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JP2003503034A - 核内ｐｐａｒレセプターを使用する発現調節システム - Google Patents

核内ｐｐａｒレセプターを使用する発現調節システム

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JP2003503034A
JP2003503034A JP2001505726A JP2001505726A JP2003503034A JP 2003503034 A JP2003503034 A JP 2003503034A JP 2001505726 A JP2001505726 A JP 2001505726A JP 2001505726 A JP2001505726 A JP 2001505726A JP 2003503034 A JP2003503034 A JP 2003503034A
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JP
Japan
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plasmid
ppar
promoter
pgl3
nucleic acid
Prior art date
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JP2001505726A
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English (en)
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ダルテイ，ラフアエル
クルゼ，ジヨエル
スタエル，バール
マフデイ，アブデレン
Original Assignee
アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明はトランスジーンの発現を薬理的に調節するための新規方法及び組成物に関する。本発明は特に、（ａ）ＰＰＡＲ応答エレメントと最小転写プロモーターを含む誘導性プロモーターの制御下に目的核酸を含む第１のエレメントと、（ｂ）転写プロモーターの制御下にＰＰＡＲをコードする核酸を含む第２のエレメントを含み、同時、別々又は時間的に間隔をあけて前記エレメントを使用する組成物に関する。本発明は実験、臨床、治療又は診断分野における前記組成物及び方法の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は生物学の分野に関する。本発明は特に遺伝子発現調節分野に関し、よ
り具体的にはトランスジーン発現の新規薬理的調節システムの調整と開発に関す
る。本発明は特にトランスジーンの転写を活性化するためのヒト由来構築物の使
用に基づく。従って、本発明は例えば筋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ
ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ核酸発現の有効な調節を可能にする新規組成物、構
築物及び方法に関する。本発明は例えば実験、臨床、治療又は診断分野に多数の
用途がある。
【０００２】 トランスジーンの発現レベル及び期間の調節は多くの用途に必要である。例え
ば、遺伝子治療ではトランスジーンから合成したタンパク質の比定量が治療の成
功に必要な場合がある。また、例えば増殖段階と生産段階を分けることが可能な
誘導発現システムを使用することにより組換えタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生
産を改善することができる。トランスジェニック動物の構築、遺伝子の効果又は
タンパク質のバイオアベイラビリティの検討等においても遺伝子発現の適切な調
節を利用して改善を加えることができる。
【０００３】 トランスジーンの転写プロモーター配列に結合する生体異種分子により活性化
される種々の人工転写レギュレーターが従来技術で考案されている。
【０００４】 これらのレギュレーターの第１の例は大腸菌のＬａｃリプレッサーと単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６のトランス活性化ドメインの融合により構築
された。これらのレギュレーターはイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）により活性化可能なものと、ＩＰＴＧにより不活化可能なものの２種類
がある（Ｂａｉｍ Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，
８８（１９９１）５０７２−５０７６；Ｌａｂｏｗ Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，１０（１９９０）３３４３−３３５６）。
【０００５】 大腸菌のＴｅｔリプレッサーとＨＳＶのＶＰ１６のトランス活性化ドメインの
融合により別のシステムも構築されている。これらのレギュレーターもテトラサ
イクリン又はその誘導体により活性化可能なものと、これらの同一分子により不
活化可能なものの２種類がある（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．とＢｕｊａｒｄ Ｈ．，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（１９９２）５５４７−５
５５１；Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８（１９９５）１７６６
−１７６９）。
【０００６】 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをヒトプ
ロゲステロンレセプターのリガンド結合ドメインとＨＳＶのＶＰ１６のトランス
活性化ドメインに融合することにより別のシステムも構築されており、この型は
ＲＵ４８６等のプロゲステロンアナログにより活性化される（Ｗａｎｇ Ｙ．ら
，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１（１９９４）８１８０
−８１８４）。ショウジョウバエエクジソンレセプターとＨＳＶのＶＰ１６のト
ランス活性化ドメインの融合体も記載されており、このシステムはエクジソンと
このステロイドホルモンのアナログにより活性化される（Ｎｏ Ｄ．ら，Ｐｒｏ
ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９３（１９９６）３３４６−３３５
１）。所定の免疫抑制分子（シクロスポリンＡ、ラパマイシン及びその誘導体）
が所定の細胞タンパク質と結合し易いことを利用したシステムもある。この場合
、転写レギュレーターは２個のタンパク質サブユニットから構成され、第１のサ
ブユニットはキメラＤＮＡ結合ドメインとヒトＦＫＢＰタンパク質３コピーの融
合により形成することができ、第２のサブユニットはヒトＦＲＡＰタンパク質の
ラパマイシン結合ドメインとヒトＮＦｋＢのｐ６５サブユニットのトランス活性
化ドメインの融合により形成することができる。この転写レギュレーターは２個
のサブユニットの二量化を可能にするラパマイシンにより活性化される（Ｒｉｖ
ｅｒａ Ｖ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２（１９９６）１０２８−１０３２）。
【０００７】 これらのシステムは組織によっては十分な調節レベルが得られるが、使用条件
を制限するいくつかの欠点がある。例えば、これらの転写レギュレーターはヒト
では異種タンパク質である。これらのレギュレーターは実際に細菌、ウイルス、
酵母又は昆虫に由来するタンパク質フラグメントから構成され、タンパク質ドメ
インがヒト起源の場合には、その結合によりヒトに異種の配列が形成される。従
って、これらのタンパク質ドメインは細胞毒性免疫反応を誘導し、異種転写レギ
ュレーターの制御下で目的遺伝子を発現する細胞を破壊し、トランスジーンの発
現を妨げかねない。このため、治療遺伝子を反復投与することが必要になり、特
に外傷性外科行為が必要な場合には重大な問題となり、特に治療遺伝子のベクタ
ーが初回注射で免疫反応を引起こすウイルスである場合には必ずしも有効ではな
い。更に、従来技術の調節システムで認められる発現レベルは必ずしも十分では
ない。
【０００８】 従って、ｉｎ ｖｉｖｏ使用に適合可能であり、種々の組織で使用することが
でき、活性化状態で高い発現レベルを確保する改善された発現調節システムが必
要である。本発明はこれらの問題を解決する。
【０００９】 本発明は実際にヒト由来アクチベーターを使用する調節システムに関する。そ
の結果、治療遺伝子の反復投与を回避できると思われる。
【００１０】 本発明は特にＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ペルオキシソームプロリフェレータ
ー活性化レセプター）を転写レギュレーターとして使用する改善された誘導性発
現システムに関する。肝特異的発現システムにおけるＰＰＲＥの使用は国際出願
ＷＯ９８／２１３４９に記載されている。本発明による改善システムは転写レギ
ュレーター（ヒトに由来し、従って本質的にヒトで非異種のＰＰＡＲタンパク質
）を生産することが可能になり、トランスジーンの発現を制御する誘導性プロモ
ーターは最小プロモーターとＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）から構成され
る。本発明のシステムはＰＰＡＲの特異的リガンドにより特に筋肉でｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ活性化可能である。更に、活性化後に得られるトラン
スジーン発現レベルはｈＣＭＶ−ＩＥプロモーター等の強力プロモーターと同等
である。
【００１１】 従って、本発明のシステムは高度な誘導、耐性（特にｉｎ ｖｉｖｏ使用の場
合）、効力及び使用条件の点で多数の利点がある。
【００１２】 従って、本発明はこのシステムを作製及び利用するための新規構築物、特にプ
ロモーター領域、発現カセット及びプラスミドに関する。本発明は遺伝子発現の
改善された制御を可能にする新規ＰＰＡＲ構築物と、これらの各種構築物の組合
せにも関する。本発明は更にこれらの方法及び組成物がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉ
ｎ ｖｉｖｏ発現の高度な制御及び調節を可能にすることを立証する。本発明は
本発明の構築物を含む細胞と、例えばＰＰＡＲリガンド化合物のスクリーニング
方法にも関する。
【００１３】 より具体的には、本発明の第１の目的は、 （ａ）ＰＰＡＲ応答エレメントと最小転写プロモーターを含む誘導性プロモー
ターの制御下に目的核酸を含む第１のエレメントと、 （ｂ）転写プロモーターの制御下にＰＰＡＲをコードする核酸を含む第２のエ
レメントを含み、同時、別々又は時間的に間隔をあけて前記エレメントを使用す
る組成物にある。
【００１４】 特定態様において、本発明の組成物は同様に同時、別々又は時間的に間隔をあ
けて使用するように（ｃ）ＰＰＡＲリガンドを更に含む。
【００１５】 転写プロモーターの制御下にレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）をコードする
核酸を含むエレメント（ｄ）を更に含むと有利である。
【００１６】 同時、別々又は時間的に間隔をあけて使用するという表現は、目的核酸の発現
の制御を可能にするために、エレメント（ａ）、（ｂ）、場合により（ｃ）及び
／又は（ｄ）を別々に製造し、別々にパッケージングし、逐次的に使用できるこ
とを意味する。一般にはエレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により（ｄ）を一
緒に製造及びパッケージングし、エレメント（ｃ）は別にパッケージングし、（
ａ）及び（ｂ）及び場合により（ｄ）と時間的に間隔をあけて使用し、これらの
各エレメントを細胞、組織、臓器等で組合せると、所望の発現調節効果が得られ
る。
【００１７】 この点で、本発明の組成物の１特定実施態様において、エレメント（ａ）及び
（ｂ）及び場合により（ｄ）は別個の遺伝子構築物に担持されている。
【００１８】 本発明の組成物の好ましい別の特定実施態様では、エレメント（ａ）及び（ｂ
）及び場合により（ｄ）は同一遺伝子構築物で結合している。従って、本発明は
目的物質とＰＰＡＲの発現を可能にする複合遺伝子構築物に関する。これらの構
築物は目的核酸の調節下の発現に必要な遺伝子エレメント全体を単独で含むので
特に有利である。
【００１９】 遺伝子構築物は種々の型及び／又は起源のものを利用でき、特にプラスミド、
エピソーム、染色体、ウイルス、ファージ等が挙げられる。遺伝子構築物はプラ
スミド又はウイルスベクターが好ましい。
【００２０】 エレメント（ａ）又は（ｂ）を別々に担持するプラスミドの例としては、例え
ば追って詳述するプラスミドＪｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３、ＪｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐ
ＧＬ３、ＤＲ１ｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３、ＤＲ１ｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３、Ｊ
ｘｎＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３、ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２又はＪｘ１０ＡＳ
−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３を挙げることができる。
【００２１】 エレメント（ａ）及び（ｂ）を結合したプラスミドの例としては、例えば追っ
て詳述するプラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−Ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２、ＳＶ−ｇ２
−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３、ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ
３又はｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３を挙げること
ができる。
【００２２】 ウイルスベクターの例としては、特に組換えアデノウイルス、組換えレトロウ
イルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクチンウイルス等を挙げることができ、
当業者に公知の方法により作製することができる。
【００２３】 遺伝子構築物の構成と構造については追って詳述する。
【００２４】 この点で、上述のように、エレメント（ａ）は少なくとも −ＰＰＡＲ応答エレメントと、 −最小転写プロモーター を含む誘導性プロモーターを含む。
【００２５】 ＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ，「Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ペルオキシソームプ
ロリフェレーター活性化レセプター」）はＰＰＡＲに結合することが可能な核酸
領域であり、その後、ＰＰＡＲの結合は隣接核酸領域へのシグナルを媒介するこ
とができる。従って、ＰＰＡＲ応答エレメントはＰＰＡＲと結合することが可能
な核酸領域である。本発明の実施にあたり、ＰＰＡＲ応答エレメントは特に１個
以上のＰＰＡＲ結合部位を含む。このような結合部位は例えば種々のヒトプロモ
ーター（例えばアポリポタンパク質ＡＩＩ遺伝子）におけるもの等が従来技術に
記載されている。このような部位を人工的に構築し、後述するようにそのＰＰＲ
Ｅ特性を試験してもよい。
【００２６】 １特定実施態様において、ＰＰＡＲ応答エレメントは配列：
【００２７】
【化１】
【００２８】 又はこの配列の機能的変異体の１個以上の部位を含む。配列番号１の配列はヒ
トａｐｏＡＩＩプロモーターのＪ領域（ヌクレオチド−７３４から−７１６まで
）に対応する。
【００２９】 別の特定実施態様において、ＰＰＡＲ応答エレメントは配列：
【００３０】
【化２】
【００３１】 又はこの配列の機能的変異体の１個以上の部位を含む。配列番号５の配列はＤ
Ｒ１コンセンサス領域に対応する。
【００３２】 機能的変異体なる用語は上述したようなＰＰＲＥ特性、即ち特にＰＰＡＲに結
合する性質を維持する任意変異配列を意味する。変異は該当配列中の１箇所以上
のヌクレオチドの付加、突然変異、欠失及び／又は置換とすることができる。こ
れらの変異は分子生物学の常法により導入することができ、例えば特に部位特異
的突然変異誘発又はより実際的には合成器で配列の人工合成により導入できる。
一般に、変異体は指定初期配列の残基の少なくとも５０％を保存する。変異体は
該当配列中の５ヌクレオチド未満が変異していることがより好ましい。その後、
こうして得られた変異体のＰＰＲＥ活性を試験する。この特性は種々の方法によ
り確認することができ、特に、 （ｉ）試験配列を好ましくは無細胞試験でＰＰＡＲとレチノイドＸレセプター
（ＲＸＲ）に接触させ、（例えばゲル上泳動遅延により）複合体の形成を検出す
る方法、 （ｉｉ）最小プロモーターとリポーター遺伝子を含む発現カセットに試験配列
を挿入し、カセットを細胞に導入し、ＰＰＡＲとＰＰＡＲリガンドの存在下と不
在下にリポーター遺伝子の発現を検出（場合により定量）する方法、 （ｉｉｉ）例えば核酸とタンパク質の相互作用を検出することが可能な当業者
に公知の他の任意方法を使用することができる。
【００３３】 変異体は例えば上記（ｉｉ）で測定した活性が好ましくは配列番号１又は５の
配列の部位で測定した活性の５０％以上、より好ましくは７５％以上であるとき
に本発明の意味で機能的であるとみなす。本発明の意味でのＰＰＡＲ結合部位の
機能的変異体は例えば参考資料として本明細書の一部とするＪｕｇｅ−Ａｕｂｒ
ｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）２５２５２）及びＮａｋｓ
ｈａｔｒｉら（ＮＡＲ ２６（１９９８）２４９１）に記載されている。
【００３４】 レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）はＲＸＲα、ＲＸＲβ及びＲＸＲγの３種
の遺伝子によりコードされ、これらの遺伝子の単離と配列については文献に記載
されている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ＤＪら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４
５，２２４−２２９；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ＤＪら（１９９２），Ｇｅｎｅ
ｓ Ｄｅｖ ６，３２９−３４４）。エレメント（ｄ）はヒトＲＸＲαをコード
するものが好ましい。
【００３５】 ＰＰＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量化については２件の論文を参照することができる
（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ＤＪとＥｖａｎｓ ＲＭ（１９９５），Ｃｅｌｌ
８３，８４１−８５０及びＷｉｌｓｏｎ ＴＭとＷａｈｌｉ Ｗ（１９９７），
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１，２３５−２４１）。Ｓｃｈｕｌｍａｎ ＩＧら（１９９８）の論文、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，３４８３−
３４９４はＰＰＡＲγ／ＲＸＲαヘテロ二量体によるトランス活性化について記
載している。
【００３６】 エレメント（ｄ）の使用はエレメント（ｂ）の活性に相乗効果がある。
【００３７】 上述のように、本発明の組成物においてＰＰＡＲ応答エレメントは複数のＰＰ
ＡＲ結合部位を含むことができる。このような部位は同一部位の反復でもよいし
、異なる部位の組合せでもよいが、同一部位の反復が好ましい。特に、応答エレ
メントは３０個まで、好ましくは３〜２０個、より好ましくは５〜１５個の結合
部位を含む。本発明の１好適実施態様は１０〜１５個の結合部位を含む構築物で
あり、実施例に示す結果は実際に特に筋細胞における誘導と発現レベルに関して
このような構築物の有利な特性を実証している。
【００３８】 本発明の組成物のエレメント（ａ）により誘導可能なプロモーターを作製する
ためには、ＰＰＡＲ応答エレメントを最小転写プロモーターに結合する。最小プ
ロモーターは基線活性が弱いか又はゼロであり、転写アクチベーターの存在下（
活性化されたＰＰＡＲとＰＰＲＥエレメントの相互作用）で増加可能な転写プロ
モーターである。従って、最小プロモーター哺乳動物細胞で天然では弱いプロモ
ーター、即ち顕著な生物学的効果を得るために非毒性及び／又は不十分な発現を
生じるプロモーターとすることができる。最小プロモーターは転写活性に非必須
の領域を欠失させることにより天然プロモーターから作製した構築物が有利であ
る。従って、転写開始コドンを中心とする一般に１６０ヌクレオチド未満の寸法
のＴＡＴボックスから主に構成されるプロモーターが好ましい。従って、最小プ
ロモーターは強弱ウイルス、細胞プロモーターから作製することができ、例えば
ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子プロモーター、ＣＭＶ極初
期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）遺伝子
プロモーター、各種骨格筋アクチンアイソフォーム遺伝子プロモーター、デスミ
ン遺伝子プロモーター、ビメンチン遺伝子プロモーター、ミオシンＬ鎖又はＨ鎖
遺伝子プロモーター等が挙げられる。最小プロモーターの具体例は例えばＣＭＶ
のヌクレオチド−５４から＋４８まで又はＴＫプロモーターのヌクレオチド−１
０５から＋５６までである。当然のことながら、当業者はこれらのプロモーター
の任意変異体又は他のプロモーターからの類似構築物を構築することができ、こ
れらも本発明の範囲で使用することができる。
【００３９】 最小プロモーター（Ｐｍｉｎ）、ＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）及び目
的核酸（ＮＡ）はエレメント（ａ）で機能的に構成され、即ち最小プロモーター
が目的核酸の発現を制御し、その活性がＰＰＲＥエレメントにより調節されるよ
うに構成される。従って、一般にこれらの領域は５’→３’方向にＰＰＲＥ−Ｐ
ｍｉｎ−ＡＮの順に配置される。しかし、当業者は本発明の範囲内で他の任意機
能的構成を予想することができる。
【００４０】 更に、上記各機能的ドメインは相互に直接結合してもよいし、エレメント（ａ
）のプロモーターの調節特性を有意に変えないヌクレオチドにより分離してもよ
い。このようなヌクレオチドは例えばクローニング段階からの機能的に中性の残
基（ＰＣＲ末端、制限部位等）とすることができる。これらのヌクレオチドは更
に本発明のシステムに改良された特徴又は性能を付与することが可能な生物学的
性質をもつことができる（自家遺伝子アンプリファイアー、特定組織アンプリフ
ァイアー、サイレンサー、イントロン、スプライシング部位等）。この点で、本
発明の１特定実施態様では、誘導性プロモーターは更に増幅性領域を含む。この
ような領域は目的核酸の発現レベルを増加できると有利である。このような増幅
性領域（Ｅ）は最小プロモーターの３’側で最小プロモーターと目的核酸の間に
以下のスキーム（５’→３’）：ＰＰＲＥ−Ｐｍｉｎ−Ｅ−ＡＮに従って配置さ
れていることが好ましい。
【００４１】 他方、本発明の構築物において最小プロモーターとＰＰＡＲ応答エレメントは
同一方向（即ち転写方向）に配置してもよいし、逆方向（即ちＰＰＡＲ応答エレ
メントがＰｍｉｎプロモーターによる転写に対してアンチセンス方向）に配置し
てもよい。実施例に示すように、これらの２種の実施態様はｉｎ ｖｉｖｏと同
様にｉｎ ｖｉｔｒｏ発現調節を有効に制御することができる。
【００４２】 上述のように、本発明の組成物のエレメント（ｂ）は少なくとも −ＰＰＡＲをコードする核酸を、 −第２の転写プロモーターの制御下に含む。
【００４３】 ＰＰＡＲは核内ホルモンレセプタースーパーファミリーに属し、ＰＰＡＲα、
ＰＰＡＲδ（ＮＵＣ−１又はＰＰＡＲβとも言う）及びＰＰＡＲγの異なる３群
に分けられる。多数のヒトＰＰＡＲの単離と配列が文献に記載されている（特に
Ｓｈｅｒ Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（１９９３）５５９８−５
６０４；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ．ら，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，５１（１９９４）１５７−１６６；Ｆａｊａｓ Ｌ．
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１９９７）１８７７９−１８７８９；
Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１９９７）
８０７１−８０７６；Ｓｃｈｍｉｄｔ Ａ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
．６（１９９２）１６３４−１６４１参照）。更に、国際出願ＷＯ９９／０５１
６１に記載されているように、ＰＰＡＲγのプロモーターは最近クローニングさ
れている。
【００４４】 本発明の１好適態様では、ＰＰＡＲをコードする核酸はヒトＰＰＡＲ、特にＰ
ＰＡＲα又はＰＰＡＲγをコードする。実施例に示す結果から実際に明らかなよ
うに、これらの分子を使用すると特に筋細胞で本発明のシステムに高度な調節及
び発現レベルを確保することができる。
【００４５】 第１の実施態様によると、前記ＰＰＡＲは天然形態即ち天然分子に対して一次
構造が変化していない形態のＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγである。
【００４６】 別の実施態様によると、前記ＰＰＡＲは複数のリガンド結合部位を含む改変Ｐ
ＰＡＲである。
【００４７】 この点で、本発明は複数のリガンド結合部位を含む任意改変ＰＰＡＲに関する
。特に、前記ＰＰＡＲはＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγ、より好ましくはＰＰＡＲγ
である。本発明の改変ＰＰＡＲは２〜５個のリガンド結合部位を含むことが好ま
しく、２〜４個がより好ましい。特に、前記ＰＰＡＲはリガンド結合に関与する
Ｅ及びＦドメインの２〜５コピーを含むＰＰＡＲである。ＰＰＡＲタンパク質は
種々のドメインを含み、リガンド非依存性トランス活性化領域を含むＮ末端Ａ／
Ｂドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）であるＣドメイン、ヒンジ領域であ
るＤドメイン、及びリガンド依存性トランス活性化領域を含むＥ／Ｆドメインを
含む。Ｅ／Ｆドメインはリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とも呼ばれる（特にＳ
ｃｈｏｏｎｊａｎｓ Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１
３０２（１９９６）９３−１０９参照）。Ｅ／Ｆドメインの範囲はＰＰＡＲによ
り異なる。例えばヒトＰＰＡＲγ２アイソフォームを使用する場合には、Ｅ／Ｆ
ドメインはアミノ酸２８４〜アミノ酸５０５である。本発明は、複数の反復Ｅ及
びＦドメインを含む改変ＰＰＡＲを構築することが可能であり、これらの改変Ｐ
ＰＡＲが機能的で改善されたＰＰＡＲリガンド誘導性をもつことを示すに至った
。従って、このような構築物は本発明の１実施態様に相当し、本発明の特定目的
の１つである。
【００４８】 本発明の改変ＰＰＡＲの典型例は２個のリガンド結合部位（即ち２個のＥ及び
Ｆドメイン）を含むＰＰＡＲγである。ＰＰＡＲγ２γ２のタンパク質配列を配
列番号２４の配列に示す。
【００４９】
【化３】
【００５０】 本発明はＰＰＡＲ型活性（ＢＲＬ４９６５３等のＰＰＡＲリガンドの存在下に
ＰＰＲＥ配列を含むプロモーターを活性化する能力）を維持する配列番号２４の
配列の任意変異体にも関する。変異体は任意突然変異体、欠失体及び／又は１個
以上の付加残基を含むポリペプチドに及ぶ。配列番号２４の配列の残基の少なく
とも８０％を維持する変異体が好ましい。
【００５１】 更に、本発明はこのような改変ＰＰＡＲをコードする任意核酸にも関する。前
記核酸はＤＮＡ（特に合成又は半合成ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）でもＲＮＡでもよい
。このＤＮＡは当業者に公知の分子生物学の常法（合成、連結、バンクスクリー
ニング等）により構築することができる。配列番号２４の配列のポリペプチドを
コードする配列を含むか又は配列番号２４のポリペプチドをコードする配列とハ
イブリダイズし、ＰＰＡＲ型活性をもつポリペプチドをコードする任意核酸が有
利である。更に、このＤＮＡは例えば転写プロモーター及び／又はターミネータ
ーを含むことができる。
【００５２】 ＰＰＡＲをコードする核酸の発現を制御する第２の転写プロモーターは哺乳動
物細胞、特にヒト細胞で機能的な任意強弱プロモーターとすることができ、遍在
的でも選択的でもよいし、構成的でも調節性でもよい。家畜（即ち哺乳動物、特
にヒト遺伝子）細胞プロモーター、ウイルス、細菌、昆虫、植物プロモーターと
することができ天然でも合成でもよいし、単純でも複合でもよい。このエレメン
ト（ｂ）に適したプロモーターの例は特にウイルスプロモーター（ＳＶ４０ウイ
ルス極初期プロモーター、ＣＭＶウイルス極初期プロモーター、レトロウイルス
ＬＴＲ、ヘルペスウイルスＴＫプロモーター）又は細胞プロモーター（ＰＧＫ、
アルブミン、ＥＦ１α、又は筋肉で強く発現される遺伝子のプロモーター、例え
ば筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）遺伝子プロモーター、各種骨格筋アクチンア
イソフォーム遺伝子プロモーター、デスミン遺伝子プロモーター、ビメンチン遺
伝子プロモーター、ミオシンＬ鎖又はＨ鎖遺伝子プロモーター）である。更に、
プロモーターは１個以上のエンハンサー領域（例えばβグロビン遺伝子イントロ
ン２エンハンサー領域、ＣＭＶウイルスの極初期遺伝子エンハンサー領域、ＥＦ
１αエンハンサー領域）、サイレンサー領域、組織特異性を付与する領域（例え
ば特定組織プロモーターから単離した領域、例えば筋クレアチンキナーゼ（ＭＣ
Ｋ）遺伝子プロモーター、各種骨格筋アクチンアイソフォーム遺伝子プロモータ
ー、デスミン遺伝子プロモーター、ビメンチン遺伝子プロモーター、ミオシンＬ
鎖又はＨ鎖遺伝子プロモーター）もしくは調節可能な特性の導入又は例えば活性
に非必須の領域の欠失により改変することができる。このようなプロモーターは
エレメント（ｄ）に含まれるＲＸＲを発現させるために使用することができる。
第２のプロモーターの好適例はウイルスプロモーター、特にＳＶ４０ウイルス初
期プロモーターとＣＭＶ極初期プロモーター又はそれらの誘導体である。
【００５３】 更に、特定実施態様では、エレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により（ｄ）
を同一遺伝子構築物で結合する場合には、追って詳述するように（エレメント（
ｂ）の）第２の転写プロモーターとエレメント（ａ）の誘導性プロモーターと、
場合によりエレメント（ｄ）のプロモーターを一体にし、特に双方向の共通プロ
モーター領域のみを形成することができる。
【００５４】 この点で、本発明の別の目的は上述のようにエレメント（ａ）とエレメント（
ｂ）と場合によりエレメント（ｄ）を含むベクターにある。
【００５５】 本発明の第１の変形例によると、エレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により
（ｄ）はベクターで同一方向に配置されている。このような変形例は例えばプラ
スミドＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３（図１７）である。
【００５６】 本発明の別の変形例によると、エレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により（
ｄ）はベクターで逆方向に配置されている。このような変形例は例えば図１６、
１８及び１９に示すプラスミドである。この変形態様ではエレメント（ａ）の誘
導性プロモーターとエレメント（ｂ）の転写プロモーターをベクターで結合し、
双方向調節性プロモーターを形成することがより好ましい。このような実施態様
は例えば図１８及び１９に示すプラスミドである。
【００５７】 この点で、本発明の特定目的はＰＰＡＲをコードする第１の核酸と、前記第１
の核酸の発現を制御する第１の最小転写プロモーターと、１個以上のＰＰＡＲ応
答エレメントと、第２の最小転写プロモーターと、前記第２の最小転写プロモー
ターの制御下にあり、目的物質をコードする第２の核酸を５’→３’方向に含む
ことを特徴とするベクターにある。
【００５８】 この型の構築物は同一プラスミドで２種の核酸を同時に発現させることができ
、ＰＰＡＲとそのリガンドにより２種の核酸を調節することによりこの発現を増
幅できるので有利である。
【００５９】 本発明の組成物における目的核酸の発現は一般にＰＰＡＲリガンド（エレメン
ト（ｃ））の存在下に活性化される。この点では、使用するＰＰＡＲに応じて天
然又は合成等の各種リガンドを使用することができる。
【００６０】 従って、ＰＰＡＲαのアクチベーターリガンドは例えばフィブリン酸とそのア
ナログ等のフィブレートである。フィブリン酸アナログとしてはゲムフィブロジ
ル（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １１４（１）（１９９５）６１）、ベザ
フィブレート（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２１（１９９５）１０２５）、シプロフ
ィブレート（ＢＣＥ＆Ｍ ９（４）（１９９５）８２５）、クロフィブレート（
Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙ １１（１９９４）３０１）、フェノフィブレート（Ｆ
ｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９５）、クリノフィブレート（Ｋｉｄｎ
ｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．４４（６）（１９９３）１３５２）、ピリ
ニキシン酸（Ｗｙ−１４，６４３）又は５，８，１１，１４−エイコサテトラノ
ン酸（ＥＴＹＡ）を挙げることができる。これらの種々の化合物はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ又はｉｎ ｉｎｖｏ生物学的及び／又は薬理的使用に適合可能である。
【００６１】 ＰＰＡＲγのアクチベーターリガンドは天然リガンドと合成リガンドから選択
することができる。天然リガンドとしては、脂肪酸とエイコサノイド（例えばリ
ノール酸、リノレン酸、９−ＨＯＤＥ、５−ＨＯＤＥ）を挙げることができ、合
成リガンドとしてはチアゾリジンジオン類、特にロシグリタゾン（ＢＲＬ４９６
５３）、ピオグリタゾン又はトログリタゾン（例えばＫｒｅｙ Ｇ．ら，Ｍｏｌ
．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１１（１９９７）７７９−７９１又はＫｌｉｅｗｅ
ｒ Ｓ．とＷｉｌｌｓｏｎ Ｔ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎ．Ｄｅｖ
．８（１９９８）５７６−５８１参照）又は化合物ＲＧ１２５２５を挙げること
ができる。
【００６２】 更に、本発明の組成物は複数のＰＰＡＲアクチベーターを組合せて含むことが
でき、特にフィブレート又はフィブレートアナログとレチノイドの組合せとする
ことができる。
【００６３】 本発明は目的核酸を細胞でｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させるた
めの上記組成物又はベクターの使用にも関する。
【００６４】 この点で、核酸は目的物質（ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等
）をコードする任意核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）とすることができる。目的物質は農
産加工、治療、ワクチン、マーカー等を目的とするものが挙げられる。
【００６５】 本発明は目的核酸を細胞でｉｎ ｖｉｖｏ発現させるための物質を製造するた
めの上記組成物又はベクターの使用にも関する。
【００６６】 本発明は更に核酸を細胞で調節下に発現させるための方法として、前記細胞を
上記組成物又はベクターと接触させる方法にも関する。
【００６７】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ使用のためには、細胞を種々のプロトコ
ールに従って本発明の組成物又はベクターと接触させることができる。例えば培
養細胞を本発明のエレメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）及び場合により（ｄ）と
共に直接インキュベートすることができ、例えばリガンド（ｃ）の存在下にエレ
メント（ａ）及び（ｂ）を含むベクターと共にインキュベートする。あるいは、
細胞をまず（特に同一ベクターで結合した）エレメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ
）及び場合により（ｄ）と共にインキュベートした後、第２段階で（培養及び場
合により改変細胞の選択後に）エレメント（ｃ）を加えてもよい。後者型のプロ
トコールは例えば培養（又は細胞増殖）段階を核酸発現段階から分離することが
できる。これらの実験は適当な任意装置及び培地で実施することができるが、滅
菌条件下にプレート、ボックス、フラスコで実施することが好ましい。細胞、ベ
クター及びリガンドの量は実施例に記載する情報と一般知識に基づいて当業者が
容易に決定することができる。
【００６８】 ｉｎ ｖｉｖｏ使用の場合には、エレメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）及び場
合により（ｄ）の投与により同時、別々又は時間的に間隔をあけて細胞（又は臓
器、組織等）をｉｎ ｖｉｖｏ接触させる。この点では、場合により独自の遺伝
子構築物形態のエレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により（ｄ）を一般に非経
口経路、特に筋肉内、静脈内、皮下、皮内、腫瘍内又は定位法により投与する。
投与法の選択は所期用途、標的組織及び／又はトランスジーンによりコードされ
る目的物質種により決定することができる。この投与のために、本発明の組成物
は細胞トランスフェクションを助長する任意物質（カチオンポリマー、脂質等）
を含むことができる。特定態様では、組成物を筋肉内経路で投与し、遺伝子構築
物を「裸の」核酸形態即ちトランスフェクション剤を加えない形態で使用する。
【００６９】 また、エレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合により（ｄ）をウイルスベクター
により導入する場合にも付加トランスフェクション剤は不要である。
【００７０】 実施例に示すように、リガンド（ｃ）はエレメント（ａ）及び（ｂ）及び場合
により（ｄ）の前、同時、後のいずれに投与してもよい。
【００７１】 この点で、リガンドの投与は例えば経口、肛門、静脈内、腹膜組織内又は筋肉
内経路で実施することができる。
【００７２】 使用量は文献に記載されているｉｎ ｖｉｖｏデータに基づいて当業者が決定
することができる。例えば、非水溶性形態の場合、ＢＲＬ４９６５３等のリガン
ドの典型用量は５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば３０ｍｇ／ｋｇであり、少なくとも
約１５μｇ／ｍｌに近い血漿濃度が得られる。バイオアベイラビリティのより高
い水溶性形態のリガンド（例えばＢＲＬ４９６５３のマレイン酸塩）のほうが典
型用量は少なく、一般に５ｍｇ／ｋｇ未満、例えば０．０１〜１ｍｇ／ｋｇであ
る。これらの用量は当然のことながら使用する構築物、使用するリガンド及び所
望用途と効果に応じて当業者が決定することができる。一般に、実施例に示す結
果から明らかなように、本発明の組成物は通常使用されているよりも低用量のリ
ガンドを使用して調節下の強いｉｎ ｖｉｖｏ発現が得られるという利点がある
。更に、リガンドの反復使用を実施してもよいが、実施例に示す結果によるとリ
ガンドの１回投与後に強い発現が得られる。
【００７３】 一般に、ベクターの使用量は所望用途に応じて０．０１〜１０００μｇ、又は
それ以上とすることができる。
【００７４】 本発明は種々の細胞、組織又は臓器で遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現させるために使用することができる。特に、哺乳動
物、好ましくはヒト細胞、組織又は臓器を対象とすることができる。例えば筋細
胞（又は筋肉）、肝細胞（又は肝臓）、心臓細胞（又は心臓、動脈もしくは血管
壁）、神経細胞（又は脳、脊髄等）又は腫瘍細胞（又は腫瘍）を挙げることがで
きる。
【００７５】 本発明の構築物、組成物及び方法は筋細胞（又は筋肉）で核酸を調節下にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ発現させるために使用するこ
とが好ましい。実施例に示す結果から明らかなように、本発明はこの種の細胞で
ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで特に有利である。
【００７６】 本発明は上記組成物又はベクターと接触させることにより改変された任意細胞
にも関する。
【００７７】 本発明は目的核酸がＰＰＡＲリガンドを（特に筋細胞又は筋肉で）ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングするためのリポータ
ー遺伝子（例えばルシフェラーゼ又は分泌アルカリホスファターゼ）である上記
組成物、ベクター又は細胞の使用にも関する。この点で、本発明はＰＰＡＲリガ
ンドの同定方法として、上記細胞を試験分子（又は組成物）と接触させ、目的核
酸（好ましくはリポーター遺伝子）の発現を検出する方法にも関する。更に、発
現を試験化合物の不在下又は参照リガンドの存在下で観察される発現と比較し、
試験化合物の活性を評価してもよい。
【００７８】 本発明は前臨床試験又はバイオアベイラビリティ、標識等の試験に有用なトラ
ンスジェニック動物、特に非ヒト哺乳動物の構築のための上記組成物又はベクタ
ーの使用にも関する。
【００７９】 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、以下の実施例は例示に過
ぎず、発明を限定するものではない。
【００８０】 図面の説明 図１：プラスミドＦＴＫｐＧＬ３の模式図。
【００８１】 図２：プラスミドＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図。
【００８２】 図３：プラスミドＪｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図。
【００８３】 図４：プラスミドＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図。
【００８４】 図５：プラスミドＤＲ１ｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図。
【００８５】 図６：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェク
ションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＦＴ
ＫｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｂ）、又はＪｘ３ＡＳ−Ｔ
Ｋ−ｐＧＬ３（ｃ）、又はＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｄ）、又はＤＲ１ｘ
３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｅ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ
５−ｈＰＰＡＲｇ２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同
時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐ
ｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【００８６】 図７：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェク
ションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＦＴ
ＫｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｂ）、又はＪｘ３ＡＳ−Ｔ
Ｋ−ｐＧＬ３（ｃ）、又はＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｄ）、又はＤＲ１ｘ
３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｅ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ
５−ｈＰＰＡＲａ（Ｋｏｚ）と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０
ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌ
ａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎ
ｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【００８７】 図８：プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３の模式図。
【００８８】 図９：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェク
ションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＪｘ
５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３（ｂ）１０
ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２と、（ｉｉｉ）
プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性
プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ
活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性
を表す。
【００８９】 図１０：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェ
クションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＪ
ｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと、（ｉｉ）プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰ
ＡＲｇ２ １０ｎｇと、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同
時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐ
ｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【００９０】 図１１：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェ
クションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＪ
ｘｎＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと、（ｉｉ）プラスミドｐＳＧ５−ｈＰ
ＰＡＲｇ２ １０ｎｇ（ａ）又は５０ｎｇ（ｂ）と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲ
Ｌ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの
活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準
化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【００９１】 図１２：プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の模式図。
【００９２】 図１３：転写レギュレーターｈＰＰＡＲｇ２及びｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の比較。
マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）に（ｉ）プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧ
Ｌ３ １０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２（ａ
）又はｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌ
ｌ ２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅ
ｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈ
ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。（ｃ）：プラスミ
ドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２又はプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２で得
られたＢＲＬ４９６５３誘導係数。この誘導係数はＢＲＬ４９６５３の存在下の
活性をＤＭＳＯの存在下の活性で割ることにより計算した。
【００９３】 図１４：プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３の模式図。
【００９４】 図１５：マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェ
クションにより評価した誘導性プロモーターの活性。細胞に（ｉ）プラスミドＪ
ｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧ
Ｌ３（ｂ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２
ｇ２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェ
クトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの
ルシフェラーゼ活性を表す。
【００９５】 図１６：プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２の模式図。
【００９６】 図１７：プラスミドＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３の模式図。
【００９７】 図１８：プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の
模式図。
【００９８】 図１９：プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ
３の模式図。
【００９９】 図２０：誘導性システムの各種態様のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較。マウス筋芽細胞
（Ｃ２Ｃ１２）にシステムの各態様で同モル数の誘導性発現カセットをトランス
フェクトした。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫを使用することにより得られ
たｈＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性の百分率として結果を表す。ＢＲＬ４９６
５３誘導係数はＢＲＬ４９６５３の存在下の活性をＤＭＳＯの存在下の活性で割
ることにより計算した。１＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２＋Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐ
ＧＬ３；２＝Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２；３＝ｐＳＧ５−ｈＰ
ＰＡＲｇ２ｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；４＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲ
ｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；５＝ＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｇＧＬ
３；６＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３；７＝ｈＰＰＡ
Ｒｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；８＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭ
Ｖ−Ｊｘ１５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；９＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ２０
ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３。
【０１００】 図２１：リガンドＢＲＬ４９６５３及びＲＧ１２５２５のｉｎ ｖｉｔｒｏ比
較。マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）に（ｉ）（ａ）に示す発現カセットのプラス
ミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと（
ｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ １０ｎｇをトランスフェクトした。誘導性
プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ
活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性
を表す。
【０１０１】 図２２：誘導性システムの各種態様のｉｎ ｖｉｖｏ比較。Ｃ５７ＢＩ／６マ
ウス（各群６頭）の左右両側の頭蓋脛骨にシステムの各態様で同モル数の誘導性
発現カセットを注射した。その後、各筋肉に電気導入した。処理動物は毎日強制
栄養によりＢＲＬ４９６５３ ３０ｍｇ／ｋｇを投与した。ＤＮＡ注射から４日
後に動物を殺し、筋肉を採取してルシフェラーゼ活性を測定した。１＝ｐＣＭＶ
−ｌｅａｄＴＫ；２＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧ
Ｌ３；３＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；
４＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３。
【０１０２】 図２３：各種誘導プロトコールとＢＲＬ４９６５３のｉｎ ｖｉｖｏ比較。Ｃ
５７ＢＩ／６マウス（各群６頭）の左右両側の頭蓋脛骨に（ａ）に示す発現カセ
ットのプラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３
１μｇを含むＤＮＡ１０μｇを注射した。各種誘導プロトコールで得られた活性
をパネル（ｂ）にまとめた。
【０１０３】 図２４：プラスミドｐＲＤＡ０２の模式図。
【０１０４】 図２５：誘導性システムでで得られたｉｎ ｖｉｖｏ誘導動態。（Ａ）１０頭
のＣ５７ＢＩ／６マウスの左右両側の頭蓋脛骨にプラスミドｐＲＤＡ０２ ３ｍ
ｇとプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ３ｍｇを含むＤＮＡ混合物を注射し
た。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から４日後、次いで３９日後に
強制栄養によりＢＲＬ４９６５３ ３０ｍｇ／ｋｇを動物に投与した。各時点で
ヘパリン採血し、Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）キット（Ｔｒｏｐｉ
ｘ，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して
分泌アルカリホスファターゼ（ｈＳｅＡＰ）の血漿中酵素活性を測定した。（Ｂ
）Ｃ５７ＢＩ／６マウス（各群１０頭２群）の左右両側の頭蓋脛骨にプラスミド
ｐＲＤＡ０２ ３ｍｇとプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ３ｍｇを含むＤ
ＮＡ混合物を注射した。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から４日後
に強制栄養によりＢＲＬ４９６５３を１回（３０ｍｇ／ｋｇ）又は５日間毎日１
回ずつ（３０ｍｇ／ｋｇ）動物に投与した。各時点でヘパリン採血し、“Ｐｈｏ
ｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ”（登録商標）キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してｈＳｅ
ＡＰの血漿中酵素活性を測定した。記載する結果（誘導係数）は指定日に測定し
たｈＳｅＡＰの活性と４日目に得られた活性の比に対応する。
【０１０５】 図２６：各種ＰＰＡＲｇリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較とその１種の用量効
果の検討。Ｃ５７ＢＩ／６マウス（各群５頭）の左右両側の頭蓋脛骨にプラスミ
ドｐＲＤＡ０２ ５ｍｇとプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ５ｍｇを含む
ＤＮＡ混合物を注射した。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から６日
後（Ａ）又は１０日後（Ｂ）に強制栄養により各種ＰＰＡＲｇリガンド（Ａ；Ｂ
ＲＬ４９６５３、Ａｃｔｏｓ（登録商標）（武田薬品）及びＡｖａｎｄｉａ（登
録商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ））又は各種用量のＢＲＬ４
９６５３（Ｂ）を動物に投与した。各時点でヘパリン採血し、“Ｐｈｏｓｐｈａ
−Ｌｉｇｈｔ”キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してｈＳｅＡＰの血漿中酵素活性
を測定した。記載する結果（誘導係数）は指定日に測定したｈＳｅＡＰの活性と
６日目（Ａ）又は１０日目（Ｂ）に得られた活性の比に対応する。
【０１０６】 図２７：プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦＡ１６５の模式図。
【０１０７】 材料と方法 プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離
、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、塩類溶媒中の
プラスミドＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈殿、大腸菌形質転換等の
分子生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に
記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．，１９８９）。
【０１０８】 各種プロモーター領域のクローニングに使用したプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓ
ｉｃとプラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌは市販品である（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）。プラスミドｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐＳＬ３０１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）も市販品である。発現プラスミド
ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２（Ｆａｊａｓ Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２７２（１９９７）１８７７９−１８７８９）及びｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲａ（Ｋ
ｏｚ）（Ｇｅｒｖｏｉｓ Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１３（１
９９９）４００−４０９）の構築については既に記載されている。
【０１０９】 プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫの構築にについても１９９８年９月２５日
付け特許出願ＦＲ９８／１２００００及び特許出願ＵＳ ＳＮ６０／１２３，２
９８（仮出願）に既に記載されている。
【０１１０】 このプラスミドは以下のように構築する。Ｔａｎａｋａら（Ｃｅｌｌ，６０（
１９９０）３７５−３８６）により既に記載されている発現ベクターｐＣＧＮは
ヘマグルチニンのエピトープをコードする配列の上流でＨＳＶのｔｋ遺伝子の「
リーダー」（＋５１／＋１０１）に融合したＣＭＶプロモーター（−５２２／＋
７２）を含む。プラスミドｐＧＣＮ（１０ｎｇ）をＰＣＲ増幅用鋳型として使用
した。使用したプライマーは以下の通りである。
【０１１１】 −プライマー６７１８：
【０１１２】
【化４】
【０１１３】 このプライマーは−５２２位（ｐＣＧＮのＥｃｏＲＩ部位から８ヌクレオチド
下流）でＣＭＶプロモーターとハイブリダイズする。
【０１１４】 −プライマー６７１９：
【０１１５】
【化５】
【０１１６】 このプライマーはｔｋ「リーダー」の１０１位までハイブリダイズする。最初
の太字のヌクレオチドＧは以下に説明するようにｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＮｃｏ
Ｉ部位を復元するために用いられる。
【０１１７】 こうして得られたＰＣＲフラグメントを精製後、Ｔ４ファージのポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄｓ Ｂｉｏｌａｂｓ）でリン酸化する。
同時にベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＮｃｏＩで直鎖化し
、精製後、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｈｅｉｍ）で処理し、ＮｃｏＩ部位を充填する。このベクターを次にアルカリホ
スファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）で脱リン酸化した後、
リン酸化ＰＣＲフラグメントの挿入に使用する。こうして、プライマー６７１９
のグアノシン（Ｇ）はＣＭＶ−ｔｋリーダーフラグメントの５’部分（プライマ
ー６７１８、ＣＭＶの−５２２位）がｐＧＬ３−ＢａｓｉｃのＨｉｎｄＩＩＩ部
位の下流に配置され、その３’末端（プライマー６７１９、ｔｋリーダー）がｐ
ＧＬ３−ＢａｓｉｃのＮｃｏＩ部位（ルシフェラーゼの最初のＡＴＧ）に連結さ
れる場合のみにＮｃｏＩ部位を復元することができる。得られたプラスミドをｐ
ＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫと呼ぶ。
【０１１８】 ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅はＤ
ＮＡサーマルサイクラー（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
）を製造業者の指示に従って使用することにより実施することができる。
【０１１９】 大腸菌細胞へのプラスミドＤＮＡのエレクトロポレーションはエレクトロポレ
ーター（Ｂｉｏ−Ｒａｂ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施す
ることができる。
【０１２０】 ヌクレオチド配列の確認はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販さ
れているキットを製造業者の指示に従って使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３
−５４６７）に開発された方法により実施することができる。
【０１２１】 マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ
（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で培養す
る。培養は湿潤雰囲気で５％ＣＯ２分圧下に３７℃インキュベーターで実施する
。
【０１２２】 トランスフェクションは２４穴プレートで実施し、各トランスフェクションを
３回ずつ実施する。トランスフェクションの２４時間前に細胞をＤＭＥＭ（登録
商標）培地に３×４１０細胞／ウェルの割合で播種する。ウェル毎に１５０ｍＭ
ＮａＣｌと５０ｍＭ重炭酸塩を加えたＤＭＥＭ（登録商標）培地（終容量２０
μｌ）でプラスミドＤＮＡ５００ｎｇ（該当プラスミドとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＩＩ ＳＫ＋プラスミドを合わせて５００ｎｇ）をカチオン脂質ＲＰＲ１２
０５３５Ｂ（ＷＯ９７／１８１８５）と６ｎｍｏｌ脂質／μｇＤＮＡの割合で混
合する。周囲温度で２０分後にＤＮＡ／脂質混合物２０μｌをＦＢＳの不在下に
細胞と２時間接触させる。次に、夫々１０％又は２％の終濃度が得られるように
ＦＢＳ又はＵＬＴＲＯＳＥＲ（登録商標）（ＢｉｏＳｅｐｒａ Ｉｎｃ．）を培
地に加える。ＦＢＳ又はＵＬＴＲＯＳＥＲ（登録商標）と同時にＤＭＳＯに溶か
したＰＰＡＲリガンドも培地に加える。トランスフェクションから４８時間後に
培地を捨て、細胞をＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）
で２回濯ぐ。次に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓ
ｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）を製造業者の指示に従って使用してＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ
のルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラー
ゼ活性を測定する。
【０１２３】 ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入実験は６週齢雌Ｃ５７ＢＩ／６マウスで実施する。
動物にケタミン（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）／Ｘｙ
ｌａｚｉｎｅ（Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａ、終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）混合物２
５０μｌを腹膜組織内投与して麻酔する。その後、各頭蓋脛骨筋に合計量１０μ
ｇのＤＮＡを１回注射する。その後、各脚に電場をかける（周波数１Ｈｚ、２５
０Ｖ／ｃｍで２０ｍｓパルス４回）。全実験期間中、１％（ｗ／ｖ）カルボキシ
セルロースに加えたＢＲＬ４９６５３（ＳｍｉｔｈＣｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ
）３０ｍｇ／ｋｇ又は１％カルボキシセルロース単独を強制栄養により動物に毎
朝投与する。遺伝子導入から４日後に動物を殺し、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ
（登録商標）チューブ（ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．）でＰＬＢ（登録商標）溶解
用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に筋肉を採取する。Ｆａ
ｓｔＰｒｅｐ（登録商標）装置（ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．）を６．５ｍ／ｓで
２５秒間使用して筋肉を粉砕し、ルシフェラーゼを抽出できるようにする。次に
、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）キット（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を製造業者の指示に従って使用してＰｈ
ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を測定する。
【０１２４】 実施例 実施例１：ＰＰＡＲ誘導性プロモーターと前記プロモーターを含む発現プラス
ミドの構築 １．１．プラスミドＦＴＫｐＧＬ３ 鋳型としてプラスミドｐＢＬＣＡＴ２（Ｌｕｃｋｏｗ Ｂ．とＳｃｈｕｔｚ
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１９８７）５４９０）を
使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１２５】
【化６】
【０１２６】 及び
【０１２７】
【化７】
【０１２８】 を使用することにより、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）のＴＫ遺伝子
のプロモーターの一部に対応し、転写開始部位に対して−１０５位から＋５６位
までのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。このフラグメントをＢｇｌＩＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、予めＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化しておい
たプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃにクローニングし、プラスミドＦＴＫｐＧＬ
３を得た。このプラスミドの模式図を図１に示す。
【０１２９】 １．２．プラスミドＪｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ 鋳型としてプラスミドＪ３ＴＫｐＧＬ３（Ｖｕ−Ｄａｃ Ｎ．ら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６（１９９５）７４１−７５０）を使用し、プライマー
としてオリゴヌクレオチド：
【０１３０】
【化８】
【０１３１】 及び
【０１３２】
【化９】
【０１３３】 を使用することにより、ヒトＡｐｏＡ−ＩＩ遺伝子のプロモーターのＪ部位を１
個以上含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。このフラグメントをＸｈｏＩ
とＳｐｅＩで消化した後、予めＸｈｏＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミド
ＦＴＫｐＧＬ３にＴＫ最小プロモーターの転写方向（Ｓ）にクローニングし、存
在するＪ部位数に応じてプラスミドＪｘ１Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３、Ｊｘ２Ｓ−ＴＫ
−ｐＧＬ３及びＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。プラスミドＪｘ３Ｓ−ＴＫ−
ｐＧＬ３の模式図を図２に示す。
【０１３４】 プラスミドＪ３ＴＫｐＧＬ３とプライマーとしてオリゴヌクレオチド３ＲＤＡ
３７及び４ＲＤＡ４８を使用することによりＰＣＲ増幅し、ＸｈｏＩとＳｐｅＩ
で消化したＤＮＡフラグメントを同様に予めＸｈｏＩとＮｈｅＩで消化しておい
たプラスミドＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３にクローニングし、存在するＪ部位数に
応じてプラスミドＪｘ４Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３、Ｊｘ５Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＪ
ｘ６Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。
【０１３５】 １．３．プラスミドＪｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ プラスミドＪｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３は誘導性プロモーターに存在するＪ部
位の方向がプラスミドＪｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３と異なる。鋳型としてプラスミ
ドＪ３ＴＫｐＧＬ３を使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド３ＲＤＡ３
７及び４ＲＤＡ４８を使用することにより、ヒトＡｐｏＡ−ＩＩ遺伝子のプロモ
ーターのＪ部位を１個以上含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。このフラ
グメントをＳａｌＩとＮｈｅＩで消化した後、予めＸｈｏＩとＮｈｅＩで消化し
ておいたプラスミドＦＴＫｐＧＬ３にＴＫ最小プロモーターの逆転写方向（ＡＳ
）にクローニングし、存在するＪ部位数に応じてプラスミドＪｘ１ＡＳ−ＴＫ−
ｐＧＬ３、Ｊｘ２ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＪｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た
。プラスミドＪｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を図３に示す。
【０１３６】 プラスミドＪ３ＴＫｐＧＬ３とプライマーとしてオリゴヌクレオチド３ＲＤＡ
３７及び４ＲＤＡ４８を使用することによりＰＣＲ増幅し、ＫｐｎＩとＳｐｅＩ
で消化したＤＮＡフラグメントを同様に予めＫｐｎＩとＮｈｅＩで消化しておい
たプラスミドＪｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３にアンチセンス（ＡＳ）方向にクロー
ニングし、存在するＪ部位数に応じてプラスミドＪｘ４ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３及
びＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。
【０１３７】 １．４．プラスミドＤＲ１ｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ このプラスミドはＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）としてコンセンサスＤ
Ｒ１と呼ぶコンセンサス配列：
【０１３８】
【化１０】
【０１３９】 を含む。プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１４０】
【化１１】
【０１４１】 及び
【０１４２】
【化１２】
【０１４３】 を使用することにより、１個以上のコンセンサスＤＲ１部位を含むＤＮＡフラグ
メントをＰＣＲ増幅した。このフラグメントをＸｈｏＩとＳｐｅＩで消化した後
、予めＸｈｏＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミドＦＴＫｐＧＬ３にセンス
方向にクローニングし、存在するコンセンサスＤＲ１部位数に応じてプラスミド
ＤＲ１ｘ２Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。プラ
スミドＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を図４に示す。
【０１４４】 オリゴヌクレオチド１ＲＤＡ６９及び２ＲＤＡ６４を使用することによりＰＣ
Ｒ増幅し、ＸｈｏＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡフラグメントを同様に予めＸｈ
ｏＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミドＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３にク
ローニングし、存在するコンセンサスＤＲ１部位数に応じてプラスミドＤＲ１ｘ
５Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３、ＤＲ１ｘ６Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＤＲ１ｘ７Ｓ−ＴＫ
−ｐＧＬ３を得た。
【０１４５】 １．５．プラスミドＤＲ１ｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ プラスミドＤＲ１ｘｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３は誘導性プロモーターに存在する
コンセンサスＤＲ１部位の方向がプラスミドＤＲ１ｘｎＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３と異
なる。プライマーとしてオリゴヌクレオチド１ＲＤＡ６９及び２ＲＤＡ６４を使
用することにより、１個以上のコンセンサスＤＲ１部位を含むＤＮＡフラグメン
トをＰＣＲ増幅した。このフラグメントをＳａｌＩとＮｈｅＩで消化した後、予
めＸｈｏＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミドＦＴＫｐＧＬ３にアンチセン
ス方向にクローニングし、存在するコンセンサスＤＲ１部位数に応じてプラスミ
ドＤＲ１ｘ２ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＤＲ１ｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た
。プラスミドＤＲ１ｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を図５に示す。
【０１４６】 プライマーとしてオリゴヌクレオチド１ＲＤＡ６９及び２ＲＤＡ６４を使用す
ることによりＰＣＲ増幅し、ＫｐｎＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡフラグメント
を同様に予めＫｐｎＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミドＤＲ１ｘ３ＡＳ−
ＴＫ−ｐＧＬ３にクローニングし、存在するコンセンサスＤＲ１部位数に応じて
プラスミドＤＲ１ｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３及びＤＲ１ｘ６ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ
３を得た。
【０１４７】 実施例２：各種応答エレメントに対するＰＰＡＲの特異性 ２．１．ｈＰＰＡＲｇ２を使用するシステム ｈＰＰＡＲｇ２を転写レギュレーターとして使用することにより誘導可能なプ
ロモーターの活性をマウス筋芽細胞で一過性トランスフェクションにより評価し
た（図６）。その結果、使用する応答エレメント（ＰＰＲＥ）によってｈＰＰＡ
Ｒｇ２リガンド（ＢＲＬ４９６５３）による誘導と活性化後の最終活性は異なる
ことが判明した。最良結果はＪ部位をＰＰＲＥとして使用することにより得られ
た。更に、ＰＰＲＥの方向も重要である。Ｊ部位の場合にはＡＳ方向のほうが好
ましい（パネルｃ）。
【０１４８】 ２．２．ｈＰＰＡＲａを使用するシステム ｈＰＰＡＲａを転写レギュレーターとして使用することにより得られた結果を
図７にまとめる。ｈＰＰＡＲｇ２と異なり、ｈＰＰＡＲａの最良ＰＰＲＥはコン
センサスＤＲ１である（パネルｄ及びｅ）。
【０１４９】 従って、これらの結果から明らかなように、（１）本発明のプラスミドは機能
的であり、（２）誘導性システムで選択するＰＰＡＲに応じて転写レギュレータ
ーに最適なＰＰＲＥを選択することが重要である。この選択はリガンドの存在に
よる誘導係数だけでなく、誘導後に到達する活性レベルにも影響し得る。当然の
ことながら、他のＰＰＲＥを本発明のシステムで使用してもよい。
【０１５０】 実施例３：ＨＳＶ１−ＴＫ最小プロモーター以外の最小プロモーター（例えば
ｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーター）を含むＰＰＡＲにより誘導可能なプロモータ
ーの構築 ３．１．ｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーターを含むプラスミドの構築 鋳型としてプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、プライマーと
してオリゴヌクレオチド：
【０１５１】
【化１３】
【０１５２】 及び
【０１５３】
【化１４】
【０１５４】 を使用することにより、（転写開始部位に対して−５４位から＋４８位までの）
ｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーターを含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。
このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩで消化した後、予めＨｉｎｄＩ
ＩＩとＢｇｌＩＩで消化しておいたプラスミドＦＴＫｐＧＬ３にクローニングし
、プラスミドＦＣＭＶｐＧＬ３を得た。
【０１５５】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３をＢｇｌＩＩとＮｈｅＩで消化し、Ｊ
部位５コピーを含む１７９ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントを単離した
。このフラグメントを予めＢｇｌＩＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラスミドＦ
ＣＭＶｐＧＬ３に挿入し、プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３を得た。プ
ラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３の模式図を図８に示す。
【０１５６】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３をＳｐｈＩとＮｈｅＩで消化し、Ｊ
部位５コピーとｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーターとルシフェラーゼをコードする
遺伝子の５’部分を含む９８２ｂｐのＳｐｈＩ−ＮｈｅＩフラグメントを単離し
た。このフラグメントを予めＳｐｈＩとＳｐｅＩで消化しておいたプラスミドＪ
ｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３に挿入し、プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧ
Ｌ３を得た。同一ストラテジーに従い、プラスミドＪｘ１５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧ
Ｌ３及びＪｘ２０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３も得た。
【０１５７】 ３．２．ｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーターを含むプラスミドの活性 誘導性システムで使用可能な最小プロモーターの比較を一過性トランスフェク
ションにより実施した。図９にまとめた結果から明らかなように、誘導後の最終
活性は最小プロモーターによって２倍の開きがある。これらの結果から特に、試
験条件ではＣＭＶプロモーターのほうが高い活性を生じると思われる。当然のこ
とながら、ＴＡＴＡボックスを含まないプロモーター等の他の最小プロモーター
も利用できる。
【０１５８】 実施例４：誘導性プロモーターに存在する応答エレメント数の重要性 誘導性プロモーターに存在する最適ＰＰＲＥ数を一過性トランスフェクション
により検討した。図１０に示す結果から明らかなように、ＰＰＲＥコピー数が多
いほどリガンド誘導係数と誘導活性は高い。しかし、この数が多すぎると、試験
に存在するｈＰＰＡＲｇ２の量に関係なく誘導係数と誘導活性はいずれも低下す
る（図１１）。最適ＰＰＲＥ数は１０〜１５であると思われる。
【０１５９】 実施例５：ＰＰＡＲリガンドにより強力誘導可能な転写レギュレーターの構築 ５．１．リガンド結合ドメイン２コピーを含む転写レギュレーターの構築。プ
ラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の構築。
【０１６０】 鋳型としてプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２を使用し、プライマーとして
オリゴヌクレオチド：
【０１６１】
【化１５】
【０１６２】 及び
【０１６３】
【化１６】
【０１６４】 を使用することにより、ＦドメインのＣ末端部分をコードするｈＰＰＡＲｇ２の
相補的ＤＮＡの領域を含むＤＮＡフラグメント（Ａと称する）をＰＣＲ増幅した
。鋳型としてプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２を使用し、プライマーとして
オリゴヌクレオチド：
【０１６５】
【化１７】
【０１６６】 及び
【０１６７】
【化１８】
【０１６８】 を使用することにより、Ｅ及びＦドメインをコードするｈＰＰＡＲｇ２の相補的
ＤＮＡの領域を含むＤＮＡフラグメント（Ｂと称する）をＰＣＲ増幅した。Ｓａ
ｃＩとＭｌｕＩで消化したフラグメントＡとＭｌｕＩとＸｂａＩで消化したフラ
グメントＢを予めＳａｃＩとＸｂａＩで消化しておいたプラスミドｐＳＧ５−ｈ
ＰＰＡＲｇ２に同時にクローニングし、プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ
２を得た。このプラスミドはその模式図を図１２に示すようにＥ及びＦドメイン
２コピー即ち２個のリガンド結合ドメインを含む転写レギュレーター（ｈＰＰＡ
Ｒｇ２ｇ２と称する）をコードする相補的ＤＮＡを含む。
【０１６９】 ＰＰＡＲγ２γ２の完全配列を以下に示す（配列番号２４）。
【０１７０】
【化１９】
【０１７１】 Ｅ及びＦドメインを含むＰＰＡＲγ２γ２のＣ末端部分の配列を以下に示す（
配列番号２５）。
【０１７２】
【化２０】
【０１７３】 ５．２．プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の活性 図１３に示す結果から明らかなように、ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２を転写レギュレー
ターとして使用するほうが誘導活性は低いが（図１３ａ及びｂ）、リガンド誘導
係数はこのレギュレーターのほうが著しく大きい（図１３ｃ）。２種の転写レギ
ュレーター間の差は、存在するレギュレーターの量に関係なくｈＰＰＡＲｇ２ｇ
２のほうがリガンド不在下のシステムのバックグラウンドが小さいという事実に
より説明される。他方、ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２は量が増すにつれて誘導活性も高く
なるが、ｈＰＰＡＲｇ２を使用するシステムではそうではなく、飽和すると思わ
れる。
【０１７４】 従って、第２のリガンド結合ドメインの存在（ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２）はより高
いリガンド誘導性を転写レギュレーターに付与する。
【０１７５】 実施例６：誘導性プロモーターの最終活性の増加 ６．１．ｈＥＦ１ａのイントロンを含む誘導性発現カセットの構築。プラスミ
ドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３の構築 プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１７６】
【化２１】
【０１７７】 及び
【０１７８】
【化２２】
【０１７９】 を使用することにより、（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｅ０２６２７、転写開始
部位に対して＋１６位から＋９８４位までの）ｈＥＦ１ａをコードする遺伝子の
最初のイントロンを含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。このフラグメン
トをＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩで消化した後、予めＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩで
消化しておいたプラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３にクローニングし、
プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３を得た。プラスミドＪｘ１０
ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３の模式図を図１４に示す。
【０１８０】 ６．２．プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３の活性 システムの最終活性を増加する目的で、ｈＥＦ１ａ遺伝子の最初のイントロン
に配置されたエンハンサー配列を誘導性プロモーターの近傍にクローニングした
。図１５に示す結果から明らかなように、エンハンサー領域の存在は転写レギュ
レーターの使用量に関係なく、システムの誘導活性を増加する。
【０１８１】 実施例７：転写レギュレーターの発現カセットと誘導性発現カセットを同時に
含むプラスミドの構築 ７．１．プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２ プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲａ（Ｋｏｚ）をＭｌｕＩとＳｃａＩで消化し
、ｈＰＰＡＲａの相補的ＤＮＡの３’領域を含む１２２９ｂｐのＭｌｕＩ−Ｓｃ
ａＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＭｌｕＩとＳｍａＩで消
化しておいたプラスミドｐＳＬ３０１に挿入し、プラスミドｐＳＬ−３’ｈＰＰ
ＡＲａを得た。
【０１８２】 プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲａ（Ｋｏｚ）をＳａｌＩとＭｌｕＩで消化し
、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターとｈＰＰＡＲａの相補的ＤＮＡの５’領
域を含む１４０６ｂｐのＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントを単離した。このフラ
グメントを予めＸｈｏＩとＭｌｕＩで消化しておいたプラスミドｐＳＬ−３’ｈ
ＰＰＡＲａに挿入し、プラスミドｐＳＬ−ｈＰＰＡＲａを得た。
【０１８３】 プラスミドｐＳＬ−ｈＰＰＡＲａをＳｐｅＩとＳａｌＩで消化し、ＳＶ４０ウ
イルスの初期プロモーターとｈＰＰＡＲａの相補的ＤＮＡを含む２６６４ｂｐの
ＳｐｅＩ−ＳａｌＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＳｐｅＩ
とＳａｌＩで消化しておいたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋プラスミド
に挿入し、プラスミドｐＢＳ−ｈＰＰＡＲａを得た。
【０１８４】 プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２をＡｖｒＩＩとＳａｃＩで消化し、ｈＰ
ＰＡＲｇ２の相補的ＤＮＡの５’領域を含む２０７０ｂｐのＡｖｒＩＩ−Ｓａｃ
Ｉフラグメント（Ｃと称する）を単離した。鋳型としてプラスミドｐＳＧ５−ｈ
ＰＰＡＲｇ２を使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１８５】
【化２３】
【０１８６】 及び
【０１８７】
【化２４】
【０１８８】 を使用することにより、ｈＰＰＡＲｇ２の相補的ＤＮＡの３’領域を含むＤＮＡ
フラグメント（Ｄと称する）をＰＣＲ増幅した。ＳａｃＩとＳａｌＩで消化した
フラグメントＣとフラグメントＤを予めＡｖｒＩＩとＳａｌＩで消化しておいた
プラスミドｐＢＳ−ｈＰＰＡＲａに同時にクローニングし、プラスミドｐＢＳ−
ｈＰＰＡＲｇ２を得た。
【０１８９】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３をＫｐｎＩとＳａｌＩで消化し、誘導
性プロモーターの制御下にｌｕｃ＋遺伝子を含む２３２４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｓａ
ｌＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＫｐｎＩとＳａｌＩで消
化しておいたプラスミドｐＢＳ−ｈＰＰＡＲｇ２に挿入し、プラスミドＪｘ５Ａ
Ｓ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２を得た。プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕ
ｃ−ｈＰＰＡＲｇ２の模式図を図１６に示す。
【０１９０】 ７．２．プラスミドＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３ プラスミドｐＢＳ−ｈＰＰＡＲｇ２をＮｏｔＩとＳａｌＩで消化し、ＳＶ４０
の初期プロモーターの制御下にｈＰＰＡＲｇ２の相補的ＤＮＡを含む２６２２ｂ
ｐのＮｏｔＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｅと称する）を単離した。鋳型としてプ
ラスミドＦＴＫ−ｐＧＬ３を使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１９１】
【化２５】
【０１９２】 及び
【０１９３】
【化２６】
【０１９４】 を使用することにより、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を含むＤＮＡフ
ラグメント（Ｆと称する）をＰＣＲ増幅した。ＳａｌＩとＮｈｅＩで消化したフ
ラグメントＥとフラグメントＦを予めＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラ
スミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３に同時にクローニングし、プラスミドＳ
Ｖ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３を得た。プラスミドＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−
ｐＧＬ３の模式図を図１７に示す。
【０１９５】 ７．３．プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ 鋳型としてプラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２を使用し、
プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０１９６】
【化２７】
【０１９７】 及び
【０１９８】
【化２８】
【０１９９】 を使用することにより、ｈＰＰＡＲｇ２の相補的ＤＮＡを含むＤＮＡフラグメン
ト（Ｇと称する）をＰＣＲ増幅した。鋳型としてプラスミドｐＣＭＶβを使用し
、プライマーとしてオリゴヌクレオチド：
【０２００】
【化２９】
【０２０１】 及び
【０２０２】
【化３０】
【０２０３】 を使用することにより、（転写開始部位に対して−５４位から＋４８位までの）
ｈＣＭＶ−ＩＥ最小プロモーターを含むＤＮＡフラグメント（Ｈと称する）をＰ
ＣＲ増幅した。ＫｐｎＩとＸｈｏＩで消化したフラグメントＧとＸｈｏＩとＮｈ
ｅＩで消化したフラグメントＨを予めＫｐｎＩとＮｈｅＩで消化しておいたプラ
スミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３に同時にクローニングし、プラスミドｈＰＰ
ＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３を得た。プラスミドｈＰＰＡＲ
ｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を図１８に示す。
【０２０４】 ７．４．プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−ＪｘｎＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３をＮｈｅＩとＳｐｈＩで消化し、誘
導性プロモーターの制御下にｌｕｃ＋遺伝子の５’領域を含む９８２ｂｐのＮｈ
ｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＳｐｅＩとＳ
ｐｈＩで消化しておいたプラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ
−ｐＧＬ３に挿入し、プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭ
Ｖ−ｐＧＬ３を得た。プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭ
Ｖ−ｐＧＬ３の模式図を図１９に示す。
【０２０５】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３をＮｈｅＩとＳｐｈＩで消化し、誘
導性プロモーターの制御下にｌｕｃ＋遺伝子の５’領域を含む９８２ｂｐのＮｈ
ｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＳｐｅＩとＳ
ｐｈＩで消化しておいたプラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−Ｃ
ＭＶ−ｐＧＬ３に挿入し、プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１５ＡＳ−
ＣＭＶ−ｐＧＬ３を得た。
【０２０６】 プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３をＮｈｅＩとＳｐｈＩで消化し、
誘導性プロモーターの制御下にｌｕｃ＋遺伝子の５’領域を含む１１５１ｂｐの
ＮｈｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントを単離した。このフラグメントを予めＳｐｅＩ
とＳｐｈＩで消化しておいたプラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ
−ＣＭＶ−ｐＧＬ３に挿入し、プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ２０Ａ
Ｓ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３を得た。
【０２０７】 実施例８：誘導性システムの各種態様のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較 図２０は誘導性システムの数種の態様で得られたｉｎ ｖｉｔｒｏ結果をまと
めたものである。これらの結果から明らかなように、単独プラスミドを使用する
システム（図２０の２及び５〜９段目）と同様に２種のプラスミドを使用するシ
ステム（図２０の１、３及び４段目）も機能的であり、即ちＰＰＡＲｇリガンド
（ここではＢＲＬ４９６５３）の存在は誘導性プロモーターの存在下におかれた
遺伝子の発現を著しく増加する。また、所定システム（図２０の３及び７〜９段
目）ではリガンド誘導係数が３０を上回り、図２０の４段目に示すシステムは誘
導後の活性がｈＣＭＶ−ＩＥプロモーター等の強力プロモーターと同等である。
【０２０８】 実施例９：各種ＰＰＡＲリガンドによる誘導性システムの活性化 ９．１．ｈＰＰＡＲｇ２を使用するシステム 図２１に示す結果から明らかなように、ＢＲＬ４９６５３以外のｈＰＰＡＲｇ
リガンド（ここではＲＧ１２５２５（ｈＰＰＡＲｇのＰＲＰリガンド））を使用
しても誘導性システムを活性化することができる。１００μＭ濃度ではＲＧ１２
５２５で処理したほうがＢＲＬ４９６５３よりも強い誘導が得られる。従って、
他の任意ＰＰＡＲｇリガンドをシステムのインデューサーとして使用することが
できる。
【０２０９】 ９．２．ｈＰＰＡＲａを使用するシステム ｈＰＰＡＲｇを使用するシステムと同様に、ｈＰＰＡＲａを転写レギュレータ
ーとして使用するシステムもフィブレート又は例えばＷＹ−１４，６４３又は他
の任意ｈＰＰＡＲａリガンドにより活性化することができる。
【０２１０】 実施例１０：誘導性システムは筋肉でｉｎ ｖｉｖｏ活性化することができる
。
【０２１１】 図２２は誘導性システムの各種態様を使用して筋肉で得られたｉｎ ｖｉｖｏ
結果をまとめたものである。これらの結果から明らかなように、試験した３種（
図２２の２〜４段目）では強制栄養によりｈＰＰＡＲｇリガンドを投与すると筋
肉で誘導性プロモーターの活性を著しく増加することが可能である。誘導係数は
図２２の２段目の態様で１４倍、図２２の３段目の態様で８倍、図２２の４段目
の態様で２４倍である。更に、１種の態様（図２２の２段目）ではＢＲＬ４９６
５３で処理した動物で得られた活性はｈＣＭＶ−ＩＥプロモーター等の強力プロ
モーターの活性と同等である。
【０２１２】 更に図２３に示す結果から明らかなように、遺伝子導入前後に関係なくリガン
ドを１回投与しただけでシステムを誘導することができる。この実験は、通常使
用されている用量の２分の１の用量で同一誘導係数が得られることも示している
。
【０２１３】 従って、核内ＰＰＡＲレセプターを転写レギュレーターとして使用するシステ
ムはｉｎ ｖｉｖｏで機能的であり、ＰＰＡＲリガンドの経口投与により誘導す
ることができる。
【０２１４】 実施例１１：分泌形産物の遺伝子の誘導性発現を可能にするプラスミドの構築 １１．１プラスミドｐＲＤＡ０２の構築 プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３をＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消
化し、４５９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩフラグメントを単離した。このフ
ラグメントを予めＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕＩで消化しておいたプラスミドｐＸＬ
３０１０（Ｂｅｔｔａｎ Ｍ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７１（１９
９９）１８７−１８９）に挿入し、プラスミドｐＲＤＡ０２を得た。このプラス
ミドは転写レギュレーターとしてＰＰＡＲを使用するシステムにより誘導可能な
プロモーターの制御下に発現するヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌形（ｈ
ＳｅＡＰ）をコードする遺伝子の相補的ＤＮＡを含む。プラスミドｐＲＤＡ０２
の模式図を図２４に示す。
【０２１５】 実施例１２：誘導性システムは分泌タンパク質の血漿濃度をｉｎ ｖｉｖｏ調
節することができる。
【０２１６】 図２５に示す結果から明らかなように、誘導性システムを使用することにより
、ＰＰＡＲリガンドを１回経口投与するだけで筋肉から分泌されるタンパク質の
血漿濃度を経時的に調節することが可能である。ｈＳｅＡＰの血漿濃度はリガン
ド投与から２日後に１８倍に増加し（図２５Ａ）、その後、１週間後にその基線
レベルに戻る。２１日目から３９日目の間では、ヒト由来ｈＳｅＡＰに対する免
疫応答が観察され、このタンパク質の血漿濃度が低下したと予想される。この免
疫応答にも拘わらず、第２回目の誘導サイクルを実施することが可能である（図
２５Ａ）。
【０２１７】 図２５Ｂに示すように、誘導性システムはリガンドを毎日投与することにより
、処理期間に等しい期間中、ｈＳｅＡＰの血漿濃度を高レベルに維持することも
できる。
【０２１８】 実施例１３：各種ＰＰＡＲリガンドは用量依存的に誘導性システムをｉｎ ｖ
ｉｖｏ活性化することができる。
【０２１９】 ＩＩ型糖尿病治療用として市販されている形態のＢＲＬ４９６５３（Ａｖａｎ
ｄｉａ（登録商標），ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）と同一治療用と
して市販されている形態のピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ（登録商標）、武田薬品
）も誘導性システムを活性化することができる（図２６Ａ）。更に図２６Ｂから
明らかなように、誘導係数はリガンド使用量に直接相関する。
【０２２０】 従って、核内ＰＰＡＲレセプターを転写レギュレーターとして使用するシステ
ムは分泌タンパク質の血漿濃度を非常に正確に調節することができる。更に、こ
の調節は各種ＰＰＡＲリガンドを使用することにより得られる。
【０２２１】 実施例１４：血管形成因子を産物とする遺伝子の誘導性発現を可能にするプラ
スミドの構築 １４．１プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦＡ１６５の構築 ヒトＶＥＧＦ１６５の読み枠をヒト胎盤全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｈｏ
ｕｃｋら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２（１９９１）１８０６−１８１
４）から逆転写とＰＣＲによりクローニングした後、−５２２位から＋７２位ま
でのＣＭＶ Ｅ／ＰプロモーターとＳＶ４０の後期ｐｏｌｙＡを含むｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｇａｔｅｎｅ）に挿入し、プラスミドｐＸＬ
３２１８を得た。このプラスミドを次にＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩで消化し、
４８２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントＡを単離した。プラスミ
ドｐＸＬ３２１８を同様にＢｓｒＧＩとＢａｍＨＩで消化し、３９０ｂｐのＢｓ
ｒＧＩ−ＢａｍＨＩフラグメントＢを得た。フラグメントＡ及びＢを予めＨｉｎ
ｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化しておいたプラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧ
Ｌ３に挿入し、プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦＡ１６５を得た。こ
のプラスミドは転写レギュレーターとしてＰＰＡＲを使用するシステムにより誘
導可能なプロモーターの制御下に発現するＶＥＧＦＡ１６５をコードする遺伝子
の相補的ＤＮＡを含む。プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦＡ１６５の
模式図を図２７に示す。
【０２２２】 このプラスミドを使用すると、例えば治療目的でＶＥＧＦの血管形成活性を経
時的に調節することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドＦＴＫｐＧＬ３の模式図を示す。
【図２】 プラスミドＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図３】 プラスミドＪｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図４】 プラスミドＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図５】 プラスミドＤＲ１ｘ３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図６】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＦＴ
ＫｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｂ）、又はＪｘ３ＡＳ−Ｔ
Ｋ−ｐＧＬ３（ｃ）、又はＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｄ）、又はＤＲ１ｘ
３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｅ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ
５−ｈＰＰＡＲｇ２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同
時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐ
ｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【図７】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＦＴ
ＫｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｂ）、又はＪｘ３ＡＳ−Ｔ
Ｋ−ｐＧＬ３（ｃ）、又はＤＲ１ｘ３Ｓ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｄ）、又はＤＲ１ｘ
３ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ｅ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ
５−ｈＰＰＡＲａ（Ｋｏｚ）と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０
ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌ
ａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎ
ｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【図８】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図９】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＪｘ
５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３（ｂ）１０
ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２と、（ｉｉｉ）
プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性
プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ
活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性
を表す。
【図１０】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＪｘ
ｎＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと、（ｉｉ）プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡ
Ｒｇ２ １０ｎｇと、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時
トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙ
ｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【図１１】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＪｘ
ｎＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと、（ｉｉ）プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰ
ＡＲｇ２ １０ｎｇ（ａ）又は５０ｎｇ（ｂ）と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ
−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活
性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化
したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。
【図１２】 プラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の模式図を示す。
【図１３】 転写レギュレーターｈＰＰＡＲｇ２及びｈＰＰＡＲｇ２ｇ２の比較を示す。マ
ウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）に（ｉ）プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ
３ １０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２（ａ）
又はｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ
２０ｎｇを同時トランスフェクトした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎ
ｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏ
ｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を表す。（ｃ）：プラスミド
ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２又はプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２で得ら
れたＢＲＬ４９６５３誘導係数。この誘導係数はＢＲＬ４９６５３の存在下の活
性をＤＭＳＯの存在下の活性で割ることにより計算した。
【図１４】 プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図１５】 マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ一過性トランスフェクション
により評価した誘導性プロモーターの活性を示す。細胞に（ｉ）プラスミドＪｘ
１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３（ａ）、又はＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＥＦ−ｐＧＬ
３（ｂ）１０ｎｇと、（ｉｉ）増加量のプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ
２と、（ｉｉｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ ２０ｎｇを同時トランスフェク
トした。各誘導性プロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
のルシフェラーゼ活性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのル
シフェラーゼ活性を表す。
【図１６】 プラスミドＪｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２の模式図を示す。
【図１７】 プラスミドＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｐＧＬ３の模式図を示す。
【図１８】 プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３の模式図を
示す。
【図１９】 プラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３の模式
図を示す。
【図２０】 誘導性システムの各種態様のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較を示す。マウス筋芽細胞（
Ｃ２Ｃ１２）にシステムの各態様で同モル数の誘導性発現カセットをトランスフ
ェクトした。プラスミドｐＣＭＶ−ｌｅａｄＴＫを使用することにより得られた
ｈＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性の百分率として結果を表す。ＢＲＬ４９６５
３誘導係数はＢＲＬ４９６５３の存在下の活性をＤＭＳＯの存在下の活性で割る
ことにより計算した。１＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２＋Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧ
Ｌ３；２＝Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｌｕｃ−ｈＰＰＡＲｇ２；３＝ｐＳＧ５−ｈＰＰ
ＡＲｇ２ｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；４＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ
２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；５＝ＳＶ−ｇ２−Ｊ１０−Ｃ−ｇＧＬ３
；６＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ５ＡＳ−ＴＫ−ｐＧＬ３；７＝ｈＰＰＡＲ
ｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；８＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ
−Ｊｘ１５ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；９＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ２０Ａ
Ｓ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３。
【図２１】 リガンドＢＲＬ４９６５３及びＲＧ１２５２５のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較を示す
。マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）に（ｉ）（ａ）に示す発現カセットのプラスミ
ドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ １０ｎｇと（ｉ
ｉ）プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ １０ｎｇをトランスフェクトした。誘導性プ
ロモーターの活性はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ活
性により標準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ活性を
表す。
【図２２】 誘導性システムの各種態様のｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す。Ｃ５７ＢＩ／６マウ
ス（各群６頭）の左右両側の頭蓋脛骨にシステムの各態様で同モル数の誘導性発
現カセットを注射した。その後、各筋肉に電気導入した。処理動物は毎日強制栄
養によりＢＲＬ４９６５３ ３０ｍｇ／ｋｇを投与した。ＤＮＡ注射から４日後
に動物を殺し、筋肉を採取してルシフェラーゼ活性を測定した。１＝ｐＣＭＶ−
ｌｅａｄＴＫ；２＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ
３；３＝ｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ｇ２＋Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３；４
＝ｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３。
【図２３】 各種誘導プロトコールとＢＲＬ４９６５３のｉｎ ｖｉｖｏ比較を示す。Ｃ５
７ＢＩ／６マウス（各群６頭）の左右両側の頭蓋脛骨に（ａ）に示す発現カセッ
トのプラスミドｈＰＰＡＲｇ２−ＣＭＶ−Ｊｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ｐＧＬ３ １
μｇを含むＤＮＡ１０μｇを注射した。各種誘導プロトコールで得られた活性を
パネル（ｂ）にまとめた。
【図２４】 プラスミドｐＲＤＡ０２の模式図を示す。
【図２５】 誘導性システムでで得られたｉｎ ｖｉｖｏ誘導動態を示す。（Ａ）１０頭の
Ｃ５７ＢＩ／６マウスの左右両側の頭蓋脛骨にプラスミドｐＲＤＡ０２ ３ｍｇ
とプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ３ｍｇを含むＤＮＡ混合物を注射した
。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から４日後、次いで３９日後に強
制栄養によりＢＲＬ４９６５３ ３０ｍｇ／ｋｇを動物に投与した。各時点でヘ
パリン採血し、Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）キット（Ｔｒｏｐｉｘ
，ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して分
泌アルカリホスファターゼ（ｈＳｅＡＰ）の血漿中酵素活性を測定した。（Ｂ）
Ｃ５７ＢＩ／６マウス（各群１０頭２群）の左右両側の頭蓋脛骨にプラスミドｐ
ＲＤＡ０２ ３ｍｇとプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ３ｍｇを含むＤＮ
Ａ混合物を注射した。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から４日後に
強制栄養によりＢＲＬ４９６５３を１回（３０ｍｇ／ｋｇ）又は５日間毎日１回
ずつ（３０ｍｇ／ｋｇ）動物に投与した。各時点でヘパリン採血し、“Ｐｈｏｓ
ｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ”（登録商標）キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してｈＳｅＡ
Ｐの血漿中酵素活性を測定した。記載する結果（誘導係数）は指定日に測定した
ｈＳｅＡＰの活性と４日目に得られた活性の比に対応する。
【図２６】 各種ＰＰＡＲｇリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較とその１種の用量効果の検討
を示す。Ｃ５７ＢＩ／６マウス（各群５頭）の左右両側の頭蓋脛骨にプラスミド
ｐＲＤＡ０２ ５ｍｇとプラスミドｐＳＧ５−ｈＰＰＡＲｇ２ ５ｍｇを含むＤ
ＮＡ混合物を注射した。その後、各筋肉に電気導入した。ＤＮＡ注射から６日後
（Ａ）又は１０日後（Ｂ）に強制栄養により各種ＰＰＡＲｇリガンド（Ａ；ＢＲ
Ｌ４９６５３、Ａｃｔｏｓ（登録商標）（武田薬品）及びＡｖａｎｄｉａ（登録
商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ））又は各種用量のＢＲＬ４９
６５３（Ｂ）を動物に投与した。各時点でヘパリン採血し、“Ｐｈｏｓｐｈａ−
Ｌｉｇｈｔ”キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してｈＳｅＡＰの血漿中酵素活性を
測定した。記載する結果（誘導係数）は指定日に測定したｈＳｅＡＰの活性と６
日目（Ａ）又は１０日目（Ｂ）に得られた活性の比に対応する。
【図２７】 プラスミドＪｘ１０ＡＳ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦＡ１６５の模式図を示す。
【手続補正書】特許協力条約第１９条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月３日（２００１．１．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マフデイ，アブデレン フランス国、94440・マロル・ザン・ブリ、 リユ・デ・ベルジエ・41 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA01 DA02 FA02 GA11 HA17 4B063 QA18 QQ53 QR32 QR55 QS34 QX01 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 BA44 CA18 CA53 DB01 NA05 NA14 ZC03 4C087 AA02 BC83 CA12 NA14 ZC03 4H045 AA10 BA40 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ＰＰＡＲ応答エレメントと最小転写プロモーターを含
    む誘導性プロモーターの制御下に目的核酸を含む第１のエレメントと、 （ｂ）転写プロモーターの制御下にＰＰＡＲをコードする核酸を含む第２のエ
    レメントを含み、同時、別々又は時間的に間隔をあけて前記エレメントを使用す
    る組成物。
  2. 【請求項２】 同時、別々又は時間的に間隔をあけて使用するように（ｃ）
    ＰＰＡＲリガンドを更に含む請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 エレメント（ａ）及び（ｂ）が別個の遺伝子構築物に担持さ
    れていることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 エレメント（ａ）及び（ｂ）が同一遺伝子構築物で結合して
    いることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 遺伝子構築物がプラスミド又はウイルスベクターであること
    を特徴とする請求項３又は４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 ＰＰＡＲ応答エレメントが１個以上のＰＰＡＲ結合部位を含
    むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 ＰＰＡＲ応答エレメントが配列番号１の配列又はこの配列の
    機能的変異体の１個以上の部位を含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物
    。
  8. 【請求項８】 ＰＰＡＲ応答エレメントが配列番号５の配列又はこの配列の
    機能的変異体の１個以上の部位を含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物
    。
  9. 【請求項９】 応答エレメントが３０個まで、好ましくは３〜２０個、より
    好ましくは５〜１５個の結合部位を含むことを特徴とする請求項６から８のいず
    れか一項に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 最小プロモーターが転写活性に非必須の領域を欠失する細
    胞又はウイルス遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１から９の
    いずれか一項に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 誘導性プロモーターが更に増幅性領域を含むことを特徴と
    する請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 最小プロモーターとＰＰＡＲ応答エレメントが同一方向に
    配置されていることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成
    物。
  13. 【請求項１３】 最小プロモーターとＰＰＡＲ応答エレメントが逆方向に配
    置されていることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物
    。
  14. 【請求項１４】 ＰＰＡＲをコードする核酸がＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγを
    コードすることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 ＰＰＡＲをコードする核酸が複数のリガンド結合部位を含
    む改変ＰＰＡＲをコードすることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項
    に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 転写プロモーターの制御下にＲＸＲをコードする核酸を含
    むエレメント（ｄ）を更に含むことを特徴とする請求項１から１５のいずれか一
    項に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載のエレメント（ａ）とエレメント（ｂ）を
    含むベクター。
  18. 【請求項１８】 エレメント（ａ）及び（ｂ）が逆方向に配置されているこ
    とを特徴とする請求項１７に記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 エレメント（ａ）の誘導性プロモーターとエレメント（ｂ
    ）の転写プロモーターがベクターで結合され、調節可能な双方向プロモーターを
    形成することを特徴とする請求項１７又は１８に記載のベクター。
  20. 【請求項２０】 ＰＰＡＲをコードする第１の核酸と、前記第１の核酸の発
    現を制御する第１の最小転写プロモーターと、１個以上のＰＰＡＲ応答エレメン
    トと、第２の最小転写プロモーターと、前記第２の最小転写プロモーターの制御
    下にあり、目的物質をコードする第２の核酸を５’→３’方向に含むことを特徴
    とする請求項１９に記載のベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１６に記載のエレメント（ｄ）を更に含むことを特
    徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載のベクター。
  22. 【請求項２２】 目的核酸を細胞でｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発
    現させるための請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１７
    から２１のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  23. 【請求項２３】 目的核酸を細胞でｉｎ ｖｉｖｏ発現させるために使用さ
    れる物質を製造するための請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物又は
    請求項１７から２１のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  24. 【請求項２４】 核酸を細胞で制御下にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖ
    ｏ発現させるための方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組
    成物又は請求項１７から２１のいずれか一項に記載のベクターと前記細胞を接触
    させることを特徴とする前記方法。
  25. 【請求項２５】 細胞が哺乳動物、好ましくはヒト細胞であることを特徴と
    する請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 細胞が筋細胞であることを特徴とする請求項２５に記載の
    方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物又は請求
    項１７から２１のいずれか一項に記載のベクターと接触させることにより改変さ
    れた細胞。
  28. 【請求項２８】 複数のリガンド結合部位を含む改変ＰＰＡＲ。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載のＰＰＡＲをコードする核酸。
  30. 【請求項３０】 ＰＰＡＲリガンドの同定方法であって、請求項２７に記載
    の細胞を試験分子と接触させ、目的核酸の発現を検出することを特徴とする前記
    方法。
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