JP2003294739A

JP2003294739A - 生化学反応体の検出方法とバイオチップ

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Publication number: JP2003294739A
Application number: JP2002093951A
Authority: JP
Inventors: Tadaaki Yabubayashi; 忠顕薮林; Masazumi Tanaka; 正純田中
Original assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Precision Products Co Ltd
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2003-10-15
Anticipated expiration: 2022-03-29
Also published as: JP4050540B2

Abstract

(57)【要約】【課題】バイオチップを用いた生化学検体の検出工程
を再現性よく簡素化し、測定者に過度の技量を要求ぜ
ず、ハイブリダイゼーションと標識修飾工程における施
術とその効果の精度を高め、最終的に目的検体の検出精
度の向上が可能となる検出方法の提供。【解決手段】基板表面に固定されない解放端側又はそ
の標識を修飾可能にした部位が基板上や表面近傍の基板
側に位置するように、または生化学検体と相補的に結合
する主要部位が基板側に位置するように、基板に配列す
るプローブにループ構造を採用して立体的な構造を与え
ることで、生化学検体とのハイブリダイゼーションを行
った後、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつその
先端などに所要の箇所に標識を修飾することが可能とな
り、ハイブリダイゼーションと標識修飾工程における精
度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、バイオチップを
用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、基板に配列
されたプローブＲＮＡに例えば解放末端側が基板側に向
くようにループ構造を取らせることで、目的ＤＮＡやＲ
ＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、前
記ループ構造が解消されて伸びることから、ハイブリダ
イズした目的の複合体（生化学反応体）にのみ任意の標
識を修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーショ
ン並びに標識の修飾自体の精度が本来的に高く、高精度
の生化学検体の検出が実現できる生化学反応体の検出方
法とバイオチップに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子検出の基本原理は、ＤＮＡが相補
的な二重螺旋構造を形成することを利用するものであ
る。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）と
Ｇ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴ
ＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プロ
ーブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成
し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在する
と、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブ
ＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺
旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを
容易に選別できることになる。

【０００３】二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法とし
て、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標
識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡ
ハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈
したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発するものを検出
する、蛍光法が知られている。

【０００４】蛍光標識としては、蛍光色素そのものの
他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖
脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物
質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色
素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発す
る標識が提案されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のＤＮＡを初めと
して検出対象となる生化学検体には、ＲＮＡ及び核酸類
似構造物などの多種多様の構造物が想定される。これら
の生化学検体を効率よく検出するには、プローブとして
機能する所要の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ構造物
を所要のガラス基板などの基板上に配列してチップ化
し、かかるバイオチップを基本単位として目的検体を含
む生化学検体とのハイブリダイゼーションを施し、当該
ハイブリダイゼーションを完了した目的の複合体（生化
学反応体）を確実に検出する必要がある。

【０００６】検体側に蛍光標識を施す蛍光法を用い、前
記バイオチップにハイブリダイゼーションを行いハイブ
リダイズしたＤＮＡを検出する方法では、蛍光標識の修
飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって
前記ハイブリダイゼーション並びに標識の修飾効率が異
なること、さらに種々条件で蛍光色素の光消失が発生す
ること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの
上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されてい
る。

【０００７】この発明は、前記バイオチップを用いた生
化学検体の検出方法の問題に鑑み、検出工程を再現性よ
く簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがな
く、ハイブリダイゼーション並びに標識の修飾工程にお
けるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に
目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の
検出方法とバイオチップの提供を目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者らは、バイオチッ
プを用いた生化学検体の検出精度の向上を目的に、ガラ
スなどの基板にプローブが多数配列されたバイオチップ
において、プローブへ生化学検体をハイブリダイゼーシ
ョンさせる方法、プローブへの蛍光標識などの標識の修
飾方法について詳細に検討したところ、１）ハイブリダイゼーションを完了して二重螺旋構造を
形成したプローブへ標識を修飾すると、ハイブリダイズ
していないプローブへも修飾が行われて標識による検出
が不能となるため、従来、予め検体側に標識の修飾を施
しておき、ハイブリダイズした後に検体側の標識を検出
することで目的検体を検出するが、条件設定の違いや施
術者の技量などによりハイブリダイゼーション時に非特
異的な吸着が生じて検出精度が変動低下すること、２）プローブがＲＮＡ及び核酸類似構造物である場合、
プローブがＤＮＡ構造物ある時と比較して生化学検体と
の結合力が強く、かつ基板に多数のプローブが配列され
ているため、目的物以外との吸着やハイブリダイゼイシ
ョンの可能性が高くノイズが増大して目的生化学検体の
検出精度が低下すること、等の問題があることを知見
し、これらを解消するには、かかるプローブが多数配列
されるバイオチップにおいて、根本的に検出精度を向上
させ得る新たな基本構造を与えなければならないことに
着目した。

【０００９】そこで発明者らは、基板にプローブが多数
配列されたバイオチップにおいて、検出精度を向上させ
得る新たな基本構造、すなわち基板上のプローブが目的
の生化学検体とのみハイブリダイズできる構成を目的に
種々検討し、ハイブリダイズしたプローブにのみ標識を
修飾することで基本的に検出精度を高めることが可能で
あることに着目し、またあえて容易にはハイブリダイズ
できないようにして目的の生化学検体とのみハイブリダ
イズするように構成して本来的な検出精度を高めておく
ことに着目し、検出精度を高めることが可能となるプロ
ーブ自体の構成について鋭意検討した。

【００１０】その結果、発明者らは、ハイブリダイズし
たプローブのみが他のハイブリダイズしていないプロー
ブより外側へ伸びていると、その先端にのみ標識が修飾
可能であること、またプローブの生化学検体と相補的に
結合する主要部位が配列するプローブ内に潜り込んでい
ると容易にはハイブリダイズできないが、選択的にかつ
確実に目的の生化学検体とのみハイブリダイズ可能であ
ることに着目し、検出精度を高めるためにバイオチップ
に立体的な構造を与えることができる構成について検討
したところ、基板表面に固定されない解放端側又はその
標識を修飾可能にした部位が基板側に位置するように、
または生化学検体と相補的に結合する主要部位が基板上
や表面近傍の基板側に位置するように、基板に配列する
プローブにループ構造を採用することで、基本的に検出
精度を高めることが可能であることを知見した。

【００１１】また、発明者らは、かかるループ構造を有
するプローブを基板に配列したバイオチップの構成は、
生化学検体の検出操作において、前述の如く先に標識を
修飾した生化学検体を用いてハイブリダイゼーションす
るのではなく、従来とは逆に生化学検体とのハイブリダ
イゼーションを行った後、ハイブリダイズしたプローブ
にのみ、かつその先端などの所要の箇所に標識を修飾す
ることが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに
標識の修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の
検出精度が著しく向上するとともに、基本的に検出精度
の向上のために各工程で施術者の技量を要求しないた
め、生化学検体の検出操作が比較的容易になることを知
見した。

【００１２】さらに、発明者らは、この発明によるバイ
オチップの構成は、ハイブリダイズしたプローブや検体
にのみ選択的に標識の修飾が可能であることから、標識
には従来の蛍光標識、蛍光色素を初め、Ｓｉを含む金属
粒子、セラミックス粒子、化学発色体など任意の粒子を
採用できること、また最初に設けた標識を目標にさらに
別の標識を修飾でき、多重標識を形成できること、従っ
て用いた標識の種類に応じて種々の標識の検出方法を採
用でき、前記多重標識の場合は標識自体の大きさを目視
可能な大きさや形態にすることが可能になり、生化学検
体の性状に応じて最適な標識や検出方法を採用できるこ
とを知見し、この発明を完成した。

【００１３】この発明は、基板表面にプローブＲＮＡを
配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＲＮ
Ａに生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハ
イブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形
成したプローブＲＮＡ又は生化学検体あるいはその両方
に標識を修飾する工程、前記標識を検出・識別する工程
を有することを特徴とする生化学反応体の検出方法であ
る。

【００１４】この発明は、基板表面にプローブＲＮＡを
配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＲＮ
Ａに予め標識を修飾した生化学検体をハイブリダイゼー
ションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は
実行後に２本鎖を形成したプローブＲＮＡ又は生化学検
体あるいはその両方に標識を修飾する工程、前記標識を
検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学反
応体の検出方法である。

【００１５】この発明は、基板表面にプローブＲＮＡを
配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＲＮ
Ａに予め標識を修飾した生化学検体をハイブリダイゼー
ションする工程、前記標識を検出・識別する工程を有す
ることを特徴とする生化学反応体の検出方法である。

【００１６】また、この発明は、上述の生化学反応体の
検出方法において、２本鎖を形成したプローブＲＮＡ及
び／又は生化学検体に標識を修飾する方法に、先に第１
の標識を修飾してさらにそれを目標として第２の標識を
修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾を採用す
ることができる。

【００１７】さらに、この発明は、基板表面にプローブ
ＲＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプロ
ーブＲＮＡに生化学検体をハイブリダイゼーションする
工程、ハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成した
プローブ及び生化学検体とループ構造を取っている他プ
ローブとを高さの違いとして検出・識別する工程を有す
ることを特徴とする生化学反応体の検出方法である。

【００１８】また、この発明は、上述の生化学反応体の
検出方法において、・標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒
子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれか
である構成、・標識を検出・識別する方法が、光散乱法、ＳＰＲ分
光法、化学発色法、蛍光検知法、イメージング処理法、
目視法のいずれかである構成、・標識の有無かかわらずハイブリダイゼーションを検
出・識別する方法が、２本鎖を形成したプローブ及び生
化学検体とループ構造を取っている他プローブとを高さ
の違いとして検知する方法であり、電子又は光学顕微鏡
観察法、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法、Ｓ
ＴＭ，ＳＴＳ，ＡＦＭ観察法、電子回折法、Ｘ線回折
法、Ｘ線トポグラフ法、Ｘ線表面回折法、蛍光Ｘ線分析
法のいずれかである構成、・標識がプローブＲＮＡより大きい構成、・金属粒子が、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆ
ｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｓｉのいずれかで
ある構成、・セラミックス粒子が、ＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、Ｚｒ
Ｏ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯのいずれかである構成、・標識を検出・識別する方法が目視法であり、標識
が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、色
素、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞の
いずれかである構成、・標識の粒径が５００ｎｍ以上である構成、を併せて
提案する。

【００１９】さらに、この発明は、基板上に一方端を固
定して配列されたプローブＲＮＡを有し、配列したプロ
ーブＲＮＡは生化学検体と相補的に結合する主要部位
が、基板上又は表面近傍にあるか、あるいは配列したプ
ローブ内に潜り込むがごとく、基板側に位置するようル
ープ構造を有することを特徴とするバイオチップであ
る。

【００２０】この発明は、基板上に一方端を固定して配
列されたプローブＲＮＡを有し、配列したプローブＲＮ
Ａはその基板表面に固定されない解放端側又はその標識
を修飾可能にした部位が、基板上又は表面近傍にある
か、あるいは配列したプローブ内に潜り込むがごとく、
基板側に位置するようループ構造を有することを特徴と
するバイオチップである。

【００２１】この発明は、基板上に一方端を固定して配
列されたプローブＲＮＡを有し、配列したプローブＲＮ
Ａは第２の標識を修飾可能にした第１の標識が修飾され
た部位が基板側に位置するようループ構造を有すること
を特徴とするバイオチップである。

【００２２】

【発明の実施の形態】この発明において、生化学検体は
ＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、例えば、核
酸類似構造物としては、核酸のリボースあるいはリン酸
ジエステル部位を修飾した分子やリボーズ−リン酸骨格
をアミド結合に置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）等が
ある。

【００２３】この発明において、プローブＲＮＡはＲＮ
Ａ及び核酸類似構造物をいい、核酸類似構造物として
は、上記と同様である。

【００２４】この発明において、プローブＲＮＡにルー
プ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にルー
プ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列
する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にルー
プ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形
成方法も採用できる。

【００２５】例えば、プローブＲＮＡの所要の二箇所に
相補的な二重鎖を形成可能な対をなす塩基の配列、一例
として図ではＡとＵの箇所を予め形成しておき、図１Ａ
に示すごとく、基板１にプローブＲＮＡ１０を配列した
際の固定端１１側近くにある塩基配列と解放端１２側近
くにある塩基配列とで結合部１３が形成されてループ１
４を生成することで、プローブＲＮＡ１０の解放端１２
が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構
成することができる。

【００２６】また、図１Ｂに示す例は、基板１に配列し
たプローブＲＮＡ１０が、図１Ａと同様にプローブＲＮ
Ａ１０の固定端１１側近くにある塩基の配列と解放端側
近くにある塩基の配列とで結合部１３が形成されてルー
プ１４を生成することで、標識３を修飾可能にした部
位、図では解放先端に設けたビオチン基２が基板１上あ
るいは基板１上面近傍に位置するように構成してある。

【００２７】プローブＲＮＡにループ構造を形成するた
めの前記した対をなす塩基の配列を設ける箇所を適宜設
定することで、結合部１３箇所が先端側、中央あるいは
固定端側と種々形態のループ構造を形成し得る。図２に
示す例は、プローブＲＮＡ２０の解放端２２側の塩基と
対をなす塩基配列をプローブＲＮＡ２０の中央部側に配
置してある。

【００２８】図２Ａに示す例は、対をなす塩基の配列を
プローブＲＮＡ２０の中央部側に配置して、生化学検体
と相補的に結合する主要部位２５が図１のプローブＲＮ
Ａ１０構成例と比較してより基板１側へ向くようにルー
プ２４を形成してある。

【００２９】また、図２Ｂに示す例は、図２Ａと同様構
成で標識を修飾可能にした解放端２２に設けたビオチン
基２が基板１上方に位置しており、図１Ｂに示す例と同
様に標識３を修飾可能にしたビオチン基２部分が、基板
１との距離にかかわらず、プローブＲＮＡ２０の解放端
２２側と対をなす塩基の配列部分、中央の結合部２３と
ループ２４部分にそして固定端２１と中央の結合部２３
との間の脚２６部とで囲まれる形態であり、基板１とル
ープ２４の隙間ｘが標識３の寸法と同程度あるいはより
狭いと、解放端２２及びビオチン基２は基板１上でどの
ような向きであっても容易には標識３で修飾され難くな
る。

【００３０】この発明において、プローブＲＮＡには前
述の如く、生化学検体と相補的に結合する主要部位がル
ープ内に配列されるように、ループを形成する結合部、
例えばプローブＲＮＡの任意の二箇所に対をなす塩基の
配列等の結合可能な分子等を適宜設けることが可能であ
り、前記ループを形成する結合部の位置やループの形
状、あるいはプローブ解放端の向き等はいずれの構成も
採用できることは上記の説明から明らかである。

【００３１】例えば図３に示すごとく、ビオチン基２を
設けた解放端２２がより基板１に近接するように結合部
２３より解放端２２の間がより長い構成、図４に示すご
とく、図３と同様構成で結合部２３より解放端２２の間
がさらに長くかつビオチン基２が結合部２３側を向いて
いる構成、さらに図５に示すごとく、図２Ｂに示す例と
同様構成で、ループ２４部分がより基板１に近接するよ
う長くした構成等が採用できる。

【００３２】さらに、図２の構成は、上述したように図
１に比較して結合部２３をプローブＲＮＡ２０の中央に
位置させるために脚２６を設けているが、ここは特に結
合部２３の対をなす塩基の配列やループ２４部分の生化
学検体と相補的に結合する主要部位２５とは無縁である
から、必ずしも塩基等の配列である必要はなく、公知の
核酸類似構造物としたり、前記の基板１とループ構造の
隙間ｘの設定のために他の分子と置換したり、種々構成
を採用できる。

【００３３】また、この発明において、プローブＲＮＡ
には、複数の第２の標識を修飾可能にした第１の標識が
修飾された部位が基板上又はその近傍の基板側に位置す
るようループ構造を有する構成が採用でき、基板とルー
プの隙間は第２の標識の外径と同程度あるいはより狭
く、第２の標識がここを通過して第１の標識に容易に近
接することができない程度の隙間となるように、前記の
結合部を設ける箇所が適宜設定されるとよい。

【００３４】プローブＲＮＡにおいて、目的の生化学検
体と所要のハイブリダイゼーションが可能であり、かつ
上述のごとく種々目的のループ構造を形成することが可
能であれば、短鎖、長鎖を問わずいずれの塩基配列の構
成であっても採用できる。また、この発明において、塩
基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するも
のが望ましく、例えば本来的に標識が修飾し難い塩基数
が５０あるいは６０以上のものが検出精度の向上や検出
時のノイズの低減に望ましく、さらに塩基数が１００を
超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適
用できる。

【００３５】この発明において、ループを形成する結合
部として、プローブＲＮＡの任意の二箇所に対をなす塩
基の配列を設ける例を説明したが、塩基の配列以外の例
えば分子間結合が可能なもの、標識の修飾に用いた手段
など、プローブＲＮＡ内に配置・配列可能であり、かつ
ペアリングしてループを形成することが可能であれば、
いずれの分子、構造物であっても利用できる。また、か
かる結合部における結合力を、採用する塩基、分子種や
その配置や長さにより適宜選定することも可能で、ハイ
ブリダイゼーションや標識の修飾時における温度条件や
他の分子構造物（検体など）との結合力等を考慮して、
当該結合部における結合力をを選定できる。

【００３６】この発明において、バイオチップを形成す
るための基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基
板等の硬質材料の他、メンブラン（例えばニトロセルロ
ースなど）等の材料も採用可能で、また積層基板などプ
ローブＲＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの
材質、構成の基板も採用できる。また、必要に応じて基
板に貴金属薄膜など種々の薄膜を成膜する場合は、その
表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。

【００３７】かかる薄膜を成膜する場合、基板の洗浄、
乾燥方法としては、半導体ウエーハや各種デバイスを製
造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の
超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピ
ン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組
合せて採用できる。

【００３８】入手や取扱いの良好なガラス基板として
は、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚い
ほうが取り扱いやすいが、バイオチップとしては目的に
応じていずれの厚みのものも利用できる。

【００３９】また、プローブＲＮＡの配列を容易にする
ため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設ける
ことができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御す
るため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶ
Ｄ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基
板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成
膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板に
Ｃｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質する
などの手段を採用できる。

【００４０】この発明において、基板上あるいは所要薄
膜表面にプローブＲＮＡを配列する工程は、特に限定さ
れるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例え
ば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＲＮＡと緩衝液
を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができ
る。

【００４１】緩衝液としては、例えばＫＨ₂ＰＯ₄とＫ₂
ＨＰＯ₄を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。
他には、ＰＢＳや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｎａ
ＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要
ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用
できる。

【００４２】以下にこの発明による生化学反応体の検出
方法を詳述する。まず、基本工程を説明すると、・基板表面にプローブＲＮＡを配列する工程、・ループ構造を形成しているプローブＲＮＡに生化学
検体をハイブリダイゼーションする工程、・ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本
鎖を形成したプローブＲＮＡ又は生化学検体あるいはそ
の両方に標識を修飾する工程、・前記標識を検出・識別する工程、を有する。

【００４３】基板表面にプローブＲＮＡを配列する工程
は、前述した基板の構成、プローブＲＮＡの構成、プロ
ーブＲＮＡの配列方法において、明らかにしたとおりで
ある。

【００４４】ループ構造を形成しているプローブＲＮＡ
に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程は、特
に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用で
き、例えば基板の洗浄後に生化学検体と緩衝溶液を用い
てハイブリダイゼーションさせることができる。前記の
緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ
を配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。

【００４５】ハイブリダイゼーションの実行中又は実行
後に２本鎖を形成したプローブＲＮＡ又は生化学検体あ
るいはその両方に標識を修飾する工程は、文字どおり２
本鎖を形成したところのプローブＲＮＡか生化学検体、
あるいはそれぞれに所要の標識を修飾するもので、２本
鎖を形成して複合体となっている両者の結合部に選択的
に入り込むようなインターカレーターを標識とするもの
ではない。

【００４６】この発明において、前記標識には、Ｓｉを
含む金属粒子、セラミックス粒子、蛍光標識、蛍光色
素、色素、化学発色体、あるいは生化学検体の検出に利
用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵
素、細胞など、プローブＲＮＡ又は生化学検体に修飾で
きるもの、さらに前記の各種標識で再修飾できればいず
れのものも利用できる。

【００４７】金属粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａ
ｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚ
ｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に
微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択でき
る。特に必須条件ではないが、プローブや検体のＲＮ
Ａ、ＤＮＡなどの所要部位に修飾可能とすること、微粒
子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに
１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定
粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好まし
い。

【００４８】セラミックス粒子標識には、球形や固有の
結晶体など、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒
子表面には成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さら
に１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数
百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得ら
れるＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯな
どのセラミックス微粒子が好ましい。

【００４９】蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用
でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色
体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等
を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体
反応を利用して修飾させることが可能である。また、こ
の発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利
用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵
素、細胞をそのまま利用することも可能である。また、
蛍光でない色素も標識として利用できる。

【００５０】この発明において化学発色体は、発色反応
に関与するものを標識として修飾するもので、酵素法等
の化学的発色をさせる方法に用いる物質をいい、例えば
ビオチン誘導体で修飾した箇所を用意することで容易に
実施できる。

【００５１】この発明において、上述の各種標識をプロ
ーブＲＮＡに修飾する方法としては、例えば金属微粒子
等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修
飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾
するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中
性のコロイダル液のごとく、微粒子を均一分散させた溶
液の形態を利用することで修飾が容易になる。

【００５２】また、プローブＲＮＡの末端にビオチンを
修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属や
セラミックス等の微粒子をビオチン−アビジンの高い結
合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プ
ローブＲＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加
することで、タンパクをコートした前記微粒子等を抗原
−抗体反応を利用して修飾することが可能である。

【００５３】さらに、生化学検体に前記各種の標識を修
飾することが可能であり、修飾方法は、当該検体の所要
箇所を適宜標識化できればよく、上述の公知のいずれの
方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法な
どいずれの方法も採用できる。

【００５４】この発明において、上述の各種標識を検出
・識別する工程は、用いた標識に応じて適宜選定できる
ことが特徴であり、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色
法、蛍光検知法、イメージング処理法、目視法などを採
用することができる。例えば、金属微粒子標識を検出す
る方法としては、ＳＰＲ分光法、光散乱法、磁気検出
法、顕微鏡観察法、微分干渉顕微鏡を用いた顕微鏡画像
解析装置などが利用できる。

【００５５】光散乱法は、金属粒子やセラミックス微粒
子標識において、微粒子が反射する光で特定波長光を発
したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にするも
ので、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明に
よる金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置
し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板
裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させる
ように条件設定することで、検出チップ基板を上面から
観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができ
る。

【００５６】また、セラミックス微粒子自体が有する可
視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミック
ス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光
させてこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の
種類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法
や装置を適宜選定するとよい。

【００５７】ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面おける屈
折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金薄
膜を形成し、金薄膜上にプローブＲＮＡを固定化し、プ
ローブＲＮＡが検体中の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜上の屈折率
が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角
度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイ
ゼ一ションした目的ＤＮＡの量と対応するために、ＳＰ
Ｒ測定によってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
の定量的な解析が可能となる。

【００５８】具体的に説明すると、基板の貴金属薄膜表
面にプローブＲＮＡを配列してバイオチップを作製し、
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブ
に貴金属コロイドや金属粒子等の標識を修飾するもの
で、末端に標識への接着部位を修飾したプローブは、ル
ープ（ヘアピン）構造を取る場合は標識が全く接着でき
ないこと、このループ構造を取るプローブはその立体的
構造により選択的に目的検体とハイブリダイズすること
で基本的な検出精度が向上し、また、目的検体とのハイ
ブリダイゼーション反応によってＲＮＡ鎖が伸びた状態
になり、ハイブリダイズされたプローブＲＮＡに選択的
に標識の修飾が行われることで、前述のＳＰＲ角のシフ
トを増幅でき、高精度の検出が可能になる。

【００５９】この発明において、ハイブリダイゼーショ
ン後に２本鎖を形成したプローブ−生化学反応体（複合
体）をＳＰＲ分光法にて検出する工程は、液中あるいは
大気中のいずれも可能である。ＳＰＲ法の測定システム
としては、公知のいずれの構成も採用可能である。例え
ば実施例では、光源としＨｅ−Ｎｅレーザー（波長６３
２．８ｎｍ）を用い、偏光子によってｐ−偏光としプリ
ズムを介して全反射条件で貴金属薄膜基板に照射し、基
板からの反射光をフォトダイオードにより検出し、得ら
れた信号は、光チョッパー、ロックインアンプを用いて
外部ノイズを取り除き増幅を行うことができる。なお基
板は、屈折率整合剤を介してプリズム上に付着させ回転
ステージ上に固定し、この回転ステージを回転させて入
射角の変化を得ることができ、また、その際、フォトダ
イオードも基板を固定した回転ステージと同調させ回
転、移動させることができる。

【００６０】化学発色法は、免疫組織染色方法が応用で
きる。これは予め４つの結合部位をもつアビジンと複数
箇所でビオチン化されたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
適当な割合で混合し、多数のＨＲＰを含み一部にアビジ
ンのビオチン結合部位を残す複合体（ＡＢＣ）を形成さ
せて、この複合体（ＡＢＣ）と予め組織中の標的抗原と
結合したビオチン化抗体とを反応させて標的抗原を検出
するもので、例えばプローブにビオチンで修飾した箇所
を用意することで容易に適用できる。また、ＡＰＲ法な
ど公知の免疫組織染色方法も応用できる。

【００６１】蛍光検知法は、種々の蛍光色素自体を所要
部位に着設したり、又は蛍光色素によりタグ化された染
色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子
等を標識自体の性質を利用したり前述のごとく抗原−抗
体反応を利用して修飾させた物を検出するが、顕微鏡と
ＣＣＤカメラを組み合せた蛍光イメージング検出システ
ム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイ
メージング装置を併用した検出方法が提案されており、
前記蛍光標識の種類やその蛍光自体の性状等、条件に応
じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。ま
た、蛍光でない色素も同様に検知できる。

【００６２】要するに顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散
乱光の検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組
み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡シス
テム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージン
グ装置を併用した検出方法が提案されているが、これら
をそのまま利用することが可能である。

【００６３】イメージング処理法は、カメラ又は顕微鏡
にてスキャニングした画像をディスプレイで目視で確認
できるように拡大、鮮鋭化、着色化等、各種の公知の画
像処理を施したり、あるいはコントラストや特定形状、
寸法の粒子をソフトウェアー的に検出するために公知の
画像処理を施すなどの方法である。

【００６４】目視法は、この発明のバイオチップがハイ
ブリダイゼーションしたプローブＲＮＡと目的検体にの
み粒子標識を修飾できることから可能になるものであ
り、詳述した各種の標識粒子の集合体を目視にて観察
し、目的検体の有無を検出するものである。

【００６５】この発明において、標識は上述のごとく独
自の色や形を有しており、これらは集合して目視可能に
なるもので、検出に際しての第１の標識と第２の標識が
それぞれプローブ又は検体に設けられる場合はこれらを
目視することになる。また、第１の標識をターゲットに
して第２の標識が修飾される場合は、第１の標識と第２
の標識の両方を目視することになるが、第１の標識が目
視できないような場合は第２の標識のみを目視すること
になる。

【００６６】また、上述の第１の標識を修飾してさらに
それを目標として第２の標識を修飾する２段階修飾、あ
るいは先に修飾した標識にさらに修飾を繰り返す多段修
飾を行って、目視可能な標識粒子の集合体となすことが
可能である。

【００６７】この発明において、２本鎖を形成したプロ
ーブＲＮＡ及び生化学検体とループ構造を取っている他
プローブＲＮＡとを高さの違いで検出・識別する方法に
は、標識の修飾の有無にかかわらず、例えば半導体ウェ
ーハやデバイスの表面性状や形状、表層部を評価するた
めに採用されている公知の各種計測評価方法並びにその
装置を適宜利用することが可能である。

【００６８】例えば、電子線計測評価手法として、電子
顕微鏡を用いた視野法、電子回折法など、Ｘ線計測評価
手法として、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ、表面回折
法、Ｘ線干渉法など、電界磁界計測評価手法として、走
査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、走査トンネル分光（Ｓ
ＴＳ）、ＳＴＭファミリーのＡＦＭなど、光学的計測評
価手法として、光伝導法、光学顕微鏡法などがある。さ
らに、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法も利用
できる。雰囲気も上記の評価方法により異なるが、真空
中、大気中又は所要溶液中のいずれでも評価できる。

【００６９】また、基板に前記手法の検査対象であるシ
リコンウェーハを用いたり、標識の種類や性質を利用し
て前記手法の検出対象や信号発生源等にすることもでき
る。また、前記の各種評価方法において、得られた信
号、画像や回折像をさらに画像処理化して３次元画像化
する公知の手法や装置を併用して、ハイブリダイゼーシ
ョン後の２本鎖を形成したプローブＲＮＡとループ構造
を取っている他プローブＲＮＡとの高さの違いを検出、
識別することができる。

【００７０】以上詳述したこの発明によるバイオチップ
を用いた生化学反応体の検出方法において、１）ループ
構造を形成しているプローブＲＮＡに予め標識を修飾し
た生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、２）
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を
形成したプローブＲＮＡ又は生化学検体あるいはその両
方に標識を修飾する工程、３）前記標識を検出・識別す
る工程を採用することも可能である。

【００７１】又、同様に生化学反応体の検出方法におい
て、１）前記のループ構造を形成しているプローブＲＮ
Ａに予め標識を修飾した生化学検体をハイブリダイゼー
ションする工程、前記標識を検出・識別する工程を採用
することも可能である。

【００７２】

【実施例】実施例１検出目標を、キャンピロバクター・ジェミニ（Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）Ｏ−１９血清型ｇｙ
ｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐのＤＮＡとし、これ
とその中央部で相補的に結合する中央６０塩基のＲＮＡ
をプローブＲＮＡとして作製した。又、比較のために前
記ＤＮＡと末端部で相補的に結合する末端３０塩基のＤ
ＮＡ、中央部で相補的に結合する中央３０塩基のＤＮ
Ａ、中央６０塩基のＤＮＡの３種類をプローブＤＮＡと
して作製した。なお、３０塩基のものは同一鎖内でルー
プを形成しないように、６０塩基のものは同一鎖内でル
ープを形成するように構成した。

【００７３】ガラス基板をアセトン、メタノール、超純
水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒
間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノー
ル、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させ
た。その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス
基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０
ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。

【００７４】前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超
純水で洗浄した後、プローブＲＮＡ、ＤＮＡの３’端側
をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチン基で修飾
したプローブＲＮＡ，ＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ₂
ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０）を基板上に滴下
し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＲＮ
Ａ、ＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出用
バイオチップとなした。

【００７５】ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶
液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）とＨ
−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．４）で洗浄後に、乾燥せずに検体ＤＮＡ
のＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１
６〜２４時間放置して実施した。

【００７６】前記チップ上のこの発明のスポットと比較
のスポットの４種に対して、前記ＤＮＡ鎖を用いてハイ
ブリダイゼーションを実施した後、アビジンをコートし
た蛍光微粒子をプローブに対して修飾した。その後、蛍
光倒立顕微鏡とＣＣＤカメラを用いてハイブリダイゼー
ションの検出、すなわち蛍光の検出を実施した。

【００７７】また、４種のスポット（プローブ）に対し
て、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、
アビジンをコートした蛍光微粒子で蛍光標識の修飾処理
を行い、その後蛍光の検出を実施した。

【００７８】塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、
ループ構造を有していないため、目的ＤＮＡとのハイブ
リダイゼーション前後でいずれも蛍光発光が観測され、
ハイブリダイゼーションの有無にかかわらず蛍光標識の
修飾が可能であること、すなわち目的ＤＮＡの検出が困
難であることを確認した。

【００７９】一方、塩基数６０のプローブＤＮＡ及びプ
ローブＲＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイ
ゼーション前では蛍光標識の修飾が全くできず、ハイブ
リダイゼーション後では目的ＤＮＡとのハイブリダイゼ
ーションが行われたプローブからのみ強い蛍光を観測す
ることができ、塩基数６０のプローブはループ構造を有
しており、ハイブリダイズしたプローブにのみ、その先
端に標識を修飾することが可能であり、目的ＤＮＡの検
出が容易であることが確認できた。

【００８０】また、本発明のプローブＲＮＡの場合は、
ＤＮＡ−ＲＮＡ結合の安定性がＤＮＡ−ＤＮＡ結合より
強いため、比較の６０塩基のプローブＤＮＡに比較して
検出感度がより高くなることを確認した。

【００８１】実施例２検出目標には、実施例１のＤＮＡに換えてＲＮＡを使用
した。すなわち、ｇｙｒＢ遺伝子（Ｃａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）より、イン・ビトロＲＮＡ
合成法により作製し、精製した約８００塩基のＲＮＡを
用いた。

【００８２】また、プローブＲＮＡには上記の合成ＲＮ
Ａと中央で相補的に結合する６０塩基のＲＮＡを用い
て、実施例１と同様のガラス基板に同様条件で配列して
この発明によるバイオチップを作製した。

【００８３】ここで標識の修飾方法として採用した金コ
ロイド修飾方法は、上記のバイオチップをハイブリダイ
ゼーション後にＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、窒素ガスでお
だやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロ
イド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時
間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジ
ンの特異的結合を利用して修飾させた。

【００８４】また、金属微粒子修飾は、プローブの５’
端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジ
ンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用い
て、ｐＨ７．４のコロイダル液となして実施した。

【００８５】前記の長いＲＮＡ鎖を用いて実施例１と同
様にハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド
修飾又は金属微粒子修飾を行い、その後ＳＰＲ測定を行
った。また比較のため、同時に目的ＲＮＡを有しないＨ
−ＢＦＲ溶液をプローブＲＮＡと反応させた後、標識に
よる修飾処理をしてからＳＰＲ測定を行った。なお、Ｓ
ＰＲ測定は、バイオチップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に
窒素ガスで穏かに乾燥し、その後速やかにＳＰＲ測定を
行なった。ＳＰＲ測定はイメージングシステムを用いて
行った。

【００８６】その結果、目的ＲＮＡとハイブリダイゼー
ションしたプローブＲＮＡのみに選択的に金コロイド修
飾及び金属微粒子修飾が可能であり、従って、ＳＰＲ角
度シフト増幅が可能で、ハイブリダイゼーションの検出
が可能であることを確認した。さらに、前記金コロイド
修飾と同様方法でストレプトアビジンを修飾した場合も
同様に目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプロー
ブＲＮＡのみに選択的に修飾が可能であった。

【００８７】さらに、比較のため、前記ハイブリダイゼ
ーションを実施することなく、アビジンをコートしたＦ
ｅ微粒子標識の修飾処理を行った。しかし、目的ＲＮＡ
とのハイブリダイゼーション前ではＦｅ微粒子標識の修
飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後ではＦｅ微
粒子標識の修飾が行われ、ハイブリダイゼーション前後
で明らかな差が見られた。

【００８８】また、上記のハイブリダイゼーションを実
施する際に、目的ＲＮＡがある場合と、ない場合を設定
して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分
干渉顕微鏡にて観察を行った。目的ＲＮＡがある場合に
は、Ｆｅ微粒子が多数観察されたが、目的ＲＮＡがない
場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されなかった。な
お、前記バイオチップのいずれの場合も、表面に粒状感
のあるなしで明確に目的ＲＮＡの存在を目視で区別する
ことができた。

【００８９】実施例３実施例２において、プローブＲＮＡの修飾に、前述の金
又はＦｅ微粒子に換えて、ビオチン基で修飾したプロー
ブの５’端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合
させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用い
て、ｐＨ７．４のコロイダルシリカとなして実施し
た。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ〜８０
０ｎｍの種々粒径のものを用いた。

【００９０】ハイブリダイゼーションの検出は、検出チ
ップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプ
リズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方
側へこれを全反射させて、検出チップ上面から観察する
ＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。

【００９１】また、比較のため、前記ハイブリダイゼー
ションを実施することなく、アビジンをコートしたシリ
カ微粒子標識の修飾処理を行った。その結果、目的ＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーション前では、シリカ微粒子標
識の修飾が全く実施できず、散乱光を観測することがで
きなかったが、ハイブリダイゼーション後では目的ＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーションが行われたプローブＲＮ
Ａからのみ強い散乱光を観測することができた。また、
いずれの粒径のシリカ粒子の場合も同様に目的ＲＮＡの
検出が可能であった。

【００９２】実施例４実施例２において、プローブＲＮＡの修飾に、前述の金
又はＦｅ微粒子コロイダル修飾に換えて、アビジン−ビ
オチン−ペルオキシターゼ複合体を用いるＡＢＣ法によ
る化学発色（酵素）法を実施した。すなわち、前記複合
体を滴下して室温で１ｈｒ放置した。その後、ＴＢＳ−
Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０添加ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄ
Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、テトラメチルベンジン溶液を
滴下し、５〜１５ｍｉｎ、室温で放置した。

【００９３】その後、超純水にて洗浄し、窒素ガスにて
乾燥させた。その結果、目的ＲＮＡがある場合は発色し
たが、目的ＲＮＡがない場合は発色せず、明確に目視に
て識別することができた。

【００９４】又、同じバイオチップを用い、上記のＡＢ
Ｃ法に換えてアビジンをコートした色素を滴下し、室温
〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。
その後、ＴＢＳで洗浄し、窒素ガスにて乾燥させたとこ
ろ、目的ＲＮＡがある場合は着色したが、目的ＲＮＡが
ない場合は着色せず、明確に目視にて目的遺伝子を検出
できた。

【００９５】上記実施例において、実施例２と同等のバ
イオチップを用い、ハイブリダイゼーション後アビジン
をコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気
中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄
し、さらに、予め染色されたタンパクにビオチンを修飾
した第２の標識を、上記条件と同様に滴下して、修飾処
理した。その後ＴＢＳで洗浄し、乾燥させたところ、目
的ＲＮＡがある場合は上記の色素のみに比較して強く着
色し、また目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目
視にて目的ＲＮＡを確認することができた。

【００９６】実施例５実施例３のコロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ
の粒径のものを用い、ハイブリダイゼーションを検出す
る方法として、ＳＴＭ、ＳＴＳ、ＡＦＭの３種を実施し
た。目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシリ
カ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼ
ーション後ではシリカ微粒子標識の修飾が行われたこと
から、ハイブリダイゼーション前後で１１０ｎｍ〜３０
０ｎｍの段差を確認した。なお、ハイブリダイゼーショ
ン後に標識の修飾を行わない場合は、目的ＲＮＡとハイ
ブリダイズせずにループ構造をとっているプローブＲＮ
Ａとハイブリダイズして２重鎖を形成したプローブＲＮ
Ａとで１５ｎｍ〜３００ｎｍの段差を確認した。又、い
ずれの検出方法でも画像処理化することで、バイオチッ
プ表面に段差があるかないかを簡単に確認できた。

【００９７】また、実施例２の平均粒径が１μｍ程度の
Ｆｅ微粒子のコロイダル修飾において、ハイブリダイゼ
ーションを検出する方法として、走査反射電子顕微鏡に
よる観察を実施したところ、目的ＲＮＡがある場合とな
い場合で１０００ｎｍ〜１０５０ｎｍの段差を確認し
た。

【００９８】

【発明の効果】この発明によるループ構造を有するプロ
ーブＲＮＡを基板に配列したバイオチップの構成は、生
化学検体の検出操作において、従来とは逆に生化学検体
とのハイブリダイゼーションを行った後に、標識による
修飾を行い、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつ
所要の箇所に標識を修飾することが可能となり、ハイブ
リダイゼーション時並びに標識の修飾時と、各工程での
精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上する。

【００９９】一般に、生体内現象を捉えるためには、Ｄ
ＮＡではなく、ｍ−ＲＮＡの発見量を調べる必要がある
とされるが、上述のようにループ構造を利用したこの発
明のプローブはバックグラウンドノイズが低く高感度の
ため、ｍ−ＲＮＡの動向をｃ−ＤＮＡを作製することな
く、直接検出可能となる。

【０１００】実施例に明らかなように、ＤＮＡを検出す
る場合、プローブにＲＮＡを用いるこの発明では、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡ結合の安定性はＤＮＡ−ＤＮＡ結合より強い
ため、プローブにＤＮＡを用いた場合より、検出感度が
高く、安定した検出精度を維持できる利点がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＲＮＡのルー
プ構造を示す説明図である。

【図２】Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＲＮＡのルー
プ構造を示す説明図である。

【図３】この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構
造を示す説明図である。

【図４】この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構
造を示す説明図である。

【図５】この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構
造を示す説明図である。

【符号の説明】

１基板２ビオチン基３標識１０，２０プローブＲＮＡ１１，２１固定端１２，２２解放端１３，２３結合部１４，２４ループ１５，２５主要部位２６脚ｘ隙間

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 ＦＦターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B029 AA07 BB20 CC03 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR55 QR66 QR82 QR83 QS03 QS15 QS34 QS36 QX02 QX07 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】基板表面にプローブＲＮＡを配列する工
程、ループ構造を形成しているプローブＲＮＡに生化学
検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイ
ゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプロ
ーブＲＮＡ又は生化学検体あるいはその両方に標識を修
飾する工程、前記標識を検出・識別する工程を有する生
化学反応体の検出方法。
【請求項２】基板表面にプローブＲＮＡを配列する工
程、ループ構造を形成しているプローブＲＮＡに予め標
識を修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする
工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２
本鎖を形成したプローブＲＮＡ又は生化学検体あるいは
その両方に標識を修飾する工程、前記標識を検出・識別
する工程を有する生化学反応体の検出方法。
【請求項３】基板表面にプローブＲＮＡを配列する工
程、ループ構造を形成しているプローブＲＮＡに予め標
識を修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする
工程、前記標識を検出・識別する工程を有する生化学反
応体の検出方法。
【請求項４】基板表面にプローブＲＮＡを配列する工
程、ループ構造を形成しているプローブＲＮＡに生化学
検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイ
ゼーションにより２本鎖を形成したプローブ及び生化学
検体とループ構造を取っている他プローブとを高さの違
いとして検出・識別する工程を有する生化学反応体の検
出方法。
【請求項５】２本鎖を形成したプローブＲＮＡ又は生
化学検体あるいはその両方に標識を修飾する方法が、先
に第１の標識を修飾してさらにそれを目標として第２の
標識を修飾する２段階以上の多段修飾である請求項１か
ら請求項３のいずれかに記載の生化学反応体の検出方
法。
【請求項６】標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラ
ミックス粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体
のいずれかである請求項１から請求項３のいずれかに記
載の生化学反応体の検出方法。
【請求項７】標識を検出・識別する方法が、光散乱
法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、イメージ
ング処理法、目視法のいずれかである請求項１から請求
項３のいずれかに記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項８】検出・識別する方法が、２本鎖を形成し
たプローブ及び生化学検体とループ構造を取っている他
プローブとを高さの違いとして検知する方法であり、電
子又は光学顕微鏡観察法、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー
顕微鏡観察法、ＳＴＭ，ＳＴＳ，ＡＦＭ観察法、電子回
折法、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ法、Ｘ線表面回折
法、蛍光Ｘ線分析法のいずれかである請求項１から請求
項４のいずれかに記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項９】標識がプローブＲＮＡより大きい請求項
８に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項１０】金属粒子が、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃ
ｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｓｉ
のいずれかである請求項６に記載の生化学反応体の検出
方法。
【請求項１１】セラミックス粒子が、ＳｉＯ₂、Ｔｉ
Ｏ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯのいずれかである請求
項６に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項１２】標識を検出・識別する方法が目視法で
あり、標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス
粒子、色素、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵
素、細胞のいずれかである請求項１から請求項３のいず
れかに記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項１３】標識の粒径が５００ｎｍ以上である請
求項１２に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項１４】基板上に一方端を固定して配列された
プローブＲＮＡを有し、配列したプローブＲＮＡは生化
学検体と相補的に結合する主要部位が基板側に位置する
ようループ構造を有するバイオチップ。
【請求項１５】基板上に一方端を固定して配列された
プローブＲＮＡを有し、配列したプローブＲＮＡはその
基板表面に固定されない解放端側又はその標識を修飾可
能にした部位が基板側に位置するようループ構造を有す
るバイオチップ。
【請求項１６】基板上に一方端を固定して配列された
プローブＲＮＡを有し、配列したプローブＲＮＡは第２
の標識を修飾可能にした第１の標識が修飾された部位が
基板側に位置するようループ構造を有するバイオチッ
プ。
【請求項１７】基板材料がガラス又は半導体シリコン
である請求項１４から求項１６のいずれかに記載のバイ
オチップ。