JP2003521915A - 反芻動物ＭＨＣクラスＩ−様Ｆｃレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を輸送する反芻動物Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）α−鎖ＤＮＡ分子、特に牛、ヒトコブラクダ及び羊のＤＮＡ分子（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を開示する。ＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子によって発現した蛋白質を開示し、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６を含む。ＩｇＧを輸送するＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子を含有するベクター、及び上記ベクターで形質転換された宿主も含む。更に、高められたレベルの免疫グロブリンあるいは免疫グロブリンγ−鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分に融合された蛋白質を含有する初乳又は乳汁を産生する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、反芻動物ＭＨＣクラスＩ−様Ｆｃレセプターに関し、更に詳しくは
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を輸送する反芻動物、特にウシ(bovine)（ウシ(cow
) ）、ヒトコブラクダ(dromedary) 及び羊Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）α−鎖Ｄ
ＮＡ分子、及びこのＤＮＡ分子をコードする蛋白質に関する。また本発明は本発
明のＤＮＡ分子を含有するベクター及びこのベクターを含有する宿主に関する。
更に、本発明は高められたレベルの免疫グロブリンあるいは免疫グロブリンγ−
鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分に融合された蛋白質を含有する初乳又は
乳汁を産生する方法を含む。

【０００２】 発明の背景 反芻動物における母親から子牛への受動免疫伝達(the transfer of passive i
mmunity)は初乳による免疫グロブリンの輸送を要件とする（１）。初乳が摂取さ
れるやいなや、免疫グロブリンは新生児の腸バリヤーを通過してその血液中に輸
送される。この腸経路は免疫グロブリンのタイプに多少非特異的であると思われ
るが、母親の血漿から乳房バリヤーを通過して初乳へのこれらの蛋白質輸送に高
い選択性がある（２）。産後すぐにすべての乳汁の免疫グロブリンの濃度は急速
に低下するので、この輸送の選択性は母親の上皮細胞バリヤーを通過する特異的
輸送メカニズムが係わっていると考えられてきた。

【０００３】 ヒト、マウス及びラットでの母親ＩｇＧの輸送に関与する蛋白質、すなわちＦ
ｃＲｎは必須の膜糖蛋白質（ＭＨＣクラスＩα−鎖に類似する）及びβ２−ミク
ログロブリンからなる（３）。ＩｇＧは新生児ラット腸上皮中で輸送小胞に観察
された（４）。種々の研究で、ＦｃＲｎはまたラット及びマウスの胎児卵黄嚢中
で（５）、成熟ラット肝実質細胞中で（６）及びヒト胎盤中で（８，９）発現す
ることが示された。最近になって、Cianga等（９）はレセプターが乳汁分泌マウ
スの乳腺で乳房の上皮細胞に集まることを示した。かれらはＦｃＲｎがＩｇＧを
乳腺から血液に循環させる特定の方法で乳汁へのＩｇＧトランスファーの調節に
ＦｃＲｎが可能な役割を果たすことを示唆した。そのＦｃＲｎは広範な組織中で
発現され、そしてＩｇＧのアイソタイプを区別するために異なる結合親和性を示
し、血清半減期と母−胎児−トランスファー（materno-fetal transfer）とマウ
スＦｃＲｎに対する種々のラットＩｇＧアイソタイプの親和性の間の相関関係は
近年証明された（１０）。

【０００４】 本発明は、ラット、マウス及びヒトＩｇＧ輸送Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）の
反芻動物相同体、特にウシ、ヒトコブラクダ及び羊における上記レセプターの相
同体をコードするｃＤＮＡの単離、及びこれをＤＮＡ分子を含有するベクターに
使用する方法及びこのベクターを含有する宿主を提供する。

【０００５】 発明の簡単な説明 ウシｃＤＮＡ、すなわち推定(deduced) アミノ酸配列は他の種におけるＦｃＲ
ｎに高度な類似性を示し、これは３つの細胞外ドメイン、疎水性膜貫通領域及び
細胞質尾部（tail) から成る。公知のＦｃＲｎ配列を一列に並べると、ウシ蛋白
質がα１ループ中でラット及びマウス配列に比べて３つのアミノ酸欠失を示すこ
とに気づいた。乳腺を含めた、多くの組織でのｂＦｃＲｎ転写の存在がＩｇＧ異
化及びトランスサイトーシスの両方でその関与を示唆させる。更に、全長をコー
ドする領域及び３’−末端非翻訳領域から成る羊のｃＤＮＡ、及び推定される羊
のアミノ酸配列、及びウシｃＤＮＡ配列に比べてｃＤＮＡの最初の３０１ヌクレ
オチドのないヒトコブラクダのｃＤＮＡ、及びウシ及び羊配列に比べて最初の６
２アミノ酸のない推定アミノ酸配列を開示する。

【０００６】 本発明のＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子を用いる一過性又は永続的トランスジェネ
シスによる反芻動物の過発現は単独でか又は対応するβ２−ミクログロブリン遺
伝子の発現の付随するアップレギュレーションによって、複合乳腺組織（udder)
中で機能性レセプター数の増加をもたらし、かくて免疫グロブリン及び（又は）
免疫グロブリンγ−鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分（これはＩｇＧの重
鎖の一定領域を有する）に融合した蛋白質を増加させる。自然に受けた又は意図
的なワクチン接種によって取得された抗体はより一層効果的に初乳／乳汁へ輸送
されるだけでなく、γ−鎖のタグの付いた蛋白質（すなわちコードする問題の遺
伝子がＩｇＧに対する、部分又は全体の重鎖一定領域遺伝子をコードする配列に
結合した蛋白質）も反芻動物の初乳／乳汁により一層効果的に輸送されるであろ
う。後者の蛋白質を遺伝子構造体を一過性に（たとえばＤＮＡ接種によって、し
かしＤＮＡ接種に限定されない）又は永続的に（たとえば“通常の(conventiona
l)”トランスジェネシスによって、しかし“通常の”トランスジェネシスに限定
されない）発現する動物によって産生することができる。

【０００７】 ＦｃＲｎトランスジェニック反芻動物はＦｃＲｎα−鎖遺伝子（同時の(conco
mitant) β２ミクログロブリン発現の存在下又は不在下）を発現し、そして標的
器官での発現は導入遺伝子を複合乳腺組織へ直接導入することによって導くこと
ができるか又は“通常の”トランスジェニック動物を標的とする適切な遺伝子に
よって複合乳腺組織中で発現することができる。

【０００８】 発明の詳細な説明 本発明は１つの観点において 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を輸送する反芻動
物Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）α−鎖ＤＮＡ分子にあり、その際その反芻動物は
牛、ヒトコブラクダ(dromedary) 及び羊より成る群から選ばれるのが好ましい。
特に、ＤＮＡ分子はＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ
：３、及びＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質を発現するこれらの３つの配列の修飾
配列より成る群から選ばれたヌクレオチド配列を有する。

【０００９】 本発明のＤＮＡ分子は単離することができ、そして生物（反芻動物）の供給源
から精製することができるか又は遺伝子工学によって産生することができると解
されねばならない。

【００１０】 表現“ＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質を発現するこれら３つの配列の修飾配列
”を本明細書及び請求項中に使用することで、先端を切断した（turncated)配列
及びヌクレオチド不適合組み合わせを有するが、ＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質
を依然として発現する配列も本発明で保護される。

【００１１】 本発明の他の観点は、反芻動物ＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子によって発現した蛋
白質にあり、その際その反芻動物は牛、ヒトコブラクダ及び羊より成る群から選
ばれるのが好ましい。特に、この蛋白質はＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ
：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、及びＩｇＧ輸送機能を有するこれらの３つの配列の
修飾配列より成る群から選ばれたアミノ酸配列を有する。

【００１２】 本発明のＤＮＡ分子は単離することができ、そして生物（反芻動物）の供給源
から精製することができるか又は遺伝子工学によって産生することができると解
されねばならない。

【００１３】 表現“ＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質の修飾配列”を本明細書及び請求項中に
使用することで、先端を切断した（turncated)配列及びヌクレオチド不適合組み
合わせを有するが、ＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質を依然として発現する配列も
本発明で保護される。

【００１４】 本発明のまた別の観点は本発明の反芻動物ＩｇＧ輸送ＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分
子を含有するベクターにある。ベクターの例はプラスミド及びファージである。

【００１５】 本発明のもう一つの観点は本発明のベクターで形質転換された宿主にある。宿
主の例は微生物、イースト、及び反芻動物、たとえばウシ、ラクダ、たとえばヒ
トコブラクダ、及び羊である。

【００１６】 本発明の反芻動物ＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子及び本発明の蛋白質を研究に及び
本発明のベクターの産生にツール（tool) として使用することができる。

【００１７】 本発明のベクターをトランスジェニック反芻動物又は局所トランスジェニック
反芻動物母親（すなわち複合乳腺組織に注射）の産生に使用することができる。

【００１８】 したがって本発明の別の観点は、高められたレベルの免疫グロブリンあるいは
免疫グロブリンγ−鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分に融合された蛋白質
を含有する初乳又は乳汁を産生する方法において、本発明の反芻動物ＦｃＲｎα
−鎖ＤＮＡ分子を一過性又は永続的トランスジェネシスによって対応する反芻動
物に本発明の蛋白質の過発現のために、場合により対応するβ２−ミクログロブ
リン遺伝子の発現の同時のアップレギュレーションでトランスファーさせて、複
合乳腺組織中で機能性レセプター数を増加させ、それによって免疫グロブリン及
び（又は）免疫グロブリンγ−鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分に融合さ
れた蛋白質の複合乳腺組織から又はこれを通って初乳又は乳汁への輸送を増加さ
せる工程からなるｓことを特徴とするものである。

【００１９】 融合蛋白質として乳汁中に良好に産生することができる蛋白質の例は、凝固生
成物、たとえば因子ＶＩＩＩ、及び薬物及び食物中に使用される蛋白質である。

【００２０】 更に、本発明を図面、実施例及び配列表によって説明することができるが、本
発明の範囲は記載した本発明の実施態様に限定することを意図するものではない
。

【００２１】 本発明は反芻動物ＦｃＲｎ遺伝子の代表的例としてウシ（bovine)(cow)ＦｃＲ
ｎ遺伝子に関して詳細に説明するが、羊のｃＤＮＡ配列及びヒトコブラクダの部
分ｃＤＮＡ配列及び対応する推定アミノ酸配列も配列表に開示する。羊及びヒト
コブラクダのＦｃＲｎ遺伝子はウシＦｃＲｎ遺伝子を得るのに使用されるのと同
一の法則の使用によって産生される。特に同一又は類似のプライマーを使用して
、羊又はヒトコブラクダ中でＦｃＲｎα−鎖をコードする遺伝子を増幅するのに
使用される。

【００２２】 図面の説明 図１。ウシＦｃＲｎα−鎖の２つの形態のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸
配列。ポテンシャルＡＴＧ開始をボールド字体で記す。一方、共通開始部位を表
わすセグメントに下線をつけた。この図で陰影のある数（shaded number)は翻訳
シグナルの重要な残基（- ３−Ａ； +４−Ｃ）を示す。シグナルペプチド開裂後
の予想されるＮＨ₂ −末端はＡｌａ下で＋１によって示される。疎水性膜にかか
る(spanning)セグメントはイタリック体で記し、一方３’−ＵＴ中のポリアデニ
ルシグナルＡＡＴＡＡＡに下線を付けた。

【００２３】 配列データはＮＣＢＩヌクレオチド配列データベースに登録番号：ＡＦ１３９
１０６として提出されている。

【００２４】 図２。ラット、マウス、ウシ及びヒトＦｃＲｎα−鎖に対する予想されるアミ
ノ酸配列のドメインごとの列。すべての配列に見出されるＮ−結合したグリコシ
レーション部位を黒三角形で示す。一方、白三角形はラット及びマウス配列中の
付加的な部位を示す。破線は潜在的にＦｃと相互作用する残基を示す。灰色のバ
ーは疎水性膜貫通領域を示し、星印はウシ配列中の停止シグナルを示す。停止シ
グナルの次の枠はウシ細胞質ドメインの保存カルボキシル末端を示す。共通残基
をカラム中の文字の出現数に基づいて目立たせ、保存の度合を強調させる。カラ
ムにおいて保存が多くなればなるほど、文字の背景はますます黒くなる。（Nich
olas K.B. 及びNicholas H. B. Jr. 1997. GeneDoc: a tool for editing and a
nnotating multiple sequence alignments) 。

【００２５】 図３。ウシＦｃＲｎの部分ゲノムＤＮＡ配列を描写する図解。これはＢ７（Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１５）及びＢ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）プライマーを用いてク
ローン化されるＰＣＲである。大文字はｃＤＮＡ配列データによって照合された
エキソン（exon) を示す。エキソン及びイントロン(intorn)はマウスＦｃＲｎの
ゲノム構造に基づいて番号づけされる（１９）。スペースの理由で配列のセグメ
ントを欠失した箇所に斜線(diagonal breaks) を加えた。点線はイントロン５の
スプライス受容部位を示す。これは保存されたＡＧジヌクレオチドを有するが、
適切なポリピリミジントラクトを欠いている。一方、イントロン６の共通スプラ
イス受容部位は破線で記しを付けた。マウスＦｃＲｎのイントロン５のスプライ
ス受容部位は２つのセグメント間の類似性を示すウシ配列の下に括弧内に示した
。マウス配列中の下線のある文字はウシ遺伝子のイントロン５のウシスプライス
アクセプター部位に相同性を示す。

【００２６】 図４。２つの型のウシＦｃＲｎα−鎖転写の組織分布。Ａ図：乳腺（Ｍ）、耳
下腺（Ｐ）、肝臓（Ｌ）、空腸（Ｊ）、腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）から及びＭＤＢ
Ｋ細胞株から１０μｇＲＮＡ中での１．６−ｋｂ転写のノーザンブロット分析は
ｂＦｃＲｎ膜貫通−細胞質領域からの３２ｐ−標識されたプローブを用いて検出
される。Ｂ図：エキソン６のＲＴ−ＰＣＲ分析はｂＦｃＲｎ転写から検出される
。エキソン６に対する標的ＰＣＲはｃＤＮＡ増幅をＢ１１／Ｂ１２プライマー（
それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１８及び２０）を用いて欠失する。

【００２７】 図５。トランスフェクションされた細胞株中で異なる種のＦｃＲｎの機能的発
現。ｈＦｃＲｎ／２９３はｈＦｃＲｎトランスフェクションされた２９３細胞株
を示し（７）、２９３はトランスフェクションされていない細胞を示し、Ｂ１は
ｂＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株を示し、ＩＭＣＤはトラ
ンスフェクションされていない細胞を示し、ｒＦｃＲｎ／ＩＭＣＤはｒＦｃＲｎ
トランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株を示す（１４）。親和性精製された
兎抗血清を用いる細胞性蛋白質全体のウエスタンブロットは、α２−α３ドメイ
ンのアミノ酸１７３−１８７（ウシ残基）に対して感度を示す。

【００２８】 図６。ＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株によるウシ−¹²⁵ Ｉ−ＩｇＧ結合。アッセイを、ｐＨ６．０〜８．０で非標識ウシＩｇＧと競合さ
せる（黒カラム）及び競合させない（白カラム）こによって３７℃で実施する。
それぞれのカラムは３反復して平均の細胞関連放射能を示す。バーは平均標準誤
差を示す。

【００２９】 実験の説明 材料及び方法 ｂＦｃＲｎｃＤＮＡフラグメントのクローニング ＲＴ−ＰＣＲ：ウシＦｃＲｎｃＤＮＡフラグメントを先ず逆転写−ＰＣＲ（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）を用いてクローン化する。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies,
Inc., Gaithersburg, MD)から単離された全ＲＮＡを、一次鎖（a first-strand
) ｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia Biotech,スウエーデン）を用いて逆転写する
。α１、α２及びα３ドメインにわたるセグメントを２つの変性プライマー（de
generate primers）（Ｂ３：５’−ＣＧＣＡＧＣＡＲＴＡＹＣＴＧＡＳＣＴＡＣ
ＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；Ｂ２：５’−ＧＡＴＴＣＣＳＡＣＣＡ
ＣＲＲＧＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８））を用いてポリメラーゼ連鎖
反応によって増幅する。これらのプライマーは公表されたラット、マウス及びヒ
トＦｃＲｎ配列の配列相同性に基づいて設計される（３、５、７）。

【００３０】 サザンブロットハイブリダイゼーション 増幅されたｃＤＮＡは１％アガロースゲル上でサイズ分画され、Ｈｙｂｏｎｄ
−Ｎナイロン膜（Amersham, Arlington Heights,IL) 上でブロットし、³²Ｐ−標
識されたヒトＦｃＲｎｃＤＮＡプローブでハイブリット形成させる。このプロー
ブをプライマー（ＨＵＦＣ２：５’−ＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ＨＵＦＣ３：５’−ＡＣＧＧＡＧＧＡＣＴ
ＴＧＧＣＴＧＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０））を用いて胎盤ＲＮＡ
からＲＴ−ＰＣＲによって生じさせ、α２、α３及び膜貫通領域を含有する５４
９ｂｐフラグメントを囲む（７）。分画されたＰＣＲ増幅された、ウシｃＤＮＡ
の生成物を含有するブロットを５×デンハード(Denhardt)溶液、５×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ、鮭精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ中で６０℃で６時間ハイブリット
形成させ、ついで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で２×１５分間室温で洗浄し、
０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分で６０℃で洗浄する。

【００３１】 クローニング及び塩基配列決定 予想されるサイズ及びサザンブロット確認(verification)にもとづいて、適切
なＴａｑポリメラーゼ生成フラグメントをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega Corp
., Madison, WI) へクローン化する。一般に、予備塩基配列決定を研究室でｆｍ
ｏｌＤＮＡ塩基配列決定システム（Promega Corp., Madison, WA) によって行う
。一方、ＴａｑＦＳ dye terminator cycle 塩基配列決定をCybergene 社（Hudd
inge Sweden)の自動化された蛍光シークエンサー（ＡＢ１、３７３Ａ−Ｓｔｒｅ
ｔｃｈ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ) によって行い、最終配列データが完成される
。

【００３２】 ｂＦｃＲｎｃＤＮＡ全長のクローニング ウシＦｃＲｎｃＤＮＡの全長を得るために、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）法（１
１）の急速増幅を使用して、未知の５’−及び３’−末端を単離し、クローン化
する。

【００３３】 ３’−ＲＡＣＥ：総ＲＮＡ５μｇをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Life Techn
ologies, Inc., Gaithersburg, MD ）によって（ｄＴ）１７−アダプタープライ
マー（５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡ（Ｔ)₁₇-３’（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１１）［ヒトコブラクダＦｃＲｎにも使用される］）を用いて逆転写
する。ついで結果として得られたｃＤＮＡをアダプタープライマー（５’−ＧＡ
ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ- ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）［ヒトコ
ブラクダＦｃＲｎにも使用される］）及びｂＦｃＲｎ特異プライマー（Ｂ３（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））を用いて３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ増幅させる。

【００３４】 ５’−ＲＡＣＥ：ウシＦｃＲｎの残存５’−末端部分をｃＤＮＡ末端の急速増
幅用５’ＲＡＣＥシステム、バージョン２．０（Life Technologies, Inc., Gai
thersburg, MD ）を用いて単離する。要約すると、総ＲＮＡをＦｃＲｎ−特異オ
リゴヌクレオオチド（Ｂ４：５’−ＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＴＴ
−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３））を用いて逆転写する。一次鎖合成の後、
最初のｍＲＮＡ鋳型をＲＮａｓｅ混合物で処理して除く。非導入ｄＮＴｐｓ、プ
ライマー及び蛋白質をGlass Max Spin Cartrige を用いてｃＤＮＡから分離する
。ついでホモポリマー尾部(homopolymeric tail)をＴｄＴ及びｄＣＴＰを用いて
ｃＤＮＡの３’−末端に加える。ＰＣＲ増幅をＴａｑポリメラーゼ、nestedＦｃ
Ｒｎ特異プライマー（Ｂ５：５’−ＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡ−
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４））及びデオキシイノシン含有アンカアープラ
イマーを用いて行う。増幅されたｃＤＮＡセグメントをサザンブロット分析によ
って分析し、上述のようにクローン化し、塩基配列を決定する。

【００３５】 ｂＦｃＲｎゲノムＤＮＡフラグメントのクローニング ウシゲノムＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌ（１２）の方法に基づいて肝臓から精製す
る。α３−膜貫通−細胞質領域のエキソン−イントロン境界を分析するために、
Ｂ７（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５））及びＢ８（５’−ＧＡＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＴＣＷＣＡＣＡ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６））プライマーを用いてゲノムＤＮＡフラグメント
をＰＣＲ増幅させる。ついで増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターへ連結さ
せ（Promega Corp., Madison, WI) 、上述のように塩基配列を決定する。

【００３６】 組織分布 ノーザンハイブリダイゼーション 種々のウシ組織サンプル（乳腺、耳下腺、肝臓、空腸、腎臓及び脾臓）を乳汁
分泌をするホルスタイン−フレジアンウシから解体処理で集め、液体窒素中で直
ちに凍結させる。これらの組織及びＭＤＢＫ細胞株から精製された全細胞性ＲＮ
Ａ（TRIzol Reagent,Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）（１０μ
ｇ／lane）を変性アガロースゲル上に流し、プラスに電荷したナイロン膜(Boehr
inger Mannheim GmbH,ドイツ）にトランスファーさせる。ブロットを³²Ｐ−標識
されたプローブを用いてハイブリット化する。このプローブはPrime-A-Gene kit
(Promega Corp., Madison、 WI)によってもたらされ、Ｂ７−Ｂ８（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１５−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を生じるｂＦＣＲｎのｃＤＮＡを
含有する。最終洗浄は６０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。

【００３７】 発現及び結合アッセイ ｂＦＣＲｎｃＤＮＡの全長をＢ１０（５’−ＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧ
ＧＧＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）［羊ＦｃＲＮ遺伝子にも使用
］及びＢ１１（５’−ＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３
’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）［羊ＦｃＲＮ遺伝子にも使用］）によって増幅
させる。ついでこのセグメントをｐＣＩ−ｎｅｏ真核性発現ベクター（Promega
Corp., Madison、 WI)へクローン化する。ＤＮＡ１０μｇをＣａＰＯ₄ 法（１３
）を用いてＩＭＣＤ細胞の１０ｃｍプレート１個にトランスフェクションする。
細胞を希釈し、Ｇ４１８セレクション下に置く。個々のＧ４１８耐性クローンを
結合アッセイのために拡張する。これらの細胞中のウシＦｃＲｎの存在をウエス
タンブロットで確認する。

【００３８】 ウシＩｇＧ（Chemicon International, Temecula, CA) をＮａ¹²⁵ Ｉで標識し
、ヨードゲン（Iodogen ）(Pierce, Rockford, IL)を用いて〜０．５Ｃｉ／μｍ
ｏｌの特異活性とする。ｐＨ依存性Ｆｃ結合及び取り込みをStory 等のプロトコ
ルにしたがって分析する（７）。要約すると、ウシＦｃＲｎを発現する細胞を先
ずＤＭＥＭ、ｐＨ６又は７．５で洗浄する。ついで標識されていないウシＩｇＧ
含有又は不含ＤＭＥＭ、ｐＨ６又は７．５中のウシ−¹²⁵ Ｉ−ＩｇＧを添加する
。細胞を結合させ、３７℃で２時間ＩｇＧを取り込み、その時非結合リガンドを
冷えたＰＢＳ、ｐＨ６．０又は７．５で洗浄して除去する。結合した放射性リガ
ンドをガンマカウンターで計る。

【００３９】 ウエスタンブロット ウシＦｃＲｎα−鎖をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされたＩＭ
ＣＤ細胞のクローン（Ｂ１）、ラットＦｃＲｎα−鎖をコードするｃＤＮＡでト
ランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞（１４）、トランスフェクションされて
いないＩＭＣＤ細胞、ヒトＦｃＲｎα−鎖をコードするｃＤＮＡでトランスフェ
クションされた２９３細胞（７）及びトランスフェクションされていない２９９
３細胞を５％ＳＤＳで抽出する。蛋白質抽出物を勾配ポリアクリルアミド変性ト
リス−グリシンゲル（Novex, San Diego, CA, 米国）上で分解させ、ついでＰＶ
ＤＦ（Novex ）にトランスファーさせる。ブロットを親和性−精製された抗Ｆｃ
Ｒｎペプチド抗体で調べ、ペプチドＬＥＷＫＥＰＰＳＭＲＬＫＡＲＰ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１９）に対する兎抗血清はα２−α３ドメインのアミノ酸１７３−
１８７（ウシ残基）を示し（１４）、結合された抗体を西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合された（horse-radish peroxydase conjugated）ヤギ抗兎抗体を用いて
検出し、化学発光（Renaissance Chemiluminescence Reagent; NEN life Scienc
e Products Inc., Boston, MA,米国）を増加させる。

【００４０】 バイオコンピューターの使用 配列比較をＢＬＡＳＴプログラムを用いて完了する（１５）。その他の公表さ
れたＦｃＲｎ配列に比べてウシＦｃＲｎの配列対距離（Sequence pair distance
) をmegalign, マッキントッシュのレーザージーンバイオコンピューターソフト
ウエアー(DNASTAR Inc., Madison, WI) によってＰＡＭ２５０残基重量表を有す
るＪ．Ｈｅｉｎ法（１６）を用いて分析する。

【００４１】 結果 ウシＦｃＲｎｃＤＮＡの単離 ウシＦｃＲｎのフラグメントを単離するために、先ずウシ肝臓から単離された
ＲＮＡからｃＮＤＡを合成する。というのはこの組織は前に他の種（６，７）で
ＦｃＲｎを発現することが証明されているからである。２つの変性プライマー（
Ｂ３及びＢ２；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及び８）でのＰＣＲ増幅は約７
５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じる。変性プライマーをラット（３）、マウ
ス（５）及びヒトＦｃＲｎ（７）配列の２つの保存配列に基づいて設計する。そ
の予想サイズ及びクローン化されたヒトＦｃＲｎフラグメントを用いるサザンブ
ロット確認に基づいて、この増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターへ連結さ
せ、クローン（クローン１５／３）の１つを完全に塩基配列決定する。データを
ＢＬＡＳＴプログラムを用いてその他の遺伝子バンク配列と比較し、ヒト、ラッ
ト及びマウスＦｃＲｎｃＤＮＡに対して高度に相同性をを示す。クローン１５／
３の挿入をα１ドメイン（エキソン３）の中央で開始し、膜貫通領域（エキソン
６）で終了する。

【００４２】 ついでＢ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及び〜１．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメ
ントを変性したアダプタープライマーを用いて３’−ＲＡＣＥを行う。得られた
いくつかのクローンを完全に塩基配列決定させる。これらの１つ（クローン４）
はα１ドメイン（エキソン３）の中央で開始し、３８−ｂｐの長さのポリ（Ａ）
尾部で終了する。挿入はα１のセグメント、全長のα２、α３ドメイン、貫通（
ＴＭ）ドメイン、細胞質（ＣＹＴ）ドメインを含有し、３’−非翻訳（３’−Ｕ
Ｔ）領域で終了する。挿入の全長はポリ（Ａ）尾部を除いて１３０４ｂｐである
。もう一つのクローン（クローン１）はクローン４に相同する完全配列（comple
te sequence)を明らかにするが、α３ドメインと細胞質領域の間の長さ１１７ｂ
ｐ欠失を示す。挿入の全長はポリ（Ａ）尾部を除いて１３８７ｂｐである。 ウシＦｃＲｎの５’部分は５’−ＲＡＣＥ技術を適用して得られる。Ｂ５（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１４）及びアダプタープライマーを使用する増幅は〜６００ｂ
ｐＤＮＡフラグメントを産生する。ついでこれをｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結さ
せ、クローンの１つ（クローン５）を塩基配列決定する。クローン５の挿入は５
６７ｂｐを含有し、これは欠けたα１、シグナル及び５’−非翻訳（５’−ＵＴ
）領域を包含する。クローン５及びクローン４は３３５ｂｐのオーバーラップを
有し、それ故にウシＦｃＲｎｃＤＮＡ³ の全領域を網羅する１５８２ｂｐの複合
ＤＮＡ配列を得ることができる（図１）。

【００４３】 ウシＦｃＲｎｃＤＮＡの特性評価 塩基配列決定されかつ統合された、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥからな
るコドンは長さ１１６ｂｐの５’−非翻訳領域、ついでＡＴＧ開始コドンを含む
。このモチーフはＫｏｚａｋコンセンサス、ＣＣ^A / _G ＣＣＡＵＧＧ（その最も
重要な残基は位置−３でプリン及び位置＋４でＧヌクレオチド（１７）である）
で翻訳制御に重要であるヌクレオチドによって側面が包囲される。ウシＦｃＲｎ
ｃＤＮＡはＴＣＡＧＧＡＴＧＣを示し、これは最適なＫｏｚａｋ配列と相異する
。ｂＦｃＲｎは位置−３でプリン塩基を示すが、この動物からの塩基配列決定さ
れたクローンすべてにおいて位置＋４でＧの代わりにＣを見出した（図１）。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲの間Ｔａｑエラーの可能性を排除するために、２つのべつの動物から
このモチーフを調べ、同一の配列を見出した。

【００４４】 開始コドンをそれぞれ全長又はエキソン６−欠失型の場合、長さ１１８０ｂｐ
又は１０６３ｂｐのオープンリーディングフレームによって続けられる。エキソ
ンコードするセグメントは保存ポリアデニル化シグナルを含む長さ３９２ｂｐ３
’−非翻訳配列によって続けられる。

【００４５】 図２は、ウシＦｃＲｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の推定アミノ酸配列をヒト
、ラット及びマウスの配列と対比して示す。以前の研究は特定化されたＦｃＲｎ
分子の構造を示し、ＭＨＣクラス−α−鎖（３，１８）の構造に似ている。単離
されたウシＦｃＲｎα−鎖の全長転写はまた３つの細胞外ドメイン（α１−α２
−α３）、膜貫通領域及び細胞質尾部からなる。だがエキソン６−欠失転写は推
定上の膜貫通領域を欠いている。この欠失ドメイン以外に、２つの分子がＤＮＡ
で及び蛋白質レバルで同一である（図１）する。

【００４６】 推定ｂＦｃＲｎアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とそのヒト、ラット
及びマウスの相補部分（couterparts)を対比して、ヒトＦｃＲｎに高度に全体的
に類似することを見出した（表１）。細胞外ドメインのうち、α３−鎖は最も保
存されるドメインに変わり、一方細胞質尾部は最高の非類似性をもたらす。

【００４７】 表１：ＰＡＭ２５０残基重量表を有するＪ．Ｈｅｉｎ法（１６）を用いて公表
されたＦｃＲｎ配列に対するウシＦｃＲｎの配列対距離（％類似率）。

【００４８】

【表１】 ヒトＦｃＲｎに比べてウシＦｃＲｎの高い類似性はさらにα１ドメインの末端
を分析して強調される。ＩｇＧ結合部位の近くにループを形成するこのセグメン
トはラット及びマウス配列に比べてウシ及びヒト分子内でそれぞれ３又は２個の
アミノ酸残基欠失を示す。これらの２つの分子の別の共通の特徴は、これらが３
つの付加的な部位（ラットＦｃＲｎ番号付けシステムに基づくα１−ドメイン：
位置１０９；α２−ドメイン：位置１５０；α３−ドメイン：位置２４７）のあ
るラット又はマウス相補部分に比べて、ウシＦｃＲｎ番号付けシステムに基づく
アミノ酸残基１２４で唯一のポテンシャルＮ−結合グリコシレーション部位を示
すことである。

【００４９】 公知のＦｃＲｎ配列と対照的に、ｂＦｃＲｎで著しく短い細胞質尾部を見出し
た。そこでこのセグメントは今まで分析されてたその他のすべてのＦｃＲｎ分子
中のように４０個ではなく３０個のアミノ酸残基から成る。この短縮にも拘わら
ず、ｂＦｃＲｎの細胞質尾部は、ジロイシンモチーフ（ａａ：３１９−３２０）
を示し、そのモチーフはエンドサイトーシス（細胞内取り込み作用）に対する、
しかし側底選別に対してではない限界シグナル(a critical signal) として以前
に認識されていた。しかしヒト分子に類似するが、この尾部はジロイシンモチー
フのラットＦｃＲｎ上流に見出されるカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）リン酸
化部位を欠いている。

【００５０】 興味深いことに、停止シグナルに続くヌクレオチドはヒト、ラット及びマウス
分子の３’末端で見出される類似のアミノ酸残基に対するコドンを示すが（図２
、ウシ配列で長方形中の残基）、他のＦｃＲｎ中に共有されるこのセグメントの
末端で停止シグナルを欠いている。分析されたすべてのクローン中にこの配列及
び予想される保存位置での共通停止シグナルの欠如を見出すことは、３’−ＲＡ
ＣＥ（ＲＴ−ＰＣＲ）法によるＴａｑエラーの可能性を除き、そして突然変異が
遺伝子のこの部分中に発生することを示唆させる。

【００５１】 ｂＦｃＲｎのゲノムＤＮＡセグメント ｂＦｃＲｎの２つの異なる転写を、公表されたマウスゲノム配列と対比する（
１９）。α３−ＴＭ−ＣＹＴドメインの周辺のマウスエキソン−イントロン境界
の分析は、エキソン６がクローン１を示すウシ転写から完全に除かれることを示
唆する。この仮説を証明するために、エキソン５の部分、エキソン６及びエキソ
ン７の短いフラグメント及び２つのイントロン（イントロン５及びイントロン６
）を含有する重要な領域のゲノムセグメントをクローン化する。Ｂ７／Ｂ８Ｓ（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５／１６）増幅されたＤＮＡをついでクローン化し、塩
基配列決定する。エキソン−イントロン境界を取り囲むヌクレオチド配列はウシ
スプライシング部位がそのマウス相補部分と一致することが明らかである（図３
）。イントロン５及びイントロン６の５’スプライス部位（供与部位）及び３’
スプライス部位（受容部位）を分析すると、イントロン５は保存スルプライス供
与部位（ＧＴ）を有し、一方その３’スプライス部位はポリピリミジントラクト
（ＰＰｙＴ）、ついでＡＧジヌクレオチドからなる共通スプライス受容配列と異
なることが分かった。イントロン５の受容部位は保存ＡＧジヌクレオチドを有す
るが、保存ポリピリミジントラクトを欠いている。イントロン５のこの非保存ス
プライス受容部位はマウスＦｃＲｎの同一遺伝子セグメントとの類似性を示す。
とういのはＡＧジヌクレオチドモチーフに先行する１５ヌクレオチドと４つの相
異しか示さないからである（図３）。この類似性に拘わらず、マウスイントロン
中に長さ１４ｎｔ保存ＰＰｙＴ、ついで２４ｎｔ、ついでＡＧジヌクレオチド（
１９）がある。類似の配列はウシイントロン５の３’末端で検出されないが

【００５２】

【外１】 イントロン６のスプライス供与及びスプライス受容部位は保存境界配列を示す。

【００５３】 ウシＦｃＲｎα−鎖転写の２つの型の組織分布 ｂＦｃＲｎα−鎖ｍＲＮＡの２つの型の組織分布をノーザンブロット及びＲＴ
−ＰＣＲを用いて調べる。ノーザンブロット分析に基づいて、１．６ｋｂ転写は
異なる発現レベルで正常に乳汁分泌するホルスタイン−フレジアンウシ及びＭＤ
ＢＫ細胞株の乳腺、肝臓、空腸、腎臓及び脾臓から得られたＤＮＡ中に存在する
が（図４）、耳下腺での発現を見出せなかった。シグナルはクラス−ＩＭＨＣｍ
ＲＮＡとのクロス−ハイブリダイゼーションを示さなかった。とういのはそれは
クラスＩ配列と異なる膜貫通−細胞質−３’−ＵＴ領域からのプローブを用いて
検出されたからである。このプローブはｂＦｃＲｎの両方の型を検出することが
できるが、恐らくその低い発現レベルのゆえに又はゲル電気泳動の低い分解能（
resolution) のゆえにより短い膜貫通−エキソン−欠失型を検出することができ
なかった。

【００５４】 上記組織中で選択的にスプライシングされた−エキソン６−欠失された−転写
の発現を分析するために、プライマーＢ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）及び
Ｂ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を使用する標的ＰＣＲ増幅（２０）を実施
した。Ｂ１２はエキソン７の３’境界領域で２つの保存ヌクレオチドと並置され
たエキソ５の５’境界保存領域に相当する。この増幅はテストされたすべての組
織中でエキソン６−欠失した転写を検出した（図４Ｂ）。

【００５５】 トランスフェクションされた細胞中でウシＦｃＲｎα−鎖の発現及びＩｇＧ結
合 ＦｃＲｎトランスフェクションされた細胞株をヒトＦｃＲｎ重鎖のエピトープ
（アミノ酸１７４−１８８）に対して生じる兎抗ペプチド抗血清を用いてサザン
ブロットによって評価する。このエピトープはヒト、ラット、及びウシＦｃＲｎ
分子中で共通であるので、発現されるウシＦｃＲｎ、並びにそのヒト及びラット
相補部分を検出するためにこの抗体をコントロールとして使用する。〜４５ｋＤ
ａバンドをｈＦｃＲｎトランスフェクションされたヒト胚腎臓２９３細胞株中で
、〜４０ｋＤａバンドをｂＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株
中で、そして２つのバンド（〜５０ｋＤａ及び〜５５ｋＤａ）をｒＦｃＲｎトラ
ンスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株中で検出した。ヒト及びラットＦｃＲｎ
トランスフェクションされた細胞で検出されたα−鎖４５ｋＤａ及び５０ｋＤａ
、５５ｋＤａバンドはそれぞれヒト及びラットＦｃＲｎα−鎖（６、２１）の公
知の分子量と一致する。ラットＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細
胞株中のより低いバンドは常に小胞体中で見出されるＦｃＲｎの高いマンノース
形であるが、上方のバンドのＦｃＲｎはゴルジ（Golgi ）で修飾された複合体型
オリゴサッカライド鎖を含有する。トランスフェクションされていない２９３及
びＩＭＣＤ細胞中でハイブリダイゼーションはなかった（図５）。

【００５６】 ウシＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株中で検出されたほぼ
４０ｋＤａバンドは、ウシＦｃＲｎとして単離されたｃＤＮＡが無傷であり、完
全に翻訳されうることを示す。ヒト及びラット分子より低いウシＦｃＲｎの分子
量は恐らくそのより短い細胞質領域及び（又は）異なるグリコシレーションによ
る。

【００５７】 ウシＦｃＲｎクローンがＦｃレセプターをコードするかどうかを決定するため
に、ｂＦｃＲｎトランスフェクションされたラットＩＭＣＤ細胞株（Ｂ１）上で
放射性標識されたウシＩｇＧの結合を測定した。ｐＨ７．５でなくて、ｐＨ６．
０で特異的にｂＦｃＲｎ結合したＩｇＧを発現した細胞；トランスフェクション
されていない細胞はどちらかのｐＨで特異結合をほとんど又は全く示さなかった
（図６）。類似のｐＨ依存結合はヒト（７）及びラットＦｃＲｎ（２２）で以前
に観察されていた。

【００５８】 結果の要旨 乳汁、腸分泌液、気管液及び涙液中でのＩｇＧ１の優位(predominance)は、家
畜(cattle)の粘膜免疫でＩｇＧ１に対する特別の役割概念を裏付ける。血清と比
べた場合、これらの分泌におけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２のより高い比率は、選択的
ＩｇＧ１輸送と局所合成の組み合わせを表わすことができた。乳房上皮細胞への
免疫グロブリン透過は非常に多く研究されている。とういのはウシ、母系免疫は
初乳免疫グロブリンによって専ら伝達されるからである。以前の研究では特異結
合部位がＩｇＧ１の輸送に恐らく係わる出産間近のウシ乳房上皮細胞上に存在す
ることを示していたが、ＩｇＧ輸送に関与するレセプターは本発明の以前に確認
されていなかった。現在、本発明者はヒト、ラット及びマウスＩｇＧを輸送する
Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）のウシ相同体をコードするｃＤＮＡを単離し、そし
て特性評価した。

【００５９】 配列分析 細胞外骨格及びＦｃＲｎ／Ｆｃ相互作用部位 ウシｃＤＮＡ及びその推定アミノ酸配列はラット、マウス及びヒトＦｃＲｎに
類似する（図２）（３，５，７）。これらの配列のうち、ウシα−鎖はそのヒト
相補部分に高度にすべての類似性を示す（表１）。

【００６０】 ラットＩｇＧ（１８）のＦｃＲｎ及びＦｃフラグメントの２：１複合体の結晶
構造に基づき、それぞれのおおよその結合領域を局在化することができる。ラッ
トＦｃＲｎ分子の重鎖の第一接触域は、残基８４−８６及び９０にかかわるα１
ドメインの末端で見出すことができる。第二接触域は残基１１３−１１９に係わ
り、一方第三域は残基１３１−１３７を網羅し、両方のサグメントはα２ドメイ
ンの部分である。

【００６１】 更に、ヒト及びウシＦｃＲｎ分子間の密接な関係は、ラットＦｃＲｎ／Ｆｃ相
互作用で第一接触域を形成するらしいα１ドメインの末端を分析することによっ
て強調される。ウシ及びヒトＦｃＲｎの両方はそのげっ歯類相補体に比べてそれ
ぞれアミノ酸残基３及び４個短い。これらの欠失はそのラット及びマウス相補体
に見出される、ＭＨＣクラス−Ｉ蛋白質中に偏在するＮ−結合されたグリコシレ
ーション部位を除くことが重要である。

【００６２】 第二接触域（α２ドメインの部分である）は十分に保存され、ＩｇＧ結合でそ
の重要性を強調する。ラット分子に比べてウシＦｃＲｎの別の相違点はα２ドメ
イン中で第三接触域（ａａ：１３４−Ａｒｇ）でラジカルアミノ酸置換である。
これらの観察は第二及び第三接触域の決定的重要性を示唆させる。一方、第一接
触域を形成するこれらの残基はウシ及びまたヒトでのＩｇＧ／ＦｃＲｎｃ相互作
用で恐らくあまり難しくない。これによってラットＦｃＲｎの予想される接触残
基の役割を分析するために位置指定突然変異誘発を適用するVaughn等の結論が更
に裏付けられる。かれらは第一接触域であると考えられたα１ドメインの残基８
４−８６の置換が結合親和性を顕著に変更しないことを見出した。

【００６３】 ＦｃＲｎ／Ｆｃ相互作用にも影響を及ぼすα３ドメイン（ａａ：２１６Ｌ，２
４２Ｋ，２４８Ｈ，２４９Ｈ）の決定残基(the critical residues) がこれまで
分析された異なる種の間で保存されることを見出した。そのヒト相補部分に類似
するｂＦｃＲｎはα３ドメイン中でＮ−結合したグリコシレーション部位がない
。これは重要なことである。というのはラットＦｃＲｎにとってこれが糖鎖交差
（carbohydrate handshake) （２２）を介してＦｃＲｎ二量化を媒介すると示唆
されていたからである。

【００６４】 これに関連して、研究のどれもｐＨ依存ＩｇＧ結合を示していないが（これは
本発明者によってウシＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を分析することで見出された（図
６））、だれでもウシにおいて乳房上皮細胞がＦｃＲｎ介在トランスサイトーシ
スを介して血液からその分泌液へＩｇＧを運ぶことができることを予想するかも
しれない。

【００６５】 要約すると、本発明のデータから、ＦｃＲｎ転写は家畜の種々の組織（乳腺も
含めて）中で発現され、そしてＩｇＧ異化作用及びトランスサイトーシスでその
示唆される関与を強化することが示される（参考のためにJunghans 1997 (23)参
照）。ウシＩｇＧサブクラスのこのレセプターによって介在されるｂＦｃＲｎ結
合親和性又は輸送効率を調べることは重要である。乳汁分泌期間中、種々の時間
で乳腺中のｂＦｃＲｎの局在化及び発現レベルの分析によって、ＩｇＧの初乳へ
の輸送におけるその機能を明確にすることもできる。

【００６６】 免疫グロブリンγ鎖に融合された蛋白質の産生 免疫グロブリンγ鎖に融合された蛋白質を産生する方法の例は、多数の文献（
たとえば２４−３５）に記載され、したがってここに開示しない。

【００６７】 トランスジェニック反芻動物の産生 トランスジェニック動物を産生する方法の例は多数の先行技術文献（たとえば
トランスジェニック羊（３６−５２）及びトランスジェニック羊（５３−６７）
に記載され、したがってここに開示しない。

【００６８】 しかしながら本明細書に引用されたすべての文献からの教示は、参考として本
発明に含まれる。

【００６９】

【外２】

【００７０】

【外３】

【００７１】

【外４】

【００７２】

【外５】

【００７３】

【外６】

【００７４】

【外７】

【００７５】

【外８】

【００７６】

【外９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はウシＦｃＲｎα−鎖の２つの形態のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸
配列を示す。

【図２】 図２はラット、マウス、ウシ及びヒトＦｃＲｎα−鎖に対する予想されるアミ
ノ酸配列のドメインごとの列を示す。

【図３】 図３はウシＦｃＲｎの部分ゲノムＤＮＡ配列を描写する図解を示す。

【図４】 図４は２つの型のウシＦｃＲｎα−鎖転写の組織分布を示す。

【図５】 図５はトランスフェクションされた細胞株中で異なる種のＦｃＲｎの機能的発
現を示す。

【図６】 図６はＦｃＲｎトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞株によるウシ−¹²⁵ Ｉ−ＩｇＧ結合を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年４月２４日（２００２．４．２４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA61 BA63 CA01 DA02 GA11 GA30 HA01 HA20 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC15 AC20 BA02 CA24 CA60 4H045 AA30 BA41 CA40 DA50 EA05 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を輸送する反芻動物Ｆｃレセプ
   ター（ＦｃＲｎ）α−鎖ＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 反芻動物が牛、ヒトコブラクダ及び羊より成る群から選ばれ
   る、請求項１記載のＩｇＧを輸送するＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 ＤＮＡ分子がＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、Ｓ
   ＥＱＩＤＮＯ：３、及びＩｇＧ輸送機能を有する蛋白質を発現するこれらの３つ
   の配列の修飾配列より成る群から選ばれたヌクレオチド配列を有する、請求項２
   記載のＩｇＧを輸送するＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 反芻動物ＦｃＲｎα−鎖ＤＮＡ分子によって発現した蛋白質
   。
5. 【請求項５】 反芻動物が牛、ヒトコブラクダ及び羊より成る群から選ばれ
   る、請求項４記載の蛋白質。
6. 【請求項６】 蛋白質がＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱ
   ＩＤＮＯ：６、及びＩｇＧ輸送機能を有するこれらの３つの配列の修飾配列より
   成る群から選ばれたアミノ酸配列を有する、請求項５記載の蛋白質。
7. 【請求項７】請求項１〜３のいずれかに記載のＩｇＧを輸送するＦｃＲｎα
   −鎖ＤＮＡ分子を含有するベクター。
8. 【請求項８】請求項７記載のベクターで形質転換された宿主。
9. 【請求項９】高められたレベルの免疫グロブリンあるいは免疫グロブリンγ
   −鎖又はＦｃＲｎと相互作用するその部分に融合された蛋白質を含有する初乳又
   は乳汁を産生する方法において、請求項１〜３のいずれかに記載の反芻動物Ｆｃ
   Ｒｎα−鎖ＤＮＡ分子を一過性又は永続的トランスジェネシスによって対応する
   反芻動物に請求項４〜６のいずれかに記載の蛋白質の過発現のために、場合によ
   り対応するβ２−ミクログロブリン遺伝子の発現の同時のアップレギュレーショ
   ンでトランスファーさせて、複合乳腺組織中で機能性レセプター数を増加させ、
   それによって免疫グロブリン及び（又は）免疫グロブリンγ−鎖又はＦｃＲｎと
   相互作用するその部分に融合された蛋白質の複合乳腺組織から又はこれを通って
   初乳又は乳汁への輸送を増加させる工程から成ることを特徴とする、上記産生方
   法。