JP2003511090A - オリゴデンドロサイト培養物、その製造方法及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】in vitro 分化オリゴデンドロサイト富化細胞培養物を開示する。又、この細胞培養物の製造方法を開示する。in vitro分化神経細胞、好ましくはオリゴデンドロサイトの富化されたin vitro分化神経細胞を、脊髄の外傷又は変性の処置のための移植に用いる方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年１０月２２日出願の米国仮出願第６０／１６１,１２５
号に対する優先性を主張する。前記仮出願は、参照によりそのまま本明細書に援
用する。

【０００２】 ３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§２０２（ｃ）により、米国保健機構基金番号ＮＩＮＤＳ、Ｎ
Ｓ０１９３１、ＮＳ３６２６５及びＮＳ３７９２７からの基金で一部行われた本
明細書に開示される発明には、米国政府が応分の権利を有することが認められる
。

【０００３】 発明の分野 本発明は細胞培養方法及び中枢神経系疾患の処置方法の分野に関するものであ
る。

【０００４】 発明の背景 種々の科学的及び学究的論文を本明細書全体にわたって参照する。これらの論
文は、参照により本明細書に組み込まれ、本発明が関係する技術の現状を説明す
る。

【０００５】 中枢神経系（ＣＮＳ）障害の回復は、脊椎動物ＣＮＳの、喪失細胞を再生する
能力及び機能的結合を再確立する能力が限られているため、阻害される。多発性
硬化症、卒中（発作）、脊髄損傷、及びその他の外傷等、多くのＣＮＳ疾患では
、無傷の軸索の脱髄が機能喪失に寄与する重要な要因である。これまでの研究は
、それ以外では無傷である神経経路の再ミエリン化（髄鞘再生）によって、 機能
の実質的回復が実現することを示唆している。治療法として、再ミエリン化によ
る機能的回復は、切断された軸索の再生による回復（この場合は適切なシナプス
結合能力も再生されなければならない）よりも遥かに簡単に実現できるようだ。

【０００６】 細胞性ブリッジ、胎児ＣＮＳ細胞、ＮＴ−３を発現する線維芽細胞、抗体ブロ
ックタンパク質性インヒビター（inhibitory protein blocking antibodies）を
発現するハイブリドーマ細胞、又は嗅被包グリア細胞（olfactory ensheathing
glial cells）を使用した、急性損傷脊髄への移植的アプローチは、軸索の再生又
は機能的利益をもたらした。慢性損傷脊髄へのラット又はネコの胎児脊髄組織の
移植物は、生き残り、ホスト脊髄と一体化し、そして多少の機能的改善に関連づ
けることができる。更に、胎児脊髄細胞を移植したラットは、若干の歩行指数の
改善利益を示し、胎児縫線細胞の後期移植は反射を高めることができる。成体（
adult）ＣＮＳから分離した神経前駆細胞（neural progenitors）は、脳に移植
した後にニューロン及びグリアに分化し（ゲイジ（Gage）ら（１９９５）Proc.
Natl. Acad. Sci. ９２巻、１１８７９−１１８８３）、又脊髄に移植した後に
オリゴデンドロサイト（乏突起神経膠細胞，希突起神経膠細胞）及びアストロサ
イト（星状神経膠細胞）に分化する。

【０００７】 神経移植研究は、倫理的観点並びに未分化多能性細胞の信頼できるソース（原
材料）の欠如から、限られてきた。in vivoで分化した神経細胞培養物は、遺伝学
的に異常な細胞を含む可能性があるため問題である。理想的には、in vitroでの
神経細胞培養が、移植やその他の商業的及び研究的目的のためのより良いソース
を提供する。

【０００８】 ＥＳ細胞は、それらが遺伝学的に正常で、分化全能であり、無限に複製するこ
とができ（スダ（Suda, Y）ら（１９８７）、J. Cell. Physiol. １３３巻、１
９７−２０１）、そしてマウス（エバンス及びカウフマン（Evans & Kaufman）
（１９８１）、Nature ２９２巻、１５４−１５６；マーチン（Martin）（１９
８１）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８巻、７６３４−７６３８）及びヒト
（トムソン（Thomson）ら（１９９８）、Science ２８２巻、１１４５−１１４
７；シャンブロット（Shamblott）ら（１９９８）、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A ９５巻、１３７２６−１３７３１）を含む数種の脊椎動物種から誘導すること
ができるので、in vivoで誘導された神経細胞で遭遇する問題を一部分解決する
。ＥＳ細胞はまた、遺伝子工学のための最もフレキシブルな幹細胞の一つでもあ
る。例えば、単一ＥＳ細胞における二重対立遺伝子ノックアウトの作製が成し遂
げられた（ウィルダー（Wilder）ら（１９９７）、Dev. Biol. １９２巻、６１
４−６２９；ハケム（Hakem）ら（１９９８）、Cell ９４巻、３３９−３５２）
。

【０００９】 理論的に、ＥＳ細胞は全ての細胞型を発生させることができ、予備的研究は、
オリゴデンドロサイトへの分化が可能であることを示した（フライチャド（Frai
chard）ら（１９９５）、J. Cell. Sci. １０８巻、３１８１−３１８８；ディ
ンスモア（Dinsmore）ら（１９９６）、Cell Transplant. ５巻、１３１−１４
３；ブラストル（Brustle）ら（１９９７）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４
巻、 １４８０９−１４８１４；ブラストル（Brustle）ら（１９９９）、Science
２８５巻、７５４−７５６）。しかしながら、オリゴデンドロサイトを産生及
び富化する簡単で確実な方法は開発されていない。

【００１０】 発明の概要 本発明は、神経細胞のin vitro分化培養物の移植によって脊髄変性を処置する
方法を提供する。本発明者らは、脊髄移植技術の諸問題を正しく認識することに
よって、in vitroで培養された細胞の有益性を確認した。更に、本発明者らは、
オリゴデンドロサイトが移植に必要とされる重要な細胞であることを発見した。
オリゴデンドロサイトの重要性の発見により、オリゴデンドロサイトが豊化（濃
縮，強化）された培養物を作製する方法が提供される。本発明の高度に富化され
たオリゴデンドロサイト培養物は、変性した脊髄組織における軸索の髄鞘形成（
ミエリン化）を増加させるための本発明の脊髄変性処置方法において特に役立た
せるために、用いることができる。

【００１１】 本発明の一態様によると、オリゴデンドロサイトが高度に富化された細胞培養
物が提供される。好ましい一実施態様において、本発明の方法はレチノイン酸分
化４−／４＋ステージＥＢ細胞を用いる。他の好ましい実施態様では、本発明の
方法は予め条件づけられた（プレコンディションド（preconditioned））オリゴ
スフェア培地を用い、これによって本明細書において“オリゴスフェア（oligos
phere）”と呼ぶ中間的細胞型を形成する。

【００１２】 本発明の他の態様は、オリゴデンドロサイトが富化された細胞培養物を特徴と
する。オリゴデンドロサイト富化培養物は、細胞集団（population）中に約２０
％〜約９９％のオリゴデンドロサイトを含んでいてよい。好ましい一実施態様に
おいて、上記培養物は本明細書に記載される本発明の方法によって作製される。

【００１３】 本発明の他の態様によると、神経細胞のin vitro分化培養物を用いて、変性し
たＣＮＳ組織を処置する方法が提供される。この方法は、in vitroで分化した神
経細胞を、このような処置を必要とする患者の脊髄に移植する段階、及びこの移
植された細胞で、損傷した又は決失した組織が置き換わることを許す段階を含む
。好ましい実施態様において、この方法の神経細胞培養物は、本発明の富化され
たオリゴデンドロサイト培養物を含む。

【００１４】 本発明のその他の特徴及び利点は、以下の図面、詳細な説明及び例により理解
されよう。

【００１５】 発明の詳細な説明 本発明は、中枢神経系の組織を再生するための組成物及び方法を提供する。驚
くべきことに、in vitro分化神経細胞の混合集団の損傷した脊髄への移植は、Ｃ
ＮＳ機能の改善に関連することが見いだされた。更に、in vitroで分化したオリ
ゴデンドロサイトの高度に富化された培養物の調製物が、移植によるＣＮＳ機能
の回復に予想外に有効であることも見いだされた。

【００１６】 こうして、本発明によると、オリゴデンドロサイトの高度に富化された培養物
を作製する方法が提供される。このオリゴデンドロサイトの高度に富化された培
養物は、ＥＳ細胞又はその他の分化全能性細胞から、“オリゴスフェア”と呼ぶ
浮遊細胞群の中間期を発生させることによって作製することができる。オリゴス
フェアは、主にオリゴデンドロサイト前駆細胞の初期型を含み、以下に詳述する
ように、in vitro分化神経細胞の混合集団を予め条件づけられたオリゴスフェア
培地中で培養することによって作製することができる。作製したオリゴデンドロ
サイトの高度に富化された培養物は、研究並びに移植治療において多くの用途を
有する新規の細胞培養物である。

【００１７】 例１に記載されるように、レチノイン酸によって神経細胞の混合集団に分化す
るように誘導されたマウス由来胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を、物理的及び化学的に
損傷したラットの脊髄に移植した。移植されたマウス細胞は、脊髄組織内で主に
オリゴデンドロサイトに分化し、そのラットの後肢の機能は対照群に比べて改善
された。驚くべきことに、移植された細胞が損傷した脊髄組織に移行する速度及
び再ミエリン化の程度において、ＥＳ培養物の使用は、in vivoで誘導された細
胞の使用より優れていた。

【００１８】 例２及び例３に記載されるように、神経細胞の混合集団からオリゴデンドロサ
イトの高度に富化された集団を培養する方法が開発され、最適化された。この方
法は、主に未熟及び成熟オリゴデンドロサイトを含む、“オリゴスフェア”と呼
ぶ中間的クラスの細胞の増殖を選択的に促進する新規の培養培地を使用する。こ
の富化方法は、既存のオリゴデンドロサイト培養物から得られる予め条件づけら
れた培地（条件づけ培地，ならし培地）を用いて、混合集団中のオリゴデンドロ
サイトの神経細胞への分割を選択的に誘導する、という予想外に簡単な概念に基
づく。

【００１９】 この富化されたオリゴデンドロサイト培養物を、ミエリン塩基性タンパク質が
欠乏しているshivererマウスの脊髄に移植すると、導入された細胞は天然の（nat
ive）オリゴデンドロサイトに適応し、天然の軸索をミエリン化した。富化され
たオリゴデンドロサイト培養物は、驚くべきことに、細胞移動及び脊髄でのミエ
リン化において、レチノイン酸分化ＥＳ細胞より効果的であった。

【００２０】 本発明は、変性したＣＮＳ組織の治療方法を提供する。この方法は、in vitro 分化神経細胞を損傷部位に移植し、導入された細胞で決失又は欠陥細胞型が置き
換わるのに十分な時間を割り当てる段階を含む。この方法は、オリゴデンドロサ
イトの高度に富化された集団を移植に用いると、特に有効である。

【００２１】 移植された細胞がＣＮＳ機能のためになる仕方を、いずれか一つの理論に限定
するものではないが、移植されたオリゴデンドロサイトは損傷した軸索を再ミエ
リン化することによって作用するようにみえる。脊髄に起きる多くの損傷では、
軸索は無傷のまま残るが、それらのミエリン鞘（髄鞘）の喪失によって役立たな
くなる。ＣＮＳ中のオリゴデンドロサイト（及び末梢神経系中のシュワン細胞（
神経繊維鞘細胞））は、ミエリン鞘内で神経の軸索を包み、電流が軸索膜を通っ
て漏れるのを防ぐ。ミエリンの絶縁機能により、活動電位は軸索に沿ってより速
く移動することができ、使用する代謝エネルギーはより小さくてすむ。損傷、遺
伝学的突然変異又は疾患のために或る領域の軸索の大部分からミエリン鞘が失わ
れた場合、シグナルは脊髄を上下に伝達され得ず、筋肉コントロール及び／又は
感覚のシグナルが消失する結果となる。従って、状況によっては、再ミエリン化
によって神経系機能を回復させることができる。

【００２２】 このように、in vitro分化オリゴデンドロサイトの使用は、ミエリン化の喪失
を含む状態において特に有用である。より詳細に述べれば、この治療方法は、中
でも多発性硬化症、アルツハイマー病、白質ジストロフィー、脳性麻痺、卒中（
発作）、心停止及びＣＮＳ外傷の治療に有効であると考えられる。

【００２３】 上記の治療方法のパフォーマンスを促進するために、本発明者らは、オリゴデ
ンドロサイトの高度に富化された分化神経細胞培養物を作製するのに、培養され
た多能性細胞を如何にして操作するのかを確定した。このように、オリゴデンド
ロサイト富化細胞培養物は、本発明によって特徴づけられる。細胞集団中にオリ
ゴデンドロサイトを約２０％しか含まないようなオリゴデンドロサイト富化培養
物も、本発明の治療方法において使用するのに適していることが見いだされた。
しかし、本発明者らは、オリゴデンドロサイトを９９％まで含む培養物を作製す
る方法を考案した。そのため、本発明には、少なくとも約２０％、好ましくは少
なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、更に好ましくは少なく
とも約５０％、更に一層好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％又は９
０％のオリゴデンドロサイトを細胞集団中に含むオリゴデンドロサイト富化培養
物が含まれる。

【００２４】 ＥＳ細胞から誘導されるオリゴデンドロサイト富化培養物が本発明にて例示さ
れる。しかし、その他の多能性細胞型も神経細胞に分化させることができる。従
って、いかなる多能性細胞型から誘導されるオリゴデンドロサイト富化培養物も
本発明に含まれる。限定されるものではないが、中でも、これらには発達中の神
経系からの前駆細胞、自然発生癌腫から誘導される細胞、及びＰ１９等の胚（胎
児）性癌腫細胞（ベイン（Bain）ら、１９９８）が含まれる。

【００２５】 多能性細胞の基礎的特徴は種間で一致しているため、いかなる脊椎動物のこの
ような細胞からのオリゴデンドロサイト富化細胞培養物も本発明に含まれる。好
ましい一実施態様において、オリゴデンドロサイトは哺乳動物細胞から作製され
る。特に好ましいのは霊長類細胞であり、最も好ましいのはヒト細胞である。オ
リゴデンドロサイト富化培養物を得ることができるその他の脊椎動物細胞には、
非制限的に、マウス（本明細書にて例示される）、ラット（本明細書にて例示さ
れる）及びハムスター等の実験用齧歯動物、及びネコ、イヌ及びウマ等の家畜化
された動物が含まれる。

【００２６】 本発明では、オリゴデンドロサイトの高度に精製された培養物を作製する方法
が示される。この方法は、次の数段階、即ち、 １．４−／４＋ステージ胚子様体からのオリゴデンドロサイト、ニューロン、及
びアストロサイトの混合培養物をトリプシン処理し、すり砕き（細胞を解離させ
るため）； ２．この細胞を、培養フラスコ中で改変ＳＡＴＯ培地（後述）を用いて特定期間
（例えば、３日間in vitroで（ＤＩＶ））培養し； ３．このフラスコを穏やかに振とうして、ゆるく付着している細胞（主にオリゴ
デンドロサイト）を懸濁させ、一方アストロサイトはフラスコに付着したままに
なり；そして ４．この懸濁細胞を、更なる培養期間のために、改変ＳＡＴＯ培地を含む新しい
フラスコに１：１の割合で移す、 各段階を含む。

【００２７】 例３は、ＥＳ細胞からオリゴデンドロサイト富化培養物を如何にして調整する
かについての詳細な一連の指示を示す。

【００２８】 新鮮なＳＡＴＯ培地と、オリゴスフェアで条件づけられた（oligosphere-cond
itioned）“古い”培地との両方を含む培地中で細胞を更に培養する上記最後の
段階が、この高度に豊化された培養物を培養する鍵となる。この培養方法の操作
をいずれか一つの説明に限定するものではないが、オリゴデンドロサイトが増殖
（成長）する培地を、オリゴデンドロサイトの生存及び増殖（成長）を選択的に
促進させる因子（類）で条件づけるのは、分化したオリゴデンドロサイトである
らしい。この培養方法は、主に未熟及び成熟オリゴデンドロサイト、及びネスチ
ン（nestin）陽性前駆細胞からなるオリゴスフェアを生成する。

【００２９】 この新規なオリゴデンドロサイト培養方法は、これまでの方法に優る多くの利
点を有する。この方法で発生する少数のアストロサイトは、培養フラスコの側面
に付着し、培養物から容易に除去される。更に、浮遊している球状の細胞塊（ク
ラスター）（オリゴスフェア）は容易に濃縮、又は別の培地に移して使用するこ
とができる。

【００３０】 この富化されたオリゴデンドロサイト培養物を作製する方法は、その他の種か
らのＥＢ細胞と共に用いることができる。例１及び２は、この方法をMus muscul us 及びRattus（クマネズミ）のＥＢ細胞と共に使用することを教示しており、こ
の方法のフレキシビリティーを例証する。全ての哺乳動物種からのＥＢ細胞は互
いに非常に類似しているため、この培養方法は、その他の種のＥＢ細胞と共に同
様な効力をもって利用することができると考えられる。特に関心とする種には、
非制限的にヒト及びサルが含まれる。

【００３１】 生物工学的に操作された幹細胞培養物も、この培養方法で役立たせるために用
いることができる。自己ＥＳ細胞は、その細胞を移植に用いる場合には特に好都
合である。自己ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞核を患者からの脱核細胞に移すことによっ
て作ることができる。この自己ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞の分化全能の特徴を有する
が、患者に移植した際に拒絶されることがない。同種からの胚性幹細胞培養物も
また、遺伝子操作を施して、患者内で拒絶を引き起こすマーカー類を除去するこ
とができる。

【００３２】 又、本発明は、軸索のミエリン化に欠陥がある患者の中枢神経系を再生する方
法を示す。その方法は、胚性幹細胞からin vitroで培養されたオリゴデンドロサ
イト細胞を導入することを含む。in vitro培養物の使用は、in vivo分化細胞を
移植するこれまでの方法より優れている。なぜならば、ＥＳ細胞は遺伝学的に正
常であるが、in vivo分化細胞集団には腫瘍細胞が隠れている可能性があること
が知られているからである。又、ＥＳ由来オリゴデンドロサイトの使用は、小脳
細胞前駆体を用いるこれまでの方法と比較してより侵襲性が低い。

【００３３】 胚性幹細胞はまた、遺伝学的に変化させやすいため、in vitro分化細胞より好
都合である。ＥＳ細胞に遺伝子操作を施して、脊髄再生を促進する因子及び／又
は細胞をより移植に耐えうるように、即ち、低酸素条件に耐性であるようにする
因子を生成させることができる。脊髄再生のために特に関心とする諸因子には、
非制限的に、ニューロトロフィン（neurotrophin）３（ＮＴ−３）、β−ＦＧＦ
及びＬ１が含まれる。オリゴデンドロサイト培養物を培養するために胚性幹細胞
を使用することは、それによって、処置すべき患者と遺伝学的に同一である細胞
を得ることができるため、特に好都合である。

【００３４】 オリゴデンドロサイトの富化された培養物を移植治療に使用することを上述し
て議論したが、この富化された細胞培養物は、研究の目的にも極めて価値がある
。本発明のオリゴデンドロサイト培養物を用いて、ヒトに見いだされるオリゴデ
ンドロサイトの障害、オリゴデンドロサイトの生産を調節するメカニズム、及び
この細胞がその他のオリゴデンドロサイトの発生を調節するために産生する因子
類を研究することができる。又、この培養物を用いて、神経組織のin vitroモデ
ル系（これは、このような組織が如何に作用し、如何に再生できるかを理解する
ために非常に価値がある）を開発することもできる。

【００３５】 以下の例は、本発明をより詳細に述べるためのものである。これらは本発明を
例証するためのものであって、本発明を制限するものではない。

【００３６】 例１ 中枢神経系を再生するためのin vitro分化神経細胞の調製及び使用 方法 細胞培養：Ｄ３又はＲＯＳＡ２６マウスＥＳ細胞を、ベイン（Bain）らの４−
／４＋プロトコル（Dev. Biol. １６８巻 ３４２−３５７（１９９５））に従う
培養物中に維持し、分化させた。未分化のＥＳ細胞を、白血病阻害因子（leukem
ia inhibitory factor：ＬＩＦ、ギプコ（Gibco））の存在下で増殖させた。細
胞を４日間、ＬＩＦ非存在下で胚子様体として培養し、それから４日間レチノイ
ン酸（all-trans-ＲＡ、５００ｎＭ、シグマ（Sigma））で処理した。９日目に
、胚子様体を一部トリプシン化し（５分間、３７℃、ＥＤＴＡ入り０.２５％ト
リプシン）、移植前にＥＳ細胞培地（ベイン（Bain）ら、Dev. Biol. １６８巻
、３４２−３５７ページ（１９９５））中に再懸濁した。

【００３７】 脊髄損傷：ニューヨーク大学（New York University）で開発された重り落下
装置を用い、既述されたようにして（バッソ（Basso）ら、J. Neurotrauma １２
巻、１−２１（１９９５）；リュー（Liu）ら、J. Neurosci. １７巻、５３９５
−５４０６（１９９７））、衝撃による損傷を引き起こした。成体ロングエバン
ス（Long Evans）雌ラット（２７５±２５ｇ；シモンセン研究所（Simonsen Lab
）、ギルロイ、ＣＡ）をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹膜腔内（i.p.
））で麻酔し、Ｔ９−１０レベルの椎弓切除術を行い、そして脊髄の背側面に、
１０ｇｍの重り（直径２.５ｍｍ）を２５ｍｍの高さから落として、重り落下衝
撃を与えた（リュー（Liu）ら、J. Neurosci.１７巻、５３９５−５４０６（１
９９７））。手術中、恒温調節加熱用パッド（Versa-Therm ２１５６、コールパ
ーマー（Cole-Parmer）、シカゴ、ＩＬ）によって直腸温度を３７.０±０.５℃
に維持し、回復期間中はラットを温度及び湿度調節チャンバー（サーモケア社（
Thermocare Inc.）、インクラインビレッジ、ＮＶ）中に一晩置いた。

【００３８】 移植：移植前日にＢＢＢスコアを記録し（損傷後８日目）、対照群と実験群を
マッチさせ、最初の運動スコアが両群で等しくなるように無作為に割り当てた。
ＮＹＵ衝撃モデルで予め行った実験に基づいて、ＢＢＢスコア８の自発的回復を
生起するように重り落下による損傷レベルを選択した。このスケールの最も感度
の高い部分は、重さ（体重）を支えた歩行が無いのに相当する。衝撃損傷の９日
後に、脊髄定位固定フレーム、５μｌハミルトン（Hamilton）シリンジに取り付
けた直径１００μｍの先端のガラスピペット、及びコプフ（Kopf）のマイクロ定
位固定インジェクションシステム（コプフ（Kopf）モデル５０００＆９００）を
用いて、ラットに神経分化ＥＳ細胞（約１００万個）、ビヒクル培地、又は成体
マウス新皮質細胞１００万個を移植した。５μｌのＥＳ細胞又はマウス新皮質細
胞懸濁液又はビヒクル培地を、Ｔ９レベルの瘻孔（syrinx）の中心に５分間以上
にわたり注入した。全部で３回の独立的実験を、時間を合わせた対照と共に行っ
た。第１組の実験は、行動分析と後期の組織学的分析のために行った［移植後５
週間、ｎ＝１１／群、ＥＳ細胞移植ｖｓ（対）ビヒクル培地対照、Ｄ３ＥＳ系使
用］。第２組は、初期（移植後２週間）及び後期（移植後５週間）の組織学的結
果を比較するために用いた［ｎ＝１１／群、ＥＳ細胞移植（ＲＯＳＡ ｌａｃ− Ｚ 遺伝子導入（transgene）系）ｖｓビヒクル培地対照］。第３組では、３群の行
動結果を比較して、ラット免疫反応がマウス細胞に与える効果を評価した［ｎ＝
６／群、神経分化ＥＳ細胞の移植（ＲＯＳＡ２６ ｌａｃ−Ｚ遺伝子導入系）ｖ
ｓマウス新皮質細胞移植ｖｓビヒクル培地対照、移植後５週間まで生存］。全群
が同じシクロスポリン免疫抑制を受けた。

【００３９】 動物のケア：外科的処置及び動物のケアは全て、実験動物福祉法、実験動物の
ケア及び使用のための指針（ＮＩＨ、ＥＨＥＷ出版、Ｎｏ．７８−２３、１９７
８年改定）及びワシントン大学医学部動物研究委員会によって提起された“齧歯
類救命手術のためのガイドライン及び方針”に従って行われた。反射的排尿が確
立されるまで、１日に３回、手による膀胱圧搾を行った。全ての群の全動物に、
シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ、皮下（s.q.））を移植日から毎日投与した。

【００４０】 行動試験：行動試験は、処置にはブラインド（盲検）の２名が、ＢＢＢ運動評
価スケール（BBB Locomotor Rating Scale）を用いて毎週行った（バッソ（Bass
o）ら、J. Neurotrauma １２巻、１−２１ページ（１９９５））。行動の結果及
び特定のＢＢＢ運動スコア例をデジタルビデオを用いて記録した。

【００４１】 免疫組織化学：使用した一次抗体は以下の抗原に対するものであった：アスト
ロサイト、ＧＦＡＰウサギポリクローナル、１：４（インクスター（Incstar）
）；オリゴデンドロサイト、ＡＰＣ ＣＣ−１ ｍＩｇＧ₁、１：４００（カル
ビオケム・オンコジーン・サイエンシズ（Calbiochem Oncogene Sciences））；
ニューロン、ＮｅｕＮ ｍＩｇＧ₁、１：５００（ケミコン（Chemicon））；抗
−マウスＥＭＡラットハイブリドーマ、１：１（バウムリンド（Baumrind）ら、D
ev. Dyn. １９４巻、３１１−３２５（１９９２））；抗−マウスＭ２ラットハ
イブリドーマ（ラゲナー（Lagenaur）＆シャハナ（Schachner）、J. Supramol.
Struct. Cell Biochem. １５巻、３３５−３４６（１９８１））；抗−ＢrdＵ
ｍＩｇＧ₁又はラットポリクローナル、１：４００（ベーリンガー−マンハイム（
Boehringer-Mannheim））；抗−β−ガラクトシダーゼ ｍＩｇＧ、１：５,００
０（プロメガ（Promega））。種特異的二次抗体（１：２００）を、Ｃｙ３、Ｆ
ＩＴＣ（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch））又はＡｌｅ
ｘａ ４８８（１：２００、モレキュラープローブス（Molecular Probes））に
結合させ、断面（切片）をヘキスト（Hoechst）３３３４２で対比染色した。一次
又は二次抗体を省略した対照スライドを各組で実施した。

【００４２】 細胞の定量：生存しているＢｒｄＵ陽性ＥＳ細胞、及び分化神経細胞のマーカ
ーについて二重にラベルした細胞を、脊髄の中間を中心として、２００μｍづつ
離れた長さ（縦）方向の３箇所の断面（切片）において数え、動物１匹あたりの
平均を出した。

【００４３】 結果 神経に分化したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、外傷性損傷の９日後にラット脊
髄に移植した。２−５週間後の組織学的分析の結果、移植体由来細胞が生き残り
、アストロサイト、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化し、損傷端から
８ｍｍ離れたところまで移行したことが判明した。更に、歩行分析の結果、移植
を受けたラットが、擬似手術された対照又は成体マウス新皮質細胞を移植された
対照には見られなかった、後肢の体重支持（weight support）及び部分的な後肢
協調を示すことが判明した。

【００４４】 本研究の最初の２組では、２２匹の成体雌ロング−エバンスラットにおいて、
重り落下（１０ｇ棒、直径２.５ｍｍ、２５ｍｍ落下）により胸郭脊髄損傷を誘
起させた（バッソ（Basso）ら、J. Neurotrauma １２巻、１−２１（１９９５）
；リュー（Liu）ら、J. Neurosci. １７巻、５３９５−５４０６（１９９７））
。９日後、Ｄ３系から誘導された４−／４＋ステージＥＳ細胞胚子様体（ベイン
（Bain）ら、Dev. Biol. １６８巻、３４２−３５７（１９９５））を部分的に
トリプシン化し（５分間、３７℃、ＥＤＴＡ入り０.２５％トリプシン）、そし
て細胞凝集物（ＥＳ細胞培地５μｌ中に全部で１００万個の細胞）を最初の脊髄
挫傷部位に形成された瘻孔に移植した（ｎ＝１１）。擬似手術した対照動物は、
シクロスポリンでの処置も含めて全く同じに取り扱ったが、それらには、細胞移
植の代わりに培養培地のみの瘻孔内注射を施した（ｎ＝１１）。移植の日から、
全てのラットに毎日シクロスポリン（１０μｇ、皮下（s.q.））を投与し、拒絶
を防止した。後肢の運動機能はバッソ−ベッティ−ブレスナーン（Basso-Beatti
e-Bresnahan：ＢＢＢ）運動評価スケールを用いて評価した（バッソ（Basso）ら
、J. Neurotrauma １２巻、１−２１（１９９５））。もう１組の１１匹（＋１
１匹の擬似手術された対照）の動物群では、ラットは同じ移植操作を受けたが、
ＲＯＳＡ２６ＥＳ細胞を用い［ｌａｃＺ遺伝子導入を含む、β−ガラクトシダー
ゼ（β−ｇａｌ）−発現マウスＥＳ細胞系］、移植の２週間後に、組織検査及び
定量的細胞計数のために動物達を犠牲にした。

【００４５】 遺伝子的にマークされ（ＲＯＳＡ２６β−ｇａｌ−発現系を用いて）、Ｂｒｄ
Ｕを用いてin vitroで予めラベルした（２４時間パルス、１０μＭ）マウスＥＳ
細胞由来細胞は、移植の１４−３３日後にin situ（本来の部位）で確認するこ
とができた；別法として、マウス特異的抗体Ｍ２（ラゲナー及びシャハナ（Lage
naur & Schachner）、J. Supramol. Struct. Cell Biochem. １５巻、３３５−
３４６（１９８１））、ＥＭＡ（バウムリンド（Baumrind）ら、Dev. Dyn. １９
４巻、３１１−３２５（１９９２））又はＴｈｙ１.１／１.２で確認することが
できた（ＥＭＡ及びＴｈｙ１.１／１.２に関するデータは示していない）。移植
の２−５週間後に検査した際、ＥＳ細胞由来細胞は、凝集して、又は損傷部位全
体にばらばらに分散して見つかった；更に、単一の細胞を、瘻孔の端から頭側（
上方：rostral）又は尾側（下方：caudal）方向のどちらにも８ｍｍも離れたと
ころで見いだすことができた（図１）。移植を受けたラットの大部分では、移植
の２週間後まで、培地で処置されたラットでは通常瘻孔で占められている空間が
、ＥＳ細胞由来細胞で満たされていた。５週間目までに、この領域のＥＳ細胞由
来細胞の密度は減少し、Ｔｈｙ１.１／１.２ラベル陽性の線維を含む細胞外基質
に置換された。その他のマウス特異的マーカーであるＭ２及びＥＭＡは、ＥＳ細
胞移植ラットには豊富にあるが擬似注射ラットには存在しないＥＳ細胞由来の突
起（process）もラベルするという点で、遺伝学的及びＤＮＡマーカー（これは
細胞体のみを標識する）に優る利点を有する。

【００４６】 マウス特異的マーカー又はＢｒｄＵに対する抗体でラベルされた、生存するＥ
Ｓ細胞由来細胞を、オリゴデンドロサイトに特異的なマーカー（腺腫性大腸ポリ
ポーシス遺伝子産物（adenomatous polyposis coli gene product）、ＡＰＣ
ＣＣ−１）、アストロサイトに特異的なマーカー（グリア原線維酸性タンパク質
（glial fibrillary acidic protein）、ＧＦＡＰ）、及びニューロンに特異的
なマーカー（ニューロン特異的核タンパク質（neuron-specific nuclear protei
n）、ＮｅｕＮ）に対する抗体でも標識した；核はヘキスト（Hoechst）３３３４
２染色で明瞭に確認することができた。生存するＥＳ細胞由来細胞の大部分は、
オリゴデンドロサイト（ＢｒｄＵでラベルされた細胞の４３±６％はＯ１でラベ
ルされた。ｎ＝１１ラット、平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差））及びアストロ
サイト（１９±４％がＧＦＡＰでラベルされた）であったが、多少のＥＳ細胞由
来ニューロン（８±５％がＮｅｕＮでラベルされた）も脊髄の中間に見いだされ
た。ＥＳ細胞由来オリゴデンドロサイトの多くは、ミエリンの肝要成分であるミ
エリン塩基性タンパク質に関しても免疫反応性であった。腫瘍生成の証拠は見つ
からなかった。

【００４７】 オープンフィールド（開放地）運動におけるパフォーマンスは、ＥＳ細胞移植
によって高まった（図２）。擬似移植群が後肢で重さ（体重）を支えられなかっ
たのに対し、ＥＳ細胞移植群は、重さ（体重）の一部を支えた移動を示した。移
植の２週後までには、ＢＢＢスコアの統計的差が得られた（図２ａ）。１カ月後
、群間で、ＢＢＢスケール上の２点の差が観察された：擬似ビヒクル移植群では
７.９±０.６、ＥＳ細胞移植群では１０.０±０.４。前者のスコアは、後肢が体
重を支えず、後肢の運動が協調しないことを特徴とする歩行を意味し、後者のス
コアは、一部後肢が体重を支え、一部後肢が協調運動をすることを特徴とする歩
行を意味する。

【００４８】 第３組の実験は、ラット対マウスの免疫反応が、観察された行動的利益に寄与
しうる可能性を調べた。損傷の９日後の４−／４＋ＥＳ細胞（ＲＯＳＡ２６系）
の移植を、２対照群―培養培地注入群及び成体マウス新皮質細胞移植群―に対し
て直接比較した（ｎ＝６／群）。ミクログリア（小神経膠細胞）／マクロファー
ジ（ＣＤ１１ｂ）及びＩＮＦ−γに対する抗体を用いた、移植の５週間後の脊髄
の免疫組織学的検査は、３群全てに同程度の炎症があることを明らかにした。Ｂ
ＢＢ運動スケールで（スローモーションビデオを用いた採点を用いて）評価され
た運動機能の改善は、ここでもＥＳ細胞移植のみに関連づけられた（図２ｂ）。

【００４９】 要するに、マウスＥＳ細胞由来細胞は、重り落下による損傷の９日後に脊髄に
移植した場合、（１）少なくとも５週間は生存しており；（２）移植部位から少
なくとも８ｍｍは離れて移動し；（３）腫瘍を生成することなくアストロサイト
、オリゴデンドロサイト、ニューロンに分化し、（４）運動機能の改善をもたら
すことが証明された。ここに示した程度と同様の行動の回復は、これまで急性損
傷モデルで示されたに過ぎない（ベルンスタイン（Bernstein）ら、Exp. Neurol
. ９８巻、６３３−６４４（１９８７）；ブレグマン（Bregman）ら、Exp. Neur
ol. １２３巻、３−１６（１９９３）；ホーランド（Howland）ら、Exp. Neurol.
１３５巻、１２３−１４５（１９９５）；グリル（Grill）ら、J. Neurosci.
１７巻：５５６０−５５７２（１９９７））。観察された利益をもたらす可能性
のある要因としては、例えば再生のために好ましい基質の提供又は成長因子の産
生による、ミエリン化の増強、後発性オリゴデンドロサイト死（delayed oligod
endrocyte death）の減少、又はホスト軸索再生の増強が含まれる。

【００５０】 例２ 高度に富化されたオリゴデンドロサイト培養物の製造方法 ＥＳ細胞由来オリゴデンドロサイトの富化（濃縮，強化）された培養物の製造
方法を開発した。生成したオリゴデンドロサイトは、損傷した脊髄及びミエリン
化不全（dysmyelinated）脊髄に移植した後、in vitro及びin vivoにおいて軸索
をミエリン化することができる。第１のモデルにおいて、ラットの背側柱白質（
dorsal column white matter）において、軸索を通過して損傷させることなく、
局所的化学的脱鞘損傷を誘起した。第２のモデルは、ミエリン塩基性タンパク質
（ＭＢＰ）が欠如したミエリン欠乏shiverer（shi/shi）突然変異マウスを用い
た。

【００５１】 材料及び方法 動物及びケア：ホモ接合（shi/shi）shivererマウス及び雌ロングエバンスラ
ットをそれぞれジャクソン（Jackson）（バール ハーバー、ＭＥ）及びシモン
セン（Simonsen）（ギルロイ、ＣＡ）研究所から入手した。処置は、実験動物福
祉法、実験動物のケア及び使用のための指針（ＮＩＨ、ＥＨＥＷ出版、Ｎｏ．７
８−２３、１９７８年改定）及びワシントン大学医学部動物研究委員会によって
提起された“齧歯類救命手術のためのガイドライン及び方針”に従って行われた
。麻酔は、ケタミン（ketamine）／メデトミジン（medetomidine）（ラットでは
７５：０.５ｍｇ／ｋｇ、マウスでは７５：１ｍｇ／ｋｇ；腹膜腔内（i.p.））
によって誘導し、アチパメゾール（atipamezole）（１.０ｍｇ／ｋｇ、皮下（s.
q.））で復帰させた。全ての動物に次のものを投与した：１）シクロスポリン（
１０ｍｇ／ｋｇ、皮下（s.q.））を移植の２４時間前及びその後毎日、２）抗生
物質（エンロフロキサシン（enrofloxacin）、２.５ｍｇ／ｋｇ、皮下（s.q.）
）を手術前及び３−５日間毎日、３）生理食塩水（２−１０ｍｌ、腹膜腔内（i.
p.））を手術後及び２日間、及び４）栄養補助剤を手術後３−５日間。

【００５２】 ＥＳ細胞培養物：Ｄ３（ｌａｃＺ−）又はＲＯＳＡ２６（ｌａｃＺ＋）マウス
ＥＳ細胞を、４−／４＋プロトコルを用いて分化させた（ベイン（Bain）ら、（
１９９５） Dev. Biol. １６８巻、３４２−３５７；例１）。in vitroで８日後
、４−／４＋ステージ浮遊胚子様体（embryoid body：ＥＢ）を部分的にトリプ
シン化し（５分、３７℃、ＥＤＴＡ入り０.２５％トリプシン）、移植のために
ＥＳ細胞培地（ＥＳＩＭ）に再懸濁するか（ベイン（Bain）ら、（１９９５）De
v. Biol.１６８巻、３４２−３５７；例１）、又は、ＥＳＩＭ中で培養するため
に（ベイン（Bain）ら、（１９９５） Dev. Biol. １６８巻、３４２−３５７；
例１）、若しくは、血清を含む又は含まない改変ＳＡＴＯ規定培地で培養するた
めに（ボッテンスタイン及びサトー（Bottenstein & Sato）、（１９７９） Proc
. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ、７６巻、５１４−７；ラフ（Raff）ら、（１９８
３） Nature ３０３巻、３９０−３９６）、更にすり砕いて単一細胞懸濁液にし
た。

【００５３】 脱鞘：背側柱白質の脱鞘は、ラット中で化学的に、特徴付けされている方法を
用いて誘起した（ホール（Hall）、（１９７２） J. Cell Sci. １０巻、５３５
−５４６；ブレイクモア（Blakemore）、（１９７６） Neuropathol. Appl. Neu
robiol. ２巻、２１−３９；ワックスマン（Waxman）ら、（１９７９） J. Neuro
l. Sci. ４４巻、４５−５３；ブレイクモア及びクラング（Blakemore & Crang
）、（１９８５）、J. Neurol. Sci. ７０巻、２０７−２２３）。Ｔ１０の椎弓
切除術後、臭化エチジウム（０.９％生理食塩水中の０.１％臭化エチジウム、１
μｌ）又はリソホスファチジルコリン（ＬＰＣ−リソレシチン；０.９％生理食
塩水中の１.０％ＬＰＣ、２μｌ）を、定位固定マイクロインジェクター（スト
エルティング（Stoelting））及び５μｌハミルトンシリンジに取り付けた３０
μｍの先端のガラスピペットを用いて、０.５ｍｍの深さで背側柱中に、１０分
以上にわたり注入した。３日後、脱鞘領域に、部分的に解離されたＥＢを移植し
た。

【００５４】 移植用細胞の調製：予めラベルした（後述の細胞追跡方法参照）４−／４＋ス
テージＥＢ又はオリゴスフェアを、既述の方法（例１）を用いる移植のために調
製し、細胞小塊（クラスター）の懸濁液を作製した。血球計数器を用いて細胞密
度を計算し、５０,０００生存細胞／μｌに調節した。

【００５５】 移植：脱鞘損傷ラットに、部分的に解離した４−／４＋ＥＢからの約１２５,
０００個の細胞を移植するか、又は培地ビヒクルを注入した。５０−１００μｍ
の先端直径のガラスピペットを、定位固定的に背側柱白質中に０.５ｍｍ差し込
んだ。定位固定マイクロインジェクターを用いて、２.５μｌのＥＳ細胞懸濁液
又はビヒクル培地を、０.２５μｌ／ｍｉｎの速度で注入した。針をそのままの
場所に５分間以上残し、ゆっくりと引き抜き、そして椎弓切除部位を人工硬膜で
覆った。第２のモデルでは、shiverer（shi/shi）マウスに１００,０００個のオ
リゴスフェア細胞又はビヒクル培地を（各々ｎ＞６）Ｔ８及びＴ１０レベルで移
植した（２部位に１μｌ、硬膜下０.３５μｍ）。

【００５６】 細胞追跡及び免疫組織化学：数種の方法を用いて移植後のＥＳ細胞を追跡した
：（１）ｌａｃＺ遺伝子導入、（２）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ＤＮ
Ａラベル、（３）蛍光細胞トラッカーオレンジ、及び／又は（４）マウス特異的
抗体。安定してｌａｃＺを発現するＲＯＳＡ２６ＥＳ細胞を、全ての移植実験に
用いた（フリードマン及びソリアノ（Friedman & Soriano）、（１９９１） Gen
es Dev. ５巻、１５１３−１５２３）。ＥＳ細胞は、４−／４＋プロトコル（例
１）の３日目から４日目までの２４時間にわたり、ＢｒｄＵ（１０μＭ；ベーリ
ンガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim）、インディアナポリス、ＩＮ）で
パルスラベルされた。更に、部分的にトリプシン解離された４−／４＋ＥＢを、
安定蛍光マーカー細胞トラッカーオレンジ（モレキュラープローブス、エウゲニ
ー、ＯＲ）と共に２０分間インキュベートし、洗浄し、更に２０分間インキュベ
ートし、そして移植前に洗浄した。細胞トラッカーオレンジは、細胞内に拡散し
、細胞質中で、定着可能な膜不透過型に変換される。

【００５７】 ラット脱鞘実験において、マウスＥＳ細胞を検出するためにマウス特異的抗体
を用いた：抗−Ｍ２（マウスのグリア＞ニューロンをラベル）及び抗−ＥＭＡ（
マウスのニューロン＞グリアをラベル）。オリゴデンドロサイト系統を確認する
ために用いる抗体には次のものが含まれる：オリゴデンドロサイト前駆細胞のた
めの抗−ＮＧ２（ケミコン（Chemicon））、未熟オリゴデンドロサイトのための
抗−Ｏ４（ハイブリドーマ）、成熟オリゴデンドロサイトのための抗−Ｏ１（ハ
イブリドーマ）、末期成熟オリゴデンドロサイトのための抗−ＭＢＰ（ベーリン
ガー−マンハイム（Boehringer-Mannheim））。ホモ接合shiverer（shi/shi）マ
ウスにはＭＢＰがまったく無く、移植後のこれら動物におけるＭＢＰ（＋）ミエ
リンの存在は、移植されたオリゴデンドロサイトを確認する有用なマーカーを提
供する。

【００５８】 電子顕微鏡検査：ＥＢ及び培養物を、標準的な方法を用いて処理した（マルヴ
ィー（Mulvey）ら（１９９８） Science ２８２巻、１４９４−１４９７）。サ
ンプルを、２０ＫＶ加速電圧で作動された日立Ｓ−４５０走査型電子顕微鏡及び
ＪＥＯＬ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡で観察した。

【００５９】 結果 ４−／４＋レチノイン酸プロトコルを用いて分化したＥＳ細胞（ベイン（Bain
）ら、（１９９５） Dev. Biol. １６８巻、３４２−３５７）は、損傷した脊髄
に移植した際、オリゴデンドロサイトを生成する（例１）。このプロトコルに基
づいて、４−／４＋ステージＥＢからオリゴデンドロサイト、ニューロン及びア
ストロサイトの混合培養物を確実に生成する方法が開発された。ＥＢは細胞塊（
クラスター）中に浮遊し、その多くは内部シスト（嚢胞）を含んでいた。超微細
構造ＳＥＭ検査の結果、表面の細胞が多数の（広範囲の）微小突起（microproce
ss）で覆われていることが判明した。

【００６０】 ＥＢの免疫組織化学的研究は、分化神経細胞のマーカーの発現が限られており
、細胞の半数未満がネスチン陽性（神経前駆細胞の初期マーカー）であることを
示した。分化神経細胞のマーカーを発現した大部分の細胞は、ＥＢの外側に限ら
れていた。但し、内部シストを取り巻く細胞の一群（subset）もまた、神経細胞
（ニューロン）マーカーでしばしばラベルされた。超微細構造観察の結果は、か
なり多数のＥＢ細胞がアポトーシス死の特徴を示すことを示唆した。更に、染色
質凝縮（ヘキスト（Hoechst）染色核で見られる）は、細胞死と一致して、細胞
の１０−２０％に存在した。

【００６１】

【表１】

【００６２】 解離４−／４＋ＥＢを標準神経培地中で更に培養すると、ニューロン、アスト
ロサイト及びオリゴデンドロサイトの混合培養物が産生された。最初の培養物の
ように、ＥＳ由来Ｉ型アストロサイトはディッシュ（培養容器）の底に付着した
融合層を形成し、その他の細胞は最上部に増殖し、ニューロンは増殖（成長）し
て、外側に放射する軸索の大きい束のある小さい凝集塊となった。混合培養物は
、血清を補充したＳＡＴＯ規定培地中で最も良く増殖（成長）し、少なくとも１
カ月間維持することができた。オリゴデンドロサイトの長命はニューロンの存在
によって増強された。in vitroで第１週目にβＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え
るとオリゴデンドロサイトの産生は増加し、細胞分割の抑制（１０^-5Ｍシトシン
アラビノシド）は、培養ＥＳ由来ニューロンの以前の研究におけるように（ベイ
ン（Bain）ら、（１９９５） Dev. Biol. １６８巻、３４２−３５７）、オリゴ
デンドロサイトの生存度を制限した。

【００６３】 免疫組織化学的マーカー並びに走査型及び透過型電子顕微鏡を用いて、ＥＳ細
胞由来オリゴデンドロサイトがミエリンを生成することが観察された。複数の軸
索及び単一軸索の複数部分をミエリン化した個々のオリゴデンドロサイトは、成
熟ミエリン化細胞に存在するミエリンの一成分に対する蛍光抗体（Ｏ１）を用い
て容易に確認することができた。９ＤＩＶ後、２−３層にゆるく包まれた軸索ミ
エリンのプロフィールが一般的であった。in vitroでの緻密な成熟ミエリンのプ
ロフィールの発生には、一般的に３−６週間かかることが知られている。我々の
混合培養物においては、１４ＤＩＶ後にはニューロンの生存が制限されるため、
この研究ではその後のステージの試験は阻まれた。軸索が存在しない場合、オリ
ゴデンドロサイトは、最初のオリゴデンドロサイト培養物と同様のミエリンのシ
ートを形成した。

【００６４】 オリゴデンドロサイトの富化された培養物は、“オリゴスフェア”と呼ぶ中間
的なin vitroステージの開発によって作製された。オリゴスフェアを作製するた
めに、４−／４＋ＥＢをトリプシン化し、すり砕き、それからＳＡＴＯ規定培地
、β−ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）からなる予め条
件づけられた“オリゴスフェア培地”５ｍｌを含むＴ２５フラスコ中に置いた。
この培地は、オリゴデンドロサイトの生存及び増殖（成長）を促進した。４日目
に、非付着細胞（主にオリゴデンドロサイトの前駆細胞）を新鮮なオリゴスフェ
ア培地に１：１の割合で移した。発生したわずかのアストロサイトはフラスコに
付着し、移らなかった。この細胞は、６−８日間にわたり、浮遊球状細胞塊（ク
ラスター）として発達した。

【００６５】 免疫組織化学的研究は、オリゴスフェアが少数のニューロン、わずかのアスト
ロサイト、多量の未熟及び成熟オリゴデンドロサイト、及びかなり多量のネスチ
ン陽性前駆細胞を含むことを示唆した（表１）。解離したオリゴスフェアを培養
すると、９２±７％のオリゴデンドロサイトを含み（ｎ＝４）、残りがニューロ
ンである培養物が生成した。１週間の生存期間が容易に達成され、培養物にオリ
ゴスフェアによって条件づけられた培地を与えると、より長期間の増殖が可能で
あった。

【００６６】 “損傷した”成体ＣＮＳにおける、ＥＳ細胞のin vivoでの分化を評価するた
めに、部分的に解離した４−／４＋ＥＢを、ラット脊髄の背側柱に化学的脱鞘の
３日後に移植した。移植の１週間後に検査した際、抗−マウス特異的抗体、ｌａ
ｃＺ発現での免疫染色、及び移植された動物におけるヘキスト（Hoechst）３３
３４２ラベルによって証明される細胞密度の増加によって示されるように、脱鞘
領域への首尾よい生着が、１０匹中９匹のラットにおいて明らかとなった。擬似
ビヒクル移植を受けたラットでは、流路（passage）の軸索は広く余裕があり（
まばらで）、少量のヘキスト（Hoechst）核ラベルが脱鞘部位に存在した。移植
されたラットの損傷部位では、ＥＳ細胞は主にオリゴデンドロサイトに分化し（
抗−ＡＰＣ ＣＣ−１）、アストロサイトには分化しなかった。ＥＳ細胞及びビ
ヒクル培地移植ラットの両方において、損傷の辺縁に高まったＧＦＡＰ反応性が
一貫して認められ、ホストの反応性アストロサイトとの結合（association）を
示唆した。脱鞘領域又はホスト組織には、ＥＳ細胞由来ニューロンの証拠（抗−
ＮｅｕＮ又は抗−ニューロン特異的エノラーゼ）はほとんど見いだされなかった
。移植を受けた１０匹のラット中９匹は、このパターンのＥＳ細胞分化を示した
。急性グラフト（移植片）拒絶の組織学的証拠が、１０匹中１匹のラットに見い
だされた。

【００６７】 第２の研究は、脱鞘した成体ＣＮＳにおける、ＥＳオリゴデンドロサイトのミ
エリン化の潜在能力を評価するために行われた。解離したオリゴスフェアを、機
能的ミエリンの本質的成分であるＭＢＰが欠如しているshiverer（shi/shi）マ
ウス（＞齢２カ月）の胸郭脊髄に移植した。移植した細胞を、そのオリゴスフェ
アを蛍光マーカー細胞トラッカーオレンジで予めラベルすることによって、又は
移植した細胞は発現するがホストshiverer（shi/shi）マウスには存在しないＭ
ＢＰを検出することによって追跡した。移植の２週間後、ＥＳ細胞由来細胞トラ
ッカーオレンジ（＋）及びＭＢＰ（＋）オリゴデンドロサイトが、白質中で優性
になった。ＥＳオリゴデンドロサイトは、白質においてオリゴデンドロサイトが
通常従う組織に適合した：ＥＳオリゴデンドロサイトは、ホストの線維束内オリ
ゴデンドロサイトと整列し、軸索をミエリン化する。ホモ接合shivererマウスは
実質的なＭＢＰ免疫反応性を示さないから、ＭＢＰ免疫反応性は移植されたＥＳ
細胞由来オリゴデンドロサイトに帰せられる。オリゴスフェア移植マウスでは移
植部位の周辺領域に広がるＭＢＰ免疫反応性が見いだされ（擬似移植マウスでは
見られなかった）、ＭＢＰ発現パターンはマウスの正常脊髄に見いだされるもの
と同様であった。白質中の軸索が占める空間によって分離された、ＭＢＰ免疫反
応性の長さ方向の平行な配置は、軸索のミエリン化の特徴を示した。

【００６８】 この例に述べられた実験は、ＥＳ細胞を用いてオリゴデンドロサイトの混合及
び富化された培養物を確実に発生させうること、及びこのオリゴデンドロサイト
がin vitroでミエリンを生成し、軸索をミエリン化しうることを証明する。更に
、移植されたＥＳ細胞は、１）脱鞘領域においてオリゴデンドロサイトに優先的
に分化することができ、これは損傷部位における環境的な合図がＥＳ細胞の分化
を指示しうることを示唆し、２）ミエリン化不全脊髄中のホスト軸索をミエリン
化することができる。

【００６９】 これは、ＥＳ細胞由来オリゴデンドロサイトがin vitroでミエリン化すること
ができ、移植後に生存して成熟ＣＮＳ中の軸索をミエリン化することができるこ
とを最初に証明した研究であると信じる。再ミエリン化の治療的措置の標的とな
る大部分の一般的障害は成体に起こるので、成熟ＣＮＳにおけるこれらの知見は
特に意味がある。特に、これらのデータは、成体ＣＮＳの損傷脱鞘領域がオリゴ
デンドロサイト分化を優先的に刺激するらしいことを証明している。

【００７０】 再ミエリン化は、ラットにおいて中程度の挫傷損傷の９日後に、解離した４−
／４＋ステージＥＳ細胞を移植した際に認められる、運動機能の急速な回復の基
礎となり得る魅力的なメカニズムである（例１）。有意な運動の回復は、移植の
１１日後に最初に明らかになり、その研究においては、オリゴデンドロサイトが
、ＥＳ細胞由来細胞の最大の分化細胞集団であった。

【００７１】 上記の結果は、損傷したＣＮＳ中の局所的条件が、ＥＳ由来神経細胞の特定の
型の分化又は生存を選択しうることも示唆している。ＥＳ細胞を挫傷損傷脊髄に
移植すると、それは互いに相関する特定のパターンで配列された多数のアストロ
サイト及びオリゴデンドロサイトに分化する（例１）。これに対して、最初に脱
鞘された損傷、縦に通過する軸索（sparing passing axon）は、優先的にＥＳ細
胞をオリゴデンドロサイトに分化させることがここで示される。この観察は、Ｃ
ＮＳから分離された前駆細胞が、ＣＮＳ中のそれらの移植部位に基づいて、異な
る神経細胞（ニューロン）表現型に分化するという以前の証明と矛盾しない（ヴ
ィカリオ−アベジョン（Vicario-Abejon）ら、（１９９５） J. Neurosci. １５
巻、６３５１−６３６３；ブラストル（Brustle）ら、（１９９５） Neuron １５
巻、１２７５−１２８５；シュホーネン（Shuhonen）ら、（１９９６） Nature
３８３巻、６２４−６２７）。これまでの報告のなかで、ＣＮＳの状態が神経前
駆細胞からのオリゴデンドロサイトの分化を選択できることを示唆したものはな
い。

【００７２】 ＥＳ細胞由来腫瘍形成の証拠は、上記のin vivo研究又は我々のこれまでの脊
髄挫傷移植系列のいずれにも見いだされなかった（ヴィカリオ−アベジョン（Vi
cario-Abejon）ら、（１９９５） J. Neurosci. １５巻、６３５１−６３６３）
。奇形腫又はその他の腫瘍型の形成は、いかなる移植研究においても懸念される
。ＥＳ細胞の有望な特徴は、それが胞胚にインプラントした後に正常動物を発生
させることによって遺伝学的に正常であることが証明できる唯一の幹細胞である
ことである。

【００７３】 例３ ＥＳ細胞からのオリゴスフェアの調整方法 本例は、ＥＳ細胞からのオリゴデンドロサイト富化細胞培養物の調整について
の詳しい指示を示す。特異的培地、試薬及び材料について記載するが、それらは
具体的例であり、本発明を制限するものではない。

【００７４】 本例では、オリゴスフェアを培養する過程を、胚子様体（ＥＢ）が上首尾に作
り出された時点から概略説明する（例１；ベイン（Bain）ら、１９９８）。多く
のストック溶液（保存溶液）がこの処方の諸成分として使用される。これらは特
定の段階を開始する前に作っておかなければならない。これらのうちの幾つかは
新たに作らなければならず、幾つかは保存して何回も使用することできる。全プ
ロトコルを最初に通して読み、いかなる処方も、その開始前に、確実に全ての材
料及びストック溶液を集合させ及び／又は作ることを勧める。各処方は、オリゴ
スフェアを作製する過程で用いられる特定の培地又は成分の作製方法を概略説明
する。その他の背景となる情報は、ベイン（Bain）らの１９９８年の論文、“Ｐ
１９胚性癌腫及び胚性幹細胞から培養物中に誘導されるニューロン様細胞”から
入手することができる。この論文は、http://thalamus.wustl.edu/gottlieblab/
gottlieb lab 3.html.でオンラインにて見出すことができる。

【００７５】 ＳＡＴＯ１００Ｘ（１００倍）ストックの処方 手順上の注意：ＳＡＴＯ１００Ｘストック溶液は、ＳＡＴＯ無血清培地のため
の培地補充ベースであり、オリゴスフェア作製過程における諸段階の第１のシリ
ーズである。ＳＡＴＯ１００Ｘストックは、一定量を取り分けて凍結する前に滅
菌濾過するので、全ての溶質はフードの外で秤量することができる。時間効率の
観点から、全ての溶質は同時に秤取し、個々のストック溶液を調製し、それから
それらを組み合わせて濾過する。又、各秤量ボート及びガラス製培養チューブに
、それらに入れる物質名を予めラベルし、間違いが起こらないようにすることを
薦める。

【００７６】 １）全ての成分溶質を入手し、フードの外で、予めラベルした別々の秤量ボー
トでそれらを秤量する。 ａ）結晶ＢＳＡ ２００ｍｇ ｂ）プロゲステロン ５ｍｇ ｃ）プトレッシン ３２ｍｇ ｄ）Ｌ−チロキシン ２.４ｍｇ ｅ）トリ−ヨードチロニン ２.４ｍｇ ｆ）アポ−トランスフェリン １８０ｍｇ ｇ）亜セレン酸ナトリウム ４ｍｇ

【００７７】 ２）ストックプロゲステロン溶液：プロゲステロン粉末５ｍｇを、５ｍＬ丸底
チューブ中の２００μＬの滅菌濾過した１００％エタノールに溶解する。濾過し
た１００％エタノールがすでに作られているならば、段階ｅまで飛ばす。 ａ）６０ｃｃ滅菌シリンジチューブを準備し、プランジャーを外す。 ｂ）〜５０ｍＬの１００％エタノールをシリンジチューブに注ぎ、２５ｍｍの滅
菌０.２μｍフィルターを取り付ける。 ｃ）エタノールを、フィルターを通して滅菌５０ｍＬコニカル（円錐形）チュー
ブに押し出す。 ｄ）チューブに“濾過した１００％ＥｔＯＨ”、日付、そしてあなたの頭文字を
ラベルする。（この濾過した１００％ＥｔＯＨは、無菌操作が維持されるのであ
れば繰り返し用いることができる。） ｅ）５ｍｇのプロゲステロン粉末を、５ｍＬ丸底チューブに注意深く入れる。 ｆ）マイクロピペットを用いて、２００μＬの滅菌濾過した１００％ＥｔＯＨを
プロゲステロンに加える。 ｇ）このチューブに蓋をし、溶質が全て溶解するまで（〜２分）渦巻き状に撹拌
（ボルテックス）する。

【００７８】 ３）ストックチロキシン溶液：チロキシン粉末２.４ｍｇを、第２の５ｍＬ丸
底チューブ中の３００μｌの滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨに溶解する。すで
に滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨが作られているならば、段階ｆまで飛ばす。 ａ）０.１Ｎ エンドトキシンフリー（無し） ＮａＯＨの５０ｍＬバイアルを
入手する（シグマ（Sigma）＃２１０−５）。 ｂ）６０ｃｃ滅菌シリンジチューブを準備し、プランジャーを外す。 ｃ）５０ｍＬの０.１Ｎ ＮａＯＨをシリンジチューブに注ぎ、２５ｍｍの滅菌
０.２μｍフィルターを取り付ける。 ｄ）ＮａＯＨを、フィルターを通して滅菌５０ｍＬコニカルチューブに押し出す
。 ｅ）チューブに“濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨ”及び日付をラベルする。（この濾
過した０.１Ｎ ＮａＯＨは、無菌操作が維持されるのであれば繰り返し用いる
ことができる。） ｆ）２.４ｍｇのチロキシン粉末を、５ｍＬ丸底チューブに注意深く入れる。 ｇ）マイクロピペットを用いて、３００μＬの滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨ
をチロキシンに加える。 ｈ）このチューブに蓋をし、溶質が全て溶解するまでボルテックスする（〜２分
）。

【００７９】 ４）ストックトリ−ヨードチロニン溶液：トリ−ヨードチロニン２.４ｍｇを
第３の５ｍＬ丸底チューブ中の３００μＬの滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨに
溶解する。 ａ）段階３からの手順を、チロキシンの代わりにトリ−ヨードチロニンを用いて
繰り返す。

【００８０】 ５）ストック亜セレン酸ナトリウム溶液：亜セレン酸ナトリウム４ｍｇを１５
ｍＬコニカルチューブ中の１００μＬの滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨに溶解
し、その後１０ｍＬのＤＭＥＭを加える。 ａ）段階３及び４からの手順を繰り返す。この場合は亜セレン酸ナトリウム４ｍ
ｇ、滅菌濾過した０.１Ｎ ＮａＯＨ１００μＬ、及び１５ｍＬ滅菌コニカルチ
ューブを用いる。 ｂ）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、亜セレン酸ナトリウム溶液を含む１５ｍＬ
コニカルチューブに１０ｍＬのＤＭＥＭを加える。 ｃ）同じピペットを用いて、溶液を３回均質化し、混合する。

【００８１】 ６）ストックＩＴＳ溶液：５ｍＬ血清ピペットを用いて、２.５ｍＬのＤＭＥ
Ｍをゴム栓付き市販ストックチューブに加え、それにＩＴＳを入れ、チューブに
蓋をし、全ての溶質が溶解するまでボルテックスする。

【００８２】 ７）残る３種類の予め秤量した成分粉末（ＢＳＡ、プトレッシン、アポ−トラ
ンスフェリン）の各々を別々の５０ｍＬ滅菌コニカルチューブに注意深く入れる
。

【００８３】 ８）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、６ｍＬのＤＭＥＭをこの３本の５０ｍＬ
滅菌コニカルチューブの各々に入れる。

【００８４】 ９）この３本のチューブの各々を、溶質の全てが溶解するまでボルテックスす
る。

【００８５】 １０）これら３本の５０ｍＬコニカルチューブの各々の内容物を一本の５０ｍ
Ｌコニカルチューブに注意深く注ぎ、蓋をし、手で混合する。

【００８６】 １１）別々のマイクロピペットの先端を用いて、個々のストック溶液のそれぞ
れの指定量を５０ｍＬコニカルチューブに入れる。 ａ）プロゲステロンストック溶液 ５μＬ ｂ）Ｌ−チロキシンストック溶液 １０μＬ ｃ）トリ−ヨードチロニンストック溶液 １０μＬ ｄ）ＩＴＳストック溶液 ２μＬ ｅ）亜セレン酸ナトリウムストック溶液 １５０μＬ。

【００８７】 ６）２５ｍＬ血清ピペットを用いて、少なくとも３回おだやかに均質化し、溶
液を混合する。

【００８８】 ７）６０ｃｃ滅菌シリンジチューブを準備し、プランジャーを外す。

【００８９】 ８）全溶液をシリンジチューブに注ぎ、プランジャーを元に戻し、２５ｍｍの
滅菌アクロディスク（Acrodisc）０.２μｍフィルターを取り付ける。

【００９０】 ９）液を、フィルターを通して滅菌５０ｍＬコニカルチューブに押し出す。

【００９１】 １０）マイクロピペットを用いて、この溶液の４００μＬずつを、蓋付きの２.
０ｍＬ滅菌ＲＮＡｓｅフリー（無し）ビオストア（Biostore）バイアル群に取り
分ける。

【００９２】 １１）バイアルに“ＳＡＴＯ１００Ｘストック”及び日付をラベルし、−２０
℃で保存する。

【００９３】 １２）凍結したＳＡＴＯ１００Ｘストックアリコートは６カ月間もつ。

【００９４】 ＳＡＴＯ成分ストック類の処方 手順上の注意：ＳＡＴＯ成分ストック溶液類は、ＳＡＴＯ無血清培地のための
成長因子添加物であり、組み合わせると、オリゴスフェアの作製過程における諸
段階の第２シリーズである。成分ストック類は、一定量を取り分けて凍結する前
に滅菌濾過するので、全ての溶質はフードの外で秤量することができる。

【００９５】 この系列の諸段階において、現場の技術者はＮ−アセチル、ＮＴ−３、ＣＮＴ
Ｆ、Ｈｅｐｅｓ、及びＬ−グルタミンのストック溶液を調製する。或るストック
は長期間もち、或るストックは新たに作らなければならない。特に記載がない限
り、これらの手順は無菌フード内で行う。時間効率の観点から、全ての溶質を同
時に秤取し、個々のストック溶液を調製し、それからそれらを一定量に取り分け
、濾過する。又、各秤量ボート及びガラス製培養チューブに、それらに入れる物
質名を予めラベルし、間違いが起こらないようにすることを薦める。

【００９６】 滅菌濾過したｄｄＨ₂Ｏ及び０.０１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７.４ １３）以下の手順中、滅菌濾過したｄｄＨ₂Ｏの少量アリコートが必要となる
。これらのアリコートを作るために、キマックス（Kimax）１Ｌボトル１本分の
滅菌（オートクレーブにかけた）ｄｄＨ₂Ｏを準備し、それをフード内に置く。

【００９７】 １４）フード下で、空の滅菌キマックス（Kimax）１Ｌボトルに、滅菌ボトルト
ップフィルターとバキュームチューブを取り付ける。

【００９８】 １５）ｄｄＨ₂Ｏをフィルターを通してボトルに注ぐ。

【００９９】 １６）２５ｍＬ血清ピペットを用いて、滅菌濾過水の全量を滅菌５０ｍＬチュ
ーブに等分に取り分ける。

【０１００】 １７）蓋をきつく締め、チューブに“濾過したｄｄＨ₂Ｏ”及び日付をラベル
する。これらのアリコート群を室温で保存する―これらは、無菌操作が維持され
るのであれば無期限にもち、繰り返し使用することができる。

【０１０１】 １８）５０ｍＬの０.０１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７.４を、滅菌５０ｍＬコニカルチ
ューブにとり、全量を６０ｃｃシリンジチューブに注ぎ、滅菌２５ｍｍアクロデ
ィスク０.２μｍフィルターを取り付け、液をフィルターを通して滅菌５０ｍＬ
コニカルチューブに押し出す。

【０１０２】 １９）蓋をきつく締め、チューブに“滅菌ＰＢＳ”及び日付をラベルする。室
温で保存する―この溶液は、正しい無菌操作が維持されるのであれば長期間もち
、同一アリコートを繰り返し使用することができる。

【０１０３】 ２０）滅菌水の５０ｍＬアリコート２つを準備し、フード内に置く。

【０１０４】 ２１）１ｍＬ血清ピペットを用いて、上記２のアリコートのうちの１つから滅
菌水１ｍＬをとり、５ｍＬ丸底チューブに入れる。

【０１０５】 ２２）フードの外でＮ−アセチル−システイン６.３ｍｇを秤量する。

【０１０６】 ２３）粉末を段階７からの５ｍＬファルコン（Falcon）チューブ内の滅菌水１
ｍＬ量に注意深く注ぐ。

【０１０７】 ２４）全ての粉末が溶解するまでボルテックスする（これには約２分間かかる
）。

【０１０８】 ２５）フード内で、３ｃｃシリンジチューブを用いて、ＮＡＣ溶液を吸い上げ
、滅菌１３ｍｍアクロディスク０.２μｍフィルターを取り付け（滅菌アクロデ
ィスク１３；０.２μｍ；一回用；低タンパク質結合；非発熱性フィルター−ゲ
ルマン・サイエンシス（Gelman Sciencis）＃４４５４）、そして液をフィルタ
ーを通して別の滅菌５ｍＬファルコンチューブに押し出す。

【０１０９】 ２６）チューブに“ＮＡＣストック”とラベルし、フード内に残す―この溶液
は長持ちせず、使用するたびに新たに調製しなければならない。

【０１１０】 ２７）１００Ｘ ＮＡＣストックがこうして用意される。

【０１１１】 ２８）滅菌０.０１Ｍ ＰＢＳの５０ｍＬアリコートを準備し、フード内に置
く。

【０１１２】 ２９）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、１０ｍＬの滅菌０.０１Ｍ ＰＢＳを
滅菌１５ｍＬ遠心チューブに移す。

【０１１３】 ３０）チューブに蓋をし、それを秤（スケール）に置く。

【０１１４】 ３１）ＢＳＡ０.１ｇを秤量し、前の段階からの１５ｍＬチューブに注意深く
入れる。

【０１１５】 ３２）チューブにきつく蓋をし、３０秒間ボルテックスする。

【０１１６】 ３３）滅菌１０ｃｃシリンジチューブを準備し、滅菌１３ｍｍアクロディスク
０.２μｍフィルターを取り付け、プランジャーを外し、ＢＳＡ溶液をシリンジ
のボディに注ぎ、プランジャーを戻し、液をフィルターを通して別の滅菌１５ｍ
Ｌコニカルチューブに押し出す―これで１％ＢＳＡストック溶液の調製は完了す
る。

【０１１７】 ３４）フード下で、１ｍＬ血清ピペットを用いて、１％ＢＳＡストック溶液１
ｍＬずつを、１０本の２ｍＬビオストアバイアル群のそれぞれに取り分ける。

【０１１８】 ３５）バイアルにきつく蓋をし、“１％ＢＳＡ”及び日付をラベルする。

【０１１９】 ３６）１％ＢＳＡストックを−２０℃で保存する―この溶液は〜６カ月間もつ
。

【０１２０】 ３７）濃縮ＮＴ−３ストック溶液（ギフト）を入手し、ＰＢＳストック溶液の
１％ＢＳＡの１ｍＬアリコートを５〜１０個準備する（必要な数は、どの程度濃
縮されたＮＴ−３ストックが入手可能かによる）。

【０１２１】 ３８）１％ＢＳＡアリコート群を室温で５分間融解させる。

【０１２２】 ３９）マイクロピペットを用いて、９００μＬの１％ＢＳＡストックと、１０
０μＬの濃縮ＮＴ−３ストックとを、新しい２ｍＬビオストアバイアルに移す。

【０１２３】 ４０）この操作を、濃縮ＮＴ−３ストックが残っていなくなるまで繰り返す。

【０１２４】 ４１）バイアルにきつく蓋をし、“１００μｇ／ｍＬ ＮＴ−３”及び日付を
ラベルする。

【０１２５】 ４２）希釈したＮＴ−３ストックを−２０℃で保存する―このストックは〜６
カ月間もつ。

【０１２６】 ４３）ＣＮＴＦ粉末の１０μｇバイアル（これは、このままの量で直接シグマ
（Sigma）社から提供される）及び１％ＢＳＡストックの１ｍＬアリコートを得
る。

【０１２７】 ４４）１％ＢＳＡストックを室温で５分間融解させる。

【０１２８】 ４５）フード下で、マイクロピペットを用いて、４００μＬの１％ＢＳＡスト
ックをＣＮＴＦの１０μｇバイアル（これは上記会社から予め測定されて提供さ
れる）に加える。

【０１２９】 ４６）溶液を〜１分間、又は全ての粉末が溶解するまでボルテックスする。

【０１３０】 ４７）ＣＮＴＦストックがこうして用意される。このストックは必要な時にそ
の都度新たに作るのが普通であるが、多くのアリコートを一度に作り、−２０℃
で数カ月保存することが可能である。

【０１３１】 ４８）滅菌ｄｄＩ水の５０ｍＬアリコートを準備する。

【０１３２】 ４９）Ｈｅｐｅｓ粉末１１.９１５ｇを秤取し、空の滅菌５０ｍＬコニカルチ
ューブに注意深く入れる。

【０１３３】 ５０）ｄｄＩ水をアリコートからＨｅｐｅｓチューブに、５０ｍＬマークまで
注ぐ。

【０１３４】 ５１）全ての粉末が溶解するまでボルテックスする。これには３０分以上かか
る。

【０１３５】 ５２）チューブの残りの容量を５０ｍＬまでｄｄＩ水で満たす。

【０１３６】 ５３）１分間ボルテックスする。

【０１３７】 ５４）滅菌６０ｃｃシリンジチューブを準備し、滅菌２５ｍｍアクロディスク
０.２μｍフィルターを取り付け、プランジャーを外し、Ｈｅｐｅｓ溶液をシリ
ンジのボディーに注ぎ、プランジャーを元に戻し、液をフィルターを通して別の
滅菌５０ｍＬコニカルチューブに押し出す−これでＨｅｐｅｓストック溶液の調
製は完了する。

【０１３８】 ５５）チューブにきつく蓋をし、“Ｈｅｐｅｓストック”及び日付をラベルす
る。

【０１３９】 ５６）室温で保存する―無菌操作が維持されるのであれば、このアリコートを
繰り返し用いることができ、〜４カ月間はもつ。

【０１４０】 ５７）１本の２００ｍＭ Ｌ−グルタミンバイアルを入手する。

【０１４１】 ５８）滅菌ｄｄＩ水の５０ｍＬアリコートを準備する。

【０１４２】 ５９）フード下で、２１ゲージ針を取り付けた６０ｃｃ滅菌シリンジを、前の
段階からの５０ｍＬ滅菌水で満たす。

【０１４３】 ６０）アルミニウムキャップのタブを注意深く取り外し、ｄｄＩ水５０ｃｃを
ゆっくりとボトルに注入する。

【０１４４】 ６１）そのボトルを２、３回振とうして、ボトルの頂部及び側面から、残って
いる粉末を除去する。

【０１４５】 ６２）アルミニウム及びゴムストッパー蓋をボトルから注意深く除去する―こ
れは粉末又は液体を損失することなく行わなければならない。このストッパーは
無菌フード内に取っておく。

【０１４６】 ６３)ボトルの口をパラフィルムで覆い、３７℃の水浴中で５分間インキュベー
トする。

【０１４７】 ６４）フード下で、ゴムストッパー蓋を元に戻し、全ての粉末が溶解するまで
振とうする―溶液は完全にクリアで無色でなければならない。

【０１４８】 ６５）６０ｃｃ滅菌シリンジチューブをとり、滅菌２５ｍｍアクロディスク０
.２μｍフィルターを取り付け、プランジャーを外し、Ｌ−グルタミン溶液をシ
リンジのボディーに注ぎ、プランジャーを元に戻し、液をフィルターを通して滅
菌５０ｍＬコニカルチューブに押し出す−これでＬ−グルタミンストック溶液の
調製は完了する。

【０１４９】 ６６）マイクロピペットを用いて、Ｌ−グルタミンストック溶液５００μＬず
つを、０.７５ｍＬビオストアバイアル群に取り分ける。

【０１５０】 ６７）蓋をきつく締め、各バイアルに“２００ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔ”及び日付
をラベルする。

【０１５１】 ６８）−２０℃で保存する―このストック溶液は〜３カ月間もち、又、遮光さ
れている必要がある。

【０１５２】 ６９）使用直前に、このストックを３７℃の水浴中で５分間融解させ、保存中
に溶液から沈殿した溶質を全て再溶解するためにボルテックスしなければならな
い。

【０１５３】 胚性幹細胞誘導培地（ＥＳＩＭ）処方 手順上の注意：ＭＳ培地と同様に、ＥＳＩＭは、最終容量を正確に測定するた
めの容量分析を行わずに、１Ｌボトル中に作製する。この理由から、諸成分の容
量の測定が正確であり、培地のボトルの型が一致していることが重要である。又
、ＥＳＩＭを作製する際に、無菌操作を常に心掛けることが重要である。全ての
粉末をフードの外で同時に秤取し、各秤量ボート及びチューブに、それらに入れ
る物質名をラベルすることを薦める。

【０１５４】 ７２）ＮＣＳ（New Calf Serum（新生仔ウシ血清））１００ｍＬ及びＦＢＳ（
Fetal Bovine Serum（ウシ胎児血清））１００ｍＬを得る。

【０１５５】 ７３）上記血清を６０℃の水浴中に３０分間置き、血清中の補体を加熱不活化
する。

【０１５６】 ７４）このように水浴で不活性化している時間に、ＮＳ（Nucleoside Stock（
ヌクレオシドストック））を作製する。

【０１５７】 ７５）ＮＳの作製：全ての成分ヌクレオシド粉末をフード外で同時に秤取する
。 ａ）アデノシン ４０ｍｇ ｂ）グアノシン ４２.５ｍｇ ｃ）シチジン ３６.５ｍｇ ｄ）ウリジン ３６.５ｍｇ ｅ）チミジン １２ｍｇ ７６）予め秤量した全てのヌクレオシド粉末を滅菌５０ｍＬコニカルチューブ
に注意深く入れる。

【０１５８】 ７７）５０ｍＬの滅菌ｄｄＨ₂Ｏを、上記ヌクレオシド粉末を含む５０ｍＬチ
ューブに注ぐ。この量のストックは、５ＬのＥＳＩＭを作製するのに十分な量で
あり、無菌操作を維持するのであれば、繰り返して使用することができる。

【０１５９】 ７８）溶液を３７℃の水浴中に〜１５分間置き、溶質が完全に溶解するまで時
々振とうする。

【０１６０】 ７９）全溶液を滅菌６０ｃｃシリンジチューブに注ぎ、プランジャーを元に戻
し、２５ｍｍ滅菌アクロディスク０.２μｍフィルターを取り付ける。溶液を、
フィルターを通して別の滅菌５０ｍＬコニカルチューブに押し出す。

【０１６１】 ８０）“ＮＳ”及び日付をラベルする。このストックは、無菌操作が維持され
るのであれば６カ月間もち、繰り返し使用できる―しかし、ＮＳの各使用前に段
階７を繰り返す。

【０１６２】 ８１）ＭＳ処方中に作製された滅菌した空のキマックス（Kimax）１Ｌボトル
の１つをとる。

【０１６３】 ８２）１ＬのＤＭＥＭを準備し、上記空の滅菌１Ｌキマックスボトルに７９０
ｍＬ注ぐ。

【０１６４】 ８３）加熱不活化血清（ＮＣＳ、ＦＢＳ）を７９０ｍＬのＤＭＥＭを含む１Ｌ
キマックスに直接注ぐ。

【０１６５】 ８４）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、１０ｍＬのＮＳストックをＤＭＥＭ＋
血清溶液に加える。

【０１６６】 ８５）ボトルを手で振って溶液を混合する。

【０１６７】 ８６）５００ｍＬボトルトップフィルター及びバキュームチューブを、別の空
の滅菌キマックス１Ｌボトルに取り付ける。

【０１６８】 ８７）ＥＳＩＭ溶液をフィルターを通して第２のボトルに注ぐ。

【０１６９】 ８８）培地を含む新しいボトルに蓋をきつく締め、“ＥＳＩＭ”、日付及びあ
なたの頭文字をラベルし、４℃の冷蔵庫中に保存する。

【０１７０】 ８９）ＥＳＩＭはこうして使用のために用意される。これは、無菌操作が維持
されるのであれば、〜３０日間もち、繰り返し使用することができる。

【０１７１】 ＳＡＴＯ無血清培地の処方 手順上の注意：この手順は、ＳＡＴＯ無血清培地（ＥＢからオリゴスフェアを
作製するために使用する培養培地）を作製するための最後の処方である。

【０１７２】 ９１）ＳＡＴＯ血清フリー培地成分表に列挙されている全ての成分を、それら
の種々の保存場所から準備する。

【０１７３】 ９２）フード下で、２５ｍＬ血清ピペットを用いて、３７ｍＬのＤＭＥＭを滅
菌５０ｍＬコニカルチューブに移す。

【０１７４】 ９３）マイクロピペットを用いて、４００μＬの１００ｍＭ ＭＥＭピルビン
酸ナトリウムストックを、前の段階からのＤＭＥＭ溶液に移す。

【０１７５】 ９４）マイクロピペットを用いて、４００μＬのＳＡＴＯ１００Ｘストックを
前の段階からのＤＭＥＭ溶液に移す。

【０１７６】 ９５）マイクロピペットを用いて、４００μＬのＮ−アセチル−システインス
トックを、前の段階からのＤＭＥＭ溶液に移す。

【０１７７】 ９６）マイクロピペットを用いて、２０μＬのＮＴ−３ストックを、前の段階
からのＤＭＥＭ溶液に移す。

【０１７８】 ９７）マイクロピペットを用いて、３２μＬのＣＮＴＦストックを、前の段階
からのＤＭＥＭ溶液に移す。

【０１７９】 ９８）マイクロピペットを用いて、６００μＬのＨＥＰＥＳストックを、前の
段階からのＤＭＥＭに移す。

【０１８０】 ９９）マイクロピペットを用いて、４００μＬのＬ−グルタミンストックを、
前の段階からのＤＭＥＭに移す。

【０１８１】 １００）２５ｍＬ血清ピペットを用いて、３回均質化し、溶液を混合する。

【０１８２】 １０１）滅菌６０ｃｃシリンジを準備し、滅菌アクロディスクフィルターを取
り付け、プランジャーを外し、ＳＡＴＯ無血清溶液をシリンジのボディーに注ぎ
、プランジャーを元に戻し、液をフィルターを通して別の滅菌５０ｍＬコニカル
チューブに押し出す。

【０１８３】 １０２）“ＳＡＴＯ無血清”、日付、及びあなたの頭文字をラベルする。

【０１８４】 １０３）４℃で保存する―この培地は、無菌操作が維持されるのであれば〜１
４日間もち、繰り返し使用することができる。

【０１８５】 オリゴスフェアの処方 手順上の注意：特に記載がなければ、全手順を無菌フード内で、滅菌器具及び
チューブを用いて行うことが重要である。特に、反復使用が指示されていない限
り、各段階のために、新しい、滅菌された、血清ピペットを用いることを薦める
。遠心分離は一般にはフード内では行わないが、細胞が確実に無菌環境に保たれ
るように、チューブの蓋はこの手順中きつく閉めた状態を保っていなければなら
ない。全ての液体又はピペットは、いかなる場合もフラスコの頸部に触れさせて
はならない。なぜならば、フラスコのこの部分は汚染されている可能性があるか
らである。Ｔ２５フラスコ中の細胞を取り扱う場合、培地が上記頸部に触れるの
を避けるために、フラスコを、フラスコの後部に向かってわずかに傾斜したよう
に維持する。

【０１８６】 最後に、細胞をインキュベーター内に置く場合は、Ｔ２５フラスコの蓋をゆる
めることが重要である。これにより、インキュベーター内の空気がフラスコ内部
の気体と確実に平衡状態になる。逆に、それらをインキュベーターから取り出す
際には、蓋をきつくフラスコに締め、無菌環境を確実に保持しなければならない
。

【０１８７】 ゼラチンコートフラスコ １）オリゴスフェア手順開始の少なくとも６時間前に、ゼラチンコーティング
手順のためのＴ２５フラスコを１０本準備する。

【０１８８】 ２）４℃の冷蔵庫から２％滅菌ゼラチン溶液を準備し、溶液が室温、クリアそ
して均質になるまでフード下に置く。

【０１８９】 ３）フード下で、２５ｍＬ血清ピペットを用いて、２２.５ｍＬの滅菌ｄｄ（d
ouble-deionized（二重脱イオン））Ｈ₂Ｏを５０ｍＬコニカルチューブに移す。

【０１９０】 ４）５ｍＬ血清ピペットを用いて、２.５ｍＬの２％滅菌ゼラチン溶液を加え
る。これによって０.２％（１：９希釈）ゼラチン溶液を作製する。

【０１９１】 ５）２５ｍＬ血清ピペットを用いて、溶液を３回均質化し、混合する。

【０１９２】 ６）５ｍＬ血清ピペットを用いて、５ｍＬの０.２％ゼラチン溶液を各Ｔ２５
フラスコに加える。

【０１９３】 ７）蓋をきつく締め、室温に少なくとも６時間置く―最適なゼラチン接着のた
めには一晩放置するのが好ましい。ゼラチンコートフラスコは室温で数週間もつ
。そのため、このフラスコはその他の手順にも用いることができる。

【０１９４】 ８）注意：いかなるゼラチンコートフラスコも、用いる直前に蓋を取り、フラ
スコを傾けて液を片側に寄せる。ゼラチンで被覆した底をこすらないように注意
しながら液を全て吸い取る。

【０１９５】 最終的ＳＡＴＯ無血清培地の調製 ９）ＳＡＴＯ無血清培地（ＳＡＴＯ無血清培地の処方を参照）アリコートを４
℃の冷蔵庫からとり、溶液が室温になるまでフード下に置く（〜１５分）。

【０１９６】 １０）フード下で、１０ｍＬ血清ピペットを用いて、１０ｍＬのＳＡＴＯ無血
清培地を１５ｍＬコニカルチューブに移す。

【０１９７】 １１）残りのＳＡＴＯ無血清培地アリコートは、４℃の冷蔵庫に戻す。

【０１９８】 １２）マイクロピペットを用いて、１μＬの１００μｇ／ｍＬ ｂＦＧＦスト
ックを、１５ｍＬコニカルチューブ中のＳＡＴＯ無血清培地１０ｍＬに加える。

【０１９９】 １３）マイクロピペットを用いて、２μＬの１０μｇ／ｍＬ ＰＤＧＦストッ
クを、ＳＡＴＯ無血清＋ｂＦＧＦ溶液に加える。

【０２００】 １４）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、３回均質化し、溶液を混合する（これ
により、段階２８及び３１のためのＳＡＴＯ無血清＋ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦスト
ック溶液の調製が完了する―これは各使用の前に新たに調製しなければならない
）。ストックのこの量は、ＥＢの１ディッシュ上での第１日目のオリゴスフェア
手順を行うのに十分な量である。

【０２０１】 ＥＢの解離 １５）４℃の冷蔵庫から、ＭＳ（Media Stock（培地ストック））及びＥＳＩ
Ｍ（Embryonic Stem Cell Induction Medium（胚性幹細胞誘導培地））を準備し
、それらを、溶液が室温になるまでフード下に置く（〜１５分）。

【０２０２】 １６）フード下で、１０ｍＬ血清ピペットを用いて、ＥＢ（４−／４＋）を、
その培地全てと共に、１００ｍｍカナダペトリ皿（ここでＥＢが成長している）
から１５ｍＬコニカルチューブに移す。

【０２０３】 １７）５分間、ＥＢを重力によってチューブの底に沈殿させる。

【０２０４】 １８）上清培地をＥＢ層の直上まで吸い取る（ＥＢを吸い取らないように注意
する）。

【０２０５】 １９）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、沈殿したＥＢに１０ｍＬのＭＳを加え
る（これは細胞と共に残っている消耗した培地を希釈するために用いられる）。

【０２０６】 ２０）段階１７及び１８を繰り返す。

【０２０７】 ２１）５ｍＬ血清ピペットを用いて、ＥＤＴＡを含む０.２５％トリプシン２
ｍＬを、１５ｍＬチューブに加える。

【０２０８】 ２２）５％ＣＯ₂雰囲気、３７℃のインキュベーター中で６−８分間インキュベ
ートする（２分ごとに懸濁液を手でおだやかに揺すり、解離を助けるべきである
）。

【０２０９】 ２３）１０ｍＬ血清ピペットを用いて、１０ｍＬのＥＳＩＭ（ES Cell Induct
ion Medium（ＥＳ細胞誘導培地））を、トリプシン及び細胞の懸濁液に加える （これはトリプシンの活性を特定時点で止めるために用いられる）。

【０２１０】 ２４）ＭＳ及びＥＳＩＭボトルを４℃の冷蔵庫に戻す。

【０２１１】 ２５）８５０Ｇで５分間遠心分離する。

【０２１２】 ２６）遠心分離機が作動している間に、２つのＴ２５ゼラチンコートフラスコ
から液体を吸い取る（フラスコの底からゲル−コーティングをかき取らないよう
に注意する）。段階８を参照。

【０２１３】 ２７）遠心分離機から細胞を取り、フード下で上清培地を細胞層の直上まで吸
い取る。

【０２１４】 ２８）５ｍＬ血清ピペットを用いて、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦを含むＳＡＴＯ無
血清培地２ｍＬ（段階９−１４を参照）を、１５ｍＬコニカルチューブ中の細胞
に加える。

【０２１５】 ２９）細胞スラリーを通してマイクロピペット先端を静にかきまわす。死滅細
胞からの剥き出しのＤＮＡが、このピペット先端の端にくっつくはずであり、細
胞スラリーから持ち上げ外に出し、棄てることができる。

【０２１６】 ３０）綿栓をしたホウ珪酸ガラス製パスツールピペット（ゴム球が取り付けて
ある）を用いて、１０回均質化し、ＥＢを単一細胞懸濁液に解離させる。１０ｍ
Ｌ血清ピペットを用いて、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦを含むＳＡＴＯ無血清培地８ｍ
Ｌを加える。

【０２１７】

【０２１８】 本発明は、上述して説明及び例示した実施態様に制限されるものではなく、添
付の請求の範囲から逸脱することなく変更及び変形が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 移植の２週間後のＢｒｄＵラベル（標識化）されたＥＳ細胞由来細胞。長さ方
向断面における１ｍｍ区分あたりのＢｒｄＵラベルされた核の平均値±ＳＥＭ（
ｎ＝１１匹ラット、ラットあたり３断面）。

【図２】 ＥＳ細胞由来細胞の移植は、行動の回復を促進した。図２ａ：黒丸、ＥＳ細胞
移植群；白丸、ビヒクル処置群（ｎ＝１１／群、平均値±ＳＥＭ）。＊同時点に
おいて対照に対してＰ＜０.０５で有意差あり（テュキー試験（Tukey's test）
によるＡＮＯＶＡ（分散分析）反復測定）。図２ｂ：ＥＳ細胞（黒丸）、ビヒク
ル（白丸）、又は成体マウス新皮質細胞（黒ダイヤモンド型）の移植を比較する
同様な実験（ｎ＝６／群）。ＥＳ細胞移植群は、両対照群からＰ＜０.０５レベ
ルで異なっていた。矢印は移植を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オリゴデンドロサイト富化細胞培養物を製造する方法であっ
   て、多能性脊椎動物細胞を少なくとも５０％の予め条件づけられたオリゴデンド
   ロサイト培養培地中で培養することを含むことを特徴とする前記方法。
2. 【請求項２】 前記多能性細胞がＥＳ細胞であることを特徴とする請求項１
   の方法。
3. 【請求項３】 前記細胞が、４−／４＋ステージ胚子様体を得るように培養
   されたものであることを特徴とする請求項２の方法。
4. 【請求項４】 前記多能性脊椎動物細胞がマウス、ラット、ハムスター、イ
   ヌ、ネコ、サル及びヒトからなる群から選択される脊椎動物から得られることを
   特徴とする請求項１の方法。
5. 【請求項５】 前記細胞がレチノイン酸で処理されたものであることを特徴
   とする請求項２の方法。
6. 【請求項６】 少なくとも２０％の未熟及び成熟オリゴデンドロサイトを含
   むことを特徴とする神経細胞のin vitro分化培養物。
7. 【請求項７】 少なくとも５０％の未熟及び成熟オリゴデンドロサイトを含
   むことを特徴とする請求項６の培養物。
8. 【請求項８】 前記細胞がマウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、サル
   及びヒトからなる群から選択される脊椎動物から得られることを特徴とする請求
   項６の培養物。
9. 【請求項９】 多能性脊椎動物細胞を少なくとも５０％の予め条件づけられ
   たオリゴデンドロサイト培養培地中で培養することを含む方法によって製造され
   ることを特徴とする請求項６の培養物。
10. 【請求項１０】 脊髄変性の処置を必要とする患者において脊髄変性を処置
    する方法であって、 ａ）in vitro分化神経細胞を患者の脊髄の変性部位に移植する段階、及び ｂ）前記移植された細胞の増殖を許し、前記細胞の増殖が前記脊髄変性の改善
    又は回復をもたらす段階、 を含むことを特徴とする前記方法。
11. 【請求項１１】 前記in vitro分化神経細胞が少なくとも２０％の未熟及び
    成熟オリゴデンドロサイトを含むことを特徴とする請求項１０の方法。
12. 【請求項１２】 前記神経細胞が、多能性脊椎動物細胞を少なくとも５０％
    の予め条件づけられたオリゴデンドロサイト培養培地中で培養することによって
    調製されることを特徴とする請求項１０の方法。
13. 【請求項１３】 オリゴデンドロサイト富化細胞培養物をＥＳ細胞から製造
    する方法であって、 ａ）ＥＳ細胞から胚子様体を供給する段階、 ｂ）前記胚子様体を解離させて解離細胞を生成する段階、 ｃ）前記解離細胞を改変ＳＡＴＯ培地中で培養する段階、 ｄ）前記解離細胞をその中で培養しているフラスコを振とうし、主にオリゴデ
    ンドロサイトを含む、ゆるく付着している細胞を懸濁させる段階、 ｅ）前記懸濁細胞の一部分を、その部分とほぼ等量の改変ＳＡＴＯ培地を含む
    新しいフラスコに移す段階、及び ｆ）移した細胞を培養し、それによってオリゴデンドロサイト富化細胞培養物
    を製造する段階、 を含むことを特徴とする前記方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３の方法によって製造されるオリゴデンドロサイ
    ト富化細胞培養物。