JP2003513681A - インターフェロンガンマ・コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インターフェロンガンマ活性を示し、そしてＩＦＮＧポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドが、非ポリペプチド部分のための付着基を含む、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基を持つことで親ＩＦＮＧポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を含む、前記コンジュゲート。該コンジュゲートは、多様な疾患の治療に用いることが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、インターフェロンガンマ様活性を持つコンジュゲート、それらの調
製法、該分子を含む薬剤組成物、および疾患の治療におけるそれらの使用に関す
る。

【０００２】発明の背景 インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー
細胞によって産生されるサイトカインであり、そして２つの非共有結合ポリペプ
チドサブユニットのホモ二量体として存在する。各二量体の成熟型は、１４３ア
ミノ酸残基を含み（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示される）、その前駆体型は、１
６６アミノ酸残基のシグナル配列を含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に示される）
。

【０００３】 各サブユニットは、位２５および９７に、２つの潜在的なＮグリコシル化部位
を有する（Ａｇｇａｒｗａｌら， Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９２
）。グリコシル化の度合いに応じ、二量体型のＩＦＮＧの分子量は、３４−５０
ｋＤａである（Ｆａｒｒａｒら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １
９９３， １１：５７１−６１１）。

【０００４】 野生型ヒトＩＦＮＧ（ｈｕＩＦＮＧ）の一次配列は、Ｇｒａｙら（Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９８：８５９−８６３， １９８２）、Ｔａｙａら（ＥＭＢＯ Ｊ． １
：９５３−９５８， １９８２）、Ｄｅｖｏｓら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １０：２４８７−２５０１， １９８２）およびＲｉｎｄｅｒｋｎ
ｅｃｈｔら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：６７９０−６７９７，
１９８４）に、そしてＥＰ ７７６７０、ＥＰ ８９６７６およびＥＰ １１０
０４４に報告された。ｈｕＩＦＮＧの３Ｄ構造は、Ｅａｌｉｃｋら（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５２：６９８−７０２， １９９１）に報告された。

【０００５】 ＩＦＮＧサブユニットポリペプチドの多様な天然存在または突然変異型が報告
されており、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ Ｎ末端アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ ２に比較し、位（−３）−（−１））を含むもの、Ｎ末端メチオニン（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ ２に比較し、位−１）を含むもの、および１２７−１３４アミ
ノ酸残基を含む、多様なＣ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型が含まれる。
分子のＩＦＮＧ活性を消滅させることなく、Ｃ末端から１−１５アミノ酸残基を
欠失させることが可能であることが知られる。さらに、ｈｕＩＦＮＧ Ｃ末端の
不均一性が、Ｐａｎら（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６６：１４５−
１４９， １９８７）に記載された。

【０００６】 ｈｕＩＦＮＧ突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）は、Ｓｌｏｄｏｗｓｋｉら
（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０２：１１３３−１１４０， １９９
１）、Ｌｕｋら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１３３１４−１３３
１９， １９９０）、Ｓｅｅｌｉｇら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１９
８１−１９８７， １９８８）、Ｔｒｏｕｓｄａｌｅら（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ２６：１２４４−１２５１， １９
８５）に、そしてＥＰ １４６３５４に報告された。天然ｈｕＩＦＮＧ変異体（
ｖａｒｉａｎｔ）は、Ｎｉｓｈｉら（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９７：１５３−
１５９， １９８５）に報告された。

【０００７】 ＵＳ ６，０４６，０３４は、ジスルフィド架橋形成を可能にし、そしてした
がって、二量体型のＩＦＮＧ変異体の安定化を可能にする、取り込まれた４対に
及ぶシステイン残基を有する、熱安定性組換えｈｕＩＦＮＧ（ｒｈｕＩＦＮＧ）
を開示する。

【０００８】 ＷＯ ９２／０８７３７は、野生型ヒトＩＦＮＧの完全（残基１−１４３）ま
たは部分的（残基１−１３２）アミノ酸配列のＮ末端に付加されたメチオニンを
含む、ＩＦＮＧ変異体を開示する。ＥＰ ２１９ ７８１は、（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ ２の）アミノ酸残基３−１２４を含む、部分的ｈｕＩＦＮＧ配列を開示す
る。ＵＳ ４，８３２，９５９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に比較し、３つのさ
らなるＮ末端アミノ酸残基（ＣＹＣ）を有する、アミノ酸配列の残基１−１２７
、５−１４６、および５−１２７を含む、部分的ｈｕＩＦＮＧ配列を開示する。
ＵＳ ５，００４，６８９は、３つのＮ末端アミノ酸残基ＣＹＣを含まないｈｕ
ＩＦＮＧをコードするＤＮＡ配列、および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）におけるそ
の発現を開示する。ＥＰ ４４６５８２は、Ｎ末端メチオニンを含まない、大腸
菌に産生されたｒｈｕＩＦＮＧを開示する。ＵＳ ６，１２０，７６２は、（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に比較し）その残基９５−１３４を含むｈｕＩＦＮＧのペ
プチド断片を開示する。

【０００９】 ｒｈｕＩＦＮＧの高レベル発現が、Ｗａｎｇら（Ｓｃｉ． Ｓｉｎ． Ｂ ２
４：１０７６−１０８４， １９９４）に報告された。 ｒｈｕＩＦＮＧにおけるグリコシル化変動が、Ｃｕｒｌｉｎｇら（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｊ． ２７２：３３３−３３７， １９９０）およびＨｏｏｋｅｒら（
Ｊ． ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ， １９９８， １８： ２８７−２９５）に報告されている。

【００１０】 ｒｈｕＩＦＮＧのポリマー修飾は、Ｋｉｔａら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｌ
ｉｖ． ６：１５７−１６７， １９９０）に、そしてＥＰ ２３６９８７およ
びＵＳ ５１０９１２０に報告された。

【００１１】 ＷＯ ９２／２２３１０は、インターフェロン、とりわけｈｕＩＦＮＧのアシ
アロ糖タンパク質コンジュゲート誘導体を開示する。 ＩＦＮＧ融合タンパク質が記載されている。例えば、ＥＰ ２３７０１９は、
ＩＦＮＧ活性を示す領域、およびＩＦＮＧ活性を示す１つの領域を有する、一本
鎖ポリペプチドを開示する。

【００１２】 ＥＰ １５８ １９８は、ＩＦＮＧ活性を示す領域、およびＩＬ−２活性を示
す領域を有する、一本鎖ポリペプチドを開示する。いくつかの参考文献、例えば
Ｌａｎｄａｒら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０００， ２９９：１６９
−１７９）は、一本鎖二量体ＩＦＮＧタンパク質を記載した。

【００１３】 ＷＯ ９９／０２７１０は、多くのうちの一例がＩＦＮＧである、一本鎖ポリ
ペプチドを開示する。 ＷＯ ９９／０３８８７は、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペ
プチドのＰＥＧ化変異体であって、該ポリペプチドの明記される領域に位置する
非必須アミノ酸残基が、システイン残基で置き換えられている、前記変異体を開
示する。ＩＦＮＧは、成長ホルモンスーパーファミリーのメンバーの一例として
言及されているが、その修飾は詳細には論じられない。

【００１４】 ＩＦＮＧは、間質性肺疾患（間質性肺線維症（ＩＰＦ）としても知られる）の
治療に示唆されてきており（Ｚｉｅｓｃｈｅら（Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅ
ｄ． ３４１：１２６４−１２６９， １９９９およびＣｈｅｓｔ １１０：
Ｓｕｐｐｌ：２５Ｓ， １９９６）およびＥＰ ７９５３３２）、その目的のた
め、ＩＦＮＧは、プレドニゾロンと組み合わせて用いることが可能である。ＩＰ
Ｆに加え、肉芽腫性疾患（Ｂｏｌｉｎｇｅｒら， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒ
ｍａｃｙ， １９９２， １１：８３４−８５０）、特定のミコバクテリウム感
染（Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３０：１３４８−１３５５， １９
９４）、腎臓癌（Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５２：８４１−８４５， １９９４）、
骨粗しょう症（Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３２：１５９４−１５９
９， １９９５）、強皮症（Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２３：６５４−６５
８， １９９６）、Ｂ型肝炎（Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ
４５：２２８２−２２９４， １９９８）、Ｃ型肝炎（Ｉｎｔ． Ｈｅｐａｔ
ｏｌ． Ｃｏｍｍｕｎｉｃ． ６：２６４−２７３， １９９７）、敗血症ショ
ック（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６７８−６８１， １９９７）、
および慢性間接リウマチが、ＩＦＮＧで治療される可能性がある。

【００１５】 薬剤組成物として、ｒｈｕＩＦＮＧは、特に、いくつかのウイルス感染および
腫瘍に対して用いられ、ある程度成功している。ｒｈｕＩＦＮＧは、通常、非経
口注射を介し、好ましくは皮下注射を介し、適用可能である。最大血清濃度は７
時間後に見られ、血漿中の半減期はｉｖ投与３０分後である。このため、ｒｈｕ
ＩＦＮＧでの有効な治療には、頻繁な注射が伴う。主な副作用は、発熱、悪寒、
発汗、頭痛、筋肉痛および傾眠からなる。これらの副作用は、ｒｈｕＩＦＮＧの
注射に関連し、そして注射後、早い時期に観察される。まれな副作用は、局所痛
および紅斑、肝臓酵素の上昇、可逆性顆粒球および血小板減少症、並びに心毒性
である。

【００１６】 ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに比較した際、薬物動態、均一性、免疫原
性および他の不都合な副作用に関して、改善された特性を有する、ＩＦＮＧ活性
を持つ新規分子を提供することが望ましい。発明の簡単な説明 本出願は、１以上の上述の望ましい利点を提供する、改善されたＩＦＮＧ様分
子を開示する。第一の側面において、本発明は、ＩＦＮＧ活性を示し、そしてＩ
ＦＮＧポリペプチドに共有結合した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分
を含むコンジュゲートであって、該ポリペプチドが、非ポリペプチド部分のため
の付着基を含む、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの
除去されたアミノ酸残基を持つことで親ＩＦＮＧポリペプチドのものと異なるア
ミノ酸配列を含む、前記コンジュゲートに関する。該コンジュゲートは、ｈｕＩ
ＦＮＧおよびｒｈｕＩＦＮＧに比較した際、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を
有し、そして所望により、ｒｈｕＩＦＮＧに比較した際、減少した免疫反応を引
き起こす。所望により、該分子種はまた、均質な分子の産生可能性、タンパク質
分解に対する改善された安定性および／または増加した生物学的利用能に関して
、さらなる改善された特性を有する。

【００１７】 その結果、本発明のコンジュゲートは、現在入手可能なＩＦＮＧ化合物よりも
いくつかの利点を提供し、これには、注射または他の型の投薬の間の期間がより
長いこと、副作用がより少ないこと、および／または抗体の減少により有効性が
増加することが含まれる。さらに、本発明のコンジュゲートの使用により、活性
タンパク質のより高い用量、そしてしたがってより有効な療法反応が得られる可
能性がある。

【００１８】 さらなる側面において、本発明は、少なくとも１つのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮＧ
ポリペプチドを含む、ＩＦＮＧ活性を示すコンジュゲートに関する。該ＩＦＮＧ
ポリペプチドは、ｈｕＩＦＮＧであっても、または本明細書に記載されるＩＦＮ
Ｇポリペプチドのいずれであってもよい。

【００１９】 さらなる側面において、本発明は、ヌクレオチド配列および発現ベクターを含
む、本発明のコンジュゲートを調製するための手段および方法と共に、ポリペプ
チドまたはコンジュゲートを調製するための方法に関する。

【００２０】 さらなる側面において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む療法組成物
、療法に使用するための本発明のコンジュゲートまたは組成物、療法におけるま
たは疾患治療用の医薬品製造のためのコンジュゲートまたは組成物の使用に関す
る。

【００２１】 最後に、本発明は、間質性肺疾患、癌、感染および／または炎症性疾患の治療
用の、そして間質性肺疾患の症例における、所望により、さらにグルココルチコ
イドと組み合わせた、医薬品、薬剤組成物またはパーツキット製造のための明記
されるＩＦＮＧコンジュゲートの使用に関する。発明の詳細な説明 定義 本出願および発明の文脈において、以下の定義が適用される： 用語「コンジュゲート」（または交換可能に「コンジュゲート化ポリペプチド
」）は、１以上の非ポリペプチド部分への１以上のポリペプチド（類）の共有結
合により形成される不均一な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）（複合物またはキメ
ラの意味で）分子を示すよう意図される。用語、共有結合は、ポリペプチドおよ
び非ポリペプチド部分が、互いに直接、共有結合しているか、あるいはそうでな
ければ、架橋、スペーサーなどの介在部分もしくは部分類、または連結部分もし
くは部分類を通じて、互いに間接的に共有結合していることを意味する。好まし
くは、コンジュゲートは、適切な濃度および条件で可溶性であり、すなわち血液
などの生理学的液に可溶性である。本発明のコンジュゲート化ポリペプチドの例
には、グリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドが含まれる。用語「非
コンジュゲート化ポリペプチド」は、コンジュゲートのポリペプチド部分に関し
、用いてもよい。

【００２２】 用語「非ポリペプチド部分」は、ＩＦＮＧポリペプチドの付着基にコンジュゲ
ート化することが可能な分子を示すよう意図される。こうした分子の好ましい例
には、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分、または有機誘導体化剤が含まれる
。本発明のコンジュゲートの文脈で用いられる際、非ポリペプチド部分は、ポリ
ペプチドの付着基を通じて、コンジュゲートのポリペプチド部分に連結している
ことが理解されるであろう。

【００２３】 用語「ポリマー分子」は、２以上の単量体の共有結合により形成される分子と
定義され、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である場
合を除き、単量体のいずれもアミノ酸残基でない。用語「ポリマー」は、用語「
ポリマー分子」と交換可能に用いることが可能である。用語「糖部分」は、ｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化、例えばＮまたはＯグリコシル
化によって付着される炭水化物分子を示すよう意図される。コンジュゲート中の
ポリマー分子（類）または糖部分などの非ポリペプチド部分の数が明白に示され
る場合を除き、本発明のコンジュゲートに含まれるかまたは別の方式で本発明に
用いられる「非ポリペプチド部分」に対する言及はすべて、コンジュゲート中の
１以上の非ポリペプチド部分への言及であるものとする。

【００２４】 用語「付着基」は、ポリマー分子または糖部分などの適切な非ポリペプチド部
分にカップリングすることが可能なアミノ酸残基群を示すよう意図される。有用
な付着基およびそれらに対応する非ポリペプチド部分は、以下の表から明らかで
ある。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【表２】

【００２７】

【表３】 ｉｎ ｖｉｖｏ Ｎグリコシル化に関しては、用語「付着基」は、慣用的でな
い方式で、Ｎグリコシル化部位を構成するアミノ酸残基（配列Ｎ−Ｘ’−Ｓ／Ｔ
／Ｃ−Ｘ’’を含む、式中Ｘ’はプロリン以外のアミノ酸残基いずれかであり、
Ｘ’’はＸ’と同一であってもよいしまたはなくてもよいアミノ酸残基いずれか
であり、そして好ましくはプロリン以外であり、Ｎはアスパラギンであり、そし
てＳ／Ｔ／Ｃは、セリン、スレオニンまたはシステインいずれかであり、好まし
くはセリンまたはスレオニンであり、そして最も好ましくはスレオニンである）
を示すよう用いられる。Ｎグリコシル化部位のアスパラギン残基は、グリコシル
化中、糖部分が付着するものであるが、こうした付着は、Ｎグリコシル化部位の
他のアミノ酸残基が存在しない限り、達成することが不可能である。したがって
、非ポリペプチド部分が糖部分であり、そしてコンジュゲート化がＮグリコシル
化により達成されようとする場合、用語「非ポリペプチド部分のための付着基を
含むアミノ酸残基」は、親ポリペプチドのアミノ酸配列の改変と関連して用いら
れる際、Ｎグリコシル化部位を構成するアミノ酸残基の１つ、２つまたはすべて
が、機能するＮグリコシル化部位がアミノ酸配列中に導入されるかまたは前記配
列から除去される方式で、改変されると理解すべきである。

【００２８】 本出願において、アミノ酸名称および原子名称（例えばＣＡ、ＣＢ、ＣＤ、Ｃ
Ｇ、ＳＧ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ、Ｃなど）は、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍ
ｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃ
ｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ ｎａｍｅｓ， ａｔｏｍ
ｎａｍｅｓ ｅｔｃ．）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３８，
９−３７（１９８４）と共に、その訂正、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
， １５２， １（１９８５））に基づく、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）
（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）により定義されるように用いられる。ＣＡはときに
、Ｃα、ＣＢはＣβと称される。用語「アミノ酸残基」は、アラニン（Ａｌａま
たはＡ）システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリ
シン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（Ｉｌ
ｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチ
オニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（Ｐｒ
ｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）
、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（Ｖａｌ
またはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、およびチロシン（Ｔｙｒまた
はＹ）残基からなる群に含まれるアミノ酸を示すよう意図される。本文書中のア
ミノ酸残基の番号付けは、シグナルペプチドを含まないｈｕＩＦＮＧ（すなわち
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２）のＮ末端からである。アミノ酸位／置換を同定するの
に用いられる用語法は、以下のように例示される：Ｎ２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
２に示されるアミノ酸配列中、アスパラギンに占められる位＃２５を示す）。
Ｎ２５Ｃ（位２５のＡｓｐ残基がＣｙｓで置換されていることを示す）。多置換
は、「＋」で示され、例えばＱ１Ｎ＋Ｐ３Ｔ／Ｓは、位１のＧｌｎ残基のＡｓｎ
での置換および位３のＰｒｏ残基のＴｈｒまたはＳｅｒ、好ましくはＴｈｒでの
置換を含むアミノ酸配列を意味する。

【００２９】 用語「ヌクレオチド配列」は、２以上のヌクレオチド分子の連続する伸長を示
すよう意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、
合成起源、またはそのいかなる組み合わせであってもよい。

【００３０】 用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、一般的に、例えばＵＳ
４，６８３，１９５に記載されるように、望ましいヌクレオチド配列をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで増幅するための方法を指す。一般的に、ＰＣＲ法は、テンプレート核
酸に優先的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーを
用いた、プライマー伸長合成の反復周期を伴う。

【００３１】 「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、本明細書におい
て、交換可能に用いられ、そしてこうしたすべての用語は、細胞の増殖または培
養から生じる子孫を含むと理解すべきである。「形質転換」および「トランスフ
ェクション」は、交換可能に用いられ、ＤＮＡを細胞に導入する方法を指す。

【００３２】 「機能可能であるように連結された」は、互いに関し、配列の通常の機能を行
うことが可能であるような配置の、酵素的連結または別の手段による、２以上の
ヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコ
ードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質と
して発現されるならば、ポリペプチドのヌクレオチド配列に機能可能であるよう
に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるなら
ば、コード配列に機能可能であるように連結し；リボソーム結合部位は、翻訳を
促進するよう配置されているならば、コード配列に機能可能であるように連結し
ている。一般的に、「機能可能であるように連結した」は、連結されるヌクレオ
チド配列が、隣接しており、そして分泌リーダーの場合、隣接しており、そして
読み枠にあることを意味する。連結は、好適な制限部位での連結により達成され
る。こうした部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは
リンカーを、標準的組換えＤＮＡ法と組み合わせて用いる。

【００３３】 用語「導入する」は、主に、既存のアミノ酸残基の置換を意味するよう意図さ
れるが、また、さらなるアミノ酸残基の挿入を意味する可能性もある。用語「除
去する」は、主に、除去されるアミノ酸残基の、別のアミノ酸残基での置換を意
味するよう意図されるが、また、除去されるアミノ酸残基の欠失（置換を伴わな
い）を意味する可能性もある。

【００３４】 用語「非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基」は、アミノ酸
残基が、非ポリペプチド部分が結合する（導入されたアミノ酸残基の場合）かま
たは結合していたであろう（除去されたアミノ酸残基の場合）ものであることを
示すよう意図される。

【００３５】 用語「１つの相違」または「と異なる」は、本明細書に記載されるＩＦＮＧポ
リペプチドのアミノ酸配列に関して用いられる際、さらなる相違が存在すること
を可能にすることを意図する。したがって、明記されるアミノ酸相違に加え、明
記されるもの以外の他のアミノ酸残基が突然変異していてもよい。

【００３６】 用語「機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期」は、通常の意味で用いられ、すなわち一
掃される前に、コンジュゲート分子の５０％が血漿または血流中に循環する時間
（「血清半減期」とも称される）、またはコンジュゲートの既定の機能性の５０
％が保持される時間を意味する。ポリペプチドまたはコンジュゲートは、通常、
１以上の細網内皮系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓または肝臓の作用により、あるいは
特異的または非特異的タンパク質分解により、一掃される。通常、クリアランス
は大きさ（糸球体ろ過のための切捨て値に比較し）、電荷、付着した炭水化物鎖
、および該タンパク質のための細胞受容体の存在に応じる。保持されるべき機能
性は、通常、抗ウイルス、抗増殖、免疫調節またはＩＦＮＧ受容体結合活性より
選択される。機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、以下の方法項にさらに論じられる
ように、当該技術分野に知られるいかなる適切な方法により、決定してもよい。

【００３７】 用語「増加した機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期」は、コンジュゲートの機能的ｉ
ｎ ｖｉｖｏ半減期が、匹敵する条件下で測定した際、参照分子、例えばｈｕＩ
ＦＮＧ、所望によりグリコシル化型、例えば非コンジュゲート化ｈｕＩＦＮＧま
たはｒｈｕＩＦＮＧのものに比較して、統計的に有意に増加していることを示す
よう用いられる。

【００３８】 用語「免疫原性」は、既定の物質に関連して用いられる際、ヒト免疫系から反
応を誘導する物質の能力を示すよう意図される。免疫反応は、細胞または抗体仲
介反応であってもよい（免疫原性のさらなる定義に関しては、例えばＲｏｉｔｔ
： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版， Ｂｌａｃｋｗｅｌ
ｌ）を参照されたい）。

【００３９】 用語「減少した免疫原性」は、本発明のコンジュゲートが、匹敵する条件下で
測定した際、参照分子、例えばｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧより、測定可
能に低い免疫反応を生じることを示すよう意図される。

【００４０】 用語「ＩＦＮＧ活性を示す」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測
定した際、ＩＦＮＧ受容体に結合し、そしてその受容体のｈｕＩＦＮＧ結合に際
して伝達されるシグナルの伝達を引き起こす能力を含む、天然ＩＦＮＧ、特にｈ
ｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧの機能の１以上を、ポリペプチドが有すること
を示すよう意図される。ＩＦＮＧ受容体は、Ａｇｕｅｔら（Ｃｅｌｌ ５５：２
７３−２８０， １９８８）およびＣａｌｄｅｒｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：４８３７−４８４１， １９８８）
に記載されている。「ＩＦＮＧポリペプチド」はＩＦＮＧ活性を示すポリペプチ
ドであり、そして本明細書において、適切なように、単量体または二量体型のポ
リペプチドに関して用いられる。例えば、特定の置換が示される場合、これらは
通常、ＩＦＮＧポリペプチド単量体に比較して示される。本発明のコンジュゲー
トのＩＦＮＧ部分に言及される場合、これは通常、二量体型である（そしてすな
わち、例えば記載されるように修飾された２つのＩＦＮＧポリペプチド単量体を
含む）。ＩＦＮＧポリペプチドの二量体型は、２つの単量体の通常の関連によっ
て提供されてもよいし、または一本鎖二量体ＩＦＮＧポリペプチドの型であって
もよい。

【００４１】 本明細書に記載されるＩＦＮＧポリペプチドは、ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩ
ＦＮＧと同じ度合いの、あるいはより低いまたはより高いｉｎ ｖｉｖｏまたは
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生理活性、例えば同一条件下で測定した際、ｈｕＩＦＮＧまた
はｒｈｕＩＦＮＧのものの１−１００％のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ生理活性、例えばｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧのものの１−２５％また
は１−５０％または２５−１００％または５０−１００％のｉｎ ｖｉｖｏまた
はｉｎ ｖｉｔｒｏ生理活性を有する可能性がある。

【００４２】 用語「親ＩＦＮＧ」は、本発明にしたがって修飾しようとする分子を示すよう
意図される。通常、親ＩＦＮＧは、本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分
をコードするように、本発明にしたがって修飾された、ヌクレオチド配列にコー
ドされる。親ＩＦＮＧは、通常、ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧあるいはそ
れらの変異体または断片である。「変異体」は、親ポリペプチドと、１以上のア
ミノ酸残基、通常、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４または１５アミノ酸残基異なるポリペプチドである。断片は、ＩＦＮ
Ｇ活性を示す、全長ｈｕＩＦＮＧ配列の一部、例えばそのＣ末端またはＮ末端一
部切除型である。

【００４３】 用語「機能部位」は、ＩＦＮＧの機能または性能に必須であるかまたは別の方
式で関与する、１以上のアミノ酸残基を示すよう意図される。こうしたアミノ酸
残基は、機能部位に「位置する」。機能部位は、当該技術分野に知られる方法に
より、決定することが可能であり、そして好ましくは適切な受容体、例えばＩＦ
ＮＧ受容体に複合体化しているポリペプチドの構造の解析により、同定される。

【００４４】 本発明のコンジュゲート 上述のように、第一の側面において、本発明は、ＩＦＮＧ活性を示し、そして
ＩＦＮＧポリペプチドに共有結合した、少なくとも１つの第一の非ポリペプチド
部分を含み、該ポリペプチドが、前記の第一の非ポリペプチド部分のための付着
基を含む、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去さ
れたアミノ酸残基を持つことで親ＩＦＮＧポリペプチドのものと異なるアミノ酸
配列を含む、コンジュゲートに関する。

【００４５】 非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基を除去するかまたは導
入することにより、選択した非ポリペプチド部分に、よりコンジュゲート化しや
すいように、ポリペプチドを特異的に適応させ、コンジュゲート化パターンを最
適化し（例えば、ＩＦＮＧ分子の表面上の非ポリペプチド部分の最適分布を確実
にし）、そしてそれにより、ＩＦＮＧ活性を示し、そしてさらに、今日入手可能
なｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに基づく分子に比較した際、１以上の改善
された特性を示す、新規コンジュゲート分子を得ることが可能である。例えば、
付着基の導入により、ＩＦＮＧポリペプチドは、適切な非ポリペプチド部分が結
合する特定のアミノ酸残基の含量が増加するかまたは該含量が改変され、それに
より、より有効な、特異的なおよび／または大規模なコンジュゲート化が達成さ
れる。１以上の付着基の除去により、こうしたコンジュゲート化が、例えばポリ
ペプチドの機能部位にまたは該部位の近くに位置するアミノ酸残基に不都合であ
る場合（こうした部位でのコンジュゲート化は、損なわれた受容体認識のため、
生じたコンジュゲートの不活性化またはＩＦＮＧ活性の減少を生じる可能性があ
るため）、ポリペプチドの部分の非ポリペプチド部分へのコンジュゲート化を避
けることが可能である。さらに、別の付着基の近くに位置する付着基は、こうし
た基への不均一なコンジュゲート化を避けるため、除去することが好都合である
可能性がある。好ましい態様において、ＩＦＮＧポリペプチドの１より多いアミ
ノ酸残基が改変され、例えば改変は、選択した非ポリペプチド部分のための付着
基を含むアミノ酸残基の除去と共に導入を含む。本態様は、非ポリペプチド部分
への最適コンジュゲート化を得るようにＩＦＮＧポリペプチドを特異的に設計す
ることが可能である点で、特に興味深いとみなされる。

【００４６】 アミノ酸残基の除去および／または導入に加え、ポリペプチドは、非ポリペプ
チド部分のための付着基を含むアミノ酸残基の導入および／または除去に関連し
ない他の置換も含んでもよい。

【００４７】 本発明により修飾しようとする親ポリペプチドは、ＩＦＮＧ活性を持ついかな
るポリペプチドでもよく、そしてしたがって、いかなる起源、例えば非ヒト哺乳
動物起源由来であってもよいが、親ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に
示されるアミノ酸配列を持つｈｕＩＦＮＧあるいはその変異体または断片である
ことが好ましい。ｈｕＩＦＮＧの変異体の例は、上述の発明の背景に記載され、
そして例えばＵＳ ６，０４６，０３４に記載されるＮ末端付加ＣＹＣを持つｈ
ｕＩＦＮＧおよびシステイン修飾変異体が含まれる。断片の特定の例は、上述の
発明の背景項に開示されるものであり、そして１−１５アミノ酸残基、例えば１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１
５アミノ酸残基がＣ末端一部切除された、および／または１−３アミノ酸残基が
Ｎ末端一部切除された、ｈｕＩＦＮＧを含む。

【００４８】 親ＩＦＮＧポリペプチドが、ｈｕＩＦＮＧの変異体または断片である場合、こ
うした親から調製された修飾ＩＦＮＧポリペプチドは、親の突然変異または一部
切除を含むことが理解されるであろう。

【００４９】 また、親ＩＦＮＧポリペプチドは、ＩＦＮＧポリペプチド単量体および別の相
同ポリペプチド間のハイブリッド分子であってもよく、所望により、該ハイブリ
ッド分子に導入された１以上のさらなる置換を含む。こうしたハイブリッドは、
上述の発明の背景項に記載される。こうしたハイブリッド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と、１５より多く、例えば１０アミノ酸残基
より多く異なるアミノ酸配列を含んでもよい。本発明において有用であるため、
ハイブリッド分子はＩＦＮＧ活性を示す。

【００５０】 非ヒト親ＩＦＮＧは、本明細書に記載されるものと類似に、例えば、（例えば
ｈｕＩＦＮＧと前記非ヒト親ＩＦＮＧのアミノ酸配列または３Ｄ構造の並列から
決定されるように）本明細書に記載される位に対応する非ヒト親ＩＦＮＧの位を
修飾することによって、修飾してもよい。

【００５１】 除去されるまたは導入される、非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミ
ノ酸残基は、選択される非ポリペプチド部分の性質に基づき、大部分の例では、
用いようとするコンジュゲート化法に基づき、選択されることが理解されるであ
ろう。例えば、非ポリペプチド部分が、例えばポリエチレングリコールまたはポ
リアルキレンオキシド由来分子などのポリマー分子である場合、付着基として機
能することが可能なアミノ酸残基は、システイン、リジン、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸およびアルギニンからなる群より選択される可能性がある。非ポリペ
プチド部分が糖部分である場合、付着基は、ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位、
好ましくはＮグリコシル化部位である。

【００５２】 非ポリペプチド部分のための付着基が、本発明にしたがい、ＩＦＮＧポリペプ
チドに導入されるかまたは該ポリペプチドから除去される場合は常に、修飾され
るポリペプチドの位は、都合よくは、以下のように選択される： 該位は、所望によりさらに１つまたは２つのＩＦＮＧ受容体分子を含む、二量
体型のＩＦＮＧの３Ｄ構造またはモデルに基づいて決定されるように、好ましく
は、ＩＦＮＧポリペプチドの表面に位置し、そしてより好ましくは、側鎖の２５
％以上が溶媒に曝露されるアミノ酸残基に占められ、好ましくは、側鎖の５０％
以上が溶媒に曝露される。こうした位（例えば受容体分子を含まないまたは含む
モデルにおいて、２５％以上または５０％以上の表面曝露に相当する）は、本明
細書中の材料および方法項に列挙される。

【００５３】 やはり興味深いのは、親ＩＦＮＧの２３のＣ末端アミノ酸残基のいずれかを修
飾する（非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基の導入および／
または除去による）ことである。これはこうした残基が、ＩＦＮＧポリペプチド
の表面に位置すると考えられるためである。

【００５４】 さらに、本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分において、ＩＦ
ＮＧの受容体結合部位に位置する付着基は、好ましくはこうした基を含むアミノ
酸残基の置換により、好ましくは除去されている。ＩＦＮＧ受容体結合部位のア
ミノ酸残基は、以下の材料および方法項に同定される。一本鎖ＩＦＮＧポリペプ
チドの場合、ただ１つの単量体の受容体結合部位の付着基を除去し、そしてそれ
により、１つの活性および１つの不活性受容体結合部位を持つ一本鎖ＩＦＮＧポ
リペプチドコンジュゲートを得ることで十分である可能性がある。

【００５５】 付着基の最適分布を決定するため、ＩＦＮＧポリペプチドの表面に位置するア
ミノ酸残基間の距離を、ＩＦＮＧ二量体ポリペプチドの３Ｄ構造に基づき計算す
る。より具体的には、こうした付着基を含むアミノ酸残基のＣＢ間の距離、また
は付着基を含む一方のアミノ酸残基の官能基（リジンではＮＺ、アスパラギン酸
ではＣＧ、グルタミン酸ではＣＤ、システインではＳＧ）および他方のアミノ酸
残基のＣＢ間の距離を決定する。グリシンの場合、ＣＡはＣＢの代わりに用いら
れる。本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分において、前記距離
のいずれも、不均一なコンジュゲート化を避けるため、または減少させるため、
好ましくは８Å以上、特に１０Å以上である。

【００５６】 また、ＩＦＮＧポリペプチドのアミノ酸配列は、エピトープを破壊するかまた
は不活性化するように、エピトープの部分を構成する１以上のアミノ酸残基が、
好ましくは非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基への置換によ
り除去されていることで、親ＩＦＮＧポリペプチドのものと異なってもよい。ｈ
ｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧのエピトープは、エピトープマッピングとして
も知られる、当該技術分野に知られる方法の使用によって、同定することが可能
である。例えば、Ｒｏｍａｇｎｏｌｉら， Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９９，
３８０（５）：５５３−９， ＤｅＬｉｓｓｅｒ ＨＭ， Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９９， ９６：１１−２０， Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔ
ｅｒら， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ， １９９７
， ８５（３）：２２９−３５， Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ ＪＭ， Ｔｏｘｉｃ
ｏｌｏｇｙ， １９９７， １１９（１）：７７−８１、並びにＬａｎｅ ＤＰ
およびＳｔｅｐｈｅｎ ＣＷ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９
９３， ５（２）：２６８−７１を参照されたい。１つの方法は、例えば９アミ
ノ酸残基のランダムオリゴペプチドを発現するファージディスプレイライブラリ
ーを確立することである。ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに向けられる特異
的抗血清由来のＩｇＧ１抗体を、免疫沈降により精製し、そして反応性ファージ
をイムノブロッティングにより同定する。精製された反応性ファージのＤＮＡを
配列決定することにより、オリゴペプチドの配列を決定することが可能であり、
その後、ＩＦＮＧの３Ｄ構造上の配列の局在を決定することが可能である。これ
により同定される構造上の領域はエピトープを構成し、これをその後、非ポリペ
プチド部分のための付着基導入のための標的領域として選択してもよい。

【００５７】 親ＩＦＮＧ分子の構造および機能をあまり破壊することを避けるため、本発明
にしたがい改変されるアミノ酸残基の総数（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示される
アミノ酸配列に比較した際）は、典型的には、１５を越えない。好ましくは、Ｉ
ＦＮＧポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と１−
１５アミノ酸残基、例えば１−８または２−８アミノ酸残基、例えばＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列と１−５または２−５アミノ酸残基異なる
、アミノ酸配列を含む。したがって、通常、ＩＦＮＧポリペプチドは、配列番号
２に示されるアミノ酸配列の成熟部分と１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基異なるアミノ酸配列を含
む。好ましくは、上記の数は、適切な非ポリペプチド部分のための付着基を含む
導入されたアミノ酸残基の総数または除去されたアミノ酸残基の総数、あるいは
こうした基を含む導入されたおよび除去されたアミノ酸残基の総数いずれかを表
す。

【００５８】 コンジュゲート化に利用可能であり、そして二量体型のＩＦＮＧポリペプチド
に存在する付着基の正確な数は、コンジュゲート化により達成されることが望ま
しい効果に依存する。得られる効果は、例えば、コンジュゲート化の性質および
度合い（例えば非ポリペプチド部分の同一性、ポリペプチドにコンジュゲート化
するのが望ましいかまたは可能である非ポリペプチド部分の数、コンジュゲート
化させるべき場所またはコンジュゲート化を避けるべき場所など）に依存する。

【００５９】 本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分は、一部切除型（例えば
親ＩＦＮＧポリペプチドと関連して、さらに上述されるように、１−１５のＣ末
端アミノ酸残基の一部切除、または１−３のＮ末端アミノ酸残基の一部切除）で
あってもよい。

【００６０】 機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、例えばコンジュゲートの分子量および増加し
た半減期を提供するのに必要な付着基の数に依存し、したがって問題の非ポリペ
プチド部分の分子量に依存する。１つの態様において、本発明のコンジュゲート
は、Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ ２２７（１９７０
）， ｐ６８０−８５にしたがったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される際、少な
くとも６７ｋＤａ、特に少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する。ＩＦＮＧは、
約３４−５０ｋＤａの範囲の分子量を有し、そしてしたがって、望ましい効果を
得るのに、さらに約２０−４０ｋＤａが必要とされる。これは、例えば、２−４
の１０ｋＤａ ＰＥＧ分子により、または本明細書に別に記載されるように、提
供することが可能である。

【００６１】 本発明のコンジュゲートにおいて、すべてのコンジュゲート化可能付着基の少
なくとも約５０％、例えば少なくとも約８０％、そして好ましくはすべてのこう
した基が適切な非ポリペプチド部分に占められることが好ましい。したがって、
好ましい態様において、本発明のコンジュゲートは、例えば１−１０の非ポリペ
プチド部分、例えば２−８または３−６を含む。

【００６２】 上述のように、生理学的条件下では、ＩＦＮＧは、二量体ポリペプチドとして
存在する。本発明にしたがい、本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド
部分は、通常、ホモ二量体型（例えば本明細書に記載されるように調製される２
つのＩＦＮＧポリペプチド分子の会合によって調製される）にある。しかし、望
ましい場合、本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分は、一本鎖型
で提供してもよく、ここで２つのＩＦＮＧポリペプチド単量体は、ペプチド結合
またはペプチドリンカーを介して連結される。一本鎖型のＩＦＮＧポリペプチド
を提供すると、２つの構成要素ＩＦＮＧポリペプチドが異なる可能性があるとい
う利点があり、これは例えばポリペプチドの非対称性突然変異誘発を可能にする
のに好適である可能性がある。例えば、ＰＥＧ化部位は、単量体の１つの受容体
結合部位から除去するが、他方では保持することが可能である。それにより、Ｐ
ＥＧ化後、１つの単量体が損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）受容体結合部位を
有し、一方、他方は完全にＰＥＧ化されている（そしてしたがって有意に増加し
た分子量を提供する）ことが可能である。

【００６３】 好ましくは、本発明のコンジュゲートは、１以上の以下の改善された特性を有
する：１）ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに比較した際、増加した機能的ｉ
ｎ ｖｉｖｏ半減期、例えば少なくとも約５倍、例えば少なくとも１０倍または
それ以上の増加。２）ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに比較した際、減少し
た免疫原性、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、そして最も好
ましくは少なくとも７５％の減少。

【００６４】 非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明のコンジュゲート 本発明のコンジュゲートの好ましい態様において、第一の非ポリペプチド部分
は、糖部分、例えばＯ連結またはＮ連結糖部分であり、そしてＩＦＮＧポリペプ
チドは、少なくとも１つの除去されたおよび／または少なくとも１つの導入され
たｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位を含む。

【００６５】 例えば、ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位は、親ＩＦＮＧ分子の、分子表面に
曝露される、好ましくは側鎖の２５％以上が溶媒に曝露される、特に５０％以上
が溶媒に曝露される、アミノ酸残基に占められる位に導入される（これらの位は
、本明細書中の方法項に同定される）。Ｎグリコシル化部位は、前記部位のＮ残
基が前記位に位置する方式で導入される。同様に、Ｏグリコシル化部位は、こう
した部位を構成するＳまたはＴ残基が前記位に位置するように導入される。さら
に、十分なグリコシル化を確実にするため、ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位、
特にＮグリコシル化部位のＮ残基あるいはＯグリコシル化部位のＳまたはＴ残基
が、ＩＦＮＧポリペプチドの１１８のＮ末端アミノ酸残基内、より好ましくは９
３のＮ末端アミノ酸残基内に位置することが好ましい。さらにより好ましくは、
ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位は、該部位を生成するのにただ１つの突然変異
が必要とされる位に導入される（すなわち機能するグリコシル化部位を生成する
のに必要とされる他のアミノ酸残基のいずれも、該分子にすでに存在する場所）
。

【００６６】 例えば、ＩＦＮＧポリペプチドの表面に曝露され、そして側鎖の２５％以上が
表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位（受容体分子を含む構造において
）での、さらなるＮグリコシル化部位の導入につながる置換には：

【００６７】

【化３】 が含まれ、該置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕ
ＩＦＮＧに比較して示される。Ｓ／Ｔは、セリンまたはスレオニン残基、好まし
くはスレオニン残基への置換を示す。

【００６８】 ＩＦＮＧポリペプチドの表面に曝露され、側鎖の５０％以上が表面に曝露され
る位（受容体分子を含む構造において）での、さらなるＮグリコシル化部位の導
入につながる置換には：

【００６９】

【化４】 が含まれ、該置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕ
ＩＦＮＧに比較して示される。

【００７０】 Ｎグリコシル化部位の導入に、１つのアミノ酸突然変異のみが必要とされる置
換には、Ｋ１２Ｓ／Ｔ、Ｇ１８Ｓ／Ｔ、Ｇ１８Ｎ、Ｋ３７Ｓ／Ｔ、Ｅ３８Ｎ、Ｍ
４５Ｎ、Ｉ４９Ｎ、Ｋ６１Ｓ／Ｔ、Ｄ６３Ｎ、Ｑ６７Ｎ、Ｖ７０Ｎ、Ｋ８０Ｓ／
Ｔ、Ｆ８２Ｎ、Ｎ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ８７Ｓ／Ｔ、Ｋ９４Ｎ、Ｓ９９Ｎ、Ｑ１０６Ｓ
／Ｔ、Ｅ１１９Ｎ、Ａ１２４Ｎ、Ｋ１３０ＮおよびＲ１４０Ｎ、特にＫ１２Ｓ／
Ｔ、Ｇ１８Ｎ、Ｇ１８Ｓ／Ｔ、Ｋ３７Ｓ／Ｔ、Ｅ３８Ｎ、Ｋ６１Ｓ／Ｔ、Ｄ６３
Ｎ、Ｑ６７Ｎ、Ｋ８０Ｓ／Ｔ、Ｎ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ９４Ｎ、Ｓ９９Ｎ、Ｑ１０６Ｓ
／Ｔ、Ａ１２４Ｎ、Ｋ１３０ＮおよびＲ１４０Ｎ（側鎖の２５％以上が表面に曝
露される位（受容体分子を含まない構造において））、またはより好ましくは、
Ｇ１８Ｎ、Ｅ３８Ｎ、Ｄ６３Ｎ、Ｑ６７Ｎ、Ｋ９４Ｎ、Ｓ９９Ｎ、Ａ１２４Ｎ、
Ｋ１３０ＮおよびＲ１４０Ｎ（受容体分子を含まない構造において、側鎖の５０
％以上が表面に曝露される位）が含まれる。

【００７１】 上記リストの置換の中で、１１８のＮ末端アミノ酸残基中、特に９３のＮ末端
アミノ酸残基中に位置する置換を選択することが好ましい。 上に示されるように、１以上の導入されたグリコシル化部位に加え、現存する
グリコシル化部位を、ＩＦＮＧポリペプチドから除去していてもよい。例えば、
上に列挙される、グリコシル化部位を導入する置換のいずれを、ｈｕＩＦＮＧの
２つの天然Ｎグリコシル化部位のいずれかを除去する置換と組み合わせてもよい
。例えば、ＩＦＮＧポリペプチドは、本発明のコンジュゲートが、付着基として
Ｋ、Ｃ、Ｄ、Ｅの適切なものを有する非ポリペプチド部分を含む場合、Ｎ２５お
よび／またはＮ９７の置換、例えば置換Ｎ２５Ｋ／Ｃ／Ｄ／Ｅおよび／またはＮ
９７Ｋ／Ｃ／Ｄ／Ｅの１つを含んでもよい。

【００７２】 本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分は、単量体当たり、単一
のｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位を含む可能性がある。しかし、機能的ｉｎ
ｖｉｖｏ半減期を増加させるのに十分な大きさになるため、ポリペプチドが、１
より多いｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部位、特に２−７のｉｎ ｖｉｖｏグリコ
シル化部位、例えば２、３、４、５、６または７のｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化
部位を含むことがしばしば望ましい。したがって、ＩＦＮＧポリペプチドは、好
ましくは上記リストのいずれかに記載される１以上の置換により導入される、単
量体当たり１つのさらなるグリコシル化部位を含んでもよいし、あるいは、２、
３、４、５、６、７またはそれ以上の導入されたｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化部
位を含んでもよい。

【００７３】 ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化部位の除去および／または導入は、ポリマー付
着部位を導入するおよび／または除去するＩＦＮＧポリペプチドの修飾に関する
続く項に記載されるように、達成することが可能である。

【００７４】 導入されたおよび／または除去された、少なくとも１つのグリコシル化部位を
有する、本項に開示されるグリコシル化ＩＦＮＧポリペプチドのいずれを、第二
の非ポリペプチド部分に、さらにコンジュゲート化してもよい。例えば、第二の
非ポリペプチド部分は、ＰＥＧなどのポリマー分子、または他の非ポリペプチド
部分のいずれであってもよい。この目的のため、コンジュゲート化は、ＩＦＮＧ
ポリペプチドにすでに存在する付着基の使用により、達成してもよいし、あるい
は、特に総数１−６、特に３−４あるいは１、２、３、４、５、または６の付着
基がコンジュゲート化に利用可能であるように、付着基を導入しそして／または
除去していてもよい。好ましくは、ＩＦＮＧポリペプチドが２つのグリコシル化
部位を含む、本発明のコンジュゲートにおいて、非ポリペプチド部分の数および
分子量は、非ポリペプチド部分を加えた総分子量が、２０−４０ｋＤａの範囲、
特に約２０ｋＤａまたは３０ｋＤａであるように、選択される。

【００７５】 特に、グリコシル化ＩＦＮＧポリペプチドは、付着基としてシステインを有す
るポリマーにコンジュゲート化してもよい。この目的のため、例えば「非ポリペ
プチド部分が、付着基としてシステインを有する分子である、本発明のコンジュ
ゲート」と題される項に記載されるように、ＩＦＮＧポリペプチドに１以上のシ
ステイン残基を挿入する。

【００７６】 あるいはまたはさらに、グリコシル化ＩＦＮＧポリペプチドは、付着基として
リジンを有するポリマーにコンジュゲート化してもよい。この目的のため、例え
ば「非ポリペプチド部分が、付着基としてリジンを有する分子である、本発明の
コンジュゲート」と題される項に言及される置換のいずれかによって、親ポリペ
プチドの１以上のシステイン残基を除去してもよい。あるいはまたはさらに、リ
ジン残基は、例えば前記項に言及される置換のいずれかによって、導入してもよ
い。

【００７７】 システインまたはリジン基を介したポリマーコンジュゲート化の代替法として
、コンジュゲート化は、「非ポリペプチド部分が酸基に結合する、本発明のコン
ジュゲート化」と題される項に記載されるように、酸基を介して、達成してもよ
い。

【００７８】 第一の非ポリペプチド部分がポリマーである、本発明のコンジュゲート 代替態様において、第一の非ポリペプチド部分はポリマー、例えば「ポリマー
分子へのコンジュゲート化」と題される項に記載されるもののいずれか、特に直
鎖または分枝ＰＥＧ分子、例えば付着基としてシステイン、リジン、アスパラギ
ン酸およびグルタミン酸を有するものである。こうしたポリマーのための付着基
の導入および／または除去は、以下の項に例示される。本態様にしたがったコン
ジュゲートのＩＦＮＧポリペプチド部分は、例えばｈｕＩＦＮＧの天然Ｎグリコ
シル化部位の１つまたは両方、あるいは直前の項に記載されるように導入された
グリコシル化部位を用いた、グリコシル化ポリペプチドであってもよい。

【００７９】 非ポリペプチド部分が、付着基としてシステインを有する、本発明のコンジ ュゲート 好ましい態様において、第一の非ポリペプチド部分は、付着基としてシステイ
ンを有するポリマーであり、そして少なくとも１つのシステイン残基が、野生型
ヒトＩＦＮＧにおいて、表面に曝露されるアミノ酸残基に占められるＩＦＮＧポ
リペプチドの位に導入されている。好ましくは、システイン残基は、「本発明の
コンジュゲート」と題される項に提供される非ポリペプチド部分ための付着基を
導入するおよび／または除去するための一般的な考慮にしたがって、導入される
。例えば、ＩＦＮＧポリペプチドは、Ｐ３Ｃ、Ｋ６Ｃ、Ｎ１０Ｃ、Ｋ１３Ｃ、Ｎ
１６Ｃ、Ｄ２１Ｃ、Ｎ２５Ｃ、Ｇ２６Ｃ、Ｇ３１Ｃ、Ｋ３４Ｃ、Ｋ３７Ｃ、Ｅ３
８Ｃ、Ｅ３９Ｃ、Ｋ５５Ｃ、Ｋ５８Ｃ、Ｎ５９Ｃ、Ｄ６２Ｃ、Ｑ６４Ｃ、Ｓ６５
Ｃ、Ｋ６８Ｃ、Ｅ７１Ｃ、Ｅ７５Ｃ、Ｎ８３Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｋ８６Ｃ、Ｋ８７Ｃ
、Ｋ９４Ｃ、Ｎ９７Ｃ、Ｓ９９Ｃ、Ｔ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１０３Ｃおよび
Ｎ１０４Ｃ（受容体を含む構造において、５０％以上の側鎖が表面に曝露される
アミノ酸残基に占められる位でのシステイン残基の導入）からなる群より選択さ
れる、少なくとも１つの置換を含んでもよい。Ｎ２５およびＮ９７は、ｈｕＩＦ
ＮＧの固有のグリコシル化部位の一部を構成するため、ＩＦＮＧポリペプチドが
非グリコシル化宿主細胞、例えば大腸菌で発現される際、置換Ｎ２５ＣおよびＮ
９７Ｃ、そして特にＮ２５Ｃ＋Ｎ９７Ｃが特に好ましい。

【００８０】 やはりまたはあるいは、本態様にしたがったＩＦＮＧポリペプチドは、ｈｕＩ
ＦＮＧのアミノ酸残基１２１−１４３のいずれかに占められる位に導入される、
少なくとも１つのシステイン残基を含んでもよい。

【００８１】 好ましくは、本側面にしたがったコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチドは、
単量体当たり総数１−８、例えば２−６のＣｙｓ残基、例えば１−３のＣｙｓ残
基を含む。

【００８２】 ポリペプチドおよびポリマーの間のコンジュゲート化は、いかなる適切な方式
で、例えば「ポリマー分子へのコンジュゲート化」と題される項に記載されるよ
うに、例えば前記項に言及された一工程法を用いるかまたは段階的方式で、達成
することが可能である。コンジュゲートが２つ以上の第一の非ポリペプチド部分
を含む場合、通常、これらの各々は、５または１０ｋＤａの分子量を有する。適
切なポリマーはＶＳ−ＰＥＧである。

【００８３】 非ポリペプチド部分が、付着基としてリジンを有する分子である、本発明の コンジュゲート 本態様にしたがい、非ポリペプチド部分は、付着基としてリジンを有するポリ
マーであり、そしてＩＦＮＧポリペプチドは、少なくとも１つのリジン残基が除
去されていることで野生型ヒトＩＦＮＧのものと異なり、該リジン残基は、Ｋ６
、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ３４、Ｋ３７、Ｋ４３、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｋ６１、Ｋ６８
、Ｋ７４、Ｋ８０、Ｋ８６、Ｋ８７、Ｋ８８、Ｋ９４、Ｋ１０８、Ｋ１２５、Ｋ
１２８およびＫ１３０からなる群より選択され、番号付けはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
２に比較して行われるものである。より好ましくは、Ｋ１２、Ｋ３４、Ｋ３７
、Ｋ１０８、Ｋ１２８およびＫ１３０からなる群より選択される少なくとも１つ
のリジン残基が除去される。これにより、この／これらの残基のコンジュゲート
化を回避することが可能である。リジン残基（類）は、いかなる他のアミノ酸残
基と置換してもよいが、好ましくはアルギニンまたはグルタミンにより置換され
る。

【００８４】 さらに、ＩＦＮＧポリペプチドは、特に、表面に曝露されるアミノ酸残基に占
められるｈｕＩＦＮＧの位において、導入された１以上のリジン残基を有するよ
う修飾してもよい。好ましくは、リジン残基は、特に少なくとも２５％、例えば
少なくとも５０％の側鎖が表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位（こう
した位は本明細書の材料および方法項に同定される）において、「本発明のコン
ジュゲート」と題される項に提供される非ポリペプチド部分のための付着基を導
入するおよび／または除去することに関する一般的な考慮にしたがって導入され
る。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２のアミノ酸残基１２１−１４３のいずれの置
換によって、少なくとも１つのリジン残基が導入されてもよい。あるいは、ＩＦ
ＮＧポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２のＤ２、Ｅ７、Ｅ９、Ｈ１９、Ｄ
２１、Ｄ２４、Ｎ２５、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｄ４１、Ｒ４２、Ｄ６２、Ｄ６３、Ｅ
７１、Ｅ７５、Ｄ７６、Ｒ８９、Ｄ９０、Ｄ９１、Ｅ９３、Ｎ９７、Ｒ１０７、
Ｈ１１１、Ｅ１１２、Ｅ１１９、Ｒ１２９、Ｒ１３１、Ｒ１３７、Ｒ１３９およ
びＲ１４０（ｈｕＩＦＮＧにおいてＮ、Ｒ、Ｄ、ＥまたはＨ残基に占められる位
）からなる群より選択される少なくとも１つの位にリジンを含んでもよい。

【００８５】 本態様にしたがい、ＩＦＮＧポリペプチドは、単量体当たり上述の位の１以上
、特に１−１５、例えば１−８または２−８、好ましくは１−５または２−５の
位に置換を含む。例えば、ＩＦＮＧポリペプチドは、上述の位の１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に置換を含ん
でもよい。Ｎ２５およびＮ９７は、ｈｕＩＦＮＧの固有のグリコシル化部位の一
部を構成するため、ＩＦＮＧポリペプチドが非グリコシル化宿主細胞、例えば大
腸菌で発現される際、置換Ｎ２５ＫおよびＮ９７Ｋ、そして特にＮ２５Ｋ＋Ｎ９
７Ｋが特に好ましい。

【００８６】 例えば、本態様にしたがったコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプチドは、上に
定義されるようなリジン残基を除去する少なくとも１つの置換（好ましくはＲま
たはＱへの置換）と組み合わせた、リジン残基の導入のための上述の置換の少な
くとも１つを含んでもよい。例えば、ＩＦＮＧポリペプチドは、置換Ｋ１２８Ｒ
、Ｋ１２８Ｑ、Ｋ１３０ＲおよびＫ１３０Ｑの少なくとも１つと組み合わせた以
下の置換Ｎ２５ＫおよびＮ９７Ｋの少なくとも１つを含む。さらにより具体的に
は、ＩＦＮＧポリペプチドは、置換Ｎ２５Ｋ＋Ｋ１２８Ｒ、Ｎ２５Ｋ＋Ｋ１３０
Ｒ、Ｎ２５Ｋ＋Ｋ１２８Ｒ＋Ｋ１３０Ｒ、Ｎ９７Ｋ＋Ｋ１２８Ｒ、Ｎ９７Ｋ＋Ｋ
１３０Ｒ、Ｎ９７Ｋ＋Ｋ１２８Ｒ＋Ｋ１３０Ｒ、Ｎ２５Ｋ＋Ｎ９７Ｋ＋Ｋ１２８
Ｒ＋Ｋ１３０Ｒ、Ｎ２５Ｋ＋Ｎ９７Ｋ＋Ｋ１２８ＲおよびＮ２５Ｋ＋Ｎ９７Ｋ＋
Ｋ１３０Ｒを含む。

【００８７】 本発明の本側面にしたがったコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、既定の
コンジュゲート化法を用いた際、付着基としてリジンを有するいかなる分子（例
えば糖部分、親油性基または有機誘導体化剤）であってもよいが、非ポリペプチ
ド部分がポリマー分子であることが好ましい。ポリマー分子は、「ポリマー分子
へのコンジュゲート化」と題される項に言及される分子のいずれかであってもよ
いが、好ましくは、直鎖または分枝ポリエチレングリコールまたはポリアルキレ
ンオキシドからなる群より選択される。最も好ましくは、ポリマー分子は、Ｓｈ
ｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ＩｎｃのＳＳ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥ
Ｇ、アルデヒド−ＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ｍＰＥＧ−Ｂ
ＴＣ、Ｅｎｚｏｎ， Ｉｎｃ．のＳＣ−ＰＥＧ、ＵＳ ５，８８０，２５５に記
載されるようなトレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ｍＰＥＧ、またはオキシカ
ルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド−ＰＥＧ（ＵＳ ５，１２２，６１
４）である。通常、リジン残基へのコンジュゲート化に関しては、非ポリペプチ
ド部分は、約５または１０ ｋＤａの分子量を有する。

【００８８】 非ポリペプチド部分が酸基に結合する、本発明のコンジュゲート さらなる態様において、本発明のコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、付
着基として酸基を有する分子であり、そしてＩＦＮＧポリペプチドは、好ましく
は「本発明のコンジュゲート」と題される項に提供される一般的な考慮にしたが
い、少なくとも１つの表面に曝露されるアミノ酸残基がアスパラギン酸残基また
はグルタミン酸残基と置換されていることでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に示される
アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。あるいは、親ＩＦＮＧポリペプチド
のＫ、Ｒ、ＱまたはＮに占められる位に、ＡｓｐまたはＧｌｕ残基を導入しても
よい。例えば、Ｎ２５、Ｎ９７、Ｋ１２５、Ｋ１２８、Ｒ１２９、Ｋ１３０およ
び／またはＲ１３１、より好ましくはＮ２５および／またはＮ９７、最も好まし
くはＮ２５＋Ｎ９７がＡｓｐまたはＧｌｕ残基で置換されてもよい。

【００８９】 先の項に記載されるのと同様に、非ポリペプチド部分が、これらの残基に結合
するものである場合、例えば受容体結合部位から、１以上のＡｓｐまたはＧｌｕ
残基を除去してもよい。

【００９０】 本発明の本側面にしたがった、付着基として酸基を有するコンジュゲートの非
ポリペプチド部分は、こうした特性を持ついかなる非ポリペプチド部分であって
もよいが、非ポリペプチド部分が、ポリマー分子または有機誘導体化剤、特にポ
リマー分子であり、そしてコンジュゲートが、例えばＳａｋａｎｅおよびＰａｒ
ｄｒｉｄｇｅ， Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．
１４， Ｎｏ．８， １９９７， ｐｐ １０８５−１０９１に記載されるよう
に、調製されることが現在好ましい。

【００９１】 本発明のコンジュゲートの非ポリペプチド部分 上にさらに示されるように、本発明のコンジュゲートの非ポリペプチド部分は
、好ましくは、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（ｉｎ ｖｉｖｏグリコシ
ル化による）および有機誘導体化剤からなる群より選択される。これらの剤はす
べて、コンジュゲートのポリペプチド部分に、望ましい特性、特に、増加した機
能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期および／または減少した免疫原性を与える可能性があ
る。コンジュゲートのポリペプチド部分は、通常、ただ一種類の非ポリペプチド
部分にコンジュゲート化するが、また、２種類以上の非ポリペプチド部分、例え
ばポリマー分子および糖部分、親油性基および糖部分、有機誘導体化剤および糖
部分、親油性基およびポリマー分子などにコンジュゲート化してもよい。２以上
の異なる非ポリペプチド部分へのコンジュゲート化は、同時にまたは連続して行
ってもよい。

【００９２】 本発明のコンジュゲートを調製する方法 以下の項、「親油性化合物へのコンジュゲート化」、「ポリマー分子へのコン
ジュゲート化」、「糖部分へのコンジュゲート化」および「有機誘導体化剤への
コンジュゲート化」において、特定の種類の非ポリペプチド部分へのコンジュゲ
ート化が記載される。

【００９３】 親油性化合物へのコンジュゲート化 ポリペプチドおよび親油性化合物は、直接またはリンカーの使用により、互い
にコンジュゲート化させることが可能である。親油性化合物は、飽和または不飽
和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテ
ノイドまたはステロイドなどの天然化合物、あるいは１以上のアルキル、アリー
ル、アルケニルまたは他の多不飽和化合物と、カルボン酸、アルコール、アミン
およびスルホン酸などの合成化合物であってもよい。所望によりリンカーを通じ
た、ポリペプチドおよび親油性化合物間のコンジュゲート化は、当該技術分野に
知られる方法にしたがい、例えばＢｏｄａｎｓｚｋｙにより、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク， １９７６に
、そしてＷＯ ９６／１２５０５に記載されるように、行ってもよい。

【００９４】 ポリマー分子へのコンジュゲート化 ポリペプチドにカップリングさせるポリマー分子は、いかなる適切なポリマー
分子、例えば天然または合成ホモポリマーまたはヘテロポリマーであってもよく
、典型的には３００−１００，０００Ｄａ、例えば３００−２０，０００Ｄａの
範囲、より好ましくは５００−１０，０００Ｄａの範囲、さらにより好ましくは
５００−５０００Ｄａの範囲の分子量を持つ。

【００９５】 ホモポリマーの例には、ポリオール（すなわちポリＯＨ）、ポリアミン（すな
わちポリＮＨ₂）およびポリカルボン酸（すなわちポリＣＯＯＨ）が含まれる。
ヘテロポリマーは、１以上の異なるカップリング基、例えばヒドロキシル基およ
びアミン基を含む、ポリマーである。

【００９６】 適切なポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリ
プロピレングリコール（ＰＰＧ）などのポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）を
含むポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、分枝ＰＥＧ類、ポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリエチレン
−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、カルボキシメチル
−デキストランを含むデキストラン、あるいは免疫原性を減少させるのに、そし
て／または機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期および／または血清半減期を増加させる
のに適した他のバイオポリマーいずれかからなる群より選択されるポリマー分子
が含まれる。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タ
ンパク質である。一般的に、ポリアルキレングリコール由来ポリマーは、生体適
合性で、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、多様な水可溶性特性を有し、そ
して生存生物から容易に排出される。

【００９７】 ＰＥＧは、例えばデキストランなどの多糖、およびそれらに匹敵するものに比
較し、架橋が可能な反応基をわずかにしか含まないため、使用が好ましいポリマ
ー分子である。特に、単官能ＰＥＧ、例えばモノメトキシポリエチレングリコー
ル（ｍＰＥＧ）は、そのカップリング化学反応が比較的単純である（ポリペプチ
ド上の付着基とのコンジュゲート化に、１つの反応基しか利用可能でない）ため
、興味深い。その結果、架橋のリスクが排除され、生じたポリペプチドコンジュ
ゲートは、より均質であり、そしてポリペプチドとポリマー分子の反応が、より
調節しやすい。

【００９８】 ポリペプチドへのポリマー分子（類）の共有結合を達成するため、ポリマー分
子のヒドロキシル端基は、活性化型で、すなわち反応性官能基を持って、提供さ
れなければならない（この例には、第一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオ
ール、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スク
シンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルプロピオネート（Ｓ
ＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、炭酸ベンゾトリア
ゾール（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニ
トロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）、およびトレシレート（ＴＲＥＳ）が含ま
れる）。適切に活性化されたポリマー分子が、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．、米国アラバマ州ハンツビルより商業的に入手可能
である。あるいは、ポリマー分子は、当該技術分野に知られる慣用法により、例
えばＷＯ ９０／１３５４０に開示されるように、活性化させることが可能であ
る。本発明で使用するための活性化直鎖または分枝ポリマー分子の特定の例は、
Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ． １９９７および２００
０カタログ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ， Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａ
ｔｉｖｅｓ、本明細書に援用される）に記載される。活性化ＰＥＧポリマーの特
定の例には、以下の直鎖ＰＥＧ類：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えばＳＰＡ−ＰＥＧ、Ｓ
ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥ
Ｇ、ＳＧ−ＰＥＧ、およびＳＣＭ−ＰＥＧ）、並びにＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ
−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥ
Ｇ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、お
よびＭＡＬ−ＰＥＧ、並びに分枝ＰＥＧ類、例えばＰＥＧ２−ＮＨＳ、並びにど
ちらも本明細書に援用されるＵＳ ５，９３２，４６２およびＵＳ ５，６４３
，５７５に開示されるものが含まれる。さらに、本明細書に援用される以下の刊
行物は、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化化学反応を開示する：ＵＳ
５，８２４，７７８、ＵＳ ５，４７６，６５３、ＷＯ ９７／３２６０７、
ＥＰ ２２９，１０８、ＥＰ ４０２，３７８、ＵＳ ４，９０２，５０２、Ｕ
Ｓ ５，２８１，６９８、ＵＳ ５，１２２，６１４、ＵＳ ５，２１９，５６
４、ＷＯ ９２／１６５５５、ＷＯ ９４／０４１９３、ＷＯ ９４／１４７５
８、ＷＯ ９４／１７０３９、ＷＯ ９４／１８２４７、ＷＯ ９４／２８０２
４、ＷＯ ９５／００１６２、ＷＯ ９５／１１９２４、ＷＯ ９５／１３０９
０、ＷＯ ９５／３３４９０、ＷＯ ９６／０００８０、ＷＯ ９７／１８８３
２、ＷＯ ９８／４１５６２、ＷＯ ９８／４８８３７、ＷＯ ９９／３２１３
４、ＷＯ ９９／３２１３９、ＷＯ ９９／３２１４０、ＷＯ ９６／４０７９
１、ＷＯ ９８／３２４６６、ＷＯ ９５／０６０５８、ＥＰ ４３９ ５０８
、ＷＯ ９７／０３１０６、ＷＯ ９６／２１４６９、ＷＯ ９５／１３３１２
、ＥＰ ９２１ １３１、ＵＳ ５，７３６，６２５、ＷＯ ９８／０５３６３
、ＥＰ ８０９ ９９６、ＵＳ ５，６２９，３８４、ＷＯ ９６／４１８１３
、ＷＯ ９６／０７６７０、ＵＳ ５，４７３，０３４、ＵＳ ５，５１６，６
７３、ＥＰ ６０５ ９６３、ＵＳ ５，３８２，６５７、ＥＰ ５１０ ３５
６、ＥＰ ４００ ４７２、ＥＰ １８３ ５０３およびＥＰ １５４ ３１６
。

【００９９】 ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲート化は、慣用法いずれ
かを用いて、例えば、以下の参考文献（ポリマー分子の活性化に適した方法もま
た記載する）に記載されるように行う：ＨａｒｒｉｓおよびＺａｌｉｐｓｋｙ監
修， Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＡＺＣ， ワシン
トン； Ｒ．Ｆ． Ｔａｙｌｏｒ，（１９９１）， “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍ
ｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ． Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ”， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ニューヨーク； Ｓ．Ｓ．
Ｗｏｎｇ，（１９９２）， “Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ．”， ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ， ボカラトン； Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，（１９９３），
“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク。当業者は、用
いられる活性化法および／またはコンジュゲート化化学反応は、ＩＦＮＧポリペ
プチドの付着基（類）と共に、ポリマーの官能基（例えばアミノ、ヒドロキシル
、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフィドリル）に応じることに気づくであ
ろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上のすべての利用可能な付着基（すなわちポリ
ペプチドの表面に曝露されている付着基）へのコンジュゲート化に対して向けら
れてもよいし、または特定の付着基、例えばＮ末端アミノ基に対して向けられて
もよい（ＵＳ ５，９８５，２６５）。さらに、コンジュゲート化は、一工程で
、または段階的方式で達成することが可能である（例えばＷＯ ９９／５５３７
７に記載されるように）。

【０１００】 ＰＥＧ化は、付着するＰＥＧ分子の数、こうした分子の大きさおよび形状（例
えば直鎖かまたは分枝か）、およびこうした分子がポリペプチドのどこに付着す
るかに関し、最適な分子を生じるよう設計されることが理解されるであろう。例
えば、用いられるポリマーの分子量は、達成される望ましい効果に基づき選択し
てもよい。例えば、コンジュゲート化の主な目的が、高分子量を有する（例えば
腎クリアランスを減少させるため）コンジュゲートを達成することである場合、
通常、望ましい分子量を得るのに、高分子量ポリマー分子を出来る限り少なくコ
ンジュゲート化することが望ましい。高い度合いのエピトープ遮蔽が望ましい場
合、これは、ポリペプチドのすべてまたは大部分のエピトープを効果的に遮蔽す
るのに十分に多数の低分子量ポリマー（例えば約５，０００Ｄａの分子量を持つ
もの）の使用により得ることが可能である。例えば、２−８、例えば３−６のこ
うしたポリマーを用いてもよい。

【０１０１】 タンパク質上の単一の付着基のみへのコンジュゲート化（ＵＳ ５，９８５，
２６５に記載されるようなもの）に関連し、直鎖でも分枝でもよいポリマー分子
が、高い分子量、例えば約２０ｋＤａを有することが好都合である可能性がある
。

【０１０２】 通常、ポリマーコンジュゲート化は、ポリマー分子と、すべての利用可能なポ
リマー付着基を反応させることを目的とする条件下で行われる。典型的には、ポ
リペプチドに対する活性化ポリマー分子のモル比は、最適反応を得るため、１０
００−１、特に２００−１、好ましくは１００−１、例えば１０−１または５−
１である。しかし、等モル比もまた、用いてもよい。

【０１０３】 本発明にしたがい、リンカーを通じて、ポリペプチドにポリマー分子をカップ
リングさせることもまた、意図される。適切なリンカーは、当業者に公知である
。好ましい例は、塩化シアヌルである（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，（１９７７）
， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２， ３５７８−３５８１； ＵＳ
４，１７９，３３７； Ｓｈａｆｅｒら，（１９８６）， Ｊ． Ｐｏｌｙｍ
． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄ．， ２４，３７５−３７８）
。

【０１０４】 コンジュゲート化に続き、残った活性化ポリマー分子を、当該技術分野に知ら
れる方法にしたがい、例えば反応混合物への第一級アミンの添加により、ブロッ
キングし、そして生じた不活性化ポリマー分子を適切な方法により除去する。

【０１０５】 糖部分へのカップリング 糖部分のカップリングは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこと
が可能である。１以上のグリコシル化部位が導入されるように修飾されている（
「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明のコンジュゲート」項を参照され
たい）ＩＦＮＧ活性を持つポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化を達成す
るため、コンジュゲートのポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列は、
グリコシル化真核発現宿主に挿入しなければならない。発現宿主細胞は、真菌（
糸状菌または酵母）、昆虫または動物細胞より、あるいはトランスジェニック植
物細胞より選択してもよい。さらに、グリコシル化は、本発明のコンジュゲート
のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列または本発明のポリペプチド
を遺伝子治療に用いる際、ヒトの体内で達成してもよい。１つの態様において、
宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫまたはＨＥＫ細胞、例え
ばＨＥＫ２９３、またはＳＦ９細胞などの昆虫細胞、または酵母細胞、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または他の適
切なグリコシル化宿主いずれか、例えば以下にさらに記載されるようなものであ
る。所望により、ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化によってＩＦＮＧポリペプチドに
付着する糖部分は、グリコシルトランスフェラーゼの使用により、例えばＮｅｏ
ｓｅ、米国ペンシルバニア州ホーシャムにより販売されるｇｌｙｃｏＡｄｖａｎ
ｃｅ^TM技術を用い、さらに修飾される。それにより、例えば、ＣＨＯ細胞による
発現およびｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化後、グリコシル化ＩＦＮＧポリペプチド
のシアル化を増加させることが可能である。

【０１０６】 ＩＦＮＧのアミノ酸残基への配糖体の共有ｉｎ ｖｉｖｏカップリングを用い
、炭水化物置換基の数またはプロフィールを修飾するかまたは増加させてもよい
。用いるカップリング様式に応じ、糖（類）を、ａ）アルギニンおよびヒスチジ
ン、ｂ）未結合（free）カルボキシル基、ｃ）システインのものなどの未結合ス
ルフィドリル基、ｄ）セリン、スレオニン、チロシンまたはヒドロキシプロリン
のものなどの未結合ヒドロキシル基、ｅ）フェニルアラニンまたはトリプトファ
ンのものなどの芳香族残基、あるいはｆ）グルタミンのアミド基に、付着させて
もよい。これらのアミノ酸残基は、本発明のコンジュゲートのＩＦＮＧポリペプ
チドにおいて、導入してもそして／または除去してもよい糖部分のための付着基
の例を構成する。ｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングの適切な方法は、例えばＷＯ
８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら, ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ． Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．， ｐｐ．２５９−３０６， １９８１に記載される。糖部分または
ＰＥＧの、タンパク質およびペプチド結合Ｇｌｎ残基へのｉｎ ｖｉｔｒｏカッ
プリングはまた、トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）によって、例えばＳａ
ｔｏら, １９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５, １３０７２−１３０８
０により、またはＥＰ ７２５１４５に記載されるように、行ってもよい。

【０１０７】 有機誘導体化剤へのカップリング ＩＦＮＧポリペプチドの共有修飾は、有機誘導体化剤とポリペプチドの付着基
（類）を反応させることにより、行うことが可能である。適切な誘導体化剤およ
び方法は、当該技術分野に公知である。例えば、システイニル残基は、最も一般
的には、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸また
はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチ
ル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α
−ブロモ−β−（４−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ
−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル ２
−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−
４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３
−ジアゾールとの反応により、誘導体化される。ヒスチジル残基は、ｐＨ ５．
５−７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応により、誘導体化される。こ
れは、この剤が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ−ブロ
モフェナシルブロミドもまた有用であり；該反応は、好ましくはｐＨ ６．０の
０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は
、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応する。これらの剤での誘導体化
は、リジニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導
体化させるのに適した他の試薬には、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸
メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）；ピリドキサールリン
酸；ピリドキサール；クロロホウ化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−
メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いたト
ランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、１つまたはいくつか
の慣用的試薬との反応により修飾され、これらの中には、フェニルグリオキサー
ル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリ
ンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため
、反応が、アルカリ条件で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は
、リジンの基と共にアルギニンのグアニジノ基と反応する可能性がある。カルボ
キシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝
Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）であって、式中、ＲおよびＲ’が異なるアルキル基である、例え
ば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド
または１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジ
イミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグル
タミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグル
タミニル残基に変換される。

【０１０８】 機能部位のブロッキング 過剰なポリマーコンジュゲート化は、ポリマーがコンジュゲート化されている
ポリペプチドの活性の損失を導く可能性があると報告されてきている。この問題
は、例えば機能部位に位置する付着基の除去により、またはコンジュゲート化前
に機能部位をブロッキングすることにより、排除することが可能である。これら
の後者の戦略は、本発明のさらなる態様を構成する（例えば機能部位の近くに位
置する可能性があるリジン残基の除去による第一の戦略は、上記にさらに例示さ
れる）。より具体的には、第二の戦略にしたがい、ポリペプチドおよび非ポリペ
プチド部分の間のコンジュゲート化は、ＩＦＮＧポリペプチドの機能部位が、ポ
リペプチドの機能部位に結合することが可能なヘルパー分子によりブロッキング
される条件下で、行われる。好ましくは、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能
部位を特異的に認識するもの、例えば受容体である。あるいは、ヘルパー分子は
、ＩＦＮＧ活性を示すポリペプチドを認識する抗体、特にモノクローナル抗体で
あってもよい。特に、ヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であってもよい
。

【０１０９】 ポリペプチドは、コンジュゲート化を達成する前にヘルパー分子と相互作用を
許可される。これは、ポリペプチドの機能部位が遮蔽されるかまたは保護され、
そしてその結果、非ポリペプチド部分、例えばポリマーによる誘導体化に利用不
能にされることを確実にする。ヘルパー分子からの溶出後、非ポリペプチド部分
およびポリペプチドの間のコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された機
能部位を含み、回収することが可能である。

【０１１０】 ブロッキングされた機能部位を有するポリペプチドの、ポリマー、親油性化合
物、糖部分、有機誘導体化剤または他の化合物のいずれかへの続くコンジュゲー
ト化は、例えば「・・・へのコンジュゲート化」と題される上記項に記載されるよ
うに、通常の方式で行われる。

【０１１１】 さらなる態様において、ヘルパー分子はまず、カラム充填素材、例えばＳｅｐ
ｈａｄｅｘまたはアガロースビーズなどの固相、あるいは表面、例えば反応容器
に共有結合される。続いて、ヘルパー分子を保持するカラム素材上にポリペプチ
ドを装填し、そして当該技術分野に知られる方法にしたがい、例えば「・・・への
コンジュゲート化」と題される上記項に記載されるように、コンジュゲート化を
行う。この方法は、溶出により、ポリペプチドコンジュゲートが、ヘルパー分子
から分離されることを可能にする。ポリペプチドコンジュゲートは、該ポリペプ
チドコンジュゲートの実質的な分解を導かない物理化学的条件下で、慣用的技術
により溶出される。ポリペプチドコンジュゲートを含む液相は、ヘルパー分子が
共有結合したままである固相から分離される。分離は他の方法で達成してもよい
：例えば、ヘルパー分子を、特異的結合剤（例えばストレプトアビジン）により
認識されることが可能な第二の分子（例えばビオチン）で誘導体化してもよい。
特異的結合剤は、固相に連結させてもよく、それにより、第二のヘルパー−固相
カラム上を通過させることを通じて、ヘルパー分子−第二の分子複合体からポリ
ペプチドコンジュゲートを分離することが可能になり、該カラムは続く溶出の際
、ヘルパー分子−第二の分子複合体を保持するが、ポリペプチドコンジュゲート
を保持しないであろう。ポリペプチドコンジュゲートは、いかなる適切な方式で
、ヘルパー分子から放出させてもよい。脱保護は、ヘルパー分子が、結合してい
るＩＦＮＧの機能部位から解離する条件を提供することにより、達成することが
可能である。例えば、ポリマーがコンジュゲート化される抗体および抗イディオ
タイプ抗体の間の複合体は、ｐＨを酸性またはアルカリ性ｐＨに調整することに
より、解離させることが可能である。

【０１１２】 タグ化ポリペプチドのコンジュゲート化 別の態様において、ＩＦＮＧポリペプチドは、タグ、すなわち典型的には１−
３０、例えば１−２０アミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列またはペプチド伸
長との融合タンパク質として、発現される。迅速でそして容易な精製を可能にす
るのに加え、タグは、タグ化ＩＦＮＧポリペプチドおよび非ポリペプチド部分の
間のコンジュゲート化を達成するための好適なツールである。特に、マイクロタ
イタープレートまたは他のキャリアー、例えば常磁性ビーズにおいて、コンジュ
ゲート化を達成するのにタグを用いてもよく、該プレートまたはキャリアーに、
タグを介し、タグ化ポリペプチドを固定することが可能である。例えばマイクロ
タイタープレートにおける、タグ化ＩＦＮＧポリペプチドへのコンジュゲート化
は、タグ化ポリペプチドが培地から直接（原則としていかなる精製もなしに）固
定され、そしてコンジュゲート化に供されることが可能であるという利点を有す
る。それにより、方法工程（発現からコンジュゲート化まで）の総数を減少させ
ることが可能である。さらに、タグは、スペーサー分子として機能し、コンジュ
ゲート化される固定化ポリペプチドへの改善された接近可能性を確実にすること
が可能である。タグ化ポリペプチドを用いたコンジュゲート化は、本明細書に開
示される非ポリペプチド部分のいずれに対してであってもよく、例えばＰＥＧな
どのポリマー分子に対してでもよい。

【０１１３】 用いられる特定のタグの同一性は、タグがポリペプチドと共に発現されること
が可能であり、そして適切な表面またはキャリアー成分上に固定されることが可
能である限り、重要でない。いくつかの適切なタグが、例えばＵｎｉｚｙｍｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デンマークから、商業的に入手可能である。例えば
、タグは、以下の配列：

【０１１４】

【化５】 （すべてＵｎｉｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デンマークから入手可能
である） のいずれであっても、または以下：

【０１１５】

【化６】 のいずれであってもよい。上述のタグに対する抗体は、例えばＡＤＩ、Ａｖｅｓ
ＬａｂおよびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから、商業的に入手
可能である。

【０１１６】 タグ化ポリペプチドをＰＥＧ化に用いるための好適な方法は、以下の材料およ
び方法項に示される。 ポリペプチドからの続くタグの切断は、商業的に入手可能な酵素の使用により
、達成することが可能である。

【０１１７】 本発明のポリペプチド さらなる側面において、本発明は、本明細書に開示されるような、一般的に新
規のＩＦＮＧポリペプチドに関する。新規ポリペプチドは、本発明のコンジュゲ
ート調製のための重要な中間化合物である。さらに、ポリペプチドは、それ自体
、興味深い特性を有する可能性がある。

【０１１８】 例えば、新規ＩＦＮＧポリペプチドは、本出願の先行する部分に、はるかにさ
らに詳細に記載されるように、表面に曝露されるアミノ酸残基のＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ
、Ｃ、Ｓ、ＴまたはＮへの少なくとも１つの置換を含む。

【０１１９】 ＩＦＮＧポリペプチドの調製法 所望によりグリコシル化型の、ＩＦＮＧポリペプチドは、当該技術分野に知ら
れるいかなる適切な方法により、産生してもよい。こうした方法は、ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を構築し、そして該配列を、形質転換されたま
たはトランスフェクションされた適切な宿主で発現させることを含む。しかし、
本発明のポリペプチドは、より効果的でないが、化学合成または化学合成の組み
合わせまたは化学合成および組換えＤＮＡ技術の組み合わせにより、産生しても
よい。

【０１２０】 ＩＦＮＧポリペプチド（単量体または一本鎖型）をコードする本発明のヌクレ
オチド配列は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２を持つ、ｈｕＩＦＮＧなど
の親ＩＦＮＧをコードするヌクレオチド配列を単離するかまたは合成し、そして
その後、適切なアミノ酸残基（類）の導入（すなわち挿入または置換）または欠
失（すなわち除去または置換）を達成するように、ヌクレオチド配列を変化させ
ることにより、構築することが可能である。

【０１２１】 ヌクレオチド配列は、都合よくは、公知の方法にしたがい、部位特異的突然変
異誘発により、修飾される。例えばＭａｒｋら, “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ｐｐ．５６６２−６６（１９８４）；および
ＵＳ ４，５８８，５８５を参照されたい。

【０１２２】 あるいは、ヌクレオチド配列を、化学合成によって、例えばオリゴヌクレオチ
ド合成装置を用いることによって調製し、ここでオリゴヌクレオチドを、望まし
いポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計し、そして好ましくは、組換えポ
リペプチドが産生されるであろう宿主細胞で好まれるコドンを選択する。例えば
、望ましいポリペプチドの部分をコードする、いくつかの小さいオリゴヌクレオ
チドを合成し、そしてＰＣＲ、連結または連結連鎖反応（ＬＣＲ）により組み立
ててもよい。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的組み立てのため
、５’または３’突出部を含む。

【０１２３】 ひとたび組み立てられたら（合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法に
より）、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を組換えベクターに挿入し
、そして望ましい形質転換宿主細胞において、ＩＦＮＧを発現させるのに必要な
調節配列に機能可能であるように連結する。

【０１２４】 もちろん、すべてのベクターおよび発現調節配列が、本明細書に記載されるＩ
ＦＮＧポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、等しくよく発現させるよ
うに機能するわけではないことを理解すべきである。また、すべての宿主が同じ
発現系で等しくよく機能するわけではないであろう。しかし、当業者は、過度の
実験を行わずに、これらのベクター、発現調節配列および宿主の中で選択を行う
ことが可能である。例えば、ベクターを選択する際、ベクターが宿主細胞中で複
製するかまたは染色体の中に組み込まれなければならないため、宿主を考慮すべ
きである。ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、および抗生物質マー
カーなどのベクターにコードされる他のタンパク質いずれかの発現もまた、考慮
すべきである。発現調節配列を選択する際、多様な要因もまた、考慮すべきであ
る。これらには、例えば、配列の相対強度、その調節可能性、およびポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列とのその適合性、特に潜在的な二次構造に関す
るものが含まれる。宿主は、選択されたベクターとの適合性、ヌクレオチド配列
にコードされる産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドを正しくフォールディ
ングする能力、その発酵または培養必要条件、およびヌクレオチド配列にコード
される産物の精製の容易さを考慮することにより、選択すべきである。

【０１２５】 組換えベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在し、
その複製が染色体複製と独立であるベクター、例えばプラスミドであってもよい
。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された際、宿主細胞ゲノムに組み込ま
れ、そして組み込まれている染色体と共に複製するものである。

【０１２６】 ベクターは、好ましくは発現ベクターであり、該ベクターにおいて、ＩＦＮＧ
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の転写に必
要なさらなる部分に機能可能であるように連結される。ベクターは、典型的には
、プラスミドまたはウイルスＤＮＡ由来である。本明細書に言及される、宿主細
胞における発現に適したいくつかの発現ベクターは、商業的に入手可能であるか
、または文献に記載される。真核宿主の有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ
４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由
来の発現調節配列を含むベクターが含まれる。特定のベクターは、例えば、ｐＣ
ＤＮＡ３．１（＋）＼Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カ
ールスバッド）およびｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォル
ニア州ラホヤ）である。細菌宿主の有用な発現ベクターには、既知の細菌プラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａ（共にＮｏｖａｇｅ
ｎ Ｉｎｃ．、米国ウィスコンシン州）を含む、大腸菌由来のプラスミド、より
広い宿主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージラ
ムダの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９および他のＤＮＡファージ、例えばＭ１
３および糸状一本鎖ＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞の有用な発現ベクター
には、２μプラスミドおよびその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（ＵＳ ４，９３１
，３７３）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ， Ａｎｎ． Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８２， ２０２−２０７， １９９６に記載さ
れる）およびｐＰＩＣＺ Ａ、ＢまたはＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる
。昆虫細胞の有用なベクターには、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅら，
“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔ
ａｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”， Ｃｅｌｌ， ４５， ｐｐ．６８５
−９８（１９８６））、ｐＢｌｕｅｂａｃ ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（共に
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能）が含まれる。

【０１２７】 本発明で使用するための他のベクターには、ＩＦＮＧポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列のコピー数の増幅を可能にするものが含まれる。こうした増
幅可能ベクターは、当該技術分野に公知である。これらには、例えば、ＤＨＦＲ
増幅（例えばＫａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｍａ
ｎおよびＳｈａｒｐ， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｕｌａ
ｒ Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ：
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉｚｅｄ Ｆｏｒ Ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ
．， ２， ｐｐ．１３０４−１９（１９８２）を参照されたい）およびグルタ
ミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えばＵＳ ５，１２２，４６４およびＥ
Ｐ ３３８，８４１を参照されたい）により増幅されることが可能なベクターが
含まれる。

【０１２８】 組換えベクターは、さらに、ベクターが問題の宿主細胞で複製することを可能
にするＤＮＡ配列を含んでもよい。こうした配列の例は（宿主細胞が哺乳動物で
ある場合）、ＳＶ４０複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクタ
ーが複製することを可能にするのに適した配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝
子ＲＥＰ １−３および複製起点である。

【０１２９】 ベクターはまた、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞の欠損を補完
する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰ
Ｉ遺伝子（Ｐ．Ｒ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｇｅｎｅ ４０， １９８５， ｐｐ
．１２５−１３０に記載される）、あるいは薬剤、例えばアンピシリン、カナマ
イシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与えるものも含んでもよい。糸状
菌では、選択可能マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ、ｓ Ｃ が含まれる。

【０１３０】 用語「調節配列」は、本明細書において、ＩＦＮＧポリペプチドの発現に必要
であるかまたは好都合である、すべての構成要素を含むと定義される。各調節配
列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対し、天然であっても外来（ｆｏｒ
ｅｉｇｎ）であってもよい。こうした調節配列には、限定されるわけではないが
、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハン
サーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーター
が含まれる。最低でも、調節配列は、プロモーターを含む。

【０１３１】 本発明において、非常に多様な発現調節配列を用いてもよい。こうした有用な
発現調節配列には、前述の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現調節配列と
共に、原核または真核細胞あるいはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節する
ことが知られるいかなるものでもよい配列、並びにそれらの多様な組み合わせが
含まれる。

【０１３２】 哺乳動物細胞において、転写を指示するのに適した調節配列の例には、ＳＶ４
０およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス
２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、
ヒトサイトメガロウイルス極初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子
１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）
最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プ
ロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンター
ミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナル
およびコザックのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ
ｌ １９８７ Ａｕｇ ２０；１９６（４）：９４７−５０）が含まれる。

【０１３３】 哺乳動物細胞での発現を改善するため、合成イントロンを、ＩＦＮＧポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列の５’非翻訳領域に挿入してもよい。合成イ
ントロンの例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州より入手可能）由来の合成イントロンである。

【０１３４】 昆虫細胞において、転写を指示するのに適した調節配列の例には、ポリヘドリ
ンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス塩基性タンパク
質プロモーター、バキュロウイルス極初期遺伝子１プロモーターおよびバキュロ
ウイルス３９Ｋ遅延初期遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化配
列が含まれる。

【０１３５】 酵母宿主細胞で使用するのに適した調節配列の例には、酵母α−接合系のプロ
モーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解
糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、ＡＤＨ
２−４ｃプロモーターおよび誘導性ＧＡＬプロモーターが含まれる。

【０１３６】 糸状菌宿主細胞で使用するのに適した調節配列の例には、ＡＤＨ３プロモータ
ーおよびターミネーター、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼまたはアルカリプロテアー
ゼ、クロカビ（Ａ． ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、クロカビまたは偽巣性コウ
ジ菌（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）グルコアミラーゼ、偽巣性コウジ菌アセトアミ
ダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アス
パラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモータ
ー、ＴＰＩ１ターミネーターおよびＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。

【０１３７】 細菌宿主細胞で使用するのに適した調節配列の例には、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、
ＴＡＣまたはＴＲＣ系のプロモーターおよびファージラムダの主要プロモーター
領域が含まれる。

【０１３８】 本発明のヌクレオチド配列は、部位特異的突然変異誘発、合成または他の方法
により調製されたのであれ、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列も
また、含んでもよいしまたは含まなくてもよい。シグナルペプチドは、ポリペプ
チドが、発現される細胞から分泌されるべきである場合、存在する。こうしたシ
グナルペプチドは、存在する場合、ポリペプチドの発現のために選択された細胞
に認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対し
て、同種（例えばｈｕＩＦＮＧと、通常、関連しているもの）でもまたは異種（
すなわちｈｕＩＦＮＧ以外の別の供給源に由来するもの）でもよいし、あるいは
宿主細胞に対して同種でもまたは異種でも、すなわち宿主細胞から通常発現され
るシグナルペプチドでもまたは宿主細胞から通常発現されないものでもよい。し
たがって、シグナルペプチドは、例えば大腸菌などの細菌に由来する原核性でも
、あるいは例えば哺乳動物、または昆虫または酵母細胞に由来する真核性でもよ
い。

【０１３９】 シグナルペプチドの存在または非存在は、例えば、ポリペプチドの産生のため
用いられる発現宿主細胞、発現されるタンパク質（細胞内または細胞外タンパク
質であるか）、および分泌を得るのが望ましいかどうかに応じる。糸状菌で使用
するため、シグナルペプチドは、都合よくは、アスペルギルス種アミラーゼまた
はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイ・リパーゼま
たはプロテアーゼあるいはフミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕ
ｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードする遺伝子に由来してもよい。シグナルペプチ
ドは、好ましくは、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、クロカビ中性α−アミラー
ゼ、クロカビ酸安定性アミラーゼ、またはクロカビ・グルコアミラーゼ由来であ
る。昆虫細胞で使用するため、シグナルペプチドは、都合よくは、昆虫遺伝子（
ＷＯ ９０／０５７８３を参照されたい）、例えば、鱗翅目マンデュカ・セクス
タ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（ＵＳ ５，０２３
，３２８を参照されたい）、ミツバチ（ｈｏｎｅｙｂｅｅ）メリチン（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇ
ｔ）（Ｍｕｒｐｈｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４， ３４９−３５７（１９９３））またはヒト膵臓
リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２８４，
ｐｐ．２６２−２７２， １９９７）由来であってもよい。

【０１４０】 哺乳動物細胞で使用するための好ましいシグナルペプチドは、ＩＦＮＧのもの
、またはネズミＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド（Ｃｏｌｏｍａ， Ｍ（１９９
２） Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９−１０４）のものである
。酵母細胞で使用するのに適したシグナルペプチドは、Ｓ．セレビシエ由来のα
−因子シグナルペプチド（ＵＳ ４，８７０，００８を参照されたい）、マウス
唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ． Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅら， Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８９， １９８１， ｐｐ．６４３−６４６を参照されたい）、修
飾カルボキシペプチダーゼ・シグナルペプチド（Ｌ．Ａ． Ｖａｌｌｓら， Ｃ
ｅｌｌ ４８， １９８７， ｐｐ．８８７−８９７を参照されたい）、酵母Ｂ ＡＲ１ シグナルペプチド（ＷＯ ８７／０２６７０を参照されたい）、および酵
母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ． Ｅｇｅ
ｌ−Ｍｉｔａｎｉら， Ｙｅａｓｔ ６， １９９０， ｐｐ．１２７−１３７
を参照されたい）であることが見出されてきている。

【０１４１】 細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適切な動物細
胞または細胞株と共にトランスジェニック動物または植物を含む、いかなる適切
な宿主を用い、ＩＦＮＧポリペプチドを産生してもよい。細菌宿主細胞の例には
、グラム陽性細菌、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば短バチルス
（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）または枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモ
ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌株が含まれる。細菌宿主
細胞へのベクターの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えばＣ
ｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ， １９７９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８：１１１−１１５を参照されたい）、コンピテン
ト細胞（例えばＹｏｕｎｇおよびＳｐｉｚｉｚｅｎ， １９６１， Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１：８２３−８２９、またはＤｕｂ
ｎａｕおよびＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ， １９７１， Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５６：２０９−２２１を参照
されたい）、エレクトロポレーション（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗ
ｅｒ， １９８８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照
されたい）、またはコンジュゲート化（例えばＫｏｅｈｌｅｒおよびＴｈｏｒｎ
ｅ， １９８７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９
：５７７１−５２７８を参照されたい）を用い、達成してもよい。

【０１４２】 適切な糸状菌宿主細胞の例には、アスペルギルス属の株、例えば、コウジカビ
、クロカビまたは偽巣性コウジ菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）あるいは
トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）が含まれる。真菌細胞は、それ自体
知られる方式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞
壁の再生を伴う方法により、形質転換することが可能である。アスペルギルス属
宿主細胞に適した形質転換法は、ＥＰ ２３８ ０２３およびＵＳ ５，６７９
，５４３に記載される。フザリウム属種の形質転換に適した方法は、Ｍａｌａｒ
ｄｉｅｒら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６およびＷＯ ９６
／００７８７に記載される。酵母は、ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ，
Ａｂｅｌｓｏｎ， Ｊ．Ｎ．およびＳｉｍｏｎ， Ｍ．Ｉ．監修， Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ中， Ｖｏｌｕｍｅ
１９４， ｐｐ １８２−１８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎ
ｃ．， ニューヨーク； Ｉｔｏら， １９８３， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３；およびＨｉｎｎｅｎら， １９７８
， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１９２０に記載される方法を用い
て、形質転換することが可能である。

【０１４３】 適切な酵母宿主細胞の例には、サッカロミセス属の株、例えば、Ｓ．セレビシ
エ、シゾサッカロミセス属、クロイベロミセス属、ピキア属、例えばＰ．パスト
リス（Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはＰ．メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏ
ｌｉｃａ）、ハンセニュラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、例えばＨ．ポリモルファ
（Ｈ． Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）またはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が含
まれる。異種ＤＮＡで酵母細胞を形質転換し、そしてそこから異種ポリペプチド
を産生するための方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉ
ｎｃ、米国カリフォルニア州パロアルト（Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ^TM 酵母形質転
換系キットの製品プロトコル中）、およびＲｅｅｖｅｓら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９９（１９９２）１９３−１９８、Ｍａ
ｎｉｖａｓａｋａｍおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．１８， ｐｐ．４４
１４−４４１５、並びにＧａｎｅｖａら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１（１９９４）１５９−１６４に開示される。

【０１４４】 適切な昆虫宿主細胞の例には、鱗翅目細胞株、例えばスポドプテラ・フルギペ
ルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９またはＳｆ２１
）またはトリコプルシオア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｏａ ｎｉ）細胞（Ｈ
ｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（ＵＳ ５，０７７，２１４）が含まれる。昆虫細胞の形質
転換およびその中での異種ポリペプチドの産生は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載
されるように行ってもよい。

【０１４５】 適切な哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、サバンナモンキー（
Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ）細胞株（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ １（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１））；マウス細
胞（例えばＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ）腎臓（
ＢＨＫ）細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ ＣＣＬ−
１０）、およびヒト細胞（例えばＨＥＫ ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３
））と共に、組織培養中の植物細胞が含まれる。さらなる適切な細胞株が当該技
術分野に知られ、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリ
ーランド州ロックビルなどの公的寄託機関から入手可能である。また、ＣＨＯ細
胞などの哺乳動物細胞は、ＩＦＮＧポリペプチドの改善されたグリコシル化を提
供するため、例えばＵＳ ５，０４７，３３５に記載されるように、シアリルト
ランスフェラーゼ、例えば１，６−シアリルトランスフェラーゼを発現するよう
修飾してもよい。

【０１４６】 外因性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法には、リン酸カルシウ
ム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ウイルス
ベクター、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００を用いる、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ、英国ペイズリーにより記載されるトランスフ
ェクション法が含まれる。これらの方法は、当該技術分野に公知であり、そして
例えばＡｕｓｂｅｌら（監修）， １９９６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ， 米国ニューヨーク州に記載される。哺乳動物細胞の培養は、
確立された方法にしたがい、例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｎｉｇｅｌ
Ｊｅｎｋｉｎｓ監修， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ， 米
国ニュージャージー州トトワ、並びにＨａｒｒｉｓｏｎ ＭＡおよびＲａｅ Ｉ
Ｆ， Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９７に記
載されるように行う。

【０１４７】 グリコシル化ポリペプチドを産生するため、好ましくは、例えば上述の種類の
真核宿主細胞を使用する。 本発明の産生法において、細胞は、当該技術分野に知られる方法を用い、ポリ
ペプチドの産生に適した栄養培地中で培養する。例えば、細胞は、適切な培地中
およびポリペプチドが発現され、そして／または単離されるのを可能にする条件
下で行われる、震蘯フラスコ培養、実験室または工業発酵装置中の小規模または
大規模発酵（連続、バッチ、流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、または固体状態発酵
を含む）により、培養してもよい。培養は、炭素および窒素供給源、並びに無機
塩を含む適切な栄養培地中で、当該技術分野に知られる方法を用いて行われる。
適切な培地は商業的供給者から入手可能であるし、または公表される組成（例え
ばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中）にしたがい、
調製することが可能である。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリ
ペプチドは、培地から直接回収することが可能である。ポリペプチドが分泌され
ない場合、細胞溶解物から回収することが可能である。

【０１４８】 生じたポリペプチドは、当該技術分野に知られる方法により、回収することが
可能である。例えば、ポリペプチドは、限定されるわけではないが、遠心分離、
ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発、または沈殿を含む慣用法により、栄養培地か
ら回収することが可能である。

【０１４９】 ポリペプチドは、限定されるわけではないが、クロマトグラフィー（例えばイ
オン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排
除）、電気泳動法（例えば分離用等電点フォーカシング）、示差溶解性（例えば
硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えばＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ． ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ
Ｒｙｄｅｎ監修， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ニューヨーク， １９８
９を参照されたい）を含む、当該技術分野に知られる多様な方法により、精製す
ることが可能である。ＩＦＮＧ活性を示すポリペプチドを精製するための特定の
方法は、ＥＰ １１００４４および未審査の日本国特許出願第１８６９９５／８
４に開示される。

【０１５０】 ＩＦＮＧポリペプチドの生物学的活性は、当該技術分野に知られるいかなる適
切な方法により、アッセイしてもよい。こうしたアッセイには、ＥＰ ４１３１
３ Ｂ１に記載されるような、抗ウイルス活性の抗体中和、プロテインキナーゼ
、オリゴアデニル酸２，５−Ａシンテターゼまたはホスホジエステラーゼ活性の
誘導が含まれる。こうしたアッセイにはまた、免疫調節アッセイ（例えばＵＳ
４，７５３，７９５を参照されたい）、増殖阻害アッセイ、およびインターフェ
ロン受容体を発現する細胞への結合の測定が含まれる。特異的アッセイは、以下
の材料および方法項に開示される。

【０１５１】 さらに、本発明は、特に間質性肺疾患であるが、また肉芽腫性疾患、癌、感染
、骨障害（例えば悪性骨粗しょう症などの骨代謝障害）および慢性関節リウマチ
などの自己免疫疾患を治療する改善法であって、主な利点が、より有効な療法の
より頻繁でないおよび／またはより侵入性でない投与、および所望により療法的
に活性である化合物（類）との免疫反応のより低いリスクである、前記改善法に
関する。

【０１５２】 本発明のコンジュゲートは、好ましくは、薬学的に許容しうるキャリアーまた
は賦形剤を含む組成物中で投与する。「薬学的に許容しうる」は、投与される患
者にいかなる不利な影響も引き起こさないキャリアーまたは賦形剤を意味する。
こうした薬学的に許容しうるキャリアーおよび賦形剤は、当該技術分野に公知で
ある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ 第１８版， Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓ． ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＬ． Ｈｏｖｇａ
ａｒｄ監修， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）；並びにＨａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，
第３版， Ａ． Ｋｉｂｂｅ監修， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓ
ｓ（２０００））。

【０１５３】 本発明のコンジュゲートは、「そのまま」で、および／またはその塩の型で、
用いてもよい。適切な塩には、限定されるわけではないが、アルカリ金属または
アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムおよび
マグネシウムとの塩と共に、例えば亜鉛塩が含まれる。これらの塩または複合体
は、結晶および／または無定形構造として存在してもよい。

【０１５４】 本発明のコンジュゲートは、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅなどの、またはＥＰ ７９５
３３２に明示されるような、ＩＦＮＧの既知の商業的調製を用いた療法で使用さ
れるのと、およそ等しい用量で投与する。投与される正確な用量は、状況に応じ
る。通常、用量は、治療される異常または適応症の重症度または伝播を予防する
または減少させることが可能であるべきである。当業者には、本発明のコンジュ
ゲートまたは組成物の有効量は、とりわけ、疾患、用量、投与計画、ポリペプチ
ドまたはコンジュゲートまたは組成物が、単独で、または他の療法剤と組み合わ
せて投与されるかどうか、組成物の血清半減期、および患者の全身の健康状態に
応じることが明らかであろう。

【０１５５】 本発明はまた、間質性肺疾患、癌、感染、骨障害（例えば悪性骨粗しょう症な
どの骨代謝障害）および／または炎症性疾患、特に間質性肺疾患、最も特に特発
性肺線維症の治療のための医薬品、薬剤組成物またはパーツキットの製造のため
の、ａ）ｈｕＩＦＮＧ、ｒｈｕＩＦＮＧまたは本明細書に記載されるようなＩＦ
ＮＧポリペプチドからなる群より選択されるＩＦＮＧポリペプチドに共有結合し
た少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含むコンジュゲート（すなわち本発明
のコンジュゲートであるコンジュゲート）またはｂ）本発明の薬剤組成物の使用
にも関する。プレドニゾロンなどのグルココルチコイドもまた含んでもよい。好
ましい投薬量は、用量当たり、ポリペプチド構成要素１−４、より好ましくは２
−３マイクログラム／ｋｇ患者重量である。好ましい投薬量は、用量当たり１０
０−３００、より好ましくは１００−１５０マイクログラムのグルココルチコイ
ド／ｋｇ患者体重である。

【０１５６】 やはり開示されるのは、所望によりさらにグルココルチコイドを含む、分子ま
たは調製を搬送する改善された手段である。 本発明はまた、間質性肺疾患の治療に適したパーツキットであって、それぞれ
所望により薬学的に許容しうるキャリアーおよび／または賦形剤と共に、上述の
活性構成要素ａ）またはｂ）を含む第一の薬剤組成物、および少なくとも１つの
グルココルチコイドを含む第二の薬剤組成物を含む、前記キットにも関する。

【０１５７】 本発明のコンジュゲートは、公知の方法によって、薬剤組成物中に処方しても
よい。適切な処方は、Ｅ．Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵＳ ５，１８３，７
４６に記載される。

【０１５８】 薬剤組成物は、液体、ゲル、凍結乾燥、粉末、圧縮固体を含む多様な型、また
はいかなる他の適切な型中に処方してもよい。好ましい型は、治療される特定の
適応症に応じるであろうし、そして当業者に明らかであろう。

【０１５９】 薬剤組成物は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、経皮、腹腔内、筋内、肺内
、膣内、直腸内、眼内に、またはいかなる他の許容しうる方式で、例えばＰｏｗ
ｄｅｒＪｅｃｔまたはＰｒｏＬｅａｓｅ技術を用い、投与してもよい。処方は、
注入によって連続的に投与してもよいが、当該技術分野に公知の技術、例えばポ
ンプまたは移植を用いた、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射が許容しうる。いくつか
の例では、処方は、溶液またはスプレーとして、直接適用される。投与の好まし
い様式は、治療される特定の適応症に応じるであろうし、そして当業者に明らか
であろう。

【０１６０】 本発明の薬剤組成物は、他の療法剤と組み合わせて投与してもよい。これらの
剤は、同一の薬剤組成物の一部として取り込まれてもよいし、あるいは本発明の
ポリペプチドまたはコンジュゲートと別個に、同時にまたは他の許容しうる治療
計画にしたがい、投与してもよい。さらに、本発明のポリペプチド、コンジュゲ
ートまたは薬剤組成物は、他の療法の付属物として用いてもよい。特に、ＥＰ
７９５３３２に記載されるようなグルココルチコイドとの組み合わせが考慮され
る。

【０１６１】 非経口剤 薬剤組成物の例は、非経口投与用に設計された溶液である。多くの場合、薬剤
溶液処方は、直ちに使用するのに適した、液体型で提供されるが、こうした非経
口処方はまた、凍結または凍結乾燥型で提供されてもよい。前者の場合、組成物
は、使用前に融解しなければならない。後者の型は、凍結乾燥調製が、その液体
対応物より一般的により安定であると、当業者に認識されるように、より多様な
保存条件下で、組成物に含まれる活性化合物の安定性を亢進するため、しばしば
用いられる。こうした凍結乾燥調製は、１以上の適切な薬学的に許容しうる希釈
剤、例えば注射用滅菌水または滅菌生理学的食塩水溶液の添加により、使用前に
再構成される。

【０１６２】 非経口剤の場合、これらは、適切なように、望ましい純度を有するポリペプチ
ドを、当該技術分野に典型的に使用される１以上の薬学的に許容しうるキャリア
ー、賦形剤または安定化剤（このすべてが「賦形剤」と称される）、例えば緩衝
剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および／
または他の雑多な添加剤と混合することにより、凍結乾燥処方または水性溶液と
して、保存するため調製される。

【０１６３】 緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを補助する。これらは
、典型的には、約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度範囲で存在する。本発明で使用す
るのに適した緩衝剤には、有機および無機酸両方、並びにそれらの塩、例えばク
エン酸緩衝剤（例えばクエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、ク
エン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物
など）、コハク酸緩衝剤（例えばコハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハ
ク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）
、酒石酸緩衝剤（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリ
ウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば
フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合
物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩
衝剤（グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウ
ム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例
えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物
、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば乳酸−乳酸ナ
トリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物な
ど）および酢酸緩衝剤（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナト
リウム混合物など）が含まれる。さらなる可能性は、リン酸緩衝剤、ヒスチジン
緩衝剤およびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩である。

【０１６４】 保存剤は、微生物増殖を遅延させるために添加され、そして典型的には、約０
．２％−１％（ｗ／ｖ）の量で添加される。本発明で使用するのに適した保存剤
には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、
プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロ
ゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、
塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン
類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノール
が含まれる。

【０１６５】 等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするため添加され、そして多価糖ア
ルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリト
ール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。
多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮し、重量０．１％および２５％の間
、典型的には１％から５％の量で存在してもよい。

【０１６６】 安定化剤は、広いカテゴリーの賦形剤を指し、機能として、増量剤（ｂｕｌｋ
ｉｎｇ ａｇｅｎｔ）から、療法剤を安定化させるか、あるいは変性または容器
壁への接着を防ぐのを補助する添加剤までの範囲にある可能性がある。典型的な
安定化剤は、多価糖アルコール（上に列挙される）；アルギニン、リジン、グリ
シン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オミシン、Ｌ−ロイ
シン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、ラク
トース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリト
ール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチト
ール、グリセロール、およびイノシトールなどのシクリトール類を含む、それら
に匹敵するものなどの有機糖または糖アルコール類；ポリエチレングリコール；
アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリ
ウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム
などの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；ヒト血
清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタン
パク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース
、フルクトースおよびグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトースおよびス
クロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖、およびデキストランなどの多糖
であってもよい。安定化剤は、典型的には、活性タンパク質重量に基づく重量０
．１から１０，０００部分の範囲で存在する。

【０１６７】 非イオン性表面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても知られる）は、
療法剤を安定化させるのを補助すると共に、療法ポリペプチドを、震蘯誘導凝集
から保護するために存在してもよく、これはまた、処方がポリペプチドの変性を
引き起こすことなく、剪断表面ストレスに曝露されることも可能にする。適切な
非イオン性表面活性剤には、ポリソルベート類（２０、８０など）、ポリオキサ
マー類（１８４、１８８など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール類、
ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル類（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０
、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０など）が含まれる。

【０１６８】 さらなる雑多な賦形剤には、増量剤または充填剤（例えばデンプン）、キレー
ト剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビ
タミンＥ）および共溶媒が含まれる。活性成分はまた、例えばコアセルベーショ
ン技術によりまたは界面重合により調製された微小カプセル、例えばヒドロキシ
メチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−（メチルメタクリレート）微小カプセ
ルに包括しても、コロイド性薬剤搬送系（例えばリポソーム、アルブミン微小球
体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に包括しても、また
はマクロエマルジョンに包括してもよい。こうした技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記に開示される。

【０１６９】 ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用する非経口処方は、無菌でなければならない。これ
は、例えば無菌ろ過膜を通じたろ過により、容易に達成される。 持続放出調製 持続放出調製の適切な例には、コンジュゲートを含む固体疎水性ポリマーの半
透性マトリックス、フィルムまたは微小カプセルなどの適切な型を有するマトリ
ックスが含まれる。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲ
ル類（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニ
ルアルコール））、ポリラクチド類、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グル
タメートのコポリマー類、分解不能エチレン−酢酸ビニル、分解可能乳酸−グリ
コール酸コポリマー類、例えばＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）技術またはＬｕｐ
ｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロ
イプロリドで構成される注射可能微小球体）、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒ
ドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸など
のポリマー類は、１００日までまたはそれを越えるような長期間、分子の放出を
可能にするが、特定のヒドロゲル類は、より短い期間、タンパク質を放出する。
被包ポリペプチドが、体内に長期間保持される場合、これらは３７℃で水分に曝
露された結果、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の損失そしておそらく免
疫原性の変化を生じる可能性がある。関与する機構に応じ、安定化のための合理
的戦略を工夫してもよい。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド交換を通じた
分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフィドリル
残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加剤を使
用し、そして特定のポリマーマトリックス組成を発展させることにより、達成す
ることが可能である。

【０１７０】 経口投与 経口投与のため、薬剤組成物は、固体または液体型、例えばカプセル、錠剤、
懸濁物、乳剤または溶液の型であってもよい。薬剤組成物は、好ましくは、既定
の量の活性成分を含む投薬単位の型で作成される。ヒトまたは他の哺乳動物に適
した一日用量は、患者の状態および他の要因に応じ、広く異なる可能性があるが
、日常的な方法を用いて、当業者により決定することが可能である。

【０１７１】 経口投与のための固体投薬型には、カプセル、錠剤、座薬、粉末および顆粒が
含まれる可能性がある。こうした固体投薬型では、活性化合物を、スクロース、
ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合しても
よい。こうした投薬型はまた、通常の実施のように、さらなる物質、例えばステ
アリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も含んでもよい。カプセル、錠剤および丸剤
の場合、投薬型はまた、緩衝剤も含んでもよい。錠剤および丸薬は、さらに、腸
溶コーティングを用いて調製してもよい。

【０１７２】 コンジュゲートは、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセ
ルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マ
グネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アラビアゴム
（ａｃａｃｉａ）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン
、および／またはポリビニルアルコールなどの佐剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合
し、そして慣用的な投与のため、錠剤にしてもまたは被包してもよい。あるいは
、これらは生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、
エタノール、油（例えばコーン（ｃｏｒｎ）油、ピーナツ（ｐｅａｎｕｔ）油、
綿実（ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ）油、ゴマ（ｓｅｓａｍｅ）油など）、トラガカン
トゴム、および／または多様な緩衝剤に溶解してもよい。他の佐剤および投与様
式が薬学業に公知である。キャリアーまたは希釈剤は、時間遅延成分、例えばモ
ノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを、単独で、または
ワックスと共に含んでもよいし、あるいは当該技術分野に公知の他の成分を含ん
でもよい。

【０１７３】 薬剤組成物は、滅菌などの慣用的な薬学的作業に供してもよいし、そして／ま
たは例えば本明細書の他の場所に開示されるように、保存剤、安定化剤、湿潤剤
、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの慣用的な佐剤を含んでもよい。

【０１７４】 経口投与のための液体投薬型は、水などの当該技術分野に一般的に用いられる
不活性希釈剤を含む、薬学的に許容しうる乳剤、溶液、懸濁物、シロップおよび
エリキシル剤を含んでもよい。こうした組成物はまた、湿潤剤、甘味料、フレー
バー剤および香料などの佐剤も含んでもよい。

【０１７５】 局所投与 局所投与に適した処方には、皮膚を通じた浸透に適した液体または半液体調製
（例えばリニメント剤、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および
目、耳、または鼻への投与に適した滴剤（ｄｒｏｐ）が含まれる。

【０１７６】 肺搬送 ジェットまたは超音波いずれかの噴霧器で使用するのに適した処方は、典型的
には、溶液１ｍｌ当たり、コンジュゲート約０．０１から２５ｍｇ、好ましくは
約０．１から１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、水に溶解したポリペプチドまたはコンジ
ュゲートを含むであろう。処方はまた、緩衝剤および単純な糖（例えばタンパク
質安定化および浸透圧の制御のため）、および／または０．１から１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度のヒト血清アルブミンも含んでもよい。用いてもよい緩衝剤の例は、酢
酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびグリシンである。好ましくは、緩衝剤
は、溶液を３から９のｐＨ範囲に調整するのに適した組成およびモル濃度を有す
るであろう。一般的に、この目的のためには、１ｍＭから５０ｍＭの緩衝剤モル
濃度が適切である。利用してもよい糖の例は、通常、処方重量１％から１０％の
範囲の量のラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロー
ス、およびキシロースである。

【０１７７】 噴霧器処方はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の霧化により引き起こされ
るタンパク質の凝集を表面が誘導するのを減少させるかまたは妨げるため、表面
活性剤も含んでもよい。多様な慣用的表面活性剤、例えばポリエチレン脂肪酸エ
ステル類およびアルコール類、並びにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テル類を使用してもよい。量は、一般的に処方の重量０．００１％および４％の
間の範囲であろう。本発明の目的に特に好ましい表面活性剤は、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエートである。

【０１７８】 特定の処方および本発明の液体粒子の適切な分散を生じる方法は、本明細書に
援用される、ＷＯ ９４／２００６９、ＵＳ ５，９１５，３７８、ＵＳ ５，
９６０，７９２、ＵＳ ５，９５７，１２４、ＵＳ ５，９３４，２７２、ＵＳ
５，９１５，３７８、ＵＳ ５，８５５，５６４、ＵＳ ５，８２６，５７０
およびＵＳ ５，５２２，３８５に開示される。

【０１７９】 計測用量吸入器で用いるための処方は、一般的に、細かく分割された粉末を含
むであろう。この粉末は、凍結乾燥し、そしてその後、液体コンジュゲート処方
を粉砕機にかけることにより産生してもよく、そしてまた、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）などの安定化剤も含んでもよい。典型的には、０．５％（ｗ／ｗ）以
上のＨＳＡを添加する。さらに、必要であれば、１以上の糖または糖アルコール
を調製に添加してもよい。例には、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソ
ルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが
含まれる。処方に添加する量は、存在するコンジュゲートの約０．０１から２０
０％（ｗ／ｗ）、好ましくはおよそ１から５０％の範囲である可能性がある。こ
うした処方をその後、凍結乾燥し、そして望ましい粒子サイズに粉砕機ですりつ
ぶす。

【０１８０】 適切な大きさの粒子を、その後、表面活性剤の補助で噴霧剤中に懸濁する。噴
霧剤は、この目的のため使用される、いかなる慣用的成分、例えばトリクロロフ
ルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール
、および１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む、クロロフルオロカーボ
ン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素
、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。適切な表面活性剤には、トリオ
レイン酸ソルビタンおよびダイズ（ｓｏｙａ）レシチンが含まれる。オレイン酸
もまた、表面活性剤として有用である可能性がある。この混合物をその後、搬送
装置に装填する。本発明で使用するのに適した商業的に利用可能な計測用量吸入
器の例は、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングル
パークに製造されるＶｅｎｔｏｌｉｎ計測用量吸入器である。

【０１８１】 粉末吸入器のための処方は、コンジュゲートを含む細かく分割された乾燥粉末
を含むであろうし、そしてまた、ラクトース、ソルビトール、スクロース、また
はマンニトールなどの増量剤も、装置からの粉末の分散を促進する量で、例えば
処方重量５０％から９０％、含んでもよい。粉末粒子は、肺において、１０マイ
クロメートル未満、好ましくは０．５および５マイクロメートルの間、最も好ま
しくは１．５および３．５マイクロメートルの間の中央値直径を有し、約１ｇ／
ｃｍ²の密度の粒子に対応する、空気力学特性を有するべきである。本明細書の
解説にしたがった使用に適した粉末吸入器の例は、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、
マサチューセッツ州ベッドフォードに製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器
である。

【０１８２】 これらの装置のための粉末は、ＵＳ ５，９９７，８４８、ＵＳ ５，９９３
，７８３、ＵＳ ５，９８５，２４８、ＵＳ ５，９７６，５７４、ＵＳ ５，
９２２，３５４、ＵＳ ５，７８５，０４９およびＵＳ ５，６５４，００７に
開示される方法により生成し、そして／または搬送することが可能である。

【０１８３】 療法製品の肺搬送のために設計された機械装置には、限定されるわけではない
が、すべて当業者に周知である噴霧器、計測用量吸入器、および粉末吸入器が含
まれる。本発明の実施に適した商業的に入手可能な装置のいくつかの特定の例は
、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ， Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイスに製造され
るＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ、コロラド州イーグルウッドに製造されるＡｃｏｒｎ ＩＩ噴霧器；Ｇｌ
ａｘｏ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークに製造さ
れるＶｅｎｔｏｌｉｎ計測用量吸入器；Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、マサチュー
セッツ州ベッドフォードに製造されるＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器；Ｉｎｈａ
ｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア
州サンカルロスの「常在雲（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｌｏｕｄ）」装置；Ａｌｋｅ
ｒｍｅｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジに製造されるＡＩＲ吸入器；および
Ａｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州ヘイワードに製造
されるＡＥＲｘ肺薬剤搬送系である。

【０１８４】 本発明は、細菌およびウイルス感染、癌または腫瘍、特発性肺線維症などの間
質性肺疾患、肉芽腫性疾患、骨障害（例えば悪性骨粗しょう症などの骨代謝障害
）および慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患を治療するための組成物および方
法を提供する。

【０１８５】 さらなる側面において、本発明は、ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに対す
る循環抗体を有する哺乳動物を治療する方法であって、ＩＦＮＧの生理活性を有
し、そして前記抗体と反応しない化合物を投与することを含む、前記方法に関す
る。化合物は、好ましくは、本明細書に記載されるようなコンジュゲートであり
、そして哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。治療される哺乳動物は、ＩＦＮ
Ｇが有用な治療法である、上に列挙される疾患のいずれを患っていてもよい。さ
らに、本発明は、ｈｕＩＦＮＧまたはｒｈｕＩＦＮＧに対する循環抗体を有する
哺乳動物の治療で使用するための薬剤製品を作成する方法であって、ＩＦＮＧの
生理活性を有し、そしてこうした抗体と反応しない化合物を、注射可能または別
の適切な処方中に処方する、前記方法に関する。用語「循環抗体」は、商業的に
入手可能なＩＦＮＧ調製のいずれかで処理したのに反応して、哺乳動物で形成さ
れる、自己抗体を示すよう意図される。

【０１８６】 やはり意図されるのは、遺伝子治療適用における、本発明のＩＦＮＧポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列の使用である。特に、「さらなるグリコシル
化部位を取り込むよう修飾された、本発明のグリコシル化ポリペプチド」と題さ
れる上記項に記載されるＩＦＮＧポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
使用するのが興味深い可能性がある。ポリペプチドのグリコシル化は、したがっ
て、遺伝子治療の経過中、すなわちヒト体内でのヌクレオチド配列の発現後に活
性化される。

【０１８７】 意図される遺伝子治療適用には、該ポリペプチドが有効な療法を提供すると期
待される疾患の治療が含まれる。 遺伝子治療を用いたＩＦＮＧの局所搬送は、非特異的投与に関連する潜在的な
毒性の問題を避けながら、療法剤を標的領域に提供することが可能である。

【０１８８】 ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療方法論両方が意図される。 定義される細胞集団に、潜在的な療法遺伝子を移入するためのいくつかの方法
が知られる。さらなる参考文献には、例えばＭｕｌｌｉｇａｎ， “Ｔｈｅ Ｂ
ａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ， ２６０， ｐｐ．９２６−３１（１９９３）を参照されたい。これらの
方法には： 例えばＷｏｌｆｆら， “Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｉｎ
ｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｓｃｌｅ Ｉｎ ｖｉｖｏ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７， ｐｐ．１４６５−６８（１９９０）に開示されるような直接遺伝子移入； 例えばＣａｐｌｅｎら， “Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＣＦＴＲ
Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｎａｓａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉ
ｕｍ Ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ”
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， ３， ｐｐ．３９−４６（１９９５）； Ｃｒｙ
ｓｔａｌ， “Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ａｓ Ａ Ｄｒｕｇ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｍ
ｅｄ．， １， ｐｐ．−１５−１７（１９９５）； ＧａｏおよびＨｕａｎｇ
， “Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍ．， １７９， ｐｐ．２８０−８５（１９９１）に開示されるようなリ
ポソーム仲介ＤＮＡ移入； 例えばＫａｙら， “Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈ
ｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ： Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｏｒｒｅ
ｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｏｇｓ”，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６２， ｐｐ．１１７−１９（１９９３）； Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ， “Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２５６， ｐｐ．８０８−１３（１９９２）に開示されるようなレトロウイルス
仲介ＤＮＡ移入； ＤＮＡウイルス仲介ＤＮＡ移入 が含まれる。こうしたＤＮＡウイルスには、アデノウイルス類（好ましくはＡｄ
−２またはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペスウイルス類（好ましくは単純
疱疹ウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイルス類（好ましくは「欠損
（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」または非自律パピローマウイルスに基づくベクター、
より好ましくはアデノ関連ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−
２に基づくベクター）が含まれる。例えばＡｌｉら， “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ
ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ”， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １， ｐｐ．３６７−８４（１９
９４）； ＵＳ ４，７９７，３６８、およびＵＳ ５，１３９，９４１を参照
されたい。

【０１８９】 本発明は、以下の実施例にさらに記載される。実施例は、いかなる方式でも、
本明細書および請求項の一般性を限定すると理解してはならない。材料および方法 アッセイ インターフェロンアッセイ概略 ＩＦＮＧが、ＨｅＬａ細胞上のＩＦＮＧ受容体と相互作用し、そして該受容体
を活性化することが先に公表されている。その結果、インターフェロン刺激応答
要素（ＩＳＲＥ）を含むプロモーターで、転写が活性化される。したがって、Ｈ
ｅＬａ細胞内に置かれたＩＳＲＥカップリング・ルシフェラーゼレポーター遺伝
子（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）の使用により、インターフェロン受容体のアゴニストに
関してスクリーニングすることが可能である。

【０１９０】 一次アッセイ ＨｅＬａ細胞を、ＩＳＲＥ−ＬｕｃおよびｐＣＤＮＡ ３．１／ハイグロでコ
トランスフェクションし、そしてハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭ培地におけ
る選択により、増殖巣（ｆｏｃｉ）（細胞クローン）を生成する。細胞クローン
は、ＩＦＮＧの存在下または非存在下で、ルシフェラーゼ活性に関してスクリー
ニングする。未刺激に対する刺激ルシフェラーゼ活性の最高の比を示したクロー
ンを、さらなるアッセイに用いる。

【０１９１】 突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）をスクリーニングするため、１５，００
０細胞／ウェルを、９６ウェル培養プレートに植え、そしてＤＭＥＭ培地中で一
晩インキュベーションする。翌日、突然変異タンパク質と共に既知の標準を、多
様な濃度で細胞に添加する。プレートを、５％ ＣＯ₂大気中で、３７℃で６時
間、インキュベーションし、続いてＬｕｃＬｉｔｅ基質（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ、オランダ・フローニンゲン）を各ウェルに添加する。プレー
トを密封し、そしてＳＰＣ（単一光子計測）モードで、ＴｏｐＣｏｕｎｔ発光測
定装置（Ｐａｃｋａｒｄ）上で発光を測定する。各個々のプレートは、刺激対照
としてＩＦＮＧと共にインキュベーションしたウェル、および未刺激対照として
正常培地を含む他のウェルを含む。刺激および未刺激ルシフェラーゼ活性間の比
は、突然変異タンパク質活性および実験間変動の両方の内部標準として働く。

【０１９２】 ＰＥＧ−ＩＦＮＧコンジュゲートの機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期測定 生物学的半減期の測定は、文献に記載されるいくつかの方法で行うことが可能
である。１つの方法は、Ｒｕｔｅｎｆｒａｎｚら（Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
Ｒｅｓ． １９９０， ｖｏｌ．１０， ｐ．３３７−３４１）に記載され、
彼らは、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＩＦＮＧの静脈内および筋内注
射を用いた。生物学的半減期は、Ｈｅｐ−２細胞および水疱性口内炎ウイルス（
ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＶＳ）を用いて
、ネズミ血清中のＩＦＮＧ力価を測定する生物学的アッセイによって、測定した
。代替法として、彼らはまた、血清中のＩＦＮＧレベルを検出するのにＥＬＩＳ
Ａを用いた。

【０１９３】 代替法として、放射能標識ＩＦＮＧを用いて、ＩＦＮＧの皮下吸収および局所
分布を研究することが可能である。ＣｒｏｏｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ（Ｊ． Ｐ
ｈａｒｍ．， １９９３， ｖｏｌ ４５， ｐ．６０６−６０９）は麻酔した
メス・スプレーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいて ¹²⁵ ＩＦＮＧの研究を行った。皮下投与後、血液および組織試料を収集し、そし
てＩＦＮＧの量をガンマ計測によって測定した。

【０１９４】 ＩＦＮＧのＰＥＧ化 ＰＥＧ化ｒｈｕＩＦＮＧは、ＵＳ ５，１０９，１２０の実施例２に記載され
るように調製することが可能である。同様に、例えば突然変異Ｎ２５Ｋを持つ、
本明細書に記載される修飾ＩＦＮＧポリペプチドをＰＥＧ化してもよい。生じた
ＰＥＧ−ＩＦＮＧ−Ｎ２５Ｋコンジュゲートは、ｒｈｕＩＦＮＧのコンジュゲー
トに比較した際、付着したさらなるＰＥＧ分子を有する。

【０１９５】 薬剤組成物の調製 例えば間質性肺疾患の治療のための薬剤組成物は、各バイアルが、５０、１０
０、２００、３００、４００または５００マイクログラムの例えばｒｈｕＩＦＮ
ＧまたはＩＦＮＧ−Ｎ２５Ｋを含む量でコンジュゲートを含むように、当業者に
公知の方法にしたがって、注射可能組成物中に、本発明の適切な精製コンジュゲ
ートを処方することによって、調製することが可能である。

【０１９６】 表面曝露アミノ酸残基の同定 構造 Ｘ線結晶解析によって決定される、ｈｕＩＦＮＧの実験的３Ｄ構造は：ＩＦＮ
Ｇホモ二量体のＣ−アルファトレースに関して報告する、Ｅａｌｉｃｋら Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５２：６９８−７０２（１９９１）に報告された。Ｗａｌｔｅｒ
ら， Ｎａｔｕｒｅ ３７６：２３０−２３５（１９９５）は、ＩＦＮＧ受容体
の可溶性型２分子と複合体を形成している、ＩＦＮＧホモ二量体の構造に関して
報告した。この構造の配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）は、公的に入手可能であっ
たことがない。Ｔｈｉｅｌら， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８：９２７−９３６（２
０００）は、構造中に、ＩＦＮＧホモ二量体と相互作用しない、受容体の第三の
分子を有する、ＩＦＮＧ受容体の可溶性型２分子との複合体を形成している、Ｉ
ＦＮＧホモ二量体の構造に関して報告した。

【０１９７】 方法 接触可能表面積（ＡＳＡ） コンピュータープログラムＡｃｃｅｓｓ（Ｂ． ＬｅｅおよびＦ．Ｍ． Ｒｉ
ｃｈａｒｄｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：３７９−４００（１９７
１））バージョン２（著作権（ｃ）１９８３ Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
）を用い、構造中の個々の原子の接触可能表面積（ＡＳＡ）を計算する。この方
法は、典型的には、１．４Åのプローブサイズを用い、そして接触可能表面積（
ＡＳＡ）をプローブの中央に形成される面積と定義する。この計算の前に、タン
パク質に直接関連しないすべての水分子、水素原子および他の原子を座標組から
除去する。

【０１９８】 側鎖の断片的（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）ＡＳＡ 側鎖原子の断片的ＡＳＡは、側鎖における原子のＡＳＡの合計を、伸長された
ＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドにおけるその残基種の側鎖原子のＡＳＡに相当
する値で割ることにより、計算する。Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆
Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２０, ５０
７−５３０を参照されたい。この例に関し、ＣＡ原子は、グリシン残基の側鎖の
一部とみなされるが、残りの残基に関してはみなされない。以下の表は、側鎖に
対する標準１００％ ＡＳＡを示す：

【０１９９】

【化７】 構造中に検出されない残基は、フレキシブル領域中に常在すると考えられるた
め、１００％曝露を有すると定義される。

【０２００】 原子間の距離の測定 原子間の距離は、分子グラフィックスソフトウェア、例えばＩｎｓｉｇｈｔＩ
Ｉ ｖ．９８．０、ＭＳＩ ＩＮＣを用いて決定した。

【０２０１】 受容体結合部位の決定 受容体結合部位は、受容体結合に際して変化する接触可能表面積を有するすべ
ての残基で構成されると定義される。これは、少なくとも２つのＡＳＡ計算：リ
ガンド（類）／受容体（類）複合体中の単離リガンド（類）に関するもの、およ
び完全リガンド（類）／受容体（類）複合体に関するものによって決定される。

【０２０２】 結果 用いたＸ線構造は、Ｔｈｉｅｌら Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８：９２７−９３６
（２０００）に報告された、構造中に、ＩＦＮＧホモ二量体と相互作用しない、
ＩＦＮＧ受容体の第三の分子を有する、ＩＦＮＧ受容体の可溶性型２分子と複合
体を形成している、ＩＦＮＧホモ二量体のものである。該構造は、ＩＦＮＧホモ
二量体からなり、２つの分子はＡおよびＢと名づけられる。構築目的のため、Ｉ
ＦＮＧ配列前に置かれる、Ｍ０と名づけられたさらなるメチオニンがあり、そし
て該配列は、Ｃ末端で１０残基、一部切除される（構築分子中、Ｑ１３３が最後
の残基である）。この例のすべての計算中、Ｍ０は構造から除去する。２つのＩ
ＦＮＧ単量体の構造は、残基１２０の後に、非常に弱い電子密度を有し、そして
、残基は、残基Ｔ１２６までしかモデル化しなかった。したがって、この例の計
算前に、残基Ｓ１２１−Ｔ１２６を構造から除去した。ＣおよびＤと名づけられ
る２つの受容体断片は、ＩＦＮＧホモ二量体と直接相互作用し、そしてＥと名づ
けられる第三の受容体分子は、ＩＦＮＧホモ二量体とまったく接触せず、そして
これらの計算に含まない。

【０２０３】 表面曝露 両分子中、Ｍ０およびＳ１２１−Ｔ１２６を除外した、分子ＡおよびＢのホモ
二量体に関する断片的ＡＳＡ計算を行った結果、以下の残基は、単量体の少なく
とも１つで、側鎖の２５％以上が表面に曝露されていた：Ｑ１、Ｄ２、Ｐ３、Ｋ
６、Ｅ９、Ｎ１０、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｙ１４、Ｎ１６、Ｇ１８、Ｈ１９、Ｓ２０
、Ｄ２１、Ａ２３、Ｄ２４、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｔ２７、Ｇ３１、Ｋ３４、Ｎ３５
、Ｋ３７、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｓ４０、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｎ５９、Ｋ６１、Ｄ６２
、Ｄ６３、Ｑ６４、Ｓ６５、Ｑ６７、Ｋ６８、Ｅ７１、Ｔ７２、Ｋ７４、Ｅ７５
、Ｎ７８、Ｖ７９、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｓ８４、Ｎ８５、Ｋ８６、Ｋ８７、Ｄ９０
、Ｅ９３、Ｋ９４、Ｎ９７、Ｓ９９、Ｔ１０１、Ｄ１０２、Ｌ１０３、Ｎ１０４
、Ｈ１１１、Ｑ１１５、Ａ１１８およびＥ１１９。

【０２０４】 以下の残基は、単量体の少なくとも１つで、側鎖の５０％以上が表面に曝露さ
れていた：Ｑｌ、Ｄ２、Ｐ３、Ｋ６、Ｅ９、Ｎ１０、Ｋ１３、Ｎ１６、Ｇ１８、
Ｈ１９、Ｓ２０、Ｄ２１、Ａ２３、Ｄ２４、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｔ２７、Ｇ３１、
Ｋ３４、Ｋ３７、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｎ５９、Ｄ６２、Ｑ６４、
Ｓ６５、Ｋ６８、Ｅ７１、Ｅ７５、Ｎ８３、Ｓ８４、Ｋ８６、Ｋ８７、Ｋ９４、
Ｎ９７、Ｓ９９、Ｔ１０１、Ｄ１０２、Ｌ１０３、Ｎ１０４、Ｑ１１５、Ａ１１
８、Ｅ１１９。

【０２０５】 両分子中、Ｍ０およびＳ１２１−Ｔ１２６を除外し、そして受容体分子Ｃおよ
びＤを含む、分子ＡおよびＢのホモ二量体に関する断片的ＡＳＡ計算を行った結
果、以下の残基は、単量体の少なくとも１つで、側鎖の２５％以上が表面に曝露
されていた：Ｑ１、Ｄ２、Ｐ３、Ｋ６、Ｅ９、Ｎ１０、Ｋ１３、Ｙ１４、Ｎ１６
、Ｇ１８、Ｈ１９、Ｄ２１、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｇ３１、Ｋ３４、Ｎ３５、Ｋ３７
、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｓ４０、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｎ５９、Ｋ６１、Ｄ６２、Ｄ６３
、Ｑ６４、Ｓ６５、Ｑ６７、Ｋ６８、Ｅ７１、Ｔ７２、Ｋ７４、Ｅ７５、Ｎ７８
、Ｖ７９、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｓ８４、Ｎ８５、Ｋ８６、Ｋ８７、Ｄ９０、Ｅ９３
、Ｋ９４、Ｎ９７、Ｓ９９、Ｔ１０１、Ｄ１０２、Ｌ１０３、Ｎ１０４、Ｅ１１
９。以下の残基は、単量体の少なくとも１つで、側鎖の５０％以上が表面に曝露
されていた：Ｐ３、Ｋ６、Ｎ１０、Ｋ１３、Ｎ１６、Ｄ２１、Ｎ２５、Ｇ２６、
Ｇ３１、Ｋ３４、Ｋ３７、Ｅ３８、Ｅ３９、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｎ５９、Ｄ６２、
Ｑ６４、Ｓ６５、Ｋ６８、Ｅ７１、Ｅ７５、Ｎ８３、Ｓ８４、Ｋ８６、Ｋ８７、
Ｋ９４、Ｎ９７、Ｓ９９、Ｔ１０１、Ｄ１０２、Ｌ１０３およびＮ１０４。

【０２０６】 上述の位のすべては、本発明にしたがった修飾のための標的である。 ２つのリストを比較した結果、受容体結合に際し、側鎖２５％以上のＡＳＡリ
ストから、Ｋ１２、Ｓ２０、Ａ２３、Ｄ２４、Ｔ２７、Ｈ１１１、Ｑ１１５およ
びＡ１１８が除外され、そして受容体結合に際し、側鎖５０％以上のＡＳＡリス
トから、Ｑ１、Ｄ２、Ｅ９、Ｇ１８、Ｈ１９、Ｓ２０、Ａ２３、Ｄ２４、Ｔ２７
、Ｑ１１５、Ａ１１８およびＥ１１９が除外される。

【０２０７】 構造中で測定されない残基、すなわち残基Ｓ１２１、Ｐ１２２、Ａ１２３、Ａ
１２４、Ｋ１２５、Ｔ１２６、Ｇ１２７、Ｋ１２８、Ｒ１２９、Ｋ１３０、Ｒ１
３１、Ｓ１３２、Ｑ１３３、Ｍ１３４、Ｌ１３５、Ｆ１３６、Ｒ１３７、Ｇ１３
８、Ｒ１３９、Ｒ１４０、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ｑ１４３は、完全に表面に曝露
されているとして扱う。これらの残基はまた、本発明にしたがって、付着基の導
入のための別個の標的を構成する（あるいは、例えば２５％以上または５０％以
上曝露される側鎖を有する、表面に曝露されるアミノ酸残基の群に属すると見る
ことが可能である）。

【０２０８】 受容体結合部位 上述のようなＡＳＡ計算を行った結果、ＩＦＮＧ分子の以下の残基が、単離二
量体に対する計算に比較して、複合体中の単量体の少なくとも１つで、減少した
ＡＳＡを有した：Ｑ１、Ｄ２、Ｙ４、Ｖ５、Ｅ９、Ｋ１２、Ｇ１８、Ｈ１９、Ｓ
２０、Ｄ２１、Ｖ２２、Ａ２３、Ｄ２４、Ｎ２５、Ｇ２６、Ｔ２７、Ｌ３０、Ｋ
３４、Ｋ３７、Ｋ１０８、Ｈ１１１、Ｅ１１２、Ｉ１１４、Ｑ１１５、Ａ１１８
、Ｅ１１９。

【０２０９】

【実施例】実施例１ 酵母およびＣＨＯ細胞におけるＩＦＮＧの発現のための発現カセットの設計 天然シグナルペプチドを含まない、成熟ｈｕＩＦＮＧをコードする全長ｃＤＮ
Ａを含むＤＮＡ配列、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１３２７４を、酵母細胞におけ
る高発現を促進するため、修飾した。まず、酵母培地への分泌を促進するため、
ＩＦＮＧシグナルペプチドの代わりにＭＡＴａシグナルペプチドを導入した。次
に、酵母で頻繁に用いられるコドンに対するコドン使用の偏向を行うことによっ
て、ｈｕＩＦＮＧヌクレオチド配列のコドンを修飾した。続いて、ＤＮＡ制限エ
ンドヌクレアーゼのための認識部位を導入するため、配列内の特定のヌクレオチ
ドを他のもので置換した。プライマーは、遺伝子を合成することが可能であるよ
うに設計した。白金Ｐｆｘ−ポリメラーゼキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）および標準的三工程ＰＣＲ反復パラメーターを用いた一工程ＰＣＲに
より、プライマーを合成遺伝子に組み合わせた。組み合わせた遺伝子を、同一条
件を用いたＰＣＲによって増幅し、そして該遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３
に示す配列を有する。

【０２１０】 合成した遺伝子を、５’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’のＸｂａＩの間で
、ｐＪＳＯ３７−ｌｉｐ（Ｏｋｋｅｌｓ， Ｊ．Ｓ．（１９９６）Ｒｅｃ． Ｄ
ＮＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ＩＩＩ．， ｖｏｌ７８２， ２０２−２０７）にク
ローニングし、ｐＩＧＹ−１を生じた。

【０２１１】 共有結合単量体ＩＦＮＧポリペプチドを含む一本鎖構築物を作成するため、以
下の３つの構築物を作成した： Ｉ）ヒトＩｇＡ１ヒンジ領域（Ｌｕｎｎ ＣＡら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ．， ２６７， １７９２０−１７９２４， １９９２）にならって設計し
た１９量体リンカーペプチドを通じて連結した、２つの成熟全長ｈｕＩＦＮＧポ
リペプチドを含む構築物。これは、以下のプライマー：

【０２１２】

【化８】 を用いたＰＣＲによって行った。

【０２１３】 ＰＣＲ断片を、５’端のＣｌａＩおよび３’端のＸｂａＩの間で、ｐＩＧＹ−
１にクローニングし、２つの単量体をＳｐｈＩ（リンカー領域に導入される）で
組み立てた。この構築物は、ｐＩＧＹ−２と称した。

【０２１４】 ＩＩ）リンカーを含まず、２つの単量体成熟全長ｈｕＩＦＮＧポリペプチドを
含む構築物。このため、ＰＣＲに以下のプライマーを用いた。

【０２１５】

【化９】 ＰＣＲ断片は、二工程ＰＣＲによって組み立て、そして５’端のＣｌａＩおよ
び３’端のＸｂａＩの間で、ｐＩＧＹ−１にクローニングし、そしてｐＩＧＹ−
３と名づけた。

【０２１６】 ＩＩＩ）上述の１９量体ペプチドリンカーを通じて共有結合した、２つのＣ末
端一部切除（最後の１１アミノ酸）単量体ＩＦＮＧポリペプチドを含む構築物。
以下のプライマーを用いた：

【０２１７】

【化１０】 ＰＣＲ断片を、５’端のＣｌａＩおよび３’端のＸｂａＩの間で、ｐＩＧＹ−
１にクローニングし、２つの単量体をＳｐｈＩ（リンカー領域に導入される）で
組み立てた。この構築物は、ｐＩＧＹ−４と称した。ＣＨＯ細胞で発現させるための構築物 ＣＨＯ細胞でＩＦＮＧを発現させるため、以下のオリゴヌクレオチドを合成し
、ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への、シグナルペプチ
ドを含むＩＦＮＧのクローニングを可能にする。

【０２１８】

【化１１】 この発現ベクターにＩＦＮＧをクローニングするため、ＡＤＪ０１２およびＡ
ＤＪ００３、並びにテンプレートとしてｐＩＧＹ−１を用いたＰＣＲ増幅は、ｐ
ｃＤＮＡ３．１／ハイグロの５’端のＢａｍＨＩおよび３’端のＸｂａＩの間に
クローニングしてｐＩＧＹ−５を生じることが可能な４５０ｂｐ断片を産生した
。

【０２１９】 ＩＦＮＧにグリコシル化部位を導入するため、古典的な二工程ＰＣＲに続き、
５’端のＢａｍＨＩおよび３’端のＸｂａＩの間にＰＣＲ断片をクローニングす
ることによって、発現プラスミド（ｐＩＧＹ−５）にＰＣＲ生成変異を導入する
ことが可能な方式で、オリゴヌクレオチドを設計した。

【０２２０】 したがって、特異的突然変異プライマーと共に用いられる２つのベクタープラ
イマーを設計した：

【０２２１】

【化１２】 異なる突然変異タンパク質のため、以下のプライマーを設計した。

【０２２２】

【化１３】 二工程ＰＣＲ、並びにＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでの消化後、これらのプライ
マー対の各々は、ｐＩＧＹ−５にクローニングすることが可能な４４７ｂｐ断片
を生じると期待される。ＣＨＯ細胞におけるインターフェロンγの発現 上述の構築物は、トランスフェクション剤としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を使用することによ
り、ＣＨＯ Ｋ１細胞株にトランスフェクションしようとするものである。２４
時間後、培地を採取し、そしてインターフェロンγ活性および濃度に関してアッ
セイする。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月２３日（２００２．５．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】 からなる群より選択される置換によって導入され、該置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕＩＦＮＧに比較して示される、請求項３
記載のコンジュゲート。

【化２】 からなる群より選択される置換によって導入され、該置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕＩＦＮＧに比較して示される、請求項４
記載のコンジュゲート。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/00 Ｃ０７Ｋ 1/113 29/00 14/57 Ｃ０７Ｋ 1/113 Ｃ１２Ｎ 1/19 14/57 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ＰＡ ２０００ ００４４７ (32)優先日 平成12年３月17日(2000．3．17) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンデルセン，キム・ヴィルブール デンマーク国デーコー−2970 フルスホル ム，アガーン・アレー １，マキシゲン・ エイピーエス (72)発明者 ハンセン，クリスチャン・カルステン デンマーク国デーコー−2970 フルスホル ム，アガーン・アレー １，マキシゲン・ エイピーエス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 BA25 CA02 CA04 CA05 CA06 CA07 CA10 CA20 DA02 DA03 DA12 EA04 FA02 FA18 GA25 HA01 HA06 HA11 4B065 AA26X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA05 BA16 CA24 CA44 CA46 4C076 CC04 CC15 DD67 EE23 EE30 EE41 EE59 FF67 4C084 AA01 AA02 AA03 BA01 BA08 BA17 BA18 BA19 CA53 DA24 MA05 MA22 MA23 MA28 MA52 MA55 MA58 MA59 NA06 ZA592 ZB112 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 BA53 BA57 CA40 DA18 EA20 EA50 FA51 FA52 FA74

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＦＮＧ活性を示し、そしてＩＦＮＧポリペプチドに共有
   結合した少なくとも１つの第一の非ポリペプチド部分を含むコンジュゲートであ
   って、該ポリペプチドが、非ポリペプチド部分のための付着基を含む、少なくと
   も１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基を
   持つことで親ＩＦＮＧポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を含む、前記コ
   ンジュゲート。
2. 【請求項２】 親ポリペプチドが野生型ヒトＩＦＮＧ（ｈｕＩＦＮＧ）あ
   るいはその変異体（ｖａｒｉａｎｔ）または断片である、請求項１記載のコンジ
   ュゲート。
3. 【請求項３】 第一の非ポリペプチド部分が、ポリマー分子、親油性化合
   物、糖部分および有機誘導体化剤からなる群より選択される、請求項１または２
   記載のコンジュゲート。
4. 【請求項４】 非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基が
   、ｈｕＩＦＮＧにおいて表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位に導入さ
   れているか、および／または該位から除去されている、請求項１−３のいずれか
   に記載のコンジュゲート。
5. 【請求項５】 非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基が
   、ｈｕＩＦＮＧにおいて側鎖の少なくとも２５％が表面に曝露されているアミノ
   酸残基に占められる位に導入されているか、および／または該位から除去されて
   いる、請求項４記載のコンジュゲート。
6. 【請求項６】 非ポリペプチド部分のための付着基を含むアミノ酸残基が
   、ｈｕＩＦＮＧにおいて側鎖の少なくとも５０％が表面に曝露されているアミノ
   酸残基に占められる位に導入されているか、および／または該位から除去されて
   いる、請求項５記載のコンジュゲート。
7. 【請求項７】 第一の非ポリペプチド部分が糖部分である、請求項３−６
   のいずれかに記載のコンジュゲート。
8. 【請求項８】 糖部分がＮ連結糖部分であり、そしてＩＦＮＧポリペプチ
   ドが、親ポリペプチドに比較した際、少なくとも１つの除去されたおよび／また
   は少なくとも１つの導入されたＮグリコシル化部位を含む、請求項７記載のコン
   ジュゲート。
9. 【請求項９】 ＩＦＮＧポリペプチドが： 【化１】 からなる群より選択される、少なくとも１つの突然変異を含み、該置換がＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕＩＦＮＧに比較して示され
   る、請求項８記載のコンジュゲート。
10. 【請求項１０】 ＩＦＮＧポリペプチドが： 【化２】 からなる群より選択される、少なくとも１つの置換を含み、該置換がＳＥＱ Ｉ
    Ｄ ＮＯ ２に示されるアミノ酸配列を持つｈｕＩＦＮＧに比較して示される、
    請求項９記載のコンジュゲート。
11. 【請求項１１】 ＩＦＮＧポリペプチドが： Ｋ１２Ｓ／Ｔ、Ｇ１８Ｓ／Ｔ、Ｅ３８Ｎ、Ｋ６１Ｓ／Ｔ、Ｎ８５Ｓ／Ｔ、Ｋ９４
    Ｎ、Ｓ９９Ｎ、Ｑ１０６Ｓ／Ｔ、Ａ１２４Ｎ、Ｋ１３０Ｎ、およびＲ１４０Ｎか
    らなる群より選択される、より好ましくは、Ｅ３８Ｎ、Ｋ９４Ｎ、Ｓ９９Ｎ、Ａ
    １２４Ｎ、Ｋ１３０ＮおよびＲ１４０Ｎからなる群より選択される、少なくとも
    １つの置換を含む、請求項８−１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
12. 【請求項１２】 少なくとも１つの第二の非ポリペプチド部分をさらに含
    む、請求項７−１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
13. 【請求項１３】 第二の非ポリペプチド部分がポリマーである、請求項１
    ２記載のコンジュゲート。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドが、第二の非ポリペプチド部分のための付
    着基を含む、少なくとも１つの導入されたおよび／または少なくとも１つの除去
    されたアミノ酸残基を持つことで親ポリペプチドのものと異なる、請求項１２ま
    たは１３記載のコンジュゲート。
15. 【請求項１５】 第一の非ポリペプチド部分がポリマーである、請求項１
    −６のいずれかに記載のコンジュゲート。
16. 【請求項１６】 ポリマーが直鎖または分枝ポリエチレングリコールであ
    る、請求項１３−１５のいずれかに記載のコンジュゲート。
17. 【請求項１７】 ポリマーのための付着基を含むアミノ酸残基が、システ
    イン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される、
    請求項１２−１６のいずれかに記載のコンジュゲート。
18. 【請求項１８】 非ポリペプチドが、付着基としてシステインを有するポ
    リマーであり、そして少なくとも１つのシステイン残基が、ｈｕＩＦＮＧにおい
    て表面に曝露されるアミノ酸残基に占められる位に導入される、請求項１５−１
    ７のいずれかに記載のコンジュゲート。
19. 【請求項１９】 非ポリペプチドが、付着基としてリジンを有するポリマ
    ーであり、そして少なくとも１つのリジン残基が除去され、該リジン残基が、Ｓ
    ＥＱ ＩＤ ＮＯ ２に比較して行われる番号付けの、Ｋ６、Ｋ１２、Ｋ１３、
    Ｋ３４、Ｋ３７、Ｋ４３、Ｋ５５、Ｋ５８、Ｋ６１、Ｋ６８、Ｋ７４、Ｋ８０、
    Ｋ８６、Ｋ８７、Ｋ８８、Ｋ９４、Ｋ１０８、Ｋ１２５、Ｋ１２８およびＫ１３
    ０からなる群より選択される、請求項１５−１７のいずれかに記載のコンジュゲ
    ート。
20. 【請求項２０】 除去されるリジンが、Ｋ１２、Ｋ３４、Ｋ３７、Ｋ１０
    ８、Ｋ１２８および／またはＫ１３０である、請求項１９記載のコンジュゲート
    。
21. 【請求項２１】 ＩＦＮＧポリペプチドがＣ末端で一部切除（ｔｒｕｎｃ
    ａｔｅｄ）されている、請求項１−２０のいずれかに記載のコンジュゲート。
22. 【請求項２２】 ＩＦＮＧポリペプチドが一本鎖ＩＦＮＧポリペプチドで
    ある、請求項１−２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
23. 【請求項２３】 少なくとも１つのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮＧポリペプチド
    を含む、ＩＦＮＧ活性を示すコンジュゲート。
24. 【請求項２４】 ＩＦＮＧポリペプチドがｈｕＩＦＮＧあるいはその変異
    体または断片である、請求項２３記載のコンジュゲート。
25. 【請求項２５】 ｈｕＩＦＮＧに比較した際、増加した機能的ｉｎ ｖｉ
    ｖｏ半減期を有する、先行する請求項のいずれかに記載のコンジュゲート。
26. 【請求項２６】 請求項１−２５のいずれかに記載のコンジュゲートのポ
    リペプチド部分をコードする、ヌクレオチド配列。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載のヌクレオチド配列を宿する、発現ベク
    ター。
28. 【請求項２８】 請求項２６記載のヌクレオチド配列または請求項２７記
    載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
29. 【請求項２９】 酵母、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｈ
    ＥＫ２９３、またはＳＦ９細胞である、請求項２８記載の宿主細胞。
30. 【請求項３０】 ＩＦＮＧポリペプチドの機能的ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を
    増加させる方法であって、非ポリペプチド部分のための付着基を構成するアミノ
    酸残基を、こうした付着基を含まない表面曝露アミノ酸残基を含む、親ＩＦＮＧ
    ポリペプチドの位に導入し、そして／またはこうした付着基を構成するアミノ酸
    残基を除去し、そして生じた修飾ポリペプチドを、導入されそして／または除去
    されたアミノ酸残基を付着基として有する非ポリペプチド部分とのコンジュゲー
    ト化に供することを含む、前記方法。
31. 【請求項３１】 非ポリペプチド部分が、ポリマー分子、糖部分、親油性
    基および有機誘導体化剤からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 コンジュゲートのポリペプチド部分を、コンジュゲート
    化を行うことが可能な条件下で、コンジュゲート化しようとする分子と反応させ
    、そしてコンジュゲートを回収することを含む、請求項１−２５のいずれかに記
    載のコンジュゲートを調製するための方法。
33. 【請求項３３】 請求項１−２５のいずれかに記載のコンジュゲートおよ
    びｂ）薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアーまたは佐剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）
    を含む、薬剤組成物。
34. 【請求項３４】 疾患、特に間質性肺疾患、最も特に特発性肺線維症の治
    療のための、請求項１−２５のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項３
    ３記載の薬剤組成物。
35. 【請求項３５】 疾患、特に間質性肺疾患、最も特に特発性肺線維症の治
    療に使用するための、請求項１−２５のいずれかに記載のコンジュゲートまたは
    請求項３４記載の薬剤組成物。