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JP2003512838A - ショウジョウバエgタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。 - Google Patents

ショウジョウバエgタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。

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JP2003512838A
JP2003512838A JP2001533986A JP2001533986A JP2003512838A JP 2003512838 A JP2003512838 A JP 2003512838A JP 2001533986 A JP2001533986 A JP 2001533986A JP 2001533986 A JP2001533986 A JP 2001533986A JP 2003512838 A JP2003512838 A JP 2003512838A
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dmgpcr
seq
polypeptide
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cell
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JP2001533986A
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デイビッド・イー・ローワリー
バルディン・ジー・スミス
テレサ・エイ・クビアック
マーサ・ジェイ・ラーセン
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Original Assignee
Pharmacia and Upjohn Co
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ショウジョウバエメラノガスター(Drosophila melannogasteer)のGPCR(DmGPCR)ポリペプチド、および、そのDmGPCRをコードし特定するポリヌクレトチドを提供する。本発明は、また、発現ベクター、宿主細胞およびその生産方法を提供する。また、本発明は、他の動物中のホモログや、動物の疾病治療や動植物に有害な昆虫の制御のために有用なDmGPCR作動薬/拮抗薬を同定するために有用な方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 発明の分野 本発明は、一部、ショウジョウバエメラノガスターGタンパク質結合レセプタ
ー(DmGPCR)をコード化する核酸分子、新規ポリペプチド、および、GP
CRに結合し、および/またはGPCRの活動に変調をもたらす化合物をスクリ
ーニングするためのアッセイ方法に関する。
【0002】 発明の背景 人間や他の生物は生細胞からなっている。その細胞が他の細胞と情報を伝え合
い外界からの情報や刺激を受け取るメカニズムの一つに、細胞表面にある膜レセ
プター分子を経由するものがある。そのような多くの膜レセプターが同定されて
、その特徴も調べられ、時には、構造上のモチーフやシグナル伝達の特徴などに
基づいて、主なレセプターファミリーに分類されている。このようなファミリー
としては、リガンド作動性イオンチャンネルレセプター、電位差依存性イオンチ
ャンネルレセプター、レセプターチロシンキナーゼ、レセプタータンパク質チロ
シンフォスファターゼやGタンパク質結合レセプターなどが挙げられるが、これ
らに限定されない。これらのレセプターは、細胞外シグナルを細胞内の生理的な
応答に変換する最も重要な役割を持つ。
【0003】 Gタンパク質結合レセプター(すなわち、GPCR)は、細胞表面レセプター
のうちで大きなファミリーを構成し、その特徴は、アミノ末端側領域が細胞外に
、カルボキシ末端側領域が細胞内に、膜を7回貫通する蛇行状タンパク質領域が
膜内に存在することである。このため、これらのレセプターは、7回貫通レセプ
ター(7TM)とも呼ばれる。これらの7回貫通領域は、前述のアミノ末端およ
びカルボキシル末端領域に加え、細胞外に3つのループ、細胞内に3つのループ
を形成する。レセプターの細胞外部分は、一つ以上の細胞外の結合対象(例えば
、リガンド)と結合し、これを認識する役割を持っている。他方、細胞内部分は
、下流の効果分子(effector molecule)を認識し、情報伝達する役割を持つ。
【0004】 GPCRと結合するリガンドは数多くあり、カルシウムイオン、ホルモン、ケ
モカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質などが
挙げられ、光子さえも結合する。GPCRは、多くの細胞種の正常な(時には、
異常な)機能にとって重要である。概論としては次の論文を参照せよ。[Strosb
er, Eur. J.Biochem., 1991, 196, 1-10;およびBohmら、Biochem J., 1997, 32
2, 1-18]。特定のリガンドが相当するレセプターに結合する時、リガンドは、
典型的には、レセプターの細胞内部分または領域と結合するある特定のヘテロ三
量体グアニン・ヌクレオチド結合調節タンパク質(Gタンパク質)を活性化する
。Gタンパク質は、次いで、細胞内の調節分子にシグナルを発信し、その調節分
子の活性を刺激するか阻害する。これらの調節分子としては、アデニレートシク
ラーゼ、ホスホリパーゼやイオンチャンネルが挙げられる。アデニレートシクラ
ーゼとホスホリパーゼは、第二のメッセンジャー分子、cAMP、イノシトール
トリホスフェートおよびジアシルグリセリンの産生に関与する酵素である。この
一連の現象を通し、細胞外のリガンドの刺激は、Gタンパク質結合レセプターを
通して細胞内の変化を引き起こす。これらのレセプターは、それぞれ特有の一次
構造、発現パターン、リガンド結合プロフィールや細胞内調節システムを持って
いる。
【0005】 Gタンパク質結合レセプターは、細胞と外界との間の情報伝達に重要な役割を
持つため、これらのレセプターは、レセプターの活性化または拮抗化による治療
的処置の標的として魅力を持っている。既知のリガンドを持つレセプターに対し
ては、特にそのリガンドの持つ作用を促進または阻害させるために作動薬や拮抗
薬の特定が進められている。いくつかのGタンパク質結合レセプターは、病原と
しての役割を持ち、(例えば、HIVのコレセプターとして働くある種のケモカ
インレセプターは、AIDSの病原としての役割を持つ。)、このため、レセプ
ターの天然リガンドについての知識がない場合においても治療的処置の標的とし
て魅力を持っている。その他のレセプターは、組織や細胞のタイプに対するそれ
らの発現パターンのため、治療的処置の標的として魅力があり、また、これらの
組織や細胞のタイプも、治療的処置の標的として魅力を持っている。後者のカテ
ゴリーに属するレセプターの例としては、免疫細胞で発現されるレセプター(こ
のレセプターは、自己免疫応答を阻害するか、病原体あるいは癌に対する免疫応
答を刺激するための標的とすることができる。)、および、脳または他の神経器
官や組織で発現されるレセプター(このレセプターは、精神分裂症、うつ病、双
極性疾病または他の神経学的障害の治療における標的として可能性がある)を挙
げることができる。後者のカテゴリーのレセプターは、また、レセプターを発現
する細胞サブタイプを、例えば蛍光活性化細胞選別により同定および/または精
製するためのマーカーとして有用である。不幸にも、知られている中枢神経シス
テム由来のGタンパク質レセプターの数はほんの少数である。このため、すでに
同定され人間を含む多くの動物の治療的処置の標的として有望とみなされている
Gタンパク質結合レセプターに対して、需要がある。
【0006】 昆虫は、農業や人屋内環境において、主な厄介者とされている。昆虫は、また
動物や人間に寄生し(この場合外部寄生虫と呼ばれる)、疾病や死亡を引き起こ
す。昆虫は、またウィルス性や寄生性の疾病を動植物や人間に伝達するベクター
として働く。このため、昆虫の数を制御するための新しい方法や、病原種または
有害種を追い払いおよび/または殺すための新しい方法に対する、永続的で切実
な需要が存在している。昆虫を殺しまたは駆逐して昆虫数を制御する一つの方法
は、化学物質を使用する方法である。この化学物質は、殺虫剤と呼ばれ、昆虫に
選択的に毒性を発揮し、他の無脊椎動物へも作用する可能性もある。現在、農作
物や家畜などの農業生産物にダメージを与える昆虫の制御のために、殺虫剤は非
常に大きな価値をもっている。殺虫剤は、また、人の家庭環境においても、例え
ば、芝や庭園の害虫や人にダメージを与えるか悩ませる刺虫、噛虫、ハエ、ゴキ
ブリなどの昆虫の制御に使われている。殺虫剤は、家畜動物やペットに寄生する
ノミ、シラミ、ダニや噛付きハエなどの外部寄生虫により引き起こされる疾病状
態の治療や予防のためにも、大きな価値を持っている。しかし、殺虫剤として用
いられている現行の化学物質は最良とはいえない。いくらかは哺乳類に対して明
らかな毒性を示し、また標的種のいくつかには、これらの殺虫剤の一部に抵抗性
を示すものが出てきている。このため、新規な作用メカニズムを持つ新しい選択
的な殺虫剤に対する需要がある。
【0007】 神経ペプチドリガンドを持つ昆虫GPCRの例は、既知ではあるが、[Liら、
EMBO Journa1, 1991, 10,3221-3229; Liら、J. Biol. Chem. 1992,267,9-12; Mo
nnierら、J. Biol. Chem., 1992,267, 1298-1302;Vanden Broeckら、Int. Rev.
Cytology, 1996, 164, 189-268; Guenrero, Peptides, 1997, 18, 1-5; Hauser
ら、J. Biol. Chem., 1997,272, 1002-1010; Birgulら、 EMBO J. 1999, 18,589
2-5900; Torfsら、J. Neurochem. 2000,74,2182-2189; およびHauserら、Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 1998, 249,822-828]、いずれもまだ新しい殺虫剤の発
見の目的で使われているという報告はない。
【0008】 典型的に無脊椎動物(例えば昆虫)に見出され、通常長さが4〜12アミノ酸
のペプチドの多きなファミリーは、FMRFアミド関連ペプチド(すなわち、F
aRP)として知られる神経ペプチドの分類である。典型的なFMRFアミドペ
プチドは、C末端の「FMRF」コンセンサスアミノ酸配列が、一般的に、(F
,Y)(M,V,I,L)R(F,Y)NH2からなっているため、このように
名づけられた。神経ペプチドとして、これらの分子は神経筋の制御が求められる
重要な生物プロセスに関与している。しかし、(神経ペプチドを含む)神経伝達
物質や神経調節物質のいくつかはレセプターのリガンドとして作用することが分
かっているが、GPCRのリガンドとしてのFaRP神経ペプチドはいまだに見
つかっていない。
【0009】 アラトスタチンは、多くの昆虫種で変態や再生に中心的な役割を果たすことが
知られている幼弱ホルモンの合成などの多様な機能を制御する昆虫神経ホルモン
の重要な群である。最初のショウジョウバエアラトスタチン、Ser−Arg−
Pro−Tyr−Ser−Phe−Gly−Leu−NH2(すなわち、ドロス
タチン−3)は、ショウジョウバエの頭部の抽出物から単離された。[Birgulら
、The EMBO J., 1999, 18, 5892-5900]。最近、ショウジョウバエ・アラトスタ
チン・プレプロプホルモン遺伝子がクローン化された。この遺伝子は、次の4つ
のショウジョウバエ・アラトスタチンをコード化している。Val−Glu−A
rg−Tyr−Ala−Phe−Gly−Leu−NH2(ドロスタチン−1)
,Leu−Pro−Val−Tyr−Asn−Phe−Gly−Leu−NH2
(ドロスタチン−2),Ser−Arg−Pro−Tyr−Ser−Phe−G
ly−Leu−NH2(ドロスタチン−3)および、Thr−Thr−Arg−
Pro−Gln−Pro−Phe−Asn−Phe−Gly−Leu−NH2(
ドロスタチン−4)。[Lenzら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000,273, 112
6-1131]。これら第一のショウジョウバエ・アラトスタチンレセプターは、Bi
rgulらによりクローン化され、Gi/Go経路を経由してドロスタチン−3
により機能的に活性化されていることが示された。[Birgulら、EMBO J. 1999,
18, 5892-5900]。第二の推定上のショウジョウバエアラトスタチンレセプター
(すなわち、DARII)が、最近クローン化された。[Lenzら、Biochem. Bio
phys. Res. Comm. 2000,273,571-577]このDARIIレセプターcDNA(acc
ession No. AF253526) は、第一のショウジョウバエアラトスタチンレセプター
に強く関係しているタンパク質をコードしている。しかし、アラトスタチンによ
るDARIIの機能的な活性化の例は、いまだに報告されていない。
【0010】 スルファキニンは、Tyr硫酸化昆虫神経ペプチドの科目である。それらは、
脊椎動物のペプチドであるガストリンやコレシストキニンに似た配列や機能(筋
栄養効果、筋消化酵素放出の刺激)を示す。2つのスルファキニン(ドロスルフ
ァキニンとも呼ばれる)をコード化する遺伝子、DSKI[Phe−Asp−A
sp−Tyr(SO3H)−Gly−His−Met−Arg−Phe−ami
de]<配列番号:160>と、DSKII[Gly−Gly−Asp−Asp
−Gln−Phe−Asp−Asp−Tyr(SO3H)−Gly−His−M
et−Arg−Phe−amide]<配列番号:161>が、ショウジョウバ
エメラノガスターにおいて同定されている。[Nichols, Mol. Cell Neuroscienc
e, 1992, 3, 342-347; Nicholsら、J. Bio1. Chem. 1988,263, 12167-12170]。
C末端のヘプタペプチド配列、Asp−Tyr(SO3H)−Gly−His−
Met−Arg−Phe−amide<配列番号:162>、は、進化的に大き
く異なる昆虫から今までに同定されたすべてのスルファキニンと同一である。広
く多岐にわたる昆虫分類間において、硫酸化されたTyr残基の存在も含み、こ
のぺプタペプチド配列が保存されていることは、この筋栄養の「活性中心」の持
つ機能的な重要性を反映するものと考えられる。[Nachman & Holman, in Insec
t Neuropeptides; Chemistry, biology and action, Kelly & Massler, Eds., 1
991, pp. 194-214, American Chemical Society, Washington, D.C.]。我々の
知る限り、昆虫スルファキニンに対するレセプターは今まで同定されていない。
【0011】 発明の概要 本発明は、ショウジョウバエメラノガスターの持つ新規なポリペプチドの驚く
べき発見に関するものである。ここで、このポリペプチドを、DmGPCR(シ
ョウジョウバエメラノガスターGタンパク質結合レセプター)と命名する。この
ポリペプチドは、他の神経ペプチドGPCRと、程度の異なる相同性を示す。本
発明は、今まで未知のGタンパク質結合レセプターをコード化する遺伝子、これ
らの遺伝子がコードするDmGPCRポリペプチド、これらのポリペプチドの抗
体、これらのポリヌクレオチドやポリペプチドを使ったキット、および、前記す
べてのものを製造し、および使用する方法を提供する。これらのDmGPCRは
、例えば、神経ペプチドの結合および/または伝達の制御において、主要成分と
しての役割を果たしていると見られる。DmGPCRは、神経ペプチドまたは他
の物質による結合および/または伝達を変化させおよび/または制御することの
できる新規物質の探索に有用である。本発明のDmGPCRは、神経ペプチドと
結合する、結果的に治療法に結びつくヒトでのホモログを探査する上でも重要で
ある。このような治療の対象となる疾病や状態の例としては、なかでも、HIV
−1またはHIV−2により引き起こされるウィルス感染などの感染病、疼痛、
癌、パーキンソン病、低血圧、高血圧、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化、
血栓症、卒中、腎不全、炎症、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患や、精神病など
、および、不安、精神分裂病、そううつ病、精神錯乱、痴呆、神経疾患、ひどい
精神遅滞や、ハンチントン病またはツレット症候群などの運動障害を含む神経疾
患などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明のこ
れらおよび他の特徴を以下に述べる。
【0012】 一つの実施形態において、本発明は、配列番号:2,4、6、8、10,12
,14,16,18,20,22または24のいずれかに記載されたアミノ酸を
含む精製単離されたDmGPCRポリペプチド、または、DmGPCRに特異的
なエピトープを含むそのフラグメントを提供する。なお、「に特異的なエピトー
プ」は、後ほど述べるように、DmGPCRに特異的な抗体により認識されるD
mGPCRレセプターの一部を意味している。より好ましい実施形態は、表4に
示される配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,2
2,または24の完全アミノ酸配列を含む精製単離ポリペプチドを含む。これら
のアミノ酸配列は、DmGPCRをコード化したポリヌクレオチド配列(配列番
号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,または23,
以下の表4に記載)より推論したものである。ここで、用語「DmGPCR」を
単数で表したが、これは、この用語「DmGPCR」が以下に例示する10個の
アミノ酸配列それぞれを含有することが意図されているためである。
【0013】 ここで提供された配列は特定のショウジョウバエ配列であるが、本発明は、そ
の範囲内に、DmGPCRの対立遺伝子の変異体や、他の脊椎動物における異な
ったの形状のDmGPCRも含んでいる。
【0014】 細胞外のエピトープは、DmGPCRなどのレセプターに結合する抗体や他の
結合物質を作成および探索するのに特に有用であると認識されている。このため
、もう一つの実施形態では、本発明は、DmGPCRの細胞外領域(例えば、N
末端細胞外領域、または3種の細胞外ループの内のうちの一つ)の少なくとも一
つを含む精製単離ポリペプチドを提供する。DmGPCRのN末端細胞外領域を
含む精製単離されたポリペプチドが特に好ましい。また、DmGPCRのN末端
細胞外領域、DmGPCRの膜貫通領域、DmGPCRの膜貫通領域を連結する
細胞外ループ、DmGPCRの膜貫通領域を連結する細胞内ループ、DmGPC
RのC末端細胞内領域、およびこれらの融合体よりなる群から選ばれたDmGP
CRのフラグメントを含む精製単離ポリペプチドも好ましい。このようなフラグ
メントは、天然レセプターの連続部分であるかもしれない。しかし、ここに提供
されるDmGPCR遺伝子やそのタンパク質配列についての知識は、この天然タ
ンパク質では隣接していないいろいろな領域の組換えを可能とすることも認識す
べきであろう。
【0015】 もう一つの実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコード化す
るヌクレオチド配列を含む精製単離ポリヌクレオチド(例えば、cDNA、ゲノ
ムDNA、合成DNA、RNA、またはこれらの混合物、単一もしくは二本鎖に
関係なく)を提供する。このようなポリヌクレオチドは、組換え的にレセプター
を発現するのに有用で、また細胞内でのレセプターの発現を(例えば、ノーザン
ハイブリダイゼーションやインサイチュハイブリッド形成法アッセイで)検出す
るためにも有用である。また、これらのポリヌクレオチドは、治療目的あるいは
異常なDmGPCRの発現に特徴的な疾病または状態のモデルを提供する目的で
、培養細胞、組織、または動物内でのDmGPCRの発現を抑制するアンチセン
ス分子や他の分子を設計する上で有用である。なお、宿主細胞中の組換えのない
天然の完全染色体は、本発明のポリヌクレオチドの定義から明らかに外れている
。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,
15,17,19,21、または23に示されるいずれかの配列を持っており、
それぞれ天然のDmGPCR配列に相当している。普遍的遺伝暗号の縮重のため
、配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22、ま
たは24で規定されるDmGPCRをコード化している、これ以外のポリヌクレ
オチド配列も存在することもあるかもしれない。
【0016】 本発明は、また、哺乳動物のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を
含む、次のような精製単離ポリペプチドも提供する。ここで、そのポリペプチド
は、配列番号:1,3,5,7,9,I1,13,15,17,19,21また
は23で規定される配列を持つポリヌクレオチド、または、これに相補的な非コ
ード鎖とハイブリッドを形成している。なお、ハイブリッドは、次の条件で形成
される。 (a)50%ホルムアミド、1%SDS、1M塩化ナトリウム、10%デキスト
ラン硫酸を含むハイブリッド化溶液中で、42℃、16時間ハイブリッド化、お
よび (b)0.1%SSC、1%SDSを含む洗液中で、2回30分間、それぞれ6
0℃で洗浄。
【0017】 関連する実施形態として、本発明は、本発明のポリペプチドを含むベクターを
提供する。このようなベクターは、例えば、このポリヌクレオチドを有用な量に
まで宿主細胞中で増殖させるのに有用である。このベクターは、本発明のポリヌ
クレオチドが、発現を支配する配列を含むポリヌクレオチドに、実効的に結合し
ている発現ベクターであることが好ましい。このようなベクターは、本発明のポ
リペプチドの組換え生産に有用である。
【0018】 さらに、もう一つの関連する実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオ
チドまたは本発明のベクターで形質転換あるいは形質移入された宿主細胞を提供
する。前述のように、このような宿主細胞は、ポリヌクレオチドの増幅に有用で
あり、また、ポリヌクレオチドにコード化されているDmGPCRポリペプチド
またはそのフラグメントの発現に有用である。
【0019】 さらに、もう一つの関連実施形態では、本発明は、DmGPCRポリペプチド
(または、そのフラグメント)の生産方法を提供する。この生産方法は、本発明
の宿主細胞を栄養培地で増殖させるステップ、および細胞または培地からポリペ
プチドまたはその変異体を単離するステップからなっている。DmGPCRが7
回膜貫通レセプターであるため、用途によっては、例えば活性測定アッセイなど
の用途の場合はそのポリペプチドが埋包された細胞膜を単離することが、また他
の用途ではより完全な単離がより好ましいと考えられる。
【0020】 さらに、もう一つの実施形態では、本発明は、本発明のDmGPCRに特異的
な抗体を提供する。抗体の特異性についてはより詳細に以下に述べられる。しか
し、過去の文献に記載されたポリペプチドから作りうる抗体や、偶然にDmGP
CRと交差反応することのできる抗体(例えば、両ポリペプチド中に似たエピト
ープが偶然存在するため)は、「交差反応」抗体であることは強調されるべきで
ある。このような交差反応抗体は、DmGPCRに「特異的」な抗体ではない。
ある抗体がDmGPCRに特異的であるかどうか、または、もう一つの既知のレ
セプターと交差反応するかどうかを決めるには、公知の技術、例えば、ウェスタ
ンブロットアッセイなどいくつかのアッセイのいずれかを使って行われる。Dm
GPCRを発現する細胞を同定し、またDmGPCRリガンド結合活性を調節す
るためには、DmGPCRのエピトープに特異的に結合する抗体が好ましい。
【0021】 一つの好ましい実施形態の変形として、本発明は、モノクローナル抗体を提供
する。このような抗体を産生するバイブリドーマも、本発明の態様に含まれる。
さらにもう一つの変形として、本発明はヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は生
体外での治療指標として有用である。
【0022】 もう一つの変形として、本発明は、ポリクローナル抗体を含む無細胞組成物を
提供する。なお、ポリクローナル抗体の内少なくとも一つの抗体は、本発明のD
mGPCRに特異的な抗体である。動物から分離される抗血清は、一つの例示組
成物であり、水または他の希釈剤、腑形剤、または担体に再懸濁された抗血清の
抗体成分を含む組成物もまた同じである。
【0023】 さらにもう一つの関連実施形態として、本発明は、DmGPCRに特異的な抗
体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。
【0024】 抗体が、化学的にあるいは組換え的に単離可能な比較的小さな抗体結合領域を
持つことは、よく知られている。このような領域は、それ自体、有用なDmGP
CR結合分子であり、またヒト抗体に再導入されるか、毒素あるいは他のポリペ
プチドと融合されてもよい。さらにもう一つの実施形態として、本発明は、Dm
GPCR特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。なお、この
フラグメントおよぼこのポリペプチドは、DmGPCRに結合する。例を限定し
ないために、本発明は、1本鎖抗体やCDRグラフト抗体であるポリペプチドを
提供する。
【0025】 また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体からなり、例え
ば製薬的に許容できる担体と共に製剤された組成物も、本発明の範囲の中に含ま
れる。
【0026】 本発明は、本発明の抗体の使用方法も提供する。例えば、本発明は、抗体がレ
セプターと結合する条件下で、DmGPCRとDmGPCRに特異的な抗体とを
接触させるステップを含むDmGPCRのリガンド結合を調整する方法を提供す
る。
【0027】 脳内で発現される哺乳類のDmGPCRホモログは、DmGPCR伝達活性の
異常が、神経的または心理的障害と相関しているかも知れないことを示唆してい
る。本発明は、神経的または精神医学的障害の治療法を提供する。この治療法は
、このような治療を必要とする哺乳類に、本発明の抗体様ポリペプチドを、哺乳
類のニューロン中のDmGPCRに結合するリガンドを調節するのに足る量を投
与することを特徴とする。DmGPCRの哺乳類ホモログは、他の組織、例えば
、すい臓(および、特にすい島組織)、下垂体、骨格筋、脂肪組織、肝臓や甲状
腺などで発現される可能性があるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0028】 本発明は、DmGPCRに結合する化合物を特定するためのアッセイも提供す
る。このアッセイの一つの例は、(a)DmGPCRを含む組成物を、DmGP
CRと結合すると予想される化合物と接触させるステップと、(b)その化合物
とDmGPCRとの結合を測定するステップを含む。一つの変化例において、上
記組成物は、表面にDmGPCRを発現する細胞を含む。さらにもう一つの変化
例は、単離DmGPCR、またはDmGPCRを含む細胞膜が使用される。結合
を、例えば標識化合物を使用して直接測定してもよいし、あるいは、化合物によ
り引き起こされるDmGPCRの細胞内情報伝達を測定することなどいくつかの
間接的な技法を用いて測定してもよい。
【0029】 本発明は、DmGPCRとDmGPCR結合パートナーとの間の結合のモジュ
レーターを特定する方法も提供する。この方法は、(a)DmGPCR結合パー
トナーと、DmGPCRを含む組成物を、推定されるモジュレーターの存在下お
よび不存在下で接触させるステップ、(b)結合パートナーとDmGPCRとの
間の結合を検出するステップ、次いで、(c)推定モジュレーターの存在下で起
こる結合パートナーとDmGPCR間の結合と、推定モジュレーター不存在下の
結合とを比較し、その増減から、推定モジュレーター化合物またはモジュレータ
ー化合物を特定するステップ、を含む。
【0030】 DmGPCR活性を刺激するDmGPCR結合パートナーは、DmGPCRの
情報伝達が不足していることを特徴とする疾病状態や状況において、作動薬とし
て有用である。リガンドが仲介するDmGPCR情報伝達をブロックするDmG
PCR結合パートナーは、DmGPCR拮抗薬として、過度のDmGPCR情報
伝達を特徴とする疾病状態や状況に対して有用である。また、DmGPCRモジ
ュレーターは、DmGPCRポリヌクレオチドやポリペプチドと同様に、このよ
うな疾病や状況の診断用アッセイとして有用である。
【0031】 もう一つの態様として、本発明は、疾病や異常状況の治療方法を提供する。こ
の治療方法は、そのような治療を必要とする患者に、配列番号:2,4,6,8
,10,12,14,16,18,20,22,または24の群から選ばれるポ
リペプチドの活性や発現を調整する物質を投与することによる。
【0032】 もう一つの態様として、本発明は、疾病や障害の診断手段として、あるサンプ
ル中のポリペプチドを検出する方法を取り上げる。なお、この方法は、次のステ
ップからなっている。(a)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,1
6,18,20,22,または24の群から選ばれるポリペプチドの核酸標的領
域と、ハイブリッド化アッセイ条件下で、ハイブリッド化する核酸プローブと、
そのサンプルを接触させるステップ、(ただし、前記プローブは、そのポリペプ
チドあるいはそのフラグメントをコード化する核酸配列からなっている。)(b
)プローブ:標的領域ハイブリッドの存在あるいは量を、疾病の指標として検出
するステップ。
【0033】 本発明の好ましい実施形態において、疾病は、代謝異常、リウマチ様関節炎、
動脈硬化症、自己免疫疾患、組織移植、心筋梗塞、心筋症、卒中、腎不全、酸化
ストレス関連神経変性異常や癌などの群の中から選ばれる。
【0034】 障害または疾病の治療に有用な物質は、問題の疾病や異常の治療に対応する活
性について、少なくとも一つの体外アッセイにおいてポジティブな結果を示すこ
とが好ましい。ポリペプチドの活性を調整する物質としては、例えば、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、作用薬や拮抗薬、およびプロテインキナーゼが好まし
いが、これらに限定されるものではない。
【0035】 ハイブリッド化条件は、、他の核酸分子の存在下でのみ、遺伝子とのハイブリ
ッド化が起こるような条件でなければならない。厳格なハイブリッド化条件にお
いてのみ、高い相補性を持つ核酸配列がハイブリッド化する。20個の隣接する
ヌクレオチド中に1または2個のミスマッチを持つような核酸のハイブリッド化
が阻害されるような条件が好ましい。このような条件は格別に規定される。
【0036】 サンプル中の遺伝子の検出が診断に利用できる疾病には、核酸(DNAおよび
/またはRNA)が、通常の細胞と較べて増幅されているような疾病を含んでい
る。なお、[増幅]とは、細胞中のDNAまたはRNAの数が、正常細胞に比べ
増加していることを意味している。
【0037】 サンプル中の核酸の検出で診断できる疾病には、好ましくは、中枢神経系およ
び代謝病が含まれる。本発明の核酸プローブ法に適する試験サンプルには、例え
ば、細胞、細胞の核酸抽出物、または生物的流体が含まれる。前述の方法に用い
られるサンプルは、アッセイ形式、検出法やアッセイされる組織、細胞または抽
出物により変動するとみられる。細胞の核酸抽出物を調整する方法は公知であり
、使用する方法に適したサンプルを得るのに利用されうる。
【0038】 また、本発明のこれ以外の特徴や変形は、本分野に精通するものにとって、詳
細な説明も含めた本出願全体から明らかであり、これらの特徴のすべても本発明
の態様とすべきである。同様に、ここに記載の本発明の特徴は、再編成して、新
たな実施形態とすることも可能である。このことは、本願記載の特徴を結合して
、ここに本発明の態様あるいは実施形態として具体的に言及されたかどうかに係
わらない。また、ここに本発明において決定的に重要であると記載された制限の
みが、そのように見なされるべきである。ここで決定的に重要であると記載され
ていない制限条件を欠いた本発明の変形は、本発明の態様とみなすべきである。
【0039】 発明を実施するための最良の形態 本発明は、特に、ショウジョウバエメラノガスターGタンパク質結合レセプタ
ー(DmGPCR)またはその一部をコードする単離精製されたポリヌクレオチ
ド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、DmGPCRを生産プロセス、上記ポリヌクレオチドおよびベク
ターの使用方法、単離および精製されたDmGPCR、DmGPCR活性を調節
する化合物を探索する方法、および、哺乳類あるいは他の脊椎動物のDmGPC
Rホモログを同定するための方法を、提供する。
【0040】 本文書では、様々な定義がされている。ほとんどの用語は、当分野には公知の
用語に帰すべき意味を持つ。本文書において以下又その他のところに特に定義さ
れた用語は、本発明の文脈全体より与えられる意味を持ち、典型的には当業者に
は理解可能なものである。ここに述べられ、当業者に理解されている「合成され
た」とは、酵素法ではなく純粋に化学的方法に生産されたポリヌクレオチドをさ
す。「全」合成DNA配列とは、したがって、完全に化学的手段で作られたもの
、また、「部分」合成DNAは、得られるDNAの一部のみが化学的手段で作ら
れたものである。用語「領域」は、バイオ分子の一次構造の物理的隣接部分であ
る。タンパク質の場合、ある領域とは、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接部
分で定義される。用語「ドメイン」は、バイオ分子の既知のあるいは想定される
機能に寄与できる構造部分をさす。ドメインは、領域あるいはその一部分と同じ
大きさを持っていても良く、ドメインは、バイオ分子の一部分を含んでもよい。
領域の全体または一部の以外に、特定領域とは異なるバイオ分子の一部分を含ん
でもよい。GPCRタンパク質ドメインの例としては、細胞外(すなわち、N末
端)、膜貫通および細胞内(すなわち、C末端)ドメインを含むが、これに限定
されるものではない。これらは、GPCRの類似した名称の領域、GPCRの7
本の各膜貫通部分、隣接する膜貫通部分を連結するループ部分(細胞外および細
胞内)と同じ広がりを持っている。
【0041】 ここで使用される用語「活性」は、応答に影響する、すなわち暴露または刺激
に応答して測定可能な影響をもつ直接または間接的な結合を示唆または示す測定
可能な指標であり、例えば、ある物質が本発明のポリペプチドやポリヌクレオチ
ドと直接結合する際の親和性、またはある刺激または現象の後での上流または下
流のタンパク質量または他の類似機能の測定値などを含んでいる。
【0042】 ここで使用される用語「抗体」は、完全無傷抗体、Fab、Fab’、F(a
b)2、およびこれらのフラグメントをさす。完全無傷抗体には、マウスモノク
ローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などのモノクローナル抗体を含む。
【0043】 ここで使用される用語「結合」は、タンパク質または複合体、結合タンパク質
またはその複合体、あるいはこれらの組み合わせ間の、物理的化学的相互作用を
意味する。結合は、イオン的、非イオン的、水素結合、ファンデアワールス、疎
水相互作用などを含む。物理的相互作用、結合は、直接的にも間接的にも可能で
、間接的には他のタンパク質や化合物の影響による。直接結合は、他のタンパク
質や化合物を経由したりこれらの影響に依存することなく、また、他の化学中間
体の存在が実質的に無い状態で起こる相互作用を持つことを指す。
【0044】 ここで使用される用語「化合物」は、同定可能な化学品または分子であり、低
分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、核酸などを含むが、こ
れに限定されるものではない。これらの化合物は、天然品でも合成品でもよい。
【0045】 ここで使用される用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワ
トソンクリック塩基対形成を指す。
【0046】 ここで使用される用語「接触」は、ある化合物を、本発明のポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの物理的近傍に、直接的間接的に持っていくことを指す。ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドは、どのような緩衝液、塩、溶液などに入っ
ていてもよい。接触は、例えば、化合物を、核酸分子またはGPCRまたはその
フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、ビーカー、マイクロタイタ
ープレート、細胞培養フラスコ、またはジーンチップなどのマイクロアレーなど
に入れることも含む。
【0047】 ここで使用される用語「相同性ヌクレオチド配列」または[相同性アミノ酸配
列」またはこれらの変化例は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも
特定の割合の相同性を示すこと特徴とする配列を指す。相同性ヌクレオチド配列
は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列も含む。このようなアイソフ
ォームは、例えばRNAの選択的スプライシングの結果、同一生物体の異なる組
織に発現されうる。他方、アイソフォーム」は、異なる遺伝子によりコードされ
ていてもよい。相同性ヌクレオチド配列は、昆虫を除く種、例えば哺乳類、の特
定のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同性ヌクレオチド配列
は、また、ここに規定するヌクレオチド配列の自然に起こる対立遺伝子の変化や
変異も含まれるが、これに限定されるものでない。しかし、相同性ヌクレオチド
配列は、他の既知GPCRをコードするヌクレオチド配列は含んでいない。相同
性アミノ酸配列は、少しのアミノ酸の置換をコードしたアミノ酸配列や、神経ペ
プチド結合および/または伝達活性をもつポリペプチドを含んでいる。しかし、
相同性アミノ酸配列は、他の既知GPCRをコードするアミノ酸配列を含んでい
ない。相同性の比率は、例えば、デフォルト値を使用してGap プログラム(ウィ
スコンシン配列分析パッケージ, Ver.8 for Unix, Genetics Computer Group, U
niversity Research Park, Madison WI)によって決定でき、それはSmith
とWaterman([Adv. App1. Math., 1981,2,482-489]、出典明示して、
その全体を本明細書の一部とみなす)のアルゴリズムを用いる。
【0048】 ここで使われる用語「単離」核酸分子は、元来の環境から分離された核酸分子
(DNAまたはRNA)を指す。単離核酸分子には、ベクター中に取り込まれた
組換えDNA分子,異種の宿主細胞に入った組換えDNA分子、完全または部分
精製核酸分子や合成DNAまたはRNA分子を含むが、これに限定するものでは
ない。
【0049】 ここで使われる用語「調整する」または「修飾する」は、特定の活性またはタ
ンパク質の量、質または効果を、増加または減少させること意味する。
【0050】 ここで使われる用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)に使われるのに十分な塩基数を持つ一連の連鎖ヌクレオチド残基を指す。こ
の短い配列は、ゲノムまたはcDNA配列により決められ(または設計され)、
特定の細胞または組織中で、同一、類似または相補性DNAまたはRNAを、増
幅させ、確認し、その存在を明らかにするのに使われる。オリゴヌクレオチドは
、約10個以上50個までのヌクレオチドを持つDNA配列の一部であり、好ま
しくは、15から30のヌクレオチドを持つ。それらは化学合成され、プローブ
として利用してもよい。
【0051】 ここで使われる用語「プローブ」は、可変長の核酸配列であり、用途にもよる
が、好ましくは10以上6,000まで個のヌクレオチドを持つ。それらは、同
一、類似、または相補的な核酸配列の検出に用いられる。天然または組換え源か
ら得られたプローブの長さが大きくなる程、オリゴマーに較べより特異的で、よ
りハイブリッド形成が遅くなる。それらは、一本鎖または二本鎖のいずれかで、
PCR、膜法ハイブリッド形成、ELISAなどの技法おいて特異性が発揮でき
るように設計されている。
【0052】 用語「阻止する」は、生物体が異常な状態に変化する可能性を減少させること
を指す。
【0053】 用語「治療する」は、治療効果をもつこと、生物体の異常な状態を、少なくと
も部分的に軽減または抑止することを指す。
【0054】 用語「治療効果」は、異常な状態を引き起こすかそれに寄与する阻害または活
性化因子を指す。治療効果は、異常状態の症状のうち、少なくとも一つの症状を
ある程度緩和する効果をもつ。異常状態の治療に関連し、治療効果は、以下の一
つ以上を指す。(a)細胞の増殖、成長、および/または分化の増加、(b)細
胞死の阻害(すなわち、減速または停止)、(c)退化の阻害、(d)異常状態
に伴う症状のうち、少なくとも一つの症状のある程度の緩和、および、(e)影
響を受けた細胞群の機能の増加。異常状態に対して有効な化合物は、以下に記載
のようにして同定可能である。
【0055】 用語「異常状態」は、ある生物体の細胞または組織が、その本来持つ機能から
外れたを機能を持つことを指す。異常状態は、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の
情報伝達、または細胞の生存に関係する。異常状態は、また、肥満、網膜退化な
どの糖尿病合併症、グルコースの摂取と代謝や脂肪酸摂取と代謝の異常などを含
んでもよい。
【0056】 異常な細胞増殖状態は、線維症や糸球体間質障害などの癌、異常な血管壊死、
脈管形成、創傷治癒、乾癬、真正糖尿病、炎症などを含む。
【0057】 異常な分化状態は、神経変性障害、遅い創傷治癒速度、および遅い組織移植治
癒速度などを含むが、これに限定されない。
【0058】 異常な細胞情報伝達状態は、過度の神経伝達物質活性などの精神障害を含むが
、これに限定されるものではない。
【0059】 異常な細胞生存状態は、プログラム細胞死(アポトーシス)経路が活性化また
は排除されている状態などに関連する。一連のプロテインキナーゼがアポトーシ
ス経路に関係している。プロテインキナーゼのいずれの機能異常も、細胞の不死
または時期の早い細胞死につながりうる。
【0060】 用語「投与する」は、生物体の細胞または組織に、ある化合物を受け入れさせ
る方法に関する。生物体の細胞または組織が、その生物体の内部または外部にあ
る時のいずれにおいても、異常状態は防止できるし治療することもできる。生物
体の外部に存在する細胞は、細胞培養プレート内で維持または成長させることが
可能である。 生物体内にある細胞に対して、化合物を投与する技法は、たくさん知られている
。 これらの技法は、経口、非経口、経皮、インジェクションやエアゾール投与法
などを含むが、これに限定するものではない。生物体外部にある細胞に対して化
合物を投与する方法も数多く知られている。例えば、細胞マイクロインジェクシ
ョン法、形質転換法やキャリアー法などが含まれるが、これらに限定するもので
はない。
【0061】 ある生物体に、シグナル伝達経路に異常を持つ一群の細胞に対してある化合物
を投与することで、異常状態を予防または治療することが可能である。生物体の
機能に与える化合物投与が与える効果を、次いで測定できる。生物体は、好まし
くは、マウス、ウサギ、モルモットまたはヤギで、より好ましくは、モンキー(
猿)またはエイプ(類人猿)である。
【0062】 「増幅」は、細胞中のDNAまたはRNAの数が、正常細胞に比べて、多くあ
ることを意味する。RNAの場合、いくつかの正常細胞では基礎的なRNAの発
現はないため、「増幅」とは、細胞中にRNAが検出可能な程度存在することと
なる。他の正常細胞では、発現の基礎レベルが存在し、このためこのような場合
は、増幅は、基礎レベルに比べ1〜2倍、好ましくはそれ以上の検出ができると
いうこととなる。
【0063】 ここで用いる熟語「ストリンジェントハイブリッド形成条件」または「ストリ
ンジェント条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標
的配列とハイブリッドを形成し、他の配列とはハイブリッド形成しない条件を指
す。ストリンジェント条件は配列に依存すし、異なる状況では異なるだろう。よ
り長い配列は、より高温でハイブリッド形成する。一般に、厳格条件には、限定
されたイオン強度とpHで、特定の配列の熱的融点(Tm)より約5℃低い温度
が選ばれる。その融点は、(限定されたイオン強度、pHと核酸濃度下)平衡状
態で、標的配列に相補的なプローブの50%が標的配列とハイブリッド形成する
温度をである。標的配列は通中過剰に存在するため、Tmでは、プローブの50
%が平衡状態で使われている。厳格条件は、典型的には、塩濃度が約1.0Mナ
トリウムイオン、典型的には約0.01ないし1.0Mナトリウムイオン(また
は他の塩)、pHが7.0から8.3で、短いプローブ、プライマーまたはオリ
ゴヌクレオチドでは温度が少なくとも30℃、また長いプローブ、プライマー、
またはオリゴヌクレオチドでは温度が少なくとも60℃の条件である。厳格条件
は、ホルムアミドなどの不安定化試薬を添加して作ってもよい。
【0064】 アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に表される。アミノ
基とカルボキシ基は配列には表記しない。ヌクレオチド配列は、一本鎖のみで表
され、5’から3’方向に、左から右に表記される。ヌクレオチドとアミノ酸は
、IUPAC−IUB生化学品命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commi
ssion)の勧める様式、または、(アミノ酸については)三文字コードで表記さ
れる。
【0065】 本発明のゲノムDNAは、本発明のポリペプチドをコードするタンパク質コー
ド領域からなり、またこの対立遺伝子変異も含んでいる。多くの遺伝子、ゲノム
DNAは転写されてRNA転写物になり、RNA転写物は1回以上のスプライシ
ング現象を受ける。この際、転写物のイントロン(すなわち、非コード領域)は
除去、またはスプライスアウトされる。RNA転写物は、異なったメカニズムの
スプライスを受けることもでき、異なったRNAの切除を受けることもできる。
異なったスプライシングを受けたものの同じDmGPCRポリペプチド配列を保
持することもある。このような転写物は、スプライス変異体とよばれ、これも本
発明の範囲内である。本発明に含まれるスプライス変異体は、したがって、同一
の元ゲノムDNAによりコードされていた、異なったmRNA転写物である。対
立遺伝子変異体は、野生型の遺伝子配列の修飾型であり、修飾は染色体の分離、
または遺伝的突然変異を引き起こす条件への暴露の間の組換えの結果として起こ
る。対立遺伝子変異体は、野生型の遺伝子と同じく、自然に発生するはいれつで
あり、体外の操作で起こる非天然発生型の変異体とは異なる。
【0066】 本発明は、DmGPCRをコードするRNAポリヌクレオチドの逆転写により
得られるcDNAも含有する。(通常、相補的鎖から第二の鎖を合成し二重鎖D
NAを与える。)
【0067】 DmGPCRポリペプチドをコードするDNA配列は、配列番号:1,3,5
,7,9,11,13,15,17,19,21,または23のいずれかに規定
されるものが好ましい。本発明の好ましいDNAは、DNAのワトソンクリック
塩基対形成ルールに従って、コード鎖から間違いなく推定することのできる配列
を持つ二重鎖分子ならびに相補分子(「非コード鎖」または「補体」)である。
本発明の特定DmGPCRポリペプチドのいずれかをコードする他のポリヌクレ
オチドで、有名な遺伝コードの縮重により、ここの記載の特定のポリヌクレオチ
ドとは配列の異なる本発明のDmGPCRポリペプチドのいずれかをコードする
異なった配列を持つものも好ましい。
【0068】 本発明は、他種、好ましくは哺乳類の、DmGPCRのDNAのホモログも含
んでいる。種ホモログ、時にはオルソログとも呼ばれる、は、一般に、少なくと
も35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくと
も60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくと
も80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も98%、または少なくとも99%以上、本発明のDNAと相同性を持っている
。一般に、本発明のポリヌクレオチドの配列相同性比率は、候補配列中のヌクレ
オチド塩基が持つ、特定のポリヌクレオチド配列で記載されているDmGPCR
配列中のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの比率として計算してよい。この比
率の計算は、2つの配列を整列し、必要ならギャップを入れて、配列の一致が最
大となるようにした後になされる。
【0069】 本発明により与えられるポリペプチド配列情報により、当業界で公知で広く実
践されている技法で、コードされたポリペプチドを大量に発現することが可能と
なる。本発明のポリヌクレオチドはまた、有名な手法、サザンおよび/またはノ
ーザンハイブリッド形成法やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで、対立遺伝
子変異体や種ホモログなどの関連DmGPCRポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの同定や単離を可能とする。関連ポリヌクレオチドの例は、ゲノム配
列を含み、対立遺伝子変異体を含み、また、DmGPCRのポリペプチドホモロ
グ、およびDmGPCRの持つ生物的免疫的および/または物理的特徴のうち一
つ以上の特徴を持つ構造類似のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
む。DmGPCRのタンパク質ホモログをコードする遺伝子は、サザンおよび/
またはPCR分析で同定され、GPCR障害の動物モデルで有用である。DmG
PCRのDNA配列の知識はまた、サザンハイブリッド形成法またはポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)を使うことで、プロモーター、オペレーター、エンハンサ
ー、レプレッサーなどのDmGPCR発現制御調整配列をコードするゲノムDN
A配列の同定を可能とする。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞のDmGP
CR発現能力を検出するハイブリッド形成アッセイに有用である。本発明のポリ
ヌクレオチドは、また、DmGPCRの遺伝子座の遺伝的変化を特定するために
有用な診断方法の基礎を提供する。また、この遺伝子座の変化に関する情報は、
診断および治療方針の決定に有用である。
【0070】 DmGPCRポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドに関する本開
示は、当業界で普通の技能を持つ労働者に、その完全長ポリヌクレオチドのあら
ゆるフラグメントを提供することとなる。本発明は、このため、DmGPCRを
コードするポリヌクレオチド中の、少なくとも14個、好ましくは少なくとも1
6、18、20、25、50または75個の連続ヌクレオチドを含む、DmGP
CRをコードするポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。好ましくは、本
発明のフラグメントヌクレオチドは、DmGPCRをコードするポリヌクレオチ
ド配列に独特の配列、および、このために、高度に厳格なまたは中程度に厳格な
条件でのみ(すなわち、特異的に)、DmGPCRをコードするポリヌクレオチ
ド(または、そのフラグメント)とハイブリッド形成する配列を含む。本発明の
ゲノム配列のポリヌクレオチドフラグメントは、コード領域に独特の配列だけで
なく、イントロン由来の完全長配列のフラグメント、調節領域、および/または
他のイントロン由来の配列も含んでいる。本発明のポリヌクレオチドに特有の配
列は、他の既知ポリヌクレオチドと配列を比較することにより認識が可能で、当
業界で広く使用されている整列プログラム、例えば公共の配列データベースから
提供されるもの、を使用することで同定が可能である。このような配列はまた、
サザンハイブリッド形成分析法により、あるポリヌクレオチドがハイブリッド形
成可能な、ゲノムDNAのフラグメントの数を決定することができるようにする
。本発明のポリヌクレオチドは、検出を容易にするため、放射性、蛍光および酵
素ラベルなどの手段で標識することができる。
【0071】 フラグメントポリヌクレオチドは、完全長またはフラグメントDmGPCRポ
リヌクレオチドの検出用プローブとして、特に有用である。一つ以上のポリヌク
レオチドを、DmGPCRをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するため
に、キット中に入れることができ、または、DmGPCRをコードするポリヌク
レオチド配列の変異を検出するのに使用することができる。
【0072】 本発明はまた、DmGPCRポリペプチドをコードするDNAで、中程度厳格
条件または高度厳格条件で、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15
,17,19,21,または23のポリヌクレオチドの非コード鎖または補体と
ハイブリッド形成するDNAも含んでいる。
【0073】 高度厳格ハイブリッド化条件は、例えば、次のようなものである。 50%ホルムアミド、1MNaCl、10%デキストラン硫酸を含むハイブリッ
ド溶液中で、42℃でハイブリッド化、0.1XSSCと1%SDSを含む洗浄
溶液を用い60℃で30分間洗浄。下記の文献のように、同程度の厳格性が、温
度や緩衝液、または塩濃度の変更で達成できることはよく知られている。[Ausu
be1ら、(編集), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1994),
pp. 6.0.3 to 6.4.10]。ハイブリッド化条件の調整は、経験的に求めても、あ
るいはプローブの長さやグアノシン/シトシン(GC)塩基対の比率から計算で
求めてもよい。このハイブリッド化条件は、次の文献に記載の方法により計算で
きる。[Sambrookら(編集)、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold S
pring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp.
9.47 to 9.51]。
【0074】 本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドやウィルスDNAベクターなどの
自己複製組換え発現構築物も、また提供される。DmGPCRをコードするポリ
ヌクレオチドが内在性または外来発現制御DNA配列と結合したまた他の発現構
築物や転写ターミネーターも提供される。発現制御DNA配列には、プロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター、および調整因子結合サイトが普通含まれ、典
型的には発現構築物が利用される発現システムにより選択される。好ましいプロ
モーターやエンハンサーの配列は、一般的には遺伝子発現の加増能力により選択
されるが、オペレーター配列は一般的に遺伝子発現の調整能力により選択される
。本発明の発現構築物には、その構築物を持つ宿主細胞の同定を可能とする一つ
以上の選択可能なマーカーをコードする配列が含まれる。発現構築物は、また宿
主細胞で相同組換えを助長する、好ましくは促進する配列を含んでいる。本発明
の好ましい発現構築物は、また宿主細胞で複製に必要な配列も含む。
【0075】 発現構築物は、コードされたタンパク質を生産するのに利用することが好まし
い。また、DmGPCRをコードするポリヌクレオチド配列を単に増幅するのに
利用してもよい。
【0076】 本発明の他の態様により、宿主細胞として、コードされたDmGPCRポリペ
プチドを発現させるために本発明のポリヌクレオチド(または、本発明のベクタ
ー)を含んでいる原核細胞や真核細胞などの細胞が提供される。本発明のポリヌ
クレオチドは、宿主細胞内に、孤立したタンパク質コード領域またはウィルスベ
クターなどの環状プラスミドあるいは線状DNAの一部として導入されてもよい
。DNAを宿主細胞に導入する有名な方法で、当業界で普通に使用されている方
法としては、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、核封入、または、
リポソーム、ミセル、ゴースト菌体やプロトプラストなどのキャリアーとの融合
などが挙げられる。本発明の発現システムとしては、バクテリア、酵母、カビ、
植物、昆虫、脊椎動物や哺乳類の細胞システムを挙げることができる。
【0077】 本発明の宿主細胞は、DmGPCRに特異的に免疫反応性の抗体を開発するた
めの免疫原の原材料として有用である。本発明の宿主細胞は、細胞は適当な培養
培地で成長させ、求めるポリペプチド生成物を細胞から下記の精製方法で単離さ
せる、DmGPCRポリペプチドの大規模生産方法においても有用である。この
ような精製方法としては、当分野では公知の方法、例えば、イムノアフィニティ
ークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、疎水相
互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイ
ズ排除ろ過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマ
トグラフィー(HPLC)、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。さらに
、これ以外の精製方法として、目的のタンパク質が、特定のタグ、ラベルやキレ
ート成分を持つ融合タンパク質として発現、精製され、この部分が特定の結合パ
ートナーまたは試薬により認識されるような精製方法も含まれる。精製タンパク
質は、切断して目的のタンパク質に変換するか、元の融合タンパク質のまま放置
することも可能である。融合成分の切断により、切断プロセスの結果としてアミ
ノ酸残基が追加された目的タンパク質を生ずることになるかもしれない。
【0078】 DmGPCR配列の知識は、細胞を修飾して、内在性のDmGPCRの発現を
許しまたは増加させるようにすることができる。(例えば、相同組換えで)細胞
を修飾して、全部または一部、天然に産生するDmGPCRプロモーターを異種
プロモーターの全部または一部で置換して、細胞が高レベルでDmGPCRを発
現するように細胞を修飾し得る。異種プロモーターは、内在性のDmGPCRを
コードする配列に作動可能に連結するように挿入することができる。(例えば、
[PCT International Publication No. WO 94/12650, PCT International Publi
cation No. WO 92/20808, and PCT International Publication N0. WO 91/0995
5.]を参照せよ)。異種プロモーターDNAに加えて、増幅可能なマーカーDN
A(例えば、ada遺伝子、dhfr遺伝子、およびカルバモイルフォスフェー
トシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロター
ゼをコードする多機能CAD遺伝子)、および/またはイントロンDNAも、異
種プロモーターと共に挿入可能であると考えられる。もしDmGPCRコード配
列に結合すれば、標準的な選別方法によりマーカーDNAの増幅は、細胞内での
DmGPCRコード配列の並列増幅につながることになる。
【0079】 本発明により提供されるDNA配列は、また、機能を持つDmGPCRが発現
できない動物や、DmGPCRの変異体を発現する動物を開発することを可能と
する。(相同的組み替えまたは「ノックアウト」ストラテジー。([Capecchi,
Science 244:1288-1292 (1989)]を参照せよ)。このような動物(特に、ラット
、ウサギ、マウスなどの実験小動物)は、DmGPCRおよびDmGPCRのモ
ジュレータのイン・ビボ活性を研究するモデルとして有用である。
【0080】 また、DmGPCRをコードするポリヌクレオチドを認識し、ハイブリッド化
するアンチセンスポリヌクレオチドも、本発明により提供される。完全長および
フラグメントアンチセンスポリヌクレオチドの両方が、提供される。本発明のフ
ラグメントアンチセンス分子は、(i)DmGPCRのRNAを特異的に認識し
ハイブリッド化するもの(DmGPCRをコードするDNAと他の既知分子をコ
ードするDNAの配列比較により決定できる)。DmGPCRコードポリヌクレ
オチドに特有の配列の特定は、公的に利用可能な配列データベースの使用、およ
び/または商業的に利用可能な配列比較プログラムの使用で可能となる。目的配
列の特定の後、制限的消化または当業界では既知の各種ポリメラーゼ連鎖反応を
利用た増幅などで、単離を行う。
【0081】 アンチセンスポリヌクレオチド(好ましくは、10から20個の塩基対オリゴ
ヌクレオチド)は、DmGPCRのmRNAを発現している細胞による、DmG
PCR発現の調整に特に関係している。DmGPCR発現制御配列またはDmG
PCRのRNAに特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸(好ましくは
、10〜20塩基対オリゴヌクレオチド)が、(例えば、ウィルスのベクターま
たはリポソームなどのコロイド分散システムで)細胞に導入される。アンチセン
ス核酸は、細胞中のDmGPCR標的ヌクレオチド配列に結合し、標的配列の転
写および/または翻訳を防止する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネー
トアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の治療用途に特に期待される。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’末端で、ポリ−L−リジントランスフェ
リンポリリジンまたはコレステロール群でさらに修飾してもよい。転写または翻
訳のいずれのレベルでのDmGPCR発現の抑制も、異常なDmGPCR発現を
特徴とする疾病/状態の、細胞または動物モデルを作り出すのに有用である。
【0082】 本発明に説くDmGPCR配列は、自然細胞や動物におけるDmGPCR発現
を調整する新規転写ファクターや、DmGPCRで形質転換あるいは形質移入さ
れた細胞の設計を容易とする。例えば、亜鉛フィンガードメインを通してDNA
と結合すルCys−His亜鉛フィンガータンパク質は、構造変化を受けや
すく、異なる標的配列の認識が可能となる。これらの人口亜鉛フィンガータンパ
ク質は、高い親和性と低い解離係数で特定の標的を認識し、遺伝子発現を制御す
る遺伝子スイッチとして作用する。本発明のDmGPCR標的配列の知識は、構
造を基礎としたモデリングやファージディスプレーライブラリー検索の組み合わ
せなど既知の方法を用いることにより、標的配列に対する亜鉛フィンガータンパ
ク質の設計を容易にする。[Segalら、Proc. Nat1. Acad. Sci. (USA) 96:2758-
2763 (1999); Liuら、Proc, Nat1. Acad. Sci. (USA) 94:5525-5530 (1997); Gr
eismanら、Science 275:657-661 (1997); Chooら、J. MoL Bio1. 273:525-532 (
1997)]。各亜鉛フィンガードメインは、通常3個以上の塩基対を認識する。1
8塩基対の配列は、一般にいずれの既知のゲノムにおいても特有の認識とするに
十分の長さを持つため、直列に6個の亜鉛フィンガーを連結した亜鉛フィンガー
タンパク質は、特定の配列に特異性を示すのに十分だと考えられる。[Segalら
]。DmGPCR配列により設計された人工反復亜鉛フィンガーは、DmGPC
R発現を促進または抑制する、活性化または抑制ドメインに融合される。他方、
亜鉛フィンガードメインは、TATAボックス結合因子(TBP)と融合するこ
とも可能で、亜鉛フィンガーペプチドとTBP間のリンカー領域の長さを変えて
、転写活性化または抑制作用をもたらすこともできる。[Kimら、Proc. Nat1. A
cad. Sci. (USA) 94:3616-3620(1997)]。このようなタンパク質やそれらをコー
ドするポリヌクレオチドは、生体内でのDmGPCR発現の制御のため、有用性
を持つこととなる。その新規転写因子は、、転写因子を発現する構築物を移入す
ることにより(遺伝子治療)、またはそのタンパク質を導入することにより、標
的細胞に届けることができる。人工亜鉛フィンガータンパク質は、またアンチセ
ンスまたは触媒的RNA法に代わる治療法として用いるために、RNA配列に結
合するように設計することもできる。[McCollら、Proc. Natl. Acad. Sci. (US
A) 96:9521-9526 (1997); Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:344-348 (1
995)]。本発明は、本発明の遺伝子配列に基づき、このような転写因子を設計す
る方法や、これらの配列の遺伝的補体を持つ細胞内(天然または転換)でのDm
GPCR発現の制御に有用なカスタム合成亜鉛フィンガータンパク質も含有して
いる。
【0083】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされている哺乳類Dm
GPCRポリペプチドの精製品や単離品を提供する。現時点では、配列番号:2
,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,または24のいず
れかのアミノ酸配列を含むDmGPCRポリペプチドが好ましい。
【0084】 本発明は、本発明の好ましいポリペプチドに対し、少なくとも99%、少なく
とも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なく
とも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なく
とも55%、または少なくとも50%の同一性および/または相同性を示すポリ
ペプチドを含んでいる。本発明の好ましいポリペプチドに対するアミノ酸配列の
「同一性」の比率は、ここに、DmGPCR配列中のアミノ酸残基と候補配列中
のアミノ酸残基が一致する比率であると定義する。ただし、これは、両配列を整
列させ、必要ならギャップを入れて同一性が最大となるようにし、また、保存的
置換は配列同一性とはみなさないで比較した結果である。本発明の好ましいポリ
ペプチドに対するアミノ酸配列の「相同性」の比率は、ここに、DmGPCR配
列中のアミノ酸残基と候補配列中のアミノ酸残基が一致する比率であると定義す
る。ただし、これは、両配列を整列させ、必要ならギャップを入れて同一性が最
大となるようにし、また、保存的置換は配列同一性とはみなさないで比較した結
果である。
【0085】 一例としては、相同性比率は、配列比較される同一のアミノ酸残基が整列され
た二つの配列の内、短いほうのアミノ酸残基のパーセントとして計算される。な
お、この時、100アミノ酸長の4個のギャップを、整列を最大とするために入
れることが許容される。([Dayboff, in ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRU
CTURE, Vo1. 5, p.124, National Biochemical Research Foundation, Washingt
on, D.C. (1972)]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。)
【0086】 本発明のポリペプチドは、自然細胞源から単離しても、あるいは化学合成して
もよい。しかし、本発明の宿主細胞を用いた組換え法により作ることが好ましい
。哺乳類の細胞の使用は、転写後の修飾をもたらすと予測される(例えば、グリ
コシル化、切取り、脂質化、およびリン酸化)。この修飾は、本発明の組替え発
現生成物に最適の生物学的活性をもたらすのに必要と考えられる。糖鎖付きおよ
び糖鎖無しのいずれのDmGPCRポリペプチドも、本発明に含まれる。
【0087】 本発明は、DmGPCRポリペプチドの変異体(またはアナログ)も含んでい
る。一例として、1個以上のアミノ酸残基がDmGPCRアミノ酸配列の中に入
った挿入変異体が挙げられる。挿入は、タンパク質の末端のいずれかまたは両方
にに起こすことも、あるいはDmGPCRアミノ酸配列の内部領域に起こすこと
もできる。末端のいずれかまたは両方に残基が付加された挿入変異体としては、
例えば、融合タンパク質やアミノ酸タグまたはラベルを持つタンパク質が挙げら
れる。
【0088】 挿入変異体は、1個以上のアミノ酸残基が、DmGPCRアミノ酸配列または
、その生物活性をもつフラグメントにに付加されたものも含む。
【0089】 本発明の変異体製品として、成熟DmGPCR製品、すなわち、アミノ酸残基
の付加でリーダーまたはシグナル配列が除去されたDmGPCR製品も含む。付
加アミノ末端残基は、他のタンパク質由来でもよく、あるいは特定のタンパク質
由来であると特定できない1個以上の残基を含んでいてもよい。1位にメチオニ
ン残基を付加したDmGPCR製品(Met−1−DmGPCR)や、2位と1
位にメチオニンとリジン残基を付加した変異体(Met−2−Lys−1−Dm
GPCR)も、想定されている。Met、Met−Lys,Lys残基(または
、1個以上の塩基性残基)が付加したDmGPCR変異体は、バクテリア宿主細
胞での組換えタンパク質の生産量増加に特に有用である。
【0090】 本発明は、特定の発現システム利用の結果としてアミノ酸残基が付加したDm
GPCR変異体も含む。例えば、目的のポリペプチドをグルタチオン−S−トラ
ンスフェラーゼ融合ポリポプペプチドとして発現するベクターは、目的ポリペプ
チドからGST成分を切除後、1位にグリシン残基が付加された目的ポリペプチ
ドを提供する。他のベクターシステムで発現の結果できる変異体も含まれる。
【0091】 挿入変異体は、DmGPCRのアミノ末端および/またはカルボキシ末端が、
他のポリペプチドに融合されている融合タンパク質も含む。
【0092】 他の態様とした、本発明は、DmGPCRポリペプチドの1個以上のアミノ酸
残基が除かれた欠失変異体を提供する。削除は、DmGPCRポリペプチドの両
端で起こり、DmGPCRの1個以上の非末端アミノ酸残基が切断される。欠失
変異体は、このためDmGPCRポリペプチドのフラグメントも含んでいる。
【0093】 本発明は、DmGPCRポリペプチドの生物的(例えば、リガンド結合および
/または細胞内シグナリング)免疫的特性を保持する配列番号:2,4,6,8
,10,12,14,16,18,20,22,または24のポリペプチドフラ
グメントで規定される配列を持つ。フラグメントは、ここに記載のポリペプチド
のいずれかの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、または40
個の連続するアミノ酸を含む。好ましいポリペプチドフラグメントは、DmGP
CRまたはその対立形質に特有のまたは特異的な抗原性の特性を示す。望ましい
生物的免疫的特性をもつ本発明のフラグメントは、当業界で広く公知で実施され
ているいずれかの方法により作ることができる。
【0094】 さらに他の態様として、本発明はDmGPCRポリペプチドの置換変異体を提
供する。置換変異体は、DmGPCRポリペプチドの1個以上のアミノ酸残基が
除去されて他の残基に置換されたものである。ある面では、置換は元来保存的で
あるが、本発明は非保存的な置換も含んでいる。この目的のため、保存的置換は
、下のテーブル1、2および3のように定義してよい。
【0095】 変異体ポリペプチドは、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの修飾により導入されたものも含む。アミノ酸は、物理的特性や
タンパク質の二次三次構造への寄与の程度により分類することができる。保存的
置換は、あるアミノ酸を他の類似特性を持つアミノ酸に置換えることと当分野で
は考えられている。保存的置換の例を、すぐ下のテーブル1に記載した。[WO 9
7/09433, p.10, 出願日3月 13, 1997; PCT/GB96/02197, 出願日9/6/96]。
【0096】
【表1】
【0097】 代替として、保存的アミノ酸は、[Lehninger, Biochemistry, Second Editio
n; Worth Publishers, Inc. NY.NY (1975), pp.71-77]に記載されたように分類
し得、すぐ下のテーブル2に示す。
【0098】
【表2】
【0099】 さらにもう一つの代替として、保存的置換の例を下のテーブル3に示す。
【0100】
【表3】
【0101】 本発明のポリペプチドの定義には、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外
の修飾をもつポリペプチドも含まれることを理解すべきである。例を挙げると、
修飾は本来共有結合的かもしれないが、例えば、ポリマー、リピッド、他の有機
、無機成分との化学結合も含んでいる。ポリペプチドの循環半減期を増加させた
り、ポリペプチドの目的細胞への標的能力を改善するために、このような変更を
してもよい。同様に、本発明は、1個以上のポリマーで共有結合的に修飾された
DmGPCRポリペプチドも含んでいる。このようなポリマーの例としては、ポ
リエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレン
グリコールなどがある。天然のDmGPCRの持つリガンド結合特性を示し高レ
ベルで発現された変異体や、恒常的に活性なレセプターを供給する変異体は、本
発明のアッセイに特に有用である。その変異体は、異常なDmGPCR活性を特
徴とする疾病/状態の細胞、組織や動物モデルとしても有用である。
【0102】 一つの関連する実施形態として、本発明は、本発明の精製ポリペプチドを含む
組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、薬学的
に受容可能な(すなわち、無菌で無毒性な)液体、半固体または固体希釈剤(薬
学的媒体、腑形剤または溶剤)などを含む。当業界で既知のいずれの希釈剤も使
用可能である。希釈剤の例には、水、生理食塩水、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロ
キシ安息香酸、マニトール、グリセリン、リン酸カルシウム、ミネラルオイルや
ココアバターなどが含まれるが、これに限定されるものではない。
【0103】 天然のDmGPCRの持つリガンド結合特性を示し高レベルで発現された変異
体や、恒常的に活性なレセプターを供給する変異体は、本発明のアッセイにおい
ても有用である。その変異体は、異常なDmGPCR活性を特徴とする疾病/状
態の細胞、組織や動物モデルとしても有用である。
【0104】 本発明により開示されたヌクレオチド配列情報の知識により、当業者は、Dm
GPCRをコードするヌクレオチド配列を、違った材料源(すなわち、異なる組
織または異なる生物体)から、当業者にとって既知で例えば次の文献に開示され
ているものなど様々な手法を用いて入手することが可能となる。([Sambrookら
、"Molecular Cloning: a laboratory manual", Second Edition, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、出典明示して、その全体を本
明細書の一部とみなす。)
【0105】 例えば、DmGPCRをコードするDNAは、ここに示されたDmGPCR遺
伝子配列情報により作成したオリゴヌクレオチドを用いて、mRNA、cDNA
またはゲノムDNAを検索することにより得ることができる。当業者にとっては
既知であり従来のハイブリッド形成アッセイに使われている(例えば、Sambrook
らの)方法により、プローブを、蛍光基、放射性基または化学発光基などの検出
基でラベルしてもよい。
【0106】 上記記載のDmGPCRヌクレオチド配列のいずれかを含む核酸分子は、他方
、ここで提供されたヌクレオチド配列により作成したPCRオリゴヌクレオチド
プライマーを用いポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して合成してもよい。
[Mullisらへの米国特許第4,683,195、およびMullisらへの米国特許第4,683,202
号]。PCR反応は、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加させる方法を提供す
る。なお、この濃度増加は、その配列が前もって精製されてなくても、またある
特定のサンプル中に1個のコピーしかなくても起こる。この方法は、一本鎖また
は二本鎖DNAのいずれの増幅にも利用できる。この方法の要点は、目的核酸分
子のテンプレート依存性ポリメラーゼ仲介による複製のためのプライマーとして
、2個のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにある。
【0107】 数多くのこれ以外のクローニング法や体外増幅法が、当業者に知られている。
このような技法の例は、例えば、次の文献に記載されている。([Bergerら、Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152 Academic
Press, Inc., San Diego, CA (Berger)]、出典明示して、全体を本明細書の一
部とみなす。)
【0108】 本発明の核酸分子およびそれ由来のフラグメントは、ある種の疾患に関連する
制限酵素DNAフラグメント長の多形性(RFLP)のスクリーニングや、遺伝
地図作成に有用である。
【0109】 本発明のDmGPCRをコードするヌクレオチド配列由来の、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、または配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,
17,19,21,または23よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列のフラ
グメント、またはこれらに相補的な配列またはホモログは、いずれも各種の組織
での遺伝子の発現を調べる道具として有用である。例えば、従来からあるオート
ラジオグラフィー技法により、検出可能な基をもつオリゴヌクレオチドを使って
、組織中でのこの酵素の自然状態での発現やこれに関連する病理学的な状態を調
べることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号
:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,または23より
なる群から選ばれた一つのヌクレオチド配列の調節領域、あるいはそれに相当す
るmRNAに向けられるべきである。このような例としては、イニシエーション
コドン、TATAボックス、エンハンサー配列などが挙げられる。
【0110】 DmGPCRのヌクレオチド配列を得るのにまたは検証するのに、自動シーク
エンス法を使用してもよい。本発明のDmGPCRヌクレオチド配列は、100
%正確と信じられる。しかし、自動法により得られるヌクレオチド配列は、ある
程度の誤差を含むことはよく知られている。自動装置で決められたヌクレオチド
配列は、典型的には少なくとも約90%、より典型的には約95%から少なくと
も約99.9%程度で与えられた核酸分子の実際のヌクレトチド配列と一致する
。本当の配列は、既知のマニュアルシークエンス法により、より正確に求めるこ
とができるだろう。1個以上のヌクレオチドの挿入または欠失につながる配列の
誤差は、転写の時点でのフレームシフトにつながり、期待されるアミノ酸配列が
、その核酸分子の持つ本来のヌクレオチド配列から変異の始めの時点で予想され
たものとは異なったものになることにつながるだろう。
【0111】 本発明のもう一つの態様は、上述の核酸分子のいずれかを含むベクターまたは
組換え発現ベクターに向けられている。ベクターは、ここではDmGPCRをコ
ードするDNAまたはRNAを増幅するため、および/または、DmGPCRを
コードするDNAを発現するために使用される。好ましいベクターとしては、プ
ラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウィルス粒子またはウィルス、統
合可能DNAフラグメント(すなわち、宿主ゲノムに相同組換えにより統合可能
なフラグメント)などを含むが、これに限定されるものではない。好ましいウィ
ルス粒子の例としては、アデノウィルス、バキュロウィルス、パルボウィルス、
ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、アデノ関連ウィルス、セムリキフォレス
トウィルス、ワクシニアウィルスやレトロウィルスなどを挙げられるが、これに
限定されるものではない。好ましい発現ベクターとしては、pcDNA3(Invit
rogen)とpSVL(Phaimacia Biotech)を挙げるが、これに限定されるものではない
。他の発現ベクターとしては、pSPORTベクター、pGEMベクター(Prome
ga)、pPROEXベクター(LT1, Bethesda, MD)、ブルースクリプトベクター(S
tratagene)、pQEベクター(Qiagen)、pSE420(Invitrogen)およびpYE
S2(Invitrogen)を挙げるが、これに限定されるものではない。
【0112】 好ましい発現ベクターは、複製可能なDNA構築物であり、ここではDmGP
CRをコードするDNA配列が、適当な宿主中のDmGPCRの発現に影響力を
及ぼす適当な制御配列に、作動できるように結合されている。DNA領域は、お
互いに機能的に関連している時は、作動可能な状態で連結または結合されている
。例えば、あるプロモーターは、ある特定の配列の転写をする場合、その配列の
コード領域に作動可能な状態で連結または結合している。増幅ベクターは、発現
制御ドメインを必要としないが、宿主中で複製する能力だけは必要で、通常この
能力は、複製開始点や形質転換体の認識を助ける選択遺伝子で付与される。発現
ベクターの制御配列の必要性は、選択された宿主や用いられた形質転換法により
異なる。一般的には、制御配列には、転写プロモーター、適当なmRNAリボソ
ーム結合をコードする配列や、転写や翻訳の終了を制御する入れるが含まれる。
【0113】 好ましいベクターは、宿主生物体によって認識されうるプロモーターを含んで
いる。本発明のプロモーター配列は、原核、真核またはウィルスのいずれでもよ
い。適当な原核配列の例としては、バクテリオファージラムダのPおよびP プロモーター([THE BACTERIOPHAGE LAMBDA, Hershey, A. D., Ed., Cold Spri
ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973)]、出典明示して、全体を本
明細書の一部とみなす;[LAMBDA II, Hendrix, R. W., Ed., Cold Spring Harb
or Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)]、 出典明示して、全体を本明細書
の一部とみなす。)および、trp、recA,ヒートショック、および大腸菌
のlacZプロモーター、およびSV40 アーリープロモーター([Benoistら、Na
ture, 1981,290,304-310]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす)が
含まれる。これ以外にプロモーターとしては、マウス乳腺癌ウィルス、ヒト免疫
不全ウィルスの長い末端反復、モロニ−ウィルス、サイトメガロウィルス最初期
プロモーター、エプスタインバーウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ヒトアクチン
、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンやヒトメタロチオネイ
ンなどが含まれるが、これに限定するものではない。
【0114】 その他の調節配列も、好ましいベクターに含まれる。適切な調整配列の好まし
い例としては、ファージMS−2のレプリカーゼ遺伝子やバクテリオファージの
cII遺伝子のシャイン−ダルガモが代表的である。シャイン−ダルガモ配列の
後ろに、DmGPCRをコードするDNAが直接つながり、結果として成熟Dm
GPCRタンパク質が発現される。
【0115】 さらに、適切な発現ベクターとして、形質転換宿主細胞のスクリーニングを可
能とする適当なマーカーも含めることができる。選択された宿主の形質転換は、
当業者には公知で、サンブルックらにより述べられている各種の技法のうちのい
ずれかを使って実施することができる。
【0116】 複製開始点は、ベクターに外来性の開始点を含ませることにより、あるいは、
宿主細胞染色体の複製メカニズムにより得られる。もし、ベクターが宿主細胞の
染色体に組み込まれれるなら、後者は十分であろう。他方、ウィルスの複製開始
点を含むベクターを使わずに、当業者は、ある選択されたマーカーとDmGPC
RDNAとを共に形質転換することもできる。適切なマーカーの例としては、ハ
イドロフォレートレダクターゼ(DHFR)または、チミジンキナーゼ([米国
特許第4,399,216]を参照せよ)を挙げることができる。
【0117】 GPCRをコードするヌクレオチド配列を、従来法によりベクターDNAと組
替えてもよい。そのような従来法としては、連結のための平滑またはねじれ終端
、適切な終端を得るための制限酵素消化、希望外の結合を避けるためのアルカリ
ホスファターゼ処理や、リエゾンとの連結などを挙げることができる。このよう
な操作法は、サムブルックらにより開示されており、公知である。哺乳類の発現
ベクターを作る方法として、例えば、次のものが開示されている。[Okayamaら
、Mol. Cel1. Biol., 1983, 3, 280; Cosmanら、Mol. Immuno1., 1986, 23,935;
Cosmanら、Nature, 1984, 312, 768; EP-A-0367566, および WO 91/18982]、
いずれも、出典明示して、それらの全体を本明細書の一部とみなす。)
【0118】 本発明の他の態様は、上述の核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを保持す
る形質転換宿主細胞に向けられている。ヌクレオチド配列の発現は、発現ベクタ
ーが適当な宿主細胞に導入された時に起こる。本発明のポリペプチドの発現に適
当な宿主細胞としては、原核細胞、酵母や真核細胞などが挙げられるが、これに
限定されない。もし原核発現ベクターが使用されるなら、適当な宿主細胞は、ク
ローン化した配列を発現できる原核細胞のいずれかとなるだろう。適当な原核細
胞としては、エシェリキア、バチルス、サルモネラ、シュードモナス、ストレプ
トマイセスやスタフィロコッカス属のバクテリアを挙げることができるが、これ
に限定されない。
【0119】 もし真核発現ベクターが使用されるなら、適当な宿主細胞は、クローン化した
配列を発現できる真核細胞のいずれかとなるだろう。真核細胞は、高等真核生物
の細胞が好ましい。適当な真核細胞は、非ヒト哺乳類組織培養細胞やヒト組織培
養細胞などを含み、これに限定されない。好ましい宿主細胞は、昆虫細胞、He
La細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、アフリカ緑サル肝
細胞(COS細胞、ヒト293細胞やマウス3T3線維芽細胞を含むが、これに
限定されない。これらの細胞の細胞培養での増殖は、単純作業となっている。(
[TISSUE CULTURE, Academic Press, Knise and Patterson, 編集、(1973)]を
参照せよ、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。)
【0120】 また、酵母宿主も宿主細胞として利用できる。好ましい酵母細胞としては、サ
ッカロマイセス、ピチアやクルベロマイセス属が挙げられるが、これに限定され
るものではない。好ましい酵母宿主は、S. cerevisiaeおよびP. pastorisである
。酵母ベクターは、好ましくは、2T酵母プラスミド由来の転写開始点配列、プ
ロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結の配列や選択可能なマーカー遺
伝子を含んでいてよい。複製のための酵母と大腸菌間のシャトルベクターも、こ
こに含まれている。
【0121】 他方、昆虫細胞も宿主細胞として利用できる。好ましい実施形態の一つでは、
本発明のポリペプチドが、バキュロウィルス発現システムを使用して発現されて
いる。([Luckowら、Bio/Technology, 1988,6,47; BACULOVIRUS EXPRESSION VE
CTORS: A Laboratory Manua1, O'Rielly et a1., 編集、W.H. Freeman and Comp
any, New York, 1992; および 米国特許第 4,879,236]、 いずれも、それらの
全体は出典明示して本明細書の一部とみなされる)。さらに、MAXBAC(商
標)完全バキュロウィルス発現システム(Invitrogen)も、例えば、昆虫細胞中で
の生産に利用できる。
【0122】 また、本発明に含まれるのは、DmGPCRまたはそのフラグメントに特異的
な抗体である。(例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体
、キメラ抗体、二機能性二特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や、本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する相補決定領域(CDR)−グラフト化抗体など)。
本発明の抗体は、好ましくは、次の特許の方法で同定、生産されたヒト抗体であ
る。([W093/l1236, 公開 June 20, 1993]、出典明示して、全体を本明細書の
一部とみなす。)Fab、Fab’、F(ab’)、およびFvを含む抗体の
フラグメントも、本発明により提供される。本発明の抗体を記述する時に使われ
る用語「に特異的」は、本発明の抗体の可変領域がDmGPCRポリペプチドを
排他的に認識し結合することを示している。すなわち、DmGPCRと他の既知
GPCRとの間に局部的な配列の一致、同一性や類似性があるかもしれないにも
係わらず、DmGPCRポリペプチドと、他の既知GPCRポリペプチドとを、
結合親和性の測定可能な大きさの差異でもって区別することができることを示し
ている。特異的抗体は、抗体の可変領域外の配列での相互作用により、また特に
、分子の固定領域との相互作用により、他のタンパク質(例えば、S. aureusタ
ンパク質AまたはELISA法における他のタンパク質)と相互作用することが
あるかもしれない。本発明の抗体の結合特性を決定するためのスクリーンアッセ
イは、既知であり、当業界では広く使用されている。このようなアッセイについ
て詳細に議論するには、Harlowらの本を参照せよ。[Harlowら、編集、 A
NTIBODIES A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Sprin
g Harbor, NY (1988), Chapter 6)]。DmGPCRポリペプチドのフラグメ
ントを認識し結合する抗体も、もし抗体が、DmGPCRポリペプチドに特異的
であれば、含まれる。本発明の抗体は、公知であり又当業界で広く使われている
方法により生産することが可能である。
【0123】 非ヒト抗体は、既知の方法でヒト化してもよい。一つの方法では、非ヒトCD
Rが、ヒト抗体またはコンセンサス抗体骨組み配列に挿入される。親和性または
免疫原性を調整するため、抗体の骨組みにさらなる変化を与えてもよい。
【0124】 本発明の抗体は、例えば、治療目的(DmGPCRの活性を調整することによ
る)、DmGPCRを検出および定量するための診断目的や、DmGPCRの精
製目的のために有用である。上記目的のために使われる本発明の抗体を含むキッ
トもまた含まれる。一般に、本発明のキットは、またその抗体が免疫特異的に働
く対照抗体も含んでいる。
【0125】 本発明の他の態様は、哺乳類に本発明のポリペプチドを、免疫応答を誘導する
のに十分な量投与し、哺乳類にそのポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方
法に向けられている。投与量は、動物種、動物の大きさなどにより異なるが、当
業者は決定できる。
【0126】 本発明の他の態様は、医薬組成物などの組成物に向けられている。これら組成
物は、上述の核酸分子または組換え発現ベクターや使用可能な担体や希釈剤を含
む。担体または希釈剤は、好ましくは薬学的に許容されるものである。適当な担
体は、下記文献の最新版に記載されている。[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCI
ENCES, A. Oso1, 本分野における標準の参照書]、 出典明示して、全体を本明
細書の一部とみなす。)このような担体または希釈剤の好ましい例として、水、
生理食塩水、リンガー溶液、デキストリン溶液や5%ヒト血清アルブミンなどが
挙げられるが、これに限定されるものではない。固定油などのリポソームや非水
腑形剤も使用できる。製剤は、汎用技術で滅菌される。
【0127】 本発明により開示されたヌクレオチド配列の情報の知識により、当業者は、当
業者には公知の、また下記文献で開示された方法により、各種の源(例えば、異
なった組織や生物体)から、FaRP結合GPCRをコードするヌクレオチド配
列を同定し入手することができるようになる。(例えば、[Sambrookら、"MOLEC
ULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL". Second Edition, Cold Spring Harbor P
ress, Cold Spring Harbor, NY (1989)]、 出典明示して、全体を本明細書の一
部とみなす。)
【0128】 例えば、GPCRをコードするDNAは、ここに開示されたDmGPCR遺伝
子配列情報により作られたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、mRNA,c
DNAまたはゲノムDNAからスクリーニングすることにより入手可能となるだ
ろう。プローブは、当業者には公知の方法やサムブルックらにより述べられた従
来のハイブリッド化アッセイにより、蛍光基、放射性原子、または化学発光基な
どの検出可能な基でラベルされてもよい。
【0129】 単離または組換えDmGPCR生成物、DmGPCR変異体または、好ましく
は、これらの生成物を発現している細胞を用いて、天然のリガンドや合成化合物
も含む特異的結合分子を、同定あるいは開発することができる。結合パートナー
は、DmGPCR生成物の精製や、既知の免疫的手法を用いた流体や組織サンプ
ル中のDmGPCR生成物の検出や定量に、有用である。結合分子は、またDm
GPCRの生物的活性、特にシグナル伝達に関連する活性を調整(すなわち、遮
断、阻害または刺激)するのにとりわけ有用である。
【0130】 本発明で提供されるDNAやアミノ酸配列の情報は、DmGPCRポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドが相互作用する結合パートナーを特定することを可能
とする。結合パートナーを特定する方法は、溶液アッセイ、DmGPCRポリペ
プチドが固定化された体外アッセイや、細胞ベースのアッセイなどである。Dm
GPCRポリペプチドの結合パートナーの特定は、正常および異常なDmGPC
Rの生物活性に伴う症状において、治療的または予防的処置のための候補物質を
提供することとなる。
【0131】 本発明は、DmGPCR結合パートナーを特定するための多数のアッセイシス
テムを含んでいる。溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、[a)DmGPC
Rポリペプチドを1個以上の結合パートナー化合物の候補と接触させるステップ
と、[b)DmGPCRポリペプチドと結合する化合物を同定するステップを含
む。DmGPCRポリペプチドに結合する化合物の同定は、DmGPCRポリペ
プチド/結合パートナー複合体の単離と、結合パートナー化合物をDmGPCR
ポリペプチドから分離により行われる。結合パートナー化合物の物理的、生物的
および/または生化学的特性をつかむためのさらなるステップも、本発明の実施
形態の一つに含められる。一例として、DmGPCRポリペプチド/結合パート
ナー複合体は、DmGPCRポリペプチドまたは結合パートナー化合物の候補の
いずれかに免疫特異的な抗体を用いて単離される。
【0132】 さらに他の実施形態では、DmGPCRポリペプチドまたは結合パートナー化
合物候補のいずれかが、単離を容易にするラベルまたはタグを含んでいる。また
、結合パートナー化合物を同定するための本発明の方法は、ラベルまたはタグと
の相互作用を通して単離するステップを含んでいる。このタイプのタグの一例が
、ポリヒスチジン配列[一般に約6個のヒスチジン残基)で、これでラベルされ
た化合物はニッケルによるキレートかにより単離できるようになる。FLAGタ
グ(Eastman Kodak, Rochester, NY)など当業界でよく知られ広く使われているこ
れ以外のラベルやタグも、本発明に含められる。
【0133】 体外アッセイの変形として、本発明は、[a)固定化DmGPCRポリペプチ
ドを結合パートナー化合物の候補を接触させるステップと、[b)候補化合物と
DmGPCRポリペプチドとの結合を検出するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、結合パートナー化合物の候補を固定化し、DmGPCRとの
結合を検出する。固定化は、公知の方法のいずれかを使って実施され、このよう
な方法としては、ビーズまたはクロマトグラフィー樹脂などの担体への共有結合
によるものや、抗体結合またはstreptavidin/biotin結合を
利用したもの[ここで、固定化された化合物はビオチン部分を含む)など非共有
、高アフィニティー相互作用を利用したものがある。結合の検出は、[i)固定
化されていない化合物状の放射性ラベルを利用して、[ii)非固定化化合物上
の蛍光ラベルを利用して、[iii)非固定化可能物に対し免疫特異的な抗体を
利用して、[iv)非固定化化合物上に、固定化化合物が付着している蛍光性担
体を刺激するラベルを持つものを利用して、あるいはこれ以外の既知で広く使用
されている技法を用いて実施される。
【0134】 本発明は、DmGPCRポリペプチドの結合パートナー化合物の候補を特定す
るための細胞ベースのアッセイも提供する。一つの実施形態として、本発明は、
細胞表面上で発現されたDmGPCRポリペプチドを、結合パートナー化合物の
候補と接触させるステップと、候補結合パートナー化合物とDmGPCRポリペ
プチドとの結合を検出するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態に
おいて、この検出は、分子の結合によるカルシウムの流動あるいは他の生理的な
現象を検出することを含む。
【0135】 DmGPCR活性を調節(すなわち、増加、減少または遮断)する物質は、推
測されるモジュレーターをDmGPCRポリペプチドまたはポリヌクレオチドを
含む細胞と共にインキュベートし、推定されるモジュレーターがDmGPCR活
性または発現に与える影響を測定することにより特定することができるだろう。
DmGPCR活性を調整する化合物の選択性は、それがDmGPCRに及ぼす影
響と、他のGPCRに及ぼす影響を比較することで評価できる。選択的なモジュ
レーターは、例えば、DmGPCRポリペプチドまたはDmGPCRをコードす
る核酸に特異的に結合する、抗体や他のタンパク質、ペプチドまたは有機分子な
どを含んでいる。DmGPCR活性のモジュレーターは、正常または異常なDm
GPCR活性が関与する疾病や生理状態の処理に治療的に有用である。DmGP
CRポリヌクレオチド、ポリペプチドやモジュレーターは、次のような疾病や症
状の処置に使用できる。例えば、HIV−1またはHIV−2によるウィルス感
染、疼痛、癌、パーキンソン病、低血圧、高血圧、および精神病性および神経学
的障害。なお、精神病性および神経学的障害には、不安、精神分裂症、躁鬱症、
せん妄、痴呆、重度の精神遅滞やハンチントン病またはツーレット症候群などの
運動障害が含まれている。DmGPCRポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび
DmGPCRモジュレーターは、このような疾病や症状の診断アッセイに用いて
もよい。
【0136】 本発明のモジュレーターを特定する方法は、結合パートナー化合物を特定する
上述方法のいずれの変形をも含んでいる。そのような変形例は、ある結合パート
ナー化合物が特定されており、結合アッセイが、ある候補モジュレーターの存在
下または不存在下で行われる方法をを含んでいる。これらの場合、一つのモジュ
レーターが特定されており、そのモジュレーターの存在下でのDmGPCRポリ
ペプチドと結合パートナー化合物間の結合は、候補モジュレーター化合物の存在
下での結合と比較すると異なっている。DmGPCRポリペプチドと結合パート
ナー化合物間の結合を増加させるモジュレーターは、エンハンサーまたはアクチ
ベーターと記載し、逆にDmGPCRポリペプチドと結合パートナー化合物間の
結合を減少させるモジュレーターをインヒビターと記載した。
【0137】 本発明は、DmGPCRポリペプチドの生物的活性(すなわち、酵素活性、結
合活性などに影響する)と相互作用するまたは阻害する化合物を特定するための
、高スループットスクリーニングアッセイ(HTS)も含んでいる。HTSは、
効率的に多数の化合物をスクリーニングすることを可能とする。DmGPCRレ
セプター−リガンド相互作用を調べる、細胞ベースのHTSシステムは、本発明
に含まれる。HTSアッセイは、目的の特性をもつ「ヒット」または「リード化
合物」を特定するもので、これらの「ヒット」または「リード化合物」から、さ
らに目的の特性の改良が進められることになる。「ヒット」または「リード化合
物」の化学修飾は、「ヒット」とDmGPCRポリペプチド間に見出される構造
/活性相関にしばしば基づいている。
【0138】 本発明の他の態様は、DmGPCRまたはDmGPCRをコードする核酸分子
のいずれかに結合する化合物を、DmGPCRまたはそれをコードする核酸分子
とある化合物とを接触させ、その化合物がDmGPCRまたはそれをコードする
核酸分子と結合するかどうかを決定することで特定する方法に向けられている。
結合は、公知の結合アッセイで測定される。この例としては、ウェスターンブロ
ット、放射ラベル競争アッセイ、ファージベースの発現クローニング、クロマト
グラフィーによる共分別、共沈殿、クロスリンキング、相互作用トラップ/ツー
ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ELISAなどがあり、例えば次の
文献に記載されている。([CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1999,
John Wiley & Sons, NY]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。)
スクリーニングされる化合物としては、細胞外、細胞内、生物由来または化学由
来のものが含まれる(DmGPCRまたはそれをコードする核酸分子との結合が
推定される化合物を含んでいるかもしれない。)が、これに限定されるものでは
ない。
【0139】 本発明の方法は、また、放射ラベル(例えば、125I、35S、32P、 P、H)、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素ラベルや免疫原性ラベルなど
のラベルで標識された神経ペプチドを含んでいる。本発明の範囲に入るモジュレ
ーターとしては、非ペプチド模倣体、非ペプチドアロステリックエフェクターな
どの非ペプチド分子や、ペプチドを挙げられるが、これに限定されるものではな
い。このようなテストに使用されるDmGPCRポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドは、溶液中で自由な状態で、固体の支持体に付着して、細胞表面に付着し
て、または細胞内に存在するか、細胞の一部と会合して存在しているだろう。当
業者は、DmGPCRと供試化合物間の複合体形成を測定することができる。他
方、当業者は、DmGPCRと、供試化合物により引き起こされるその基質との
間の複合体形成の減少を測定することが可能である。
【0140】 本発明の他の態様は、DmGPCRの活性を調節する(すなわち、増加または
減少させる)化合物を特定する手段に向けられている。なお、ここで、その特定
手段は、DmGPCRを一つの化合物と接触させ、その化合物がDmGPCRの
活性を調整するかどうかを決定することからなっている。試験化合物の存在下で
の活性と、試験化合物の不存在下での活性を比較する。試験化合物を含むサンプ
ルの活性が、試験化合物を欠くサンプルの活性よりも高い場合、その化合物は活
性を増加させたこととなろう。同様に、試験化合物を含むサンプルの活性が、試
験化合物を欠くサンプルの活性より低い場合、その化合物は活性を阻害したこと
となるだろう。
【0141】 本発明は、多くのドラッグスクリーニング手法の中で、DmGPCRを用いて
化合物をスクリーニングのに特に有用である。スクリーニングされる化合物とし
ては、細胞外、細胞内、生物由来または化学由来のものが含まれる(DmGPC
R活性を調整すると推定される化合物を含んでいるかもしれない)が、これに限
定されるものではない。このテストに使用されるDmGPCRポリペプチドは、
溶液中で自由な状態で、固体の支持体に付着、細胞表面に付着、または細胞内に
存在、或いは細胞の一部と会合などのいずれかの形で存在していてもよい。当業
者は、例えば、DmGPCRと供試化合物間の複合体形成を測定することができ
る。また、当業者は、DmGPCRと、供試化合物により引き起こされるその基
質との間の複合体形成の減少を測定することが可能である。
【0142】 本発明のDmGPCRポリペプチドの活性は、例えば、化学的に合成されたペ
プチドリガンドと結合するまたはそれにより活性化される能力を測定することに
より決定される。他方、DmGPCRの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、
ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、リピッド、臭気物質
や光子などとの、それらの持つ結合能力を測定することでアッセイできる。他方
、GPCRの活性は、イフェクター分子の活性を測定することで決定できる。な
お、このイフェクター分子としては、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼ
やイオンチャンネルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、GPC
R活性のモジュレーターは、GPCRレセプターの機能、例えばレセプターの結
合特性またはGタンパク質−仲介シグナル伝達または膜局在などの活性を、改変
するかもしれない。この方法のいろいろな実施形態において、アッセイは、イオ
ンフラックスアッセイ、酵母成長アッセイ、[35S]−GTPアッセイなどの非
加水分解性GTPアッセイ、cAMPアッセイ、イノシトール酸リン酸アッセイ
、ジアシルグリセリンアッセイ、アエクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセ
イ、細胞内カルシウム濃度を求めるFLIPRアッセイ、有糸分裂生起アッセイ
、MAPキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ(例えば、[H]
−アラキドン酸)やその他の結合または機能ベースのDmGPCR活性測定用の
既知のアッセイなどの形態をとることができる。これらの実施形態の多くにおい
て、本発明は、既知のGタンパク質(例えばG16、G15またはキメラGqd 、Gqs5、Gqo5、Gq25など)のいずれか含有物も含んでいる。Dm
GPCR活性は、当業者には既知のFaRP用のアッセイに使われる方法により
決定することができる。本発明のDmGPCRレセプターの生物活性としては、
天然または非天然リガンドの結合や、既知のDmGPCR機能の活性のいずれか
などが含まれるが、これに限定されるものではない。DmGPCR活性の非限定
例としては、Gタンパク質の会合および/または各種グアニジレートヌクレオチ
ドのGタンパク質結合に対する影響力の発揮などを伴うかもしれない、いろいろ
な形の膜を通した伝達を含んでいる。もう一つのDmGPCR活性の例は、既知
のGタンパク質とは異なるアクセサリータンパク質またはポリペプチドの結合で
ある。
【0143】 本発明のモジュレーターは、いろいろな化学構造を示す。これらは、一般に、
天然GPCRレセプターの非ペプチド模倣品、GPCRレセプターのペプチドま
たは非ペプチドアロステリックイフェクターや、GPCRレセプターの活性化剤
または阻害剤(競争、不競争および非競争)(例えば、抗体製品)として作用す
るペプチドに、分類される。本発明は、適当なモジュレーターの入手源を制限し
ない。これらは、植物、動物またはミネラル抽出物などの天然源、あるいは、低
分子ライブラリー(コンビナトリアル化学の手法で作られたライブラリーの化合
物を含む)やペプチドライブラリーなどの非天然源からのいずれの入手源から入
手したものでもよい。DmGPCRレセプターのペプチドモジュレーターの例は
、次の一次構造を示す:GLGPRPLRFamide、GNSFLRFami
de、GGPQGPLRFamide、GPSGPLRFamide、PDVD
HVFLRFamide、およびpyr0−EDVDHVFLRFamide。
【0144】 他のアッセイが、酵素活性を測定するのに使われる。例えば、光度計、放射計
、HPLC、電気化学などを使用したもので、例えば、次の文献に記載されてい
る。([ENZYME ASSAYS: A PRACTICAL APPROACH, 編集、 Eisenthal and M. J.
Danson, 1992, Oxford University Press]、出典明示して、全体を本明細書の
一部とみなす。)
【0145】 GPCRをコードするcDNAの新薬探索プログラムでの使用はよく知られて
いる。一日に何千もの未知化合物を高スループットスクリーン(HTS)でテス
トすることのできるアッセイは、徹底的に文書化されている。文献には、HTS
結合アッセイで新薬探索するのに放射ラベルされたリガンド使用する例が数多く
載っている。([Williams, MEDICINAL RESEARCH REVIEWS, 1991, 11, 147-184;
および、総説、Sweetnamら、J. Natural Products, 1993, 56, 441-455]を参照
せよ。)組替えレセプターは、結合アッセイHTSに好ましい。なぜならそれら
は選りすぐれた特異性(より相対純度が高い)を与え、大量のレセプター物質を
作ることができ、また広い範囲のフォーマットで使用できるからである。([Ho
dgson, BIO/TECHNOLOGY, 1992, 10,973-980]を参照せよ、出典明示して、全体
を本明細書の一部とみなす。)
【0146】 いろいろな非相同システムが、組替えレセプターの機能的な発現に使用でる。
いずれも当業者には既知のものである。このようなシステムには、バクテリア[
Strosbergら、Trends in Pharmacological Sciences, 1992, 13,95-98]; 酵母
[Pausch, Trends in Biotechnology, 1997, 15,487-494]、多種の昆虫細胞[V
anden Broeck, Int. Rev. Cytology, 1996, 164, 189-268]、両生類細胞[Jaya
wickremeら、Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8,629-634]や多種の
哺乳類セルライン(CHO, HEK293, COS, その他.; 参照。Gerhardtら、Eur. J. Ph
armacology, 1997,334, 1-23]が含まれる。これらの例は、線虫類[PCT出願 WO
98/37177]から得られたセルラインを含む他の細胞発現システムの可能性を排
除しない。
【0147】 本発明の好ましい実施形態では、試験化合物をDmGPCRと接触させ、その
化合物とDmGPCR間の複合体の存在をアッセイすることから成るGPCR活
性を調節する方法である。このようなアッセイでは、リガンドは普通ラベルされ
ている。適当なインキュベーションの後に、フリーのリガンドは結合状態で存在
するものから分離される。フリーまたは複合体を形成していないラベルは、特定
の化合物がDmGPCRに結合する能力の指標となる。
【0148】 本発明の他の実施形態において、DmGPCRに対して適当な結合親和性を持
つ化合物の高スループットスクリーニングが使用される。短時間で、多数の異な
った低分子ペプチドテスト化合物が、固体の基体上に合成される。これらのペプ
チドテスト化合物は、DmGPCRに接触させられ、洗浄される。結合されたD
mGPCRは、次いで既知の方法により検出される。本発明の精製プチドは、上
記新薬探索技法での使用のために、板の上に直接塗布してもよい。また、非中和
抗体も、タンパク質を捕捉し、固体担体上に固定化するのに使うことができる。
【0149】 一般に、発現されたDmGPCRは、そのはっきり規定されたリガンド(この
場合、相当するそれを活性化する神経ペプチド)と併用して、HTS結合アッセ
イに供される。検出されたペプチドは、適当な放射性同位体(例えば、125
H、35S、または32Pを挙げるが、これに限定されない)で、当業者に
は公知の方法でラベルされる。他方、これらのペプチドは、適当な蛍光誘導体[
Baindurら、Drug Dev. Res., 1994,33,373-398; Rogers, Drug Discovery Today
, 1997,2,156-160]を用いた有名な方法でラベルされてもよい。組換えタンパク
質を発現しているセルラインから作られた膜標本中のレセプターに特異的に結合
する放射性リガンドは、HTSアッセイにおいて数多くの標準法の一つで検出さ
れる。この標準法としては、レセプター−リガンド複合体ろ過し、結合リガンド
と非結合リガンドを分離する方法[Williams, Med. Res, Rev., 1991, 11, 147-
184、および Sweetnamら、J. Natural Products, 1993, 56,441-455]も含まれ
ている。他の方法としては、シンチレーション近接アッセイ(SPA)または、
そのような分離が不必要であるフラッシュプレート形式も、含まれる。[Nakaya
ma, Cur. Opinion Drug Disc. Dev., 1998 1, 85-91; および、Bosseら、J. Bio
molecular Screening, 1998, 3, 285-292.]蛍光リガンドの結合は、いろいろな
方法で検出可能である。例えば、蛍光エネルギー転移(FRET),直接スペク
トロフォトフルオレッセンス分極[Rogers, Drug Discovery Today, 1997, 2, 1
56-160; および、 Hil1, Cur. Opinion Drug Disc. Dev., 1998, 1,92-97]が
、挙げられる。
【0150】 組換えシステムで発現された非相同レセプターの活性化が、宿主細胞中に発言
されたGタンパク質の仲介により、様々な生物的応答に導くことは、よく知られ
ている。GPCRに作動薬作用させると、Galphaサブユニット上の結合サイト
で、結合GDPのGTPへの交換が引き起こされる。放射性、GTPの非加水分
解性誘導体、GTPγ[35S]を使って、作動薬のレセプターへの結合を測定
できる。[Simら、Neuroreport, 1996, 7,729-733]。この結合を使って、同様
に、既知の作動薬の存在下GTPγ[35S]の結合を減少させることにより、
拮抗薬のレセプターへの結合能力を測定することができる。このため、GTPγ
35S]結合を基礎とするHTSを作り出すことができる。しかしこの方法は
、好ましい方法ではない。
【0151】 非相同性GPCRの機能的な発現に必要なGタンパク質は、宿主細胞の天然の
構成物でもよいし、よく知られている組換え技術ににより導入したものでもよい
。Gタンパク質は、無傷の原型でもキメラでもよい。ほぼ完全な適確性を示すG
タンパク質は(例えば、Gα16)は、どのようなレセプターをも結合させて検
出可能な応答経路に導くことができる。Gタンパク質の活性化は、他の自然タン
パク質の刺激または阻害を引き起こし、これを測定可能な応答に結びつけること
ができる。
【0152】 このような生物学的応答の例としては、次のものがあるが、限定されるもので
はない。特別に操作された酵母細胞の制限栄養素のない状態での生存能力[Paus
ch, Trends in Biotechnology, 1997, 15,487-494]、および、蛍光染料で測定
した細胞内Ca2+濃度の変化[Murphyら、Cur. 0pinion Drug Disc. Dev., 19
98, 1, 192-199]。蛍光変化は、リガンド誘導性の膜電池または細胞内pHの変
化の測定にも使われる。これらの目的のためのHTSに適する自動システムにつ
いては、すでに述べられている。[Schroederら、J. Biomolecular Screening,
1996, 1,75-80]。Xenopus laevisから調整されたメラニン保有細胞は、非相G
PCRの活性化の応答として、顔料組織にリガンド依存性の変化を示す。この応
答は、HTS形式に適合可能である。[Jayawickremeら、Cur. 0pinion Biotech
nology, 1991,5,629-634]。アッセイは、多くのセカンドメッセンジャーに対し
てでも可能である。例えば、cAMP、ホスホイノシチドやアラキドン酸などが
あるが、それらは普通HTSには使われていない。
【0153】 それらのレセプターを用いるHTS法の好ましい例としては、永久形質転換C
HO細胞が挙げられる。この細胞中で、これらの細胞から調整された膜中におけ
るGTPγ[35S]の結合を特異的に変換する能力を指標に、作動薬や拮抗薬
を特定することができる。本発明の他の実施形態においては、永久形質転換CH
O細胞が、組換えレセプタータンパク質をかなり大量に含む膜の調製に使用でき
る。こららの膜調製物は、特定のレセプターに特異的な放射ラベルリガンドを用
いることで、レセプター結合アッセイに使用できる。代わりに、これらのレセプ
ターのそれぞれを別々にまたは組み合わせて保有している永久形質転換CHO細
胞中での内部Ca2+濃度または膜電位の変化を蛍光測定するなどの機能アッセ
イが、HTSには好ましい。HEK293またはCOS細胞などの異なった種類
の哺乳類細胞も、同形式に同じように好ましいと考えられる。さらに好ましいの
は、ショウジョウバエS2細胞などの永久形質転換昆虫セルラインである。さら
により好ましいのが、当業者には公知のHTS形式のショウジョウバエメラノガ
スターレセプターを発現している組換え酵母細胞である(例えば、[Pausch, Tr
ends in Biotechnology, 1997, 15, 487-494])。
【0154】 本発明は、DmGPCRレセプターに結合するリガンドの阻害剤をスクリーン
ニングし同定する目的のアッセイを多数含んでいる。一例においては、DmGP
CRレセプターは固定化され、結合パートナーとの相互作用を、例えば阻害剤の
ような候補モジュレーターの存在下および不存在下で測定する。他の一例では、
DmGPCRレセプターとその結合パートナーの相互作用は、候補阻害化合物の
存在下および不存在下の両方で、溶液アッセイをつかって測定する。いずれのア
ッセイにおいても、阻害剤は、DmGPCRレセプターとその結合パートナー間
の結合を減少させる化合物として特定される。本発明に含まれる他の一例は、ジ
ハイブリッドアッセイの変形であり、このアッセイでは、タンパク質/タンパク
質相互作用の阻害剤の特定が、形質転換されたまたは形質移入された宿主細胞中
で、正のシグナルを検出することにより行われる。
【0155】 本発明に含まれる候補モジュレーターは、可能性のある活性化剤または阻害剤
のいずれのライブラリーから選ばれる化合物も含んでいる。低分子も十らーたー
を特定するために使われるライブラリーは、数多くある。例えば、(1)化学ラ
イブラリー、(2)天然物ライブラリー、および(3)任意のペプチド、オリゴ
ヌクレオチドまたは有機分子を含む混合ライブラリーなどが含まれている。化学
ライブラリーは、任意の化学構造からなっており、その一部は既知物質のアナロ
グまたは他の新薬探索スクリーンでの「ヒット」または「リード」として特定さ
れた化合物のアナログであり、また一部は、特定の目的無しに合成された合成有
機化合物からなっている。天然物ライブラリーは、微生物、動物、植物または海
洋生物の収集物であり、(1)発酵、および土壌、植物または海洋微生物からブ
ロスの抽出、または(2)植物または海洋生物からの抽出などの方法により、ス
クリーニングのための混合物を作るの使用される。天然物ライブラリーは、ポリ
ペプチド、非リボゾームペプチドや、それらの変異体(非天然由来)を含んでい
る。(概説として次を参照せよ。Science 282:63-68 (1998)]。混合ライブラリ
ーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物などを混合して
保有している。これらのライブラリーは、従来からある自動合成法、例えば、P
CR,クローニングまたは独自の合成法などにより比較的簡単に作ることができ
る。特に興味があるのは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。他
の興味あるライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、マルチパ
ラレル合成物コレクション、リコンビナトリアル、およびポリペプチドライブラ
リーなどである。コンビナトリアル化学およびそのライブラリーを概観するには
、次を参照せよ。[Myers,Cuir.0pm.Biotechno1. 8:701-707 (1997)]。ここに
述べた各種ライブラリーを用いてモジュレーターを特定することで、候補の「ヒ
ット」(または、「リード」)化合物をさらに修飾して「ヒット」化合物の調節
活性を最適化することが可能となる。
【0156】 さらに異なった候補阻害剤も考えられる。例えば、溶解タイプの結合パートナ
ーや、キメラまたは融合タンパク質の結合パートナーなどで、これらも本発明に
含まれる。ここに使用される「結合パートナー」は、非ペプチドモジュレーター
、天然リガンド以外の神経ペプチドなどのペプチドモジュレーター、抗体、抗体
のフラグメント、および、特定されたDmGPCRの発現生産物に免疫特異的な
抗体ドメインを含む修飾化合物なども、広く含んでいる。
【0157】 DmGPCRレセプターの特定の神経ペプチドリガンドを特定するために、他
のアッセイを使用してもよい。このようなアッセイとしては、試験リガンドと標
的タンパク質との直接結合を測定することにより標的タンパク質のリガンドを特
定するアッセイ、および、イオンスプレーマススペクトル/HPLC法または他
の物理的分析的手法を用いて、限外ろ過で標的タンパク質のリガンドを特定する
アッセイがふくまれる。これに代えて、そのような結合相互作用を、例えば、酵
母ツーハイブリッドシステムを使用して、間接的に評価することもできる。([
Fieldsら、Nature, 340:245-246 (1989);および Fieldsら、Trends in Genetics
, 10:286-292 (1994)]を参照せよ、 双方とも、出典明示して、全体を本明細書
の一部とみなす。)このツーハイブリッドシステムは、二つのタンパク質または
ポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。この方法は
、既知の標的タンパク質に結合するタンパク質の特定あるいは、その相互作用に
最も必要なドメインや残基を見出すのに使われる。DNA結合タンパク質をコー
ドする遺伝子のクローニング、タンパク質に結合するペプチドの特定や、新薬の
スクリーニングのために、この方法の変形法が、開発されている。このツーハイ
ブリッドシステムは、相互作用を持つ一対のタンパク質が持つ、転写活性領域を
、レポーター遺伝子の上流にある活性化配列(UAS)に結合するDNA結合領
域の近傍に持っていく能力を調べるもので、通常は酵母中で実施されている。そ
のアッセイには、次の2つのハイブリッド遺伝子の確立が必要である。(1)第
一のタンパク質に融合したDNA結合領域、および(2)第二のタンパク質に融
合した活性化領域。このDNA結合領域は、第一のハイブリッドタンパク質を、
レポーター遺伝子のUASに向かわせる。しかし、ほとんどのタンパク質は活性
化領域を書くため、このDNA結合ハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝
子の転写を活性化しない。第二のハイブリッドタンパク質は、活性化ドメインを
もつが、UASに結合しないため、それ自体ではレポーター遺伝子の発現を活性
化できない。しかし、両方のハイブリッドタンパク質が存在するとき、第一と第
二のタンパク質の非共有相互作用が、活性化ドメインをUASに結びつけ、レポ
ーター遺伝子の転写を活性化する。例えば、第一のタンパク質として、他のタン
パク質や核酸と相互作用を持つことが知られているGPCR生産物またはそのフ
ラグメントを使用する時、このアッセイはその結合相互作用を妨害する薬剤を検
出するのに利用できる。異なるテスト試薬がそのシステムに添加されるため、レ
ポーター遺伝子の発現は監視される。阻害剤が存在は、レポーターシグナルは消
失につながる。
【0158】 DmGPCR遺伝子生成物の機能が不明で、その遺伝子生成物に結合するリガ
ンドがない場合、酵母ツーハイブリッドアッセイがその遺伝子生産物に結合する
タンパク質の同定に使用できる。DmGPCRレセプターまたはそのフラグメン
トに結合するタンパク質を特定するアッセイにおいて、DmGPCRレセプター
(または、そのフラグメント)とUAS結合領域(すなわち、第一のタンパク質
)の両方をコードする融合ポリヌクレオチドを使ってよい。また、本アッセイで
は、各種の活性化領域に融合された第二タンパク質をコードする多数のハイブリ
ッド遺伝子が作られ、スクリーンされる。典型的には、第二タンパク質は、cD
NAまたはゲノムDNA融合ライブラリー全体中の1個以上のメンバーによりコ
ードされ、その際、第二タンパク質コード領域は、活性化ドメインに融合される
。このシステムは、広範なタンパク質に利用可能で、第二の結合タンパク質の実
体あるいはその機能を知る必要もない。このシステムは感度が高く、他の方法で
は検出できない相互作用も検出できる。一時的な相互作用でも、安定な一つのm
RNAの転写を引き起こし、このmRNAから繰り返し転写が起こってレポータ
ータンパク質を産生することになるかもしれない。
【0159】 標的タンパク質と結合する物質を調べるのに、他のアッセイを利用してもよい
。試験リガンドと標的タンパク質との直接結合を特定するためのこのようなスク
リーン法の一つが、次の特許に記載されている。([U.S. Patent N0. 5,585,27
7]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。)この方法は、タンパク
質は、一般的に、折りたたみ構造または非折りたたみ構造の混合物の状態で存在
し、常に両状態間で交代しているという原則によっている。ある試験リガンドが
、折りたたみ構造の標的タンパク質に結合する時(すなわち、試験リガンドが、
標的タンパク質のリガンドである場合)、リガンドにより結合された標的タンパ
ク質は、折りたたみ状態で存在する。このため、標的タンパク質に結合する試験
リガンドが存在するときは、リガンドの不存在下に比べ、標的タンパク質は折り
たたみ構造で存在する程度が高くなる。リガンドの標的タンパク質への結合は、
標的タンパク質の折りたたみ構造と非折りたたみ構造を区別できる方法なら、ど
のような方法でも決定可能である。このアッセイを行う上で、標的タンパク質の
機能を知る必要性はない。この方法で、どのような試験リガンドのアッセイも可
能である。このようなリガンドとしては、金属、ポリペプチド、タンパク質、リ
ピッド、多糖類、ポリヌクレオチドや低分子有機分子などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
【0160】 標的タンパク質のリガンドを特定するもう一つの方法が、次の文献に記載され
ている。([Wieboldtら、Ana1. Chem., 69:1683-1691(1997)]、出典明示して
、全体を本明細書の一部とみなす。)この手法は、溶液相での標的タンパク質へ
の結合を、同時に20−30物質しながらンビナトリアルライブラリーをスクリ
ーンする。標的タンパク質に結合する物質は、他のライブラリー成分から、単に
膜洗浄だけで分離される。フィルター上に保持された特異的に選別された分子は
、続いて標的タンパク質から遊離され、HPLCや空気圧式エレクトロスプレー
(イオンスプレー)マススペクトルで分析される。この操作は、ライブラリー中
から標的タンパク質に最大の親和性を示すものを選別し、低分子ライブラリーに
特に有用である。
【0161】 本発明の他の実施形態は、競争的スクリーニングアッセイの使用も含む。競争
的スクリーニングアッセイでは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する中和
抗体が、そのポリペプチドと結合する試験化合物と競合する。このように、抗体
は、DmGPCRと、一個以上の抗原性決定因子を共有するペプチドの存在を検
出するのに使うことができる。放射ラベルされた競争的結合試験は、次の文献に
記載されている。([A.H. Linら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1
997, vo1.41, No.10. pp.2127-2131]、出典明示して、この開示の全体を本明細
書の一部とみなす。)
【0162】 本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、相互作用する調製
タンパク質の同定、特徴の決定や精製のための研究手段として用いる。本発明の
ポリペプチドに、いろいろな既知の方法により適当なラベルを付け、相互作用し
ている分子を捕まえるのに用いる。例えば、分子を、ラベル化ポリペプチドと共
にインキュベートし、非結合ポリペプチドを洗浄で除いた後、ポリペプチド複合
体が定量される。異なる濃度のポリペプチドから得られたデータは、ポリペプチ
ドとタンパク質複合体間の結合の数、親和性や関連性などの値の計算に用いられ
る。
【0163】 ラベル化ポリペプチドは、ポリペプチドが相互作用を持つ分子の精製のための
試薬としても有用である。そのようなポリペプチドが相互作用を持つ分子には、
阻害剤が含まれるが、これに限定されない。アフィニティー精製の一つの実施形
態として、あるポリペプチドがクロマトグラフィーカラムに共有結合で結合され
る。細胞やその膜は抽出され、各種細胞小成分はカラム内を通過させられる。分
子は、そのポリペプチドに対する親和性に応じてカラムに結合する。ポリペプチ
ド複合体は、カラムから回収され、解離され回収された分子はタンパク質配列決
定に供される。このアミノ酸配列は、次いで捕捉された分子の同定や、適当なc
DNAライブラリーからの相当する遺伝子をクローニングのためオリゴヌクレオ
チドの設計や変性に使用される。
【0164】 あるいは、本発明のDmGPCRに似た対リガンド特性を示すが、ヒトまたは
動物体中の内在性のリガンドより低分子で、半減期が長い化合物が、特定できる
かもしれない。有機化合物を設計する時、本発明の分子は、「リード」化合物と
して使用できる。既知の医薬的に活性な化合物を模倣して設計することは、「リ
ード」化合物を基礎とした医薬品開発でよく知られたアプローチである。標的と
なる特性を求めるために、多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避
けるため、模倣の設計、模倣合成や試験が一般に行われている。さらに、本発明
のDNAでコードされ推測されたアミノ酸配列の分析から得られる構造データは
、より特異的でこのためより高い薬理作用を持つ新薬の設計に有用である。
【0165】 本発明のタンパク質配列と、利用可能なすべてのデータベースにある配列とを
比較すると、Gタンパク質結合レセプターの膜貫通領域とかなり大きな同一性が
示される。したがって、入手可能な他タンパク質の膜貫通ドメインの情報をもと
に、コンピューターモデリングを使ってで、本発明のタンパク質の推定三次構造
を求めることができる。このようにして、DmGPCRの予想構造をもとに、新
規なリガンドを設計することができる。
【0166】 ある特定の実施形態では、本発明のスクリーニング法により特定された新規分
子は、低分子量有機分子であり、この場合、錠剤などの経口摂取用の組成物また
は医薬組成物が、これから作られる。その組成物または医薬組成物は、核酸分子
、ベクター、ポリペプチド、抗体やここに記載のスクリーニング法により特定さ
れた化合物を含み、下記のどの投与経路用に作られてもよい。例えば、経口、静
脈内、皮下、鼻内、筋肉内または腹腔内などを含みむが、これに限定されない。
担体または他の成分の性質は、具体的な投与経路や投与される本発明の実施形態
による。この関係で有用な技術や手順は、なかでも、次の文献に記載されている
。([REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Oso1, A 編集、1
980]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。)
【0167】 これらの低分子量化合物の服用量は、治療すべき疾病状態または状況、あるい
は体重やヒトまたは動物の状態など他の臨床的要素に、およびその化合物の投与
経路に依存する。ヒトまたは動物を治療するにあたり、約0.5mg/kg体重
から500mg/kg体重当たりの投与量で化合物を投与できる。治療は、典型
的にはより少ない服用量で投与され、目的の治療効果が観測されるまで継続され
る。
【0168】 本発明の他の態様は、ここに開示のDmGPCRヌクレオチド配列の動物中の
DmGPCRホモログの特定のための使用である。これらの動物としては、ヒト
および他の哺乳類、および無脊椎動物類である。ここに開示するヌクレオチド配
列またはその部分のいずれも、ホモログを特定するために、当業者には公知のス
クリーニング法を使用して、例えば、データベースまたは、例えばゲノムまたは
cDNAライブラリーのような核酸ライブラリーを検索するのに使用できない。
この方法によれば、少なくとも50%以上、より好ましくは少なくとも60%以
上、より好ましくは少なくとも70%以上、より好ましくは少なくとも80%以
上、より好ましくは少なくとも90%以上、より好ましくは少なくとも95%以
上、またより好ましくは少なくとも100%以上のDmGPCRと相同性をを持
つホモログが得的できる。
【0169】 本化合物および方法は、核酸分子、ポリペプチド、抗体、ここに記載のスクリ
ーニング法により特定された化合物などを含み、様々な薬学的用途をもち、例え
ば、癌細胞や腫瘍の成長などの無秩序な細胞の成長の治療または予防に使うこと
ができる。具体的な実施形態の一つとして、本分子は、遺伝子治療に用いられる
。遺伝子治療手順の概観には、次の文献を参照せよ。(例えば、[Anderson, Sc
ience, 1992,256, 808-813]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。
【0170】 本発明は、哺乳類において、DmGPCR天然結合パートナーが関与する活性
を、作動(刺激)するまたは拮抗する方法もまた含んでいる。この方法は、上記
動物に、上記ポリペプチドに対する作動薬または拮抗薬を、前記作動または拮抗
を起こすのに必要な十分な量投与することを特徴とする。それゆえ、本発明の一
実施形態は本発明のタンパク質の作動薬または拮抗薬を用いて、哺乳類における
疾病を治療する方法であり、DmGPCR関連機能を作動または拮抗するに足る
量にて作動薬または拮抗薬を哺乳類に投与することを特徴とする。
【0171】 疾病の新規治療法を発見する努力として、生医学研究者や化学者は、タンパク
質ポリペプチドの機能を阻害する分子を設計、合成、試験してきた。低分子有機
分子のいくつかは、タンパク質ポリペプチドの機能を調整する化合物の分類を形
成する。プロテインキナーゼの機能を阻害すると報告されている分子の例として
は、ビスモノサイクリック、ビサイクリック、またはヘテロサイクリックアリー
ル化合物[Maguireら、PCT WO 92/20642, 11月26日1992公開]、ビニレン−アザ
インドール誘導体[Ballinariら、PCT WO 94/14808, 公開7月7日, 1994]、1−
シクロプロピル−4−ピリジル−キノン[米国特許第 5,330,992]、スチリル化
合物[米国特許第5,217,999]、スチリル−置換ピリジル化合物[米国特許第5,3
02,606]、ある種のキナゾリン誘導体[EP出願No. 0 566 266 A1]、セレオイン
ドールおよびセレニド[Dennyら、PCT W0 94/03427, 公開 2月17日, 1994.]、
トリサイクリックポリハイドロキシル化合物[Dow、PCT WO 92/21660, 公開日、
10月10日, 1992 ]、および、ベンジルホスホン酸化合物[Dowら、PCT WO 91/15
495, 公開日 10月17日, 1991]などがあるが、これに限定されない。
【0172】 細胞膜を通過でき又難酸加水分解性の化合物は、患者に投与後に成体利用効率
が高くなるため、治療薬として大きな長所を持っている。しかし、これらのタン
パク質阻害剤の多くは、機能阻害の程度が低い。また、多くは様々なプロテイン
キナーゼを阻害し、このため疾患に対する治療法として多数の副作用を引き起こ
す。
【0173】 インドリノン化合物のいくつかは、しかし、酸抵抗性、膜透過有機分子の分類
を形成する。下記文献は、オキシインドール環に融合したテトラリン、ナフタレ
ン、キノリン、およびインドール置換基を持つ水溶性インドリノン化合物を記載
している。([WO 96/22976 Ballinariら、公開日、8月1日, 1996)。こららの
二環性置換基は、今度は、ヒドロキシル化アルキル、リン酸および他の置換基な
どの極性基で置換されている。下記特許は、他のビサイクリック構造やモノサイ
クリック構造がオキシインドールに融合したインドリノン化合物のインドリノン
化学ライブラリーについて記載している。([Tangら、U.S. Patent Applicatio
n Serial Nos. 08/702,232, 出願日 8月23日, 1996, 名称 "INDOLINONE COMBINA
TORIAL LIBRARIES AND RELATED PRODUCTS AND THE METHODS FOR THE TREATMENT
OF DESEASE" [Lyon & Lyon Docket N0. 221/187];および 08/485,323, 出願日
6月7日, 1995, 名称 "BENZYLIDENE-Z-INDOLINE COMPOUNDS FOR THE TREATMENT O
F DISEASE" by Tang et a1. [Lyon & Lyon Docket N0. 223/298);および、Ball
inariら、International Patent Publication WO 96/22976, 公開日8月1日, 199
6)]、これら全ては、出典明示して、図表も含みそれらの全体を本明細書の一
部とみなす)。下記特許は、インドリノンの合成方法、細胞中でのインドリノン
の生物活性の試験方法、およびインドリノン誘導体の阻害パターンについて教え
ている。[Tangら、出願08/702,232, 出願日8月23日, 1996, 名称 "INDOLINONE
COMBINATORIAL LIBRARIES AND RELATED PRODUCTS AND METHODS FOR THE TREATME
NT OF DISEASE" [Lyon & Lyon Docket No. 221/187]; Tangら、08/485,323,
出願日6月7日, 1995, 名称 "BENZYLIDENE-Z-INDOLINE COMPOUNDS FOR THE TREAT
MENT OF DISEASE", [Lyon & Lyon Docket No. 223/298]; および、Ballinari
ら、WO 96/22976, 公開日8月1日, 1996]、 いずれも、図表を含み、出典明示し
て、全体を本明細書の一部とみなす。)
【0174】 キナーゼ活性を調整することのできる他の例としては、チルホスチン、キナゾ
リン、キノキソリンやキノリンが挙げられるが、これに限定されない。上述のキ
ナゾリン、チルホスチン、キノリンやキノキソリンは、よく知られた化合物で、
次のような文献に記載されている。例えば、キナゾリンについて記載する代表的
な文献は、次を含む。[Barkerら、EPO Publication No. 0 520 722 Al; Jones
ら、米国特許第4,447,608; Kabbeら、米国特許第4,757,072; KaulおよびVougiou
kas, 米国特許第5,316,553; Kreighbaum and Comer, 米国特許第4,343,940; Peg
gおよびWardleworth, EPO Publication No. 0 562 734 Al; Barkerら、Proc. of
Am. Assoc. for Cancer Research 32:327 (1991); Bertino, J.R., Cancer Res
earch 3: 293-304 (1979); Berdno, J.R., Cancer Research 9(2 part l):293-3
04 (1979); Curtinら、Br. J. Cancer 53:361-368 (1986); Fernandesら、Cance
r Research 43:1117-1123 (1983); Fernsら、J. Org. Chem. 44(2): 173-178; F
ryら、Science 265:1093-1095 (1994); Jackmanら、Cancer Research 51:5579-5
586 (1981); Jonesら、J. Med. Chem. 29(6):1114-1118; Lee and Skibo, Bioch
emistry 26(23):7355-7362 (1987); Lemusら、J. Org. Chem. 54:3511-3518 (19
89); Ley and Seng, Synthesis 1975:415-522 (1975); Maxwellら、Magnetic Re
sonance in Medicine 17:189-196 (1991); Miniら、Cancer Research 45:325-33
0 (1985); Phillips and Castle, J. Heterocyclic Chem. 17(19):1489-1596 (1
980); Reeceら、Cancer Research 47(11):2996-2999 (1977); Sculierら、Cance
r Immunol. and Immunother. 23:A65 (1986); Sikoraら、Cancer Letters 23:28
9-295 (1984); およびSikoraら、Analytical Biochem. 172:344-355 (1988)]、
全て、出典明示して、図表も含む全体を本明細書の一部とみなす。
【0175】 キノキサリンは、KaulおよびVougioukasにより述べられている
。[米国特許第5,316,553」、これらは全て、出典明示して、図表も含むその全
体を本明細書の一部とみなす。)
【0176】 キノリンは、下記文献に記載されている。([Dolleら、J. Med. Chem. 37:26
27-2629 (1994); MaGuire, J. Med. Cbem, 37:2129-2131 (1994); Burkeら、J.
Med. Chem. 36:425-432 (1993); およびBurkeら、BioOrganic Med. Chem. Lette
rs 2:1771-1774 (1992)] 全ては、出典明示して、図表も含むその全体を本明細
書の一部とみなす。)
【0177】 チルホスチンは、下記文献に記載されている。[Alienら、Clin. Exp. Immuno
1. 91:141-156 (1993); Anafiら、B1ood 82:12:3524-3529 (1993); Bakerら、J.
Cell Sci. 102:543-555 (1992); Bilderら、Amer. Physio1. Soc. pp. 6363-61
43:C721-C730 (1991); Bruntonら、Proceedings of Amer. Assoc: Cancer Rsch.
33:558 (1992); Bryckaertら、Experimental Cell Research 199:255-261 (199
2); Dongら、J. Leukocyte Biology 53:53-60 (1993); Dongら、J. Immuno1. 15
1(5):2717-2724 (1993); Gazitら、J. Med. Chem. 32:2344-2352 (1989); Gazit
ら、J. Med. Chem. 36:3556-3564 (1993); Kaurら、Anti-Cancer Drugs 5:213-2
22 (1994); Kaurら、King et al., Biochem. J. 275:413-418 (1991); Kuoら、C
ancer Letters 74:197-202 (1993); Levitzid, A., The FASEB J. 6:3275-3282
(1992); Lyallら、J. Bio1. Chem. 264:14503-14509 (1989); Petersonら、The
Prostate 22:335-345 (1993); Pillemerら、Int. J. Cancer 50:80-85 (1992);
Posnerら、Molecular Pharmacology 45:673-683 (1993); Renduら、Bio1. Pharm
acology 44(5):881-888 (1992); Sauro and Thomas, Life Sciences 53:371-376
(1993); Sauro and Thomas, J. Pharm. and Experimental Therapeutics 267(3
):l 19-1125 (1993); Wolbringら、J. Bio1. Chem. 269(36): 22470-22472 (199
4); および、 Yonedaら、Cancer Research 51:4430-4435 (1991)]、 これらは
全て、出典明示して、図表も含む全体を本明細書の一部とみなす。)
【0178】 モジュレーターとして使用できる他の化合物としては、下記文献記載のオキシ
インドリノンを含む。[U.S. patent application Serial No. 08/702,232 出願
日8月23日, 1996]、出典明示して、図表も含み全体を本明細書の一部とみなす
【0179】 患者に投与する化合物の服用量を決定する方法および生物体に化合物を投与す
る形態は、下記文献に開示されている。([U.S. Application Serial No. 08/7
02,282, 出願日August 23, 1996 and International patent publication numbe
r WO 96/22976, 公開日August 1 1996, いずれも、出典明示して、図表も含み全
体を本明細書の一部とみなす。) 当業者は、これらの開示が本発明に適用でき
、又容易に適合されることが分かるだろう。
【0180】 適当な投与量は、治療される疾病の種類、使用される特定の組成物や、患者の
サイズや生理的状態などのいろいろな要素に依存する。ここに記載の化合物の治
療的に有効な投与量は、初めは、細胞培養や動物モデルから評価できる。例えば
、投与量は、細胞培養アッセイで決定されたIC50を考慮して、ある循環濃度
領域となるように動物モデルで設定される。動物モデルデータは、ヒトへの有用
な投与量をより正確に決定するのに使うことができる。
【0181】 障害を防ぐため薬剤の最適選択を行うために、血漿、癌や腫瘍組織での、薬剤
や代謝性産物の血漿半減期や体内分布も決定することができる。このような測定
は、実施可能である。例えば、HPLC分析は、薬剤で処理された動物の血漿の
分析に、放射ラベルされた化合物は、X線、CATスキャンやMRIなどの検出
方法を使って決定することができる。スクリーニングアッセイで強い阻害作用を
示し、弱い薬物動態学的性質を示す化合物は、化学構造の変更や再試験などで最
適化することができる。この点で、優れた薬物動態学的特徴を持つ化合物が、モ
デルとして使われる。
【0182】 毒性試験は、血液組成を測定することで実施してもよい。例えば、毒性試験は
、適当な動物モデル中で、次のように実施される。1)化合物がマウスに投与さ
れる。(処理されない対照のマウスも又使われるべきである)、2)各処理群中
のマウス1匹から尾静脈経由で血液サンプルを定期的に抜く、3)サンプルは、
赤血球及白血球数、血液細胞組成、やリンパ球と多形核白血球の比率などが分析
される。各投与療法と対照の結果を比較することで、毒性の有無を決めることが
できる。
【0183】 毒性試験の最後に、動物の犠牲の上にさらなる試験をすることができる。(好
ましくは、アメリカ獣医学協会安楽死部会のアメリカ獣医学協会のガイドライン
報告による。[Journal of American Veterinary Medical Assoc., 202:229-249
, 1993]。各処置群を代表する動物は、次いで、転移、異常な疾病あるいは毒性
の直接的な証拠を探るため、巨視的解剖により調べられる。組織の巨視的な異常
は記録され、組織学的に検査される。体重または血液を減少させる化合物は、主
要臓器に悪影響を持つ化合物同様好ましくない。一般的に、悪影響が大きいほど
化合物はより好ましくなくなる。
【0184】 癌の治療のために使用される疎水性薬剤の一日使用量は、1から500mg/
日であり、好ましくは1から250mg/日、もっとも好適には1から50mg
/日である。活性成分の血漿レベルが治療効果を発揮するのに十分であれば、薬
剤の投与の頻度は、少なくしてもよい。血漿レベルは薬剤の効力を反映するはず
である。一般に、化合物の効果が強いほど、効果を発揮するのに必要な血漿レベ
ルは低くなる。
【0185】 DmGPCRのmRNA転写物は、多くの組織に見出される。このような組織
には、抹消血液リンパ球、脾臓、骨髄、唾液腺、心臓、甲状腺、副腎、すい臓、
肝臓、大腸、肺、前立腺、小腸、筋肉、胃、胎盤や胎児肝臓などが含まれる。配
列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,または、
23で提供される配列は、DmGPCRレセプターの完全長cDNAを見つける
のに使用してもよい。そのレセプターのクローンは、上述のように、そのレセプ
ターを活性化する内在性の神経伝達物質/ホルモンや、障害を治療するのに有用
性をもつと期待される化合物のスクリーニングを可能とする。このような障害と
しては、心血管障害、再灌流障害、冠血管血栓症、凝固障害、癌などの無秩序な
細胞成長、緑内障、肥満、代謝異常、炎症性障害やCNS障害などが含まれる。
【0186】 例えば、DmGPCRは、T細胞が疾病に関与している喘息などの呼吸器系疾
患の治療に有用であろう。気管平滑筋の収縮は、トロンビンにより刺激される。
[Cicalaら、(1999) Br. J. Phamiacol. 126:478-484)また、閉塞性細気管支炎
において、トロンビンレセプターの活性化は有害であるかもしれないとされてい
る。[Hauckら、(1999) Am. J. Physio. 1277:L22-L29]。さらに、肥満細胞は
、またトロンビンレセプターを持つことが示されている。[Cirinoら、(1996) J
. Exp. Med. 183:821-827)。DmGPCRは、また線維芽細胞プロコラーゲン
合成を通して、慢性の肺炎における気管構造の再構築に有用であると考えられる
。(例えば、Chambersら、(1998) Biochem. J. 333:121-127; Trejoら、(1996)
J. Biol. Chem. 271:21536-21541]を参照せよ。)
【0187】 さらに他の一例では、トロンビンレセプターの活性化後のT細胞によるsCD
40Lの放出とCD40lの発現の増加は、DmGPCRが、T細胞の役割と炎
症に起因する不安定狭心症の治療に有用である可能性があることを示唆している
。[Aukrustら、(1999) Circulation, 100:614-620]を参照せよ。
【0188】 さらなる一例は、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ関節炎や甲状
腺炎などの炎症性疾患の治療である。DmGPCRの組織発現プロファイルによ
ると、トロンビンレセプターの阻害は、これらの疾病に有益であるかもしれない
。(例えば、次の[Mornsら、(1996) Ann. Rheum. Dis. 55:841-843]を参照せ
よ。)T細胞に加えて、NK細胞や単球は、これらの疾病の原因として寄与する
決定的な細胞種である。(例えば、[Naldini & Camey, (1996) Cell Immuno1.
172:35-42; Hoffman & Cooper, (1995) B1ood Cells Mol. Dis. 21:156-167; Co
lottaら、(1994) Am. J. Pathol. 144:975-985]を参照せよ。)
【0189】 骨髄や脾臓でのDmGPCRの発現は、それが造血性前駆体細胞の増殖にある
役割を果たしているかもしれないことを示唆する。[DiCuccioら、(1996) Exp.
Hematol. 24:914-918]を参照せよ。
【0190】 もう一つの例として、DmGPCRは、急性、および/または外傷性脳障害の
治療に有用であるかもしれない。星状膠細胞は、トロンビンレセプターを発現す
ると報告されている。トロンビンレセプターの活性化が、脳手術後の血管神経膠
症に関連しているかもしれない。したがって、レセプター活性の阻害が、神経炎
症を抑えるのに有益であるかもしれない。星状膠細胞が介在する瘢痕形成も、ま
たトロンビンレセプターの阻害で抑えることができるかもしれない。例えば、[
Pindonら、(1998) Eur. J. Biochem. 255:766-774; Ubl & Reiser., (1997) Gli
a 21:361-369; Grabham & Cunningham, (1995) J. Neurochem. 64:583-591]を
参照せよ。
【0191】 DmGPCRレセプターの活性化は、ニューロンや星状膠細胞のアポトーシス
や、神経突起の成長の防止などを仲介するかもしれない。阻害は慢性および急性
の脳損傷の双方に効果的である。例えば、[Donovanら、(1997) J. Neurosci. 1
7:5316-5326;Turgeonら、(1998) J. Neurosci. 18:6882-6891; Smith-Swintosky
ら、(1997) J. Neurochem. 69:1890- 1896; Gillら、(1998) Brain Res. 797:3
21-327; Suidanら、(1996) Semin. Thromb. Hemost. 22:125-133.]を参照せよ
【0192】 次のテーブル4は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの配列を含んで
いる。
【0193】
【表4】
【0194】
【表5】
【0195】
【表6】
【0196】
【表7】
【0197】
【表8】
【0198】
【表9】
【0199】
【表10】
【0200】
【表11】
【0201】
【表12】
【0202】
【表13】
【0203】
【表14】
【0204】 ブダペスト条約により、本発明のクローンは、下記に寄託した。 [the Agricultural Research Culture Collection (NRRL) International Depo
sitory Authority, 1815N. University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.
A.)目録番号と寄託日は下のテーブル5に記載した。
【0205】
【表15】
【0206】 本発明は、以下に実施例にてさらに描写するが、これらは本発明を説明するた
めのものであって、本発明の範囲を制限することを意図しているのではなく、ま
た、そのように解釈されてはならない。本発明は、ここに具体的に記載のものと
は異なった形で実施可能であることは明白である。ここにある教示に照らして、
多数の本発明の改変や変形が可能であり、これらも本発明の範囲内に入る。
【0207】 本特許文書に記載の各特許、出願特許や文献は、ここにそれらの全体を参照と
して示すものである
【0208】 下に提示する実施例1は事実であるが、その他の実施例は予言的である。
【実施例】
【0209】 Celera社ゲノムD.melanogasterデータベースを、生成さ
れるmRNAを予想するための各種の遺伝子検索ソフトウェアを用い、予想タン
パク質およびmRNAデータベースに変換した。(「PnuFlyPep」データベース
)遺伝子検索ソフトウェアを用いた遺伝子データベースの検索方法は、公知であ
る。
【0210】 複数個の、Cエレガンス(C.elegans)のFaRP GPCRのヌク
レオチド配列を、このmRNAデータベースのクエリー配列として使用した。こ
のデータベースで、FASTAやGapped BLASTなど多くの種類の手
段を用いて類似領域を検索した。([Altschulら、Nuc. Acids Res., 1997,25,3
389, これは、ここでその全体を参照として利用した。)
【0211】 簡潔に述べると、BLASTアルゴリズム(BLASTは、Basic Local Alignment
Search Toolを短縮したもの)は、配列の類似性を決定するのに適している。[A
ltschulら、J. Mo1. Bio1., 1990, 215,403-410, これは、ここでその全体を参
照として利用した)。BLAST分析を実施するのためのソフトウェアは、国立
バイオテクノロジ-情報センター(the National Center for Biotechnology Inf
ormation)から誰でも入手可能である。(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。この
アルゴリズムは、まずデータベース中の同じ長さの単語と並べたとき、正の閾値
スコアTとマッチするか満足させるクエリー配列中のWの長さの短い単語を見つ
けることにより、高スコア配列ペア(HSP)を見つける。Tは、隣接単語スコ
ア閾値と呼ばれている。[Altschulら、前出]。これらの初期に見出された隣接
単語は、HSPを見つける検索を始める上でのシードとなる。そのヒットした単
語は、、総整列スコアが増加するように、配列に沿って配列の両方に延長される
。単語の両方向への延長は、次の場合停止される。すなわち、1)総整列スコア
が、その最大値より一定量X下がった場合、2)総整列スコアが、ネガティブな
スコアを持つ整列のため、ゼロまたはそれ以下になる時、または、3)配列のど
ちらか一方の末端に達した時である。BLASTアルゴリズム変数W、TとXは
、整列の感度と速度を決定する。ブラストプログラムは、デフォルトとして、単
語の長さ(W)を11、BLOSUM62スコアマトリックス([Henikoffら、
Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 1992,89, 10915-10919]を参照せよ、 出典明示
して、全体を本明細書の一部とみなす)整列(B)を50、期待値(E)を10
、M=5,N=4、および、両鎖の比較としている。
【0212】 BLASTアルゴリズム([Karlinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90,587
3-5787]、 出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす)、およびギャップ
ドブラストは、二つの配列間の近似性の統計分析を実施する。BLASTアルゴリズ
ムにおいて使われる近似性の尺度は、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間
でマッチが偶然起こる確率の指標を与える最小総確率(P(N))である。例えば、
ある核酸とあるGPCR遺伝子またはcDNAとは、もし、その核酸とGPCR
間の最小総確率が、約1より小さい、好ましくは約0.1より小さい、さらに好ま
しくは約0.01より小さい、およびさらに好ましくは約0.001より小さい時、
近似していると考えられる。
【0213】 予想されるタンパク質に相当するmRNAは、PnuFlyPepデータベー
スを構築するのに使われた予想mRNAのデータベースから引き出される。この
ようにして次のヌクレオチド配列が特定された。その配列は、配列番号:1,3
,5,7,9,11,13,15,および17で、それぞれ、クエリー配列と統
計的に有意な重複相同性を持つ。配列番号:3,4,5,6,および9ないし1
6(DmGPCRの2a,2b,5a,5b,6a,および、6bに相当する)
のヌクレオチド配列が、もう一つの特定された配列からPCRクローニングと配
列決定より得られた。これらの配列はそれぞれ、DmGPCR遺伝子のスプライ
ス変異体である。
【0214】 実施例2 cDNAの作成 cDNAは、成体ショウジョウバエメラノガスターのポリARNA[Clonte
ch Laboratories, Palo Alto, CA)、または成体ショウジョウバエメラノガスタ
ーの完全RNA(以下に記載)より作成された。完全RNAを得るには、ショウ
ジョウバエメラノガスターの親株(Biological Supply Company, Burlington, NC
)を冷却することにより麻酔させ、5から6匹の成虫を、10mlの水、10m
lのフォームラ4−24ショウジョウバエ培地と活性乾燥酵母(Biological Supp
ly Company)6から10グレインを含む培養容器に加える。各容器の末端には発
砲ポリウレタンのプラグを取り付け、ハエを室温(RT)で4から6週間インキ
ュベートした。期限がくると、容器を冷却し、麻酔のかかったハエは液体窒素中
に入れられた50mlのポリプロピレンチューブに移した。凍結したハエは、液体
窒素存在下で乳鉢と乳棒でするつぶす時まで、−70℃で保存した。液体窒素を
含む組織粉末は、ドライアイス上で50mlのポリプロピレンチューブに移しかえ
た。液体窒素を蒸発させた後、粉体組織は、−70℃で保存した。
【0215】 RNAを得るために、3000mgの粉体組織を、ドライアイス上でポリプロ
ピレンチューブに移し、6Mのグアニジン塩酸の0.1M NaOAc、pH
5.2の溶液を加えた。RNAase汚染に伴う問題を減らすため、すべての溶
液は、DEPEで処理されたか、FEPCで処理した蒸留水で作成され、すべて
のガラス容器は加熱されるか、未使用のプラスチック実験器具を使用した。チュ
ーブは、渦混合した後、氷上に置いた。粉体組織は20、21、および22ゲー
ジの針を繰り返し通して、ホモジナイズした。チューブは、遠心分離し(100
0xg、10分間)、2.5から3mlの上清液をUltra−Clear遠心
チューブ(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)の中に入った8mlの5
.7M塩化セシウムの0.1MNaOAc溶液の上に置いた。サンプルは、L8
−70遠心分離機(Beckman Instruments, Inc.,)にて、25000rpmで、
18℃で18時間遠心した。上清液は、傾けて除き、チューブを逆さまにして水抜
きした。RNAのペレットは、200μlのRNAaseフリーの蒸留水(Qiagen I
nc., Valencia, CA)に分散し、RNAaseフリーの蒸留水100μlで2回
洗浄した。RNAは、44μlの3M NaOAc、pH5.2溶液と1mlの冷100%エ
タノールを加えて沈殿させた。−70℃で一夜保存後、チューブは、14000
rpmで1時間遠心分離(Eppendorfmicroftige 5402)し、75%エタノール(D
EPC処理の蒸留水で作成)で洗浄した。ついで、ペレットは、RNAaseフ
リーの蒸留水に溶解した。260または280nmでの吸光度を、10mMトリ
スHCl、pH7.5溶液で測定し、RNAの濃度と純度を見積もった。
【0216】 一本鎖cDNAは、スーパースクリプトII酵素(GIBCO BRL,Ro
ckville,MD)を用いる方法により作成した。500ngのA+RNA
または3μg(μl)の完全RNAのいずれかを、RNAaseフリーの蒸留水
と250ng(2.5μl)のランダムプライマーを含む微量遠心管に添加した
。チューブ(12μl)は、70℃で10分間インキュベートし、氷上で冷却後
、次いで4μlの5x第一ストランド緩衝液、2μlの0.1MのDTTおよび
1μlの10mM dNTP混合物を添加した。25℃で10分間、次いで42
℃で2分間インキュベートの後、1μl(200ユニット)のスーパースクリプ
トIIを添加し、さらに42℃で50分インキュベートを継続した。酵素は、7
0℃で15分間加熱して不活性化させた。cDNAに相補的なRNAを除くため
、2μl(2ユニット)のRNAase(Boehringer Mannhe
im, Indianapolis, IN)を添加、次いで37℃で20分間
インキュベートした。cDNAは、−20℃で保存した。
【0217】 PCR反応 ショウジョウバエメラノガスターGタンパク質結合レセプターを増幅するため
、アンプリワックスビーズ(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) を用いて、標準
の50/100μlPCR反応またはホットスタートPCR反応を行った。プラ
イマー(Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX)を溶解するのに、
蒸留水を使用した。5’と3’プライマーは10μM濃度、内部プライマーは1
μMである。各PCR反応は、2から4ユニットのrTth XL DNAポリ
メラーゼ、1.2から1.5mMのMg(OAc)、200μMの各dNTP
,および200または400nMの各プライマーを含んでいた。ホットスタート
PCRには、32から36μlの「低」カクテル(蒸留水)、3.3xXL緩衝
液、dNTPおよびMg(OAc)を、各プライマー2または4μlに添加し
た。(総体積、40μl)。アンプリワックスビーズ(Perkin Elme
r Cetus)を添加し、チューブを75℃で5分間インキュベート、室温で
冷却、次いで60μlの「高」カクテル(dHO,3.3xXL−緩衝液、r
Tth およびテンプレート)を添加した。PCR増幅は、Perkin El
mer Series 9600 thermal cyclerで行った。熱
サイクルの典型的プログラムは、94℃で1分、次いで30サイクルの増幅(9
4℃で0.5分、60℃で0.5分、72℃で2分)、次いで60℃で6分であ
った。PCR生成物の3’Aオーバーハング(「テーリング」)を作るため、1
μlのTaqポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, C
A)をPCR増幅の終わりに添加し、チューブを72℃で10分間インキュベー
トした。反応混合物は、TAB緩衝液で準備した1%アガロースゲルで分析した
。PCR生成物は、通常QIAquickスパンカラムを用いて精製した。
【0218】 連結と形質転換 すべてのPCR反応生成物とPCR3.1ベクター(Invitrogen)
との連結、および、連結生成物のワンショットTM TOP10F形質転換受容
性細胞への形質転換は、製造業者の指示通り行った。挿入のためにスクリーニン
グされる形質転換細胞は、50μgアンピシリン/mlを含むLBブロス中で増
殖させた。挿入を持つコロニーは、沸騰−溶解プラスミドミニプレップ法(5)
または、形質転換細胞から直接プラスミドDNAを増幅する「コロニーPCR」
法のいずれかで特定した。
【0219】 DNA配列決定 配列決定用のDNAは、キアゲンアニオン交換プラスミドキット(QIAGEN-tip
20) を用いて、製造業者の指示に従って、37℃で一夜培養した5mlのLBか
らDNAを単離して得た。4種のプライマー(T7、MIS逆、「センス」およ
び「アンチセンス」)を、各DNAの配列決定に使用した。染料−ターミネータ
ー配列決定化学では、BigDye TM Terminator 試薬(Ap
plied Biosystems, Foster City, CA)、
あるいは、DYEnamic TM ET terminator kit
(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.,
Piscataway,NJ)を使用した。配列決定反応は、製造業者の推薦法
に従った。プライマーと取り込まれなかったヌクレオチドは、Centri−S
epスパンカラム(Princeton Separations, Adel
phia, NJ)を用いて除去した。配列決定反応は、Applied Bi
osystems 377 automated DNA sequencer
で分析した。DNA配列は集めて、セクエンチャー (Gene Codes, Ann Arbor, MI)、配列分析プログラムのGCGグループ (W
isconsin Package Version 10.1, Genet
ics Computer Group (GCG), Madison, W
l)、 およびベクターNTI5.5プログラムで利用可能な機能 (Info
rmax, Bethesda, MD)を用いて分析した。
【0220】 本発明のDmGPCRのクローニングと配列決定の結果は次の通りである。
【0221】 DmGPCR1 PnuFlyPep34651に相当するcDNAを対象としたのPCRプラ
イマーは、ショウジョウバエpolyAmRNAから調製したcDNA調整品
からPCR生成物を増幅するのに使用できた。この生成物は、クローン化し、配
列を決定した。実験的に決められた配列は、予想された配列と一致した。
【0222】 DmGPCR2 PnuFlyPep67585に相当するcDNA向けのプライマーを用いて
、PCR生成物の増幅を試みたが、うまくいかなかった。予想配列と、C. e
legans レセプターおよび他の神経ペプチドレセプターとを整列比較する
と、予想配列の5’末端が異常に長いことを示し、その側の遺伝子の予想にエラ
ーがあったことを示唆した。ゲノム配列を参考にして、各種の代わりの5’PC
Rプライマーを設計し試験した。これらプライマーの組合せの内の一つ、完全R
NAから調製したcDNAを使ったものはが、正しいサイズの生成物を与えるの
に成功した。PCR反応由来のクローンの配列決定の結果、増幅された生成物が
期待される5’および3’末端を持つこと、また、予想配列が6個のアミノ酸か
らなる短い断片を欠くことを除き、予想配列と一致することが示された。クロー
ンの比較により、2つのスプライスアイソフォームが存在することが判明した。
一つ(「DmGPCR2a」と命名)は、予想配列とよく似ていた。他方(「D
mGPCR2b」と命名)は、分子のTM II直後から細胞内C末端に入ると
ころに位置する23個のアミノ酸からなる断片を欠いていた。
【0223】 DmGPCR3 DmGPCR3が予想するタンパク質に相当する遺伝子は、文献中に報告され
ている。この遺伝子(GenBank accession M77168)
は、MKD、「発生的制御タキキニンレセプター」、として記載されている。(
MonnierD, et al., Journal of Biologi
cal Chemistry 1992;267(2): 1298−302)
。M77168とPnuFlyPep68505配列の比較により、予想配列が
cDNAとはかなり異なることが示された。cDNAは、より長い5’末端を持
ち、51アミノ酸をコードするエクソンを欠き、また3’末端もかなり短かった
。公開されている配列に向けた複数のPCRプライマーを設計し、一つのPCR
生成物が完全RNAから調整されたcDNAを用いて得られた。この生成物は、
構造がすでに報告されているNKD配列と一致した。
【0224】 DmGPCR4 PnuFlyPep 67393に相当するcDNAを用いて、DmGPCR
の増幅用のPCRプライマーを設計した。全ショウジョウバエmRNAから作ら
れたcDNAライブラリーを用い、PCR生成物が得られ、クローン化された。
クローンとPnuFlyPep 67393から予想された」配列を比較すると
、これらの配列が、HMMGeneがいずれのクローン化PCRにもないことを
除き、一致することが判明した。DmGPCRは、最近レンツらによりクローン
化されている。[Lenzら、Biochem. Biophys. Res.
Comm., 273:571−577 (2000))。また、第二の推定
アラトスタチンレセプターとして分類されている。
【0225】 DmGPCR5 DmGPCR5(PnuFlyPep67522)は、すでに次の文献に、「
タチキニン関連ペプチド(M77168)のショウジョウバエレセプター」とし
て記載されている。[Li XJら、BMBO Journal 1991;1
0(ll):3221−9)。初めの外見上、PnuFlyPepタンパク質に
相当する予想cDNAは、報告されている配列に一致した。PCRプライマーを
用いて、ショウジョウバエメラノガスターのpolyA+mRNAから調製した
cDNAより、適当なサイズのPCR生成物に増幅した。 クローン化されたPCR生成物の配列決定の結果、全体的なスプライシングパタ
ーンは同じであるが、配列のエラーが報告されている配列に2箇所あることが判
明した。これらのエラーは、フレームシフト変異、次いで代償性フレームシフト
変異を引き起こし、結果として実験的に求めた配列と報告されている配列に間に
46番目のアミノ酸から始まる13個のアミノ酸の差となった。このクローン化
遺伝子は、「DmGPCR5a」と命名した。
【0226】 又、DmGPCR5aには、スプライシングアイソフォームが認められた。こ
の変異体は、N末端細胞外ドメインに、余分な3個のアミノ酸をコードしていた
。この変異体は、「DmGPCR5b」と命名した。
【0227】 DmGPCR6 PnuFlyPep15731に相当するGPCRは、「神経ペプチドY」M
81490として報告されている。[Li XJら、Journal of B
iological Chemistry 1992;267(l):9−12
)。PnuFlyPepから予想される配列は、 M81490とは、分子の両
端で異なっていた。PnuFlyPep15731は、M81490と比べ、N
末端に余分な15個のアミノ酸を持っていた。PnuFlyPep15731に
3’末端も、M81490と比べ、保存されていたTMVIおよびTMVII残
基が切断され、保持していなかった。
【0228】 M81490の配列を使い、初期PCRプライマーを設計した。これらのプラ
イマーと完全mRNA由来のテンプレートを使用して、PCR生成物が得られた
。クローン化されたPCR生成物を調べた結果、それがM81490と同じプロ
セシングパターンを持つことが判明した。このクローンは、「DmGPCR6a
」と命名した。
【0229】 DmGPCR6aのクローニング中に、もう一つのスプライシングアイソフォ
ームが発見された。このアイソフォームは、異なったスプライス受容サイトを使
い、6a型とほぼ同じ配列を使ってはいるものの異なる読み枠を使った結果、異
なった3’末端を作り出したものである。又、このクローンの読み枠は、元の3
’PCRプライマーを超えて伸びている。3’末端のゲノム配列を調べた結果、
多数の疑わしいエクソンが明らかとなった。これらの多数のエクソンに相当する
PCRプライマーを調べ、PCR生成物を増幅するプライマーを一つ探し当てた
。この生成物は、「6b」と命名した。ゲノム配列を調べた結果は、PnuFl
yPep15731により予想される発動因子ATGは、余分な15個のアミノ
酸を含有するM81490の開始コドンのフレーム中にあること、又PnuFl
yPep15731の開始コドンが正しい開始コドンであると可能性が高いこと
を示唆した。新しいPnuFlyPep15731を導入した5’PCRプライ
マーを設計し、2個の3’PCRプライマーと組み合わせて、「DmGPCR6
aL」と「DmGPCR6bL」の増幅およびクローン化に使用した。
【0230】 DmGPCR7 当初のDmGPCR7遺伝子の増幅の試みは、失敗に終わった。 予想配列[PnuFlyPep67863) と他のGPCRとを整列比較の結
果、間違いは、多分分子の3’末端の予想にあると考えられた。その予想配列は
、他のほとんどのGPCRの3’末端より、大幅に長い3’末端を有していた。
ゲノム配列を調べた結果は、間違いはスプライシングの予想にあるようで、スプ
ライシングによりフレーム内停止コドン[この停止コドンは分子を適当な大きさ
にする)を除去してしまったことを示唆した。3’PCRプライマーは、そのイ
ントロン内に設計した。また、予想開始コドンの直ぐ上流のフレーム内ATGを
使用するように新しい5’PCRプライマーを設計した。完全mRNA由来のc
DNAのPCR増幅は、期待したサイズの生成物を与えた。
【0231】 DmGPCR8 DmGPCR8は、PnuFlyPep予想配列向けに設計されたPCRプラ
イマーを用いて増幅できた。polyA+RNA由来のcDNAを、PCR反応
用のテンプレートとして使用した。配列の決定されたクローン6種は、すべてP
nuFlyPep予想配列と構造が一致した。69位[DNA配列)には他形性
が認められ、クローンの半分がこの位置に「C」を、他の半分は「A」を持って
いた。この変化はアミノ酸配列の変化につながり、それぞれ、AspまたはGl
uである。セレーラ社の配列は「A」を示しており、このため、以降の研究用に
は、任意に「A」クローン[Glu)を選択した。正しい配向を持つ「A」クロ
ーンはなかった。このため、Pme Iを用いて元のpCR3.1クローンおよ
びPme I消化pCR3.1ベクターから挿入部を除くためのサブクローニン
グのステップを使い、配向を逆転させた。
【0232】 DmGPCR9 DmGPCR9は、 PnuFlyPepの予想する配列に向けたPCRプラ
イマーと、polyA+RNAから調製したcDNAテンプレートとを用いてク
ローン化した。ゲノム構造は、PnuFlyPepからの予想と一致した。
【0233】 DmGPCR10 DmGPCR10[PnuFlyPep70325)向けのプライマーを使い
PCR生成物を作成しようとしたが、当初はうまくいかなかった。予想されたc
DNAを調べた結果、予想配列が、多くの保存残基があるにもかかわらず、高度
に保存されているはずの「WXP」モチーフがTMVIに、「NPXXF」がT
MVIIに欠けている点で異常であることが明らかとなった。ゲノム配列を、最
後のエクソンの80kb下流まで調べたが、他に可能性のあるエクソンは見出さ
れなかった。DmGPCR10用の無傷のクローンを得ようとは、試みなかった
【0234】 DmGPCR11[アラトスタチン様ペプチドレセプター) アラトスタチン様ペプチドレセプター向けのPCRプライマーを、既知の配列
を用いて設計した。[Birgul N.ら、EMBO Journal 19
99;18(21):5892−900)。PCR生成物は、完全mRNA調製
物由来のcDNAを用いて得られ、クローン化され、配列決定された。このcD
NAは、文献に記載のものと一致するタンパク質をコードしていた。
【0235】 実施例3、ノーザンブロット分析 ノーザンブロットは、mRNAの発現を見るのに使える。上述のセンスおよび
アンチセンス配向オリゴヌクレオチドが、配列番号:1,3,5,7,9,14
,13,15,17,19、および21の群から選ばれるヌクレオチド配列のG
PCRのcDNA配列の一部を増幅するプライマーとして使用できる。
【0236】 クロンテック社のヒト組織ノーザンブロット(Human II #7767
−1) を、プローブとハイブリッド形成させた。前ハイブリッド形成は、42
℃で4時間、5xSSC、lx デンハート試薬、0.1% SDS,50%
ホルムアミド,250mg/ml サケ精子DNA中を含む混合物中で行った。
ハイブリッド化は、42Cで一夜、同じ混合物中に、約1.5x106cpm/
mlのラベル化されたプローブを添加して行った。
【0237】 プローブは、レディプライムDNAラベルシステム社のalpha−32P−
dCTPでラベルし、ニックカラム(Amersham Pharmacia)
で精製し、ハイブリッド化溶液に添加した。ロ液は、42℃で0.2x SS
Cおよび0.1% SDSで、数回洗浄した。ろ紙は、コダックXARフィルム
(Eastman Kodak Company, Rochester, N
.Y., USA)に、−80℃で強化スクリーンを用いて露出させた。
【0238】 実施例4、DmGPCR真核細胞の組替え発現 A.DmGPCRの哺乳類細胞での発現 DmGPCRタンパク質を産生するため、DmGPCRをコードするポリヌク
レオチドを、適当な発現ベクターと標準的な遺伝光学技法を用いて適当な宿主細
胞中で発現させた。例えば、実施例1に述べられたDmGPCRをコードする配
列は、市販の発現ベクターpzeoSV2 (Invitrogen, San
Dieg0, CA)にサブクローン化し、形質移入試薬FuGENE 6
(Boehringer−Mannheim)、および 試薬添付の形質移入手
順に従い、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に形質移入した。たとえ
ばヒト胎生肝臓(HEK 293)、CHO細胞、およびCOS細胞などの他の
真核細胞のセルラインも適当である。、DmGPCRを安定に発現する細胞は、
100 ng/ml ゼオシン(Stertagene, LaJolla,
CA)存在下での成長により選別した。DmGPCRは、標準的なクロマトグラ
フィー法により細胞から精製すればよい。精製を楽にするため、DmGPCRの
アミノ酸配列の一部に相当する1つ以上の合成ペプチド配列に対して、抗血清を
作り、この抗血清をDmGPCRのアフィニティー精製に利用する。DmGPC
Rは、精製を容易とするため、タグ配列(例えば、ポリヒスチジン、ヘマグルチ
ニン, FLAGなど) のフレーム内で発現してもよい。さらに、DmGPC
Rポリペプチドの利用分野の多くにおいては、DmGPCRの宿主細胞からの精
製が必ずしも必要がないことにも留意すべきである。
【0239】 B,DmGPCRの293セルでの発現 DmGPCRの哺乳類CHO細胞での発現のため、関連するDmGPCRコー
ド配列をもつプラスミドを、pSecTag2A ベクター(favitrog
en)を使用して作成する。pSecTag2Aベクターは、分泌のためのマウ
スIgKチェーンリーダー配列、anti−myc抗体で組換えタンパク質を検
出するためのc−myc抗原決定基、ニッケルキレートクロマトグラフィーで精
製のためのC末端ポリヒスチジン、および安定な形質移入体の選別のためのゼオ
シン抵抗性遺伝子をを持っている。このGPCRのcDNAの増幅のための順方
向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、GPCR配列にマッ
チするHindIIIクローニングサイトを導入するための5’延長ヌクレオチ
ドを持っている。逆プライマーも、同様にルーチンな手順で決定でき、好ましく
は、クローニングのためのXhoI制限サイトとDmGPCR配列の逆補体に相
当するヌクレトチドを導入するための5’延長ヌクレオチドを持っている。PC
Rの条件は、徐冷温度が55Cであった。PCR生成物は、ゲル精製し、ベクタ
ーのHindIIIサイトにクローン化した。
【0240】 DNAは、キアゲンクロマトグラフィーカラムで精製し、DOTAP移入媒体
(Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN)を使って、293セルにで形質移入した。一時的に形質移入された細胞は
、移入24時間後に、アンチひすHisとアンチDmGPCRペプチド抗体とを
用いるウェスターンブロット法で試験した。永久形質転換細胞は、ゼオシンで選
択し、増殖させた。組換えタンパク質の酸性は、細胞および媒体の両方から、ア
ンチHisまたはアンチGPCRペプチド抗体を用いるウェスターンブロット法
で検出した。
【0241】 C.DmGPCRのCOS細胞での発現 DmGPCRのCOS7細胞での発現のため、配列番号:1,3,5,7,9
,11,13,15,17,19,21、または、23の群から選択されるヌク
レオチド配列を持つポリヌクレオチド分子を、p3−CIベクターにクローン化
できる。このベクターは、bGH(ウシ成長ホルモン)ポリアデニル化配列の上
流にHCMV(ヒトサイトメガロウィルス)プロモーターイントロンと、多数の
クローン化サイトを持つpUC18由来のプラスミドである。又、このプラスミ
ドは、薬剤メトトレクセース(MTX)の存在下で安定な形質移入体を選択する
ための役立つDHFR(デヒドロフォレートリダクターゼ)遺伝子を持っている
【0242】 その順方向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、クローニ
ングのためのXbaI制限サイトを導入するための5’延長ヌクレオチドと、そ
れに続いて配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,2
1、または23のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列に相当するヌクレ
オチドを持っている。その逆プライマーも、ルーチンな手順で決定でき、好まし
くは、SaiIクローニングサイトを導入するための5’−延長ヌクレオチドと
、それに続いて配列番号:1,3,5、7,9,11,13,15,17,19
,21、または23のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列の逆補体に相
当するヌクレオチドを持っている
【0243】 PCRは、95℃で5分間の初期変性ステップ、95℃で30秒間の変性30
サイクル、58℃30秒間の徐冷、および72℃30秒間の伸張、続いて72℃
5分間の伸張からなる。PCR生成物はゲル精製され、p3−ClベクターのX
baIおよびSalIサイトに結合される。この構築物は、増幅およびDNA精
製のため大腸菌細胞に形質移入される。DNAはキアゲンクロマトグラフィーカ
ラムで精製、COS7細胞にリポフェクタミン試薬(BRL)を用いて製造業者
の手順に従って形質移入される。形質移入48時間および72時間後、媒体と細
胞中での組換えタンパク質の発現が調べられる。
【0244】 COS細胞から発現されたDmGPCRは、細胞成長培地を、10mgタンパ
ク質/ml間で濃縮され、例えば、クロマトグラフィーでタンパク質が精製され
る。精製されたDmGPCRは、YM−10膜を取り付けたアミコン濃縮装置で
、0.5 mg/mlまで濃縮し、−80℃で保存される。
【0245】 D.DmGPCRの昆虫細胞での発現 バキュロウィルスシステムでのDmGPCRの発現に、配列番号:1,3,5
,7,9,11,13,15,17,19,21、または23の軍から選ばれた
ヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子が、PCRにより増幅された。そ
の順方向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、NdeIクロ
ーニングサイトを付加するための5’延長ヌクレオチドと、それに続いて配列番
号:1,3,5、7,9,11,13,15,17,19,21、または23の
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に相当するヌクレオチドを持ってい
る。その逆プライマーも、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、KpnIク
ローニングサイトを導入するための5’−延長ヌクレオチドと、それに続いて配
列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21、または2
3のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列の逆補体に相当するヌクレオチ
ドを持っている
【0246】 PCR生成物はゲル精製され、NdeIおよびKpnIで消化され、pAcH
TL−A(Pharmmgen, San Dieg0, CA)ベクターの相
当するサイトに結合される。pAcHTL発現ベクターは、オートグラファカリ
フォミカヌクレアポリヘドロシスウィルス(AcMNPV)の強いポリヘドリン
プロモーターと、多重クローニングサイトの上流にある6XHisタグを持って
いる。組換えタンパク質中のホスホリル化のためのプロテインキナーゼサイトと
切除のためのトロンビンサイトも、又多重クローニングサイトの前にある。もち
ろん、他の多くのバキュロウィルスベクターが、pAcHTL−Aに代えて使用
可能であり、例えば、pAc373,pVL941やpAcIM1などがある。
GPCRポリペプチドの発現のために、他に適当なベクターも使用可能である。
ただし、そのベクター構築物が、転写、翻訳や輸送のためのシグナル(例えば、
フレーム内AUG)を適当な場所に、および、必要に応じてシグナルペプチドを
、含んでいるのが条件である。これらのベクターは、Luckowらにより報告
されている。(たくさんの中で代表は、Luckowら、Virology 1
70:31−39)ウィルスは、標準的なバキュロウィルス発現方法を使って、
増殖単離される。例えば、Summersらの報告がある。 [A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS
VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PRO
CEDURES, Texas Agricultural Experime
ntal Station Bulletin No. 1555 (1987
))。
【0247】 ある好ましい実施形態は、「バキュロゴールド」形質転移キットをメーカーの
確立した方法をにしたがって使用し、DmGPCR遺伝子を含むpAcHLT−
Aをバキュロウィルスに形質移入することである。各ウィルス単離物は、感染後
24時間に35Sメチオニンで放射ラベルした感染細胞を使用してタンパク質生
産量を分析される。感染細胞は、感染後48時間で収穫し、ラベル化されたタン
パク質を、SDS−PAGEで可視化される。高度な発現レベルを示すウィルス
は単離し、スケールアップした発現に用いることができる。
【0248】 DmGPCRポリペプチドのSf9細胞での発現には、配列番号:1,3,5
,7,9,11,13, 5,17,19,21、または23から構成される群
の中から選択されたヌクレオチド配列を持つポリペプチド分子を、上記バキュロ
ウィルス発現に用いたプライマーや方法を用いて、PCRにより増幅してもよい
。DmGPCRのcDNAは、Sf9昆虫中で発現のために、pAcHLT−A
ベクター(Phanningen) にクローン化される。この挿入断片は、内
部のNdeIサイトを(上記バキュロウィルスの発現で記載のプライマーを使い
)除去後、NdeIやKplIサイトにクローン化される。DNAは、キアゲン
クロマトグラフィーカラムで精製され、Sf9細胞で発現される。非精製プラー
クからの予備的なウェスターンブロット試験で、GPCR特異的抗体と反応する
期待サイズの組換えタンパク質があるかどうか調べられる。これらの結果は、さ
らに精製し、HiG5細胞中で発現の最適化後に確認される。
【0249】 実施例5、トラップ/ツーハイブリッドシステムの相互作用 DmGPCRと相互作用を持つタンパク質をアッセイするため、トラップ/ツ
ーハイブリッドライブラリースクリーニングの相互作用が使用可能である。本ア
ッセイは、最初にFieldsらにより記述されている。([Fieldsら、
Nature, 1989, 340,245],全体を参照とする)。手順は
、次の文献に記載してある。[CIRRENT PROTOCOLS IN M
OLECULAR BIOLOGY 1999, John Wiley &
Sons, NY and Ausube1,F. M.ら、1992, SH
ORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,
fourth edition, Greene and Wiley−int
erscience, NY, 出典明示して、その全体を本明細書の一部とみ
なす。)キットは、クローンテックから入手可能である。 Clontech, Palo Alto, CA (Matchmaker
Two−Hybrid System 3)
【0250】 DmGPCRの全配列または一部の配列をコードするヌクレオチド配列と酵母
転写因子GAL4のDNA結合ドメイン(DNA−BD)の融合は、標準的なサ
ブクローニング手法を用いて、ある適当なプラスミド(すなわち、pGBKT7
)中で実施される。同様に、GAL4活性ドメイン(AD)融合ライブラリーは
、第二のプラスミド(すなわち、pGADT7)中で、可能性のあるGPCR結
合タンパク質のcDNAから形成される。cDNAライブラリーを作るための手
順は、Sambrookらを参照せよ。[Sambrookら、1989, M
OLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUA
L, second edition. Cold Spring Harbo
r Press, Cold Spring Haibor, NY)]、出典
明示して、全体を本明細書の一部とみなす。DNA−BD/GPCR融合構築物
は、配列決定により確認され、自律的なレセプター遺伝子活性や細胞毒性につき
試験され、その両方ともツーハイブリッド分析を阻害するであろう。同様な対照
が、宿主細胞中での発現や転写活性の欠損を確認するために、AD/ライブラリ
ー融合生成物に対しても実施される。酵母細胞は、GPCRおよびライブラリー
融合プラスミドの両方で、下記の標準的な手順で、形質転換される(約105形
質転換体/ml)。[Ausube1ら、1992, SHORT PROTO
COLS IN MOLECULAR BIOLOGY, fourth ed
ition, Greene and Wiley−interscience
, NY]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。DNA−BD/G
PCRのAD/ライブラリータンパク質を用いた体外結合試験は、特定の酵母プ
ラスミドレセプター遺伝子の転写につながる。(すなわち、lacZ、HIS3
、ADE2、LEU2)。酵母細胞は、栄養素欠乏培地でレポーター遺伝子の発
現をスクリーニングする。コロニーは、Xgal(5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドイルp−beta−D−ガラクトシド)補充培地中で増殖後、二重にP
−ガラクトシダーゼ活性の測定がされる。beta−ガラクトシダーゼ活性のフ
ィルターアッセイについては、次の文献を参照せよ。[Breedenら、Co
ld Spring Harb., Symp. Quant. Bio1.,
1985,50,643]、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。
正の値を持つAD−ライブラリープラスミドは、形質転移体の中なら取り出し、
DmGPCR/ライブラリータンパク質相互作用を確認するために、元の酵母菌
株や非関連DNA−BD融合タンパク質を持つ他の菌株に再導入される。挿入D
NAは、配列決定され、開放性の読み枠がGAL4 ADに融合しているか確認
され、又DmGPCR結合タンパク質が何か確認される。
【0251】 実施例6、ゲル電気泳動を用いたモビリティ−シフトDNA結合アッセイ。 ゲル電気泳動モビリティーシフトアッセイは、特定のタンパク質−DNA相互
作用を迅速に検出できる。手順は、Sambrookらのマニュアルなどで広く
入手可能である。[Sambrookら、1989 MOLECULAR C
LONING: A LABORATORY MANUAL, second
edition. Cold Spring Harbor Press, C
old Spring Harbor, NY; および Ausube1,
F. M.ら。1992, SHORT PROTOCOLS IN MOLE
CULAR BIOLOGY, fourth edition, Green
e and Wiley−interscience, NY]、いずれも、出
典明示して、その全体を本明細書の一部とみなす。
【0252】 プローブDNA(<300bp)は、合成オリゴヌクレオチド、制限エンドヌ
クレアーゼフラグメント、または32Pで末端ラベル化したPCRフラグメント
などから得ることができる。精製DmGPCR(約15μg)または粗DmGP
CR抽出物(約15ng)のサンプルは、低温で(22−27Cの範囲)、少な
くとも30分間、10−15μlの、放射ラベル化プローブDNA,非特異的キ
ャリアーDNA(約1μg)、BSA(300μg/ml)および10%(v/
v)グリセリンを含む緩衝液中(すなわち、TAEまたはTBE)でインキュベ
ートした。反応混合物は、次いでポリアクリルアミドゲルに乗せ、30−35m
Aで、フリーのDNAとタンパク質−DNA複合体とが良好な分離を示すまで展
開した。ゲルは、次いで乾燥され、フリーのDNAとタンパク質−DNA複合体
に相当するバンドは、オートラジオグラフィーで検出した。
【0253】 実施例7、DmGPCRの抗体 DmGPCRレセプターに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体を作成するのに、また、それらの抗原結合フラグメントまたは、ヒト化変異体
を含むそれらの変異体を作成するのに、標準的な技法を使った。このような手順
は、例えば、Sambrookらにより述べられている。[Sambrookら
、(1989) および Harlowら (編集), ANTIBODIES
A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Ha
rbor Laboratory; Cold Spring Harbor,
NY (1988))。一つの実施形態では、組換えDmGPCRポリペプチ
ド(または、これらのポリペプチドを含有している細胞または細胞膜)が、抗体
を作成するための抗原として使用される。もう一つの実施形態では、DmGPC
Rの免疫原部分に相当するアミノ酸配列(例えば、6,7,8,9,10,11
,12,13,14,15,16,17,18,19,20,または、これ以上
のアミノ酸)を持つ1個以上のペプチドが、抗原として使用される。DmGPC
Rの細胞外部分に相当するペプチド、特に親水性細胞外部分が好ましい。抗原は
、抗体生産を増加させるため、アジュバントと混合してもよいし、ハプテンと結
合させてもよい。
【0254】 A.ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体 一つの手順を例示すると、組換えDmGPCRまたはその合成フラグメントを
、モノクローナル抗体産生用のマウス(あるいは、ポリクローナル抗体には、ウ
サギなどのより大型哺乳類)に免疫化する。免疫原性を増加するために、ペプチ
ドはキーホールリンペットヘモシャン(Pierce)に、製造業者の推薦法に
より、抱合させることが出来る。最初の注入には、抗原はフロイント完全アジュ
バントでエマルジョン化し、皮下注射される。2から3週間の間隔で、DmGP
CR抗原の一定量がフロイント不完全アジュバントでエマルジョン化され、皮下
注射される。最後の追加免疫の前に、血清サンプルを免疫されたマウスから取り
出し、ウェスターンブロット法でアッセイして、DmGPCRと免疫反応する抗
体の存在を確認する。免疫された動物からの血清は、ポリクローナル抗血清とし
て、あるいはDmGPCRを認識するポリクローナル抗体を単離するのに使用し
てもよい。代わりに、モノクローナル抗体を作成するために、マウスを犠牲にし
て、脾臓を取り出してもよい。
【0255】 モノクローナル抗体を作るためには、脾臓を、10ml無血清RPMI164
0中に入れる。単細胞乳濁液は、2mMのL−グルタミン、1mMピルビン酸ナ
トリウム、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプ
トマイシン(RPMI)(Gibco,Canada)を添加した無血清RPM
I1640中で脾臓を破砕することにより得られる。細胞乳濁液は、遠心分離で
ろ過洗浄し、無血清RPMIに再乳濁する。3匹の無処理のBalb/cマウス
から取り出された胸腺細胞は、同様に取り出し、フィーダーレイヤーとして使用
した。10%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone Laboratori
es, Inc., Logan, Utah) を含むRPMI中に対数期で
保存されたNS−1骨髄腫細胞は、遠心分離し洗浄した。
【0256】 雑種細胞(ハイブリドーマ)を作るのに、免疫かされたマウス由来の脾臓細胞
が、NS−1細胞と混合され、遠心分離後、上澄みは吸引除去した。細胞のペレ
ットは、チューブから外し、2mlのPEG1500(75mMHRPES、p
H8.0中50%)(Boehringer−Mannheim)をかき混ぜな
がら注ぎ、さらに無血清RPMIを添加した。その後、細胞は遠心分離し、15
%ヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン(HAT)(
Gibco)、25units/mlのIL−6(Boehringer−Ma
nnheim)および1.5x106胸腺細胞/mlを含むRPMIに再乳濁し
、10枚のコーニング平底96ウェル組織培養プレート(Coming, Co
ming New York)に移した。
【0257】 融合後、2,4,6日後に、100μlの培地をウェルから除き、新鮮な培地
で入れ替えた。8日後に、融合をELISAでスクリーニングし、DmGPCR
に結合するマウスIgGの存否をテストした。選ばれた融合ウェルは、希釈によ
りさらにクローン化して、抗DmGPCR抗体を生産するモノクローナル培養物
を得た。
【0258】 B.抗DmGPCRモノクローナル抗体のヒト化 ここに述べられたDmGPCRの発現パターンや、治療的処置の標的としての
GPCRの過去の記録は、DmGPCR阻害剤(拮抗剤)としての可能性を示唆
している。DmGPCR中和抗体は、DmGPCR抗体として、有益な治療剤の
一分類を構成する。以下に、抗DmGPCRモノクローナル抗体を、モノクロー
ナル抗体を「ヒト化」して、血清半減期を改良し、ヒト宿主に対する免疫原性を
低減し(すなわち、ヒトの非ヒト抗DmGPCR抗体に対する抗体応答を抑制し
)、ヒトの治療剤としての有用性を改良する手順を記載する。
【0259】 ヒト化の原理は、文献中に記載されており、抗体タンパク質のモジュール状配
列のため容易となっている。結合補体の可能性を最小限に押させるため、IgG
4アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【0260】 例えば、あるレベルのヒト化は、興味のある非ヒト抗体タンパク質の可変ドメ
インとヒト抗体分子の固定ドメインを含むキメラ抗体により達成できる。例えば
、[Morrisonら、Adv. Immuno1., 44:65−92
(1989)]を参照せよ。DmGPCR中和、抗DmGPCR抗体の可変ドメ
インは、B細胞ハイブリドーマ、または興味のあるハイブリドーマから単離され
たmRNAから作られたcDNAからクローンされる。遺伝子フラグメントのV
領域は、ヒト抗体固定ドメインをコードするエクソンに連結され、その構築物は
適当な哺乳類宿主細胞(例えば、ミエローマまたはCHO細胞)中で発現される
【0261】 さらに高いレベルのヒト化を達成するのに、可変領域遺伝子フラグメントの非
ヒトモノクローナル抗体遺伝子中の抗原結合性の相補的決定領域(CDR)をコ
ードする部分が、ヒト抗体配列にクローンされる。例えば、[Jonesら、N
ature 321:522−525 (1986); Riechmann
ら、Nature 332:323−327 (1988); Verhoey
enら、Science 239:1534−36 (1988); および
Tempestら、Bio/Technology 9:266−71 (19
91)]を参照せよ。必要なら、ヒト抗体のCDR3を囲むbeta−シートフ
レームを、元のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造を厳密に写
し取るように、修飾される。[Kettleboroughら、Protein
Engin., 4:773−783 (1991);およびFooteら、
J. Mo1. Bio1., 224:487−499 (1992)]を参
照せよ。
【0262】 これに代わるアプローチは、興味のある非ヒトモノクローナル抗体の表面を、
非ヒト抗体の内部や結合残基は保持しながら、非ヒト抗体の表面残基のいくつか
を改変(例えば、部位特異的突然変異誘発で)することにより、ヒト化すること
である([Padlan, Molecular lmmuno1., 28(
4/5):489−98 (1991)])。
【0263】 上述のアプローチは、DmGPCR中和抗DmGPCRモノクローナル抗体を
使って、又、DmGPCR発現またはリガンド仲介DmGPCRシグナリングが
損なわれているような疾病や一時的状態を治療するために治療薬として有用なヒ
ト化DmGPCR中和抗体を産生するハイブリドーマを使って行われる。
【0264】 実施例8、DmGPCR活性のモジュレーターを特定するためのアッセイ
【0265】 以下に、DmGPCR活性のモジュレーターを特定するための、各種の非限定
的なアッセイについて述べるの。これらのアッセイで特定されるモジュレーター
の中には、レセプターの天然リガンド化合物、天然リガンドの合成アナログおよ
び誘導体、抗体、抗体のフラグメント、および/または天然抗体または高スルー
プットスクリーニングで特定された合成化合物由来の抗体類似化合物等が含まれ
る。DmGPCRに結合するすべてのモジュレーターは、組織サンプル中にある
DmGPCRを特定する(すなわち、診断目的、病理学目的などで)のに有用で
ある。抗原および抗体モジュレーターは、DmGPCR活性を、DmGPCRの
異常なレベルに特徴される疾病状態の治療のために、それぞれ情報制御および下
方制御するのに有用である。アッセイは、推定上のモジュレーターで行われても
よいし、および/または、既知の作動薬を候補拮抗薬と組み合わせて(またはそ
の逆)行われてもよい。
【0266】 A、cAMPアッセイ 第一のタイプのアッセイでは、候補モジュレーター化合物に露出されたDmG
PCR形質移入細胞の中のサイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)のレベ
ルが、測定される。cDNAアッセイの手順は、文献に記載されている。例えば
、[Sutherlandら、Circulation 37:279 (19
68); Frandsenら、Life Sciences 18: 529
−541 (1976); Dooleyら、Journal of Phar
macology and Experimental Therapeuti
cs 283 (2):735−41 (1997); および George
ら、Journal of Biomolecular Screening
2 (4): 235−40 (1997)]を参照せよ。その手順の一例、ア
デニリルシクラーゼ活性化フラッシュプレートアッセイ(NEN Life S
cience Products)を以下に述べる。
【0267】 手短に述べると、DmGPCRコード配列(例えば、cDNAまたはイントロ
ンの無いゲノムDNA)は、市販の発現ベクター、例えばpzeoSV2(In
vitrogen)内にサブクローン化され、一時的にチャイニーズハムスター
卵巣(CHO)細胞に、ベーリンガーマンハイム社からFuGENE形質移入試
薬につけて提供される形質移入手順のような既知の方法で形質移入される。形質
移入されたCHO細胞は、フラッシュプレートアッセイキットからの96ウェル
マイクロプレートに播種される。このマイクロプレートは、cAMPに対する抗
血清が前もって結合されている固体シンチラントでコートされている。 このトロールとして、いくらかのウェルには野生型(形質移入されていない)C
HO細胞が播種される。プレート上の他のウェルは、標準曲線を作成するために
使われるいろいろな量のcAMP標準溶液を受け取る。
【0268】 1つ以上の試験化合物(すなわち、候補モジュレーター)、および、水および
/またはその化合物を含まない培地/希釈剤を対照として、各ウェル中の細胞に
加える。処理後、cAMPを、室温でちょうど15分間、細胞内に集まらせる。
アッセイは、[125I]−ラベルされたcAMPを含む溶解緩衝液の添加で停
止し、プレートをパッカードトップカウント96ウェルマイクロプレートシンチ
レーションカウンターを使用して測定する。溶解されたラベル細胞から(あるい
は、標準から)のラベルされていないcAMP、および固定量の[125I]−
cAMPは、プレートに結合している抗体に対し競争する。標準曲線が作成され
、未知物のcAMP値は、内挿により決定される。試験化合物への暴露の応答と
しての細胞の細胞内cAMPレベルの変化は、DmGPCR活性の調整能力の指
標となる。Gタンパク質のGsサブタイプに結合する、レセプターの作動道薬と
して働くモジュレーターは、cAMPの産生を刺激し、3−10倍と測定可能な
ほどcAMPレベルを増加させる。Gタンパク質のGi/oサブタイプと結合す
る、レセプターの作動薬は、フォルスコリン刺激性のcAMP産生を阻害し、5
0−100%と測定可能なほどcAMPレベルを減少させる。逆作動薬として働
くモジュレーターは、恒常的に活性化されているか既知の作動薬により活性化さ
れているレセプターでのこれらの影響を逆転させる。
【0269】 B,エクオリンアッセイ もう一つのアッセイでは、細胞(例えば、CHO細胞)が一時的に DmGPCR発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築
物の両方で形質移入される。コファクターのコエレンテラジンの存在下、アポア
クオリンは、細胞内(細胞質)の自由カルシウム量に比例して、測定可能な発光
をする。一般的、[Cobboldら、“Aequorin measurem
ents of cytoplasmic free calcium,” I
n: McCormack J.G. and Cobbold P.H.,
編集、 CELLULAR CALCIUM: A PRACTICAL A
PPROACH, 0xfoid:IRL Press (1991); St
ablesら、Analytical Biochemistry 252:
115−26 (1997); および Haugland, HANDBOO
K OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH
CHEMICALS. Sixth edition. Eugene OR
: Molecular Probes (1996)]を参照せよ。
【0270】 あるアッセイを例にとると、DmGPCRは、市販の発現ベクターpzeoS
V2 (Invitrogen) にサブクローンされ、一時的に、発光タンパ
ク質アポアクオリン(Molecular Probes, Eugene,
OR)をコードする構築物と共に、形質移入試薬FuGENE(Boehrin
ger−Mannheim)および製品と共に供給された形質移入手順を使って
、VHO細胞内に共形質移入される。
【0271】 その細胞は、37℃で24時間、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、1
0U/mlペニシリンおよび10ng/mlストレプトマイシンを添加した血清
MEM中(Gibco/BRL, Gakhersburg, MD)で培養
された。24時間後、培地は、5pMコエレンテラジン(Molecular
Probes, Eugene, OR)を含む無血清MEMに変更した。培養
はさらに2時間、37℃で続けられた。次いで、細胞はプレートから、VERS
ENを用いて剥離、洗浄し、無血清MEM中に200,000cells/ml
となるように再乳濁した。
【0272】 無血清MEMで、候補DmGPCRモジュレーター化合物の希釈液をつくり、
不透明な96ウェルアッセイプレートのウェルに、50μl/well量を投入
した。プレートは、次いでMLXマイクロタイタープレート発光計(Dynex
Technologies, Inc., Chantilly, VA)に
乗せた。その装置は、50μlの細胞乳濁液を、各ウェルに一液づつ投入し、直
後に15秒間発光を読み取るようにプログラムされている。各光シグナルピーク
の曲線間の面積を使って、候補モジュレーターの容量反応曲線が作られる。Sl
ideWriteで、一サイトリガンドに対する式を用いて、分析されたデータ
、およびEC50の値が得られる。化合物により引き起こされる発光の変化は、
モジュレーター活性の指標と考えられる。Gタンパク質のGqサブタイプと結合
するレセプターで作動薬として働くモジュレーターは、最大100倍の発光の増
加を与える。逆作動薬として作用するモジュレーターは、恒常的に活性化してい
るあるいは既知の作動薬で活性化されているレセプターでこの影響を逆転させる
だろう。
【0273】 C.ルシフェラーゼレセプター遺伝子アッセイ 発光タンパク質ルシフェラーゼは、DmGPCR活性のモジュレーターをアッ
セイするためのもう一つの有用な道具を提供する。細胞(例えば、CHO細胞ま
たはCOS7細胞)は、一時的に DmGPCR発現生産物(例えば、pzeoSV2中のDmGPCR)、および
、ルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を転写因子結合サイト(例えばcAMP応
答因子(CRE)、AP−1またはNF−kappaBなど)から下流に持つリ
ポーター生産物の両方で、共形質移入される。Gタンパク質のGsサブタイプに
結合したレセプターに結合する作動薬は、cAMPの増加を引き起こし、CRE
転写因子を活性化してルシフェラーゼ遺伝子の発現をもたらす。Gタンパク質の
Gqサブタイプに結合するレセプターに結合する作動薬は、プロテインキナーゼ
Cを活性化するジアシルグリセリンの生産を引き起こし、又その結果ルシフェラ
ーゼ遺伝子の発現を引き起こす。ルシフェラーゼの発現レベルは、この情報伝達
減少の活性化の状態を反映する。一般的、[Georgeら、Journal
of Biomolecular Screening 2(4): 235−
240 (1997); および、Stratowaら、Current Op
inion in Biotechnology 6: 574−581 (1
995)]を参照せよ。ルシフェラーゼ活性は、例えば、プロメガ(Madis
on, WT)から入手可能な市販ルシフェラーゼアッセイ試薬を使って定量的
に測定することが出来る。
【0274】 アッセイの一例を示すと、CHO細胞を、形質移入の前日に、24ウェル培養
プレートに100,000細胞/ウェルの密度で入れ、37Cで、10%ウシ胎
児血清、2mMグルタミン、10U/mlペニシリン、および10μgストレプ
トマイシンを添加したMEM中で培養する。細胞は、DmGPCR発現生産物お
よびルシフェラーゼ遺伝子を含むリポーター生産物の両方で、共形質移入される
。リポータープラスミドCREルシフェラーゼ、AP−1ルシフェラーゼ、およ
びNF−kappaBルシフェラーゼは、スツラタジーン(LaJolla,
CA)から購入可能である。形質移入は、FuGENE−6形質移入試薬(Bo
ehringer−Maimheim) を用い、提供会社の支持にしたがって
実施した。レセプター生産物のみで形質移入された細胞を対照として用いた。形
質移入24時間後、細胞は37℃に前もって暖められたPBSで一度洗浄された
。次いで、無血清MEMのみ(対照)を細胞に添加、あるいは1個以上の候補モ
ジュレーターを添加したMEMを細胞に添加し、こららの細胞は、37℃で5時
間インキュベートした。その後、細胞は、氷冷されたPBSで一度洗浄し、一ウ
ェル当たり100μlの溶解緩衝液を添加しで溶解した。なお、溶解緩衝液は、
プレメガのルシフェラーゼアッセイキットのものである。室温で15分間インキ
ュベート後、溶解混合物15μlは、不透明白色96ウェルプレート中で50μ
gの基質溶液と混合され、直後に発光を、Wallace model 145
0 MicroBeta scintillation and lumine
scence counter (Wallace Instruments, Gaithersburg, MD)で測定した。
【0275】 候補モジュレーターの存否による発光の差異は、モジュレーター活性の指標で
ある。恒常的に活性化されている、あるいは作動薬により活性化されるレセプタ
ーは、リポーター遺伝子のみを形質移入した細胞に較べ、典型的には3−20倍
の発光量の増加を与える。逆作動薬として働くモジュレーターは、この影響の逆
を示す。
【0276】 D、FLIPRを用いた細胞内カルシウムの測定 細胞内のカルシウムレベルの変動は、Gタンパク質結合レセプター活性のもう
一つの指標であることはよく認められており、このようなアッセイを、DmGP
CR活性のモジュレーターのスクリーニングに使用してもよい。例えば、DmG
PCR発現ベクターが形質移入されたCHO細胞を、4x104細胞/ウェルの
密度で、プレート上のいろいろなウェルから出る発光シグナルを区別するように
特に設計されたパッカード社の黒壁96ウェルプレート上乗せる。細胞は、37
Cで60分間、1% ウシ胎児血清および4種のカルシウム指示染料(Fluo
−3 AM, Fluo−4 AM, Calcium Green−1 AM
, または、Oregon Green 488 BAPTA−1 AM)の内
の一つを,それぞれ4μMで添加した、36 mg/L ピルビン酸、1 g/
L グルコースを含む、デュルベコ社のPBS(D−PBS)中で、インキュベ
ータした。プレートは、1%ウシ胎児血清を含まない修正D−PBSで一度洗い
、細胞膜から残存染料を除くため37℃で10分間インキュベートした。さらに
、カルシウム応答の活性化の前に、1%ウシ胎児血清を除いた修正D−PBSで
数回洗った。
【0277】 カルシウム応答は、1個以上の候補レセプター作動薬化合物、カルシウムイオ
ノフォアA23187(10μM,正の対照)またはATP(4μM、正の対照
)、の添加で開始した。蛍光は、モレキュラーデバイス社のFLIPRで、アル
ゴンレーザーを使用して行った。例えば、Kuntzweilerら、Drug
Development Research, 44(l):14−20(1
998)]を参照せよ。なお、検出カメラのFストップは2.5で、露出時間は
0.4ミリ秒であった。細胞の持つ基礎蛍光は、候補作動薬、ATPまたはA2
3187,の添加前約20秒間測定し、この基礎蛍光量を応答シグナルから差し
引いた。カルシウムシグナルは、2秒ごとに記録をとりながら約200秒間測定
した。カルシウムイオノフォアA23187およびATPは、カルシウムシグナ
ルを、ベースラインレベルより200%上に増加させる。一般に、活性化された
GPCRは、カルシウムシグナルを、ベースラインシグナルより、約10−15
%増加させる。
【0278】 E、分裂促進性アッセイ 分裂促進性アッセイでは、候補モジュレーターの持つ、DmGPCR仲介細胞
分裂の誘起または阻害能力が、測定される。例えば、[Lajinessら、J
ournal of Phaimacology and Experimen
tal Therapeutics 267(3):1573−1581 (1
993)]を参照せよ。例えば、DmGPCRを安定に発現しているCHO細胞
を、96ウェルプレートに、5000細胞/ウェルの密度で播種し、37Cで1
0%ウシ胎児血清を含むMEM中で48時間増殖させる。48時間後、細胞は、
無決死MEMで2回洗浄される。洗浄後、80μlの新鮮なMEM、または既知
の分裂促進因子を含むMEMを、20μlの1個以上の候補モジュレーターまた
は無血清培地で希釈された試験化合物ををいろいろな濃度で含むMEMと共に、
添加する。対照として、各プレート上のいくつかのウェルには、無血清培地だけ
を入れ、またいくつかには、10%ウシ胎児血清を含む培地を入れる。形質移入
されていない細胞またはベクターだけで形質移入された細胞も、対照として使え
る。
【0279】 16−18時間培養後、[3H]−チミジン(2Ci/mmol)1μlをウ
ェルに投入し、37Cでさらに2時間インキュベートした。細胞は、トリプシン
処理され、細胞収穫器 (Tomtec)でフィルターマット上に捕集された。
そのフィルターは、次いでベータプレートカウンターで測定された。無血清試験
ウェルに取り込まれた[H]−チミジンは、血清で刺激された細胞での結果(
正の対照)と比較された。試験化合物を複数の濃度で測定することで、次の重回
帰式で表される容量反応曲線の作成と分析が可能となる。 A = B x [C/ (D+ C)] +G 。ここで、Aは血清刺激のパ
ーセント、Bは最大効果マイナスベースライン、CはEC50、Dは化合物の濃
度、又Gは最大効果である。B、C、およびGの変数は、シンプレックス最適化
法で決定される。レセプターに結合する作動薬は、[H]−チミジンの細胞内
への取り込みを増加させ、血清への応答の最大80%程度まで増加させると考え
られる。
【0280】 レセプターに結合する拮抗薬は、既知の作動薬で見られる刺激を、最大100
%阻害するだろう。
【0281】 F、[35S]GTPγS結合アッセイ
【0282】 Gタンパク質結合レセプターは、GTPと結合し加水分解して結合GDPを形
成する機能を持つ細胞内Gタンパク質を通して情報を伝達しているため、非加水
分解性GT候補モジュレーターの存在および不存在下での、GTPアナログ[ S]GTPγSの結合の測定は、モジュレーター活性のもう一つのアッセイと
なる。 例えば、Kowalら、Neurophannacology 37:179−
187 (1998)]を参照せよ。
【0283】 一つの例を示すと、DmGPCR発現ベクターを安定に形質移入された細胞を
、10cm組織培養プレート中で密集前まで増殖させ、Ca2+/Mg2+フリ
ーでリン酸で緩衝された氷冷生理食塩水5mlで1回洗浄後、同緩衝液5ml中
に入れる。細胞は、遠心分離(500xg、5分間)によりペレット化され、T
EF緩衝液(25mM−Tris、pH7.5、5mM−EDTA,5mM−E
GTA)に再乳濁され、液体窒素中で凍結される。解凍後、細胞は、ダウンスホ
モジナイザーを使用してホモゲナイズされ、1000xgで5分間の遠心分離で
核酸や非破壊細胞が除かれる。
【0284】 ホモジネートの上澄液から、20000xgで20分間の遠心分離で膜成分が
除かれる。膜ペレットは、TEEで一度洗浄後、結合緩衝液(20mM−HEP
ES,pH7.5、150mM−NaCl、10mM−MgCl2、1mM−E
DTA)に最乳濁される。再入濁された膜は、液体窒素で凍結され、−70℃で
使用される時まで保存される。
【0285】 上記のように調整され保存された細胞膜の一部は、解凍され、ホモジナイズさ
れ、20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 1 mM ED
TA, 120 mM NaC1, 10 pM GDP, および 0.2
mM アスコルビン酸(濃度10−50 ng/m1)を含む緩衝液に希釈され
る。最終的に90μlの量で、ホモジネートは、いろいろな濃度の候補モジュレ
ータ−化合物、または100μMのGTPと共に、30℃で30分間インキュベ
ートされ、次いで氷冷される。各サンプルに、グアノシン5’−O−(3[35 S]thio)三リン酸(NEN, 1200 Ci/mmol; [35S]
−GTPγS)を10μl、最終濃度が100−200pMとなるように添加す
る。サンプルは、30℃でさらに30分間インキュベートし、1 ml of
10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl溶液を
4Cで添加し、反応はろ過で停止される。
【0286】 サンプルは、ワットマンGF/Bフィルターでろ過され、ろ紙は20mlの氷
冷HEPES,PH7.4、10mM−MgCl2で洗浄される。フィルターは
、液体シンチレーションカウンターで測定される。[35S]GTPγSの非特
異的結合は、100μMGTPの存在下で測定され、合計から差し引かれる。細
胞中で結合している[35S]GTPγSの量を調整する化合物が選択され、非
形質移入対照細胞と比較される。作動薬によるレセプターの活性化は、[35
]GTPγS結合に最大5倍の増加をもたらす。この応答は、拮抗薬によりブロ
ックされる。
【0287】 G、MAPキナーゼ活性アッセイ DmGPCRを発現している細胞中のMAPキナーゼ活性の測定は、GPCR
のモジュレーターを特定するためのもう一つのアッセイを提供する。例えば、L
ajinessら、Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics 267(3):15
73−1581 (1993); および、Boultonら、Cell 65
:663−675 (1991)]を参照せよ。
【0288】 一つの例としては、DmGPCRを安定に形質移入されたCHO細胞を、アッ
セイの48時間前に、6ウェルプレートに70,000細胞/ウェルの密度で播
種する。この48時間の間、細胞は37℃で、10%ウシ胎児血清、2mMグル
タミン、10U/mlペニシリンおよび10ng/mlストレプトマイシンを含
むMEM培地で培養される。 細胞は、刺激剤の添加前の1−2時間は、血清−欠乏状態とする。
【0289】 アッセイには、細胞は、培地のみで、あるいは、培地に候補作動薬または20
0nMのフォルボルエステルー酢酸メリストイル(すなわち、PMA,正対照)
を添加したもので処理され、次いで、細胞は37℃でいろいろな時間インキュベ
ートされる。反応を停止するために、プレートを氷上に乗せ、培地を吸引除去し
た後に、細胞は、氷冷されたMEDTAを含むPBS1mlで洗浄される。その
後、細胞溶解緩衝液(12.5 mM MOPS, pH 7.3, 12.5
mM グリセロリン酸, 7.5 mM MgCl2, 0.5 mM EG
TA, 0.5 mM バナジン酸ナトリウム, I mM ベンズアミジン,
1 mM ジチオスレイトール, 10 μg/ml ロイペプチン, 10
μg/ml アプロチニン, 2 @g/ml ペプスタチンA,および 1
μM オカダ酸)200μlが、細胞に添加される。細胞は、プレートから剥
ぎ取り、23 3/4針を通過させることでホモジナイズした。サイトソル部分
は、20000xgで15分間遠心分離することにより得られた。
【0290】 サイトソルの一部(1−5μgのタンパク質を含む5−10μl)は、1mM
サブストレートペプチド(APRTPGGRR (配列番号: 163)、Up
state Biotechnology, Inc. N.Y.)および[γ
−32P]ATP(NEN, 3000 Ci/mmol)50μlと混合され
、希釈して最終的に比活性約2000cpm/pmolを持つ溶液合計25μl
とした。サンプルは30℃で5分間インキュベートし、反応は、20μlを2c
の面積のワットマンP81ホスホセルロースろ紙片にスポットすることで停
止させた。ろ紙片は、1%HPOで4回洗浄後、ロ紙片は、液体シンチレー
ションスペクトルにかけて結合ラベルを定量した。同一のサイトソル抽出物を、
MAPKサブストレートペプチド抜きでインキュベートし、これらのサンプルか
らの結合ラベルが、サブストレートペプチド含有の相当するサンプルから差し引
かれた。各ウェルからのサイトソル抽出物は、別ポイントとして使用された。タ
ンパク質濃度は、染料結合タンパク質アッセイ(Bi0−Rad Labora
tories)で求められた。レセプターの作動薬活性化は、MAPK酵素活性
に最大5倍の増加をもたらすと考えられる。この増加は、拮抗薬によりブロック
される。
【0291】 H、[H]アラキドン酸放出 GPCRの活性化が細胞中のアラキドン酸の放出を活性化することはすでに観
察されており、こらはまた、GPCR活性のモジュレーターを特定するためのも
う一つの有用なアッセイを提供する。例えば、Kantermanら、Mole
cular Pharmacology 39:364−369 (1991)
]を参照せよ。例えば、DmGPCR発現ベクターが安定に形質CHO細胞移入
されたCHO細胞は、24ウェルプレートに、15,000細胞/ウェルの密度
で播種され、10% ウシ胎児血清、2 mM グルタミン、 10 U/ml
ペニシリン、および 10 ng/mlストレプトマイシンを添加した ME
M培地で、48時間37℃で増殖させられる。各ウェルの細胞は、10 mM
HEPES, pH 7.5、および0.5% 脂肪酸非含有ウシ血清アルブミ
ンを含むMEM倍地0.5microCi/ml中で、[H]アラキドン酸(
Amersham Corp., 210 Ci/mmol) で、37℃で2
時間ラベルされる。細胞は、2回、同緩衝液1mlで洗浄される。
【0292】 候補モジュレーター化合物は、同緩衝液1ml中に、単独でまたは10mMA
TPと一緒に入れられ、細胞は37℃で30分間インキュベートされる。緩衝液
単独および偽形質転移細胞が、対照として用いられた。各ウェルからのサンプル
(0.5ml)は、液体シンチレーションスペクトルで計測した。レセプターを
活性化する作動薬は、STP刺激性の[H]アラキドン酸の放出を活性化する
はずである。この活性化は、拮抗薬でブロックされる。
【0293】 I、細胞外酸性化速度 さらにもう一つのアッセイでは、DmGPCR活性の候補モジュレーターの影
響は、試験化合物により誘起される細胞外のpH変化を測定することでアッセイ
できる。例えば、Dunlopら、Journal of Pharmacol
ogical、および Toxicological Methods 40(
l):47−55 (1998)]を参照せよ。一つの実施形態において、Dm
GPCR発現ベクターが形質移入されたCHO細胞は、12mmカプセルカップ
(Molecular Devices Corp.) に、10% ウシ胎児
血清、2 mM L−グルタミン、10 U/ml ペニシリン、および10
@g/ml ストレプトマイシンを含むMEM培地中で4x105細胞/カップ
の密度で播種される。細胞は、この培地中で5%CO下、37℃で24時間イ
ンキュベートされる。
【0294】 細胞外酸性化速度は、サイトセンサーミクロフィジオメーター(Molecu
lar Devices Corp.)を使用して測定された。カプセルカップ
は、ミクロフィジオメーターのセンサー室に入れられ、その室は、流動緩衝液(
4 mM L−グルタミン、10 units/ml ペニシリン、10 ug
/ml ストレプトマイシン、26 mM NaClを含む炭酸塩MEM)を使
って、100ml/分の流速で灌流した。候補作動薬または他の試薬は、流動緩
衝液で希釈され、第二の流体経路を灌流させられた。60秒のポンプサイクルの
うち、38秒間はポンプがオン、22秒はオフと設定した。センサー室中の流動
緩衝液のpHは、このサイクルの43−59秒の間に測定された。なお、ポンプ
は60秒後に新しい次のサイクルを開始する。流動緩衝液の記録時間中の酸性化
の速度は、サイトソフトプログラムにより計算された。酸性化速度の変化は、ベ
ースライン値(モジュレーター候補添加の直前の4回の速度測定の平均値)を、
モジュレーター候補の添加後得られた最大速度から差し引くことで求めた。その
装置の検出感度は、61mV/pH単位である。レセプターの作動薬として作用
するモジュレーターは、細胞外酸性化速度を、作動薬不存在下の速度と較べ、増
加させることとなる。この応答は、レセプターの拮抗剤として作用するモジュレ
ーターによりブロックされる。
【0295】 実施例9、DmGPCRとペプチドリガンドの整合性 細胞培養と形質移入 野生種のチャイニーズハムスター卵巣(CHO−K1)細胞(入手元、the
American Type Culture Collection, R
ockville, MD)は、37℃で、空気中5%のCOを含む湿った雰
囲気下、10% 熱不活性化FBS、10 μg/ml ゲンタマイシン、およ
びDMEM完全培地を与えるための0.1 mM 非必須アミノ酸を含む、DM
EM培地中で、培養した。細胞は、LipofectAMINE PLUSを用
い、基本的には製造業者の指示に従って、pCR3.1ベクター中のオーファン
GPCR DNAで形質移入された。簡潔に述べると、CHO細胞は、10cm
滅菌組織培養プレート(Coming Glass Works, Comin
g, NY)に乗せた。それらは、形質移転の日には、50−60%の密集度で
あった。プラスチックチューブ中で、上記PLUS(20 microI/pl
ate)を、前もって0.75mlのOptiMEMに希釈されたcDNA(5
nG/プレート)に添加、混合し、室温で15分間インキュベートされた。別途
、LipofectAMINE(30 μl/プレート)は、0.75 ml
のOptiMEMと混合され、前もって複合体形成されたDNA/PLUS混合
物中に添加され、室温で15分間インキュベートされた。細胞の培地は、無血清
形質移転培地(plain DMEM, 5 ml/plate)で置換され、
DNA−PLUS−LipofectAMINE 複合体が添加(プレート当た
り、1.5 ml )後、3時間、37℃/5%COでインキュベートされた
。続いて、培地に、20%FBSを含む完全DMEM培地(6.5 ml ml
/プレート)を追加し、さらに37℃/5%COで、24から48時印急べ戸
を継続した。グリーンフルオレセントプロテイン(GFP,4μg・プレート)
を、GPCRも使用したのと同じ条件での形質移入収率を見積もるため、CHO
細胞中での一時的なGFP発現に使用した。
【0296】 膜標本 形質移入細胞は、氷冷したダルベコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一回洗
浄(10cmのプレート当たり5ml)し、剥ぎ取って同緩衝液5ml中に乳濁
した。多数のプレートからのセル乳濁液は混合して、4℃で500xgで10分
間遠心分離した。細胞のペレットは、氷冷TEE (25 mM TRIS,
5 mM EGTA, 5 mM EDTA)に再乳濁させた。適当な量は、液
体窒素中で急速凍結され、−70℃で保存された。解凍後、細胞はホモジナイズ
され、4℃、500xgで5分間遠心分離で、核酸と非破壊細胞をペレット化し
た。上澄み液は、4℃で、47,000xgで30分間遠心分離された。膜ペレ
ットは、一回TEEで洗浄後、20 mM HEPES、 pH7.4、100
mM NaC1, 10 mM MgCl2, I mM EDTA (アッ
セイ緩衝液)に再乳濁され、適量は取り出され、液体窒素中で凍結された。膜画
分は、−70Cで保存された。タンパク質濃度は、ピアス社(Rockford
, Illinois)のBCAタンパク質アッセイ試薬、および標準としてB
SAを用いて、測定された。
【0297】 [35S]GTPγS結合アッセイ 適量の細胞膜は解凍、ホモジナイズされ、20 mM HEPES, pH
7.4, 100 mM NaC1, 10 mM MgCl2, 1 mM
EDTA を含む緩衝液(アッセイ緩衝液)で希釈された。初めに、反抗混合物
が、96ウェルポロプロピレンプレートに作成された。各ウェル中で、ペプチド
水溶液(20 micro1, 10 X)または水対照(20 micro1
)、アッセイ緩衝液中のGDP(0.11 m1, 最終10 μM)、および
アッセイ緩衝液に乳濁された膜(50 micor1, 10 μg 膜タンパ
ク質)を混合し、氷上に置いた。リガンド−GDP−膜混合物は、室温で20分
間振とうしながらインキュベートされ、次いで氷上で冷却された。各サンプルに
、20 micro1 グアノシン−5’−O−(3−[35S]thio)−
三リン酸 ([35S]GTPγS) (600−1,200 Ci/mmo
l、New England Nuclear, Boston, MA) が
添加された。インキュベーション混合物と共にプレートは、室温で45分間イン
キュベートされた。反応混合物の適量(0.175ml)は、次いで、洗浄緩衝
液で前処理(100μl/プレート)された96ウェルFBマルチスクリーンフ
ィルタープレート(Millipore)に移され、バキュームマニホールド(
Millipore)を使用して真空ろ過された。次いで、膜は3回、0.25
mlの氷冷洗浄緩衝液/ウェル(10 mM HEPES, 10 mM Mg
Cl2, pH 7.4) で、洗浄された。最後の洗浄の後、スーパーミック
スオプチフェーズシンチレーション流体(25 micro1/wel1,
Wallac)を添加し、プレートは封をされて、とリラックス1450ミクロ
ベータカウンター(Wallac) で、1分/ウェルの速度で測定された。正
の対照として、ドーパミン2型レセプターを安定して発現しているCHO細胞の
膜が、1mMのドーパミン、0.025%アスコルビン酸、またはベヒクル(0
.0025%最終アスコルビン酸)で処理されたた。非特異的結合は、100p
Mの冷GTPγSの存在下での測定で求め、トータルから差し引いた。各処理は
、三回行われた。
【0298】 データ分析 リガンド誘起性の[35S]GTPγS結合の刺激活性は、リガンドの添加が
ない場合の基礎活性の何倍の増加があるかで表現されている。各処理は、三回、
または、場合によっては二回行われ、結合(cpm)は、平均値+/−標準偏差
で表されている。レセプター/リガンドシステムの容量応答曲線は、非線形最小
自乗SASモデル、y=BmaxX/(Kd+X)、を使って分析された。他の
容量応答曲線は、プリズムおよび次の式を使って分析された。(GraphPa
d Software, Inc. San Dieg0, CA)。y=Bo
ttom+(Top−Bottom)/(I+10LOGEC50−x)
【0299】 結果 当初、我々は、GPTγSアッセイを、一つの機能アッセイとして選択した。
その理由は、作動薬駆動のGPTγSアッセイは 多くの下流の情報伝達現象の活性化経路とは無関係に、GPCR活性化カスケイ
ドの初期の現象を反映するからである。これは、機能がや情報伝達経路が未知の
オーファン(孤児)GPCRの活性化を評価するのに特に有用と考えられる。G
PTγSアッセイは、ショウジョウバエGPCRをコードするDNAで一時的に
形質移入されたCHO細胞から調整された膜を使用し、96ウェルマルチスクリ
ーンG/FBフィルタープレートとマルチスクリーンバキュームマニホールド(
Millopore)をろ過に用いて、実施される。GPTγSアッセイは、G
タンパク質のGqクラスに結合するGPCRを認識する力が弱いことはすでに知
られているため、GLIPR読み出しを基礎とするCa+2可動化アッセイも、
ショウジョウバエGPCRをコードするDNAで一時的に形質移入されたCHO
細胞中のGq結合オーファンGPCRの評価に使用した。
【0300】 GPTγSアッセイを用い、DmGPCR(PnuFlyPep34651)
が、二つのペプチド、DPKQDFMRF−NH2 <配列番号:26> an
d PDNFMRF−NH2 <配列番号:27>により最も大きく活性化され
ることが明らかとなった。(ECHOの領域、370から570nM)。Nam
buらにより報告されているように[Nambu et a1. (Neuro
n 1,55− 61, 1988)、これらの2個のペプチドは、同じ前駆
体遺伝子上に、他の9個のFaRPと共に、コードされている。効率は低いもの
の(EC50が、5 からlO μMの領域)GPTγS結合を刺激することの
できる他のFARPや他の神経ペプチドとしては、次のペプチドが含まれる。T
DVDHVFLRF−NH2 <配列番号:25>, TPAEDFMRF−N
H2 <配列番号:28>, SLKQDFMHF−NH2 <配列番号:29
>, SVKQDEMHF−NH2 <SEQ ID NO:30, AAM
DRY−NH2<配列番号:31>, and SVQDNFMHF−NH2<
配列番号:32>さらに、FLIPRアッセイは、コロラドポテトハムシペプチ
ド、ARGPQLRLRF− NH2 <配列番号:33>が、EC50が10
0−200nMを持つDmGPCRレセプターに相当することを示した。
【0301】 GPTγS応答によって示されるように、DmGPCR(PnuFlyPep
67393)は、ショウジョウバエメラノガスターアラトスタチン、EC50
が低いナノモラー領域にあるドロスタチンー3(SRPYSFGL−NH2 <
配列番号:161)、およびDiplotera punctata (ゴキブ
リ)のアラトスタチン類、すなわちGDGRLYAFGL−NH2<配列番号:
34>, DKLYSFGL−NH2 <配列番号:35>, APSGAQR
LYGFGL−NH2 <配列番号:36>, and GGSLYSFGL−
NH2<配列番号:37> (EC50、約20−280 nMの領域)。上記
ペプチドは、FLIPRで10micorMでの試験で、非常に強いカルシウム
シグナルを引き起こしている。DmGPCRは、最近レンツらによるクローン化
され、第二の推定上のアラトスタチンレセプター(DARII)と分類されてい
る。しかし、レセプター活性化についての薬理的データは、今までに報告されて
いない。我々の知る限り、これが、各種のアラトスタチンが本レセプターを活性
化する最初の実験的な証拠である。
【0302】 DmGPCR6a(M811490)は、PYYレセプターとして、リにより
報告されている。 Li et a1. [J Biol Chem 26
7,9−12, 1992)。DTPγSアッセイを用いた試験では、テーブル
6に記載のペプチドが、5μMの試験において、DmGPCRをコードするDN
Aを形質移入されたCHO細胞由来の膜への、DTPγSの結合を刺激(ベース
の1.7から4倍の増加)している。本レセプターを活性化する一連の昆虫やC
. elegans由来のペプチドに加えて、ヒトNPFF(FLFQPQRF
−NH2 <配列番号:59 )も、DmGPCRに対するリガンドであること
が明らかとなった(5micorMのNPFFで、DTPγS結合の4倍の増加
)。
【0303】 DmGPCR6aL、とDmGPCR6bLは、DmGPCR6a(M811
490)の二つのスプライス変異体である。後者は、PYYレセプターであると
、リらにより報告されている。[Liら、J. Biol. Chem. 26
7, 9−12, 1992)。我々は、DmGPCR6aLおよびDmGPC
R6bLを、いずれも、C末端にArg−Phe−NH2(RFa)配列を持つ
ペプチドのみを認識するため、RF−アミドレセプターと命名する。これらのG
PCRが「見ない」ペプチドは、C末端にRFa配列とは異なった配列を持つ。
カルシウム可動化アッセイ(FLIPR)において、DmGPCR6aLおよび
DmGPCR6bLは、10micorMの試験で、一連のFaRPに対してた
いへん強いCa+2応答を示した。以下のテーブル6に記載の配列は、様々な種
に属するすでに特定された活性FaRPのすべてを示している。これらの種とし
ては、ショウジョウバエ、C. elegans, A suum, 軟体動物
, P. redivivus, 吸血網、ロブスター、ヒト、およびヒルなど
を含んでいる。C末端の「RFアミド法則」から外れる唯一の例外は、ペプチド
pGluDRDYRPLQF−NI@ <配列番号:120>で、C末端は、
Gln−Phe−NH2(QFa)配列で終わっている。面白いことに、DmG
PCR6aLとDmGPCR6bLは、NPFF(FLFQPQRF−NH2
<配列番号:152>)、RFアミド配列をC末端に持つ哺乳類ペプチドを認識
する。(注。上記結果において、p−GluまたはpQは、ピログルタミン酸を
指す。)
【0304】 DmGPCR9は、カルシウム可動化アッセイにおけるたいへん強いシグナル
の点で、FDDY(S03H)GHLRF−NH2 <配列番号:157>と似
ている。(EC50は、低ナノモラー領域)このペプチドに対して、DmGPC
R9をコードするDNAを形質移入されたCHO細胞由来の膜で、DTPγS応
答がないという事実は、DmGPCR9が、Gq情報伝達経路と共役している可
能性が高いことを示唆している。FDDY(S03H)GHLRjF−NH2
<配列番号:157>は、天然のドロスルファキニン−1(DSK−1)のMe
t→Leu7アナログ、FDDY(S03H)GHMRF−NH2 <配列番号
:159>を代表する。このため、我々はDmGPCR9レセプターを、スルフ
ァキニンレセプターであると指定する。FDDY(S03H)GHLRF−NH
2<配列番号:157>の非硫酸化体であるFDDYGHLRf−NHz <配
列番号:158> が、10μMでの試験で、非常に弱いカルシウムシグナルを
示し、また、他の117個の試験されたFaRPおよび関連ペプチドのいずれも
が、DmGPCRレセプターのFLIPRまたはDmGPCR9アッセイで活性
を示さなかったことから、このマッチは、非常に特異的である。
【0305】 リガンドとそのレセプターの対照表を、以下のテーブル6に示す。
【0306】
【表16】
【0307】
【表17】
【0308】
【表18】
【0309】
【表19】
【0310】 実施例10、競合アッセイ モノ−ヨウ素化ペプチドの調整 ペプチドは、典型的なクロラミンT手法で、ヨウ素化される。2mlのガラス
バイアルに、10μlの1mMペプチド水溶液、10μlの0.1M(pH7.
99)リン酸ナトリウム緩衝液、1.0mCi[125I]ヨウ化ナトリウムお
よび5μlの2mg/mlクロラミンT溶液(リン酸緩衝液中)が添加される。
混合物は、60秒間振とうし、反応は25μlの5mg/mlメタ重亜硫酸ナト
リウムのリン酸緩衝液溶液の添加で停止する。混合物は、HPLCにかけ、バイ
ダックC18カラム(0.45x15cm)を使用し、グラジエント分離させる
。使用のグラジエントは、タイム0で、A70%とB30%、タイム25分でA
20%,B80%である。(A:0.1M酢酸アンモニウム水溶液、B:0.1
M酢酸アンモニウム水溶液、CHCN60%v/v)。流速は、1.0ml/
分。サンプルは、0.25mlの捕集緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
中、0.5%ウシ血清アルブミン、0.1%トリトンX100,および0.05
%ツイーン20を含む)に、30秒間隔で、t=8からt=20分まで捕集する
。モノヨウ素化ペプチドは、典型的には、t=11分で溶離する。収率は、0.
75ml中約100micrCiである。
【0311】 結合アッセイ 使用の96ウェルプレートは、ミリポリマルチスクリーンろ過プレート(FB
不透明 1.0 μM ガラス繊維B型,カタログ番号MAFBNOB50)
である。フィルターアッセイにおいて、ミリポリペプチドアマルチスクリーン溶
媒耐性マニホールド(カタログ番号MAVM0960R )を、プレートと共に
最後に用いた。各重複アッセイは、1ウェルで、容量は100μl、5μgのタ
ンパク質を含んでいる(調整法は、上に記載)。各テスト群は、2個の重複アッ
セイを持つ。各テスト化合物に対し、1グル−プは[125I]ペプチドのみで
(総結合を測定)、もう一つの群は、1μM(または、指定された)濃度のテス
ト化合物および[125I]ペプチド(非特異的結合を測定)で試験を行う。各
重複アッセイに試薬を入れる順番は、アッセイ緩衝液(20 mM HEP
ES, 10 mM MgCl2, 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.4
)、テスト化合物(アッセイ緩衝液中で作成)、および膜乳濁液(アッセイ緩衝
液中)である。膜乳濁液の添加は、結合反応を開始させる。反応は室温(22℃
)で30分行う。30分のインキュベート後、各プレートは、ろ過マニホールド
に取り付け、真空をかけて、ろ紙をとおして液体を引き(捨てる)、タンパク質
を各ウェルのろ紙上に捕集する。洗浄には、真空を開放し、200μlのアッセ
イ緩衝液を各ウェルに添加し、次いで真空を再印加する。この洗浄は、2回異常
繰り返される。(各重複に対し合計3回の洗浄)。洗浄後、各プレートの裏側を
覆うプラスチックを除去し、プレートは底のシールされたミクロベータシンチレ
ーションカウンターのカセット(カタログ番号1450− 105)にセットさ
れる。各ウェルに25μlのシンチラントを添加し、プレートはロータリーシェ
ーカー上で80rpmで1時間振とうし、その後位置や放置される。次の日に、
プレートは、ミクロベータシンチレーションカウンターで計測される。総結合の
平均値から、非特異的結合の平均値を差し引いて、標準(ペプチドアミド)およ
び未知物質の特異的結合値が計算される。
【0312】 上述の本発明の好ましい実施形態のいくつかは、いかに説明されるが、次に続
く実施形態を含むが、それに限定はされない。当業者が理解するように、本発明
の範囲から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態の改変や修正すること
は、多数可能である。そのような改変のすべてが、本発明の範囲内に入るものと
する。
【0313】 ここに引用した各報文の全開示は、出典明示して本明細書の一部とみなされる
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 48/00 A61P 3/10 4C084 A61P 3/04 7/02 4C085 3/10 9/00 4C086 7/02 9/02 4H045 9/00 9/10 101 9/02 9/12 9/10 101 13/12 9/12 19/02 13/12 25/00 19/02 25/04 25/00 25/10 25/04 25/14 25/10 25/16 25/14 25/18 25/16 25/24 25/18 29/00 25/24 101 29/00 31/12 101 31/18 31/12 35/00 31/18 37/06 35/00 C07K 14/705 37/06 16/28 C07K 14/705 C12N 1/19 16/28 1/21 C12N 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z C12Q 1/68 C12P 21/08 G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 5/00 B // C12P 21/08 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM ,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH, GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS ,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN, MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM ,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN, YU,ZA,ZW (72)発明者 テレサ・エイ・クビアック アメリカ合衆国49083ミシガン州リッチラ ンド、イースト・ビー・アベニュー5844番 (72)発明者 マーサ・ジェイ・ラーセン アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、ネイプルズ・コート56番 Fターム(参考) 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA41 BA63 CA01 DA02 DA06 DA12 EA02 EA04 FA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QS34 QS36 QX01 4B064 AG20 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA80X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 CA49 CA53 DC50 NA14 ZA01 ZA08 ZA15 ZA18 ZA36 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA81 ZA96 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZB33 ZC41 ZC42 ZC55 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 CC31 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA08 ZA15 ZA18 ZA36 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA81 ZA96 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZB33 ZC41 ZC42 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA51 DA50 EA20 EA50

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 単離核酸分子であって、 a)配列番号:1,3,5,9,11,13,15,17,19,21,もしく
    は23、またはそのフラグメント; b)配列番号:1,3,5,9,11,13,15,17,19,21、もしく
    は23、またはそのフラグメントに相同な配列; c)配列番号:2,4,6,10,12,14,16,18,20,22もしく
    は24、またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列;および
    d)配列番号:2,4,6,10,12,14,16,18,20,22もしく
    は24、またはそのフラグメントに相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
    ードする配列 よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、DmGPCRの少なくとも
    一部分をコードする前記単離核酸分子。
  2. 【請求項2】 前記核酸分子がDNAである請求項1記載の核酸分子。
  3. 【請求項3】 前記核酸分子がRNAである請求項1記載の核酸分子。
  4. 【請求項4】 前記ヌクレオチド配列が配列番号:1,3,5,9,11,
    13,15,17,19,21,または23を含む請求項2記載の核酸分子。
  5. 【請求項5】 配列番号:1,3,5,9,11,13,15,17,19
    ,21または23の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記核
    酸分子の補体がDmGPCRの少なくとも一部をコードする単離核酸分子。
  6. 【請求項6】 前記分子が、配列番号:1,3,5,9,11,13,15
    ,17,19,21または23に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    ある請求項5記載の核酸分子。
  7. 【請求項7】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号:1,3,5,9,11
    ,13,15,17,19,21または23の調節領域に向けられる請求項6記
    載の核酸分子。
  8. 【請求項8】 請求項1または5の核酸分子を含む発現ベクター。
  9. 【請求項9】 前記核酸分子が、配列番号:1,3,5,9,11,13,
    15,17,19,21または23を含む請求項8記載の発現ベクター。
  10. 【請求項10】 前記ベクターがプラスミドである請求項8記載のベクター
  11. 【請求項11】 前記ベクターがウィルス粒子である請求項8記載のベクタ
    ー。
  12. 【請求項12】 前記ベクターが、アデノウィルス、バキュロウィルス、パ
    ルボウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、アデノ随伴ウィルス、セ
    ムリキ森林ウィルス、ワクシニアウィルス、およびレトロウィルスよりなる群か
    ら選択される請求項11記載のベクター。
  13. 【請求項13】 前記核酸分子が、サルウィルス40、マウス乳腺腫瘍ウィ
    ルス、ヒト免疫不全ウィルスの末端反復配列、マロニーウィルス、サイトメガロ
    ウィルス最初期プロモーター、エプスタインバーウィルス、ラウス肉腫ウィルス
    、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およ
    びヒトメタロチオネンよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結
    されている請求項8記載のベクター。
  14. 【請求項14】 請求項8記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  15. 【請求項15】 前記細胞がバクテリア細胞である請求項14記載の形質転
    換宿主細胞。
  16. 【請求項16】 前記バクテリア細胞がE.coliである請求項15記載
    の形質転換宿主細胞。
  17. 【請求項17】 前記細胞が酵母である請求項14記載の形質転換宿主細胞
  18. 【請求項18】 前記酵母がS.cerevisiaeである請求項17記
    載の形質転換宿主細胞。
  19. 【請求項19】 前記細胞が昆虫細胞である請求項14記載の形質転換宿主
    細胞。
  20. 【請求項20】 前記昆虫がS.frugiperdaである請求項19記
    載の形質転換宿主細胞。
  21. 【請求項21】 前記細胞が哺乳類細胞である請求項14記載の形質転換宿
    主細胞。
  22. 【請求項22】 哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeL
    a細胞、アフリカミドリザル肝臓細胞、ヒト293細胞、およびマウス3T3フ
    ィブロブラストよりなる群から選択される請求項21記載の形質転換宿主細胞。
  23. 【請求項23】 配列番号:2,4,6,10,12,14,16,18,
    20,22もしくは24、またはそのホモログもしくはフラグメントを含むポリ
    ペプチドの製造方法であって、 a)請求項8の組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入し; b)前記宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現条件下で培養し;および c)前記ポリペプチドを回収するステップを含むポリペプチドの製造方法。
  24. 【請求項24】 前記宿主細胞を溶菌し、および前記ポリペプチドを前記宿
    主細胞の溶菌液から回収する請求項23記載の方法。
  25. 【請求項25】 前記宿主細胞を溶菌することなく培養培地を精製すること
    によって、前記ポリペプチドを回収する請求項23記載の方法。
  26. 【請求項26】 請求項1または5記載の核酸分子および許容される担体ま
    たは希釈剤を含む組成物。
  27. 【請求項27】 請求項8記載の組換え発現ベクターおよび許容される担体
    または希釈剤を含む組成物。
  28. 【請求項28】 請求項1記載の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド
  29. 【請求項29】 前記ポリペプチドが配列番号:2,4,6,10,12,
    14,16,18,20,22または24を含む請求項28記載のポリペプチド
  30. 【請求項30】 前記ポリペプチドが配列番号:2,4,6,10,12,
    14,16,18,20,22または24に相同なアミノ酸配列を含む請求項2
    8記載のポリペプチド。
  31. 【請求項31】 前記配列番号:2,4,6,10,12,14,16,1
    8,20,22または24に相同な前記配列が、配列番号:2,4,6,10,
    12,14,16,18,20,22または24と比べて、少なくとも1箇所の
    保存的アミノ酸置換を含む請求項30記載のポリペプチド。
  32. 【請求項32】 前記ポリペプチドが配列番号:2,4,6,10,12,
    14,16,18,20,22または24のフラグメントを含む請求項28記載
    のポリペプチド。
  33. 【請求項33】 請求項28のポリペプチドと許容される担体または希釈剤
    を含む請求項28記載の組成物。
  34. 【請求項34】 請求項28記載のポリペプチドのエピトープに結合する単
    離抗体。
  35. 【請求項35】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項34記載の抗
    体。
  36. 【請求項36】 請求項34記載の抗体と、許容される担体または希釈剤と
    を含む組成物。
  37. 【請求項37】 請求項28のポリペプチドに対する免疫応答を哺乳類に誘
    起させる方法であって、前記哺乳類に前記免疫応答を誘起させるのに十分な前記
    ポリペプチドの量を投与することを特徴とする該方法。
  38. 【請求項38】 DmGPCRに結合する化合物を特定する方法であって、 a)DmGPCRを化合物と接触させ;および b)前記化合物がDmGPCRに結合するか決定するステップを含む該方法。
  39. 【請求項39】 DmGPCRへの前記化合物の結合が、タンパク質結合ア
    ッセイで決定される請求項38記載の方法。
  40. 【請求項40】 前記タンパク質結合アッセイが、ゲル−シフトアッセイ、
    ウェスターンブロット、放射ラベル競争アッセイ、ファージ−ベース発現クロー
    ニング、クロマトグラフィーによる共分画、共沈殿、架橋、相互トラップ/ツー
    ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、およびELISAよりなる群から選
    択される請求項39記載の方法。
  41. 【請求項41】 DmGPCRをコードする核酸分子に結合する化合物を特
    定する方法であって、 a)DmGPCRをコードする前記核酸分子を化合物と接触させ;および b)前記化合物が前記核酸分子に結合するかどうか決定するステップを含む該
    方法。
  42. 【請求項42】 結合をゲル−シフトアッセイで決定する請求項41記載の
    方法。
  43. 【請求項43】 DmGPCRの活性を調整する化合物を特定する方法であ
    って、 a)DmGPCRを化合物と接触させ;および b)DmGPCR活性が調整されたかどうか決定するステップを含む該方法。
  44. 【請求項44】 前記活性が、神経ペプチド結合である請求項43記載の方
    法。
  45. 【請求項45】 前記活性が、神経ペプチド伝達である請求項43記載の方
    法。
  46. 【請求項46】 DmGPCRとDmGPCR結合パートナーとの間の結合
    のモジュレーターを特定する方法であって、 a)DmGPCR結合パートナーとDmGPCRを含む組成物とを、推定モジ
    ュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ; b)結合パートナーとDmGPCR間の結合を検出し;および c)推定されるモジュレーター化合物の存在下での結合が、前記推定モジュレ
    ーター化合物の不存在下での結合と比較して、増加または減少しているかを決定
    するステップを含む該方法。
  47. 【請求項47】 DmGPCRがDMGPCR1であって、結合パートナー
    が配列番号:25ないし33よりなる群から選択されるペプチドである請求項4
    6記載の方法。
  48. 【請求項48】 結合パートナーが配列番号:26で表されるペプチドであ
    る請求項47記載の方法。
  49. 【請求項49】 結合パートナーが配列番号:27で表されるペプチドであ
    る請求項47記載の方法。
  50. 【請求項50】 DmGPCRがDMGPCR4であって、結合パートナー
    が配列番号:34ないし37よりなる群から選択されるペプチドである請求項4
    6記載の方法。
  51. 【請求項51】 結合パートナーが配列番号:34で表されるペプチドであ
    る請求項50記載の方法。
  52. 【請求項52】 結合パートナーが配列番号:35で表されるペプチドであ
    る請求項50記載の方法。
  53. 【請求項53】 結合パートナーが配列番号:36で表されるペプチドであ
    る請求項50記載の方法。
  54. 【請求項54】 結合パートナーが配列番号:37で表されるペプチドであ
    る請求項50記載の方法。
  55. 【請求項55】 DmGPCRがDMGPCR6aであって、結合パートナ
    ーが配列番号:38ないし59よりなる群から選択されるペプチドである請求項
    46記載の方法。
  56. 【請求項56】 DmGPCRがDmGPCR6aLであって、結合パート
    ナーが配列番号:60ないし157よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項46記載の方法。
  57. 【請求項57】 DmGPCRがDMGPCR6bLであり、結合パートナ
    ーが、配列番号:60ないし157よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項46記載の方法。
  58. 【請求項58】 DmGPCRがDMGPCR6bLであって、結合パート
    ナーが配列番号:60ないし156よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項46記載の方法。
  59. 【請求項59】 DmGPCRがDMGPCR9であって、結合パートナー
    が配列番号:157で表されるペプチドである請求項46記載の方法。
  60. 【請求項60】 請求項38、41、43または46のいずれかに記載の方
    法で特定された化合物。
  61. 【請求項61】 DmGPCRの動物ホモログを特定する方法であって、 a)配列番号:1,3,5,9,11,13,15,17,19,21もしく
    は23またはその一部で動物の核酸データベースをスクリーニングし;および b)前記ライブラリーまたはデータベースの一部が前記配列番号:1,3,5
    ,7,9,11,13,15,17,19,21もしくは23、またはその一部
    と相同かどうか決定するステップを含む該方法。
  62. 【請求項62】 DmGPCRの動物ホモログを特定する方法であって、 a)配列番号:1,3,5,9,30,11,13,15,17,19,21
    または23よりなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその一部を有する
    核酸分子で動物の核酸ライブラリーをスクリーニングし;および b)前記ライブラリーまたはデータベースの一部が、前記配列番号:1,3,
    5,7,9,11,13,15,17,19,21もしくは23、またはその一
    部と相同かどうか決定するステップを含む該方法。
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