JP2003113118A - Ｍｈｃ非拘束性ｔ細胞／ｎｋ細胞とｍｈｃ拘束性細胞との組み合わせによる、ｍｈｃ発現が存在しないか、低いか、または異常な腫瘍細胞の攻撃 - Google Patents
Ｍｈｃ非拘束性ｔ細胞／ｎｋ細胞とｍｈｃ拘束性細胞との組み合わせによる、ｍｈｃ発現が存在しないか、低いか、または異常な腫瘍細胞の攻撃Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】本発明は、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞／ＮＫ細
胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて含む治療組成
物、特に、ＬＡＫ細胞を含む治療組成物に関する。さら
に、本発明は、ヒトでの、ＭＨＣクラス１ａ分子および
１ｂ分子の存在しないか、低いか、または異常な発現を
示す腫瘍の治療における該組み合わせの使用に関する。
前述の組成物／組み合わせを用いることにより、別の方
法では免疫検出から逃れる腫瘍細胞変種の発生に抵抗す
る均衡のとれた選択圧力を提供することが可能である。
胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて含む治療組成
物、特に、ＬＡＫ細胞を含む治療組成物に関する。さら
に、本発明は、ヒトでの、ＭＨＣクラス１ａ分子および
１ｂ分子の存在しないか、低いか、または異常な発現を
示す腫瘍の治療における該組み合わせの使用に関する。
前述の組成物／組み合わせを用いることにより、別の方
法では免疫検出から逃れる腫瘍細胞変種の発生に抵抗す
る均衡のとれた選択圧力を提供することが可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＭＨＣ非拘束性Ｔ
細胞／ＮＫ細胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて含
む治療組成物、特に、ＬＡＫ細胞を含む治療組成物に関
する。さらに、本発明は、ヒトでの、存在しないか、低
いか、または異常なＭＨＣ分子発現を示す腫瘍の治療に
おける前記組成物の使用に関する。
細胞／ＮＫ細胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて含
む治療組成物、特に、ＬＡＫ細胞を含む治療組成物に関
する。さらに、本発明は、ヒトでの、存在しないか、低
いか、または異常なＭＨＣ分子発現を示す腫瘍の治療に
おける前記組成物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】ほとんどのＴリンパ球による免疫認識
は、リンパ球上の特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と標的
細胞上の抗原に関する表面相互作用によって起こる。抗
体とは異なり、ＴＣＲはインタクトな抗原を認識しな
い。ＴＣＲはほとんど例外なく、主要組織適合遺伝子複
合体（ＭＨＣ）分子により細胞表面上に提示されたペプ
チドの形をした抗原断片だけを認識する。抗原がＭＨＣ
分子により提示された時だけＴ細胞が抗原を認識する能
力は「ＭＨＣ拘束」と呼ばれる。反応するＴ細胞はＭＨ
Ｃ拘束性リンパ球と呼ばれる。２つのクラスのＭＨＣ分
子クラスＩおよびクラスＩＩがあり、これらは結合する
抗原の種類および相互作用するＴ細胞のサブセットによ
って機能上区別される。クラスＩ分子とクラスＩＩ分子
で２つに分かれているのはＴ細胞活性化におけるそれら
の異なった役割と関係がある。クラスＩ分子は、ＭＨＣ
拘束性ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にペ
プチドを提示する。これらの細胞は標的細胞を直接溶解
する。従って、これらの細胞がクラスＩ分子により提示
された細胞内抗原に由来するペプチドを認識することは
生物学的に適している。さらに、クラスＩ分子はほぼ全
ての有核細胞で発現されるので、細胞が適切なＭＨＣ／
ペプチド複合体を提示する場合、ＣＴＬは実質的に全て
の細胞を認識および破壊することができる。他方で、ク
ラスＩＩ分子はＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞にペプチドを
提示する。ＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞の主な機能は、Ｂ
細胞、マクロファージ、およびＣＴＬを含む他のリンパ
球の活性を高めるサイトカインを分泌することである。
これらは免疫応答の統合に中心的な役割を果たしてい
る。
は、リンパ球上の特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と標的
細胞上の抗原に関する表面相互作用によって起こる。抗
体とは異なり、ＴＣＲはインタクトな抗原を認識しな
い。ＴＣＲはほとんど例外なく、主要組織適合遺伝子複
合体（ＭＨＣ）分子により細胞表面上に提示されたペプ
チドの形をした抗原断片だけを認識する。抗原がＭＨＣ
分子により提示された時だけＴ細胞が抗原を認識する能
力は「ＭＨＣ拘束」と呼ばれる。反応するＴ細胞はＭＨ
Ｃ拘束性リンパ球と呼ばれる。２つのクラスのＭＨＣ分
子クラスＩおよびクラスＩＩがあり、これらは結合する
抗原の種類および相互作用するＴ細胞のサブセットによ
って機能上区別される。クラスＩ分子とクラスＩＩ分子
で２つに分かれているのはＴ細胞活性化におけるそれら
の異なった役割と関係がある。クラスＩ分子は、ＭＨＣ
拘束性ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にペ
プチドを提示する。これらの細胞は標的細胞を直接溶解
する。従って、これらの細胞がクラスＩ分子により提示
された細胞内抗原に由来するペプチドを認識することは
生物学的に適している。さらに、クラスＩ分子はほぼ全
ての有核細胞で発現されるので、細胞が適切なＭＨＣ／
ペプチド複合体を提示する場合、ＣＴＬは実質的に全て
の細胞を認識および破壊することができる。他方で、ク
ラスＩＩ分子はＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞にペプチドを
提示する。ＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞の主な機能は、Ｂ
細胞、マクロファージ、およびＣＴＬを含む他のリンパ
球の活性を高めるサイトカインを分泌することである。
これらは免疫応答の統合に中心的な役割を果たしてい
る。
【０００３】ＭＨＣ分子は高度の多形性を特徴とし、異
なる遺伝子座および対立遺伝子によりコードされた多く
の異なる変種が特定されている。ＭＨＣ対立遺伝子を区
別するアミノ酸変化の多くは、ＭＨＣ分子がその形状お
よび電荷を調整する結合溝に局在している。特定のＭＨ
Ｃ分子に結合することができるペプチドは、その分子の
結合溝の立体配置とぴったり合わなければならない。ヒ
ト集団内には多くの異なるＭＨＣ対立遺伝子があり、一
般的に、個体は（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ遺伝子座によりコ
ードされる）６種類の異なるクラスＩａ分子を発現す
る。各クラスＩａ分子は、ペプチド結合溝のアミノ酸組
成が異なるため、異なるペプチドレパートリーを結合す
る。さらに、個体には、ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、およびＧを含
む多数のクラスＩｂ分子をコードするＨＬＡ対立遺伝子
がある。
なる遺伝子座および対立遺伝子によりコードされた多く
の異なる変種が特定されている。ＭＨＣ対立遺伝子を区
別するアミノ酸変化の多くは、ＭＨＣ分子がその形状お
よび電荷を調整する結合溝に局在している。特定のＭＨ
Ｃ分子に結合することができるペプチドは、その分子の
結合溝の立体配置とぴったり合わなければならない。ヒ
ト集団内には多くの異なるＭＨＣ対立遺伝子があり、一
般的に、個体は（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ遺伝子座によりコ
ードされる）６種類の異なるクラスＩａ分子を発現す
る。各クラスＩａ分子は、ペプチド結合溝のアミノ酸組
成が異なるため、異なるペプチドレパートリーを結合す
る。さらに、個体には、ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ、およびＧを含
む多数のクラスＩｂ分子をコードするＨＬＡ対立遺伝子
がある。
【０００４】ＭＨＣ拘束性細胞が抗原刺激に応答するた
めには、ＭＨＣ／ペプチド複合体が標的細胞の表面に発
現されなければならず、Ｔ細胞が同族ＴＣＲを発現しな
ければならない。ＭＨＣ分子を介して提示された特異的
抗原をＴ細胞が認識する特異的能力は、様々な治療法
（例えば、抗腫瘍療法）に用いられている。
めには、ＭＨＣ／ペプチド複合体が標的細胞の表面に発
現されなければならず、Ｔ細胞が同族ＴＣＲを発現しな
ければならない。ＭＨＣ分子を介して提示された特異的
抗原をＴ細胞が認識する特異的能力は、様々な治療法
（例えば、抗腫瘍療法）に用いられている。
【０００５】しかしながら、免疫系には腫瘍細胞の排除
に用いられ得るかなりのＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞レパート
リーがあることを、既知のストラテジーは考慮に入れて
いない。これは、一部は、抗腫瘍療法においてＭＨＣ非
拘束性Ｔ細胞を用いる試みが不成功に終わっていたため
である。一般的に、ＭＨＣ非拘束性タイプのＴリンパ球
は、ＭＨＣ−ペプチドリガンド発現とは無関係に起こる
腫瘍細胞の認識によって腫瘍と闘う。
に用いられ得るかなりのＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞レパート
リーがあることを、既知のストラテジーは考慮に入れて
いない。これは、一部は、抗腫瘍療法においてＭＨＣ非
拘束性Ｔ細胞を用いる試みが不成功に終わっていたため
である。一般的に、ＭＨＣ非拘束性タイプのＴリンパ球
は、ＭＨＣ−ペプチドリガンド発現とは無関係に起こる
腫瘍細胞の認識によって腫瘍と闘う。
【０００６】ＭＨＣ非拘束性免疫応答を示す細胞の例は
リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞である。ＬＡ
Ｋ細胞は、様々な腫瘍細胞ならびにＨＬＡクラスＩ陰性
標的細胞を溶解する、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞とＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞の混合物である。ＬＡＫ集
団に存在する活性化ＮＫ細胞のような活性化ＮＫ細胞
は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用後にその細胞溶解
機能が抑制される。ＬＡＫ由来Ｔ（ＬＡＫ−Ｔ）細胞の
調節は明らかにされていない。
リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞である。ＬＡ
Ｋ細胞は、様々な腫瘍細胞ならびにＨＬＡクラスＩ陰性
標的細胞を溶解する、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞とＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞の混合物である。ＬＡＫ集
団に存在する活性化ＮＫ細胞のような活性化ＮＫ細胞
は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用後にその細胞溶解
機能が抑制される。ＬＡＫ由来Ｔ（ＬＡＫ−Ｔ）細胞の
調節は明らかにされていない。
【０００７】ＭＨＣクラスＩ分子との抑制性受容体の相
互作用によるリンパ球機能の負の調節の役割の芽生えつ
つある理解により、ＬＡＫ機能に影響を及ぼす機構への
新たな見識がもたらされる。ナチュラル細胞傷害性受容
体などの活性化受容体はＮＫによる溶解の誘導を担って
おり、ＮＫ細胞の細胞溶解能力はその抑制性受容体の発
現によって最終的に決定される。ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞は本発明におけるＴ細胞活性化に重要である。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はリンパ系細胞の系統で
あり、抗原特異的受容体を欠き、先天性免疫系の一部で
ある。これらの細胞は、特有の細胞傷害性顆粒を有する
大きなリンパ球として血中を循環する。これらのリンパ
球様細胞は先天性免疫において重要な機能を示す。リン
パ球様細胞は、異常細胞（例えば、腫瘍細胞およびウイ
ルス感染細胞）を認識および殺傷することができ、細胞
内病原体に対する先天性免疫防御に重要であると考えら
れる。リンパ球様細胞は、抗原特異的受容体を欠いてい
るが、ある特定のウイルス感染細胞を検出および攻撃す
ることができる。
互作用によるリンパ球機能の負の調節の役割の芽生えつ
つある理解により、ＬＡＫ機能に影響を及ぼす機構への
新たな見識がもたらされる。ナチュラル細胞傷害性受容
体などの活性化受容体はＮＫによる溶解の誘導を担って
おり、ＮＫ細胞の細胞溶解能力はその抑制性受容体の発
現によって最終的に決定される。ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞は本発明におけるＴ細胞活性化に重要である。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はリンパ系細胞の系統で
あり、抗原特異的受容体を欠き、先天性免疫系の一部で
ある。これらの細胞は、特有の細胞傷害性顆粒を有する
大きなリンパ球として血中を循環する。これらのリンパ
球様細胞は先天性免疫において重要な機能を示す。リン
パ球様細胞は、異常細胞（例えば、腫瘍細胞およびウイ
ルス感染細胞）を認識および殺傷することができ、細胞
内病原体に対する先天性免疫防御に重要であると考えら
れる。リンパ球様細胞は、抗原特異的受容体を欠いてい
るが、ある特定のウイルス感染細胞を検出および攻撃す
ることができる。
【０００８】ＮＫ細胞の異なる供給源の広範囲の分析に
より、本質的に全てのヒトＮＫ細胞には、クラスＩ分子
と相互作用し、ＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制し、それに
より正常な体細胞をＮＫによる攻撃から保護する抑制性
受容体があることが分かった（文献１〜３に概説され
る）。２種類の形態の抑制性受容体がＮＫ細胞により発
現される。キラー細胞抑制性受容体（ＫＩＲ）は免疫グ
ロブリンスーパーファミリーに属し、古典的ＭＨＣクラ
スＩａ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）分子と相互作用するが、
Ｃ型レクチンスーパーファミリーの抑制性受容体は、非
古典的ＭＨＣクラスＩｂ（ＨＬＡ−Ｅ）分子を結合する
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ２量体からなる（文献４；
５）。クラスＩａ分子およびＩｂ分子の発現により、有
核細胞は、これらの抑制性受容体タイプのいずれかを有
するＮＫ細胞による攻撃を独立して防ぐことができる２
組のリガンドを有する。
より、本質的に全てのヒトＮＫ細胞には、クラスＩ分子
と相互作用し、ＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制し、それに
より正常な体細胞をＮＫによる攻撃から保護する抑制性
受容体があることが分かった（文献１〜３に概説され
る）。２種類の形態の抑制性受容体がＮＫ細胞により発
現される。キラー細胞抑制性受容体（ＫＩＲ）は免疫グ
ロブリンスーパーファミリーに属し、古典的ＭＨＣクラ
スＩａ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）分子と相互作用するが、
Ｃ型レクチンスーパーファミリーの抑制性受容体は、非
古典的ＭＨＣクラスＩｂ（ＨＬＡ−Ｅ）分子を結合する
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ２量体からなる（文献４；
５）。クラスＩａ分子およびＩｂ分子の発現により、有
核細胞は、これらの抑制性受容体タイプのいずれかを有
するＮＫ細胞による攻撃を独立して防ぐことができる２
組のリガンドを有する。
【０００９】しかしながら、前述のように、ＬＡＫ由来
Ｔ（ＬＡＫ−Ｔ）細胞の調節は明らかにされていない。
近年、現行の化学療法または放射線療法によって排除す
ることができない腫瘍を治療するために、免疫系を利用
した新たな治療法が研究されている。最初の免疫療法
は、しばしばＩＬ−２と併用されるインターフェロン
（ＩＦＮαまたはＩＦＮγのいずれか）の全身適用を用
いた（文献６〜９）。
Ｔ（ＬＡＫ−Ｔ）細胞の調節は明らかにされていない。
近年、現行の化学療法または放射線療法によって排除す
ることができない腫瘍を治療するために、免疫系を利用
した新たな治療法が研究されている。最初の免疫療法
は、しばしばＩＬ−２と併用されるインターフェロン
（ＩＦＮαまたはＩＦＮγのいずれか）の全身適用を用
いた（文献６〜９）。
【００１０】癌患者の免疫療法のためにＬＡＫ細胞の抗
腫瘍能力を最初に調べたのがＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよび
同僚であった（文献１０；１１）。進行性疾患をもつ患
者にＬＡＫ細胞を養子移入した後に、一部の患者は劇的
な応答を示したが、多くの腫瘍は退縮しなかった。ヒト
ＬＡＫ細胞の非常に多くの動物研究およびインビトロ分
析によって、腫瘍退縮を媒介する主要なエフェクター成
分として活性化ＮＫ細胞が特定されたが、Ｔ細胞画分に
おいて弱い細胞傷害機能も発見された。しかしながら、
ＬＡＫ細胞を単独で使用した臨床試験またはＮＫの生存
率を維持するために高用量ＩＬ−２と併用した臨床試験
は臨床効果を改善しなかった。さらに、特に、ＩＬ−２
がＬＡＫ細胞と同時投与された時に、併発する毒性によ
って臨床利益が厳しく制限された。
腫瘍能力を最初に調べたのがＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよび
同僚であった（文献１０；１１）。進行性疾患をもつ患
者にＬＡＫ細胞を養子移入した後に、一部の患者は劇的
な応答を示したが、多くの腫瘍は退縮しなかった。ヒト
ＬＡＫ細胞の非常に多くの動物研究およびインビトロ分
析によって、腫瘍退縮を媒介する主要なエフェクター成
分として活性化ＮＫ細胞が特定されたが、Ｔ細胞画分に
おいて弱い細胞傷害機能も発見された。しかしながら、
ＬＡＫ細胞を単独で使用した臨床試験またはＮＫの生存
率を維持するために高用量ＩＬ−２と併用した臨床試験
は臨床効果を改善しなかった。さらに、特に、ＩＬ−２
がＬＡＫ細胞と同時投与された時に、併発する毒性によ
って臨床利益が厳しく制限された。
【００１１】さらなる臨床試験で、インビボで抗腫瘍活
性を媒介する未分離ＬＡＫ細胞の能力が、多数の細胞を
進行性疾患をもつ患者に養子移入した後に研究された
（文献１０；１２〜２０）。一部の腫瘍病変の劇的な退
縮が観察されたが、これはめったに現れず、長続きせ
ず、高い毒性と関連していた。全身高用量ＩＬ−２治療
を与えた患者において、ＬＡＫ細胞の誘導が臨床応答に
関係なくほとんどの個体においてインビボおよびインビ
トロで観察された。このことから、ＬＡＫ細胞の効力
は、まず間違いなくエフェクター細胞と腫瘍細胞との相
互作用のレベルで調節されることが分かった。ＬＡＫに
よる腫瘍退縮の基本原理を特定できず、それにより、そ
の関連毒性にもかかわらずこの療法の恩恵を受け得る患
者を特定できないために、さらなる臨床開発が制限され
た。
性を媒介する未分離ＬＡＫ細胞の能力が、多数の細胞を
進行性疾患をもつ患者に養子移入した後に研究された
（文献１０；１２〜２０）。一部の腫瘍病変の劇的な退
縮が観察されたが、これはめったに現れず、長続きせ
ず、高い毒性と関連していた。全身高用量ＩＬ−２治療
を与えた患者において、ＬＡＫ細胞の誘導が臨床応答に
関係なくほとんどの個体においてインビボおよびインビ
トロで観察された。このことから、ＬＡＫ細胞の効力
は、まず間違いなくエフェクター細胞と腫瘍細胞との相
互作用のレベルで調節されることが分かった。ＬＡＫに
よる腫瘍退縮の基本原理を特定できず、それにより、そ
の関連毒性にもかかわらずこの療法の恩恵を受け得る患
者を特定できないために、さらなる臨床開発が制限され
た。
【００１２】この毒性と一部の腫瘍だけしか退縮しなか
った理由を理解できないことが、ＬＡＫ細胞のようなＭ
ＨＣ非拘束性腫瘍細胞を断念して、腫瘍浸潤リンパ球を
養子移入するか、またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を誘導
するように設計された治療ストラテジーを採用すること
につながった。これらの新たなストラテジーもまた腫瘍
退縮の兆候を示すが、今度の場合も腫瘍退縮は一部の患
者でしか観察されなかった。興味深いことに、いくつか
のよく研究された例において、強いクラスＩ拘束性ＣＴ
Ｌ応答をインビボで生じていた患者において、ＭＨＣク
ラスＩ発現の部分的または完全な喪失を示す腫瘍変種が
発生することが発見された。
った理由を理解できないことが、ＬＡＫ細胞のようなＭ
ＨＣ非拘束性腫瘍細胞を断念して、腫瘍浸潤リンパ球を
養子移入するか、またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を誘導
するように設計された治療ストラテジーを採用すること
につながった。これらの新たなストラテジーもまた腫瘍
退縮の兆候を示すが、今度の場合も腫瘍退縮は一部の患
者でしか観察されなかった。興味深いことに、いくつか
のよく研究された例において、強いクラスＩ拘束性ＣＴ
Ｌ応答をインビボで生じていた患者において、ＭＨＣク
ラスＩ発現の部分的または完全な喪失を示す腫瘍変種が
発生することが発見された。
【００１３】従って、ＣＴＬによる選択圧力が、ＣＴＬ
のＴＣＲによって捕捉される対応ＭＨＣ−ペプチド複合
体をもはや発現しない腫瘍変種の発生につながったよう
に見える。
のＴＣＲによって捕捉される対応ＭＨＣ−ペプチド複合
体をもはや発現しない腫瘍変種の発生につながったよう
に見える。
【００１４】腫瘍の広範囲の免疫組織化学研究によっ
て、選択されたＨＬＡアロタイプに多くの場合限られる
ＨＬＡ分子の異常発現を示す細胞の高い出現率が明らか
になった。このような腫瘍はＷ６／３２のようなパンク
ラスＩ抗体（ｐａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）をなお結合するが、そのＭＨＣ発現の混乱のために
ＭＨＣ拘束性ＣＴＬによる排除から逃れることができる
かもしれない。
て、選択されたＨＬＡアロタイプに多くの場合限られる
ＨＬＡ分子の異常発現を示す細胞の高い出現率が明らか
になった。このような腫瘍はＷ６／３２のようなパンク
ラスＩ抗体（ｐａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）をなお結合するが、そのＭＨＣ発現の混乱のために
ＭＨＣ拘束性ＣＴＬによる排除から逃れることができる
かもしれない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＭＨＣクラスＩ分子の低いか、存在しないか、また
は異常な発現を示す腫瘍を治療するための改善したスト
ラテジーを提供することにある。
は、ＭＨＣクラスＩ分子の低いか、存在しないか、また
は異常な発現を示す腫瘍を治療するための改善したスト
ラテジーを提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】この問題は、独立請求項
に示される特徴によって解決される。本発明の好ましい
実施態様は従属請求項に詳述される。
に示される特徴によって解決される。本発明の好ましい
実施態様は従属請求項に詳述される。
【００１７】現在まで用いられてきた療法／組成物に関
連する問題は、一方では、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞による攻
撃に対する腫瘍細胞の感受性低下を引き起こす前記エス
ケープ機構によるものである。他方では、前述のよう
に、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞を伴う療法が、長期の、再現
可能で、有効な治療結果を示していなかった。
連する問題は、一方では、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞による攻
撃に対する腫瘍細胞の感受性低下を引き起こす前記エス
ケープ機構によるものである。他方では、前述のよう
に、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞を伴う療法が、長期の、再現
可能で、有効な治療結果を示していなかった。
【００１８】最近の実験において、本発明者らは、ＭＨ
Ｃ非拘束性Ｔ細胞（例えば、活性化ＮＫ細胞のようなＬ
ＡＫ−Ｔ細胞）がＨＬＡクラスＩ分子との相互作用によ
って抑制されることを示した。ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラス
Ｉ陽性腫瘍細胞を溶解するが、腫瘍細胞のクラスＩ発現
を増大させるインターフェロンγで腫瘍細胞が刺激され
ると、溶解は阻止される。しかしながら、この細胞傷害
性の抑制はクラスＩ特異的モノクローナル抗体の存在下
で逆転される。ＨＬＡ陰性標的細胞は、ＨＬＡクラスＩ
ａ分子またはクラスＩｂ分子を発現させるためのトラン
スフェクション後に、ＬＡＫ−Ｔ細胞による溶解から部
分的に保護することができる。従って、ＨＬＡ分子によ
る負の調節の原理は、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞（例えば、
腫瘍患者および健常な対照ドナーから作成されたＬＡＫ
−Ｔ細胞）に適用される。ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラスＩａ
分子およびクラスＩｂ分子により抑制されるが、既知の
ＮＫ抑制性受容体を発現しない。明らかに、ＬＡＫ−Ｔ
細胞は、今まで特定されていない抑制性受容体によって
負に調節される。本発明者らによって行われた実験によ
り、これらのＴ細胞は、その細胞傷害機能がクラスＩ分
子との相互作用によって効率的に抑制されなかったの
で、低いまたは混乱したＭＨＣクラスＩ発現を示す腫瘍
細胞変種の認識に最も有効であることが分かった。これ
らの結果は、特定のＨＬＡアロタイプの低いかまたは異
常な発現を示す腫瘍変種と闘うことによって腫瘍疾患治
療におけるＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞（例えば、ＬＡＫ−Ｔ
細胞）の有効使用を可能にする、新たなアプローチにつ
ながった。
Ｃ非拘束性Ｔ細胞（例えば、活性化ＮＫ細胞のようなＬ
ＡＫ−Ｔ細胞）がＨＬＡクラスＩ分子との相互作用によ
って抑制されることを示した。ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラス
Ｉ陽性腫瘍細胞を溶解するが、腫瘍細胞のクラスＩ発現
を増大させるインターフェロンγで腫瘍細胞が刺激され
ると、溶解は阻止される。しかしながら、この細胞傷害
性の抑制はクラスＩ特異的モノクローナル抗体の存在下
で逆転される。ＨＬＡ陰性標的細胞は、ＨＬＡクラスＩ
ａ分子またはクラスＩｂ分子を発現させるためのトラン
スフェクション後に、ＬＡＫ−Ｔ細胞による溶解から部
分的に保護することができる。従って、ＨＬＡ分子によ
る負の調節の原理は、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞（例えば、
腫瘍患者および健常な対照ドナーから作成されたＬＡＫ
−Ｔ細胞）に適用される。ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラスＩａ
分子およびクラスＩｂ分子により抑制されるが、既知の
ＮＫ抑制性受容体を発現しない。明らかに、ＬＡＫ−Ｔ
細胞は、今まで特定されていない抑制性受容体によって
負に調節される。本発明者らによって行われた実験によ
り、これらのＴ細胞は、その細胞傷害機能がクラスＩ分
子との相互作用によって効率的に抑制されなかったの
で、低いまたは混乱したＭＨＣクラスＩ発現を示す腫瘍
細胞変種の認識に最も有効であることが分かった。これ
らの結果は、特定のＨＬＡアロタイプの低いかまたは異
常な発現を示す腫瘍変種と闘うことによって腫瘍疾患治
療におけるＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞（例えば、ＬＡＫ−Ｔ
細胞）の有効使用を可能にする、新たなアプローチにつ
ながった。
【００１９】この研究に基づいて、ＭＨＣ非拘束的に腫
瘍細胞を攻撃する免疫細胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み
合わせて含む治療組成物を用いることにより、別の方法
では免疫検出を逃れる腫瘍細胞変種の発生に抵抗する均
衡のとれた選択圧力が得られる。
瘍細胞を攻撃する免疫細胞をＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み
合わせて含む治療組成物を用いることにより、別の方法
では免疫検出を逃れる腫瘍細胞変種の発生に抵抗する均
衡のとれた選択圧力が得られる。
【００２０】一般的に、本発明による治療組成物は、
（ａ）活性化ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／またはナチ
ュラルキラー（ＮＫ）細胞を、（ｂ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細
胞、または（ｃ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の免疫応答を誘導
する治療物質と組み合わせて含む。
（ａ）活性化ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／またはナチ
ュラルキラー（ＮＫ）細胞を、（ｂ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細
胞、または（ｃ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の免疫応答を誘導
する治療物質と組み合わせて含む。
【００２１】１つの好ましい実施態様によれば、活性化
ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞として、リンホカイン活性化キラー（ＬＡ
Ｋ）細胞が用いられる。
ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー
（ＮＫ）細胞として、リンホカイン活性化キラー（ＬＡ
Ｋ）細胞が用いられる。
【００２２】ＬＡＫ細胞は、ＣＤ４サブセットおよびＣ
Ｄ８サブセットの両方のＣＤ３−ＮＫ細胞およびＣＤ３
＋Ｔ細胞からなる混合集団である。ＬＡＫ細胞の特徴は
ＭＨＣ非拘束的に様々な腫瘍細胞を溶解する能力であ
る。さらに、ＬＡＫ細胞は、ＭＨＣ非拘束性細胞傷害エ
フェクター細胞を同定するための一般基準として役立つ
クラスＩ陰性標的細胞（例えば、ＤａｕｄｉおよびＫ５
６２）を殺傷することができる。ＬＡＫ集団のＣＤ３−
画分およびＣＤ３＋画分への分離により、ＮＫ細胞およ
びＴ細胞の両方がクラスＩ陰性標的細胞および様々な異
なる腫瘍細胞を溶解できることが明らかになった。
Ｄ８サブセットの両方のＣＤ３−ＮＫ細胞およびＣＤ３
＋Ｔ細胞からなる混合集団である。ＬＡＫ細胞の特徴は
ＭＨＣ非拘束的に様々な腫瘍細胞を溶解する能力であ
る。さらに、ＬＡＫ細胞は、ＭＨＣ非拘束性細胞傷害エ
フェクター細胞を同定するための一般基準として役立つ
クラスＩ陰性標的細胞（例えば、ＤａｕｄｉおよびＫ５
６２）を殺傷することができる。ＬＡＫ集団のＣＤ３−
画分およびＣＤ３＋画分への分離により、ＮＫ細胞およ
びＴ細胞の両方がクラスＩ陰性標的細胞および様々な異
なる腫瘍細胞を溶解できることが明らかになった。
【００２３】実際には、ＬＡＫ細胞は他のＭＨＣ非拘束
性Ｔ細胞／ＮＫ細胞より優れた１つの主な利点を示し、
この利点は、これらの細胞をインビトロで産生すること
ができる比較的簡単な方法である。前記のように、およ
び実施例で詳細に説明されるように、ＬＡＫ細胞は、高
用量インターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下でのイン
ビトロ培養によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得
られる。この方法は、ヒトＮＫ細胞ならびにＣＤ４＋お
よびＣＤ８＋Ｔ細胞を（すなわち、混合末梢血リンパ球
（ＰＢＬ）集団の同種異系刺激によって）産生する他の
方法より優れている。
性Ｔ細胞／ＮＫ細胞より優れた１つの主な利点を示し、
この利点は、これらの細胞をインビトロで産生すること
ができる比較的簡単な方法である。前記のように、およ
び実施例で詳細に説明されるように、ＬＡＫ細胞は、高
用量インターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下でのイン
ビトロ培養によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得
られる。この方法は、ヒトＮＫ細胞ならびにＣＤ４＋お
よびＣＤ８＋Ｔ細胞を（すなわち、混合末梢血リンパ球
（ＰＢＬ）集団の同種異系刺激によって）産生する他の
方法より優れている。
【００２４】腫瘍特異的ＣＴＬは、新鮮な腫瘍材料また
は既知の組換え腫瘍抗原を用いて（それぞれ、腫瘍およ
び組織材料の入手可能性に応じて）様々なアプローチに
より作成することができる。腫瘍特異的ＣＴＬの作成に
関するさらなる詳細を実施例に示す。
は既知の組換え腫瘍抗原を用いて（それぞれ、腫瘍およ
び組織材料の入手可能性に応じて）様々なアプローチに
より作成することができる。腫瘍特異的ＣＴＬの作成に
関するさらなる詳細を実施例に示す。
【００２５】本発明の治療組成物は、活性化ＭＨＣ非拘
束性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細
胞を、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて、あるいはＭ
ＨＣ拘束性Ｔ細胞の免疫応答を誘導する治療物質と組み
合わせて投与することができる。
束性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細
胞を、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞と組み合わせて、あるいはＭ
ＨＣ拘束性Ｔ細胞の免疫応答を誘導する治療物質と組み
合わせて投与することができる。
【００２６】本発明の１つの態様によれば、ＭＨＣ拘束
性Ｔ細胞の免疫応答を誘導する治療物質は腫瘍細胞また
は樹状細胞を含むワクチンである。別の態様は遺伝子療
法の使用である。この遺伝子療法により、特異的免疫応
答を誘導する能力を改善するように機能するサイトカイ
ンまたは表面分子をコードするさらなる遺伝子を含む遺
伝子操作された腫瘍細胞を用いて、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞
の免疫応答が誘導される。このような遺伝子組換えを腫
瘍細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入し、次いで、患者にワク
チンとして再適用してもよく、遺伝子を様々な手段によ
って腫瘍にインビボで導入してもよい。腫瘍細胞への遺
伝物質の導入は以下の手段によって行うことができる。
ｅｘ ｖｉｖｏアプローチでは、遺伝子銃法、エレクト
ロポレーション、またはアデノウイルス、ＡＡＶ、レト
ロウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、
およびポックスウイルスのようなウイルスベクター（例
えば、特に、ＭＶＡ）、ならびにカチオン性脂質（これ
らの多数の市販用製品が入手可能である）を用いること
ができる。インビボアプローチでは、同様に、遺伝子銃
法ならびにアデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、
ＥＢＶ、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、およびポック
スウイルスのようなウイルスベクター（例えば、特に、
ＭＶＡ）、カチオン性脂質（これらの多くが市販されて
いる、前記を参照のこと）を用いることができる。
性Ｔ細胞の免疫応答を誘導する治療物質は腫瘍細胞また
は樹状細胞を含むワクチンである。別の態様は遺伝子療
法の使用である。この遺伝子療法により、特異的免疫応
答を誘導する能力を改善するように機能するサイトカイ
ンまたは表面分子をコードするさらなる遺伝子を含む遺
伝子操作された腫瘍細胞を用いて、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞
の免疫応答が誘導される。このような遺伝子組換えを腫
瘍細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入し、次いで、患者にワク
チンとして再適用してもよく、遺伝子を様々な手段によ
って腫瘍にインビボで導入してもよい。腫瘍細胞への遺
伝物質の導入は以下の手段によって行うことができる。
ｅｘ ｖｉｖｏアプローチでは、遺伝子銃法、エレクト
ロポレーション、またはアデノウイルス、ＡＡＶ、レト
ロウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、
およびポックスウイルスのようなウイルスベクター（例
えば、特に、ＭＶＡ）、ならびにカチオン性脂質（これ
らの多数の市販用製品が入手可能である）を用いること
ができる。インビボアプローチでは、同様に、遺伝子銃
法ならびにアデノウイルス、ＡＡＶ、レトロウイルス、
ＥＢＶ、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、およびポック
スウイルスのようなウイルスベクター（例えば、特に、
ＭＶＡ）、カチオン性脂質（これらの多くが市販されて
いる、前記を参照のこと）を用いることができる。
【００２７】好ましくは、腫瘍細胞の免疫原性を改善す
るために、以下の表面分子を腫瘍細胞に導入することが
できる：Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＩＣＯＳリガンド、およ
びＢ７−Ｈ３。Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．Ｍ．およびＣｏｌ
ｌｉｎｓ，Ｍ．２００２．Ｂ７リガンドファミリーおよ
びその受容体：免疫応答の補助刺激および抑制の新たな
経路（Ｔｈｅ Ｂ７ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｌｉｇａｎ
ｄｓ ａｎｄ ｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｅｗ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２０：２９−５３を参照のこと。さらに、ＣＤ４０
およびＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）を用いることが
できる。さらなる情報については、Ｇｒｅｗａｌ，Ｉ．
Ｓ．およびＲ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ．１９９８．細胞性
免疫におけるＣＤ４０およびＣＤ１５４（ＣＤ４０ ａ
ｎｄ ＣＤ１５４ ｉｎ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１６：１１１−１３５を参照のこと。さらなる例は
４−１ＢＢリガンドである。Ｗｅｎ，Ｔ．、Ｂｕｋｃｚ
ｙｎｓｋｉ、Ｊ．およびＷａｔｔｓ，ＴＨ．２００２．
ヒトＴ細胞の４−１ＢＢリガンドによる補助刺激は、Ｃ
Ｄ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、
ならびに細胞傷害性エフェクター機能の発達を誘導する
（４−１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅ
ｌｌｓｉｎｄｕｃｅｓ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ
ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏ
ｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を参照のこと。同様に、これに
関連してＭＨＣクラスＩＩ分子を用いることができる。
Ｆａｂｒｅ−ＪＷ．２００１．同種異系応答および腫瘍
免疫（Ｔｈｅａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：６４９−６５２を参照のこ
と。
るために、以下の表面分子を腫瘍細胞に導入することが
できる：Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＩＣＯＳリガンド、およ
びＢ７−Ｈ３。Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．Ｍ．およびＣｏｌ
ｌｉｎｓ，Ｍ．２００２．Ｂ７リガンドファミリーおよ
びその受容体：免疫応答の補助刺激および抑制の新たな
経路（Ｔｈｅ Ｂ７ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｌｉｇａｎ
ｄｓ ａｎｄ ｉｔｓｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｅｗ ｐ
ａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２０：２９−５３を参照のこと。さらに、ＣＤ４０
およびＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）を用いることが
できる。さらなる情報については、Ｇｒｅｗａｌ，Ｉ．
Ｓ．およびＲ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ．１９９８．細胞性
免疫におけるＣＤ４０およびＣＤ１５４（ＣＤ４０ ａ
ｎｄ ＣＤ１５４ ｉｎ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１６：１１１−１３５を参照のこと。さらなる例は
４−１ＢＢリガンドである。Ｗｅｎ，Ｔ．、Ｂｕｋｃｚ
ｙｎｓｋｉ、Ｊ．およびＷａｔｔｓ，ＴＨ．２００２．
ヒトＴ細胞の４−１ＢＢリガンドによる補助刺激は、Ｃ
Ｄ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、
ならびに細胞傷害性エフェクター機能の発達を誘導する
（４−１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅ
ｌｌｓｉｎｄｕｃｅｓ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ
ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏ
ｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を参照のこと。同様に、これに
関連してＭＨＣクラスＩＩ分子を用いることができる。
Ｆａｂｒｅ−ＪＷ．２００１．同種異系応答および腫瘍
免疫（Ｔｈｅａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：６４９−６５２を参照のこ
と。
【００２８】前述の治療組成物は、ＭＨＣクラス１ａ分
子または１ｂ分子の低いか、存在しないか、または異常
な発現を示す腫瘍の治療において用いることができる。
１つの好ましい実施態様によれば、これらの腫瘍は、Ｈ
ＬＡ−Ｃ分子および／またはＨＬＡ−Ｅ分子の低いか、
存在しないか、または異常な発現を示す。
子または１ｂ分子の低いか、存在しないか、または異常
な発現を示す腫瘍の治療において用いることができる。
１つの好ましい実施態様によれば、これらの腫瘍は、Ｈ
ＬＡ−Ｃ分子および／またはＨＬＡ−Ｅ分子の低いか、
存在しないか、または異常な発現を示す。
【００２９】これらの腫瘍の例は、結腸癌、乳癌、前立
腺癌、ならびに腎細胞癌（ＲＣＣ）および黒色腫であ
る。
腺癌、ならびに腎細胞癌（ＲＣＣ）および黒色腫であ
る。
【００３０】ＭＨＣ非拘束性細胞は、ＭＨＣ拘束性ＣＴ
Ｌの養子移入とは別に、もしくは組み合わせて適用され
るか、またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答をインビボで誘
導するように設計された他の治療ストラテジーの適用と
同時に適用される。
Ｌの養子移入とは別に、もしくは組み合わせて適用され
るか、またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答をインビボで誘
導するように設計された他の治療ストラテジーの適用と
同時に適用される。
【００３１】本発明の組成物は、例えば、活性化ＮＫ細
胞およびＬＡＫ−Ｔ細胞の混合物またはＬＡＫ−Ｔ細胞
を主に含む培養物からなるＬＡＫ細胞を含んでもよく、
以下の特徴を示す腫瘍をもつ患者の養子療法に用いるこ
とができる： １）任意または全てのＭＨＣクラスＩａ分子またはクラ
スＩｂ分子の発現の不存在 ２）ＭＨＣクラスＩａ分子（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ遺伝子
座によりコードされる）またはクラスＩｂ分子（ＨＬＡ
−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇ遺伝子座によりコードされる）
の発現の低さ（これは、いずれか１つの遺伝子座または
これらの４つの遺伝子座のいずれか１つの対立遺伝子の
低い発現を示す腫瘍を含み得る） ３）天然レベルのＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−Ｅの発現に
よってＮＫ細胞またはＬＡＫ−Ｔ細胞に対する感受性が
著しく高まる可能性のある腫瘍。
胞およびＬＡＫ−Ｔ細胞の混合物またはＬＡＫ−Ｔ細胞
を主に含む培養物からなるＬＡＫ細胞を含んでもよく、
以下の特徴を示す腫瘍をもつ患者の養子療法に用いるこ
とができる： １）任意または全てのＭＨＣクラスＩａ分子またはクラ
スＩｂ分子の発現の不存在 ２）ＭＨＣクラスＩａ分子（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ遺伝子
座によりコードされる）またはクラスＩｂ分子（ＨＬＡ
−ＥもしくはＨＬＡ−Ｇ遺伝子座によりコードされる）
の発現の低さ（これは、いずれか１つの遺伝子座または
これらの４つの遺伝子座のいずれか１つの対立遺伝子の
低い発現を示す腫瘍を含み得る） ３）天然レベルのＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−Ｅの発現に
よってＮＫ細胞またはＬＡＫ−Ｔ細胞に対する感受性が
著しく高まる可能性のある腫瘍。
【００３２】ＭＨＣクラスＩａもしくはクラスＩｂの発
現の不存在または低いレベルは、腫瘍細胞集団（原発腫
瘍または転移）における一部だけの腫瘍細胞の特徴でも
よく、腫瘍集団（原発腫瘍または転移）における全ての
細胞の特徴でもよい。
現の不存在または低いレベルは、腫瘍細胞集団（原発腫
瘍または転移）における一部だけの腫瘍細胞の特徴でも
よく、腫瘍集団（原発腫瘍または転移）における全ての
細胞の特徴でもよい。
【００３３】以下によって腫瘍におけるＭＨＣクラスＩ
発現を測定することができる様々なアプローチがある： ａ）ＭＨＣ発現を検出する適切なモノクローナル抗体を
用いた、クリオスタット切片による凍結保存腫瘍材料の
免疫組織化学的染色（例えば、（文献２１；２２）） ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子に対するモノクローナル抗体
（例えば、試薬Ｗ６／３２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ，アメリカメリーランド州ロックヴィル））または
特定のＭＨＣ遺伝子座もしくは対立遺伝子によりコード
されるタンパク質を検出する他の抗体を用いた、単離腫
瘍細胞のフローサイトメトリー分析（例えば、（文献２
３）） ｃ）腫瘍細胞から単離されたＤＮＡにおける様々な遺伝
子座の有無を検出することができるオリゴヌクレオチド
プライマーを用いた、ＭＨＣ対立遺伝子発現の分子分析
（すなわち、これらの方法はＭＨＣ遺伝子における染色
体変化を検出することができる）（例えば、（文献２
４）） ｄ）ＭＨＣクラスＩａまたはクラスＩｂ対立遺伝子をコ
ードするＲＮＡの欠失またはレベル減少を検出するＲＴ
−ＰＣＲ法（例えば、（文献２５）） ｅ）様々なＭＨＣクラスＩ遺伝子座または対立遺伝子に
対応するタンパク質バンドの喪失を検出する等電点電気
泳動法を用いた、生化学的分析（例えば、（文献２６） ｆ）特定のクラスＩａ分子またはクラスＩｂ分子によっ
て負に調節される十分に特徴付けられたＮＫ細胞または
ＬＡＫ−Ｔ細胞を用いた機能研究。腫瘍細胞がこのよう
なエフェクター細胞集団の細胞傷害を抑制しないこと
は、同様の特異性を有するＬＡＫ細胞またはＬＡＫ−Ｔ
細胞による攻撃に対して感受性があることを示す。
発現を測定することができる様々なアプローチがある： ａ）ＭＨＣ発現を検出する適切なモノクローナル抗体を
用いた、クリオスタット切片による凍結保存腫瘍材料の
免疫組織化学的染色（例えば、（文献２１；２２）） ｂ）ＭＨＣクラスＩ分子に対するモノクローナル抗体
（例えば、試薬Ｗ６／３２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ，アメリカメリーランド州ロックヴィル））または
特定のＭＨＣ遺伝子座もしくは対立遺伝子によりコード
されるタンパク質を検出する他の抗体を用いた、単離腫
瘍細胞のフローサイトメトリー分析（例えば、（文献２
３）） ｃ）腫瘍細胞から単離されたＤＮＡにおける様々な遺伝
子座の有無を検出することができるオリゴヌクレオチド
プライマーを用いた、ＭＨＣ対立遺伝子発現の分子分析
（すなわち、これらの方法はＭＨＣ遺伝子における染色
体変化を検出することができる）（例えば、（文献２
４）） ｄ）ＭＨＣクラスＩａまたはクラスＩｂ対立遺伝子をコ
ードするＲＮＡの欠失またはレベル減少を検出するＲＴ
−ＰＣＲ法（例えば、（文献２５）） ｅ）様々なＭＨＣクラスＩ遺伝子座または対立遺伝子に
対応するタンパク質バンドの喪失を検出する等電点電気
泳動法を用いた、生化学的分析（例えば、（文献２６） ｆ）特定のクラスＩａ分子またはクラスＩｂ分子によっ
て負に調節される十分に特徴付けられたＮＫ細胞または
ＬＡＫ−Ｔ細胞を用いた機能研究。腫瘍細胞がこのよう
なエフェクター細胞集団の細胞傷害を抑制しないこと
は、同様の特異性を有するＬＡＫ細胞またはＬＡＫ−Ｔ
細胞による攻撃に対して感受性があることを示す。
【００３４】これらの各方法の対照として、入手可能な
場合、対応する正常組織を用いることができる。例え
ば、腎細胞癌の場合、腫瘍腎摘出時に得られる正常な腎
臓実質組織を用いることができる。あるいは、対照とし
てＰＢＭＣを用いることができる。
場合、対応する正常組織を用いることができる。例え
ば、腎細胞癌の場合、腫瘍腎摘出時に得られる正常な腎
臓実質組織を用いることができる。あるいは、対照とし
てＰＢＭＣを用いることができる。
【００３５】要約として、以下の状況で、ＭＨＣ非拘束
性細胞とＭＨＣ拘束性細胞の組み合わせを適用すること
ができる：
性細胞とＭＨＣ拘束性細胞の組み合わせを適用すること
ができる：
【００３６】１）患者の腫瘍細胞（原発腫瘍または転
移）がＭＨＣクラスＩａまたはクラスＩｂの発現に関し
て前記の特徴のいずれかを示す場合。
移）がＭＨＣクラスＩａまたはクラスＩｂの発現に関し
て前記の特徴のいずれかを示す場合。
【００３７】２）治療原理がＭＨＣ拘束性の腫瘍細胞認
識に基づく免疫療法処置を患者が受けたことがあり、そ
の免疫療法によって患者の腫瘍（原発腫瘍または転移）
は応答しなかったか、部分的な応答だけを示したか、ま
たは応答を示したがその後に増殖の回復を示した場合。
これらの状況は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答が単独で全
ての腫瘍細胞を排除できなかったことを示す。
識に基づく免疫療法処置を患者が受けたことがあり、そ
の免疫療法によって患者の腫瘍（原発腫瘍または転移）
は応答しなかったか、部分的な応答だけを示したか、ま
たは応答を示したがその後に増殖の回復を示した場合。
これらの状況は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答が単独で全
ての腫瘍細胞を排除できなかったことを示す。
【００３８】３）症例の大きな割合において異常なＭＨ
Ｃ発現を示すことが以前に示されている腫瘍タイプ（例
えば、黒色腫、結腸癌、乳癌、および前立腺癌）につい
て大きな腫瘍サイズ（原発病変または転移病変）を有す
る患者で（例えば、（文献２１；２２））。
Ｃ発現を示すことが以前に示されている腫瘍タイプ（例
えば、黒色腫、結腸癌、乳癌、および前立腺癌）につい
て大きな腫瘍サイズ（原発病変または転移病変）を有す
る患者で（例えば、（文献２１；２２））。
【００３９】４）ＭＨＣ拘束性エフェクター細胞により
認識することのできない腫瘍変種の選択に反撃する並行
治療として、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の誘導に基づく免疫療
法を受ける予定のある患者で。
認識することのできない腫瘍変種の選択に反撃する並行
治療として、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の誘導に基づく免疫療
法を受ける予定のある患者で。
【００４０】ＭＨＣ拘束性応答に基づく免疫療法を受け
た後に、このような療法と同時に、またはＭＨＣ拘束性
応答に基づく療法の適用前に、ＭＨＣ非拘束性細胞を患
者に適用することができる。正確な適用方法が療法の他
の構成要素（例えば、ＭＨＣ拘束性ＣＴＬの養子移入ま
たはＭＨＣ拘束性応答を誘導する様々なワクチン形態の
適用）と協調されなければならない。これは、公表され
た研究（例えば、文献１１〜１５）に従って行うことが
できる。
た後に、このような療法と同時に、またはＭＨＣ拘束性
応答に基づく療法の適用前に、ＭＨＣ非拘束性細胞を患
者に適用することができる。正確な適用方法が療法の他
の構成要素（例えば、ＭＨＣ拘束性ＣＴＬの養子移入ま
たはＭＨＣ拘束性応答を誘導する様々なワクチン形態の
適用）と協調されなければならない。これは、公表され
た研究（例えば、文献１１〜１５）に従って行うことが
できる。
【００４１】（図面の簡単な説明）図１ ＭＨＣクラス
Ｉ陰性標的細胞および悪性標的細胞に対するＲＣＣ患者
および健常ドナーから得られたＬＡＫ細胞の細胞傷害活
性。（Ａ）２人のＲＣＣ患者のＰＢＭＣから作成された
ＬＡＫ細胞、ＬＡＫ−２６（黒棒）およびＬＡＫ−５３
（点付きの棒）、ならびに（Ｂ）２人の健常ドナーから
作成されたＬＡＫ細胞、ＣＰ−１７６（白棒）およびＣ
Ｐ−４１（斜線の棒）を、３種類のＭＨＣクラスＩ陰性
標的細胞であるＬ７２１．２２１、Ｋ５６２、およびＤ
ａｕｄｉを用いて分析した。結果は、５回〜７回の独立
した実験から得られたデータを用いてＬ７２１．２２１
細胞の５０％溶解と比較して調節された％相対的細胞傷
害応答（％ＲＣＲ）（文献２７）の平均値±標準偏差を
表す。％比溶解のレベルは２５〜５０％であった。ＬＡ
Ｋ−２６およびＬＡＫ−５３細胞をＥ：Ｔ１０：１で試
験し、ＬＡＫ−ＣＰ１７６およびＬＡＫ−ＣＰ４１を
Ｅ：Ｔ２０：１で試験した。（Ｃ）Ｅ：Ｔ２０：１で
の、様々なＲＣＣ株（ＲＣＣおよびＳＫＲＣ）ならびに
１種類の黒色腫株（ＭＥＬ−２５）に対するＬＡＫ−２
６細胞の比細胞傷害活性。（Ｄ）Ｅ：Ｔ２０：１での、
同じＲＣＣおよびＭＥＬ株に対するＬＡＫ−ＣＰ１７６
細胞の比溶解パターン。図２ ＲＣＣ−２６細胞の内因
性または外因性ＩＦＮγ調整による溶解の抑制。ＩＦＮ
γなし（白記号）または１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮγの
９６時間刺激後（黒記号）での、ＲＣＣ−２６細胞
（△）、ベクター対照細胞ＲＣＣ−２６ＶＣ（□）に対
する、ＬＡＫ−２６Ｔ細胞（Ａ〜Ｃ）およびＢ．３ＮＫ
細胞（Ｄ〜Ｆ）の比細胞傷害活性。ＬＡＫ−２６（Ａ）
およびＢ．３ＮＫ（Ｄ）による溶解に対する感受性につ
いて非改変ＲＣＣ−２６細胞およびＲＣＣ−２６ＶＣ細
胞を直接比較した。２種類の内因性ＩＦＮγ発現ＲＣＣ
−２６株であるｅｎｄｏγ１（灰色○）およびｅｎｄｏ
γ２（灰色◇ ）が、それぞれＬＡＫ−２６細胞（Ｂ）
およびＢ．３ＮＫ細胞（Ｅ）についてＲＣＣ−２６ＶＣ
対照細胞（□）と比較した標的細胞として用いられた。
外因性ＩＦＮγなし（○；◇ ）または外因性ＩＦＮγ
９６時間刺激後（●；◆ ）でのｅｎｄｏγ１およびｅ
ｎｄｏγ２細胞に対するＬＡＫ−２６（Ｃ）およびＢ．
３ＮＫ細胞（Ｆ）の細胞傷害活性。全てのエフェクター
／標的の組み合わせを同時に試験した。データは４回の
独立した実験のうちの１つの％比溶解として示される。
（Ｇ）パンクラスＩ特異的ｍａｂＷ６／３２を用いた、
ＲＣＣ−２６腫瘍細胞および形質導入変種におけるＭＨ
ＣクラスＩの発現。データは、９回の代表的な実験の１
つについての、特異的ｍａｂによるＭＦＩからイソタイ
プ対照ｍａｂによるＭＦＩを差し引くことにより評価さ
れた修正平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）を表す。図３ ＬＡ
Ｋ活性およびＢ．３ＮＫ活性は腫瘍特異的でなく、抑制
はＨＬＡクラスＩ ｍａｂでブロックすることにより逆
転することができる。（Ａ）ＬＡＫ−２６細胞および
（Ｂ）Ｂ．３ＮＫ細胞を、腫瘍（ＲＣＣ−２６）細胞お
よび正常腎臓細胞（ＮＫＣ−２６）に対して、対照ｍａ
ｂ（ＭＯＰＣ２１）の存在下、ＩＦＮγなしで（白棒）
またはＩＦＮγ９６時間刺激後（黒棒）に並行研究し
た。クラスＩ特異的ｍａｂ（Ｗ６／３２）と３０分間プ
レインキュベートされた細胞は両グラフにおいて斜線の
棒で示される。一般的なクラスＩ染色用のＷ６／３２
（Ｃ＋Ｄ）およびＨＬＡ−Ｃ特異的ｍａｂであるＬ３１
（Ｅ＋Ｆ）を用いて、ＲＣＣ−２６（Ｃ＋Ｅ）およびＮ
ＫＣ−２６（Ｄ＋Ｆ）のＨＬＡクラスＩ表面発現を分析
した。刺激されていないＲＣＣ−２６またはＮＫＣ−２
６細胞は太線の白グラフで示される。ＩＦＮγ刺激細胞
は黒グラフとして示され、ｍａｂ ＭＯＰＣ２１による
対照染色は細線の白グラフで示される。図４ クラスＩ
陰性細胞にトランスフェクトされたＨＬＡクラスＩａ分
子およびＩｂ分子によるＬＡＫ細胞傷害性の抑制。（Ａ
〜Ｄ）クラスＩ分子を発現するように改変した後に、様
々なクラスＩ陰性標的細胞を用いてＬＡＫ−２６細胞の
細胞傷害性を試験した。（Ａ）クラスＩ陰性Ｌ７２１．
２２１（ρ）株を、ＨＬＡ−Ａ１、Ｃｗ７、Ｂ８ハプロ
タイプを発現するクラスＩ陽性ＨＬＡヘミ接合変種Ｌ７
２１．１１２株（π）と比較した。（Ｂ）クラスＩ陰性
Ｄａｕｄｉ細胞（□）を、Ａ＊０１０２、Ａ＊６６０
１、Ｂ＊５８０１、Ｂ＊５８０２、Ｃｗ＊０３０２、お
よびＣｗ＊０６０２を潜在的に発現するクラスＩ陽性Ｄ
ａｕｄｉ−β ２ｍトランスフェクタント（■）（２８）
と比較した。（Ｃ）クラスＩ陰性Ｋ５６２細胞（◇ ）
および対応するＨＬＡ−Ｅ発現トランスフェクタント
（◆ ）。（Ｄ）Ｌ７２１．２２１細胞を、単一のＨＬ
Ａ対立遺伝子（Ｂ＊３５０１、Ｃｗ ＊０７０２、Ｃｗ＊
０６０２）を発現するトランスフェクタント（同等レベ
ルのＭＨＣ発現を示す（データ示さず））と比較した。
データは、Ｅ：Ｔ２０：１で３回の独立した実験の％Ｒ
ＣＲの平均値＋ＳＤを表す。Ｅ：Ｔ＝２０：１での、Ｌ
７２１．２２１細胞ならびにＨＬＡ−Ｇ、Ｂ＊３５０
１、Ｂ＊２７０５、Ｃｗ ＊０７０２、およびＣｗ＊０６
０２を発現するトランスフェクタントの（Ｅ）ＬＡＫ−
ＣＰ４１溶解および（Ｆ）ＬＡＫ−ＣＰ１７６溶解。Ａ
〜Ｃのデータは％比溶解を表し、Ｄ〜Ｆの値は、参照と
して３回以上の独立した実験からのＬ７２１．２２１の
５０％溶解を用いた％ＲＣＲの平均値＋ＳＤを表す（２
７）。Ｌ７２１．２２１の％比溶解の値は３５％〜５８
％であった。図５ ＣＤ４＋ＬＡＫ−Ｔ細胞の細胞傷害
性の負の調節。（Ａ）富化ＣＤ４＋ＬＡＫ−２６由来Ｔ
細胞（左）および混合ＬＡＫ−２６集団（右）の表現型
分析。ＣＤ３およびＣＤ４染色を示す。富化ＣＤ４＋Ｌ
ＡＫ−２６由来Ｔ細胞の細胞傷害パターン（Ｂ）を混合
ＬＡＫ−２６集団の細胞傷害パターン（Ｃ）と比較し
た。データは、基準値としてＫ５６２の５０％溶解を用
いた％ＲＣＲを表す。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＫ５６２の
％比溶解は２６％であり、混合集団の％比溶解は３０％
であった。
Ｉ陰性標的細胞および悪性標的細胞に対するＲＣＣ患者
および健常ドナーから得られたＬＡＫ細胞の細胞傷害活
性。（Ａ）２人のＲＣＣ患者のＰＢＭＣから作成された
ＬＡＫ細胞、ＬＡＫ−２６（黒棒）およびＬＡＫ−５３
（点付きの棒）、ならびに（Ｂ）２人の健常ドナーから
作成されたＬＡＫ細胞、ＣＰ−１７６（白棒）およびＣ
Ｐ−４１（斜線の棒）を、３種類のＭＨＣクラスＩ陰性
標的細胞であるＬ７２１．２２１、Ｋ５６２、およびＤ
ａｕｄｉを用いて分析した。結果は、５回〜７回の独立
した実験から得られたデータを用いてＬ７２１．２２１
細胞の５０％溶解と比較して調節された％相対的細胞傷
害応答（％ＲＣＲ）（文献２７）の平均値±標準偏差を
表す。％比溶解のレベルは２５〜５０％であった。ＬＡ
Ｋ−２６およびＬＡＫ−５３細胞をＥ：Ｔ１０：１で試
験し、ＬＡＫ−ＣＰ１７６およびＬＡＫ−ＣＰ４１を
Ｅ：Ｔ２０：１で試験した。（Ｃ）Ｅ：Ｔ２０：１で
の、様々なＲＣＣ株（ＲＣＣおよびＳＫＲＣ）ならびに
１種類の黒色腫株（ＭＥＬ−２５）に対するＬＡＫ−２
６細胞の比細胞傷害活性。（Ｄ）Ｅ：Ｔ２０：１での、
同じＲＣＣおよびＭＥＬ株に対するＬＡＫ−ＣＰ１７６
細胞の比溶解パターン。図２ ＲＣＣ−２６細胞の内因
性または外因性ＩＦＮγ調整による溶解の抑制。ＩＦＮ
γなし（白記号）または１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮγの
９６時間刺激後（黒記号）での、ＲＣＣ−２６細胞
（△）、ベクター対照細胞ＲＣＣ−２６ＶＣ（□）に対
する、ＬＡＫ−２６Ｔ細胞（Ａ〜Ｃ）およびＢ．３ＮＫ
細胞（Ｄ〜Ｆ）の比細胞傷害活性。ＬＡＫ−２６（Ａ）
およびＢ．３ＮＫ（Ｄ）による溶解に対する感受性につ
いて非改変ＲＣＣ−２６細胞およびＲＣＣ−２６ＶＣ細
胞を直接比較した。２種類の内因性ＩＦＮγ発現ＲＣＣ
−２６株であるｅｎｄｏγ１（灰色○）およびｅｎｄｏ
γ２（灰色◇ ）が、それぞれＬＡＫ−２６細胞（Ｂ）
およびＢ．３ＮＫ細胞（Ｅ）についてＲＣＣ−２６ＶＣ
対照細胞（□）と比較した標的細胞として用いられた。
外因性ＩＦＮγなし（○；◇ ）または外因性ＩＦＮγ
９６時間刺激後（●；◆ ）でのｅｎｄｏγ１およびｅ
ｎｄｏγ２細胞に対するＬＡＫ−２６（Ｃ）およびＢ．
３ＮＫ細胞（Ｆ）の細胞傷害活性。全てのエフェクター
／標的の組み合わせを同時に試験した。データは４回の
独立した実験のうちの１つの％比溶解として示される。
（Ｇ）パンクラスＩ特異的ｍａｂＷ６／３２を用いた、
ＲＣＣ−２６腫瘍細胞および形質導入変種におけるＭＨ
ＣクラスＩの発現。データは、９回の代表的な実験の１
つについての、特異的ｍａｂによるＭＦＩからイソタイ
プ対照ｍａｂによるＭＦＩを差し引くことにより評価さ
れた修正平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）を表す。図３ ＬＡ
Ｋ活性およびＢ．３ＮＫ活性は腫瘍特異的でなく、抑制
はＨＬＡクラスＩ ｍａｂでブロックすることにより逆
転することができる。（Ａ）ＬＡＫ−２６細胞および
（Ｂ）Ｂ．３ＮＫ細胞を、腫瘍（ＲＣＣ−２６）細胞お
よび正常腎臓細胞（ＮＫＣ−２６）に対して、対照ｍａ
ｂ（ＭＯＰＣ２１）の存在下、ＩＦＮγなしで（白棒）
またはＩＦＮγ９６時間刺激後（黒棒）に並行研究し
た。クラスＩ特異的ｍａｂ（Ｗ６／３２）と３０分間プ
レインキュベートされた細胞は両グラフにおいて斜線の
棒で示される。一般的なクラスＩ染色用のＷ６／３２
（Ｃ＋Ｄ）およびＨＬＡ−Ｃ特異的ｍａｂであるＬ３１
（Ｅ＋Ｆ）を用いて、ＲＣＣ−２６（Ｃ＋Ｅ）およびＮ
ＫＣ−２６（Ｄ＋Ｆ）のＨＬＡクラスＩ表面発現を分析
した。刺激されていないＲＣＣ−２６またはＮＫＣ−２
６細胞は太線の白グラフで示される。ＩＦＮγ刺激細胞
は黒グラフとして示され、ｍａｂ ＭＯＰＣ２１による
対照染色は細線の白グラフで示される。図４ クラスＩ
陰性細胞にトランスフェクトされたＨＬＡクラスＩａ分
子およびＩｂ分子によるＬＡＫ細胞傷害性の抑制。（Ａ
〜Ｄ）クラスＩ分子を発現するように改変した後に、様
々なクラスＩ陰性標的細胞を用いてＬＡＫ−２６細胞の
細胞傷害性を試験した。（Ａ）クラスＩ陰性Ｌ７２１．
２２１（ρ）株を、ＨＬＡ−Ａ１、Ｃｗ７、Ｂ８ハプロ
タイプを発現するクラスＩ陽性ＨＬＡヘミ接合変種Ｌ７
２１．１１２株（π）と比較した。（Ｂ）クラスＩ陰性
Ｄａｕｄｉ細胞（□）を、Ａ＊０１０２、Ａ＊６６０
１、Ｂ＊５８０１、Ｂ＊５８０２、Ｃｗ＊０３０２、お
よびＣｗ＊０６０２を潜在的に発現するクラスＩ陽性Ｄ
ａｕｄｉ−β ２ｍトランスフェクタント（■）（２８）
と比較した。（Ｃ）クラスＩ陰性Ｋ５６２細胞（◇ ）
および対応するＨＬＡ−Ｅ発現トランスフェクタント
（◆ ）。（Ｄ）Ｌ７２１．２２１細胞を、単一のＨＬ
Ａ対立遺伝子（Ｂ＊３５０１、Ｃｗ ＊０７０２、Ｃｗ＊
０６０２）を発現するトランスフェクタント（同等レベ
ルのＭＨＣ発現を示す（データ示さず））と比較した。
データは、Ｅ：Ｔ２０：１で３回の独立した実験の％Ｒ
ＣＲの平均値＋ＳＤを表す。Ｅ：Ｔ＝２０：１での、Ｌ
７２１．２２１細胞ならびにＨＬＡ−Ｇ、Ｂ＊３５０
１、Ｂ＊２７０５、Ｃｗ ＊０７０２、およびＣｗ＊０６
０２を発現するトランスフェクタントの（Ｅ）ＬＡＫ−
ＣＰ４１溶解および（Ｆ）ＬＡＫ−ＣＰ１７６溶解。Ａ
〜Ｃのデータは％比溶解を表し、Ｄ〜Ｆの値は、参照と
して３回以上の独立した実験からのＬ７２１．２２１の
５０％溶解を用いた％ＲＣＲの平均値＋ＳＤを表す（２
７）。Ｌ７２１．２２１の％比溶解の値は３５％〜５８
％であった。図５ ＣＤ４＋ＬＡＫ−Ｔ細胞の細胞傷害
性の負の調節。（Ａ）富化ＣＤ４＋ＬＡＫ−２６由来Ｔ
細胞（左）および混合ＬＡＫ−２６集団（右）の表現型
分析。ＣＤ３およびＣＤ４染色を示す。富化ＣＤ４＋Ｌ
ＡＫ−２６由来Ｔ細胞の細胞傷害パターン（Ｂ）を混合
ＬＡＫ−２６集団の細胞傷害パターン（Ｃ）と比較し
た。データは、基準値としてＫ５６２の５０％溶解を用
いた％ＲＣＲを表す。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＫ５６２の
％比溶解は２６％であり、混合集団の％比溶解は３０％
であった。
【００４２】以下において本発明の詳細な説明が提供さ
れる。本発明の基礎となる基本原理を定種類のＭＨＣ非
拘束性細胞（すなわち、ＬＡＫ細胞）によって例示する
が、本発明の範囲はＬＡＫ細胞およびその使用に限定さ
れないことに留意する。
れる。本発明の基礎となる基本原理を定種類のＭＨＣ非
拘束性細胞（すなわち、ＬＡＫ細胞）によって例示する
が、本発明の範囲はＬＡＫ細胞およびその使用に限定さ
れないことに留意する。
【００４３】
【発明の実施の形態】（ＲＣＣ患者および健常ドナーか
らのＬＡＫ細胞はＭＨＣクラスＩ陰性標的細胞およびＭ
ＨＣクラスＩ陽性腫瘍株を認識する）
らのＬＡＫ細胞はＭＨＣクラスＩ陰性標的細胞およびＭ
ＨＣクラスＩ陽性腫瘍株を認識する）
【００４４】ＲＣＣ患者および健常ドナーのＰＢＭＣか
ら作成されたＬＡＫ細胞を、ＭＨＣクラスＩ陰性標的細
胞および様々な腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性につい
て試験した。図１は、数回の独立した実験の複合的な結
果をまとめている。この実験では、ＭＨＣクラスＩ陰性
標的細胞であるＬ７２１．２２１、Ｋ５６２、およびＤ
ａｕｄｉが４種類の異なるＬＡＫ集団によって効率的に
溶解された。２人のＲＣＣ患者から得られたＬＡＫ−２
６とＬＡＫ−５３との間（図１Ａ）、および２人の健常
な対照ドナーから得られたＬＡＫ−ＣＰ１７６とＬＡＫ
−ＣＰ４１との間（図１Ｂ）には、細胞傷害活性レベル
の実質的な差は観察されなかった。患者由来ＬＡＫ−２
６は自己由来ＲＣＣ株（ＲＣＣ２６）を溶解することが
でき、さらに、ＨＬＡバックグラウンドとは無関係に様
々な同種異系ＲＣＣ株（ＳＫＲＣ）ならびにＭＥＬ−２
５黒色腫株を認識することができた（図１Ｃ）。対照で
あるドナー由来ＬＡＫ−ＣＰ１７６株は、同じようにこ
れらの様々な腫瘍細胞株を溶解した（図１Ｄ）。これら
の腫瘍細胞株の全てが、クラスＩ特異的ｍａｂであるＷ
６／３２の結合によってクラスＩ陽性であることが示さ
れた（データ示さず）。これらの結果により、ＬＡＫ集
団は非ＭＨＣ拘束的に標的細胞を認識でき、溶解はどの
単一の腫瘍にも特異的でないことが証明された。
ら作成されたＬＡＫ細胞を、ＭＨＣクラスＩ陰性標的細
胞および様々な腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性につい
て試験した。図１は、数回の独立した実験の複合的な結
果をまとめている。この実験では、ＭＨＣクラスＩ陰性
標的細胞であるＬ７２１．２２１、Ｋ５６２、およびＤ
ａｕｄｉが４種類の異なるＬＡＫ集団によって効率的に
溶解された。２人のＲＣＣ患者から得られたＬＡＫ−２
６とＬＡＫ−５３との間（図１Ａ）、および２人の健常
な対照ドナーから得られたＬＡＫ−ＣＰ１７６とＬＡＫ
−ＣＰ４１との間（図１Ｂ）には、細胞傷害活性レベル
の実質的な差は観察されなかった。患者由来ＬＡＫ−２
６は自己由来ＲＣＣ株（ＲＣＣ２６）を溶解することが
でき、さらに、ＨＬＡバックグラウンドとは無関係に様
々な同種異系ＲＣＣ株（ＳＫＲＣ）ならびにＭＥＬ−２
５黒色腫株を認識することができた（図１Ｃ）。対照で
あるドナー由来ＬＡＫ−ＣＰ１７６株は、同じようにこ
れらの様々な腫瘍細胞株を溶解した（図１Ｄ）。これら
の腫瘍細胞株の全てが、クラスＩ特異的ｍａｂであるＷ
６／３２の結合によってクラスＩ陽性であることが示さ
れた（データ示さず）。これらの結果により、ＬＡＫ集
団は非ＭＨＣ拘束的に標的細胞を認識でき、溶解はどの
単一の腫瘍にも特異的でないことが証明された。
【００４５】（ＬＡＫ集団は主にＣＤ４＋およびＣＤ８
＋Ｔ細胞からなる）これらの研究で利用された４人の異
なるドナーから得られた増殖ＬＡＫ培養物のリンパ球サ
ブセットの表現型分析が行われた。表１は、そのような
ＬＡＫ集団におけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞および
ＣＤ３＋ＣＤ５６−Ｔ細胞の分布を示す。ＲＣＣ患者お
よび健常ドナーから得られたＬＡＫ細胞間の差異は明ら
かでなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞が主要な細胞タイプであ
り、全試料における細胞の９５％を超えていた。ＬＡＫ
−ＣＰ１７６培養物はＣＤ８＋Ｔ細胞が大部分を占める
が、他のＬＡＫ試料はほぼ同数のＣＤ４＋およびＣＤ８
＋Ｔ細胞を含んでいた。対照的に、ＣＤ３−ＣＤ５６＋
ＮＫ細胞は非常に少ない数でしか存在せず、全細胞の０
〜６％であった。これらの結果から、これらのＬＡＫ細
胞の作成および維持に用いられた培養条件は、主とし
て、ＮＫ細胞の接着画分ではなくリンパ球のＴ細胞画分
の増殖につながったことが明らかになった。これらのＬ
ＡＫ細胞株の表現型は、主な細胞傷害成分が活性化Ｔ細
胞に起因することを示していた。実際には、混合ＬＡＫ
集団からのＮＫ細胞のわずかな残存画分の枯渇はその細
胞傷害能力または特異性を変えなかった（データ示さ
ず）。
＋Ｔ細胞からなる）これらの研究で利用された４人の異
なるドナーから得られた増殖ＬＡＫ培養物のリンパ球サ
ブセットの表現型分析が行われた。表１は、そのような
ＬＡＫ集団におけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞および
ＣＤ３＋ＣＤ５６−Ｔ細胞の分布を示す。ＲＣＣ患者お
よび健常ドナーから得られたＬＡＫ細胞間の差異は明ら
かでなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞が主要な細胞タイプであ
り、全試料における細胞の９５％を超えていた。ＬＡＫ
−ＣＰ１７６培養物はＣＤ８＋Ｔ細胞が大部分を占める
が、他のＬＡＫ試料はほぼ同数のＣＤ４＋およびＣＤ８
＋Ｔ細胞を含んでいた。対照的に、ＣＤ３−ＣＤ５６＋
ＮＫ細胞は非常に少ない数でしか存在せず、全細胞の０
〜６％であった。これらの結果から、これらのＬＡＫ細
胞の作成および維持に用いられた培養条件は、主とし
て、ＮＫ細胞の接着画分ではなくリンパ球のＴ細胞画分
の増殖につながったことが明らかになった。これらのＬ
ＡＫ細胞株の表現型は、主な細胞傷害成分が活性化Ｔ細
胞に起因することを示していた。実際には、混合ＬＡＫ
集団からのＮＫ細胞のわずかな残存画分の枯渇はその細
胞傷害能力または特異性を変えなかった（データ示さ
ず）。
【００４６】（ＬＡＫ−Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞の
ＩＦＮγによる抑制にはＭＨＣクラスＩ増強が関連して
いる）腫瘍細胞のＩＦＮγ処理は精製ＮＫ細胞およびＬ
ＡＫ細胞に対する耐性につながり得ることが以前に示さ
れている（文献２９；３０）。ＭＨＣ発現もまたＬＡＫ
−Ｔ細胞に対する腫瘍細胞感受性に影響を及ぼすことが
できるかを確かめるために、ＲＣＣ−２６細胞を外因性
ＩＦＮγ刺激によるクラスＩ発現の増強後に分析した。
あるいは、ＲＣＣ−２６株に、内因性サイトカインの産
生およびその後のクラスＩ発現のアップレギュレーショ
ンにつながるヒトＩＦＮγ ｃＤＮＡを形質導入した
（文献３１）。自己由来ＬＡＫ−２６Ｔ細胞を用いて、
これらの様々なＩＦＮγにより調整されたＲＣＣ−２６
細胞の溶解に対する感受性を評価した（図２Ａ〜Ｃ）。
Ｃｗ１、３、７サブグループのＨＬＡ−Ｃ分子を結合す
るＫＩＲファミリーのｐ５８．２受容体を排他的に発現
することが以前に示された精製Ｂ．３ＮＫ細胞を比較に
含めた（図２Ｄ〜Ｆ）。非改変ＲＣＣ−２６細胞および
空ベクターを有する対照株（ＲＣＣ−２６ＶＣ）は両方
のエフェクター細胞タイプによって溶解され、これによ
って活性化ＮＫ細胞はより強力な溶解能力を示した。外
因性ＩＦＮγ刺激の後、ＬＡＫ−Ｔ細胞およびＮＫ細胞
による溶解に対して両方の腫瘍株はかなりの耐性を示し
た（図２Ａ，Ｄ）。ＩＦＮγ形質導入株（ｅｎｄｏγ
１）により同程度の耐性が観察されたが、他方の形質導
入株（ｅｎｄｏ□２）は両方のエフェクター集団に対し
て部分的な耐性しか示さなかった（図２Ｂ，Ｅ）。しか
しながら、さらなるＩＦＮγ刺激が、この形質導入株の
ＬＡＫ−２６Ｔ細胞およびＢ．３ＮＫ細胞に対する耐性
の増大につながった（図２Ｃ，Ｆ）。この耐性は、ＲＣ
Ｃ−２６およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞の外因性ＩＦＮγ
刺激により誘導される耐性と同等であった。並行研究に
おいて、ＬＡＫ−５３、ＬＡＫ−ＣＰ４１、およびＬＡ
Ｋ−ＣＰ１７６ Ｔ細胞がＬＡＫ−２６Ｔ細胞および
Ｂ．３ＮＫ細胞と同様の細胞傷害パターンを示した。こ
のことから、ＩＦＮγ誘導効果とＬＡＫ由来細胞傷害性
Ｔ細胞に対する耐性との一般的な相関関係が証明された
（データ示さず）。
ＩＦＮγによる抑制にはＭＨＣクラスＩ増強が関連して
いる）腫瘍細胞のＩＦＮγ処理は精製ＮＫ細胞およびＬ
ＡＫ細胞に対する耐性につながり得ることが以前に示さ
れている（文献２９；３０）。ＭＨＣ発現もまたＬＡＫ
−Ｔ細胞に対する腫瘍細胞感受性に影響を及ぼすことが
できるかを確かめるために、ＲＣＣ−２６細胞を外因性
ＩＦＮγ刺激によるクラスＩ発現の増強後に分析した。
あるいは、ＲＣＣ−２６株に、内因性サイトカインの産
生およびその後のクラスＩ発現のアップレギュレーショ
ンにつながるヒトＩＦＮγ ｃＤＮＡを形質導入した
（文献３１）。自己由来ＬＡＫ−２６Ｔ細胞を用いて、
これらの様々なＩＦＮγにより調整されたＲＣＣ−２６
細胞の溶解に対する感受性を評価した（図２Ａ〜Ｃ）。
Ｃｗ１、３、７サブグループのＨＬＡ−Ｃ分子を結合す
るＫＩＲファミリーのｐ５８．２受容体を排他的に発現
することが以前に示された精製Ｂ．３ＮＫ細胞を比較に
含めた（図２Ｄ〜Ｆ）。非改変ＲＣＣ−２６細胞および
空ベクターを有する対照株（ＲＣＣ−２６ＶＣ）は両方
のエフェクター細胞タイプによって溶解され、これによ
って活性化ＮＫ細胞はより強力な溶解能力を示した。外
因性ＩＦＮγ刺激の後、ＬＡＫ−Ｔ細胞およびＮＫ細胞
による溶解に対して両方の腫瘍株はかなりの耐性を示し
た（図２Ａ，Ｄ）。ＩＦＮγ形質導入株（ｅｎｄｏγ
１）により同程度の耐性が観察されたが、他方の形質導
入株（ｅｎｄｏ□２）は両方のエフェクター集団に対し
て部分的な耐性しか示さなかった（図２Ｂ，Ｅ）。しか
しながら、さらなるＩＦＮγ刺激が、この形質導入株の
ＬＡＫ−２６Ｔ細胞およびＢ．３ＮＫ細胞に対する耐性
の増大につながった（図２Ｃ，Ｆ）。この耐性は、ＲＣ
Ｃ−２６およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞の外因性ＩＦＮγ
刺激により誘導される耐性と同等であった。並行研究に
おいて、ＬＡＫ−５３、ＬＡＫ−ＣＰ４１、およびＬＡ
Ｋ−ＣＰ１７６ Ｔ細胞がＬＡＫ−２６Ｔ細胞および
Ｂ．３ＮＫ細胞と同様の細胞傷害パターンを示した。こ
のことから、ＩＦＮγ誘導効果とＬＡＫ由来細胞傷害性
Ｔ細胞に対する耐性との一般的な相関関係が証明された
（データ示さず）。
【００４７】様々な標的細胞と相互作用した後のＬＡＫ
−Ｔ活性および対照ＮＫ活性の減少が、クラスＩ発現の
増加がフローサイトメトリーで検出された全ての実験に
おいて一貫して見られた。図２Ｇは、ＲＣＣ−２６細胞
におけるＩＦＮγによるＭＨＣクラスＩ発現の増強を分
析した非常に多くの実験のうちの１つの代表的な結果を
示す。ＲＣＣ−２６およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞はかな
りのレベルのクラスＩ分子を構成的に発現していたが、
クラスＩ特異的ｍａｂであるＷ６／３２による染色によ
り検出されたように、発現はＩＦＮγ刺激後に増大し
た。ＭＨＣ発現の総レベルは様々な細胞株によって異な
るが、再現可能であり、明らかにＩＦＮγ誘導に対する
個々の株の応答性のばらつきを反映していた。興味深い
ことに、ｅｎｄｏγ２株は、ｅｎｄｏγ１細胞と比較し
て低いＭＨＣ分子構成レベルを示した。この形質導入株
はまた、ＬＡＫ−ＴおよびＮＫによる細胞傷害性に対す
る感受性が高かった。しかしながら、外因性ＩＦＮγに
よるｅｎｄｏγ２細胞の刺激はクラスＩ発現の増強（デ
ータ示さず）および両方のエフェクター細胞タイプに対
する耐性の増大（図２Ｃ，Ｆを参照のこと）につながっ
た。追加実験において、他の腫瘍細胞株がＩＦＮγ処理
後にＬＡＫ−Ｔ細胞に対する耐性を獲得したことが示さ
れた（データ示さず）。
−Ｔ活性および対照ＮＫ活性の減少が、クラスＩ発現の
増加がフローサイトメトリーで検出された全ての実験に
おいて一貫して見られた。図２Ｇは、ＲＣＣ−２６細胞
におけるＩＦＮγによるＭＨＣクラスＩ発現の増強を分
析した非常に多くの実験のうちの１つの代表的な結果を
示す。ＲＣＣ−２６およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞はかな
りのレベルのクラスＩ分子を構成的に発現していたが、
クラスＩ特異的ｍａｂであるＷ６／３２による染色によ
り検出されたように、発現はＩＦＮγ刺激後に増大し
た。ＭＨＣ発現の総レベルは様々な細胞株によって異な
るが、再現可能であり、明らかにＩＦＮγ誘導に対する
個々の株の応答性のばらつきを反映していた。興味深い
ことに、ｅｎｄｏγ２株は、ｅｎｄｏγ１細胞と比較し
て低いＭＨＣ分子構成レベルを示した。この形質導入株
はまた、ＬＡＫ−ＴおよびＮＫによる細胞傷害性に対す
る感受性が高かった。しかしながら、外因性ＩＦＮγに
よるｅｎｄｏγ２細胞の刺激はクラスＩ発現の増強（デ
ータ示さず）および両方のエフェクター細胞タイプに対
する耐性の増大（図２Ｃ，Ｆを参照のこと）につながっ
た。追加実験において、他の腫瘍細胞株がＩＦＮγ処理
後にＬＡＫ−Ｔ細胞に対する耐性を獲得したことが示さ
れた（データ示さず）。
【００４８】患者２６の正常腎臓実質から得られた細胞
株（ＮＫＣ−２６）（３２）が入手できたために、ＬＡ
Ｋ−ＴおよびＮＫ細胞傷害性のＩＦＮγ誘導抑制が腫瘍
細胞に限られるのか、または正常上皮細胞の溶解にも影
響を及ぼすのかという評価が可能になった。ＮＫＣ−２
６細胞は、自己由来ＬＡＫ−２６Ｔ細胞（図３Ａ）およ
び同種異系Ｂ．３ＮＫ細胞（図３Ｂ）によって溶解され
た。このことから、これらのエフェクター細胞は腫瘍特
異的でないことが証明された。ＲＣＣ−２６細胞で見ら
れるように、ＮＫＣ−２６の外因性ＩＦＮγ刺激は、Ｌ
ＡＫ−２６Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞による細胞傷害
性のかなりの抑制をもたらした。このことから、ＩＦＮ
γ誘導耐性もまた腫瘍特異的でないことが明らかになっ
た。示していない研究において、同種異系ＬＡＫ−Ｔ細
胞がＮＫＣ−２６株を溶解することができ、ＩＦＮγ刺
激がその部分的な耐性につながることが発見された。こ
のことから、この効果は自己由来ＬＡＫ−Ｔ細胞に限定
されないことが分かった。
株（ＮＫＣ−２６）（３２）が入手できたために、ＬＡ
Ｋ−ＴおよびＮＫ細胞傷害性のＩＦＮγ誘導抑制が腫瘍
細胞に限られるのか、または正常上皮細胞の溶解にも影
響を及ぼすのかという評価が可能になった。ＮＫＣ−２
６細胞は、自己由来ＬＡＫ−２６Ｔ細胞（図３Ａ）およ
び同種異系Ｂ．３ＮＫ細胞（図３Ｂ）によって溶解され
た。このことから、これらのエフェクター細胞は腫瘍特
異的でないことが証明された。ＲＣＣ−２６細胞で見ら
れるように、ＮＫＣ−２６の外因性ＩＦＮγ刺激は、Ｌ
ＡＫ−２６Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞による細胞傷害
性のかなりの抑制をもたらした。このことから、ＩＦＮ
γ誘導耐性もまた腫瘍特異的でないことが明らかになっ
た。示していない研究において、同種異系ＬＡＫ−Ｔ細
胞がＮＫＣ−２６株を溶解することができ、ＩＦＮγ刺
激がその部分的な耐性につながることが発見された。こ
のことから、この効果は自己由来ＬＡＫ−Ｔ細胞に限定
されないことが分かった。
【００４９】ＩＦＮγ刺激後のクラスＩ発現を分析した
並行研究は、ＲＣＣ−２６細胞（図３Ｃ）およびＮＫＣ
−２６細胞（図３Ｄ）によるＷ６／３２抗体結合の増大
を示した。同様に、ｍａｂ Ｌ３１を用いて、Ｂ．３Ｎ
Ｋ細胞の活性を支配するｐ５８．２抑制性受容体のリガ
ンドとして働くＨＬＡ−Ｃ分子のレベルが両方の細胞株
上で増加することが発見された（図３Ｅ，Ｆ）。ｍａｂ
Ｌ３１で観察された弱い染色パターンは、ＨＬＡ−Ｃ
分子のβ２ｍのない重鎖とのｍａｂ Ｌ３１の優先的な
反応性で説明がつくかもしれない（文献３３）。
並行研究は、ＲＣＣ−２６細胞（図３Ｃ）およびＮＫＣ
−２６細胞（図３Ｄ）によるＷ６／３２抗体結合の増大
を示した。同様に、ｍａｂ Ｌ３１を用いて、Ｂ．３Ｎ
Ｋ細胞の活性を支配するｐ５８．２抑制性受容体のリガ
ンドとして働くＨＬＡ−Ｃ分子のレベルが両方の細胞株
上で増加することが発見された（図３Ｅ，Ｆ）。ｍａｂ
Ｌ３１で観察された弱い染色パターンは、ＨＬＡ−Ｃ
分子のβ２ｍのない重鎖とのｍａｂ Ｌ３１の優先的な
反応性で説明がつくかもしれない（文献３３）。
【００５０】（ＭＨＣクラスＩ特異的抗体はＬＡＫ−Ｔ
細胞の細胞傷害性の抑制を逆転させる）ＩＦＮγは多く
の異なる遺伝子の発現を調節するので、クラスＩ分子が
ＬＡＫ−Ｔ活性およびＮＫ活性のダウンモジュレーショ
ンに直接寄与することを証明するために、標的細胞上の
クラスＩリガンドをブロックするｍａｂを用いた機能抑
制研究が用いられた。ＩＦＮγで刺激されたＲＣＣ−２
６細胞またはＮＫＣ−２６細胞とＷ６／３２ ｍａｂと
のプレインキュベーションによって、両方のエフェクタ
ー集団の抑制が逆転した（図３Ａ，Ｂ）。従って、正常
上皮細胞および腫瘍細胞の耐性はクラスＩ分子により媒
介され、クラスＩ表面発現の抗体マスキング（ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ ｍａｓｋｉｎｇ）は両標的細胞の溶解に対す
る感受性を回復することができた。
細胞の細胞傷害性の抑制を逆転させる）ＩＦＮγは多く
の異なる遺伝子の発現を調節するので、クラスＩ分子が
ＬＡＫ−Ｔ活性およびＮＫ活性のダウンモジュレーショ
ンに直接寄与することを証明するために、標的細胞上の
クラスＩリガンドをブロックするｍａｂを用いた機能抑
制研究が用いられた。ＩＦＮγで刺激されたＲＣＣ−２
６細胞またはＮＫＣ−２６細胞とＷ６／３２ ｍａｂと
のプレインキュベーションによって、両方のエフェクタ
ー集団の抑制が逆転した（図３Ａ，Ｂ）。従って、正常
上皮細胞および腫瘍細胞の耐性はクラスＩ分子により媒
介され、クラスＩ表面発現の抗体マスキング（ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ ｍａｓｋｉｎｇ）は両標的細胞の溶解に対す
る感受性を回復することができた。
【００５１】ＬＡＫ−Ｔ細胞傷害性のクラスＩ依存的抑
制は、表２にまとめたさらに詳しいブロッキング研究に
よって確認された。様々な標的細胞に対するＬＡＫ−Ｔ
細胞（ＬＡＫ−２６、ＬＡＫ−ＣＰ４１）およびＢ．３
ＮＫの細胞傷害活性をＷ６／３２またはイソタイプ対照
ｍａｂの存在下で分析した。刺激されていないＲＣＣ−
２６細胞およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞とＷ６／３２ ｍ
ａｂとのプレインキュベーションによって、様々なエフ
ェクター細胞による溶解がイソタイプ対照と比較してわ
ずかに増大した。Ｗ６／３２ ｍａｂの添加によって、
ＩＦＮγで刺激されたＲＣＣ−２６細胞またはＲＣＣ−
２６ＶＣ細胞で見られる溶解の抑制はかなり逆転した。
さらに、両方のＩＦＮγ発現形質導入株の溶解がＷ６／
３２ ｍａｂの存在下でかなり増大した。クラスＩ分子
のマスキングによって達成された、一貫して改善された
細胞傷害性はまた、第２のＲＣＣ株および対応するＩＦ
Ｎγ形質導入株でも観察された（データ示さず）。これ
らの結果により、クラスＩ分子は、ＬＡＫ−Ｔ細胞およ
び活性化ＮＫ細胞のＩＦＮγによる抑制に直接寄与する
ことが証明された。
制は、表２にまとめたさらに詳しいブロッキング研究に
よって確認された。様々な標的細胞に対するＬＡＫ−Ｔ
細胞（ＬＡＫ−２６、ＬＡＫ−ＣＰ４１）およびＢ．３
ＮＫの細胞傷害活性をＷ６／３２またはイソタイプ対照
ｍａｂの存在下で分析した。刺激されていないＲＣＣ−
２６細胞およびＲＣＣ−２６ＶＣ細胞とＷ６／３２ ｍ
ａｂとのプレインキュベーションによって、様々なエフ
ェクター細胞による溶解がイソタイプ対照と比較してわ
ずかに増大した。Ｗ６／３２ ｍａｂの添加によって、
ＩＦＮγで刺激されたＲＣＣ−２６細胞またはＲＣＣ−
２６ＶＣ細胞で見られる溶解の抑制はかなり逆転した。
さらに、両方のＩＦＮγ発現形質導入株の溶解がＷ６／
３２ ｍａｂの存在下でかなり増大した。クラスＩ分子
のマスキングによって達成された、一貫して改善された
細胞傷害性はまた、第２のＲＣＣ株および対応するＩＦ
Ｎγ形質導入株でも観察された（データ示さず）。これ
らの結果により、クラスＩ分子は、ＬＡＫ−Ｔ細胞およ
び活性化ＮＫ細胞のＩＦＮγによる抑制に直接寄与する
ことが証明された。
【００５２】（ＨＬＡクラスＩａ分子およびクラスＩｂ
分子はＬＡＫ−Ｔの細胞傷害性を抑制することができ
る）ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラスＩ陰性標的細胞を効率的に
溶解したので、本発明者らは、このような細胞における
クラスＩ分子の発現がＬＡＫ−Ｔ活性を直接阻害するこ
とができるかどうかを調べた。クラスＩ陰性細胞株Ｌ７
２１．２２１は、放射線により誘導される変異誘発と連
続したＨＬＡ喪失変異体の選択によってクラスＩ陽性リ
ンパ芽球様細胞株（Ｌ７２１）から得られた。Ｌ７２
１．１１２株は、２つの親ハプロタイプ（ＨＬＡ−Ａ
１，Ｂ８，Ｃｗ７）のうちの１つをなお発現するこの系
列で作成されたヘミ接合細胞株である。Ｌ７２１．２２
１細胞はＬＡＫ−２６Ｔ細胞による溶解に対して非常に
感受性が高いが、Ｌ７２１．１１２細胞によるクラスＩ
分子の発現は部分的な保護をもたらした（図４Ａ）。Ｄ
ａｕｄｉ細胞株はβ２ｍを産生せず、それにより、細胞
表面で安定なクラスＩ分子を発現しない。β２ｍ遺伝子
をＤａｕｄｉ細胞にトランスフェクションすることによ
り、Ｄａｕｄｉ細胞のクラスＩ分子発現が再現された
（文献２８）。この発現はＷ６／３２ ｍａｂによる染
色によって確認された（データ示さず）。非改変細胞株
はＬＡＫ−２６Ｔ細胞により効率的に溶解されたが、ト
ランスフェクタント細胞はかなりの耐性を示した（図４
Ｂ）。Ｋ５６２細胞が、ＨＬＡ−Ｅ分子をコードするク
ラスＩｂ遺伝子によるトランスフェクション後に、ＬＡ
Ｋ−２６Ｔ細胞による溶解に対して部分的に耐性になっ
たことも発見された（図４Ｃ）。Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｃｗ
６、およびＨＬＡ−Ｃｗ７分子を発現するように遺伝子
組換えされたＬ７２１．２２１細胞もまた、ＬＡＫ−２
６Ｔ細胞の標的細胞として分析された。ＨＬＡ−Ｂ３５
分子でもＨＬＡ−Ｃｗ７分子でも再現可能な抑制は見ら
れなかったが、ＨＬＡ−Ｃｗ６発現によって部分的な耐
性（２５％）が誘導された（図４Ｄ）。これらの結果か
ら、クラスＩ分子だけがＬＡＫ−２６Ｔ細胞の細胞傷害
性を直接抑制できることが確かめられた。
分子はＬＡＫ−Ｔの細胞傷害性を抑制することができ
る）ＬＡＫ−Ｔ細胞はクラスＩ陰性標的細胞を効率的に
溶解したので、本発明者らは、このような細胞における
クラスＩ分子の発現がＬＡＫ−Ｔ活性を直接阻害するこ
とができるかどうかを調べた。クラスＩ陰性細胞株Ｌ７
２１．２２１は、放射線により誘導される変異誘発と連
続したＨＬＡ喪失変異体の選択によってクラスＩ陽性リ
ンパ芽球様細胞株（Ｌ７２１）から得られた。Ｌ７２
１．１１２株は、２つの親ハプロタイプ（ＨＬＡ−Ａ
１，Ｂ８，Ｃｗ７）のうちの１つをなお発現するこの系
列で作成されたヘミ接合細胞株である。Ｌ７２１．２２
１細胞はＬＡＫ−２６Ｔ細胞による溶解に対して非常に
感受性が高いが、Ｌ７２１．１１２細胞によるクラスＩ
分子の発現は部分的な保護をもたらした（図４Ａ）。Ｄ
ａｕｄｉ細胞株はβ２ｍを産生せず、それにより、細胞
表面で安定なクラスＩ分子を発現しない。β２ｍ遺伝子
をＤａｕｄｉ細胞にトランスフェクションすることによ
り、Ｄａｕｄｉ細胞のクラスＩ分子発現が再現された
（文献２８）。この発現はＷ６／３２ ｍａｂによる染
色によって確認された（データ示さず）。非改変細胞株
はＬＡＫ−２６Ｔ細胞により効率的に溶解されたが、ト
ランスフェクタント細胞はかなりの耐性を示した（図４
Ｂ）。Ｋ５６２細胞が、ＨＬＡ−Ｅ分子をコードするク
ラスＩｂ遺伝子によるトランスフェクション後に、ＬＡ
Ｋ−２６Ｔ細胞による溶解に対して部分的に耐性になっ
たことも発見された（図４Ｃ）。Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｃｗ
６、およびＨＬＡ−Ｃｗ７分子を発現するように遺伝子
組換えされたＬ７２１．２２１細胞もまた、ＬＡＫ−２
６Ｔ細胞の標的細胞として分析された。ＨＬＡ−Ｂ３５
分子でもＨＬＡ−Ｃｗ７分子でも再現可能な抑制は見ら
れなかったが、ＨＬＡ−Ｃｗ６発現によって部分的な耐
性（２５％）が誘導された（図４Ｄ）。これらの結果か
ら、クラスＩ分子だけがＬＡＫ−２６Ｔ細胞の細胞傷害
性を直接抑制できることが確かめられた。
【００５３】ＭＨＣ抑制の優れた特異性への見通しもま
た他のＬＡＫ−Ｔ細胞（ＬＡＫ−ＣＰ４１およびＬＡＫ
−ＣＰ１７６）について得られた。なぜなら、ＨＬＡ−
Ｃｗ６発現によってＬ７２１．２２１細胞の溶解を５０
％を超えて特異的に抑制することが可能であったからで
ある（図４Ｅ，Ｆ）。対照的に、これらの細胞における
ＨＬＡ−Ｇ、−Ｂ３５、−Ｂ２７、−Ｃｗ７分子の発現
はＬＡＫ−Ｔ細胞に対する耐性を誘導しなかった。ＨＬ
Ａ−ＧのシグナルペプチドはＨＬＡ−Ｅ分子に結合する
ことができ、これによりＨＬＡ−Ｅ分子の安定な表面発
現が可能になるので（文献３４）、ＨＬＡ−Ｅ分子の抑
制作用は起こりそうにないように見える。従って、Ｌ７
２１．２２１−Ｇ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ分子およびＨＬＡ
−Ｅ分子を両方とも同時に発現することができる。これ
らの細胞は抑制を引き起こすことができなかったので、
ＨＬＡ−Ｅはこれらの２種類のＬＡＫ−Ｔ細胞集団にお
いて調節的な役割を果たしていなかったように思われ
る。
た他のＬＡＫ−Ｔ細胞（ＬＡＫ−ＣＰ４１およびＬＡＫ
−ＣＰ１７６）について得られた。なぜなら、ＨＬＡ−
Ｃｗ６発現によってＬ７２１．２２１細胞の溶解を５０
％を超えて特異的に抑制することが可能であったからで
ある（図４Ｅ，Ｆ）。対照的に、これらの細胞における
ＨＬＡ−Ｇ、−Ｂ３５、−Ｂ２７、−Ｃｗ７分子の発現
はＬＡＫ−Ｔ細胞に対する耐性を誘導しなかった。ＨＬ
Ａ−ＧのシグナルペプチドはＨＬＡ−Ｅ分子に結合する
ことができ、これによりＨＬＡ−Ｅ分子の安定な表面発
現が可能になるので（文献３４）、ＨＬＡ−Ｅ分子の抑
制作用は起こりそうにないように見える。従って、Ｌ７
２１．２２１−Ｇ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ分子およびＨＬＡ
−Ｅ分子を両方とも同時に発現することができる。これ
らの細胞は抑制を引き起こすことができなかったので、
ＨＬＡ−Ｅはこれらの２種類のＬＡＫ−Ｔ細胞集団にお
いて調節的な役割を果たしていなかったように思われ
る。
【００５４】（ＬＡＫ由来ＣＤ４Ｔ細胞もまたＭＨＣ分
子によって負に調節される）ＣＤ４＋リンパ球の富化
が、混合ＬＡＫ−Ｔ細胞集団からＣＤ８＋細胞を枯渇さ
せることにより行われた。これらのＴ細胞が細胞傷害性
であり、ＩＦＮγで調整された腫瘍細胞への暴露によっ
てその活性がダウンレギュレートできることを直接確認
するために、ＣＤ４が選択されたＴ細胞（図５Ａ左）
を、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含む未分離Ｌ
ＡＫ−２６Ｔ細胞集団（図５Ａ右）と比較した。高度に
精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、未分離ＬＡＫ−Ｔ細胞集
団と同様に、ＲＣＣ−２６、ＮＫＣ−２６、およびＫ５
６２標的細胞を溶解することができた（図５Ｂおよび
Ｃ）。さらに、未分離ＬＡＫ−Ｔ細胞集団と同様に、Ｒ
ＣＣ−２６細胞およびＮＫＣ−２６細胞のＩＦＮγによ
る調整（外因性刺激または内因性発現）は精製ＣＤ４＋
Ｔ細胞の溶解の抑制につながった。
子によって負に調節される）ＣＤ４＋リンパ球の富化
が、混合ＬＡＫ−Ｔ細胞集団からＣＤ８＋細胞を枯渇さ
せることにより行われた。これらのＴ細胞が細胞傷害性
であり、ＩＦＮγで調整された腫瘍細胞への暴露によっ
てその活性がダウンレギュレートできることを直接確認
するために、ＣＤ４が選択されたＴ細胞（図５Ａ左）
を、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含む未分離Ｌ
ＡＫ−２６Ｔ細胞集団（図５Ａ右）と比較した。高度に
精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、未分離ＬＡＫ−Ｔ細胞集
団と同様に、ＲＣＣ−２６、ＮＫＣ−２６、およびＫ５
６２標的細胞を溶解することができた（図５Ｂおよび
Ｃ）。さらに、未分離ＬＡＫ−Ｔ細胞集団と同様に、Ｒ
ＣＣ−２６細胞およびＮＫＣ−２６細胞のＩＦＮγによ
る調整（外因性刺激または内因性発現）は精製ＣＤ４＋
Ｔ細胞の溶解の抑制につながった。
【００５５】（ＬＡＫ−Ｔ細胞は既知の抑制性受容体を
発現していない）クラスＩによる抑制によってＬＡＫ−
Ｔ細胞が調節されたという証明は、ＬＡＫ−Ｔ細胞がＮ
Ｋ細胞によって発現されるような抑制性受容体を有する
可能性があることを示唆した。従って、ＨＬＡ−Ｂ、
Ｃ、またはＥ分子と相互作用するいくつかの既知の抑制
性受容体に特異的なｍａｂを用いて、このような受容体
を同定するための表面表現型解析が行われた。表３にま
とめたように、ＫＩＲ免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属する抑制性受容体（ｐ５８．１、ｐ５８．２、ま
たはＮＫＢ１）はＴ細胞上に存在しなかった。ＣＤ９４
分子を発現したＣＤ３ ＋細胞およびＣＤ３−細胞のパー
セントはわずかであった（３〜７％）。ＮＫ細胞では、
ＨＬＡ−Ｅ特異的へテロ２量体抑制性受容体を生じるた
めに、ＣＤ９４がＮＫＧ２Ａ補助受容体分子と会合する
ことが発見されている。ＨＬＡ−Ｅを発現するＫ５６２
細胞はＬＡＫ−２６Ｔ細胞による細胞傷害性をかなり抑
制したので（図４Ｃを参照のこと）、本発明者らはこの
集団においてこのような受容体を有するＴ細胞を発見す
ることを期待した。しかしながら、ＮＫＧ２Ａ抗体を結
合したＬＡＫ−２６Ｔ細胞は１％未満であった（データ
示さず）。同様に、ＬＡＫ−２６、ＬＡＫ−ＣＰ４１、
およびＬＡＫ−ＣＰ１７６はＨＬＡ−Ｃｗ６分子によっ
て部分的に抑制されたので（図４Ｄ〜Ｆを参照のこ
と）、ｐ５８．１受容体を発現するＴ細胞が期待された
が、これもまたこれらの集団で発見されなかった。従っ
て、明らかに、これらの受容体に特徴的な特異的クラス
ＩリガンドがこれらのＴ細胞に抑制シグナルを送ってい
るが、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＥリガンドによるＮＫ
細胞抑制を支配する既知の抑制性受容体は、測定できる
いかなる程度にもＬＡＫ−Ｔ細胞によって発現していな
かった。
発現していない）クラスＩによる抑制によってＬＡＫ−
Ｔ細胞が調節されたという証明は、ＬＡＫ−Ｔ細胞がＮ
Ｋ細胞によって発現されるような抑制性受容体を有する
可能性があることを示唆した。従って、ＨＬＡ−Ｂ、
Ｃ、またはＥ分子と相互作用するいくつかの既知の抑制
性受容体に特異的なｍａｂを用いて、このような受容体
を同定するための表面表現型解析が行われた。表３にま
とめたように、ＫＩＲ免疫グロブリンスーパーファミリ
ーに属する抑制性受容体（ｐ５８．１、ｐ５８．２、ま
たはＮＫＢ１）はＴ細胞上に存在しなかった。ＣＤ９４
分子を発現したＣＤ３ ＋細胞およびＣＤ３−細胞のパー
セントはわずかであった（３〜７％）。ＮＫ細胞では、
ＨＬＡ−Ｅ特異的へテロ２量体抑制性受容体を生じるた
めに、ＣＤ９４がＮＫＧ２Ａ補助受容体分子と会合する
ことが発見されている。ＨＬＡ−Ｅを発現するＫ５６２
細胞はＬＡＫ−２６Ｔ細胞による細胞傷害性をかなり抑
制したので（図４Ｃを参照のこと）、本発明者らはこの
集団においてこのような受容体を有するＴ細胞を発見す
ることを期待した。しかしながら、ＮＫＧ２Ａ抗体を結
合したＬＡＫ−２６Ｔ細胞は１％未満であった（データ
示さず）。同様に、ＬＡＫ−２６、ＬＡＫ−ＣＰ４１、
およびＬＡＫ−ＣＰ１７６はＨＬＡ−Ｃｗ６分子によっ
て部分的に抑制されたので（図４Ｄ〜Ｆを参照のこ
と）、ｐ５８．１受容体を発現するＴ細胞が期待された
が、これもまたこれらの集団で発見されなかった。従っ
て、明らかに、これらの受容体に特徴的な特異的クラス
ＩリガンドがこれらのＴ細胞に抑制シグナルを送ってい
るが、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＥリガンドによるＮＫ
細胞抑制を支配する既知の抑制性受容体は、測定できる
いかなる程度にもＬＡＫ−Ｔ細胞によって発現していな
かった。
【００５６】実施例：以下の実施例は例示のために示さ
れるのであって、本発明の保護の範囲を制限するものと
みなされるべきでない。 ＬＡＫ細胞の作成：凝固を阻止するためにヘパリン（５
０単位／ｍｌ）（例えば、ヘパリンナトリウム，Ｂｒａ
ｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ社）または脱線維素を用い
て、血液試料を得る。さらに多数のＰＢＭＣを得るため
に、血液１〜４リットル相当を得るようにアフェレーシ
スを行ってもよい（血液調製法は（文献３５）に記載さ
れている）。
れるのであって、本発明の保護の範囲を制限するものと
みなされるべきでない。 ＬＡＫ細胞の作成：凝固を阻止するためにヘパリン（５
０単位／ｍｌ）（例えば、ヘパリンナトリウム，Ｂｒａ
ｕｎ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ社）または脱線維素を用い
て、血液試料を得る。さらに多数のＰＢＭＣを得るため
に、血液１〜４リットル相当を得るようにアフェレーシ
スを行ってもよい（血液調製法は（文献３５）に記載さ
れている）。
【００５７】標準的な方法（文献３５）を用いてフィコ
ール／ハイパーク（例えば、Ｂｉｏｃｏｌｌ Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ
社）密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）を単離する。
ール／ハイパーク（例えば、Ｂｉｏｃｏｌｌ Ｓｅｐａ
ｒａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ
社）密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）を単離する。
【００５８】ＰＢＭＣをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で
２回洗浄し、直接培養するか、または後で用いるために
凍結保存する。凍結保存のために、ＰＢＭＣは、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地，Ｆ
ａ，インビトロゲン社）に２５〜５０％自己由来血清お
よび１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ培地に５〜２０×１
０６細胞／ｍｌの濃度で溶解して１ｍｌずつ凍結し、液
体窒素タンクの気相内で保存する。凍結保存したＰＢＭ
Ｃは、部分的に融解した細胞試料に５０％ヒト血清含有
ＲＰＭＩ培地を滴下することによって融解する。プラス
チック製遠心管に移した後に、培地の体積を増やして３
〜５ｍｌにし、細胞を２回洗浄する（文献３５）。
２回洗浄し、直接培養するか、または後で用いるために
凍結保存する。凍結保存のために、ＰＢＭＣは、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地，Ｆ
ａ，インビトロゲン社）に２５〜５０％自己由来血清お
よび１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ培地に５〜２０×１
０６細胞／ｍｌの濃度で溶解して１ｍｌずつ凍結し、液
体窒素タンクの気相内で保存する。凍結保存したＰＢＭ
Ｃは、部分的に融解した細胞試料に５０％ヒト血清含有
ＲＰＭＩ培地を滴下することによって融解する。プラス
チック製遠心管に移した後に、培地の体積を増やして３
〜５ｍｌにし、細胞を２回洗浄する（文献３５）。
【００５９】２度目の洗浄後に、新鮮に単離したＰＢＭ
Ｃまたは融解したＰＢＭＣを１×１０６細胞／ｍｌの密
度で「ＬＡＫ」培地に再懸濁する。ＬＡＫ培地は、以下
の２種類の方法の１つで調製することができる： ａ）１５％ヒト血清および１０００単位／ｍｌの組換え
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（例えば、Ｐｒｏ
ｌｅｕｋｉｎ，Ｃｅｔｕｓ社，アメリカ合衆国カリフォ
ルニア州エメリーヴィレ）を含むＲＰＭＩ培地 ｂ）１５％ヒト血清および１０００単位／ｍｌのＩＬ−
２および１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のフィトヘマグルチニ
ン（例えばＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，
アメリカ合衆国ミシガン州デトロイト）を含むＲＰＭＩ
培地。
Ｃまたは融解したＰＢＭＣを１×１０６細胞／ｍｌの密
度で「ＬＡＫ」培地に再懸濁する。ＬＡＫ培地は、以下
の２種類の方法の１つで調製することができる： ａ）１５％ヒト血清および１０００単位／ｍｌの組換え
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（例えば、Ｐｒｏ
ｌｅｕｋｉｎ，Ｃｅｔｕｓ社，アメリカ合衆国カリフォ
ルニア州エメリーヴィレ）を含むＲＰＭＩ培地 ｂ）１５％ヒト血清および１０００単位／ｍｌのＩＬ−
２および１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のフィトヘマグルチニ
ン（例えばＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，
アメリカ合衆国ミシガン州デトロイト）を含むＲＰＭＩ
培地。
【００６０】ＰＢＭＣを、４〜１５ｍｌの体積を含む垂
直にした５０ｍｌ培養フラスコ（例えば、Ｆａｌｃｏ
ｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，アメリカ合
衆国カリフォルニア州サンホゼ）に入れて３７℃および
５％ＣＯ２で７２〜９６時間培養する。その後、培養物
を計数し、ＰＨＡを含まないＬＡＫ培地を用いて細胞密
度を１×１０６細胞／ｍｌに再調節する。培養物の体積
が１５ｍｌを超えたら、２つのフラスコに分け、培養を
同じ条件下で続ける。
直にした５０ｍｌ培養フラスコ（例えば、Ｆａｌｃｏ
ｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，アメリカ合
衆国カリフォルニア州サンホゼ）に入れて３７℃および
５％ＣＯ２で７２〜９６時間培養する。その後、培養物
を計数し、ＰＨＡを含まないＬＡＫ培地を用いて細胞密
度を１×１０６細胞／ｍｌに再調節する。培養物の体積
が１５ｍｌを超えたら、２つのフラスコに分け、培養を
同じ条件下で続ける。
【００６１】培養物の体積を２５０ｍｌ培養フラスコ
（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
社，アメリカ合衆国カリフォルニア州サンホゼ）（＞４
５〜１５０ｍｌ／フラスコ）にスケールアップすること
によって、さらに多数の細胞を得ることができる。十分
なＰＢＭＣが入手できたら（例えば、アフェレーシスか
ら得られたら）、多くの細胞数（例えば、１０９細胞）
まで数個の２５０ｍｌフラスコを同時に培養することが
できる。
（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
社，アメリカ合衆国カリフォルニア州サンホゼ）（＞４
５〜１５０ｍｌ／フラスコ）にスケールアップすること
によって、さらに多数の細胞を得ることができる。十分
なＰＢＭＣが入手できたら（例えば、アフェレーシスか
ら得られたら）、多くの細胞数（例えば、１０９細胞）
まで数個の２５０ｍｌフラスコを同時に培養することが
できる。
【００６２】培養期間終了時に、ＮＫ細胞およびＬＡＫ
−Ｔ細胞の組成を決定するために、活性化細胞をリンパ
球亜群について表現型解析することができる。本発明者
らの経験では、２〜３週間の培養後、集団は大部分がＬ
ＡＫ−Ｔ細胞である。細胞傷害能力の機能評価は、標的
細胞としてＤａｕｄｉおよびＫ５６２細胞株を用いた標
準的なクロム遊離アッセイを用いて行うことができる
（文献２７）。
−Ｔ細胞の組成を決定するために、活性化細胞をリンパ
球亜群について表現型解析することができる。本発明者
らの経験では、２〜３週間の培養後、集団は大部分がＬ
ＡＫ−Ｔ細胞である。細胞傷害能力の機能評価は、標的
細胞としてＤａｕｄｉおよびＫ５６２細胞株を用いた標
準的なクロム遊離アッセイを用いて行うことができる
（文献２７）。
【００６３】活性化ＬＡＫ細胞は、後で用いるために前
記と同じ凍結プロトコールを用いて凍結保存してもよ
く、培養段階の完了後に直接適用してもよい。 （腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の作成）腫瘍
特異的ＣＴＬは、新鮮な腫瘍材料または既知の組換え腫
瘍抗原を用いて（それぞれ、腫瘍および組織材料の入手
可能性に応じて）様々なアプローチによって作成するこ
とができる。
記と同じ凍結プロトコールを用いて凍結保存してもよ
く、培養段階の完了後に直接適用してもよい。 （腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の作成）腫瘍
特異的ＣＴＬは、新鮮な腫瘍材料または既知の組換え腫
瘍抗原を用いて（それぞれ、腫瘍および組織材料の入手
可能性に応じて）様々なアプローチによって作成するこ
とができる。
【００６４】インビトロ腫瘍株が入手できるまれな場合
では、ＣＴＬは、放射線照射した腫瘍細胞に対するＰＢ
Ｌの刺激によって作成することができる。簡単に述べる
と、腫瘍細胞を２４ウェルプレートで増殖させ、腫瘍細
胞の放射線照射後に、自己由来ＰＢＬをヒト血清含有培
地（必要に応じてＩＬ−２および／またはＩＬ−４を添
加する）に添加した。７〜１０日後に、Ｔ細胞を収集
し、再度、放射線照射した腫瘍細胞培養物で再刺激し
た。数回の再刺激後に、標準的なクロム遊離、ＥＬＩＳ
ＰＯＴ、またはサイトカイン分泌アッセイを用いて混合
ＣＴＬ集団の活性および特異性を試験した。
では、ＣＴＬは、放射線照射した腫瘍細胞に対するＰＢ
Ｌの刺激によって作成することができる。簡単に述べる
と、腫瘍細胞を２４ウェルプレートで増殖させ、腫瘍細
胞の放射線照射後に、自己由来ＰＢＬをヒト血清含有培
地（必要に応じてＩＬ−２および／またはＩＬ−４を添
加する）に添加した。７〜１０日後に、Ｔ細胞を収集
し、再度、放射線照射した腫瘍細胞培養物で再刺激し
た。数回の再刺激後に、標準的なクロム遊離、ＥＬＩＳ
ＰＯＴ、またはサイトカイン分泌アッセイを用いて混合
ＣＴＬ集団の活性および特異性を試験した。
【００６５】あるいは、腫瘍株が入手できない場合で
は、樹状細胞（ＤＣ）による特異的な腫瘍抗原由来ペプ
チドの提示を促すために、これらのプロフェッショナル
抗原提示細胞（ＡＰＣ）をパルス（ｐｕｌｓｅ）するた
めの腫瘍組織溶解産物をインビトロで用いることができ
る。既知の腫瘍抗原に関して、例えば、悪性黒色腫の場
合、ＤＣをパルスするために、既知の黒色腫抗原から得
られた合成ペプチドまたは組換えタンパク質断片が用い
られる。ＤＣによる腫瘍抗原提示の別の原理は、腫瘍Ｒ
ＮＡの内因性発現によってＤＣを直接パルスするために
用いることができる腫瘍由来ＲＮＡの作成に基づいてい
る。混合ＣＴＬ集団の再刺激ならびに活性化および特異
性の分析のための手順は前記に記載されている（すなわ
ち、標準的なクロム遊離、ＥＬＩＳＰＯＴ、またはサイ
トカイン分泌アッセイ）。
は、樹状細胞（ＤＣ）による特異的な腫瘍抗原由来ペプ
チドの提示を促すために、これらのプロフェッショナル
抗原提示細胞（ＡＰＣ）をパルス（ｐｕｌｓｅ）するた
めの腫瘍組織溶解産物をインビトロで用いることができ
る。既知の腫瘍抗原に関して、例えば、悪性黒色腫の場
合、ＤＣをパルスするために、既知の黒色腫抗原から得
られた合成ペプチドまたは組換えタンパク質断片が用い
られる。ＤＣによる腫瘍抗原提示の別の原理は、腫瘍Ｒ
ＮＡの内因性発現によってＤＣを直接パルスするために
用いることができる腫瘍由来ＲＮＡの作成に基づいてい
る。混合ＣＴＬ集団の再刺激ならびに活性化および特異
性の分析のための手順は前記に記載されている（すなわ
ち、標準的なクロム遊離、ＥＬＩＳＰＯＴ、またはサイ
トカイン分泌アッセイ）。
【００６６】ＣＴＬ作成手順に関係なく、ほとんどのア
プローチは、血中の腫瘍特異的ＣＴＬ前駆体の非常に低
い頻度、腫瘍特異的ＣＴＬの時間のかかる面倒な生成、
および個々の腫瘍材料または一般的な腫瘍抗原の入手可
能性などの似たような制約に対処しなければならない。
プローチは、血中の腫瘍特異的ＣＴＬ前駆体の非常に低
い頻度、腫瘍特異的ＣＴＬの時間のかかる面倒な生成、
および個々の腫瘍材料または一般的な腫瘍抗原の入手可
能性などの似たような制約に対処しなければならない。
【００６７】（エフェクター細胞および標的細胞）腫瘍
腎摘出を受けたＲＣＣ患者または健常ドナーから得られ
たＰＢＭＣが、ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１００Ｕ／ｍｌペニシ
リン／ストレプトマイシン（完全培地）、１５％熱不活
化プールヒト血清、１％フィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ，Ｄｉｆｃｏ−Ｌａｂｏｒａｏｔｒｉｅｓ社，ミシガ
ン州デトロイト）、および１０００Ｕ／ｍｌ ｒＩＬ−
２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｅｔｕｓ社、カリフォルニ
ア州エメリーヴィレ）を添加）での培養によるＬＡＫ細
胞の作成に用いられた。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣ
Ｄ８＋Ｔ細胞の増殖集団を得るために、これらの培養物
を数週間にわたって維持した。ＬＡＫ由来ＣＤ４＋Ｔ細
胞は、製造業者の説明書に従って磁気ビーズ分離（Ｄｙ
ｎａｌ，ノルウェー国オスロ）でＣＤ８＋Ｔ細胞および
ＮＫ細胞を枯渇させることによって富化した。ヒトＮＫ
細胞は前記のように活性化し、精製ＮＫ細胞を、ＣＤ４
およびＣＤ３でコーティングされた免疫磁気ビーズ（Ｄ
ｙｎａｌ）を用いてＴ細胞を枯渇させることにより得
た。これらの研究に用いられる富化ＮＫ細胞株（Ｂ．３
ＮＫ細胞と呼ぶ）を完全培地（ｒＩＬ−２（３００Ｕ／
ｍｌ）添加）において維持した。Ｌ７２１細胞株から得
られたエプスタインバーウイルス形質転換リンパ芽球様
細胞株（ＬＣＬ）を用いて、これらのエフェクター細胞
の細胞傷害性を評価した。Ｌ７２１．１１２細胞株は、
Ａ１、Ｃｗ７、Ｂ８ハプロタイプを発現するＬ７２１の
ヘミ接合変種である（親切にもＴ．Ｓｐｉｅｓ，Ｆｒｅ
ｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅから提供され
た）。Ｌ７２１．２２１細胞株はＭＨＣクラスＩ分子を
全く発現しない（３６）。この株は、記載されているよ
うに、クラスＩ対立遺伝子Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３７０
２、Ｃｗ＊０６０２、およびＣｗ＊０７０２を発現する
ようにトランスフェクトされた。Ｋ５６２のＨＬＡ−Ｅ
トランスフェクタントは、ＨＬＡ−Ａ２のエキソン１お
よびＨＬＡ−Ｅのエキソン２〜７をコードするｐｃＤＮ
Ａ３ベクターにクローニングされたハイブリッドＤＮＡ
をトランスフェクトすることにより作成された。この構
築物は、ＨＬＡ−Ａ２由来ペプチドによるＨＬＡ−Ｅ重
鎖の安定化によってＨＬＡ−Ｅの表面発現を可能にす
る。β２ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする遺伝
子でトランスフェクトされたＤａｕｄｉ細胞（文献２
８）は、親切にもＰ．Ｐａｒｈａｍ（スタンフォード大
学，カリフォルニア州パロアルト）から提供された。
腎摘出を受けたＲＣＣ患者または健常ドナーから得られ
たＰＢＭＣが、ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１００Ｕ／ｍｌペニシ
リン／ストレプトマイシン（完全培地）、１５％熱不活
化プールヒト血清、１％フィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ，Ｄｉｆｃｏ−Ｌａｂｏｒａｏｔｒｉｅｓ社，ミシガ
ン州デトロイト）、および１０００Ｕ／ｍｌ ｒＩＬ−
２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｅｔｕｓ社、カリフォルニ
ア州エメリーヴィレ）を添加）での培養によるＬＡＫ細
胞の作成に用いられた。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣ
Ｄ８＋Ｔ細胞の増殖集団を得るために、これらの培養物
を数週間にわたって維持した。ＬＡＫ由来ＣＤ４＋Ｔ細
胞は、製造業者の説明書に従って磁気ビーズ分離（Ｄｙ
ｎａｌ，ノルウェー国オスロ）でＣＤ８＋Ｔ細胞および
ＮＫ細胞を枯渇させることによって富化した。ヒトＮＫ
細胞は前記のように活性化し、精製ＮＫ細胞を、ＣＤ４
およびＣＤ３でコーティングされた免疫磁気ビーズ（Ｄ
ｙｎａｌ）を用いてＴ細胞を枯渇させることにより得
た。これらの研究に用いられる富化ＮＫ細胞株（Ｂ．３
ＮＫ細胞と呼ぶ）を完全培地（ｒＩＬ−２（３００Ｕ／
ｍｌ）添加）において維持した。Ｌ７２１細胞株から得
られたエプスタインバーウイルス形質転換リンパ芽球様
細胞株（ＬＣＬ）を用いて、これらのエフェクター細胞
の細胞傷害性を評価した。Ｌ７２１．１１２細胞株は、
Ａ１、Ｃｗ７、Ｂ８ハプロタイプを発現するＬ７２１の
ヘミ接合変種である（親切にもＴ．Ｓｐｉｅｓ，Ｆｒｅ
ｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅから提供され
た）。Ｌ７２１．２２１細胞株はＭＨＣクラスＩ分子を
全く発現しない（３６）。この株は、記載されているよ
うに、クラスＩ対立遺伝子Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３７０
２、Ｃｗ＊０６０２、およびＣｗ＊０７０２を発現する
ようにトランスフェクトされた。Ｋ５６２のＨＬＡ−Ｅ
トランスフェクタントは、ＨＬＡ−Ａ２のエキソン１お
よびＨＬＡ−Ｅのエキソン２〜７をコードするｐｃＤＮ
Ａ３ベクターにクローニングされたハイブリッドＤＮＡ
をトランスフェクトすることにより作成された。この構
築物は、ＨＬＡ−Ａ２由来ペプチドによるＨＬＡ−Ｅ重
鎖の安定化によってＨＬＡ−Ｅの表面発現を可能にす
る。β２ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする遺伝
子でトランスフェクトされたＤａｕｄｉ細胞（文献２
８）は、親切にもＰ．Ｐａｒｈａｍ（スタンフォード大
学，カリフォルニア州パロアルト）から提供された。
【００６８】ＲＣＣ−２６腫瘍株は患者２６（ＨＬＡ対
立遺伝子：Ａ＊０２０１、Ａ＊３３０３、Ｂ＊４１０
１、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊１５０２、Ｃｗ＊１７０１）
の初期段階Ｉ（Ｔ１、Ｇ２、Ｎ０、Ｍ０）腫瘍から樹立
され、正常腎臓株ＮＫＣ−２６は腫瘍腎摘出時に得られ
た正常腎臓実質から樹立された（文献３２）。両方の細
胞株を１０％ＦＣＳ含有完全培地（抗生物質なし）にお
いて培養した。以前に述べられたように（文献３７）レ
トロウイルス系を用いて、ＲＣＣ−２６にヒトＩＦＮγ
ｃＤＮＡを形質導入した。独立したレトロウイルス形
質導入によって２種類のＩＦＮγ発現株（ｅｎｄｏγ１
およびｅｎｄｏγ２と呼ぶ）が作成された（文献３
１）。ＩＦＮγ ｃＤＮＡを含まない同じベクターを用
いて対照株（ＲＣＣ−２６ＶＣ）が作成された（文献３
１）。腫瘍細胞の外因性ＩＦＮγ刺激は１０００Ｕ／ｍ
ｌの組換えＩＦＮγ（Ｒｏｃｈｅ社，スイス国バーゼ
ル）を含む培地において９６時間行われた。
立遺伝子：Ａ＊０２０１、Ａ＊３３０３、Ｂ＊４１０
１、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊１５０２、Ｃｗ＊１７０１）
の初期段階Ｉ（Ｔ１、Ｇ２、Ｎ０、Ｍ０）腫瘍から樹立
され、正常腎臓株ＮＫＣ−２６は腫瘍腎摘出時に得られ
た正常腎臓実質から樹立された（文献３２）。両方の細
胞株を１０％ＦＣＳ含有完全培地（抗生物質なし）にお
いて培養した。以前に述べられたように（文献３７）レ
トロウイルス系を用いて、ＲＣＣ−２６にヒトＩＦＮγ
ｃＤＮＡを形質導入した。独立したレトロウイルス形
質導入によって２種類のＩＦＮγ発現株（ｅｎｄｏγ１
およびｅｎｄｏγ２と呼ぶ）が作成された（文献３
１）。ＩＦＮγ ｃＤＮＡを含まない同じベクターを用
いて対照株（ＲＣＣ−２６ＶＣ）が作成された（文献３
１）。腫瘍細胞の外因性ＩＦＮγ刺激は１０００Ｕ／ｍ
ｌの組換えＩＦＮγ（Ｒｏｃｈｅ社，スイス国バーゼ
ル）を含む培地において９６時間行われた。
【００６９】（細胞媒介性細胞傷害アッセイ）細胞媒介
性溶解を、標準的な４時間クロム５１遊離アッセイ（文
献２７）において定量した。自発的遊離は、標的細胞だ
けをインキュベートすることによって測定し、総遊離
は、標識細胞を直接計数することによって測定した。以
下のように、％細胞傷害性を計算した：％比溶解（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）＝（実験で得られたｃｐｍ
−自発的ｃｐｍ／総ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）×１００。
エフェクター細胞の３段階滴定の２回の測定値が全ての
実験に用いられた。独立した実験からのデータを比較す
るために、５０％の基準値として各実験におけるトラン
スフェクトされていないＬ７２１．２２１またはＫ５６
２細胞の比溶解を用いて、％相対的細胞傷害応答（ｒｅ
ｌａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓ
ｅ、％ＲＣＲ）を計算した。この基準値と比較して他の
標的細胞の％溶解を求め、％ＲＣＲとして表した（文献
２７）。
性溶解を、標準的な４時間クロム５１遊離アッセイ（文
献２７）において定量した。自発的遊離は、標的細胞だ
けをインキュベートすることによって測定し、総遊離
は、標識細胞を直接計数することによって測定した。以
下のように、％細胞傷害性を計算した：％比溶解（ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）＝（実験で得られたｃｐｍ
−自発的ｃｐｍ／総ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）×１００。
エフェクター細胞の３段階滴定の２回の測定値が全ての
実験に用いられた。独立した実験からのデータを比較す
るために、５０％の基準値として各実験におけるトラン
スフェクトされていないＬ７２１．２２１またはＫ５６
２細胞の比溶解を用いて、％相対的細胞傷害応答（ｒｅ
ｌａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓ
ｅ、％ＲＣＲ）を計算した。この基準値と比較して他の
標的細胞の％溶解を求め、％ＲＣＲとして表した（文献
２７）。
【００７０】ＭＨＣクラスＩ分子の影響を評価するため
に、エフェクター細胞の添加の３０分前に、クラスＩ特
異的ｍａｂであるＷ６／３２を標的細胞に添加した。ｍ
ａｂＷ６／３２を１：１００希釈腹水として使用し、Ｕ
ＰＣ１０（ＩｇＧ２ａ）（Ｓｉｇｍａ社，ドイツダイゼ
ンホーフェン）をイソタイプ対照として使用した。
に、エフェクター細胞の添加の３０分前に、クラスＩ特
異的ｍａｂであるＷ６／３２を標的細胞に添加した。ｍ
ａｂＷ６／３２を１：１００希釈腹水として使用し、Ｕ
ＰＣ１０（ＩｇＧ２ａ）（Ｓｉｇｍａ社，ドイツダイゼ
ンホーフェン）をイソタイプ対照として使用した。
【００７１】（エフェクター細胞および標的細胞の免疫
表現型解析）エフェクター細胞を、以下のリンパ球特異
的ｍａｂのパネルを用いて特徴付けた：ＦＩＴＣまたは
ＰＥで標識されたＣＤ３特異的ｍａｂ（ＵＣＨＴ１）、
ＣＤ４特異的ｍａｂ（１３Ｂ８．２）、ＣＤ８特異的ｍ
ａｂ（Ｂ９．１１）、ＣＤ５６特異的ｍａｂ（ＮＫＨ−
１）（Ｂａｃｋｍａｎｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ社，メイン州
ウェストブルックから購入）。抑制性受容体発現は，Ｆ
ＩＴＣまたはＰＥで標識されたｐ５８．１特異的ｍａｂ
（ＫＩＲ２ＤＬ１，ＥＢ６）、ｐ５８．２特異的ｍａｂ
（ＫＩＲ２ＤＬ３，ＧＬ１８３）、ＣＤ９４特異的ｍａ
ｂ（ＨＰ−３Ｂ１）（全てＢａｃｋｍａｎｎ／Ｃｏｕｌ
ｔｅｒから購入）、およびＮＫＢ１特異的ｍａｂ（ＫＩ
Ｒ３ＤＬ１，ＤＸ９）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社，カリ
フォルニア州サンディエゴから購入）を用いて分析し
た。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄
し、ＰＢＳ−１％パラホルムアルデヒドで固定し、フロ
ーサイトメトリー（ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃ
ｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，カリフォルニア州サン
ホゼ）を用いて分析した。
表現型解析）エフェクター細胞を、以下のリンパ球特異
的ｍａｂのパネルを用いて特徴付けた：ＦＩＴＣまたは
ＰＥで標識されたＣＤ３特異的ｍａｂ（ＵＣＨＴ１）、
ＣＤ４特異的ｍａｂ（１３Ｂ８．２）、ＣＤ８特異的ｍ
ａｂ（Ｂ９．１１）、ＣＤ５６特異的ｍａｂ（ＮＫＨ−
１）（Ｂａｃｋｍａｎｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ社，メイン州
ウェストブルックから購入）。抑制性受容体発現は，Ｆ
ＩＴＣまたはＰＥで標識されたｐ５８．１特異的ｍａｂ
（ＫＩＲ２ＤＬ１，ＥＢ６）、ｐ５８．２特異的ｍａｂ
（ＫＩＲ２ＤＬ３，ＧＬ１８３）、ＣＤ９４特異的ｍａ
ｂ（ＨＰ−３Ｂ１）（全てＢａｃｋｍａｎｎ／Ｃｏｕｌ
ｔｅｒから購入）、およびＮＫＢ１特異的ｍａｂ（ＫＩ
Ｒ３ＤＬ１，ＤＸ９）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社，カリ
フォルニア州サンディエゴから購入）を用いて分析し
た。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄
し、ＰＢＳ−１％パラホルムアルデヒドで固定し、フロ
ーサイトメトリー（ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃ
ｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，カリフォルニア州サン
ホゼ）を用いて分析した。
【００７２】腫瘍細胞のＭＨＣ分子表面発現を、Ｗ６／
３２ハイブリドーマ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州
ロックヴィル）の培養上清を用いたフローサイトメトリ
ーによって試験した。ＨＬＡ−Ｃ特異的ｍａｂであるＬ
３１は、親切にもＰ．Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ，イタリア国
ミラノ（文献３３）から提供された。ｍａｂ ＵＰＣ１
０およびＭＯＰＣ２１（Ｓｉｇｍａ社）を負の対照とし
て使用した。細胞をｍａｂと氷上で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗マウス免
疫グロブリン（Ｆ（ａｂ）２，１１５−１１６−１４
６；Ｄｉａｎｏｖａ社，ドイツ国ハンブルク）と３０分
間インキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分
析した。
３２ハイブリドーマ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州
ロックヴィル）の培養上清を用いたフローサイトメトリ
ーによって試験した。ＨＬＡ−Ｃ特異的ｍａｂであるＬ
３１は、親切にもＰ．Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ，イタリア国
ミラノ（文献３３）から提供された。ｍａｂ ＵＰＣ１
０およびＭＯＰＣ２１（Ｓｉｇｍａ社）を負の対照とし
て使用した。細胞をｍａｂと氷上で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗マウス免
疫グロブリン（Ｆ（ａｂ）２，１１５−１１６−１４
６；Ｄｉａｎｏｖａ社，ドイツ国ハンブルク）と３０分
間インキュベートし、フローサイトメトリーを用いて分
析した。
【００７３】参考文献のリスト
(1) Long EO. Regulation of immune responses throug
h inhibitory receptors. Annu Rev Immunol 1999; 17:
875-904. (2) Colonna M, Moretta A, Vely F, Vivier E. A high
-resolution view of NK-cell receptors: structure a
nd function. Immunol Today 2000; 21(9):428-431. (3) Ravetch JV, Lanier LL. Immune inhibitory recep
tors. Science 2000; 290(5489):84-89. (4) Lopez-Botet M, Bellon T, Llano M, Navarro F, G
arcia P, de Miguel M.Paired inhibitory and trigger
ing NK cell receptors for HLA class I molecules. H
um Immunol 2000; 61(1):7-17. (5) Braud VM, Allan DS, O'Callaghan CA, Soderstrom
K, D'Andrea A, Ogg GSet al. HLA-E binds to natura
l killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C[see co
mments]. Nature 1998; 391(6669):795-799. (6) Bukowski RM. Natural history and therapy of me
tastatic renal cell carcinoma: the role of interle
ukin-2. Cancer 1997; 80(7):1198-1220. (7) Jayson GC, Middleton M, Lee SM, Ashcroft L, Th
atcher N. A randomizedphase II trial of interleuki
n 2 and interleukin 2-interferon alpha in advanced
renal cancer. Br J Cancer 1998; 78(3):366-369. (8) Jonasch E, Haluska FG. Interferon in Oncologic
al Practice: Review ofInterferon Biology, Clinical
Applications, and Toxicities. Oncologist 2001; 6
(1):34-55. (9) Negrier S, Escudier B, Lasset C, Douillard JY,
Savary J, Chevreau Cet al. Recombinant human inte
rleukin-2, recombinant human interferon alfa-2a, o
r both in metastatic renal-cell carcinoma. Groupe
Francais d'Immunotherapie. N Engl J Med 1998; 338
(18):1272-1278. (10) Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, C
hang AE, EttinghausenSE et al. Observations on the
systemic administration of autologous lymphokine-
activated killer cells and recombinant interleukin
-2 to patientswith metastatic cancer. N Engl J Med
1985; 313(23):1485-1492. (11) Rosenberg SA. Adoptive immunotherapy of cance
r using lymphokine activated killer cells and reco
mbinant interleukin-2. Important Adv Oncol 1986;55
-91. (12) Rosenberg S. Lymphokine-activated killer cell
s: a new approach to immunotherapy of cancer. J Na
tl Cancer Inst 1985; 75(4):595-603. (13) Hoffman DM, Gitlitz BJ, Belldegrun A, Figlin
RA. Adoptive cellulartherapy. Semin Oncol 2000; 27
(2):221-233. (14) Rosenberg SA. Interleukin-2 and the developme
nt of immunotherapy for the treatment of patients
with cancer. Cancer J Sci Am 2000; 6 Suppl 1:S2-S
7. (15) Kruit WH, Schmitz PI, Stoter G. The role of p
ossible risk factors for acute and late renal dysf
unction after high-dose interleukin-2, interferon
alpha and lymphokine-activated killer cells. Cance
r Immunol Immunother 1999; 48(6):331-335. (16) Tomita Y, Katagiri A, Saito K, Imai T, Saito
T, Tanikawa T et al. Adoptive immunotherapy of pat
ients with metastatic renal cell cancer using lymp
hokine-activated killer cells, interleukin-2 and c
yclophosphamide:long-term results. Int J Urol 199
8; 5(1):16-21. (17) Kruit WH, Goey SH, Lamers CH, Gratama JW, Vis
ser B, Schmitz PI et al. High-dose regimen of inte
rleukin-2 and interferon-alpha in combination with
lymphokine-activated killer cells in patients wit
h metastatic renal cell cancer. J Immunother 1997;
20(4):312-320. (18) Law TM, Motzer RJ, Mazumdar M, Sell KW, Walth
er PJ, O'Connell M etal. Phase III randomized tria
l of interleukin-2 with or without lymphokine-acti
vated killer cells in the treatment of patients wi
th advanced renal cell carcinoma. Cancer 1995; 76
(5):824-832. (19) Rosenberg SA, Lotze MT, Yang JC, Topalian SL,
Chang AE, Schwartzentruber DJ et al. Prospective
randomized trial of high-dose interleukin-2alone o
r in conjunction with lymphokine-activated killer
cells for the treatment of patients with advanced
cancer. J Natl Cancer Inst 1993; 85(8):622-632. (20) Parmiani G. An explanation of the variable cl
inical response to interleukin 2 and LAK cells. Im
munol Today 1990; 11(4):113-115. (21) Cabrera T, Angustias FM, Sierra A, Garrido A,
Herruzo A, Escobedo Aet al. High frequency of alt
ered HLA class I phenotypes in invasive breast car
cinomas. Hum Immunol 1996; 50(2):127-134. (22) Cabrera T, Salinero J, Fernandez MA, Garrido
A, Esquivias J, Garrido F. High frequency of alter
ed HLA class I phenotypes in laryngeal carcinomas.
Hum Immunol 2000; 61(5):499-506. (23) Tongio MM. 12th International Histocompatibil
ity Workshop HLA classI monoclonal antibodies stud
y. In: Charron D, editor. HLA: Genetic diversity o
f HLA. Functional and medical Implication. Charro
n,D., 1997: 7-12. (24) Bignon JD. HLA DNA class II typing by PCR-SSO
P: 12th InternationalHistocompatibility Workshop e
xperience. In: Charron D, editor. HLA: Genetic div
ersity of HLA. Functional and medical Implication.
EDK Medical and Scientific International Publishe
r, 1997: 21-25. (25) Norgaard L. A mRNA based SBT protocol for typ
ing of HLA-A locus alleles. In: Charron D, editor.
HLA: Genetic diversity of HLA. Functional and med
ical Implication. EDK Medical and Scientific Inter
national Publisher, 1997: 254-256. (26) Lardy NM. One dimensional iso-electric focusi
ng (1D-IEF) of HLA class I variants: 12th Internat
ional Histocompatibility Workshop experience. In:
Charron D, editor. HLA: Genetic diversity of HLA.
Functional and medical Implication. EDK Medical an
d Scientific International Publisher,1997: 18-20. (27) Schendel DJ, Wank R, Dupont B. Standardizatio
n of the human インビトロ cell-mediated lympholysi
s technique. Ti ssue Antigens 1979; 13(2):112-120. (28) Browning MJ, Madrigal JA, Krausa P, Kowalski
H, Allsopp CE, LittleAM et al. The HLA-A,B,C genot
ype of the class I negative cell line Daudireveals
novel HLA-A and -B alleles. Tissue Antigens 1995;
45(3):177-187. (29) Taniguchi K, Petersson M, Hoglund P, Kiesslin
g R, Klein G, Karre K.Interferon gamma induces lun
g colonization by intravenously inoculatedB16 mela
noma cells in parallel with enhanced expression of
class I majorhistocompatibility complex antigens.
Pr oc Natl Acad Sci U S A 1987; 84(10):3405-3409. (30) Jabrane-Ferrat N, Calvo F, Faille A, Lagabrie
lle JF, Boisson N, Quillet A et al. Recombinant ga
mma interferon provokes resistance of humanbreast
cancer cells to spontaneous and IL-2 activated non
-MHC restrictedcytotoxicity. Br J Cancer 1990; 61
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an interferon gamma complementary DNA intoa renal
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ecific lysis of human renal cell carcinomasby tumo
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ecognition ofautologous and allogeneic tumor line
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ns free of beta2-microglobulin: distributionin nor
mal tissues and neoplastic lesions of non-lymphoid
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nt HLA-E ligand diversity for the regulationof NK
cells [In Process Citation]. Hum Immunol 2000; 61
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rleukin-2, recombinant human interferon alfa-2a, o
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mbinant interleukin-2. Important Adv Oncol 1986;55
-91. (12) Rosenberg S. Lymphokine-activated killer cell
s: a new approach to immunotherapy of cancer. J Na
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ossible risk factors for acute and late renal dysf
unction after high-dose interleukin-2, interferon
alpha and lymphokine-activated killer cells. Cance
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hokine-activated killer cells, interleukin-2 and c
yclophosphamide:long-term results. Int J Urol 199
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h metastatic renal cell cancer. J Immunother 1997;
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(5):824-832. (19) Rosenberg SA, Lotze MT, Yang JC, Topalian SL,
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ional Histocompatibility Workshop experience. In:
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novel HLA-A and -B alleles. Tissue Antigens 1995;
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g R, Klein G, Karre K.Interferon gamma induces lun
g colonization by intravenously inoculatedB16 mela
noma cells in parallel with enhanced expression of
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【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】
【図１】 ＭＨＣクラスＩ陰性標的細胞および悪性標的
細胞に対するＲＣＣ患者および健常ドナーから得られた
ＬＡＫ細胞の細胞傷害活性。
細胞に対するＲＣＣ患者および健常ドナーから得られた
ＬＡＫ細胞の細胞傷害活性。
【図２】 ＲＣＣ−２６細胞の内因性または外因性ＩＦ
Ｎγ調整による溶解の抑制。
Ｎγ調整による溶解の抑制。
【図３】 ＬＡＫ活性およびＢ．３ＮＫ活性は腫瘍特異
的でなく、抑制はＨＬＡクラスＩ ｍａｂでブロックす
ることにより逆転することができる。
的でなく、抑制はＨＬＡクラスＩ ｍａｂでブロックす
ることにより逆転することができる。
【図４】 クラスＩ陰性細胞にトランスフェクトされた
ＨＬＡクラスＩａ分子およびＩｂ分子によるＬＡＫ細胞
傷害性の抑制。
ＨＬＡクラスＩａ分子およびＩｂ分子によるＬＡＫ細胞
傷害性の抑制。
【図５】 ＣＤ４＋ＬＡＫ−Ｔ細胞の細胞傷害性の負の
調節。
調節。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
(72)発明者 ドロレス シェンデル
ドイツ連邦共和国 Ｄ−80469 ミュンヘ
ン ハンス ザクス シュトラーセ 12
／フィーア
(72)発明者 クリスティーヌ ファルク
ドイツ連邦共和国 Ｄ−80801 ミュンヘ
ン カイザーシュトラーセ 34
(72)発明者 エルフリーデ ネスナー
ドイツ連邦共和国 Ｄ−81545 ミュンヘ
ン ハルトハウザーシュトラーセ 119
(72)発明者 エリザベート ヴァイス
ドイツ連邦共和国 Ｄ−81925 ミュンヘ
ン クナッパーツブッシュシュトラーセ
５
Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB19 BB34 CA44
4C084 AA19 MA02 NA14 ZB262
ZC022
4C085 AA03 BB01 CC08 DD23 EE01
4C087 AA01 AA02 BB63 CA04 MA02
NA14 ZB26 ZC02
Claims (19)
- 【請求項１】 ａ）ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／また
はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、 ｂ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞、または ｃ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の免疫応答を誘導する治療物質
と組み合わせて含む、治療組成物。 - 【請求項２】 ａ）における細胞がリンホカイン活性化
キラー（ＬＡＫ）細胞からなる、請求項１に記載の治療
組成物。 - 【請求項３】 ａ）における細胞がＬＡＫ−Ｔ細胞から
なる、請求項１に記載の治療組成物。 - 【請求項４】 ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導する治
療物質が、遺伝子操作された腫瘍細胞である、請求項１
〜３のいずれかに記載の治療組成物。 - 【請求項５】 ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導する治
療物質が、腫瘍細胞または樹状細胞を含むワクチンであ
る、請求項１〜３のいずれかに記載の治療組成物。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の組
成物と、医薬として許容し得る担体とを含む、医薬組成
物。 - 【請求項７】 医薬品における請求項１〜６のいずれか
一項に記載の組成物の使用。 - 【請求項８】 ＭＨＣクラスＩａ分子またはＩｂ分子の
低いか、存在しないか、または異常な発現を示す腫瘍の
治療における請求項１〜６に記載の組成物のいずれか１
つの使用。 - 【請求項９】 前記腫瘍が、ＨＬＡ−Ｃ分子および／ま
たはＨＬＡ−Ｅ分子の低いか、存在しないか、または異
常な発現を示す、請求項８に記載の使用。 - 【請求項１０】 ＭＨＣクラスＩａ分子またはＩｂ分子
の低いか、存在しないか、または異常な発現を示す腫瘍
を治療するための方法における、 ａ）活性化ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／またはナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞と、 ｂ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞、または ｃ）ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導する治療物質との
組み合わせの使用。 - 【請求項１１】 前記腫瘍が、ＨＬＡ−Ｃ分子および／
またはＨＬＡ−Ｅ分子の低いか、存在しないか、または
異常な発現を示す、請求項１０に記載の使用。 - 【請求項１２】 腫瘍を治療するための方法が、ＭＨＣ
拘束性Ｔ細胞またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導す
る治療物質を適用する前に、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞およ
び／またはＮＫ細胞を適用するステップを含む、請求項
１０または１１に記載の使用。 - 【請求項１３】 腫瘍を治療するための方法が、ＭＨＣ
拘束性Ｔ細胞またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導す
る治療物質を適用すると同時に、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞
および／またはＮＫ細胞を適用するステップを含む、請
求項１０または１１に記載の使用。 - 【請求項１４】 腫瘍を治療するための方法が、ＭＨＣ
拘束性Ｔ細胞またはＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の応答を誘導す
る治療物質を適用した後に、ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞およ
び／またはＮＫ細胞を適用するステップを含む、請求項
１０または１１に記載の使用。 - 【請求項１５】 腫瘍を治療するための方法が、腫瘍に
おけるＭＨＣクラスＩ発現を最初に測定するステップを
さらに含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の
使用。 - 【請求項１６】 ＭＨＣ非拘束性Ｔ細胞および／または
ＮＫ細胞がＬＡＫ細胞からなる、請求項１０〜１５のい
ずれか一項に記載の使用。 - 【請求項１７】 哺乳動物を治療するための方法におけ
る請求項７〜１６のいずれか１つに記載の使用。 - 【請求項１８】 ヒトを治療するための方法における請
求項１７に記載の使用。 - 【請求項１９】 前記腫瘍が、結腸癌、乳癌、前立腺
癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、または黒色腫から選択され
る、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の使用。
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