JP2003310300A - 遺伝子検査方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子診断特にＳＮＰｓ検査法として、短時
間で行いかつ簡便な方法が望まれていた。 【解決手段】 変異種ターゲットと野生種ターゲットと
にそれぞれ相補的で長さの異なるあるいは電気泳動速度
の異なる２種のプライマーを用意してターゲットにハイ
ブリダイズさせ、蛍光標識核酸をプライマーに付加し、
電気泳動で分離検出する。 【効果】 簡便に、短時間で遺伝子検査を行える。
間で行いかつ簡便な方法が望まれていた。 【解決手段】 変異種ターゲットと野生種ターゲットと
にそれぞれ相補的で長さの異なるあるいは電気泳動速度
の異なる２種のプライマーを用意してターゲットにハイ
ブリダイズさせ、蛍光標識核酸をプライマーに付加し、
電気泳動で分離検出する。 【効果】 簡便に、短時間で遺伝子検査を行える。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡ検出、遺伝子
診断、一塩基変異検出などＤＮＡの検出、遺伝子のタイ
ピングなどの方法に関する。
診断、一塩基変異検出などＤＮＡの検出、遺伝子のタイ
ピングなどの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトゲノム配列解析の完了にともない、
遺伝子情報を診断など医療分野に活用しようとする動き
が活発化している。ＤＮＡの代表的な分析技術はゲル電
気泳動であり、特にキャピラリーアレーゲル電気泳動装
置は高速高スループットＤＮＡ分析システムとして広く
用いられ、ゲノム解析にも用いられている。ゲノム配列
解析に続いて注目されているのは遺伝子発現プロフィー
ル分析や遺伝子中の１塩基置換（ＳＮＰｓ：ｓｉｎｇｌ
ｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｓ）の分析である。種々条件下で発現している遺伝子を
調べたり、種々固体の遺伝子変異を調べたりすることで
遺伝子の機能や遺伝子と病気あるいは医薬品感受性との
関連が調べられている。また、これらの蓄積された遺伝
子に関する知識を用いて病気の診断などが行われつつあ
る。
遺伝子情報を診断など医療分野に活用しようとする動き
が活発化している。ＤＮＡの代表的な分析技術はゲル電
気泳動であり、特にキャピラリーアレーゲル電気泳動装
置は高速高スループットＤＮＡ分析システムとして広く
用いられ、ゲノム解析にも用いられている。ゲノム配列
解析に続いて注目されているのは遺伝子発現プロフィー
ル分析や遺伝子中の１塩基置換（ＳＮＰｓ：ｓｉｎｇｌ
ｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｓ）の分析である。種々条件下で発現している遺伝子を
調べたり、種々固体の遺伝子変異を調べたりすることで
遺伝子の機能や遺伝子と病気あるいは医薬品感受性との
関連が調べられている。また、これらの蓄積された遺伝
子に関する知識を用いて病気の診断などが行われつつあ
る。
【０００３】病気の診断では未知の遺伝子の解析と異な
り、既に知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象で
ある。これには安いコストで検査できることが望まし
く、種々の方法が発達してきている。医療診断では単一
の遺伝子による病気の診断から種々遺伝子と環境が影響
して起こる病気や医薬品に対する感受性に関連した複数
の遺伝子の検査が重要になりつつある。此処では何種類
もの遺伝子を同時に検査することが重要である。従って
一つの遺伝子や変異を検査するのでなく複数の遺伝子を
検査する必要があるが、遺伝子の検査部位の増幅プロセ
スを含めて安価にＳＮＰｓなどを測定するシステムが求
められている。このため、ゲノム解析に用いられたキャ
ピラリーゲル電気泳動とは異なった簡便な方法が望まれ
ている。ＳＮＰｓ分析や遺伝子のプローブ検査に使用で
きるシステムとしては、Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ，
Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙ，ＤＮＡ ｃｈｉｐ，ｐｙｒ
ｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，
３６３（１９９８））などが報告されている。前３者は
蛍光標識を用いた検出方法であり、励起レーザー光源と
光検出システムを持つ。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
は段階的相補鎖合成と化学発光を用いたシステムで、微
量の核酸基質を順次注入するシステムと光検出システム
を持つ。また、我々は最近、プライマーの３’末端近傍
をターゲットのＳＮＰｓ部位にハイブリダイズさせ相補
鎖合成を進行させて得られるピロリン酸をＡＴＰに変え
て化学発光させてＳＮＰｓを検出する方法を報告してい
る。此処では３’末端のプライマーがターゲットにしっ
かりとハイブリダイズしたときにだけ相補鎖合成が起き
る特性を利用して野生種のターゲットと変異種のターゲ
ットを見分けている（生物物理化学 ２００１， ４
５： ２１９−２２５）。一方、ゲル電気泳動を用いた
ＳＮＰｓ分析方法も普及してきている。もっとも簡便な
のが４種類の蛍光標識ターミネーターを用いて１塩基相
補鎖伸長を行いゲル電気泳動により、蛍光標識ターミネ
ーターと蛍光標識ＤＮＡを分離して計測する（Ｂｉｏ
Ｗａｖｅ １７， ２−５（２００１））。この方法は
本発明に一番近いので詳しく説明する。ＰＣＲなどでコ
ピー数を増幅したターゲットとなるＤＮＡを用意する。
解析に用いるのは２本鎖ＤＮＡでも１本鎖ＤＮＡでも良
いが此処では話しを簡単にするために１本鎖ＤＮＡをタ
ーゲットとする。ターゲットの変位を観測しようとする
部位の手前に３’末端が来るように設計されたプライマ
ーをハイブリダイズして１塩基相補鎖合成する。この時
相補鎖合成基質として４種の蛍光標識ターミネーターを
加えておく。どの核酸基質（此処ではターミネーター）
が取り込まれてもこれ以上相補鎖伸長はしない。相補鎖
伸長したプライマーにはどれか一つだけ蛍光標識ターミ
ネーターが取り込まれる。複数の蛍光体がプライマーに
結合し合成相補鎖をつくることはない。生成した相補鎖
伸長鎖はターゲットＤＮＡに変位した塩基が合っても無
くても同じ長さであり、変位の有無により標識蛍光体の
種類が異なる。反応液中には未反応のたくさんの蛍光標
識ｄｄＮＴＰがあるのでこのままでは蛍光検出できず、
ゲル電気泳動により蛍光標識ｄｄＮＴＰと伸長した蛍光
標識ＤＮＡ鎖を分離し、色分解蛍光計測により変位（Ｓ
ＮＰｓ）の種類を決定する。
り、既に知られた遺伝子やその変異の有無が検査対象で
ある。これには安いコストで検査できることが望まし
く、種々の方法が発達してきている。医療診断では単一
の遺伝子による病気の診断から種々遺伝子と環境が影響
して起こる病気や医薬品に対する感受性に関連した複数
の遺伝子の検査が重要になりつつある。此処では何種類
もの遺伝子を同時に検査することが重要である。従って
一つの遺伝子や変異を検査するのでなく複数の遺伝子を
検査する必要があるが、遺伝子の検査部位の増幅プロセ
スを含めて安価にＳＮＰｓなどを測定するシステムが求
められている。このため、ゲノム解析に用いられたキャ
ピラリーゲル電気泳動とは異なった簡便な方法が望まれ
ている。ＳＮＰｓ分析や遺伝子のプローブ検査に使用で
きるシステムとしては、Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ，
Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙ，ＤＮＡ ｃｈｉｐ，ｐｙｒ
ｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，
３６３（１９９８））などが報告されている。前３者は
蛍光標識を用いた検出方法であり、励起レーザー光源と
光検出システムを持つ。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
は段階的相補鎖合成と化学発光を用いたシステムで、微
量の核酸基質を順次注入するシステムと光検出システム
を持つ。また、我々は最近、プライマーの３’末端近傍
をターゲットのＳＮＰｓ部位にハイブリダイズさせ相補
鎖合成を進行させて得られるピロリン酸をＡＴＰに変え
て化学発光させてＳＮＰｓを検出する方法を報告してい
る。此処では３’末端のプライマーがターゲットにしっ
かりとハイブリダイズしたときにだけ相補鎖合成が起き
る特性を利用して野生種のターゲットと変異種のターゲ
ットを見分けている（生物物理化学 ２００１， ４
５： ２１９−２２５）。一方、ゲル電気泳動を用いた
ＳＮＰｓ分析方法も普及してきている。もっとも簡便な
のが４種類の蛍光標識ターミネーターを用いて１塩基相
補鎖伸長を行いゲル電気泳動により、蛍光標識ターミネ
ーターと蛍光標識ＤＮＡを分離して計測する（Ｂｉｏ
Ｗａｖｅ １７， ２−５（２００１））。この方法は
本発明に一番近いので詳しく説明する。ＰＣＲなどでコ
ピー数を増幅したターゲットとなるＤＮＡを用意する。
解析に用いるのは２本鎖ＤＮＡでも１本鎖ＤＮＡでも良
いが此処では話しを簡単にするために１本鎖ＤＮＡをタ
ーゲットとする。ターゲットの変位を観測しようとする
部位の手前に３’末端が来るように設計されたプライマ
ーをハイブリダイズして１塩基相補鎖合成する。この時
相補鎖合成基質として４種の蛍光標識ターミネーターを
加えておく。どの核酸基質（此処ではターミネーター）
が取り込まれてもこれ以上相補鎖伸長はしない。相補鎖
伸長したプライマーにはどれか一つだけ蛍光標識ターミ
ネーターが取り込まれる。複数の蛍光体がプライマーに
結合し合成相補鎖をつくることはない。生成した相補鎖
伸長鎖はターゲットＤＮＡに変位した塩基が合っても無
くても同じ長さであり、変位の有無により標識蛍光体の
種類が異なる。反応液中には未反応のたくさんの蛍光標
識ｄｄＮＴＰがあるのでこのままでは蛍光検出できず、
ゲル電気泳動により蛍光標識ｄｄＮＴＰと伸長した蛍光
標識ＤＮＡ鎖を分離し、色分解蛍光計測により変位（Ｓ
ＮＰｓ）の種類を決定する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】医療診断のためのＤＮ
Ａ検査方法としては（１）装置および試薬などのコスト
が安いこと、（２）高速高スループットの検出ができる
こと、（３）同時に複数のＤＮＡ部位の診断をおこなえ
ること、（４）１塩基の変異を識別検出できること、な
どが重要である。種々の方法の中で１塩基相補鎖伸長に
よる方法は産物を質量分析したりキャピラリーゲル電気
泳動により分析したりするもので広く普及している。し
かし、質量分析装置は高価であり、また、計測自体は短
時間で終わるものの測定にかけるための試料の準備に手
間がかかるなどの難点があった。一方、キャピラリーゲ
ル電気泳動を用いた方法ではＤＮＡシーケンシングに用
いている装置を使用しているため、泳動路長が長く検出
に３０−６０分を必要とする。さらに、４種のターミネ
ーター（ｄｄＮＴＰ）をそれぞれ異なる蛍光体で標識し
たものを相補鎖合成基質として用いており、色分離機能
を持った高価な計測装置が必要であった。これらは短時
間で簡便にＳＮＰｓ計測をしたり、高スループット分析
をするには適しているとはいえず、新しいＳＮＰｓ分析
手法が求められている。
Ａ検査方法としては（１）装置および試薬などのコスト
が安いこと、（２）高速高スループットの検出ができる
こと、（３）同時に複数のＤＮＡ部位の診断をおこなえ
ること、（４）１塩基の変異を識別検出できること、な
どが重要である。種々の方法の中で１塩基相補鎖伸長に
よる方法は産物を質量分析したりキャピラリーゲル電気
泳動により分析したりするもので広く普及している。し
かし、質量分析装置は高価であり、また、計測自体は短
時間で終わるものの測定にかけるための試料の準備に手
間がかかるなどの難点があった。一方、キャピラリーゲ
ル電気泳動を用いた方法ではＤＮＡシーケンシングに用
いている装置を使用しているため、泳動路長が長く検出
に３０−６０分を必要とする。さらに、４種のターミネ
ーター（ｄｄＮＴＰ）をそれぞれ異なる蛍光体で標識し
たものを相補鎖合成基質として用いており、色分離機能
を持った高価な計測装置が必要であった。これらは短時
間で簡便にＳＮＰｓ計測をしたり、高スループット分析
をするには適しているとはいえず、新しいＳＮＰｓ分析
手法が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】これらの課題を解決する
ために、用いる蛍光体を一種類とし、検査用のプライマ
ーをターゲットにハイブリダイズさせ相補鎖合成して得
られるＤＮＡ鎖の長さがターゲットＤＮＡに変位が有る
が否かで変化する様にした。さらに、高速泳動を実現す
る為にゲル電気泳動路長の短いキャピラリーゲル電気泳
動あるいはチップ上に設けたゲル電気泳動路を活用して
１―２分以内に計測結果が得られる方法を提示する。
ために、用いる蛍光体を一種類とし、検査用のプライマ
ーをターゲットにハイブリダイズさせ相補鎖合成して得
られるＤＮＡ鎖の長さがターゲットＤＮＡに変位が有る
が否かで変化する様にした。さらに、高速泳動を実現す
る為にゲル電気泳動路長の短いキャピラリーゲル電気泳
動あるいはチップ上に設けたゲル電気泳動路を活用して
１―２分以内に計測結果が得られる方法を提示する。
【０００６】まず発明の基本となっている方法について
説明する。ここで用いる検出用のプローブ（プライマ
ー）は変異種のターゲットと相補的な変異種用のプライ
マーと野生種のターゲットに相補的な野生種用のプライ
マーを混合したものである。野生種用のプライマーには
１０マーからなるポリＴ配列（他の配列でも良い）がつ
いており、変異種用のプライマーよりも時間がかかって
泳動する。すなわち電気泳動でこれらは分離検出でき
る。ターゲットとなるＤＮＡにプローブ（プライマー）
をハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼと反応基質
ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）および蛍光
標識ターミネーター（ｄｄＮＴＰ−ｆ）を加えてＤＮＡ
相補鎖合成をおこなう（ｄＮＴＰは必ずしも必要でな
い）。プライマーの末端部分の変異部位に相補的な部分
がマッチすれば蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが取り込まれて
プライマーは蛍光標識される。しかし、ターゲットの変
異部位に相補的なプライマーの部分がマッチしていない
と相補鎖合成は起こらず蛍光標識は取り込まれない。末
端の変異部位に隣接するか、２塩基離れた部位の塩基を
ターゲットと相補的でない様にしておくと変異部のマッ
チミスマッチによる相補鎖合成のスイッチングをより確
実に行うことができる。プライマーのターゲットにハイ
ブリダイズする長さは２０マー前後を用いた。野生型と
変異型が含まれるヘテロタイプのターゲットでは２本の
強度の等しいピークが現れる。一方、野生型だけあるい
は変異型だけのホモタイプのターゲットでは１本のピー
クしか現れないのでどちらのピークか判定するために内
部標準となる蛍光標識ＤＮＡ鎖を少量加えておく必要が
ある。相補鎖合成しただけの反応産物をそのまま電気泳
動すると蛍光標識核酸基質（ｄＮＴＰ−ｆ）によるピー
クがスペクトル中に現れるのでこれを内部標準にしても
良い。以下発明の詳細を開示する。
説明する。ここで用いる検出用のプローブ（プライマ
ー）は変異種のターゲットと相補的な変異種用のプライ
マーと野生種のターゲットに相補的な野生種用のプライ
マーを混合したものである。野生種用のプライマーには
１０マーからなるポリＴ配列（他の配列でも良い）がつ
いており、変異種用のプライマーよりも時間がかかって
泳動する。すなわち電気泳動でこれらは分離検出でき
る。ターゲットとなるＤＮＡにプローブ（プライマー）
をハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼと反応基質
ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）および蛍光
標識ターミネーター（ｄｄＮＴＰ−ｆ）を加えてＤＮＡ
相補鎖合成をおこなう（ｄＮＴＰは必ずしも必要でな
い）。プライマーの末端部分の変異部位に相補的な部分
がマッチすれば蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが取り込まれて
プライマーは蛍光標識される。しかし、ターゲットの変
異部位に相補的なプライマーの部分がマッチしていない
と相補鎖合成は起こらず蛍光標識は取り込まれない。末
端の変異部位に隣接するか、２塩基離れた部位の塩基を
ターゲットと相補的でない様にしておくと変異部のマッ
チミスマッチによる相補鎖合成のスイッチングをより確
実に行うことができる。プライマーのターゲットにハイ
ブリダイズする長さは２０マー前後を用いた。野生型と
変異型が含まれるヘテロタイプのターゲットでは２本の
強度の等しいピークが現れる。一方、野生型だけあるい
は変異型だけのホモタイプのターゲットでは１本のピー
クしか現れないのでどちらのピークか判定するために内
部標準となる蛍光標識ＤＮＡ鎖を少量加えておく必要が
ある。相補鎖合成しただけの反応産物をそのまま電気泳
動すると蛍光標識核酸基質（ｄＮＴＰ−ｆ）によるピー
クがスペクトル中に現れるのでこれを内部標準にしても
良い。以下発明の詳細を開示する。
【０００７】
【発明の実施の形態】＜実施例１＞第一の実施例は検査
用プライマーの３’末端をターゲットの変異部位に一致
させ、相補鎖合成により蛍光標識ターミネーター（ｄＮ
ＴＰ−ｆ）をプライマーに取り込み、流動性ポリマーを
分離媒体として用いるチップ電気泳動あるいはキャピラ
リー電気泳動によるＳＮＰｓタイピングの例である。短
時間でＳＮＰｓタイピングをするには泳動路長の短いゲ
ル電気泳動を用いることが必要である。２０マー程度の
蛍光標識ＤＮＡを２−３分以内に分析するには泳動路長
は３−１０ｃｍ程度が良い。ガラスやプラスティックの
表面に作製した溝を電気泳動路として用いるチップ電気
泳動は安価な装置と短時間で泳動結果が得られる手段と
して使われており、日立電子エンジニアリングあるいは
アジレントテクノロジーから装置が市販されている。現
在はほとんどＰＣＲ産物の長さチェックなどの目的に使
われる。ＤＮＡを蛍光標識したり、２本差ＤＮＡの間に
入るインターカレーター色素を用いてＤＮＡを染色した
りしてレーザー誘起蛍光法で測定する。レーザーとして
安価な赤色レーザーが便利であり、このレーザーで励起
できるＣｙ−５などの色素でＤＮＡを標識して計測が行
われる。簡便な装置では計測できる蛍光の種類は一つで
ある。チップ電気泳動では泳動路長が短いこともあり、
１塩基の鎖長差のＤＮＡを識別することは難しい。そこ
でターゲットが野生型かあるいは変異型化によって、で
きるだけ鎖長に変化がでるように試料調製し計測すると
短い泳動路のゲル電気泳動でＳＮＰｓのタイピングがで
きる。本発明はこれを可能にする方法を提供するもので
ある。
用プライマーの３’末端をターゲットの変異部位に一致
させ、相補鎖合成により蛍光標識ターミネーター（ｄＮ
ＴＰ−ｆ）をプライマーに取り込み、流動性ポリマーを
分離媒体として用いるチップ電気泳動あるいはキャピラ
リー電気泳動によるＳＮＰｓタイピングの例である。短
時間でＳＮＰｓタイピングをするには泳動路長の短いゲ
ル電気泳動を用いることが必要である。２０マー程度の
蛍光標識ＤＮＡを２−３分以内に分析するには泳動路長
は３−１０ｃｍ程度が良い。ガラスやプラスティックの
表面に作製した溝を電気泳動路として用いるチップ電気
泳動は安価な装置と短時間で泳動結果が得られる手段と
して使われており、日立電子エンジニアリングあるいは
アジレントテクノロジーから装置が市販されている。現
在はほとんどＰＣＲ産物の長さチェックなどの目的に使
われる。ＤＮＡを蛍光標識したり、２本差ＤＮＡの間に
入るインターカレーター色素を用いてＤＮＡを染色した
りしてレーザー誘起蛍光法で測定する。レーザーとして
安価な赤色レーザーが便利であり、このレーザーで励起
できるＣｙ−５などの色素でＤＮＡを標識して計測が行
われる。簡便な装置では計測できる蛍光の種類は一つで
ある。チップ電気泳動では泳動路長が短いこともあり、
１塩基の鎖長差のＤＮＡを識別することは難しい。そこ
でターゲットが野生型かあるいは変異型化によって、で
きるだけ鎖長に変化がでるように試料調製し計測すると
短い泳動路のゲル電気泳動でＳＮＰｓのタイピングがで
きる。本発明はこれを可能にする方法を提供するもので
ある。
【０００８】１０ｃｍ以下の短い電気泳動路でも分離で
きるように野生型にマッチするプライマーと変異型にマ
ッチするプライマーとでは長さが変化するようにした。
すなわち野生型のプライマーにはポリＴからなるオリゴ
ヌクレオチドを５’末端に付加し、電気泳動速度が変異
型のプライマーより遅くなるようにした。両者の違いは
このポリＴ配列と変位部分の核酸の種類が野生型に相補
的（野生型プライマー）か、あるいは変異型に相補的
（変異型プライマー）かだけである。図１は本発明の原
理説明図である。野生型プライマーと変異型プライマー
を等しい濃度で含む検査用プライマーを用意する。野生
型プライマーは５’末端に１０マーから成るポリＴ配列
を持つ。配列番号１〜８に例として用いたプライマーの
配列と、配列番号９〜１２にターゲットＤＮＡの配列を
示した。ターゲットＤＮＡの注目する変異部の隣の塩基
種に相補的なターミネーター（ｄＮＴＰ−ｆ）、この例
ではｄＴＴＰ−ｆ、とＤＮＡポリメラーゼを加えて相補
鎖合成を行う。プライマーの３’末端がターゲットと相
補的である場合にはプライマーを起点として相補鎖が伸
びる。相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないの
で蛍光標識は取り込まれない。この場合には１塩基伸長
であるがｄＮＴＰ（ターミネーターの塩基種を除く）と
蛍光標識ターミネーターを加えて数塩基伸長して蛍光標
識ターミネーターを取り込むようにしても良い。いずれ
の場合にも伸長する塩基長は野生型及び変異型で同じで
あるがターゲットがどちらであるかによって相補鎖伸長
従って蛍光標識が取り込まれるか否かが決定される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしてはＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｅｎａ
ｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）やＳｅｑｅｎａｓｅ Ｖｅ
ｒ．２ Ｔ７ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｍｂｉｏｎ製
のＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗが使用できる。これらの酵素は
いずれも遺伝子工学的に５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を無くしたも
のである。特に本発明に使用できる酵素の条件として
は、プライマーの３’末端を削るエクソヌクレアーゼ活
性（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）の無いことが
重要である。これは、プライマーの３’末端とターゲッ
トＤＮＡがミスマッチの状態においてエクソヌクレアー
ゼによりプライマーの３’末端が削られると、野生型の
プライマーと変異型のプライマーとで３’末端の構造に
関係なく相補鎖伸長が可能となるためである。本発明の
実施例では、プライマーの高次構造の影響で相補鎖伸長
反応が起きづらくなる影響を除去する目的、２本鎖ＤＮ
Ａでも野生型及び変異型の測定を可能とするために、耐
熱性酵素であるＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｅｎａｓｅ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いる。蛍光標識はＣｙ−
５を用い、ｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５はアマシャムバイオサイ
エンスのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙ５
Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＫｉｔ（各々、ｄｄＡＴ
Ｐ−Ｃｙ５：８．８μＭ、ｄｄＣＴＰ−Ｃｙ５：７．０
μＭ、ｄｄＧＴＰ−Ｃｙ５：１７．６μＭ、ｄｄＴＴＰ
−Ｃｙ５：１４．３μＭのストック）を用いた。
きるように野生型にマッチするプライマーと変異型にマ
ッチするプライマーとでは長さが変化するようにした。
すなわち野生型のプライマーにはポリＴからなるオリゴ
ヌクレオチドを５’末端に付加し、電気泳動速度が変異
型のプライマーより遅くなるようにした。両者の違いは
このポリＴ配列と変位部分の核酸の種類が野生型に相補
的（野生型プライマー）か、あるいは変異型に相補的
（変異型プライマー）かだけである。図１は本発明の原
理説明図である。野生型プライマーと変異型プライマー
を等しい濃度で含む検査用プライマーを用意する。野生
型プライマーは５’末端に１０マーから成るポリＴ配列
を持つ。配列番号１〜８に例として用いたプライマーの
配列と、配列番号９〜１２にターゲットＤＮＡの配列を
示した。ターゲットＤＮＡの注目する変異部の隣の塩基
種に相補的なターミネーター（ｄＮＴＰ−ｆ）、この例
ではｄＴＴＰ−ｆ、とＤＮＡポリメラーゼを加えて相補
鎖合成を行う。プライマーの３’末端がターゲットと相
補的である場合にはプライマーを起点として相補鎖が伸
びる。相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないの
で蛍光標識は取り込まれない。この場合には１塩基伸長
であるがｄＮＴＰ（ターミネーターの塩基種を除く）と
蛍光標識ターミネーターを加えて数塩基伸長して蛍光標
識ターミネーターを取り込むようにしても良い。いずれ
の場合にも伸長する塩基長は野生型及び変異型で同じで
あるがターゲットがどちらであるかによって相補鎖伸長
従って蛍光標識が取り込まれるか否かが決定される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしてはＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｅｎａ
ｓｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）やＳｅｑｅｎａｓｅ Ｖｅ
ｒ．２ Ｔ７ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｍｂｉｏｎ製
のＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗが使用できる。これらの酵素は
いずれも遺伝子工学的に５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を無くしたも
のである。特に本発明に使用できる酵素の条件として
は、プライマーの３’末端を削るエクソヌクレアーゼ活
性（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）の無いことが
重要である。これは、プライマーの３’末端とターゲッ
トＤＮＡがミスマッチの状態においてエクソヌクレアー
ゼによりプライマーの３’末端が削られると、野生型の
プライマーと変異型のプライマーとで３’末端の構造に
関係なく相補鎖伸長が可能となるためである。本発明の
実施例では、プライマーの高次構造の影響で相補鎖伸長
反応が起きづらくなる影響を除去する目的、２本鎖ＤＮ
Ａでも野生型及び変異型の測定を可能とするために、耐
熱性酵素であるＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｅｎａｓｅ ＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いる。蛍光標識はＣｙ−
５を用い、ｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５はアマシャムバイオサイ
エンスのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙ５
Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＫｉｔ（各々、ｄｄＡＴ
Ｐ−Ｃｙ５：８．８μＭ、ｄｄＣＴＰ−Ｃｙ５：７．０
μＭ、ｄｄＧＴＰ−Ｃｙ５：１７．６μＭ、ｄｄＴＴＰ
−Ｃｙ５：１４．３μＭのストック）を用いた。
【０００９】ターゲットＤＮＡは通常の方法に従って血
液からＤＮＡを抽出して、注目する部位をＰＣＲ増幅し
て用いた。すなわち、全血２ｍｌに５０ｍＭのＮａＣｌ
溶液１８ｍｌを添加して赤血球を溶血させる。４℃の条
件で３５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を得る。得
られた沈殿を５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、白血球
分画を得る。ＤＮＡｚｏｌ（ＧＢＣＯ ＢＲＬ）１ｍｌ
添加し、細胞壁を溶解する。１８Ｇの注射針付きのシリ
ンジで溶液を出し入れしてゲノムＤＮＡを短く切断す
る。遠心して不要物を除く。エタノール０．５ｍｌと添
加し攪拌後、遠心してゲノムＤＮＡを回収する。７０％
エタノールでリンス後、４００μｌの水を添加し６５℃
で溶解する。１０ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ Ａを８μｌ
添加し３７℃２時間インキュベートしてＲＮＡを分解す
る。フェノール・クロロホルム・アミルアルコール混合
液を４００μｌ添加し、酵素を失活させる。プロパノ−
ル沈殿操作によりゲノムＤＮＡを回収する。０．５×Ｔ
Ｅ（ｐＨ８．０）２００μｌに溶解する。この操作でほ
ぼ１００μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡ溶液を得る。一本鎖
ＤＮＡを得るために、ＰＣＲプライマーの片方にビオチ
ンをつけておき、アビジンを表面に固定した磁気ビーズ
でＰＣＲ産物を釣りだし、熱変性などで一本鎖にしてタ
ーゲットＤＮＡとして用いた。すなわち、上記で調製し
たゲノムＤＮＡ試料１μｌにキアゲン社のＨｏｔＳｔａ
ｒＴａｑ添付の１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、５ｍＭのｄ
ＮＴＰを２μｌ、ＰＣＲ用の２種のプライマー（１ｐｍ
ｏｌ／μｌ）５μｌ、水３７μｌ、ＨｏｔＳｔａｒＴａ
ｑ ０．２５μｌを添加し、９５℃１０分間加熱後、９
４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で６０秒間
のステップを３０回繰り返し、特定ＤＮＡ領域を増幅す
る。ＰＣＲ産物にはフリーのプライマーが混在し、後の
時期ビーズを用いた１本鎖ＤＮＡ調製の収率を低下させ
るため、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取り除く。
液からＤＮＡを抽出して、注目する部位をＰＣＲ増幅し
て用いた。すなわち、全血２ｍｌに５０ｍＭのＮａＣｌ
溶液１８ｍｌを添加して赤血球を溶血させる。４℃の条
件で３５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を得る。得
られた沈殿を５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、白血球
分画を得る。ＤＮＡｚｏｌ（ＧＢＣＯ ＢＲＬ）１ｍｌ
添加し、細胞壁を溶解する。１８Ｇの注射針付きのシリ
ンジで溶液を出し入れしてゲノムＤＮＡを短く切断す
る。遠心して不要物を除く。エタノール０．５ｍｌと添
加し攪拌後、遠心してゲノムＤＮＡを回収する。７０％
エタノールでリンス後、４００μｌの水を添加し６５℃
で溶解する。１０ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ Ａを８μｌ
添加し３７℃２時間インキュベートしてＲＮＡを分解す
る。フェノール・クロロホルム・アミルアルコール混合
液を４００μｌ添加し、酵素を失活させる。プロパノ−
ル沈殿操作によりゲノムＤＮＡを回収する。０．５×Ｔ
Ｅ（ｐＨ８．０）２００μｌに溶解する。この操作でほ
ぼ１００μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡ溶液を得る。一本鎖
ＤＮＡを得るために、ＰＣＲプライマーの片方にビオチ
ンをつけておき、アビジンを表面に固定した磁気ビーズ
でＰＣＲ産物を釣りだし、熱変性などで一本鎖にしてタ
ーゲットＤＮＡとして用いた。すなわち、上記で調製し
たゲノムＤＮＡ試料１μｌにキアゲン社のＨｏｔＳｔａ
ｒＴａｑ添付の１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、５ｍＭのｄ
ＮＴＰを２μｌ、ＰＣＲ用の２種のプライマー（１ｐｍ
ｏｌ／μｌ）５μｌ、水３７μｌ、ＨｏｔＳｔａｒＴａ
ｑ ０．２５μｌを添加し、９５℃１０分間加熱後、９
４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で６０秒間
のステップを３０回繰り返し、特定ＤＮＡ領域を増幅す
る。ＰＣＲ産物にはフリーのプライマーが混在し、後の
時期ビーズを用いた１本鎖ＤＮＡ調製の収率を低下させ
るため、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取り除く。
【００１０】ＰＣＲ産物（２００〜５００ｆｍｏｌ）に
磁気ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｅｓ （Ｍ２８０）
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ （Ｄｙｎａｌ， ６．７
×１０8 ｂｅａｄｓ／ｍｌ）１μｌと２Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮＰ−４０、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）の溶液２５
μｌを添加し、２５℃で３０分間攪拌する。マグネット
でＰＣＲ産物の結合した磁気ビーズを回収し、０．１
Ｍ ＮａＯＨ １００μｌに懸濁して５分間放置後、水
洗し、ビーズに固定した１本鎖ＤＮＡあるいはＮａＯＨ
溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡを得る。ビーズに固定し
た１本鎖ＤＮＡ は１０μｌの水に懸濁して試料として
用いる。ＮａＯＨ溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡの場合
は、直ちに３Ｍ酢酸で中和し、エタノール沈殿して１０
μｌの水に溶解して試料として用いる。、各々にプライ
マー（１０ｐｍｏｌ）を添加し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑ
ｕｅｎａｓｅの系で伸長反応を行わせ、Ｃｙ５ｄｄＮＴ
Ｐを取りこませ、電気泳動計測する。具体的には、１０
μｌ反応体積で、上記１本鎖ＤＮＡ（０．４〜１ｐｍｏ
ｌがベスト）に野生型と変異型用のプライマーを各々１
０ｐｍｏｌとターゲットＤＮＡに対応する２０〜４０ｐ
ｍｏｌのｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５ 酵素に添付されている１
０×緩衝液１μｌとＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ
２ユニットを氷上で添加し、直ちに９４℃３０秒間、
５４℃３０秒間、７２℃３０秒間のサイクルを３０回行
った後に、さらに７２℃で２分間伸長反応を行う。伸長
反応終了液５μｌに１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含むホ
ルムアミド５μｌを加え、８０℃で３分間熱変成した
後、氷冷する。全量を以下の電気泳動装置で電気泳動分
離分析する。
磁気ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｅｓ （Ｍ２８０）
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ （Ｄｙｎａｌ， ６．７
×１０8 ｂｅａｄｓ／ｍｌ）１μｌと２Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮＰ−４０、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）の溶液２５
μｌを添加し、２５℃で３０分間攪拌する。マグネット
でＰＣＲ産物の結合した磁気ビーズを回収し、０．１
Ｍ ＮａＯＨ １００μｌに懸濁して５分間放置後、水
洗し、ビーズに固定した１本鎖ＤＮＡあるいはＮａＯＨ
溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡを得る。ビーズに固定し
た１本鎖ＤＮＡ は１０μｌの水に懸濁して試料として
用いる。ＮａＯＨ溶液中に遊離した１本鎖ＤＮＡの場合
は、直ちに３Ｍ酢酸で中和し、エタノール沈殿して１０
μｌの水に溶解して試料として用いる。、各々にプライ
マー（１０ｐｍｏｌ）を添加し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑ
ｕｅｎａｓｅの系で伸長反応を行わせ、Ｃｙ５ｄｄＮＴ
Ｐを取りこませ、電気泳動計測する。具体的には、１０
μｌ反応体積で、上記１本鎖ＤＮＡ（０．４〜１ｐｍｏ
ｌがベスト）に野生型と変異型用のプライマーを各々１
０ｐｍｏｌとターゲットＤＮＡに対応する２０〜４０ｐ
ｍｏｌのｄｄＮＴＰ−Ｃｙ５ 酵素に添付されている１
０×緩衝液１μｌとＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ
２ユニットを氷上で添加し、直ちに９４℃３０秒間、
５４℃３０秒間、７２℃３０秒間のサイクルを３０回行
った後に、さらに７２℃で２分間伸長反応を行う。伸長
反応終了液５μｌに１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含むホ
ルムアミド５μｌを加え、８０℃で３分間熱変成した
後、氷冷する。全量を以下の電気泳動装置で電気泳動分
離分析する。
【００１１】電気泳動分離は日立電子エンジニアリング
製の電気泳動装置「コスモアイ」を用い、電気泳動部は
日立化成製の「Ｉ−チップ」を用いた。これは流動性ポ
リマーを分離媒体に用いた電気泳動チップである。電気
泳動路の長さは約４ｃｍであり、数塩基の鎖長の差を分
析するのは難しいが、１０塩基鎖長の差があると分離分
析可能である。図２は配列番号１のポリＴ部分の長さを
変え、蛍光標識ターミネーターを３’末端に相補鎖合成
で導入したＤＮＡ鎖の電気泳動スペクトルである。２１
は配列番号２に示した変異型プライマーで２１マー、２
２は配列番号１記載の野生型プライマーのポリＴの長さ
が２のもの、２３は配列番号１記載の野生型プライマー
のポリＴの長さが５のもの、２４は配列番号１記載の野
生型プライマーのポリＴの長さが９のものである。ポリ
Ｔの長さが５塩基以上では変異型プライマーと野生型プ
ライマーとを良く識別できる事が分かる。ゲル電気泳動
に要する時間は１−２分である。ポリＴの長さを２０マ
ー以上に長くすると電気泳動時間は長くなり、ｄｄＮＴ
Ｐ−ｆの信号と重なる事が在り望ましくない。蛍光標識
されたプライマーの現れる位置は背景蛍光も無く精度の
高い測定が行える。
製の電気泳動装置「コスモアイ」を用い、電気泳動部は
日立化成製の「Ｉ−チップ」を用いた。これは流動性ポ
リマーを分離媒体に用いた電気泳動チップである。電気
泳動路の長さは約４ｃｍであり、数塩基の鎖長の差を分
析するのは難しいが、１０塩基鎖長の差があると分離分
析可能である。図２は配列番号１のポリＴ部分の長さを
変え、蛍光標識ターミネーターを３’末端に相補鎖合成
で導入したＤＮＡ鎖の電気泳動スペクトルである。２１
は配列番号２に示した変異型プライマーで２１マー、２
２は配列番号１記載の野生型プライマーのポリＴの長さ
が２のもの、２３は配列番号１記載の野生型プライマー
のポリＴの長さが５のもの、２４は配列番号１記載の野
生型プライマーのポリＴの長さが９のものである。ポリ
Ｔの長さが５塩基以上では変異型プライマーと野生型プ
ライマーとを良く識別できる事が分かる。ゲル電気泳動
に要する時間は１−２分である。ポリＴの長さを２０マ
ー以上に長くすると電気泳動時間は長くなり、ｄｄＮＴ
Ｐ−ｆの信号と重なる事が在り望ましくない。蛍光標識
されたプライマーの現れる位置は背景蛍光も無く精度の
高い測定が行える。
【００１２】上記の他種々のＳＮＰｓについてタイピン
グを行った。この結果、十分な精度で１−２分以内にタ
イピングできる事が確認された。電気泳動の場合、電気
泳動時間は条件により変化する事があり、単独のピーク
が観測された場合にこれが変異型なのか野生型なのか判
断しにくい難点がある。しかし、この場合には残存する
蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが現れるのでこれを基準にして
判別できる利点がある。また、ｄｄＮＴＰ−ｆはプライ
マーによる信号より後にでるので相補鎖合成サンプルを
精製処理すること無しに計測試料とすることができる便
利さがある。
グを行った。この結果、十分な精度で１−２分以内にタ
イピングできる事が確認された。電気泳動の場合、電気
泳動時間は条件により変化する事があり、単独のピーク
が観測された場合にこれが変異型なのか野生型なのか判
断しにくい難点がある。しかし、この場合には残存する
蛍光標識ｄｄＮＴＰ−ｆが現れるのでこれを基準にして
判別できる利点がある。また、ｄｄＮＴＰ−ｆはプライ
マーによる信号より後にでるので相補鎖合成サンプルを
精製処理すること無しに計測試料とすることができる便
利さがある。
【００１３】このようにして調製したゲノムＤＮＡから
本発明のＳＮＰ検出ができることを確認しているが、以
下の実施例では本発明に直結する部分を説明するため
に、テンプレートとしては配列番号９−１２に示した配
列のＤＮＡを化学合成したものをモデルとして用いた。 サンプル１：５’−ＣＣＧＡＧ ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＡ
Ｃ／Ｔ ＧＡＣＴＧＧＡＴＡＴ ＡＧＧＧＡＣＣＴＡ
Ｃ−３’（配列番号９） サンプル２：５’−ＡＡＡＡＴ ＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡ
Ｇ／Ｃ ＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴ ＡＴＴＧＧＴＡＡＧ
Ａ−３’（配列番号１０） サンプル３：５’−ＧＧＡＧＧ ＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧ
Ｔ／Ｃ ＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧ ＧＴＴＡＧＧＡＧＴ
Ｔ−３’（配列番号１１） サンプル４：５’−ＴＴＧＧＴ ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡ
Ｇ／Ｔ ＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡ ＡＴＴＣＴＡＡＴＧ
Ｃ−３’（配列番号１２）
本発明のＳＮＰ検出ができることを確認しているが、以
下の実施例では本発明に直結する部分を説明するため
に、テンプレートとしては配列番号９−１２に示した配
列のＤＮＡを化学合成したものをモデルとして用いた。 サンプル１：５’−ＣＣＧＡＧ ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＡ
Ｃ／Ｔ ＧＡＣＴＧＧＡＴＡＴ ＡＧＧＧＡＣＣＴＡ
Ｃ−３’（配列番号９） サンプル２：５’−ＡＡＡＡＴ ＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡ
Ｇ／Ｃ ＡＴＧＧＴＡＣＴＡＴ ＡＴＴＧＧＴＡＡＧ
Ａ−３’（配列番号１０） サンプル３：５’−ＧＧＡＧＧ ＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧ
Ｔ／Ｃ ＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧ ＧＴＴＡＧＧＡＧＴ
Ｔ−３’（配列番号１１） サンプル４：５’−ＴＴＧＧＴ ＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡ
Ｇ／Ｔ ＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡ ＡＴＴＣＴＡＡＴＧ
Ｃ−３’（配列番号１２）
【００１４】サンプル１ではプライマーとして野生型
３’−ＧｃＡｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇｔ
ｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１）を用いる。一
方、変異型プライマーには３’−ＡｃＡｇａｃｃｔａｔ
ａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇ−５（配列番号２）を用いる。
これらを１：１の割合で混合したものが検査用のプライ
マーである。これはターゲットサンプルの変異位置より
３’末端側にハイブリダイズする。プライマーの３’末
端は変異部位に来るように設計されている。プライマー
の３’末端から３塩基目にはターゲットとミスマッチす
るように塩基種を選んでいる。これは、変異部位の塩基
種のミスマッチによりプライマーの３’末端が非常には
がれ安くなり、相補鎖合成が完全にブロックされる様に
するためである。このような人工的なミスマッチ塩基種
をプライマーに入れないときには３’末端だけのミスマ
ッチでは相補鎖合成が部分的に進行して精度の高いタイ
ピングができない事が在るためである。加える蛍光標識
ターミネーターはｄｄＴＴＰ−ｆである。
３’−ＧｃＡｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇｔ
ｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１）を用いる。一
方、変異型プライマーには３’−ＡｃＡｇａｃｃｔａｔ
ａｔｃｃｃｔｇｇａｔｇ−５（配列番号２）を用いる。
これらを１：１の割合で混合したものが検査用のプライ
マーである。これはターゲットサンプルの変異位置より
３’末端側にハイブリダイズする。プライマーの３’末
端は変異部位に来るように設計されている。プライマー
の３’末端から３塩基目にはターゲットとミスマッチす
るように塩基種を選んでいる。これは、変異部位の塩基
種のミスマッチによりプライマーの３’末端が非常には
がれ安くなり、相補鎖合成が完全にブロックされる様に
するためである。このような人工的なミスマッチ塩基種
をプライマーに入れないときには３’末端だけのミスマ
ッチでは相補鎖合成が部分的に進行して精度の高いタイ
ピングができない事が在るためである。加える蛍光標識
ターミネーターはｄｄＴＴＰ−ｆである。
【００１５】サンプル２，３，４に対応した野生型及び
変異型プライマーと蛍光標識ターミネーターは以下の通
りである。 サンプル２： 野生型プライマー ３’−ＣｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａ
ａｃｃａｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号３）、 変異型プライマー ３’−ＧｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａ
ａｃｃａｔｔｃｔ−５’（配列番号４）、 ターミネーター ｄｄＴＴＰ−ｆ サンプル３： 野生型プライマー ３’−ＡｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａ
ａｔｃｃｔｃａａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号５）、 変異型プライマー ３’−ＧｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａ
ａｔｃｃｔｃａａ−５’（配列番号６）、 ターミネーター ｄｄＣＴＰ−ｆ サンプル４： 野生型プライマー ３’−ＣａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａ
ａｇａｔｔａｃｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号７）、 変異型プライマー ３’−ＡａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａ
ａｇａｔｔａｃｇ−５’（配列番号８） ターミネーター ｄｄＴＴＰ−ｆ である。
変異型プライマーと蛍光標識ターミネーターは以下の通
りである。 サンプル２： 野生型プライマー ３’−ＣｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａ
ａｃｃａｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号３）、 変異型プライマー ３’−ＧｔＴｃｃａｔｇａｔａｔａ
ａｃｃａｔｔｃｔ−５’（配列番号４）、 ターミネーター ｄｄＴＴＰ−ｆ サンプル３： 野生型プライマー ３’−ＡｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａ
ａｔｃｃｔｃａａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号５）、 変異型プライマー ３’−ＧｃＧｔａｇｔｇｃｔｃｃａ
ａｔｃｃｔｃａａ−５’（配列番号６）、 ターミネーター ｄｄＣＴＰ−ｆ サンプル４： 野生型プライマー ３’−ＣａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａ
ａｇａｔｔａｃｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番
号７）、 変異型プライマー ３’−ＡａＧｃａｇｃｔｃｃｔｔａ
ａｇａｔｔａｃｇ−５’（配列番号８） ターミネーター ｄｄＴＴＰ−ｆ である。
【００１６】ここでは一種類のターミネーターだけを用
いたが、ターミネーターに加えて残り３種の核酸基質ｄ
ＮＴＰを加えた試薬キットを用意しておけば全てのＳＮ
Ｐｓに対応できる。この場合、相補鎖合成の長さはター
ゲットにより変化し、数塩基伸びてからターミネーター
が取り込まれて相補鎖合成が停止する場合もあるがこの
場合でも変異種と野生型の鎖長の差は１０塩基である。
いたが、ターミネーターに加えて残り３種の核酸基質ｄ
ＮＴＰを加えた試薬キットを用意しておけば全てのＳＮ
Ｐｓに対応できる。この場合、相補鎖合成の長さはター
ゲットにより変化し、数塩基伸びてからターミネーター
が取り込まれて相補鎖合成が停止する場合もあるがこの
場合でも変異種と野生型の鎖長の差は１０塩基である。
【００１７】＜実施例２＞第２の実施例はプライマーと
して変異部分の数塩基先に３’末端が来るものを用いた
例である。サンプル１を例にプライマー末端の構造を説
明する。プライマーの末端から３塩基目がターゲットの
変異部位に一致する様にプライマーを作る。サンプル１
の場合には 野生型プライマー ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号
１３） 変異型プライマー ３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇ−５’（配列番号１４） である。３’末端から３塩基目はターゲットを認識して
相補鎖合成を行うか否か判別する塩基である。此処では
４塩基目にミスマッチ塩基種Ｇ（本来Ｃ）を入れて、３
塩決めがミスマッチの時には３’末端がはがれて相補鎖
合成が起こらない様にした。この人工的なミスマッチは
２塩基目に入れても良い。注目する変異部位がプライマ
ーの塩基とターゲットの塩基種とで相補的か否かで末端
のハイブリダイゼーションの安定度が変化して相補鎖合
成能力がコントロールできれば良いので、いろいろな変
形が採用できる。相補鎖合成基質としてｄｄＴＴＰ−ｆ
を入れておけば１塩基伸長して反応は停止するので生成
物は野生型の場合３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＧＧｔｇａｃｃ
ｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’で
あり、変異型の場合 ３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＡＧｔｇａ
ｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。此処で（−
ｆ）は核酸塩基Ｔに蛍光体が付いていることを示す。相
補鎖合成基質としてｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物たと
えばｄｄＣＴＰ−ｆ， ｄＴＴＰを用いることもでき
る。この場合、ｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰ−ｆが一つず
つ取り込まれて２塩基伸長し、生成する蛍光標識断片は
野生型の場合３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＧＧｔｇａｃｃｔ
ａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’、変
異型の場合 ３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＡＧｔｇａｃｃｔ
ａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。これらはいずれも
ｄｄＣＴＰ−ｆよりも早く電気泳動し、２分以内に結果
を知ることができる。蛍光体がＣｙ５やＣｙ５．５やＴ
ｅｘａｓＲｅｄでは、ｄｄＮＴＰ−ｆが蛍光標識断片よ
り遅く泳動される条件を作ることができる。これは、蛍
光体のチャージに強く依存しており、フルオレッセイン
のようなマイナスチャージを持つ蛍光体ではｄｄＮＴＰ
−ｆが早く泳動するのでこれは成立しない。
して変異部分の数塩基先に３’末端が来るものを用いた
例である。サンプル１を例にプライマー末端の構造を説
明する。プライマーの末端から３塩基目がターゲットの
変異部位に一致する様にプライマーを作る。サンプル１
の場合には 野生型プライマー ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号
１３） 変異型プライマー ３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇ−５’（配列番号１４） である。３’末端から３塩基目はターゲットを認識して
相補鎖合成を行うか否か判別する塩基である。此処では
４塩基目にミスマッチ塩基種Ｇ（本来Ｃ）を入れて、３
塩決めがミスマッチの時には３’末端がはがれて相補鎖
合成が起こらない様にした。この人工的なミスマッチは
２塩基目に入れても良い。注目する変異部位がプライマ
ーの塩基とターゲットの塩基種とで相補的か否かで末端
のハイブリダイゼーションの安定度が変化して相補鎖合
成能力がコントロールできれば良いので、いろいろな変
形が採用できる。相補鎖合成基質としてｄｄＴＴＰ−ｆ
を入れておけば１塩基伸長して反応は停止するので生成
物は野生型の場合３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＧＧｔｇａｃｃ
ｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’で
あり、変異型の場合 ３’−Ｔ（−ｆ）ｃｔＡＧｔｇａ
ｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。此処で（−
ｆ）は核酸塩基Ｔに蛍光体が付いていることを示す。相
補鎖合成基質としてｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物たと
えばｄｄＣＴＰ−ｆ， ｄＴＴＰを用いることもでき
る。この場合、ｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰ−ｆが一つず
つ取り込まれて２塩基伸長し、生成する蛍光標識断片は
野生型の場合３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＧＧｔｇａｃｃｔ
ａｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−５’、変
異型の場合 ３’−Ｃ（−ｆ）ｔｃｔＡＧｔｇａｃｃｔ
ａｔａｔｃｃｃｔｇｇ−５’である。これらはいずれも
ｄｄＣＴＰ−ｆよりも早く電気泳動し、２分以内に結果
を知ることができる。蛍光体がＣｙ５やＣｙ５．５やＴ
ｅｘａｓＲｅｄでは、ｄｄＮＴＰ−ｆが蛍光標識断片よ
り遅く泳動される条件を作ることができる。これは、蛍
光体のチャージに強く依存しており、フルオレッセイン
のようなマイナスチャージを持つ蛍光体ではｄｄＮＴＰ
−ｆが早く泳動するのでこれは成立しない。
【００１８】＜実施例３＞第３の実施例はＳＮＰｓの頻
度解析の例である。個人のＳＮＰｓ解析の場合には現れ
るスペクトルパターンは野生型ホモ、変異型ホモおよび
ヘテロの３種である。此処では変異種が何％入っている
かなどの詳しい定量分析は不要である。測定対象がこれ
ら３つのいずれに属するか決めることをＳＮＰタイピン
グと言っている。ＳＮＰｓと医薬品感受性あるいは病気
に関する感受性との関連を調べるには数万人にもなる非
常に多くの患者のＳＮＰｓを調べてこれら感受性との相
関関係を調べる必要がある。ＳＮＰｓのかずは数百万と
言われているのでひとつ筒これを調べると大変な労力が
必要である。そこで、患者サンプルを症状毎にあるいは
医薬品応答のタイプ毎に混合してＳＮＰｓを測定して病
気や医薬品に対する応答とＳＮＰｓの関連を調べること
が良いスクリーニング方法として考えられている。これ
には変異ターゲットと野生型ターゲットを鋳型として同
時に同じ条件で相補鎖合成して得られる産物を分離して
精度良く検出する必要がある。相補鎖合成とゲル電気泳
動を用いるＳＮＰｓタイピング方法として使われている
４種の蛍光標識ｄｄＮＴＰを用いて相補鎖合成して１塩
基伸長する方法では野生型から得られる相補鎖も変異型
から得られる相補鎖も同じ塩基長であり電気泳動分離し
たときに得られるピークが重なる。これらを色分離検出
して相対的な存在比を計算するが誤差が大きい難点があ
る。本発明では同じ色素で同じ条件下で相補鎖合成して
電気泳動分離して同じ検出器で検出するので定量的な評
価にはより適した方法である。短時間で電気泳動を完了
するチップ電気泳動を用いてもＤＮＡ鎖長が１０塩基以
上離れるとピークは完全に分離できるので定量検討に適
している。図３は変異型プライマーの信号強度（Ｉｍ）
および野生型プライマーの信号強度（Ｉｗ）の和（Ｉｗ
＋Ｉｍ）を母数にして変異型の信号強度（Ｉｍ）割合を
表した検量線３１である。３２のポイントが変異型１％
のプロットである。この結果より１％以下の精度で分析
できる事がわかる。変異株の存在量と信号強度が比例関
係にあることから、本方法が変異株の存在比を調べるの
に有効である事が分かる。このような分析はプールサン
プル分析として特に重要視されているが良い方法がなく
新たな方法が望まれていたものである。存在量の少ない
ＳＮＰｓの頻度解析には野生型プライマーに対して変異
型プライマーを相対的に多く入れて測定することも有効
である。これにより、変異型のプライマーに蛍光標識が
導入された相補鎖伸長産物が多く生成して少ない頻度で
現れる変異型をより簡単に計測できる。
度解析の例である。個人のＳＮＰｓ解析の場合には現れ
るスペクトルパターンは野生型ホモ、変異型ホモおよび
ヘテロの３種である。此処では変異種が何％入っている
かなどの詳しい定量分析は不要である。測定対象がこれ
ら３つのいずれに属するか決めることをＳＮＰタイピン
グと言っている。ＳＮＰｓと医薬品感受性あるいは病気
に関する感受性との関連を調べるには数万人にもなる非
常に多くの患者のＳＮＰｓを調べてこれら感受性との相
関関係を調べる必要がある。ＳＮＰｓのかずは数百万と
言われているのでひとつ筒これを調べると大変な労力が
必要である。そこで、患者サンプルを症状毎にあるいは
医薬品応答のタイプ毎に混合してＳＮＰｓを測定して病
気や医薬品に対する応答とＳＮＰｓの関連を調べること
が良いスクリーニング方法として考えられている。これ
には変異ターゲットと野生型ターゲットを鋳型として同
時に同じ条件で相補鎖合成して得られる産物を分離して
精度良く検出する必要がある。相補鎖合成とゲル電気泳
動を用いるＳＮＰｓタイピング方法として使われている
４種の蛍光標識ｄｄＮＴＰを用いて相補鎖合成して１塩
基伸長する方法では野生型から得られる相補鎖も変異型
から得られる相補鎖も同じ塩基長であり電気泳動分離し
たときに得られるピークが重なる。これらを色分離検出
して相対的な存在比を計算するが誤差が大きい難点があ
る。本発明では同じ色素で同じ条件下で相補鎖合成して
電気泳動分離して同じ検出器で検出するので定量的な評
価にはより適した方法である。短時間で電気泳動を完了
するチップ電気泳動を用いてもＤＮＡ鎖長が１０塩基以
上離れるとピークは完全に分離できるので定量検討に適
している。図３は変異型プライマーの信号強度（Ｉｍ）
および野生型プライマーの信号強度（Ｉｗ）の和（Ｉｗ
＋Ｉｍ）を母数にして変異型の信号強度（Ｉｍ）割合を
表した検量線３１である。３２のポイントが変異型１％
のプロットである。この結果より１％以下の精度で分析
できる事がわかる。変異株の存在量と信号強度が比例関
係にあることから、本方法が変異株の存在比を調べるの
に有効である事が分かる。このような分析はプールサン
プル分析として特に重要視されているが良い方法がなく
新たな方法が望まれていたものである。存在量の少ない
ＳＮＰｓの頻度解析には野生型プライマーに対して変異
型プライマーを相対的に多く入れて測定することも有効
である。これにより、変異型のプライマーに蛍光標識が
導入された相補鎖伸長産物が多く生成して少ない頻度で
現れる変異型をより簡単に計測できる。
【００１９】＜実施例４＞本実施例は複数のサンプルを
同時にタイピングする例である。この場合、複数の変異
部位に対応した信号を分離検出してピークの同定をする
必要がある。電気泳動スペクトルの横軸すなわち電気泳
動時間は条件によって変化するので、その都度標準物質
を同時に電気泳動するなどしてピークの同定をする必要
がある。より簡単に観測された信号が変異種のターゲッ
トによるのか、野生型のターゲットによるのか同定する
のに都合の良い方法を開示する。
同時にタイピングする例である。この場合、複数の変異
部位に対応した信号を分離検出してピークの同定をする
必要がある。電気泳動スペクトルの横軸すなわち電気泳
動時間は条件によって変化するので、その都度標準物質
を同時に電気泳動するなどしてピークの同定をする必要
がある。より簡単に観測された信号が変異種のターゲッ
トによるのか、野生型のターゲットによるのか同定する
のに都合の良い方法を開示する。
【００２０】通常電気泳動スペクトルに現れるパターン
は１本のピークである。ピークの形状を変えて識別でき
るようにすれば標準物質などを用いなくても、また、野
生型に起因するピークと変異型に起因するピークの間隔
を短くしても識別検出できる。本実施例では、野生型の
プライマーを２つの異なる長さのポリＴを付加したプラ
イマー（異なる泳動速度のプライマーであればよい）か
ら構成し、スペクトル上でピークに特徴ある形を作るよ
うにした。より具体的にサンプル１に対する野生型のプ
ライマーで示すと 野生型プライマー ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１５） および ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔ−５’（配列番号１６） であり、比率を２：１の５ ｐｍｏｌと２．５ ｐｍｏ
ｌ（５０μｌスケール）とした。一方、変異型プライマ
ーは３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ
−５’ （５ ｐｍｏｌ）（配列番号１４）である。こ
こで、野生型プライマーに付けるポリＴの長さは３塩基
及び６塩基であり前の実施例より短くしてある。得られ
るスペクトルパターンは図４に示したように形から変異
種と野生型を容易に識別できる。調べようとするＳＮＰ
ｓが複数ある場合には、まず、ゲノムから前期と同様に
目的とする領域を複数ＤＮＡ断片同時ＰＣＲなどで増や
した後、前期と同様にターゲットのＤＮＡ鎖を１本鎖と
して取り出す。各ＳＮＰｓに対応する検査用プライマー
をサンプルと混合しハイブリダイゼーションを行う。Ｃ
ｙ−５（異なる蛍光体を用いても良い）で標識された４
種のｄＮＴＰ−ｆを加えて相補鎖合成する。もちろん、
ｄｄＮＴＰ−ｆとｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰ−ｆとｄｄ
ＮＴＰの組み合わせでも良い。検査用のプライマーはＳ
ＮＰｓの種類ごとに異なる位置に蛍光標識された相補鎖
合成産物が現れるようにプライマーの長さや泳動速度を
調製しておく。図５は複数（３種）のサンプルを測定し
た例である。５１、５４、５７が変異型のピーク、５２
と５３の組、５５と５６の組、５８と５９の組が５１、
５４、５７に対応する野生形のピークである。どのＳＮ
Ｐｓについても必ず野生型か変位型のピークが観測され
る。場合によっては両方の信号が観測される。ピーク形
状の違いに注目するとヘテロタイプのサンプルでは真ん
中が低く、量端が高い３本のピークで並んでいることに
なる。ホモの場合にはいずれかの高いピークが消失する
（変異型では低いピークも消失）ので容易にＳＮＰｓの
タイプを判別でき、全てのＳＮＰｓが同定できる。
は１本のピークである。ピークの形状を変えて識別でき
るようにすれば標準物質などを用いなくても、また、野
生型に起因するピークと変異型に起因するピークの間隔
を短くしても識別検出できる。本実施例では、野生型の
プライマーを２つの異なる長さのポリＴを付加したプラ
イマー（異なる泳動速度のプライマーであればよい）か
ら構成し、スペクトル上でピークに特徴ある形を作るよ
うにした。より具体的にサンプル１に対する野生型のプ
ライマーで示すと 野生型プライマー ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｔｔｔ−５’（配列番号１５） および ３’−ｃｔＧＧｔｇａｃｃｔａｔａ
ｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔ−５’（配列番号１６） であり、比率を２：１の５ ｐｍｏｌと２．５ ｐｍｏ
ｌ（５０μｌスケール）とした。一方、変異型プライマ
ーは３’−ｃｔＡＧｔｇａｃｃｔａｔａｔｃｃｃｔｇｇ
−５’ （５ ｐｍｏｌ）（配列番号１４）である。こ
こで、野生型プライマーに付けるポリＴの長さは３塩基
及び６塩基であり前の実施例より短くしてある。得られ
るスペクトルパターンは図４に示したように形から変異
種と野生型を容易に識別できる。調べようとするＳＮＰ
ｓが複数ある場合には、まず、ゲノムから前期と同様に
目的とする領域を複数ＤＮＡ断片同時ＰＣＲなどで増や
した後、前期と同様にターゲットのＤＮＡ鎖を１本鎖と
して取り出す。各ＳＮＰｓに対応する検査用プライマー
をサンプルと混合しハイブリダイゼーションを行う。Ｃ
ｙ−５（異なる蛍光体を用いても良い）で標識された４
種のｄＮＴＰ−ｆを加えて相補鎖合成する。もちろん、
ｄｄＮＴＰ−ｆとｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰ−ｆとｄｄ
ＮＴＰの組み合わせでも良い。検査用のプライマーはＳ
ＮＰｓの種類ごとに異なる位置に蛍光標識された相補鎖
合成産物が現れるようにプライマーの長さや泳動速度を
調製しておく。図５は複数（３種）のサンプルを測定し
た例である。５１、５４、５７が変異型のピーク、５２
と５３の組、５５と５６の組、５８と５９の組が５１、
５４、５７に対応する野生形のピークである。どのＳＮ
Ｐｓについても必ず野生型か変位型のピークが観測され
る。場合によっては両方の信号が観測される。ピーク形
状の違いに注目するとヘテロタイプのサンプルでは真ん
中が低く、量端が高い３本のピークで並んでいることに
なる。ホモの場合にはいずれかの高いピークが消失する
（変異型では低いピークも消失）ので容易にＳＮＰｓの
タイプを判別でき、全てのＳＮＰｓが同定できる。
【００２１】＜実施例５＞ここではＳＮＰｓタイピング
を中心に有効性を述べたが、一般の遺伝子タイピング
（検査対象のＤＮＡ中に目的とする配列を持ったものが
あるか否かを調べること）にも応用可能である。検査し
ようとする部位にハイブリダイズする種々長さのプロー
ブを用意する。電気泳動パターンとして現れたときにど
のピークが何に相当するかわかるように、いくつかのプ
ローブについてはターゲットにハイブリダイズする部分
の配列は同じで５’末端にＴやＡを１−２塩基付加した
プローブ（プライマー）を一定の比率で混合しておく。
スペクトルパターン中にはこの混合比を反映したピーク
型が現れるので種々のピークが同時に現れても、また、
電気泳動速度が変化して単純に泳動時間からピークの同
定が困難な場合でも、形状からピークの同定が容易であ
る。複数のＤＮＡプローブが一度に電気泳動すると分離
能などの点で問題となる場合もあるが、この場合、グル
ープ分けしたサンプルを時系列的に電気泳動分離して連
続して分離解析することもできる。特に電気泳動時間が
短いので繰り返し測定してもあまり多くの時間を必要と
しない利点がある。
を中心に有効性を述べたが、一般の遺伝子タイピング
（検査対象のＤＮＡ中に目的とする配列を持ったものが
あるか否かを調べること）にも応用可能である。検査し
ようとする部位にハイブリダイズする種々長さのプロー
ブを用意する。電気泳動パターンとして現れたときにど
のピークが何に相当するかわかるように、いくつかのプ
ローブについてはターゲットにハイブリダイズする部分
の配列は同じで５’末端にＴやＡを１−２塩基付加した
プローブ（プライマー）を一定の比率で混合しておく。
スペクトルパターン中にはこの混合比を反映したピーク
型が現れるので種々のピークが同時に現れても、また、
電気泳動速度が変化して単純に泳動時間からピークの同
定が困難な場合でも、形状からピークの同定が容易であ
る。複数のＤＮＡプローブが一度に電気泳動すると分離
能などの点で問題となる場合もあるが、この場合、グル
ープ分けしたサンプルを時系列的に電気泳動分離して連
続して分離解析することもできる。特に電気泳動時間が
短いので繰り返し測定してもあまり多くの時間を必要と
しない利点がある。
【００２２】
【発明の効果】以上説明したように本発明では一つのタ
ーゲットＤＮＡ配列部位に対して長さの異なる二つのプ
ライマー（プローブ）を同時に用いてターゲットにハイ
ブリダイズし、ハイブリダイズしたものについて相補鎖
合成可能な条件のものについて同じ塩基数だけ相補鎖合
成すると共に蛍光標識を取り込み、短い電気泳動、早い
電気泳動で短時間に分離検出ことで、簡便、高スループ
ット、低価格機器の使用などを実現するものである。Ｓ
ＮＰｓ分析の場合について言うと、２つのプライマーす
なわち野生型ターゲットＤＮＡにマッチする野生型プラ
イマーと変異型ターゲットにマッチする変異型プライマ
ーを混合したものを検査用のプライマーとして用いて相
補鎖合成により蛍光標識核酸をプライマーの末端に導入
する。この時ターゲットにマッチしたプライマーにだけ
蛍光標識核酸は導入される。変異型プライマーと野生型
プライマーとでは長さが異なるように作られており、短
いゲル電気泳動で短時間に分離検出する事ができる。相
補鎖合成はターゲットにマッチしたプライマーにだけ起
こるが、この場合に伸びる塩基数は野生型と変異型で同
じである。そこで長さの違いから容易にどちらのプライ
マーか区別することができる。此処では野生型プライマ
ーの５’末端にポリＴをつけたが、ＤＮＡ以外の原子団
をつけて電気泳動速度を変化させても良く、いずれの場
合も短時間で電気泳動分離できるものである必要があ
る。この結果１―２分で変異の有無を調べる事を可能と
した。泳動路を１００本持った装置を使用し、測定サイ
クルを長めに見て３分とすると１時間で２０００の変異
測定が可能である。また、一日１０時間稼働すると２万
のＳＮＰｓタイピングを可能とする高スループットＳＮ
Ｐｓタイピングを可能とする。さらに、ＳＮＰｓと医薬
品感受性の関連研究で重要となる変異ＤＮＡの存在比計
測にも活用できる方法であり、ＤＮＡ検出分野に大きく
貢献する方法である。
ーゲットＤＮＡ配列部位に対して長さの異なる二つのプ
ライマー（プローブ）を同時に用いてターゲットにハイ
ブリダイズし、ハイブリダイズしたものについて相補鎖
合成可能な条件のものについて同じ塩基数だけ相補鎖合
成すると共に蛍光標識を取り込み、短い電気泳動、早い
電気泳動で短時間に分離検出ことで、簡便、高スループ
ット、低価格機器の使用などを実現するものである。Ｓ
ＮＰｓ分析の場合について言うと、２つのプライマーす
なわち野生型ターゲットＤＮＡにマッチする野生型プラ
イマーと変異型ターゲットにマッチする変異型プライマ
ーを混合したものを検査用のプライマーとして用いて相
補鎖合成により蛍光標識核酸をプライマーの末端に導入
する。この時ターゲットにマッチしたプライマーにだけ
蛍光標識核酸は導入される。変異型プライマーと野生型
プライマーとでは長さが異なるように作られており、短
いゲル電気泳動で短時間に分離検出する事ができる。相
補鎖合成はターゲットにマッチしたプライマーにだけ起
こるが、この場合に伸びる塩基数は野生型と変異型で同
じである。そこで長さの違いから容易にどちらのプライ
マーか区別することができる。此処では野生型プライマ
ーの５’末端にポリＴをつけたが、ＤＮＡ以外の原子団
をつけて電気泳動速度を変化させても良く、いずれの場
合も短時間で電気泳動分離できるものである必要があ
る。この結果１―２分で変異の有無を調べる事を可能と
した。泳動路を１００本持った装置を使用し、測定サイ
クルを長めに見て３分とすると１時間で２０００の変異
測定が可能である。また、一日１０時間稼働すると２万
のＳＮＰｓタイピングを可能とする高スループットＳＮ
Ｐｓタイピングを可能とする。さらに、ＳＮＰｓと医薬
品感受性の関連研究で重要となる変異ＤＮＡの存在比計
測にも活用できる方法であり、ＤＮＡ検出分野に大きく
貢献する方法である。
【００２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> HITACHI, LTD.
<120> A method for testing a gene
<130> H200747
<160> 16
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>1
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t 31
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>2
acagacctat atccctggat g 21
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 10
<400>3
cttccatgat ataaccattc tttttttttt t 31
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 10 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 9
<400>4
gttccatgat ataaccattc t 21
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 11
<400>5
acgtagtgct ccaatcctca attttttttt t 31
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 11 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 11
<400>6
gcgtagtgct ccaatcctca a 21
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 12 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 12
<400>7
cagcagctcc ttaagattac gttttttttt t 31
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 12 and be complementary extend to the DNA template represented by
SEQ ID NO: 12
<400>8
aagcagctcc ttaagattac g 21
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>9
ccgaggcata gtagaygact ggatataggg acctac 36
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>10
aaaatataaa ataaasatgg tactatattg gtaaga 36
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>11
ggaggctgag gtgggyggat cacgaggtta ggagtt 36
<210>12
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA template
<400>12
ttggtccctg tcctaktggt cgaggaattc taatgc 36
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>13
ctggtgacct atatccctgg tttttttttt 30
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>14
ctagtgacct atatccctgg 20
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>15
ctggtgacct atatccctgg tttttt 26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>DNA primer which hybridize with a DNA template represented by SEQ I
D NO: 9 and be complementary extend to the DNA template represented by S
EQ ID NO: 9
<400>16
ctggtgacct atatccctgg ttt 23
【００２４】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：配列番号９に示
すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳
型と相補的に伸長させるDNAプライマー 配列番号２：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイ
ズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるD
NAプライマー 配列番号３：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号４：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号５：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号６：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号７：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号８：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号９：DNA鋳型 配列番号１０：DNA鋳型 配列番号１１：DNA鋳型 配列番号１２：DNA鋳型 配列番号１３：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１４：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１５：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１６：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー
すDNA鋳型とハイブリダイズし、配列番号９に示すDNA鋳
型と相補的に伸長させるDNAプライマー 配列番号２：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダイ
ズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させるD
NAプライマー 配列番号３：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号４：配列番号１０に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１０に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号５：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号６：配列番号１１に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１１に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号７：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号８：配列番号１２に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号１２に示すDNA鋳型と相補的に伸長さ
せるDNAプライマー 配列番号９：DNA鋳型 配列番号１０：DNA鋳型 配列番号１１：DNA鋳型 配列番号１２：DNA鋳型 配列番号１３：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１４：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１５：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー 配列番号１６：配列番号９に示すDNA鋳型とハイブリダ
イズし、配列番号９に示すDNA鋳型と相補的に伸長させ
るDNAプライマー
【図１】本発明の原理説明図である。
【図２】種々ポリＴを用いて分離能を調べた図である。
【図３】ＳＮＰｓの定量分析のための検量線を示す。
【図４】スペクトルパターンでピークを識別する結果を
示した図である。
示した図である。
【図５】混合分析の模式図である。
１１；検査プライマーのターゲットと相補的な部分
１２；プライマーがハイブリダイズするターゲットの配
列部分 １３；蛍光標識 １４；ポリＴの付いてない変異型ターゲットを調べるた
めの変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴ
マーによるピーク １５；ポリＴの付いている野生型ターゲットを調べるた
めの変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴ
マーによるピーク ２１；変異型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産
物 ２２；ＴＴＴを付加した野生型プライマーから得た蛍光
標識１塩基伸長産物 ２３；ＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマーから得
た蛍光標識１塩基伸長産物 ２４；ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマ
ーから得た蛍光標識１塩基伸長産物 ２５；Ｔ２０（Ｔが２０つながったもの）を付加した野
生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物 ４１；一種の変異プライマーを用いて得られるピークパ
ターン ４２；２−３マーの異なるポリＴを持つ野生型プライマ
ーを混合して得られるピークパターン ５１；ヘテロタイプのＳＮＰｓ検査部位１から得られる
パターン ５２；変異型のＳＮＰｓ検査部位２から得られるパター
ン ５３；野生型のＳＮＰｓ検査部位３から得られるパター
ン
列部分 １３；蛍光標識 １４；ポリＴの付いてない変異型ターゲットを調べるた
めの変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴ
マーによるピーク １５；ポリＴの付いている野生型ターゲットを調べるた
めの変異型プライマーに蛍光標識核酸が付加したオリゴ
マーによるピーク ２１；変異型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産
物 ２２；ＴＴＴを付加した野生型プライマーから得た蛍光
標識１塩基伸長産物 ２３；ＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマーから得
た蛍光標識１塩基伸長産物 ２４；ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴを付加した野生型プライマ
ーから得た蛍光標識１塩基伸長産物 ２５；Ｔ２０（Ｔが２０つながったもの）を付加した野
生型プライマーから得た蛍光標識１塩基伸長産物 ４１；一種の変異プライマーを用いて得られるピークパ
ターン ４２；２−３マーの異なるポリＴを持つ野生型プライマ
ーを混合して得られるピークパターン ５１；ヘテロタイプのＳＮＰｓ検査部位１から得られる
パターン ５２；変異型のＳＮＰｓ検査部位２から得られるパター
ン ５３；野生型のＳＮＰｓ検査部位３から得られるパター
ン
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２５Ｅ
(72)発明者 岡野 和宣
東京都国分寺市東恋ヶ窪一丁目280番地
株式会社日立製作所中央研究所内
(72)発明者 永井 啓一
東京都国分寺市東恋ヶ窪一丁目280番地
株式会社日立製作所中央研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 HA19
4B063 QA13 QQ42 QR32 QR55 QR62
QS25 QS34 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】 DNA配列の所定の検査部位に対して２つ
の長さの異なるあるいは電気泳動速度の異なるプライマ
ー（ＤＮＡプローブ）を混合したものを検査プローブと
して相補鎖合成を行い、蛍光標識ＤＮＡ鎖を得て、電気
泳動分離することを特徴とする遺伝子検査方法。 - 【請求項２】 前記検査部位は、野生型と変異型とで塩
基が異なる部位であり、野生型と変異型とで前記プライ
マーの伸長鎖の長さが異なるように試料調製することを
特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。 - 【請求項３】 前記相補鎖合成に際して蛍光標識核酸基
質（ｄＮＴＰあるいはｄｄＮＴＰ）を取り込み、蛍光検
出により相補鎖合成産物を検出することを特徴とする請
求項１記載の遺伝子検査方法。 - 【請求項４】 ゲル電気泳動はチップに溝を掘り泳動路
としたチップ電気泳動あるいはキャピラリーにゲルある
いは流動性ポリマーなどの分離媒体を詰めたキャピラリ
ー電気泳動であり、泳動路長は１０ｃｍ以下で有ること
を特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。 - 【請求項５】 前記プライマーは３’末端あるいは３’
末端近傍が変異を調べようとする部位にハイブリダイズ
するように設計されており、ワイルドタイプ検出用のプ
ライマーは変異を調べようとする部位がこの部位がター
ゲットにマッチするか否かで相補鎖合成による相補鎖伸
長がコントロールされ、検出用のプライマーは長さの異
なる変異型にマッチするプライマーとワイルド型にマッ
チするプライマーからなり、ターゲットにハイブリダイ
ズして相補鎖伸長反応を行い、マッチしたプライマーに
蛍光標識核酸基質（ターミネーター（ｄｄＮＴＰ−ｆｌ
ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）あるいは蛍光標識ｄＮＴＰ）を取
り込み、生成物をゲル電気泳動により分析することを特
徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。 - 【請求項６】 相補鎖合成により蛍光標識核酸気質を取
り込んだＤＮＡ鎖が蛍光標識核酸基質（ｄＮＴＰ−ｆｌ
ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）よりも早く電気泳動する条件下で
分離分析することを特徴とする請求項１記載の遺伝子検
査方法。 - 【請求項７】 前記相補鎖合成の基質としてｄＮＴＰあ
るいはｄｄＮＴＰと類似の相補鎖合成基質となる核酸ア
ナログを用いることを特徴とする請求項１記載の遺伝子
検査方法。 - 【請求項８】 ゲルあるいは流動性ポリマーを用いた電
気泳動による遺伝子検査方法であり、ターゲットハイブ
リダイゼーション特性が同一で長さの異なる一組のプラ
イマーを用いて１塩基あるいは数塩基の相補鎖合成を行
い、蛍光標識を取り込んで電気泳動分離する際、ターゲ
ット部位の種類により観測されるＤＮＡバンドの電気泳
動パターンのピーク形状が変化するように長さの異なる
当該プライマーを混合して検査プローブ（検査プライマ
ー）としたことを特徴とする遺伝子検査方法。
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| EP3286327B1 (en) | 2015-04-24 | 2021-11-10 | Agena Bioscience, Inc. | Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms |
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2003
- 2003-01-29 US US10/353,033 patent/US7049104B2/en not_active Expired - Fee Related
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