるが同時に細胞の分化を阻害する薬剤の存在下、
半ビボで増殖させた細胞を含有する、半ビボで培養した治療用細胞製剤が提供さ
れる。

【００５１】 記載されている好ましい実施態様のさらに別の特徴にしたがって、上記薬剤は
、遷移金属の金属キレート化剤および亜鉛からなる群から選択される。

【００５２】 本発明のその外の実施態様にしたがって、銅を捕捉する遷移金属のキレート化
剤および／または亜鉛の存在下、収穫、単離および貯蔵からなる群から選択され
るステップの少なくとも一つで幹細胞を処理するステップを含んでなる幹細胞の
保存法が提供される。

【００５３】 本発明のさらなる側面にしたがって、それぞれ、細胞の分化を阻害する有効な
量または濃度の銅を捕捉する遷移金属キレート化剤および／または亜鉛を補充さ
れた幹細胞の収集バッグ、分離および洗浄用の緩衝液が提供される。

【００５４】 本発明のさらなる側面にしたがって、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、
分化の阻害を起こすかまたは分化の誘発を起こすかを確認する検定法であって；
幹細胞または前駆細胞または実質的に未分化の細胞系の集団を、遷移金属キレー
ト化剤の存在下で培養し、前記細胞の分化を監視するステップを含んでなり、分
化が未処理細胞と比べて増大している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を誘
発し、一方、分化が未処理細胞と比べて減少しているかまたは分化が全くない場
合は、遷移金属キレート化剤が分化を阻害している検定法が提供される。

【００５５】 本発明のさらなる側面にしたがって、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、
分化の阻害を起こすかまたは分化の誘発を起こすかを確認する検定法であって；
細胞の集団を、遷移金属キレート化剤の存在下で培養し、前記細胞の銅含有量を
監視するステップを含んでなり、前記細胞の銅含有量が未処理細胞と比べて増大
している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を誘発し、一方、銅含有量が未処
理細胞と比べて減少している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を阻害してい
る検定法が提供される。 本発明のさらなる側面にしたがって、細胞の集団の分化を誘発する方法であっ
て；細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート
化剤を加えるステップを含んでなる方法が提供される。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、細胞が生体内の細胞である。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、細胞を半ビボで増殖させる。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、細胞が造血細胞である。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、細胞が、正常細胞および癌細胞からなる群から選択される。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記遷移金属キレート化剤がトリペプチドである。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記遷移金属キレート化剤が、ＧＧＨ，ＧＨＬおよび１，４，８，１１−テト
ラアザシクロテトラデカンからなる群から選択される。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記遷移金属キレート化剤がＧＧＨである。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記遷移金属キレート化剤がペプチドまたはペプチド類似体である。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記遷移金属キレート化剤がペプチド配列を含有している。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記ペプチド配列が、配列番号：１および２からなる群から選択される。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記細胞が、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、神経幹細胞もしくは神経前駆
細胞、希突起グリア幹細胞もしくは希突起グリア前駆細胞、皮膚幹細胞もしくは
皮膚前駆細胞、肝臓幹細胞もしくは肝臓前駆細胞、筋肉幹細胞もしくは筋肉前駆
細胞、骨幹細胞もしくは骨前駆細胞、間葉幹細胞もしくは間葉前駆細胞、膵臓幹
細胞もしくは膵臓前駆細胞、軟骨幹細胞もしくは軟骨前駆細胞、ストロマ幹細胞
もしくはストロマ前駆細胞、胚性幹細胞、および培養されて拡張された幹細胞も
しくは培養されて拡張された前駆細胞からなる群から選択される。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記細胞が、骨髄、末梢血液および新生児臍帯血からなる群から選択されるソ
ース由来の細胞である。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記細胞が、造血ＣＤ_３４ ^＋細胞について豊富化されている。 以下に記載されている本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって
、前記細胞が、未分化幹細胞および分化拘束前駆細胞からなる群から選択される
。 本発明のさらなる側面にしたがって、急性白血病細胞の末端分化を誘発する方
法であって；前記細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移
金属キレート化剤を加えるステップを含んでなる方法が提供される。 本発明のさらなる側面にしたがって、非白血病の造血前駆細胞の分化を誘発す
る方法であって；前記細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な
遷移金属キレート化剤を加えるステップを含んでなる方法が提供される。 記載される本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴にしたがって、前記細胞
が生体内細胞および半ビボの細胞からなる群から選択される。 本発明のさらなる側面にしたがって、正常な幹細胞を、細胞系譜に分化拘束さ
れた前駆細胞に半ビボで分化させる方法であって；前記正常な幹細胞に、銅を捕
捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート化剤を加えるステッ
プを含んでなる方法が提供される。 本発明のさらなる側面にしたがって、幹細胞を、樹状細胞に分化拘束された前
駆細胞に半ビボで分化させる方法であって；前記幹細胞に、銅を捕捉しかつ細胞
の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート化剤を加えるステップを含んでな
る方法が提供される。 本発明のさらなる側面にしたがって、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するの
に有効な遷移金属キレート化剤、および医薬として許容されるキャリヤーを含有
する、細胞集団に分化を誘発する医薬組成物が提供される。

【００５６】 本発明は、細胞を増殖させるが、銅を欠乏させることで細胞の分化を遅延させ
る方法を提供することによって、現在知られている配置構成の欠点を成功裡に処
理する。本発明は、細胞分化を誘発する新規の手段を提供することによって、現
在知られている配置構成の欠点を成功裡に処理する。 本発明の方法のさらなる特徴と利点を以下に説明する。

【００５７】図面の簡単な説明 本発明は、以下、添付の図面を参照して例示のためだけに説明される。図面に
対する詳細で特異的な参照については、これらは例示のために、および本発明の
好ましい実施態様の説明的議論の目的のみに示されるものであり、また、本発明
の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解しうる説明であると考えられ
るものを提供するために提示される。これに関して、本発明の基本的な理解のた
めに必要とされる以上の詳細な構成を示す試みはなされない。ここで示す説明お
よび図面は本発明を実施する際にいくつかの形態がどのようにして実現されるか
を当業者に明らかにする。

【００５８】 図１はＣＤ_３４細胞のクローンを形成する性能（clonlogenic potential）に
対するＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細
胞を、低投与量のサイトカイン類、すなわちＦＬＴ３−５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−
１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下で、かつＴＥＰＡなしまた
は各種濃度のＴＥＰＡありで、３×１０^４細胞／ｍｌにて、液体培養で平板培養
した。７日目に、０．１ｍｌずつの試料を、半固形培地で細胞をクローン化し、
コロニーを１４日後に計数することによって、コロニー形成細胞について検定し
た。二つの独立した実験の結果を示してある。

【００５９】 図２は全細胞およびＣＤ_３４細胞に対する、ＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒
グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、ＦＬ−５ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１
０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（２０μＭ）
ありまたはなしで、液体培養で平板培養した。７日目に、ウェル内培養物の容積
の１／２を取り出し次いでそれを、図に示したように新鮮な培地およびＩＬ−３
（２０ｎｇ／ｍｌ）で置換することによってデミ−デポピュレート（demi-depop
ulate）した。１４日目にＣＤ_３４細胞の比率（右）および全細胞数（左）を、
希釈計数を掛け算して求めた。

【００６０】 図３はＣＤ_３４細胞の細胞数およびクローン形成性能に対するＴＥＰＡの長期
間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、高投与量のサイ
トカイン類すなわちＦＬ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６
−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、
ＥＰＯ−１Ｕ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（２０μＭ）ありかまたはなしで、
３×１０^４細胞／ｍｌにて液体培養で平板培養した。４日目に、サイトカイン類
とＴＥＰＡを補充した新鮮な培地０．９ｍｌで、培養物を１：１０の比率で希釈
した。７日目、１４日目および２１日目に、培養物の容積の１／２を取り出し次
いでそれを、図に示したように新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで置
換して培養物をデミ−デポピュレートした。収穫した培地の細胞を計数して、イ
ニシエーティング細胞が１×１０^３である部分を半固形培地でクローン化した。
液体培養物中の細胞の数（上図）と半固形培地中のコロニーの数（下図）を、希
釈計数を掛け算して示してある。^＊印は小さなコロニーと細胞クラスターを示す
。

【００６１】 図４は初期サイトカイン類とともに培養されたＣＤ_３４細胞に対するＴＥＰＡ
の長期間の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、ＦＬ−５
０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌおよびトロンボポエチン（ＴＰＯ）−２
０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで液体培養で
平板培養した。１週間毎に、培養物容積の１／２を取り出し、図に示したように
、それを新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで置換することによって、
培養物をデミ−デポピュレートした。収穫した培地の細胞を計数して、イニシエ
ーティング細胞が１×１０^３の部分を半固形培地でクローン化した。液体培養物
中の細胞の数（下図）と半固形培養物内のコロニーの数（上図）を、希釈計数を
掛け算して示してある。^＊印は、コロニーが全く発生しなかったことを示す。

【００６２】 図５は赤血球前駆細胞の発生に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
正常な成人ドナーから得た末梢血液単核細胞を、赤血球二相液体培養システムで
培養した（２３−２５）。培養物第二相は、１０μＭのＴＥＰＡなしまたはあり
で補充した。培養物は、１４日後に、全細胞と、ヘモグロビン含有細胞〔ベンジ
ジン陽性（Ｂ^＋）細胞〕について分析した。

【００６３】 図６ａ−ｄは細胞の成熟に対するＴＥＰＡの作用を示す図である。ＴＥＰＡな
し（図６ａと図６ｃ）とＴＥＰＡあり（図６ｂと図６ｄ）の場合の長期間（７週
間）培養物中の細胞の形態と構造を示す。Cytospinで調製したスライドガラスを
May-Grunwald Giemsaで染色した。倍率は、図６ａと６ｂが×６００で図６ｃと
６ｄが×１４８５である。

【００６４】 図７はＣＤ_３４細胞で開始される培養物の細胞数とクローン形成性能に対する
遷移金属キレート化剤の作用を示す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞
を、ＦＬ−２０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍ
ｌ、ＩＬ−６−２０ｎｇ／ｍｌが存在しかつＴＥＰＡ−１０μＭ、キャプトプリ
ル（ＣＡＰ）−１０μＭまたはペニシラミン（ＰＥＮ）−１０μＭの存在下で、
液体培養で平板培養した。７日目に、細胞を計数し、イニシエーティング細胞が
１×１０^３の培養物の部分を、半固形培地で平板培養した。棒は、７日目の全細
胞数（×１０^３／ｍｌ）と、クローン化して１４日目のプレート当たりのコロニ
ーの数を示す。

【００６５】 図８はＣＤ_３４細胞のクローン生成性能と全細胞数に対する銅の作用を示す棒
グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、サイトカイン類すなわちＦＬ−１
０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６
−１０ｎｇ／ｍｌの存在下で、液体培養で平板培養した。培養物に、図に記載し
たように、硫酸銅−５μＭとＴＥＰＡ−２０μＭを補充した。７日目に、細胞を
計数し（下図）、次いでイニシエーティング細胞が１×１０^３の部分を半固形培
地で平板培養した。コロニーは１４日後に採点した（上図）。

【００６６】 図９は培養されたＣＤ_３４細胞のクローン生成性能に対するイオンの作用を示
す棒グラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、ＦＬ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣ
Ｆ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの
存在下でかつＴＥＰＡ−１０μＭありまたはなしで液体培養で平板培養した。培
養物には、図に記載したように、硫酸銅−５μＭ、亜セレン酸ナトリウム−５ｍ
Ｍまたは鉄を飽和させたトランスフェリン０．３ｍｇ／ｍｌを補充した。７日目
に、イニシエーティング細胞が１×１０^３である培養物の部分を、半固形培地で
平板培養した。１４日後に、コロニーを採点した。

【００６７】 図１０はＣＤ_３４細胞の増殖性能に対する亜鉛の作用を示す棒グラフである。
臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、ＦＬ−１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−１０ｎｇ／ｍｌ
、ＩＬ−３−１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−１０ｎｇ／ｍｌの存在下でかつＴＥＰ
Ａ−１０μＭまたは硫酸亜鉛−５ｍＭまたは両者ありで液体培養で平板培養した
。７日目に、イニシエーティング細胞が１×１０^３の部分を半固形培地で平板培
養した。コロニーを１４日後に採点した。

【００６８】 図１１ａ−ｃはＣＤ_３４の長期間培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラ
フである。ＳＣＦ、ＦＬＴ３およびＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）ならびにＩ
Ｌ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなし
で、液体培地内で精製細胞を平板培養することによって、培養を、１０^４の臍帯
血由来のＣＤ_３４細胞で開始した。１週間毎に、細胞の１／２を取り出し続いて
新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを添加することによって、培養物を
デミ−デポピュレートした。指定の週に、細胞を計数し、そして半固形培地でク
ローン化することによって、コロニー形成細胞（ＣＦＵｃ）について検定した。
ＣＦＵｃの頻度を、細胞数当たりのＣＦＵｃの数として算出した。１日目に精製
ＣＤ_３４細胞をクローン化して、１０^４のイニシエーティング細胞当たり２．５
×１０^３のＣＦＵｃが生成した。^＊印はコロニーが全く発生しなかったことを示
す。

【００６９】 図１２−１４は異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下での細胞増殖
、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃの頻度に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである
。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、ＳＣＦ、ＦＬＴ３およびＩＬ−６の存在下で（
ＳＣＦ、ＦＬＴ、Ｉｌ−６）（各々５０ｎｇ／ｍｌ）かつＴＥＰＡ（１０μＭ）
ありまたはなしで、液体培地内で、図１１ａ−ｃに詳細に記載したようにして培
養した。さらに、培養物には、図に記載してあるように、ＩＬ−３（２０ｎｇ／
ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）または両者を補充した。１週間毎に、培養物
をデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充
した。指定の週に、細胞を計数し（図１２）、ＣＦＵｃについて検定し（図１３
）およびＣＦＵｃの頻度を算出した（図１４）。^＊印はコロニーが全く発生しな
かったことを示す。

【００７０】 図１５は対照およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ_３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対
するＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ_{３ ４} 細胞を図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１週間後、対照およびＴ
ＥＰＡの培養物の１／２に、後期作用性サイトカインであるＧ−ＣＳＦとＧＭ−
ＣＳＦ（各々１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した。１週間毎に、培養物はデミ−デポピ
ュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡを補充した。３，４お
よび５週目に細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定し、次いでＣＦＵｃ頻度を算
出した。

【００７１】 図１６−１７は長期間の細胞増殖とＣＦＵｃの産生に対する培地＋ＴＥＰＡの
部分変更と完全変更の作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、
図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１週間毎に、培養物はデミ−デポ
ピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＴＥＰＡで補充した。１週間
毎に、培養内容物（細胞および上澄み液）の１／２を取り出して、新鮮な培地、
サイトカイン類およびＴＥＰＡありまたはなしで置換した（部分的変更）。ある
いは、培養物の全内容物を収穫し、遠心分離し、上澄み液と細胞の１／２を廃棄
して、残りの細胞を、新鮮な培地とサイトカイン類およびＴＥＰＡありまたはな
しで再培養した（完全変更）。指定の週に、細胞の数（図１６）とＣＦＵｃの数
（図１７）を求めた。

【００７２】 図１８はＣＤ_３４細胞の拡張に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。
臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。１
，２および３週目に、ＣＤ_３４ ^＋細胞をフローサイトメトリーで計数した。^＊印
はコロニーが全く発生しなかったことを示す。

【００７３】 図１９はＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示すグラフであ
る。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した
。ＴＥＰＡ（１０μＭ）を、培養の開始時（１日目）または６日後に添加した。
１週間毎に、培養物はデミ−デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類お
よびＴＥＰＡを補充した。３，４および５週目に、ＣＦＵｃを計数して検定し、
次いでＣＦＵｃ頻度を算出した。

【００７４】 図２０は長期間のＣＦＵｃ産生に対する、単一のサイトカインとともに行う短
期間のプレインキュベーションの作用を示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ_{３ ４} 細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。培養物は、１日目に、
ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ
／ｍｌ）でかつＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで補充した。あるいは、培
養物は、１日目に、ＴＥＰＡ（１０μＭ）および単一のサイトカインとしてのＦ
ＬＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）で補充した。２日目に、これらの培養物に、ＳＣＦ、
ＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した
。１週間毎に、これら培養物のデミ−デポピュレートして、新鮮な培地、サイト
カイン類およびＴＥＰＡを補充した。指定の週に、細胞を、ＣＦＵｃについて検
定した。

【００７５】 図２１ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の作用を
示すグラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したよう
にして培養した。ポリアミンキレート化剤のテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰ
Ａ）、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）ま
たはトリエチレン−テトラミン（ＴＥＴＡ）を、各種の濃度で添加した。１週間
毎に、培養物を、デミ−デポピュレートして、新鮮な培地、サイトカイン類およ
びキレート化剤を補充した。３，４，６および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵ
ｃについて検定した。示した試験結果は、最適活性を有する濃度すなわちＴＥＰ
Ａ−４０μＭ、ＰＥＨＡ−４０μＭ、ＥＤＡ−２０μＭおよびＴＥＴＡ−２０μ
Ｍの場合の結果である。

【００７６】 図２２ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の作用を示
すグラフである。臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したように
して培養した。キレート化剤のキャプトプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥ
Ｎ）およびＴＥＰＡを各種の濃度で添加した。１週間毎に、培養物を、デミ−デ
ポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびキレート化剤を補充した。
４，５および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定した。示した結果
は、最適活性を有する濃度すなわちＴＥＰＡ−１０μＭ、ＰＥＮ−５μＭおよび
ＣＡＰ−４０μＭの場合の結果である。

【００７７】 図２３ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示すグラフである。
臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにして培養した。亜
鉛（Ｚｎ）を、１日目に、各種濃度で添加した。１週間毎に、培養物を、デミ−
デポピュレートして新鮮な培地、サイトカイン類およびＺｎを補充した。４，５
および７週目に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて検定した。

【００７８】 図２４は末梢血液由来のＣＤ_３４細胞培養物に対するＴＥＰＡの作用を示すグ
ラフである。末梢血液由来のＣＤ_３４細胞を、図１１ａ−ｃに詳記したようにし
て培養した。培養物には、ＴＥＰＡを補充しまたは補充しなかった。１週間毎に
、培養物を、デミ−デポピュレートして新鮮な培地とＴＥＰＡを補充した。１週
目と４週目に、細胞をＣＦＵｃについて検定した。^＊印はコロニーが全く発生し
なかったことを示す。 図２５ａ−ｂは、ＣＤ_３４ ^＋細胞培養物に対する銅キレート化性ペプチドの作
用を示す。培養は、１０^４臍帯血由来ＣＤ_３４ ^＋細胞を使用し、ＳＣＦ，ＦＬＴ
３およびＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）、銅結合性ペプチドのＧｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｈｉｓ（ＧＧＨ）もしくはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（ＧＨＬ）（各々１０μＭ
）、または遅延作用性（late-acting）サイトカイン類の顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−
ＣＳＦ）と顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）（各々１０ｎｇ／ｍ
ｌ）の存在下、液体媒地で精製細胞を平板培養することによって開始した。培養
物は、一週間毎に、デミ−デポピュレートし（demi-depopulate）、新鮮な培地
、サイトカイン類およびペプチド類を補充した。７週間後、細胞を計数し（図２
５ａ）、次いで培養物のコロニー形成細胞（ＣＦＵｃ、図２５ｂ）を検定した。 図２６は本発明の検定法で使用される遷移金属キレート化剤の化学構造式を示
し、この検定法はキレート化剤が細胞の分化を阻止するかまたは誘発する可能性
を確認するのに利用できる。 図２７ａ〜ｆは、ＴＥＰＡあり（２７ａ−ｄ）またはＴＥＰＡなし（２７ｅ−
ｆ）で、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写真を示す。

【００７９】好ましい実施態様の説明 本発明は、細胞の大集団を含有する半ビボで培養された細胞の治療用細胞製剤
を提供するために使用できる幹細胞と前駆細胞の増殖を制御し、および／または
分化を調節する方法であって、分化は阻害されるが拡張は増大される方法の発明
である。本発明はまた代わりに細胞分化を誘発するためにも使用することができ
る。具体的に述べると、本発明は、例えば造血細胞の移植に用いることができる
幹細胞と前駆細胞の拡張した集団、遺伝子治療に使用できる遺伝子操作に適した
幹細胞または前駆細胞の生成、および例えば限定されないがβ−異常ヘモグロビ
ン症などの疾患の新しい治療手段を提供するのに使用できる。また代わりに、本
発明は遺伝子治療に使用できる遺伝子操作のために、および細胞移植のために例
えば使用できる分化した細胞の大集団を提供するのに使用できる。

【００８０】 したがって本発明は、幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法に関
する。さらに詳しく述べると、本発明は、遷移金属、特に銅の利用効率を明らか
に修正することによって、一つの側面では幹細胞および前駆細胞に増殖を強制す
るが分化を抑制する方法に関し、別の側面では幹および前駆細胞の分化を誘発す
る方法に関する。両方の側面において、本発明は本発明の第一の側面の場合は拡
張している細胞に対して、第二の側面の場合は分化している細胞に対して、遷移
金属、特に銅の利用性能を修正する（減少させるか又は増大させる）ことによっ
て行われる。

【００８１】 本発明の方法の原理と操作は、添付図面と付随する説明と実施例によってより
充分に理解できる。

【００８２】 本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の
説明に述べられているかまたは添付図面に示されている要素の詳細な構造と配置
に用途が限定されるものではないと解すべきである。本発明は、他の実施態様が
可能であり、または各種の方法で実施することができる。また、本願で利用され
る表現法と用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなすべきではないと
解すべきである。

【００８３】 本発明の研究の過程で、銅などの遷移金属に結合（キレート化）するか、また
は銅の代謝を阻害する一連の化学薬剤が、幹細胞および中期と後期の前駆細胞の
分化するプロセスを可逆的に阻害（遅延）することができて、活性細胞増殖の相
を刺激し延長することができることが発見されたのである。

【００８４】 遷移金属を減少させるこの新たに発見された作用が利用されて、造血細胞、肝
細胞および胚性幹細胞を含む各種の細胞の半ビボでの拡張が最大限になった。こ
のような半ビボで拡張された細胞はいくつもの臨床状態に利用できる。以下にい
くつかの例を挙げる。

【００８５】 造血細胞の移植：造血細胞の移植は、各種の遺伝性疾患または悪性疾患に対す
る優れた治療法になっている。初期の移植法は、全骨髄（ＢＭ）集団を利用した
が、最近は、幹細胞（ＣＤ_３４ ^＋細胞）が豊富化された一層特別な集団が使用さ
れている（１）。

【００８６】 かような細胞は、骨髄に加えて、末梢血液（ＰＢ）および新生児臍帯血液（Ｃ
Ｂ）などの他の起源から得ることができる（２）。ＰＢ細胞による移植は、ＢＭ
に比べて、汎血球減少の期間が短くなるので、感染症や出血の危険性が少なくな
る（３−５）。

【００８７】 移植にＰＢを使用する場合の追加の利点は、利用しやすいことである。ＰＢ移
植を制限する因子は、循環する多分化能性の幹細胞と前駆細胞の数が少ないこと
である。

【００８８】 ＰＢ由来の幹細胞を、移植に用いるのに十分得るため、これらの細胞は、化学
療法とサイトカイン類で処理することによって骨髄から循環系へ可動化させた後
、白血球分離法を繰り返して“収穫される”（３−４）。この処理は、正常なド
ナーに対して適切なものでないことは明らかである。

【００８９】 半ビボで拡張された幹細胞を移植して使用すると、以下の利点がある（２，６
−７）。

【００９０】 成人の造血系を再構成するのに必要な血液の容積が減少し、かつ可動化と白血
球分離法が必要でなくなる（３）。

【００９１】 将来使用する可能性がある少数のＰＢもしくはＣＢの幹細胞を貯蔵することが
できる。

【００９２】 悪性腫瘍がみられる患者の自己移植の場合、自己注入時の汚染腫瘍細胞が疾患
再発の原因になることが多い（３）。ＣＤ_３４ ^＋幹細胞を選択し拡張すると、最
終の移植体の腫瘍細胞の負荷量が減少する。

【００９３】 上記培養物はＴリンパ球が有意に減少する。このことは、同種異系の移植片を
移植する際に、移植片宿主相関病を少なくするのに有用である。

【００９４】 臨床試験は、少数のＰＢＣＤ_３４ ^＋細胞由来の半ビボで拡張された細胞を移植
すると、高投与量の化学療法で治療された患者の造血を回復できることを示した
が、その試験結果によって、これらの培養された細胞の長期間にわたるインビボ
での造血能力について、しっかりした結論を下すことはできない（３−４）。

【００９５】 移植に成功するには、血球減少相の期間が短いことと移植期間の長いことが重
要である。移植片に、中期と後期の前駆細胞を含めると、ドナー由来の成熟細胞
の産生を加速しかつ血球減少相を短縮することができる。それ故、半ビボで拡張
された細胞が、造血の短期間での回復と長期間にわたる復原を最適化するため、
幹細胞に加えて、一層分化した前駆細胞を含有していることが大切である。中期
と後期の前駆細胞、特に好中球系統と骨髄巨核球系統に拘束されているものの拡
張は、幹細胞の拡張とあいまって、上記目的を達成するのに役立つはずである（
８）。

【００９６】 かような培養物は、骨髄を完全に除かれた患者に造血を復原するのに有用であ
るのみならず通常の放射線療法または化学療法に続く骨髄の回復を短期間で行う
ための補助手段としても有用である。

【００９７】 まれな細胞の遺伝子欠陥の出生前の診断：出生前の診断は、妊婦から胚細胞を
収集し次いでそれを遺伝子欠陥について分析して行った。胚細胞を収集する好ま
しい非侵襲の方法は、母体の血液循環系中に浸透した胚の有核赤血球前駆体を分
離することによって行われる。しかしこのような細胞は非常にまれであるから、
分析する前に細胞の拡張を行わねばならない。したがって、本発明は、出生前に
診断するため胚細胞を拡張する方法を提供するものである。

【００９８】 遺伝子療法：長期間の遺伝子治療に成功するには、そのゲノムに導入遺伝子を
組み込まれた遺伝的改変幹細胞が高頻度で存在していることが不可欠の必要条件
である。ＢＭ組織の場合、その細胞の大部分は、サイクリング（cycling）前駆
細胞（細胞周期を進行中の前駆細胞）であり、一方、幹細胞は細胞集団の小画分
のみを構成し、その大部分は、静止した非サイクリング状態である。ウィルスベ
ースの（例えばレトロウィルスベースの）ベクターは、導入遺伝子を宿主ゲノム
に組み込むのに、活性細胞分裂（active cell division）が必要である。そのた
め、新鮮なＢＭ幹細胞に遺伝子を導入することは非常に効率が悪い。半ビボで、
幹細胞の精製された集団を拡張しかつその細胞分裂を調節できると、それらの遺
伝的改変の確率を増大することができる（９）。

【００９９】 養子免疫療法：半ビボで拡張された確定リンパ系サブ集団（subpopulation）
が、研究されており、かつ各種の悪性腫瘍、免疫不全、ウィルスと遺伝子の疾患
の養子免疫療法に使用されている（１０−１２）。

【０１００】 その治療法は、必要な免疫応答を促進するかまたは欠陥機能を置き換える。こ
の方法は、Rosenbergら（１３）が、多数の自己の半ビボで拡張された非特異的
キラーＴ細胞および実質的に半ビボで拡張された特異的な腫瘍浸透リンパ球を用
いて、臨床によって最初に開発した。

【０１０１】 機能的に活性の抗原提示細胞が、サイトカインを保持する培養物中、ＣＤ_３４ ^＋ ＰＢ細胞の出発集団から増殖させることができることも報告されている。これ
らの細胞は、可溶性タンパク質の抗原を、インビトロで自己Ｔ細胞に提示するこ
とができるので、高投与量の化学療法の後の微小の残存疾患の免疫療法のための
新しい可能性が見込まれる。抗原提示樹状細胞の半ビボでの拡張も研究された（
１４−１６）。

【０１０２】 非造血性の幹細胞と前駆細胞の半ビボ拡張：例えば神経幹細胞またはオリゴデ
ンドロサイト等の前駆細胞の半ビボ拡張。

【０１０３】 ミエリンの障害は、今までのところまだ不治のヒト神経疾患の重要なグループ
を形成している。動物モデルの場合、特に、オリゴデンドロサイト系の細胞を移
植すると、病巣に有意に髄鞘が再び生成して、機能が回復した生理学的徴候が現
れる（３６）。将来の治療は、移植、および内因性修復の促進の両方を行うこと
ができ、これら二つの方法は、ドナーの組織の半ビボの処理と組み合わせること
ができる。

【０１０４】 米国特許第５４８６３５９号は、２種以上の組織（例えば骨、軟骨、筋肉また
は骨髄支質）に分化できる単離されたヒト間葉幹細胞、およびヒト間葉幹細胞を
単離し精製しおよび培養で拡張する方法を教示している。

【０１０５】 米国特許第５７３６３９６号は、単離され、培養で拡張されたヒト間葉幹細胞
のインビトロまたは半ビボでの系統特異的誘発法（lineage-directed induction
）であって、その間葉幹細胞を、選択された系統へのその分化を誘発するのに有
効な生物活性因子と接触させるステップを含んでなる方法を教示している。さら
に、かような培養で拡張され系統に対し誘発された間葉幹細胞を、それらが、間
葉組織の再生または修復を行うために起源とした宿主中に導入することも含む方
法が開示されている。

【０１０６】 米国特許第４６４２１２０号は、軟骨と骨類の欠陥を修復するのに用いる組成
物を教示している。これらの組成物は、そのまままたは天然もしくは人工の骨の
中に埋包されて、ゲルの形態で提供される。そのゲルは特定のタイプの細胞を含
有している。これらの細胞は、胚の拘束軟骨細胞、または一般に、ライブリノー
ゲン、アンチプロテアーゼおよびトロンビンを組み合わせた軟骨形成誘発因子の
影響によって軟骨細胞に変換しうる可能性があるあらゆる種類の間葉組織起源の
組織でよい。

【０１０７】 米国特許第５６５４１８６号は、血液が含有する間葉組織細胞が、培養で増殖
し、そしてインビボで、動物モデルで示されているように、その血液から創傷部
位に移行して皮膚を生成することができることを教示している。

【０１０８】 米国特許第５７１６４１１号は、動物とヒトの創傷または火傷の皮膚を再生す
る方法を教示している。この方法は、最初、創傷をコラーゲングリコサミノグリ
カンマトリックスで覆い、その移植されたＧＣマトリックスを、間葉細胞と血管
によって、健康な下側の組織から浸透させ、次いで、動物またはヒトの体表面の
創傷のない部位の、動物またはヒトから採取した表皮細胞から増殖させた培養表
皮自己移植シートをはりつけるステップを含んでなる方法である。得られた移植
片は生着速度に優れ、かつ、正常な皮膚の外観、成長、成熟および分化を示して
いる。

【０１０９】 米国特許第５７１６６１６号は、軟骨または肺臓の欠陥を特徴とする疾患、障
害または症状がみられる患者を治療する方法を教示している。この方法は、正常
な同系の個体から単離した支質細胞を静脈投与するか、または単離された細胞の
遺伝子欠陥を矯正した後、患者から単離した支質細胞を静脈投与するステップを
含んでなる方法である。遺伝子を受容者の個体に導入する方法も開示されている
。その方法は、骨髄試料を、受容者の個体または適合した同系ドナーから得て、
その試料から付着細胞を単離し、受容者または適合同系ドナーから単離した付着
細胞に、遺伝子をトランスフェクトし、次いで、そのトランスフェクトされた付
着細胞を受容者の個体に静脈投与するステップを含んでなる方法である。調節配
列に作動可能に連結された外因性遺伝子を含有する、単離された支質細胞を含有
する組成物が開示されている。

【０１１０】 上記の各例では、非造血幹細胞と非造血前駆細胞が、器官の失われたかまたは
損傷した細胞を補充するための細胞の外部供給源として使用されている。このよ
うな用途には、第一に、必要な細胞集団を得るため、分化する前に、細胞の拡張
（cell expansion）が必要である。上記の諸米国特許に開示されている方法のい
ずれかを実施する際、本発明の方法が非常に有効かつ有用になるのは、このステ
ップである。

【０１１１】 半ビボおよびインビボ両者の用途の追加例：皮膚の再生、肝臓の再生、筋肉の
再生および骨粗しょう症における骨の増殖。

【０１１２】 骨髄幹細胞の末梢血液中への可動化〔ペリフェラリゼーション（peripheraliz ation）〕 ：遷移金属キレート化剤の作用の発見はインビボでも利用できる。上
記のように、移植に用いるＰＢ由来幹細胞は、化学療法およびサイトカインで治
療することによってこれら細胞を骨髄から循環系に可動化させた後、白血球分離
法を繰り返して“収穫”される（３−４）。

【０１１３】 化学療法の使用は、正常なドナーに対して勿論、適切でない。ＴＥＰＡなどの
遷移金属キレート化剤をドナーへ投与すると、骨髄幹細胞のプールが増大し、次
に、そのプールは内因性Ｇ−ＣＳＦまたは注射されたＧ−ＣＳＦによって周縁に
向かって可動化される。

【０１１４】 白血病：正常な造血と異なり、白血病の場合、増殖と分化のプロセスが連結し
ておらず、その悪性細胞は、分化できないので、連続的に増殖する性能を維持し
ている。

【０１１５】 遷移金属の特に銅の減少によって、正常な前駆細胞の増殖と分化のプロセスを
連結しないように駆動する分子現象を理解すれば、白血病発生に関与する細胞プ
ロセスを解明することができる。

【０１１６】 胎児ヘモグロビン産生の刺激：胎児ヘモグロビンが増大すると、鎌状細胞貧血
およびβ−サラセミアなどのβ−異常ヘモグロビン症がみられる患者の臨床徴候
が改善することが報告されている（３８）。

【０１１７】 胎児ヘモグロビンは、通常、全ヘモグロビンの約１％を占めているが、赤血球
産生が加速されると（例えば、急性の溶血または出血またはエリスロポエチンの
投与によって）上昇する（３５）。

【０１１８】 この現象は、赤血球前駆細胞の成熟／分化のプロセスの加速と関連しているこ
とが示唆されている（３７）。

【０１１９】 ＴＥＰＡなどの遷移金属キレート化剤を、β−異常ヘモグロビン症の患者に投
与すると、第一に（分化を阻止することによって）、患者の初期赤血球前駆細胞
のプールを増大して同期化する（synchronize）。

【０１２０】 上記薬剤の投与を中止した後、その薬剤が身体から排泄されると、その初期集
団は成熟が加速され、胎児ヘモグロビンの産生が増大する。

【０１２１】 したがって、本発明の一つの側面によって、細胞の集団を拡張し、同時にその
細胞の分化を阻害する方法が提供される。この方法は、細胞が増殖し同時に遷移
金属を利用するその細胞の性能を低下させる条件を、その細胞に与えるステップ
を含んでいる。

【０１２２】 遷移金属を利用する細胞の性能の低下は、例えば（例えば適切なキレート化剤
で）遷移金属を減らすことによって、または（例えば亜鉛イオンを添加して）遷
移金属の代謝を妨害することによって実施できる。

【０１２３】 用語“阻害する”は、本願で使用する場合、ゆっくり行う、減少させる、遅ら
せる、防止するまたは無効にすることを意味する。

【０１２４】 用語“分化”は、本願で使用する場合、発育中、比較的一般的な種類から特殊
な種類への変化を意味する。各種細胞系の細胞分化は、十分に報告されているプ
ロセスなので、本願ではそれ以上に述べる必要はない。用語“分化”は、本願で
使用する場合、成熟とは区別される。成熟は特定の細胞型が成熟して機能し、そ
して例えばプログラムされた細胞死を介して死ぬという、時には細胞分裂と関連
した過程である。

【０１２５】 本発明の好ましい実施態様によれば、拡張すべき細胞は生体内に存在している
。この場合、細胞が増殖する条件は、自然に提供される。したがって、遷移金属
、例えば限定されないが銅を利用する細胞の性能の低下は、遷移金属例えば銅の
キレート化剤、亜鉛イオンまたは両者を投与することによって実施される。

【０１２６】 遷移金属のキレート化剤および／または亜鉛イオンの投与は、これらのものを
含有し、さらに粘稠化剤、担体、緩衝剤、希釈剤、界面活性剤、保存剤などの当
該技術分野で公知のすべてのものを含有していてもよい医薬組成物で行われる。

【０１２７】 その医薬組成物は、局所または全身の治療が選択されるかどうかおよび治療さ
れる部位によって一つ以上の方法で投与できる。投与は、局所に（眼内、膣内、
直腸内、鼻腔内を含む）、経口で、吸入により、または非経口で例えば静脈内点
滴、または腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内注射で行うことができる。

【０１２８】 局所投与用の配合剤としては、限定されないが、ローション剤、軟膏剤、ゲル
剤、クリーム剤、坐剤、滴剤、液剤、スプレー剤および粉末薬がある。通常の医
薬担体、水性、粉末もしくは油状の基剤、粘稠化剤が必要であるかまたは望まし
い。

【０１２９】 経口投与用の組成物としては、粉末薬もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体
の懸濁剤もしくは水剤、サシェ剤、カプセル剤または錠剤がある。粘稠化剤、希
釈剤、着香剤、分散助剤、乳化剤または結合剤が望ましい。

【０１３０】 非経口投与用の配合剤としては限定されないが、緩衝剤、希釈剤などの適切な
添加剤も含有する滅菌溶液がある。

【０１３１】 投薬は、治療すべき症状の重症度と反応性によって決まるが、数日〜数カ月間
または治癒するまでまたは疾患状態が減退するまで続く治療の過程で、通常、１
日当たり１回以上である。当業技術者であれば最適の投与量、投与法および反復
率（repetition rate）は容易に決定できる。徐放投与方式が、いくつかの用途
で有利である。

【０１３２】 本発明の他の好ましい実施態様で、拡張すべき細胞は、半ビボで存在している
。

【０１３３】 用語“半ビボ（ex-vivo）”は、本願で使用する場合、生きている生物から取
り出されて、その生物の外部（例えば試験管内）で増殖される細胞を意味する。
しかし、用語“半ビボ”は、本願で使用する場合、各種の細胞系（例えばＨＬ−
６０、ＭＥＬ、ＨｅＬａなど）のようにインビトロ（in-vitro）でしか増殖しな
いことが知られている細胞を意味しない。

【０１３４】 半ビボで増殖する細胞に、細胞増殖の条件を与えることには、それらの細胞に
栄養素および好ましくは１種以上のサイトカインを与えることが含まれる。また
、それら細胞の、銅などの遷移金属を利用する性能は、適切な遷移金属（例えば
銅）キレート化剤および／または亜鉛イオンによって低下させる。

【０１３５】 このキレート化剤および／または亜鉛イオンの最終濃度は、特定の用途に応じ
て、マイクロモルまたはミリモルの範囲内でよい。例えば、約０．１μＭ〜約１
００ｍＭ、好ましくは約４μＭ〜約５０ｍＭ、さらに好ましくは約５μＭ〜約４
０ｍＭの範囲内である。

【０１３６】 本発明の好ましい実施態様によれば、キレート化剤は、ポリアミンのキレート
化剤であり、限定されないが、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン
、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン
、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘ
キサミン、トリエチレンテトラミン−塩酸、テトラエチレンペンタミン−塩酸、
ペンタエチレンヘキサミン−塩酸、テトラエチルペンタミン、キャプトプリル、
ペニシラミン、Ｎ，Ｎ′−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジア
ミン、Ｎ，Ｎ，ビス（２アミノエチル）１，３プロパンジアミン、１，７−ジオ
キサ−４，１０−ジアザシクロドデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロ
テトラデカン−５，７−ジオン、１，４，７−トリアザシクロノナントリ塩酸、
１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン、１，４，８，１２−テト
ラアザシクロペンタデカンまたは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン
があり、テトラエチルペンタミンが好ましい。上記キレート化剤は、銅イオンに
対して高いアフィニティーを有していることが知られている。しかし、これらの
キレート化剤は他の遷移金属に対してもかなりのアフィニティーを有している（
３９）。この文献（３９）は全体を本願に援用するものである。

【０１３７】 本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記サイトカイン類は、初期作用性
サイトカイン類の例えば限定されないが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、イン
ターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキン−３、および／ま
たは後期作用性サイトカイン類の例えば限定されないが顆粒球コロニー刺激因子
、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンである。

【０１３８】 上記細胞としては、限定されないが、造血幹又は前駆細胞、神経幹又は前駆細
胞、オリゴデンドロサイト幹又は前駆細胞、皮膚幹又は前駆細胞、肝幹又は前駆
細胞、筋肉幹又は前駆細胞、骨幹又は前駆細胞、間葉幹又は前駆細胞、膵幹又は
前駆細胞、軟骨幹又は前駆細胞、支質幹又は前駆細胞または胚性幹細胞を含むあ
らゆる細胞系の細胞がある。

【０１３９】 本発明の方法によって半ビボで拡張するのに用いる造血細胞は、用途に応じて
、骨髄、末梢血液または新生児臍帯血から得ることができる。

【０１４０】 造血細胞は、造血ＣＤ_３４ ^＋細胞（すなわち幹細胞）を豊富化することが好ま
しい。幹細胞の画分の豊富化は、当該技術分野で知られているように、細胞ソー
ティング（cell sorting）で行うことができる。

【０１４１】 本発明によって拡張される細胞は、分化されていない幹細胞または拘束前駆細
胞でよい。幹細胞は、上述した細胞系を含むがこれらに限定されない多種類の細
胞系について知られている。これらの細胞は、その細胞系の最も分化されていな
い細胞であることが特徴である。一方、前駆細胞は、その細胞系内で特定の分化
経路にすでに拘束されているので、一層分化している。

【０１４２】 さらに本発明によって、造血細胞の移植方法が提供される。この方法には次の
ステップが含まれている。第一に、移植すべき造血細胞をドナーから得る。第二
に、造血細胞は、その細胞が増殖し同時に遷移金属の特に銅を利用するその細胞
の性能を低下させる条件を半ビボで与えられて、その細胞の集団が拡張され、同
時に細胞の分化が阻害される。最後に、その細胞を患者に移植する。自己移植の
場合、ドナーと患者は単一の個体である。これらの細胞は、末梢血液、骨髄また
は新生児臍帯血から得ることができる。これらの細胞は、幹細胞または前駆細胞
を豊富化すること（例えば細胞ソーティングによって）が好ましい。

【０１４３】 さらに、本発明によって、幹細胞を、外来遺伝子（導入遺伝子）で遺伝的に改
変（形質導入、トランスフェクト、形質転換）する方法が提供される。この方法
には、次のステップが含まれている。第一に、遺伝的に改変すべき幹細胞を入手
する。第二に、その細胞が増殖し同時に遷移金属、特に銅を利用するその細胞の
性能を低下させる条件を、その細胞に半ビボで与えて、細胞の集団を拡張させ、
同時に細胞の分化を阻害する。第三に、その細胞を、外来遺伝子で遺伝的に改変
する。遺伝的改変法は当該技術分野で公知であるので、本願ではそれ以上の説明
は必要でない。遺伝的改変のプロトコルの例は、Sambrook,J., Fritsch,E.F., M
aniatis,T., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor
Laboratory Press、ニューヨーク、１９８９年を含む多くの実験室マニュアル
に見られる。遺伝的改変は、外来遺伝子を含有するベクターで行うことが好まし
い。

【０１４４】 さらに、本発明のこの側面によって、養子免疫療法が提供される。この方法に
は以下のステップが含まれている。第一に、造血前駆細胞を患者から得る。第二
に、その細胞にその細胞が増殖し同時に遷移金属の特に銅を利用するその細胞の
性能を低下させる条件が半ビボで与えられて、その細胞の集団が拡張され同時に
細胞の分化が阻害される。最後に、その細胞を、患者に移植する。

【０１４５】 さらに、本発明のこの側面によって、骨髄幹細胞をドナーの末梢血液中に可動
化させてその細胞を収穫する方法を提供する。この方法には以下のステップが含
まれる。第一に、ドナーに、上記細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低
下させる薬剤を投与して、幹細胞の集団を拡張させ、同時に幹細胞の分化を阻害
する。第二に、その細胞を白血球分離法によって収穫する。ドナーにサイトカイ
ン（初期および／または後期に作用するサイトカイン）を投与することは、可動
化を高めるのに好ましい。前記薬剤は、遷移金属キレート化剤および／または亜
鉛イオンが好ましい。

【０１４６】 さらに、本発明のこの側面によって、赤血球前駆細胞の成熟／分化を減速させ
てβ−異常ヘモグロビン症の患者を治療する方法が提供される。この方法には、
細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低下させる薬剤を患者に投与して幹
細胞の集団を拡張し、同時に幹細胞の分化を阻害し、その結果、その薬剤が身体
から自然に排泄されると、その幹細胞は成熟が加速されて胎児ヘモグロビンの産
生が増大するステップが含まれる。

【０１４７】 さらに、本発明のこの側面によって、半ビボで培養された細胞の治療用製剤が
提供される。その製剤は、細胞の、遷移金属の特に銅を利用する性能を低下させ
て細胞の集団を拡張させ、同時に細胞の分化を阻害する薬剤の存在下、半ビボで
増殖させた細胞を含有している。 さらに、本発明を実施している際に、銅などの遷移金属を捕捉して（キレート
化して）細胞による銅取りこみを高める一連の他の化学薬剤が、幹細胞および反
応中間前駆細胞と後期前駆細胞の分化プロセスを可逆的に誘発するかもしくは容
易にして、細胞の分化を強制もしくは加速できることが発見された。 この新しく発見された作用を利用して、各種細胞の半ビボでの分化を最高にし
た。 ＴＥＰＡなどのポリアミン類、またはペニシラミンおよびカプトプリル（Capt
opril）などのキレート化剤を含む一群の銅キレート化剤が、細胞の分化を遅延
させて、各種の幹細胞および／または前駆細胞の連続細胞増殖と長期間にわたる
生成を保持することは、すでに分かっていたことであり、先に説明してあり、後
記実施例のセクションに例示されている。これらの作用は、過剰量の銅によって
無効にすることができた。このことは、これら銅キレート化剤が銅をキレート化
して銅を阻害することを強く示唆している。 しかし、本願では、銅結合性ペプチドＧＧＨとＧＨＬ（配列番号１と２）とポ
リアミンの１，４，８，１１−テトラザシクロテトラデカンを含有する、第二群
の、遷移金属例えば銅のキレート化剤が細胞の分化を加速して細胞の増殖を制限
することを開示する。後者の作用は、培養物に、細胞の分化を加速する性能を有
していることが知られているＧ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどの遅延作用性（late
-acting）サイトカイン類を補充した場合と類似の動態であることが観察された
。銅の塩（１μＭ）が類似の作用をもっていた。 後記実施例のセクションで提供されるこれらの試験結果は、上記のキレート化
剤群の化合物、すなわち分化誘発性キレート化剤が、分化阻害キレート化剤であ
る前者のキレート化剤群とは逆に、細胞分化機構に対する銅の利用度を改善する
ことによって培養物に作用することを示している。 銅結合性化合物の前記二つの対照的な作用が、それら化合物の異なる銅結合ア
フィニティによって起こり、すなわち、分化阻害性化合物は、銅を高いアフィニ
ティで、実質的に不可逆的に捕捉して細胞の銅含有量を減少させるキレート化剤
として機能し、一方分化促進性化合物は銅を可逆的に捕捉して（低アフィニティ
で）、分化するため銅を要求している細胞の部位への銅の送達を助けているとい
うことが現在の作業仮説である。この仮説は、本発明の広い範囲に限定するもの
ではない。 本発明の分化誘発性キレート化剤の生物学的特性は、次のようないくつもの臨
床上の設定に使用できる。 急性白血病細胞の末端分化（terminal differentiation）の誘発：白血病の現
在の治療法は、その悪性細胞を化学療法または放射線療法によって殺すことに基
づいている。この治療法は悪性細胞に対して特異的な方法ではなく、正常な細胞
にも作用する。実際に、この方法は、この治療法が各種の正常な組織に対して毒
性があるので制限される。急性白血病には細胞分化にブロックがあるので、別の
方法によって、白血病細胞の分化を誘発させて、それに伴い白血病を発症しない
ようにすることができる。 Fibachら（５４）は、ある種の骨髄性白血病の未分化細胞が分化誘発剤に応答
して、分化し、成熟した機能性で非分裂性の顆粒球またはマクロファージになり
、その結果、白血病発症性を失うことを示した。この誘発剤はインターロイキン
−６であることが確認された。この誘発剤は、最初、マスクの骨髄性白血病細胞
系に対する分化因子として精製されたが、正常細胞に対し早期造血成長因子とし
て機能することも見出された。 本発明のこの側面による分化誘発性キレート化剤は、ヒトとマウス両者の白血
病株化細胞系、ならびに急性および慢性のヒト骨髄性白血病から新たに移植され
た細胞の分化を誘発し、増殖を阻害することが見出されたのである。芽球細胞は
その白血病の表現型を失って、機能性で非分裂性のマクロファージに変化する。 本発明の分化誘発性キレート化剤の白血病細胞に対する上記作用によって、こ
れらキレート化剤は、以下の二つの臨床設定で骨髄性白血病を治療するのに有用
になる可能性がある。その臨床設定は、（ａ）それ自体または他の造血因子もし
くは低投与量化学療法を組み合わせて、主な方法として“分化誘発療法”を用い
ることによる寛解の誘発；（ｂ）その寛解状態の維持；および（ｃ）残留白血病
細胞を半ビボまたは生体内で除くための個体内移植である。 非白血病造血前駆細胞の分化の誘発：いくつもの非白血病造血病原性症状は、
細胞分化にブロックがある。これらの症状としては、特発性もしくは薬物誘発性
のまたは赤血球無形成症および先天性好中球減少症のような状態の“成熟阻止”
がある。本発明のこの側面の分化誘発剤は、これらの症状の場合、細胞分化を促
進するのに有用である。 正常幹細胞の細胞系譜分化拘束前駆細胞（lineage committed progenitor）へ の半ビボ分化 ：移植に成功するには、血球減少相の期間の短縮と、長期間の移植
が非常に重要である。移植体に反応中間前駆細胞および後期前駆細胞（late pro
genitor）を入れると、ドナー由来成熟細胞の産生が加速されかつ血球減少相が
短縮される。したがって、半ビボで拡張された細胞が、幹細胞に加えて、一層分
化した前駆細胞、特に好中球細胞系譜と巨核球細胞系譜へ分化するよう拘束され
ている細胞を含有していることは、造血の短期間の回復と長期間の修復を最適化
するために大切である。本発明のこの側面の分化誘発性キレート化剤はこの目的
を達成するのに役立つ。 幹細胞の樹状細胞分化拘束前駆細胞への半ビボ分化：樹状細胞は、“専門的な
”免疫刺激性の抗原提示細胞である。各種の研究によって、樹状細胞を免疫療法
で使用できることが示唆されている。この方法には、腫瘍抗原によって生体内で
パルスされた樹状細胞を治療用ワクチンとして注入する方法、および樹状細胞を
用いて、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を生体内で刺激して、養子免疫Ｔ細胞療法に使用
する方法（５５）が含まれている。本発明のこの側面の分化誘発性キレート化剤
は、これら細胞の分化に対して作用する。 したがって、本発明のこの側面によって、細胞分化を誘発するのに有効な、遷
移金属例えば銅のキレート化剤を細胞に加えることによる、細胞集団の生体内も
しくは半ビボでの分化誘発法が提供される。本発明のこの側面による上記方法は
、例えば、（ｉ）急性白血病細胞の末端分化の誘発、（ii）非白血病造血前駆細
胞の分化の誘発；（iii）正常幹細胞の細胞系譜分化拘束前駆細胞への半ビボ分
化および／または（iv）幹細胞の樹状細胞分化拘束前駆細胞への半ビボ分化を行
うのに利用できる。 本発明のこの側面の好ましい実施態様の細胞は造血細胞である。遷移金属キレ
ート化剤で誘発される造血細胞の分化は後記実施例のセクションで例示する。本
発明のこの側面にしたがって、遷移金属キレート化剤によって分化する細胞は正
常細胞でも癌細胞でもよい。したがって、本発明のこの側面の細胞は、例えば、
骨髄、末梢血液および新生児の臍帯血などのソース由来のものでもよい。本発明
のこの側面の実施態様によって、これらの細胞は、造血ＣＤ_３４ ^＋細胞について
豊富化されている（enrich）。別の実施態様によれば、これらの細胞は未分化幹
細胞および／または分化拘束前駆細胞である。さらに、これらの細胞は、例えば
、神経細胞と希突起グリア細胞、皮膚細胞、肝細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細
胞、膵細胞、軟骨細胞またはストロマ細胞であってもよい。 さらに本発明のこの側面によって、細胞集団に分化を誘発する医薬組成物が提
供される。本発明のこの側面の組成物は、細胞分化を誘発するのに有効な量もし
くは濃厚の一種の遷移金属キレート化剤と医薬として許容されるキャリヤーを含
有している。 本発明のこの側面の実施態様によれば、前記遷移金属キレート化剤はトリペプ
チドであり、例えばＧＧＨおよび／またはＧＨＬである。この両ペプチドは、後
記実施例のセクションで分化を誘発することを示してある。したがって本発明の
この側面の遷移金属キレート化剤は、ペプチドまたはペプチド類似体であるかま
たはペプチド配列を含有している。 本明細書および前記特許請求の範囲のセクションで用いる場合、用語“ペプチ
ド”は、天然ペプチド類（分解生成物または合成法で合成されたペプチド）を意
味し、さらにペプトイド類およびセミペプトイド類などのペプチドミメティック
ス（ペプチド類似体）を意味し、これらペプチドには、例えば、それらペプチド
を、身体内に存在しているとき一層安定にし、または生理的条件下でキレート化
するのにより有効にする変形がある。このような変形としては、限定されないが
、環化、Ｎ末端の変形、Ｃ末端の変形、ペプチド結合の変形（限定されないが、
ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ _２ −ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含む）、骨格の変形
および残基の変形がある。ペプチドミメティック化合物の製造方法は、当該技術
分野で周知のことであり、Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd.,１７．
２章、F.Choplin Pergamon Press(１９９２年）に詳述されている。なおこの文
献はあたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。 用語“アミノ酸”は、本願で使用する場合、２０種類の天然に存在するアミノ
酸類（これらアミノ酸は、生体内で翻訳後、変形されることが多く、例えばヒド
キシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンがある）およびその外の特
異なアミノ酸類（限定されないが、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、
イソデスモシン（isodesmosin）、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニ
チンがある）を含むものである。さらに、用語“アミノ酸”はＤ−アミノ酸とＬ
−アミノ酸の両者を含む。 分化誘発性遷移金属キレート化剤の投与は、このキレート化剤を含有する医薬
組成物で行うことができ、その組成物は、さらに、医薬として許容可能なキャリ
ヤー、例えば増粘剤、緩衝剤、希釈剤、表面活性剤、保存剤などを含有していて
もよく、これらはすべて当該技術で周知であり、さらに分化阻害キレート化剤に
ついては先に述べている。 したがって、本発明を計画し実施したとき、銅を捕捉する遷移金属キレート化
剤は分化誘発剤であるかまたは分化阻害剤であることが見出された。分化阻害性
キレート化剤は、銅を効率的に捕捉するかまたは存在している細胞すなわち銅を
含有している細胞に入ることができないので、細胞に対する銅の利用度を低下さ
せ、結局、細胞の銅含量を減らして分化が阻止され細胞が拡張すると考えられる
。この現象は、拡張中の細胞の増殖培地に、銅を添加することによって逆転させ
ることができる。さらに、分化誘発性キレート化剤は、銅を余り効率的には捕捉
せず、存在する細胞すなわち銅を含有している細胞に入ることができるので、細
胞に対する銅の利用度が増大し、結局、細胞の銅含量を増大して分化が加速され
増殖が阻害されると考えられる。これらの想定は、分化を誘発するキレート化剤
が細胞の銅レベルを増大させるが、一方、分化を阻害するキレート化剤は、細胞
の銅レベルを減らすという事実によって有力になっている。 これらの知見に基づいて、本発明は、分化誘発性キレート化剤および分化阻害
性キレート化剤を確認する二つの独立のもしくは補助の試験法を提供するもので
ある。 したがって、本発明の他の側面によって、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤
が分化の阻害を起こすのかまたは分化の誘発を起こすのかを確認する方法が提供
される。本発明のこの側面の検定法は、幹細胞もしくは前駆細胞または実質的に
未分化の細胞系の細胞の集団を、遷移金属キレート化剤の存在下、培養して、こ
れら細胞の分化を監視することによって行われ、分化が未処理の細胞と比べて増
大している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を誘発しており、一方、分化が
未処理の細胞と比べて減少しているかまたは分化が全く認められない場合は、遷
移金属キレート化剤が分化を阻害している。 本発明の別の側面によって、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、分化の阻
害を起こすのかまたは分化の誘発を起こすのかを確認する検定法が提供される。
本発明のこの側面の検定法は、細胞の集団を、遷移金属キレート化剤の存在下、
培養して、これら細胞の銅含有量を監視することによって行われ、細胞の銅含有
量が未処理の細胞と比べて増えている場合は、遷移金属キレート化剤が分化を誘
発しており、一方、その銅含有量が未処理細胞に比べて減少している場合は、遷
移金属キレート化剤が分化を阻害している。 本発明の追加の目的、利点および新規の特徴は、以下の実施例を試験すること
によって、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を
限定するものではない。その上に、先に詳述しかつ特許請求の範囲のセクション
で請求した本発明の各種の実施態様と側面は各々、以下の実施例の実験によって
支持されている。

【０１４８】 実 施 例 ここで以下の実施例を上記説明とともに参照して、本発明を説明するが、本発
明を限定するものではない。 一般的に、本願で使用する名称及び本発明で利用される実験手順は分子的、生
化学的、微生物的及び組換えＤＮＡの技術を含む。かかる技術は文献に全て説明
されている。例えば、“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook et
al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Au
subel, R. M., ed. (1994);“ Cell Biology: A Laboratory Handbook”Volumes
I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology”Vol
umes I-III Coligan J. E., ed. (1994); “Oligonucleotide Synthesis”Gait,
M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization”Hames, B. D., and Higg
ins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation”Hames, B. D., a
nd Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture”Freshney, R. I., e
d. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press, (1986); “A Pract
ical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) および“Methods and
Enzymology”Vol. 1-317 Academic Press; を参照されたい。これらの文献はす
べてここにその全てが記載されているかの如くここに参照文献として組入れられ
る。他の一般的な参照文献は本願明細書中に与えられている。これらの手順は当
業者には周知であると考えられ、読者の便利のために与えられる。ここに含まれ
る情報はすべて参照文献としてここに組入れられる。

【０１４９】 実 施 例 １ 幹および前駆細胞を遷移金属のキレート化剤で処理することに よってこれらの細胞に増殖を強制しながらも分化を制限する 実 験 の 手 順 ＣＤ_３４細胞の選択：全血ユニット由来の末梢血液“バフィコート（buffy co
at）”細胞、白血球分離法によって得た末梢血液細胞または臍帯血細胞を、Fico
ll-Hypaque（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）上に重層し、次いで１０００×ｇで、２
０分間、室温で遠心分離した。単核細胞の間期層（interphase layer）を収集し
、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＣａ／Ｍｇなしリン酸塩緩衝
食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を、マウスのモノクローナル抗ＣＤ_３４抗
体（０．５μｇ／１０^６単核細胞）とともに４℃にて３０分間インキュベートし
、次いで、miniＭＡＣＳ装置（Miltenyi-Biotec, Bergisch, Gladbach, ドイツ
）を、メーカーのプロトコルにしたがって使用して単離した。

【０１５０】 培養の手順：前駆細胞を拡張するため、ＣＤ_３４ ^＋を豊富化した画分または未
分離の単核細胞を、１０％の予め選択されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する
α−最少必須培地（両者とともに米国ニューヨーク州グランドアイランド所在の
ＧＩＢＣＯから入手）または血清なしの培地（Progenitor−３４培地、米国ニュ
ーヨーク州グランドアイランド所在のLife Technologies）中に、約１−３×１
０^４細胞／ｍｌで接種した。これらの培地には、成長因子と遷移金属キレート化
剤の混合物を補充した。過剰湿度の５％ＣＯ_２空気の雰囲気内で、３７°にて培
養物をインキュベートした。培地の１／２を、すべての補充剤を含有する新鮮な
培地で、１週間毎に変えた。

【０１５１】 クローン化の可能性の評価：液体培地で発育させた細胞のクローン化の可能性
を、異なる時間間隔で、半固形培地内で検定した。細胞を、洗浄し、３５ｍｍの
皿の中の、組換え成長因子（ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯ）
を補充したα培地を含有するメチルセルロース中に接種した。２週間インキュベ
ートした後、培養物を倒立顕微鏡で採点した。コロニーを、その細胞の組成にし
たがって、芽球、混合物、赤血球、骨髄および巨核球のコロニーに分離した。

【０１５２】 形態学的評価：得られた培養物集団の特性を決定するため、細胞の一部をスラ
イドガラスの上に被着させ（cytocentrifuge, Shandon, Runcorn, 英国）、固定
し、次いでMay-Grunwald Giemsaで染色した。細胞の残りの部分は、細胞内ヘモ
グリンについて、ベンジジンで染色した。

【０１５３】 免疫蛍光染色：異なる時間間隔で、液体培養物から得た細胞を、ＣＤ_３４抗原
について検定した。一部を収穫し、洗浄し、次いでＦＬＴＣで標識した抗ＣＤ_{４ ５} モノクローナル抗体、およびＰＥで標識した抗ＣＤ_３４（ＨＰＣＡ−２）モノ
クローナル抗体またはＰＥで標識した対照のマウスＩｇとともに、氷上でインキ
ュベートした。インキュベートした後、赤色細胞を溶解溶液で溶解し、残った細
胞を洗浄し、次いでフローサイトメーターで分析した。

【０１５４】 フローサイトメトリー：ＦＡＣＳtar^plusフローサイトメーター（Becton-Dick
inson, Immunofluorometry systems, 米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー
）を使用して、細胞を分析して選別した。シース液として食塩水を使用し、細胞
を、１０００細胞／秒の速度で、７０ｍｍのノズルを通じて通過させた。４８８
ｎｍのアルゴンレーザビーム（２５０ｍＷ）を、励起のための光源として使用し
た。グリーン（ＦＩＴＣ由来）蛍光を５３０±３０ｎｍの帯域フィルターを使っ
て測定し、レッド（ＰＥ由来）蛍光を５７５±２６ｎｍの帯域フィルターを使用
して測定した。ＰＭＴは適当な電圧に設定した。蛍光を測定するのに対する増幅
を利用し、前方光散乱を測定するのに線形増幅を利用した。少なくとも１０^４の
細胞を分析した。

【０１５５】 実 験 結 果 造血前駆細胞の増殖を刺激し分化を阻害する培養条件を開発しようとして、Ｃ
Ｄ_３４ ^＋細胞を下記の補助剤とともに培養した。

【０１５６】 遷移金属キレート化剤、例えばテトラエチルペンタミン（ＴＥＰＡ）、キャプ
トプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥＮ）などのキレート化剤、または遷移
金属の代謝を阻害する亜鉛などのイオン。 初期に作用するサイトカイン：幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド（Ｆ
Ｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および
インターロイキン−３（ＩＬ−３）。 後期作用性サイトカイン：顆粒コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒／マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ
）。

【０１５７】 ＣＤ_３４ ^＋の短期間培養物の増殖とクローン性に対するＴＥＰＡの作用：ＣＤ _３４ ^＋ 細胞にＴＥＰＡを加え、低投与量の初期作用性サイトカインとともに培養
した結果、全細胞数およびＣＤ_３４ ^＋細胞の数（蛍光で標識した特定の抗体を利
用するサイトメトリーで測定、図２）ならびに細胞のクローン性（半固形培地内
で培養物の一部分を平板培養し、２週間後に発生するコロニーを採点して測定、
図１）が、サイトカインだけを補充した培養物と比べて有意に増大した。ＴＥＰ
Ａの存在下で半固形培地に発生したコロニーは、骨髄、赤血球および混合表現型
のコロニーであった。

【０１５８】 高投与量の初期サイトカイン類を補充したか（表１）または初期作用性と後期
作用性のサイトカインを組み合わせて補充した（図３）培養物におけるＴＥＰＡ
の作用をさらに評価した。これらの試験結果は、ＴＥＰＡが、これらの培養物中
のＣＤ_３４ ^＋細胞のクローン性と比率を有意に増大することを示した。全細胞に
ついては、初期サイトカインを補充した培養物ではＴＥＰＡによって増大したが
（表１、図２）、初期サイトカインと後期サイトカインの両者を補充した培養物
ではＴＥＰＡは限界的な（marginal）阻害を起こした（図３）。

【０１５９】 ＦＬ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ−５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６−５０ｎｇ／ｍｌ
の存在下、ＩＬ−３−２０ｎｇ／ｍｌありもしくはなしでかつＴＥＰＡ−１０μ
Ｍありもしくはなしで液体培養にて、臍帯血由来のＣＤ_３４細胞を平板培養した
。７日目に、ＣＤ_３４細胞の比率と全細胞数を測定した。イニシエーティング細
胞が１×１０^３の部分を、半固形培地でクローン化することによって、コロニー
形成細胞（ＣＦＵ）についてゼロ日目と７日目に検定した。ＣＦＵの拡張は、７
日目に存在するＣＦＵ／ゼロ日に存在するＣＦＵの比率を示す。

【０１６０】

【表１】

【０１６１】 ＣＤ_３４ ^＋の長期間培養物の増殖とクローン性に対するＴＥＰＡの作用：１週
間毎にデミ−デポピュレーション（demi-depopulation）（培養容積の１／２を
取り出して新しい培地とサイトカインで置換）を行うことによって、長期間培養
物を３−５週間維持した。ＴＥＰＡを添加した結果、初期サイトカイン（図４）
または初期サイトカインと後期サイトカインの両者（図３）を補充した長期間培
養物のクローン性がサイトカインだけを補充した培養物に比べて高くなった。

【０１６２】 培養を３週間行った後、サイトカインだけを補充した培養物はクローン性が急
激に低下したが、サイトカインを組み合わせてＴＥＰＡで処理した培養物は高い
クローン性を維持した。なおそのクローン性は短期間培養物よりはるかに高かっ
た。

【０１６３】 造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの作用：造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの
作用をいくつかのモデルで試験した。

【０１６４】 マウスの赤白血病細胞（ＭＥＬ）：ＭＥＬ細胞は赤芽球様細胞である。いくつ
もの化学薬剤（分化誘発剤）で処理されると、ＭＥＬ細胞は赤血球分化を起こし
て、ヘモグロビンが蓄積される。ＭＥＬ細胞を、分化誘発剤のヘキサメチレンビ
スアセトアミド（ＨＭＢＡ）およびキレート化剤のＴＥＰＡもしくはキャプトプ
リルの存在下で培養した。培養３日目に、細胞の全数とヘモグロビン含有細胞の
比率を測定した（表２）。試験結果は、ＴＥＰＡとキャプトプリルの両者が、Ｈ
ＭＢＡで誘発されるＭＥＬ細胞の分化を阻害することを示した。

【０１６５】 ヒト赤血球細胞の培養物：参照文献２３−２６に特に記載されているような２
相液体培養法に従って、正常なヒトの赤血球細胞を増殖させた。第一相において
、末梢血液単核細胞を、初期成長因子の存在下、５−７日間インキュベートした
。第二相においては、これらの因子を、赤血球特異的増殖／分化因子であるエリ
スロポエチンで置換した。

【０１６６】 これらの培養物は、第二相の開始（initiation）時にＴＥＰＡを補充した。全
細胞数およびヘモグロビン含有細胞の比率を１４日後に測定した。試験結果（図
５）は、ＴＥＰＡの存在下では、ヘモグロビン含有細胞が急激に減少し、一方、
細胞の全数はごくわずかしか減少しなかったことを示した。

【０１６７】 これらの試験結果は、ＴＥＰＡが赤血球分化を阻害するが、前駆細胞の増殖性
能に有意に影響しないことを示唆している。

【０１６８】

【表２】

【０１６９】 マウスの赤赤血球病細胞（ＭＥＬ）を、分化誘発剤のヘキサメチレンビスアセ
トアミド（ＨＭＢＡ、４ｍＭ）を補充しかつ異なる濃度のＴＥＰＡまたはキャプ
トプリルありもしくはなしの液体培地で培養した。３日目に、全細胞数とヘモグ
ロビン含有（ベンジジン陽性）細胞を測定した。

【０１７０】 ＣＤ_３４ ^＋で開始された培養物：ＣＤ_３４ ^＋細胞で開始された長期間液体培養
物を、サイトカインの異なるカクテルで維持した。これら培養物の１／２に、Ｔ
ＥＰＡを連続的に補充した。細胞の分化の状態を試験するため、サイトスピンプ
リパレーション（cytospin preparation）を、May-Grunwald Giemsaで染色した
（図６ａ−ｄ）。試験結果は、ＴＥＰＡなしで４−５週間維持された培養物は、
完全に分化した細胞だけを含有し、一方、ＴＥＰＡありの培養物は、完全に分化
した細胞に加えて、１０％−４０％の未分化の芽球様細胞のサブセットを含有し
ていることを示した。

【０１７１】 これらの試験結果は、ＴＥＰＡが、ＣＤ_３４ ^＋細胞の分化の遅延を誘発して、
長期間の半ビボ培養物中の初期前駆細胞の増殖と蓄積が延長されることを示唆し
ている。

【０１７２】 ＴＥＰＡの活性の機構：ＴＥＰＡが、銅などの遷移金属を減少させることによ
って、ＣＤ_３４ ^＋細胞に影響を与えるかどうかを確認するため、２種の方法を行
った。

【０１７３】 第一の方法で、異なる遷移金属キレート化剤：テトラ−エチルペンタミン（Ｔ
ＥＰＡ）、キャプトプリル（ＣＡＰ）またはペニシラミン（ＰＥＮ）の作用を評
価した。その試験結果は、これらの化合物がすべて、ＣＤ_３４ ^＋細胞に対して、
ＴＥＰＡと同じ作用を共有していることを示した（図７）。

【０１７４】 第二の方法は、ＴＥＰＡで処理した培養物に銅を補充する方法である。その試
験結果は、ＴＥＰＡの活性が銅によって逆転し（図８）、一方、他のイオンの例
えば鉄やセレンなどを補充した場合、少なくとも、本願で採用される短期間〜中
間の期間の培養では逆転しないことを示した（図９）。

【０１７５】 亜鉛は、遷移金属の代謝、例えば銅の代謝を阻害することが知られているが、
それ自体で、培養物のクローン性を拡大する。この作用は、亜鉛とＴＥＰＡの両
者の存在下で非常に強力であった（図１０）。

【０１７６】 上記の諸実施例において、ＣＤ_３４細胞の培養物に、例えば、初期採用性サイ
トカインとポリアミン薬剤であるテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を補充
することによって、支質の支持なしで長期間培養物（ＬＴＣ）を維持できること
が示されている。これらの培養物において以下の三つの現象すなわち（ｉ）細胞
の連続増殖；（ii）クローン形成性細胞（clonogenic cell）（ＣＦＵｃ）の拡
張；および(iii)細胞の未分化状態での維持が明らかであった。

【０１７７】 対照的に、ＴＥＰＡで処理されていない対照培養物は、増殖を停止してＣＦＵ
ｃを生成し、次いでそれらの細胞は、著しく早く分化した。

【０１７８】 したがって、ＴＥＰＡおよび他の遷移金属キレート化剤は、遷移金属、特に銅
をキレート化させて細胞の分化を阻害／遅延することによって長期培養物を維持
する。

【０１７９】 以下の実施例は、上記結果をさらに立証して、長期培養物に対する最適培養条
件を教示し、造血細胞の分化に影響する追加のキレート化剤を教示しそしてＴＥ
ＰＡなどのキレート化剤の標的細胞に対する活性の機構の解明に役立つ。

【０１８０】 ヒトの新生児臍帯血由来のＣＤ_３４ ^＋細胞を、免疫磁気法で精製し、次いでサ
イトカインを補充しかつ遷移金属キレート化剤ありまたはなしの液体培地内で培
養した。１週間毎に、培養物は、培養内容物（上澄み液と細胞）の１／２を取り
出して、それを、新鮮な培地、サイトカインおよびキレート化剤で置換すること
によってデミ−デポピュレート（demi-depopulate）した。指定の週毎に、培養
物の細胞内容物を、全細胞（手動顕微鏡／血球計数法による）、ＣＤ_３４ ^＋細胞
（免疫フローサイトメトリーによる）およびクローン形成性細胞（細胞を、サイ
トカインを補充した半固形培地内でクローン化することによる）について定量し
た。これらの培養物は１×１０^４の細胞でイニシエートした。その細胞の５０−
８０％はＣＤ_３４ ^＋であり、２５−５０％はＣＦＵｃであった。その試験結果を
図１１−２４に示したが、１×１０^４のイニシエーティング細胞当たりで計算し
た（それら数値は希釈係数を掛け算されている）。

【０１８１】 図１１は、長期間のＣＤ_３４培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す。初期作用
性サイトカインを補充した液体培地内（支質細胞を欠いている）で、ＣＤ_３４細
胞で開始された培養物は、ＴＥＰＡによって、長期間（＞６週間）維持できた。
このような培養物内で、サイトカインと組み合わせたＴＥＰＡは、クローン形成
性細胞（ＣＦＵｃ）の維持と拡張を支持した。なおその培養物は２．５×１０^３ のＣＦＵｃでスタートした。６週間後に、培養を終結したところ、ＴＥＰＡで処
理した培養物は３００×１０^３のＣＦＵｃを含有していた（すなわち、１２０倍
の拡張）が対照の培養物はＣＦＵｃを全く含有していなかった。

【０１８２】 図１２−１４は、異なる組み合わせの初期サイトカインの存在下での細胞の増
殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃの頻度（frequency）に対するＴＥＰＡの作用を示
す。初期作用性サイトカイン類ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ、ＩＬ−６とＴＥＰＡと
の組み合わせが、クローン形成性能（clonogenic potential）を有する細胞の維
持と長期間拡張のための最適の組み合わせであることが見出された。

【０１８３】 図１５は、対照のＣＤ_３４培養物およびＴＥＰＡを補充したＣＤ_３４培養物の
ＣＦＵｃ頻度に対するＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示す。細胞の分化を刺
激する後期作用性サイトカインのＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦを培養物に補充する
と、クローン形成性細胞が迅速に失われた。この分化刺激作用はＴＥＰＡによっ
て遮断される。

【０１８４】 図１６−１７は、長期間の細胞増殖（図１６）およびＣＦＵｃの産生（図１７
）に対する、培地＋ＴＥＰＡの部分的変更または完全変更の作用を示す。得られ
た試験結果は、最大の拡張を維持するためには、ＴＥＰＡを、少なくとも１週間
毎に、完全に取り替えなければならないことを示している。

【０１８５】 図１９は、ＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示す。ＣＤ_{３ ４} 細胞をＴＥＰＡに初期に暴露することが、ＣＦＵｃの長期間の維持と拡張を行
うのに決定的であったことは明らかであり、ＴＥＰＡが前駆細胞の分化に対し、
分化の各種の段階で影響することを示唆している。

【０１８６】 図２０は、単一のサイトカインとの短期間のプレインキュベーションの、長期
のＣＦＵｃ産生に対する作用を示す。試験結果は、ＴＥＰＡで処理された培養物
は、サイトカイン類の全種類ではなくて単一のサイトカインを最初の２４時間に
補充した場合、ＬＴＣ−ＣＦＣがより多く保存されることを示しているが、この
ことは、前者の条件下で細胞が一層効率的に遮断されることを示唆している。

【０１８７】 図２１ａ−ｂは、ポリアミンキレート化剤のＣＤ_３４細胞培養物に対する作用
を示す。ポリアミンキレート化剤は、長期培養中、細胞の増殖を維持しかつＣＦ
Ｕｃを拡張した。試験されたこれら化合物の中で、長い連鎖のポリアミンである
ＴＥＰＡとＰＥＨＡが、短い連鎖のポリアミン類より有効であることが見出され
た。

【０１８８】 図２２ａ−ｂは、ＣＤ_３４細胞培養物に対する、遷移金属キレート化剤の作用
を示す。ペニシラミン（ＰＥＮ）とキャプトプリル（ＣＡＰ）は、公知の遷移金
属キレート化剤であるが、長期の培養中、クローン形成性細胞の細胞増殖と拡張
を維持した。

【０１８９】 図２３ａ−ｂは、ＣＤ_３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示す。亜鉛は、遷
移金属、特に銅の代謝を阻害することが知られており、その作用は、長期間の培
養物中でのキレート化剤の作用に似ているが、前記キレート化剤類自体より作用
の程度は小さい。

【０１９０】 したがって、造血前駆細胞の半ビボの拡張は、これら細胞の非分裂の分化細胞
（non-dividing differentiated cell）への進行によって制限される。この分化
プロセスは、該前駆細胞を支質細胞層上で培養することによって、遅延させるこ
とができる。その支質は細胞の連続増殖とＣＦＵｃの長期間の生成を支持するの
で、その支質が、該前駆細胞に対して抗分化作用を加えると考えられる。

【０１９１】 本発明の他の実施態様によって、幹細胞類、例えば限定されないが、臍帯血由
来の幹細胞、末梢血液由来の幹細胞および骨髄由来の幹細胞を保存する方法が提
供される。この方法は、遷移金属キレート化剤例えばＴＥＰＡの存在下、幹細胞
を収集し、単離しおよび／または貯蔵して処理することによって実施される。

【０１９２】 臍帯血由来の細胞は、１０μＭＴＥＰＡの存在下またはなしで収集し次いで４
℃で２４時間貯蔵した（分離せずに）。次にＣＤ_３４ ^＋細胞を、１０μＭのＴＥ
ＰＡ−ＰＢＳ緩衝液またはＴＥＰＡなしのＰＢＳ緩衝液それぞれを使って分離し
た。次にその細胞を、１０μＭＴＥＰＡの存在下、長期間培養で増殖させた。

【０１９３】 試験結果は、ＴＥＰＡの存在下で処理した細胞で開始された培養物は８週間、
拡張したが、ＴＥＰＡなしで貯蔵された細胞で開始された培養物は、わずか５週
間で拡張が停止した。

【０１９４】 細胞の収集と、冷凍もしくは移植との間に少なくとも数時間かかることはよく
知られている。

【０１９５】 これらの試験結果は、遷移金属キレート化剤、例えばＴＥＰＡを、収集バッグ
および分離緩衝液と洗浄緩衝液に加えると、幹細胞の収量が増大しかつ長期間増
殖するそれら幹細胞の性能が改善されるので、“新鮮”な、冷凍保存されたかま
たは半ビボで拡張された造血細胞を移植した後の短時間での生着と長時間のリポ
ピュレーション（repopulation）が容易になる。

【０１９６】 したがって、分化を阻害する遷移金属キレート化剤を有効量または有効濃度で
補充した、幹細胞の収集バッグ分離緩衝液および洗浄緩衝液が、本発明によって
さらに提供される。

【０１９７】 上述の実施例において特異的に説明されている通り、支質なしの培養物内に、
細胞の連続増殖と、ＣＦＵｃの長期間の生成を維持する新規な系が開発されてい
る（図１１）。その系は、初期作用性サイトカイン類、例えば幹細胞因子（ＳＣ
Ｆ）、ＦＬＴ３、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰ
Ｏ）（但しインターロイキン−３ありまたはなしの場合あり）および遷移金属キ
レート化剤の使用を組み合わせている（図１２−１４）。上記初期サイトカイン
類は、該前駆細胞の生存と増殖を支持し、Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦなどの後期
作用性サイトカインに比べて分化に対する刺激が低い（図１５）。これらのキレ
ート化剤は、遷移金属の特に銅をキレート化することによって、分化を阻害する
。１週間毎の完全な培地変更は、部分変更に比べて、ＬＴＣ−ＣＦＣの維持を改
善した。これは、ＴＥＰＡ−遷移金属の錯体、例えばＴＥＰＡ−銅の錯体が安定
でないことを示唆している（図１６−１７）。

【０１９８】 いくつもの証拠が、ＴＥＰＡは初期前駆細胞の分化を阻害することを示唆して
いる（図１８）。例えば、ＴＥＰＡの添加が培養の６日目まで遅れたとき、その
作用は、１日目からＴＥＰＡを補充されている培養物と比べて低下した（図１９
）。

【０１９９】 ＴＥＰＡを１日目に添加すると、最適の結果が得られたが、２日目にサイトカ
イン類の全補充物を添加することが有利であった。したがって、１日目に１種類
のサイトカイン例えばＦＬＴ３だけ補充され続いて残りのサイトカイン類（ＳＣ
Ｆ、ＴＰＯおよびＩＬ−３）を添加した、ＴＥＰＡ処理培養物は、すべてのサイ
トカイン類を１日目に添加された培養物より長期間維持された（図２０）。我々
は、細胞の分化が、前記サイトカイン類によって駆動されかつ銅などの遷移金属
類に依存しているので、分化を阻害するには、サイトカイン類の全補充物に暴露
される前に、前記遷移金属を消耗させる必要があるという仮説を立てている。単
一のサイトカインは迅速な活性化（増殖と分化）を支持しないが、細胞の生育能
を維持するので、静止性の未分化ＣＤ_３４が活性化する前に、その中の遷移金属
を、ＴＥＰＡが効率的にキレート化することができる。

【０２００】 選別することによって、各種のキレート化剤が、細胞の連続増殖およびＣＦＵ
ｃの長期間にわたる生成を支持し、そして細胞の分化を遅らせることが見出され
た。これらの化合物としては、ポリアミン類、例えば限定されないがＴＥＰＡ、
ＥＤＡ、ＰＥＨＡおよびＴＥＴＡ（図２１ａ−ｂ）、またはキレート化剤類、例
えば限定されないがペニシラミン（ＰＥＮ）およびキャプトプリル（ＣＡＰ）（
図２２ａ−ｂ）がある。遷移金属（特に銅）の代謝を阻害する亜鉛も、ＬＴＣ−
ＣＦＣを支持した（図２３ａ−ｂ） 実 施 例 ２ ＣＤ_３４細胞培養物の増殖とクロナビリティー（clonability） に対する銅キレート化性ペプチドの作用 実 験 方 法 ＣＤ_３４細胞の選択：全血ユニット由来の末梢血液“バフィーコート”細胞、
白血球採取法によって得た末梢血細胞、または血液細胞を、Ficoll Hypaque（密
度：１．０７７ｇ／ｍｌ）上に層状に重ね合わせ、次に室温にて、１０００ｘｇ
で２０分間、遠心分離した。単核細胞の間期層を集め、１％のウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を含有し、Ｃａ／Ｍｇを含有しないリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄
した。その細胞を、マウスのモノクローナル抗ＣＤ_３４抗体（０．５μｇ／１０ ^６ モノクローナル細胞）とともに４℃で３０分間インキュベートし、次にｍｉｎ
ｉＭＡＣＡ装置（Miltenyi-Biotec, Bergisch, Gladbach, ドイツ）を使用し、
メーカーのプロトコルにしたがって分離した。 培養方法：前駆細胞を拡張するため、ＣＤ_３４ ^＋豊富化画分を１×１０^４細胞
１ｍｌにて、１０％の予め選択されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するα最少
必須培地に接種した（両方ともにＧＩＢＣＯ、米国ニューヨーク州、グランドア
イランド所在から入手）。この培地に、成長因子と銅キレート化剤の混合物を補
充した。その培養物を、エキストラ湿度の空気中５％ＣＯ_２の大気中３７℃でイ
ンキュベートした。培地の１／２を、一週間毎に、すべての補充物質を含有する
新鮮な培地で取り替えた。 培養された細胞のクローン化性を、半固体培地内で検定した。これらの細胞を
洗浄し、次に、３０％ＦＣＳを補充しさらに組換え成長因子〔幹細胞因子（ＳＣ
Ｆ），Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）〕を補充し
たα培地を含有するメチルセルロースの３５ｍｍディッシュに接種した。２週間
インキュベートした後、培養物を倒立顕微鏡を用いて記録した。コロニーを、そ
の細胞組成にしたがって、芽球コロニー、混合コロニー、赤芽球コロニー、骨髄
コロニー、および巨核球コロニーに分類した。 形態学的評価：得られた培養集団を特徴づけるため、細胞の一部を、スライド
ガラス上に堆積させて（細胞遠心分離機、Shandon, Runcorn, 英国）、固定し次
いでMay-Grunwald Giemsaで染色した。 ＣＤ_３４抗原の免疫蛍光染色：細胞を、氷上にて、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ _４５ モノクローナル抗体と、ワイコエリトリン（ＰＥ）で標識した抗ＣＤ_３４（
ＨＰＣＡ−２）モノクローナル抗体またはＰＥで標識した対照のマウス免疫グロ
ブリン（Ｉｇ）とともにインキュベートした。インキュベートした後、細胞を洗
浄し次にフローサイトメトリーで分析した。 フローサイトメトリー：細胞を、ＦＡＣＳｔａｒ^ｐｌｕｓフローサイトメータ
ー（Becton-Dickinson, Immunofluorometry systems, 米国カリフォルニア州マ
ウンテン・ビュー）を用いて分析した。細胞を、食塩水を使用して、シース液（
Sheath fluid）として、７０μｍノズルを、１０００細胞／秒の速度で通過させ
た。４８８ｎｍのアルゴンレーザビーム（２５０ｍＷ）を励起光源として使用し
た。グリーン（ＦＩＴＣ由来の）蛍光を、５３０±３０ｎｍ帯域フィルターを使
って測定し、そして、レッド（ＰＥ由来の）蛍光を５７５±２６ｎｍ帯域フィル
ターを使って測定した。ＰＭＴは適当な電圧で設定した。蛍光の測定には対数増
幅を利用し、前方光散乱に対しては線形増幅を利用した。少なくとも１０^４個の
細胞を分析した。 実 験 結 果 ＣＤ_３４細胞培養物の増殖とクロナビリティに対する銅キレート化性ペプチド の作用 ：ＳＣＦ，ＦＬＴ３およびＩＬ−６（各々５０ｎｇ／ｍｌ）ならびに銅結
合性ペプチドのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（ＧＧＨ）もしくはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｙｓ（ＧＨＬ）（各々１０μＭ）または遅延作用性サイトカインのＧ−ＣＳＦと
ＧＭ−ＣＳＦ（各々１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、液体培地で、精製細胞を平板培
養することによって、１０^４個の臍帯血由来ＣＤ_３４ ^＋細胞を用いて培養を開始
した。一週間毎に、培養物をデミ−デポピュレートし、新鮮培地、サイトカイン
類およびペプチド類を補充した。７週間後に、細胞を計数し、ＣＦＵｃについて
検定した。 図２５ａ−ｂに示すように、試験結果は、ＧＧＨとＧＨＬがそれぞれ、細胞数
を、１０％と２５％減少させ、そしてＧ−ＣＳＦ＋ＧＭ−ＣＳＦが２０％減少さ
せることを示した。培養物のクローン原生（clonogenic potential）に対する作
用は非常に著しく、ＧＧＨとＧＨＬによってそれぞれ８０％と７８％低下し、そ
してＧ−ＣＳＦ＋ＧＭ−ＣＳＦによって８９％低下した。 実 施 例 ３ 細胞の分化に対して特異的遷移金属キレート化剤の 作用を確認する遷移金属キレート化剤検定法 実 験 方 法 分化の阻害：ＭＥＬ（マウス赤白血病細胞系）、８×１０^３細胞／ｍｌを、下
記表３に示す濃度の各種キレート化剤とともに、２４ｈｒインキュベートした。
次いで培養物に、分化誘発剤のヘキサメチレンビスアセトアミド（２ｍＭ）を補
充した。分化した細胞（ベンジジン陽性）の細胞数と百分率を、分化誘発剤を添
加してから７２ｈｒ後に測定した。 同様に、ＨＬ−６０（ヒト骨髄性白血病細胞系）、１×１０^５細胞／ｍｌを、
下記表３に示す濃度の各種キレート化剤とともに、２４ｈｒインキュベートした
。次いで培養物に、分化誘発剤のビタミンＤまたはレチノイン酸（両者ともに１
×１０^−７Ｍ）を補充した。分化した細胞（食菌細胞）の細胞数と百分率を測定
した。 分化の誘発：ＨＬ−６０、１×１０^５細胞／ｍｌを各種キレート化剤とともに
インキュベートした。分化した細胞（食菌細胞）の細胞数と百分率を測定した。 銅の測定：１０００ｘｇで５分間遠心分離することによって細胞を収穫した。
得られた細胞ペレットを、ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋とＭｇ^＋＋を含有していない）中に
再懸濁させ次いで１０００ｘｇで遠心分離することによって、３回洗浄した。２
×１０^６個の細胞を含有する前記洗浄物の一部を、金属が入っていないエッペン
ドルフ試験管に移し、１０００ｘｇで遠心分離して細胞を回収した。得られた細
胞ペレットを、０．０３Ｍの超純度硝酸中に再懸濁させて１×１０^７細胞／ｍｌ
の濃度にした。その細胞を高剪断力ミキサ（polytron, Kinematica, スイス）で
１分間均質化して、細胞を破壊し細胞が含有している銅を放出させた。細胞の試
料を渦巻撹拌してからバイアルオートサンプラーに移し、Perkin Elmerの黒鉛原
子吸光分光光度計によって、３２４．７ｎｍの波長で２回ずつ分析した。これら
の試料は、０．０３Ｍの超純度硝酸で希釈した市販の原溶液から調製した銅標準
溶液と比較して分析した。 実 験 結 果 下記表３に、ＨＬ−６０細胞についての試験結果を要約した。ＭＥＬ細胞の分
化の阻害は類似の結果を示した。図２６はこれら実験に使用した各種キレート化
剤の化学構造式を示す。

【表３】 ＮＤ−測定せず；ｐｐｂ−パートパービリオン 上記表３から明らかなように、細胞の銅含有量を調整するキレート化剤の性能
とキレート化剤の生物学的活性の間に良好な相関関係が見られた。細胞の銅含有
量を減少させるキレート化剤は強力な分化阻害剤である。一方、細胞の銅含有量
を増やすキレート化剤は強力な分化誘発剤である。実際に、分化阻害性キレート
化剤、例えばＴＥＰＡ、ＰＥＨＡなどは、ＣＤ_３４ ^＋細胞に対するそれらの活性
を試験すると、分化を阻害することが見出された。分化誘発性活性を有するキレ
ート化剤、例えば、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカンおよび銅結
合性ペプチドのＧＧＨとＨＨＫは、分化を刺激することが見出された。したがっ
て、キレート化剤が細胞の銅含有量を調整する（増やすかまたは減らす）性能を
審査する方法は、造血幹（ＣＤ_３４ ^＋）細胞などの各種の細胞型に対するキレー
ト化剤の作用に関する予報検定法になる。 実 施 例 ４ 非造血細胞に対する銅キレート化剤による分化の調整 前記発明の背景のセクションで述べたように、そして科学文献から知られてい
るように、銅が生体内で枯渇すると、造血細胞以外の、を含む複数の細胞系譜に
作用する。したがって、遷移金属キレート化剤の分化に対する作用は、造血細胞
系譜の細胞に限定されず、むしろこの作用は、すべての真核細胞が共有している
基本的な現象であると予想された。 胎芽幹細胞（embryonal stem cell）：胎芽幹細胞は、培地に白血病阻害因子
（ＬＩＦ）を補充すると、培養中、分化しないままで維持することができる。Ｔ
ＥＰＡをＬＩＦの代わりに用いて、細胞の未分化表現型を維持できることが見出
された。 したがって、胎芽幹細胞を、（６６）に記載されているのとほとんど同様にし
て、ＬＩＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＥＰＡ（１０〜２０μＭ）の存
在下、３〜４日間培養して、その分化を、未処理の対照細胞と比較した。

【表４】 表４に示した試験結果は、ＴＥＰＡが、他の細胞型に対して発揮するのと類似
の作用を、胎芽幹細胞に発揮することを明確に示している。 肝細胞：麻酔をかけたＢＡＬＢ／ｃマウスを、滅菌用具を使って解剖して、肝
臓を取り出し、Ｆ１２培養培地（Biological Industries, Kibbutz Bet Ha'Emek
, イスラエル）中に浸漬した。その肝臓を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
しシーザー（seizure）で細切して細片にした。３％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄
した後、前記肝臓組織片を、０．０５％コラゲナーゼとともに、５％ＣＯ_２の大
気の雰囲気下、３７℃で連続して振盪しながら、３０分間インキュベートした。
その消化された肝臓組織片を、次に微細メッシスのストレーナーに押しつけてつ
ぶした。３％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、その肝臓細胞を、１５ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液、０．１グルコース、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、０．５μｇ／
ｍｌインスリン、７．５ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾンで強化し、かつ１５μｇ／
ｍｌのＴＥＰＡありまたはなしのＦ１２培地に接種し、５％ＣＯ_２大気雰囲気下
、３７℃でインキュベートした。一夜インキュベートした後、培地を取り出し、
細胞に、１５μｇ／ｍｌのＴＥＰＡありまたはなしで、先に述べたように強化し
た新鮮なＦ１２培地を補充した。肝細胞を、３５ｍｍディッシュ内で、１５μｇ
／ｍｌ ＴＥＰＡありまたはなしの強化Ｆ１２培地とともに、数週間、３７℃に
て、５％ＣＯ_２大気雰囲気下でインキュベートした。細胞の培地は、１週間毎に
、新鮮な培地と取り替えた。ＴＥＰＡとともに５週間半ビボで拡張させた肝細胞
培養物は多くの分裂細胞と未分化細胞（図２７ａ−ｄ）を含有していたが、ＴＥ
ＰＡで処理しなかった培養物は、分化した細胞のみをごく少量含有していた（図
２７ｅ−ｆ）。 植物細胞：植物細胞の細胞内銅含有量に対するＴＥＰＡの作用を以下のように
して確認した。ボストンタマシダのカルス組織培養物を、商業的植物組織培養物
生産機関（Biological Industries, Kibbutz Bet Ha'Emek, イスラエル）から入
手し、培地中の異なる濃度のＴＥＰＡとともに２日間、室温でインキュベートし
た。ＰＢＳで３回洗浄した後、組織を、０．０３Ｍ超純度硝酸中に懸濁させ、次
に高剪断力ミキサ（polytron, Kinematica, スイス）で３分間均質化して、細胞
を破壊し細胞内の銅を放出させた。細胞の試料は、渦巻撹拌を行った後、バイア
ルオートサンプラーに移し、次に、Perkin Elmer黒鉛炉原子吸光分光光度計によ
って、３２４．７ｎｍの波長にて、２回ずつ分析した。これらの試料は、０．０
３Ｍ超純度硝酸で希釈した市販原液で調製した銅標準溶液と比較して分析した。 下記の表５に、植物細胞の細胞内銅濃度に対する、増殖培地中の各種ＴＥＰＡ
濃度の作用を要約して示す。

【表５】 植物細胞をＴＥＰＡとともにインキュベートすると、植物細胞内の細胞内銅含
有量が減少することは上記表から明らかである。 実 施 例 ５ 半ビボで培養した細胞の生体内での性能の評価 ＳＣＩＤマウスに対する、半ビボで拡張されたヒト造血細胞の移植：（５６）
に記載されているのとほとんど同様にして、臍帯血精製ＣＤ_３４ ^＋細胞の、新鮮
なものまたは２週間もしくは４週間半ビボ培養したもの（ＴＥＰＡプラスまたは
マイナス）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。４週間後、そのマウスを殺
し、その大腿骨と脛骨を切除し、次いで２５ゲージの針をとりつけた注射器で、
骨髄をフラッシュ（flush）した。単細胞懸濁液を調製し、その細胞を洗浄し次
に、その一部をトリパンブルーを用いて計数した。 ヒト起源の移植された細胞を定量するため、細胞を、ＦＩＴＣ接合抗ＣＤ_４５ 抗体、およびＰＥ接合抗ＣＤ_３４抗体、ＰＥ接合抗ＣＤ_１９抗体もしくはＰＥ接
合ＣＤ_３３抗体で染色した。抗ＣＤ_４５抗体は、ヒトを認識するがマウスを認識
しないので、細胞がヒト起源であることを示す。 移植された細胞の増殖性能と分化性能は、（５６）に記載されているのとほと
んど同じの、ヒト由来のコロニーを特異的に増殖させる条件下で、骨髄細胞を、
半固体培地でクローン化することによって検定した。 試験結果（表６）は、拡張された細胞の移植性能が新鮮細胞より高いことを示
しており、３〜６％ＣＤ_４５ ^＋に比較して２０〜６０％ＣＤ_４５ ^＋である。ＴＥ
ＰＡの存在下、半ビボで拡張させた６個の臍帯血試料がすべて、動物に移植する
のに成功したが、一方、ＴＥＰＡなしで拡張された試料は、６個のうち２個しか
移植されなかった。

【表６】 一頭のマウス当たり移植された細胞の数：新鮮なＣＢ＝１×１０^５の精製ＣＤ _３４ ^＋ 細胞；半ビボで拡張された細胞＝１×１０^５（ＣＢ１−４，６）または０
．５×１０^５（ＣＢ５）を培養したＣＢ ＣＤ_３４ ^＋細胞の生成物。^＊２×１０ ^５ ＳＣＩＤＢＭ細胞当たりコロニー（赤血球および骨髄のコロニー）の数。ヒト
新生児臍帯血。^＋２〜３頭のマウスの平均値。 致死的に放射線を照射されたマウスの造血再構成−新鮮細胞対半ビボ拡張細胞 ：３ヶ月齢の雌のＢａｌｂ／ｃＸＣ５７Ｂ１／６Ｆ１マウスに致死的に放射線を
照射し（１０００ラド）、１日後、１×１０^５の新鮮骨髄細胞、または１×１０ ^５ の骨髄細胞をＴＥＰＡありまたはなしで３〜５週間、半ビボで拡張させて得た
生成物（詳細は表７に示す）を移植した。末梢血のＷＢＣ計数を、一週間毎に実
施した。 試験結果は、ＷＢＣの回復が、ＴＥＰＡの存在下、半ビボで拡張させた骨髄細
胞を移植されたマウスの方が、新鮮細胞またはＴＥＰＡなしで拡張された細胞を
移植されたマウスと比べて、速いことを示した。

【表７】 一頭のマウス当たり移植された細胞の数： 新鮮ＢＭ＝１×１０^５細胞。半ビボで拡張された細胞＝１×１０^５を培養したＢ
Ｍ細胞の生成物。移植されなかった放射線照射マウスの生存数は３実験すべてに
ついて０／５であった。

【０２０１】 本発明を、その特定の実施態様とともに説明してきたが、多くの別法、変型お
よび変化は当業技術者には分かることは明白である。したがって、本発明は、特
許請求の範囲の精神と広い範囲内にあるすべてのかような別法、変型および変化
を含むものである。

【０２０２】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＣＤ_３４細胞のクローンを形成する性能に対するＴＥＰＡの短期間の作用を示
す棒グラフである。

【図２】 全細胞およびＣＤ_３４細胞に対する、ＴＥＰＡの短期間の作用を示す棒グラフ
である。

【図３】 ＣＤ_３４細胞の細胞数およびクローン形成性能に対するＴＥＰＡの長期間の作
用を示す棒グラフである。

【図４】 初期サイトカイン類とともに培養されたＣＤ_３４細胞に対するＴＥＰＡの長期
間の作用を示す棒グラフである。

【図５】 赤血球前駆細胞の発生に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。

【図６ａ】 細胞の成熟に対するＴＥＰＡなしの作用を示す図である。

【図６ｂ】 細胞の成熟に対するＴＥＰＡありの作用を示す図である。

【図６ｃ】 細胞の成熟に対するＴＥＰＡなしの作用を示す図である。

【図６ｄ】 細胞の成熟に対するＴＥＰＡありの作用を示す図である。

【図７】 ＣＤ_３４細胞で開始される培養物の細胞数とクローン形成性能に対する遷移金
属キレート化剤の作用を示す棒グラフである。

【図８】 ＣＤ_３４細胞のクローン生成性能と全細胞数に対する銅の作用を示す棒グラフ
である。

【図９】 培養されたＣＤ_３４細胞のクローン生成性能に対するイオンの作用を示す棒グ
ラフである。

【図１０】 ＣＤ_３４細胞の増殖性能に対する亜鉛の作用を示す棒グラフである。

【図１１】 図１１ａ−ｃはＣＤ_３４細胞の長期間培養物に対するＴＥＰＡの作用を示す棒
グラフである。

【図１２】 異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下での細胞増殖に対するＴＥＰ
Ａの作用を示す棒グラフである。

【図１３】 異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下でのＣＦＵｃに対するＴＥＰ
Ａの作用を示す棒グラフである。

【図１４】 異なる組み合わせの初期サイトカイン類の存在下でのＣＦＵｃの頻度に対する
ＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。

【図１５】 対照およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ_３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対するＧ−
ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフである。

【図１６】 長期間の細胞増殖に対する培地＋ＴＥＰＡの部分変更と完全変更の作用を示す
グラフである。

【図１７】 長期間のＣＦＵｃの産生に対する培地＋ＴＥＰＡの部分変更と完全変更の作用
を示すグラフである。

【図１８】 ＣＤ_３４細胞の拡張に対するＴＥＰＡの作用を示す棒グラフである。

【図１９】 ＣＦＵｃ頻度に対する、ＴＥＰＡの遅い添加の作用を示すグラフである。

【図２０】 長期間のＣＦＵｃ産生に対する、単一のサイトカインとともに行う短期間のプ
レインキュベーションの作用を示すグラフである。

【図２１】 図２１ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の作用を
示すグラフである。

【図２２】 図２２ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の作用を示
すグラフである。

【図２３】 図２３ａ−ｂはＣＤ_３４細胞培養物に対する亜鉛の作用を示すグラフである。

【図２４】 末梢血液由来のＣＤ_３４細胞培養物に対するＴＥＴＡの作用を示すグラフであ
る。

【図２５】 ＣＤ_３４ ^＋細胞培養物に対する銅キレート化性ペプチドの作用を示す。

【図２６】 本発明の検定法で使用される遷移金属キレート化剤の化学構造式を示す。

【図２７ａ】 ＴＥＰＡありで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【図２７ｂ】 ＴＥＰＡありで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【図２７ｃ】 ＴＥＰＡありで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【図２７ｄ】 ＴＥＰＡありで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【図２７ｅ】 ＴＥＰＡなしで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【図２７ｆ】 ＴＥＰＡなしで、５週間、半ビボ（ex-vivo）で拡張させた肝細胞培養物の写
真を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８７ 45/00 １０１ Ａ６１Ｐ 7/00 48/00 35/02 Ａ６１Ｐ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 35/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ペレド， トニー イスラエル， 90805 メヴァセレット ジオン， カーメル ストリート ８ (72)発明者 フィバック， エイタン イスラエル， 90805 メヴァセレット ジオン， ハクラニム ストリート 11 (72)発明者 トレヴェス， アヴィ イスラエル， 90805 メヴァセレット ジオン， カーメル ストリート 10 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BB20 CA02 CB01 DA51 FA12 FA37 FB03 FB07 4B063 QA05 QQ08 QQ61 QQ79 QQ91 QR77 QS03 QX01 4B065 AA93 BB12 BB19 BB34 CA44 4C084 AA02 AA06 AA13 AA17 AA20 BA15 DA01 DA15 DA18 DA19 MA02 NA05 NA14 ZA51 ZB27 ZC78 4C086 AA01 AA04 BC58 MA05 NA05 NA14 ZA51 ZB27 4C087 AA01 AA03 BB34 BB44 BB59 BB65 CA12 DA05 MA02 NA05 NA14 ZA51 ZB27 ZC78

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞の集団を拡張し、同時に細胞の分化を阻害する方法であ
   って；細胞が増殖し同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を前記
   細胞に与えるステップを含んでなる方法。
2. 【請求項２】 細胞が生体内にあるので、細胞が増殖する前記条件は生体内
   で自然に提供されるが、銅を利用する前記細胞の前記性能を、銅を捕捉する遷移
   金属キレート化剤を投与することによって低下させる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 細胞の、銅を利用する前記性能を、亜鉛を投与することによ
   ってさらに低下させる請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞が生体内にあるので、細胞が増殖する前記条件は生体内
   で自然に提供されるが、銅を利用する前記細胞の前記性能を、亜鉛を投与するこ
   とによって低下させる請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 銅を利用する前記細胞の前記性能を、銅を捕捉する遷移金属
   キレート化剤を投与することによってさらに低下させる請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 銅を利用する前記細胞の前記性能を、銅を捕捉する遷移金属
   キレート化剤によって低下させる請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記遷移金属キレート化剤が、ポリアミンのキレート化剤類
   、すなわち、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミ
   ン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノー
   ルアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレン
   テトラミン−塩酸、テトラエチレンペンタミン−塩酸、ペンタエチレンヘキサミ
   ン−塩酸、テトラエチルペンタミン、キャプトプリル、ペニシラミン、Ｎ，Ｎ′
   −ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，ビス（２
   アミノエチル）１，３プロパンジアミン、１，７−ジオキサ−４，１０−ジアザ
   シクロドデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−
   ジオン、１，４，７−トリアザシクロノナントリ塩酸、１−オキサ−４，７，１
   ０−トリアザシクロドデカン、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカ
   ン、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンからなる群から選択される請
   求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 細胞が半ビボの細胞である請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞が増殖する前記条件を細胞に提供することが、細胞に、
   栄養素およびサイトカイン類を提供することを含む請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記サイトカイン類が初期に作用するサイトカイン類であ
    る請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記初期に作用するサイトカイン類が、幹細胞因子、ＦＬ
    Ｔ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポエチンおよびインターロイキ
    ン−３からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記サイトカイン類が、後期に作用するサイトカイン類で
    ある請求項９に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記後期に作用するサイトカイン類が、顆粒球コロニー刺
    激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチンから
    なる群から選択される請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記細胞が、造血細胞、神経細胞と希突起グリア細胞、皮
    膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、植物細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞
    、軟骨細胞およびストロマ細胞からなる群から選択される請求項８に記載の方法
    。
15. 【請求項１５】 前記細胞が、骨髄、末梢血液および新生児臍帯血からなる
    群から選択される起源由来の細胞である請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記細胞が、造血ＣＤ_３４ ^＋細胞について豊富化されてい
    る請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記細胞が、未分化幹細胞および分化拘束前駆細胞からな
    る群から選択される請求項１に記載の方法。
18. 【請求項１８】 （ａ）移植すべき造血細胞をドナーから得て、 （ｂ）前記細胞が増殖し、同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条
    件を前記細胞に半ビボで与えて、前記細胞の集団を拡張させ、同時に前記細胞の
    分化を阻害し、次いで （ｃ）前記細胞を患者に移植する、 ステップを含んでなる造血細胞の移植方法。
19. 【請求項１９】 前記ドナーと前記患者が単一の個体である請求項１８に記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 前記造血細胞が、末梢血液、骨髄、新生児臍帯血および胚
    性幹細胞からなる群から選択される起源から得られる請求項１８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記造血細胞を得るステップがさらに、前記細胞を幹細胞
    について豊富化させることを含む請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記造血細胞を得るステップがさらに、前記細胞を前駆細
    胞について豊富化させることを含む請求項２０に記載の方法。
23. 【請求項２３】 （ａ）遺伝的に改変される幹細胞を得て、 （ｂ）細胞が増殖し、同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条件を
    前記細胞に半ビボで与えて、前記細胞の集団を拡張させ、同時に前記細胞の分化
    を阻害し、次いで （ｃ）前記細胞を外来遺伝子で遺伝的に改変する、 ステップを含んでなる幹細胞を外来遺伝子で遺伝的に改変する方法。
24. 【請求項２４】 遺伝的改変が、外来遺伝子を含有するベクターによって行
    われる請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 （ａ）造血前駆細胞を患者から得て、 （ｂ）前記細胞が増殖し、同時に銅を利用する前記細胞の性能を低下させる条
    件を前記細胞に半ビボで与えて、前記細胞の集団を拡張させ、同時に前記細胞の
    分化を阻害し、次いで （ｃ）前記細胞を患者に移植する、 ステップを含んでなる養子免疫療法の方法。
26. 【請求項２６】 骨髄幹細胞をドナーの末梢血液中に可動化させて該細胞を
    収穫する方法であって； （ａ）ドナーに、銅を利用する前記細胞の性能を低下させる薬剤を投与して、
    幹細胞の集団を拡張させ、同時に前記幹細胞の分化を阻害し、次いで、 （ｂ）該細胞を白血球分離法で収穫する、 ステップを含んでなる方法。
27. 【請求項２７】 ドナーにサイトカインを投与するステップをさらに含んで
    いる請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記サイトカインが、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、イ
    ンターロイキン−６、トロンボポエチン、インターロイキン−３、顆粒球コロニ
    ー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポエチン
    からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記薬剤が、遷移金属キレート化剤および亜鉛からなる群
    から選択される請求項２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 赤血球前駆細胞の成熟／分化を減速させてβ−異常ヘモグ
    ロビン症の患者を治療する方法であって；銅を利用する前記細胞の性能を低下さ
    せる薬剤を患者に投与して、幹細胞の集団を拡張させ、同時に前記幹細胞の分化
    を阻害し、その結果、前記薬剤が身体から自然に排泄されると、幹細胞が成熟を
    促進されて胎児ヘモグロビンの産生が増大するステップを含んでなる方法。
31. 【請求項３１】 前記薬剤が、遷移金属キレート化剤および亜鉛からなる群
    から選択される請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 銅を利用する前記細胞の性能を低下させて、前記細胞の集
    団を拡張させ、同時に前記細胞の分化を阻害する薬剤の存在下で増殖させた半ビ
    ボの細胞を含有する、半ビボで培養した細胞の治療用細胞製剤。
33. 【請求項３３】 前記薬剤が、銅を捕捉する遷移金属キレート化剤および亜
    鉛からなる群から選択される請求項３２に記載の製剤。
34. 【請求項３４】 銅を捕捉する遷移金属キレート化剤および／または亜鉛の
    存在下、収穫、単離および貯蔵からなる群から選択される少なくとも一つのステ
    ップで、幹細胞を処理するステップを含んでなる幹細胞の保存方法。
35. 【請求項３５】 銅を捕捉する遷移金属キレート化剤および／または亜鉛を
    、細胞の分化を阻害するのに有効な量または濃度で補充した幹細胞収集バッグ、
    分離緩衝液および洗浄緩衝液。
36. 【請求項３６】 銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、分化の阻害を起こ
    すかまたは分化の誘発を起こすかを確認する検定法であって；幹細胞または前駆
    細胞または実質的に未分化の細胞系の集団を、遷移金属キレート化剤の存在下で
    培養し、前記細胞の分化を監視するステップを含んでなり、分化が未処理細胞と
    比べて増大している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を誘発し、一方、分化
    が未処理細胞と比べて減少しているかまたは分化が全くない場合は、遷移金属キ
    レート化剤が分化を阻害している検定法。
37. 【請求項３７】 銅を捕捉する遷移金属キレート化剤が、分化の阻害を起こ
    すかまたは分化の誘発を起こすかを確認する検定法であって；細胞の集団を、遷
    移金属キレート化剤の存在下で培養し、前記細胞の銅含有量を監視するステップ
    を含んでなり、前記細胞の銅含有量が未処理細胞と比べて増大している場合は、
    遷移金属キレート化剤が分化を誘発し、一方、銅含有量が未処理細胞と比べて減
    少している場合は、遷移金属キレート化剤が分化を阻害している検定法。
38. 【請求項３８】 細胞の集団の分化を誘発する方法であって；細胞に、銅を
    捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート化剤を加えるステ
    ップを含んでなる方法。
39. 【請求項３９】 細胞が生体内の細胞である請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 細胞を半ビボで増殖させる請求項３８に記載の方法。
41. 【請求項４１】 細胞が造血細胞である請求項３８に記載の方法。
42. 【請求項４２】 細胞が、正常細胞および癌細胞からなる群から選択される
    請求項３８に記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記遷移金属キレート化剤がトリペプチドである請求項３
    ８に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記遷移金属キレート化剤が、ＧＧＨ，ＧＨＬおよび１，
    ４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンからなる群から選択される請求項
    ３８に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記遷移金属キレート化剤がＧＧＨである請求項３８に記
    載の方法。
46. 【請求項４６】 前記遷移金属キレート化剤がペプチドまたはペプチド類似
    体である請求項３８に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記遷移金属キレート化剤がペプチド配列を含有している
    請求項３８に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記ペプチド配列が、配列番号：１および２からなる群か
    ら選択される請求項４７に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記細胞が、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、神経幹細
    胞もしくは神経前駆細胞、希突起グリア幹細胞もしくは希突起グリア前駆細胞、
    皮膚幹細胞もしくは皮膚前駆細胞、肝臓幹細胞もしくは肝臓前駆細胞、筋肉幹細
    胞もしくは筋肉前駆細胞、骨幹細胞もしくは骨前駆細胞、間葉幹細胞もしくは間
    葉前駆細胞、膵臓幹細胞もしくは膵臓前駆細胞、軟骨幹細胞もしくは軟骨前駆細
    胞、ストロマ幹細胞もしくはストロマ前駆細胞、胚性幹細胞、および培養されて
    拡張された幹細胞もしくは培養されて拡張された前駆細胞からなる群から選択さ
    れる請求項３８に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記細胞が、骨髄、末梢血液および新生児臍帯血からなる
    群から選択されるソース由来の細胞である請求項３８に記載の方法。
51. 【請求項５１】 前記細胞が、造血ＣＤ_３４ ^＋細胞について豊富化されてい
    る請求項３８に記載の方法。
52. 【請求項５２】 前記細胞が、未分化幹細胞および分化拘束前駆細胞からな
    る群から選択される請求項３８に記載の方法。
53. 【請求項５３】 急性白血病細胞の末端分化を誘発する方法であって；前記
    細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート化剤
    を加えるステップを含んでなる方法。
54. 【請求項５４】 前記細胞が、生体内の細胞および半ビボの細胞からなる群
    から選択される請求項５３に記載の方法。
55. 【請求項５５】 非白血病の造血前駆細胞の分化を誘発する方法であって；
    前記細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属キレート
    化剤を加えるステップを含んでなる方法。
56. 【請求項５６】 前記細胞が生体内細胞および半ビボの細胞からなる群から
    選択される請求項５５に記載の方法。
57. 【請求項５７】 正常な幹細胞を、細胞系譜に分化拘束された前駆細胞に半
    ビボで分化させる方法であって；前記正常な幹細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分
    化を誘発するのに有効な遷移金属キレート化剤を加えるステップを含んでなる方
    法。
58. 【請求項５８】 幹細胞を、樹状細胞に分化拘束された前駆細胞に半ビボで
    分化させる方法であって；前記幹細胞に、銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発する
    のに有効な遷移金属キレート化剤を加えるステップを含んでなる方法。
59. 【請求項５９】 銅を捕捉しかつ細胞の分化を誘発するのに有効な遷移金属
    キレート化剤、および医薬として許容されるキャリヤーを含有する、細胞集団に
    分化を誘発する医薬組成物。
60. 【請求項６０】 前記遷移金属キレート化剤がトリペプチドである請求項５
    ９に記載の組成物。
61. 【請求項６１】 前記遷移金属キレート化剤が、ＧＧＨ，ＧＨＬおよび１，
    ４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンからなる群から選択される請求項
    ５９に記載の組成物。
62. 【請求項６２】 前記遷移金属キレート化剤がＧＧＨである請求項５９に記
    載の組成物。
63. 【請求項６３】 前記遷移金属キレート化剤がペプチドまたはペプチド類似
    体である請求項５９に記載の組成物。
64. 【請求項６４】 前記遷移金属キレート化剤がペプチド配列を含有している
    請求項５９に記載の組成物。