JP2003199582A - 植物由来のプロモーター - Google Patents
植物由来のプロモーターInfo
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- JP2003199582A JP2003199582A JP2002063742A JP2002063742A JP2003199582A JP 2003199582 A JP2003199582 A JP 2003199582A JP 2002063742 A JP2002063742 A JP 2002063742A JP 2002063742 A JP2002063742 A JP 2002063742A JP 2003199582 A JP2003199582 A JP 2003199582A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 クロダネカボチャポリアミン合成酵素群のＳ
−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモータ
ー、スペルミジン合成酵素遺伝子およびアルギニン脱炭
酸酵素遺伝子のプロモーターがキメラ遺伝子の発現を制
御可能であることを明らかにすること。 【解決手段】 クロダネカボチャのゲノムDNAを、クロ
ダネカボチャのＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺
伝子、クロダネカボチャのスペルミジン合成酵素遺伝
子、クロダネカボチャのアルギニン脱炭酸酵素遺伝子の
DNA配列情報を用いてインバースPCR法によりＳ−アデノ
シルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子5'上流配列、スペルミ
ジン合成酵素伝子5'上流配列を取得し、これをサブクロ
ーニングし、サイクルシーケンス法によって塩基配列を
決定する。遺伝子組換え植物を用いてＧＵＳ活性を検定
し、プロモーターの活性を調べる。
−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモータ
ー、スペルミジン合成酵素遺伝子およびアルギニン脱炭
酸酵素遺伝子のプロモーターがキメラ遺伝子の発現を制
御可能であることを明らかにすること。 【解決手段】 クロダネカボチャのゲノムDNAを、クロ
ダネカボチャのＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺
伝子、クロダネカボチャのスペルミジン合成酵素遺伝
子、クロダネカボチャのアルギニン脱炭酸酵素遺伝子の
DNA配列情報を用いてインバースPCR法によりＳ−アデノ
シルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子5'上流配列、スペルミ
ジン合成酵素伝子5'上流配列を取得し、これをサブクロ
ーニングし、サイクルシーケンス法によって塩基配列を
決定する。遺伝子組換え植物を用いてＧＵＳ活性を検定
し、プロモーターの活性を調べる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、クロダネカボチャ
のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモ
ーター、スペルミジン合成酵素遺伝子のプロモーターお
よびアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターに関す
るものであり、該プロモーターは遺伝子組み換えを利用
した植物の新品種の開発や有用物質を生産させる植物の
改変に利用される。
のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモ
ーター、スペルミジン合成酵素遺伝子のプロモーターお
よびアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターに関す
るものであり、該プロモーターは遺伝子組み換えを利用
した植物の新品種の開発や有用物質を生産させる植物の
改変に利用される。
【０００２】
【従来の技術】植物遺伝子工学は、多大な時間とコスト
を要する交配によらず、所望の特性を持った植物を作出
することができる極めて有用な技術である。よって、植
物細胞への遺伝子導入法の開発によって、様々な形質転
換植物の作出が可能になってきた。現在このような遺伝
子工学を用いて様々な形質転換植物の開発が盛んに行わ
れており、欧米を始め、日本国内でも実用化されてい
る。
を要する交配によらず、所望の特性を持った植物を作出
することができる極めて有用な技術である。よって、植
物細胞への遺伝子導入法の開発によって、様々な形質転
換植物の作出が可能になってきた。現在このような遺伝
子工学を用いて様々な形質転換植物の開発が盛んに行わ
れており、欧米を始め、日本国内でも実用化されてい
る。
【０００３】植物の遺伝子工学を利用した品種改良は、
主に農作物の分野であり、アンチセンス技術を利用した
日持ちのよいトマトや除草剤耐性のダイズやナタネ、耐
虫性のバレイショやトウモロコシがあり、このような主
要な食物に対する遺伝子組み換え技術の適用は、食糧問
題を解決する上で計り知れない役割を果たしている。さ
らに、近年は、農作物以外の植物に遺伝子工学的手法を
用いて、物質生産や、環境修復を植物に行わせることも
積極的に試みられている。それらは、今後、エネルギー
問題や環境問題へ大きく寄与することが予想されてい
る。
主に農作物の分野であり、アンチセンス技術を利用した
日持ちのよいトマトや除草剤耐性のダイズやナタネ、耐
虫性のバレイショやトウモロコシがあり、このような主
要な食物に対する遺伝子組み換え技術の適用は、食糧問
題を解決する上で計り知れない役割を果たしている。さ
らに、近年は、農作物以外の植物に遺伝子工学的手法を
用いて、物質生産や、環境修復を植物に行わせることも
積極的に試みられている。それらは、今後、エネルギー
問題や環境問題へ大きく寄与することが予想されてい
る。
【０００４】形質転換体植物を作成する上での重要な問
題は、植物細胞内へ導入した遺伝子を効率よく発現させ
ることがあげられる。プロモーター配列は植物細胞内で
の遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一
般に転写活性の強いプロモーター配列を用いることによ
り、目的遺伝子の発現レベルを向上させることが可能で
ある。しかし、プロモーター配列には、植物種や、器
官、組織や細胞または環境条件ごとに存在するRNAポリ
メラーゼの違いに基づく特異性が存在することが知られ
ており、従って、植物細胞での遺伝子発現を行おうとす
る場合には、目的の条件で機能するプロモーター配列を
用いる必要がある。現在、実用レベルで利用可能なプロ
モーターは限られており、一般的には、カリフラワーモ
ザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターがよく用いら
れている。
題は、植物細胞内へ導入した遺伝子を効率よく発現させ
ることがあげられる。プロモーター配列は植物細胞内で
の遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一
般に転写活性の強いプロモーター配列を用いることによ
り、目的遺伝子の発現レベルを向上させることが可能で
ある。しかし、プロモーター配列には、植物種や、器
官、組織や細胞または環境条件ごとに存在するRNAポリ
メラーゼの違いに基づく特異性が存在することが知られ
ており、従って、植物細胞での遺伝子発現を行おうとす
る場合には、目的の条件で機能するプロモーター配列を
用いる必要がある。現在、実用レベルで利用可能なプロ
モーターは限られており、一般的には、カリフラワーモ
ザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターがよく用いら
れている。
【０００５】ところで、クロダネカボチャは、低温、高
塩濃度、乾燥などのストレスを受けるとその体内にポリ
アミン合成酵素群の遺伝子を発現し、ポリアミンを蓄積
することが知られている。ポリアミンとは第１級アミノ
基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍
的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミン
が見出されている。代表的なポリアミンとしてはプトレ
シン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの
主な生理作用としては、核酸との相互作用による核酸
の安定化と構造変化、種々の核酸合成系への促進作
用、タンパク質合成系の活性化、細胞膜の安定化や
物質の膜透過性抗性の強化などが知られている。
塩濃度、乾燥などのストレスを受けるとその体内にポリ
アミン合成酵素群の遺伝子を発現し、ポリアミンを蓄積
することが知られている。ポリアミンとは第１級アミノ
基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍
的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミン
が見出されている。代表的なポリアミンとしてはプトレ
シン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの
主な生理作用としては、核酸との相互作用による核酸
の安定化と構造変化、種々の核酸合成系への促進作
用、タンパク質合成系の活性化、細胞膜の安定化や
物質の膜透過性抗性の強化などが知られている。
【０００６】植物におけるポリアミンの役割としては細
胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や
細胞保護が報告されており、環境ストレスに対しては塩
ストレス、酸ストレス（Plant cell physiol., 38(10),
156-1166, 1997）、低温ストレス（Plant Science, 12
2, 111-117, 1997 、Plant Science, 126, 1-10, 199
7、Japan Jour. Crop Sci., 50(3), 411-412, 1981）と
の関わりが主に報告されている。
胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や
細胞保護が報告されており、環境ストレスに対しては塩
ストレス、酸ストレス（Plant cell physiol., 38(10),
156-1166, 1997）、低温ストレス（Plant Science, 12
2, 111-117, 1997 、Plant Science, 126, 1-10, 199
7、Japan Jour. Crop Sci., 50(3), 411-412, 1981）と
の関わりが主に報告されている。
【０００７】植物のポリアミン生合成に関わるポリアミ
ン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤ
Ｃ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシ
ルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン
合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭ
Ｓ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵
素をコードする遺伝子については植物から既に幾つかが
単離されている。
ン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤ
Ｃ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシ
ルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン
合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭ
Ｓ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵
素をコードする遺伝子については植物から既に幾つかが
単離されている。
【０００８】ＡＤＣ遺伝子はエンバク（Mol. Gen. Gene
t., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physiol.,
103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（plant physio
l.,111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mol. Bi
ol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセ
ンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-248,199
6）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Plant Mol. Bio
l., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant Physi
ol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝
子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol., 39(1), 73
-79, 1998）等から単離されている。しかしながら、こ
れらの植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子プロモ
ーターについては全く報告されていない。
t., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physiol.,
103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（plant physio
l.,111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mol. Bi
ol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョウセ
ンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-248,199
6）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Plant Mol. Bio
l., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant Physi
ol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤＳ遺伝
子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol., 39(1), 73
-79, 1998）等から単離されている。しかしながら、こ
れらの植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子プロモ
ーターについては全く報告されていない。
【０００９】
【発明が解決しようする課題】本発明の目的の１つは、
植物における遺伝子工学的手法を用いて、品種改良など
を行うために必要な遺伝子の制御を行うことができるプ
ロモーターを提供することである。さらには、温度の制
御により、目的遺伝子を制御することが可能なプロモー
ターを提供することである。
植物における遺伝子工学的手法を用いて、品種改良など
を行うために必要な遺伝子の制御を行うことができるプ
ロモーターを提供することである。さらには、温度の制
御により、目的遺伝子を制御することが可能なプロモー
ターを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、本発明の
植物プロモーターを得るために、すでに、クロダネカボ
チャの生理学の知見による遺伝子レベルでの解明をめざ
し、鋭意研究して、クロダネカボチャよりいくつかのcD
NAを単離した（特開2001-46079）。これらの単離したcD
NAを調査し、さらに、特にＳ−アデノシルメチオニン脱
炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子およびア
ルギニン脱炭酸酵素遺伝子の上流配列をクローニング
し、解析した結果、モデル植物のタバコで発現するプロ
モーターを見出し、本発明を完成するに至った。
植物プロモーターを得るために、すでに、クロダネカボ
チャの生理学の知見による遺伝子レベルでの解明をめざ
し、鋭意研究して、クロダネカボチャよりいくつかのcD
NAを単離した（特開2001-46079）。これらの単離したcD
NAを調査し、さらに、特にＳ−アデノシルメチオニン脱
炭酸酵素遺伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子およびア
ルギニン脱炭酸酵素遺伝子の上流配列をクローニング
し、解析した結果、モデル植物のタバコで発現するプロ
モーターを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】本発明は、以下の項１〜項２２に関する。
項１、植物由来Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺
伝子のプロモーター領域を含むDNA断片。 項２、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項３、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１記
載のDNA断片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項４、請求項２または３の塩基配列からなるDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プ
ロモーターとして作用する能力を有するDNA断片。 項５、温度により制御可能な請求項１から４のいずれか
１項に記載のDNA断片。項６、請求項１から５のいずれ
か１項に記載のDNA断片を含むベクター。 項７、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求
項６記載のベクター。 項８、請求項６または７記載のベクターを宿主植物細胞
に導入した形質転換植物。 項９、請求項８記載の形質転換植物から得られた種子及
びその子孫。 項１０、植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子のプロ
モーター活性を有するDNA断片。 項１１、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項１２、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１
０に記載のDNA断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項１３、請求項１１または１２の塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断
片。 項１４、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のDN
A断片を含むベクター。 項１５、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請
求項１４記載のベクター。 項１６、請求項１４または１５に記載のベクターを宿主
植物細胞に導入した形質転換植物。 項１７、請求項１６記載の形質転換植物から得られた種
子及びその子孫。 項１８、植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロ
モーター活性を有するDNA断片。 項１９、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項２０、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１
８に記載のDNA断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
断片。 項２１、請求項１９または２０に記載の塩基配列からな
るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有する
DNA。 項２２、温度により制御可能な請求項18から21のいずれ
か１項に記載のDNA断片。 項２３、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のDN
A断片を含むベクター。 項２４、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請
求項２３記載のベクター。 項２５、請求項２３または２４に記載のベクターを宿主
植物細胞に導入した形質転換植物。 項２６、請求項２５記載の形質転換植物から得られた種
子及びその子孫。
伝子のプロモーター領域を含むDNA断片。 項２、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項３、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１記
載のDNA断片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項４、請求項２または３の塩基配列からなるDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プ
ロモーターとして作用する能力を有するDNA断片。 項５、温度により制御可能な請求項１から４のいずれか
１項に記載のDNA断片。項６、請求項１から５のいずれ
か１項に記載のDNA断片を含むベクター。 項７、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請求
項６記載のベクター。 項８、請求項６または７記載のベクターを宿主植物細胞
に導入した形質転換植物。 項９、請求項８記載の形質転換植物から得られた種子及
びその子孫。 項１０、植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子のプロ
モーター活性を有するDNA断片。 項１１、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項１２、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１
０に記載のDNA断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項１３、請求項１１または１２の塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断
片。 項１４、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のDN
A断片を含むベクター。 項１５、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請
求項１４記載のベクター。 項１６、請求項１４または１５に記載のベクターを宿主
植物細胞に導入した形質転換植物。 項１７、請求項１６記載の形質転換植物から得られた種
子及びその子孫。 項１８、植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子のプロ
モーター活性を有するDNA断片。 項１９、以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA 項２０、以下の（a）または（b）のDNAを含む請求項１
８に記載のDNA断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
断片。 項２１、請求項１９または２０に記載の塩基配列からな
るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有する
DNA。 項２２、温度により制御可能な請求項18から21のいずれ
か１項に記載のDNA断片。 項２３、請求項１８から２２のいずれか１項に記載のDN
A断片を含むベクター。 項２４、異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にある請
求項２３記載のベクター。 項２５、請求項２３または２４に記載のベクターを宿主
植物細胞に導入した形質転換植物。 項２６、請求項２５記載の形質転換植物から得られた種
子及びその子孫。
【００１２】
【発明の実施の態様】本発明の「植物プロモーター」と
は、植物においてプロモーターとして、作用する能力
（プロモーター機能）を有するDNA断片のことである。
「プロモーター」とは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素
（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味し、塩
基の共通配列を有し、これを認識してmRNAを合成する酵
素（RNAポリメラーゼ）がmRNAを合成する。ここで、
「プロモーター機能」とは、RNAポリメラーゼがDNA上の
特異な領域に結合し、転写開始する作用をいう。具体的
には、S-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペ
ルミジン合成酵素遺伝子またはアルギニン脱炭酸酵素遺
伝子のプロモーターであり、または以下の（a）、（b）
または（c）のDNAを含むDNA断片を含む。 （a）配列番号１、１３または２５の塩基配列からなるD
NA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA （c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロ
モーターとして作用する能力を有するDNA。
は、植物においてプロモーターとして、作用する能力
（プロモーター機能）を有するDNA断片のことである。
「プロモーター」とは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素
（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味し、塩
基の共通配列を有し、これを認識してmRNAを合成する酵
素（RNAポリメラーゼ）がmRNAを合成する。ここで、
「プロモーター機能」とは、RNAポリメラーゼがDNA上の
特異な領域に結合し、転写開始する作用をいう。具体的
には、S-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、スペ
ルミジン合成酵素遺伝子またはアルギニン脱炭酸酵素遺
伝子のプロモーターであり、または以下の（a）、（b）
または（c）のDNAを含むDNA断片を含む。 （a）配列番号１、１３または２５の塩基配列からなるD
NA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA （c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロ
モーターとして作用する能力を有するDNA。
【００１３】本発明の植物プロモーターは、配列番号
１、１３または２５記載の塩基配列からなるDNAにおい
て、１もしくは複数のDNAが欠失、置換もしくは付加さ
れた塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして
作用する能力を有するDNAである。本発明の植物プロモ
ーターには、配列番号１、１３または２５記載の塩基配
列の３‘または５’末端に、翻訳効率を上げる塩基配列
などを付加したものや、３‘または５’末端をプロモー
ター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
１、１３または２５記載の塩基配列からなるDNAにおい
て、１もしくは複数のDNAが欠失、置換もしくは付加さ
れた塩基配列からなり、かつ、植物プロモーターとして
作用する能力を有するDNAである。本発明の植物プロモ
ーターには、配列番号１、１３または２５記載の塩基配
列の３‘または５’末端に、翻訳効率を上げる塩基配列
などを付加したものや、３‘または５’末端をプロモー
ター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
【００１４】本発明の「ベクター」とは、上記プロモー
ターをベクターに導入したものであり、ベクターとして
は、大腸菌由来のベクター、例えば、pBluescriptベク
ター、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプ
ラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB、シャトルベクター、
ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが挙げられ
る。また、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイク
ウイルスを利用することもできる。ベクターはそれぞれ
の宿主細胞に応じて選択する。植物プロモーターをベク
ターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入
する方法に従う。
ターをベクターに導入したものであり、ベクターとして
は、大腸菌由来のベクター、例えば、pBluescriptベク
ター、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプ
ラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB、シャトルベクター、
ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが挙げられ
る。また、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイク
ウイルスを利用することもできる。ベクターはそれぞれ
の宿主細胞に応じて選択する。植物プロモーターをベク
ターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入
する方法に従う。
【００１５】本発明の「形質転換植物」とは、上記ベク
ターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物である。宿
主植物細胞としては、シロイヌナズナWassilewskija
株、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウ
モロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられ
る。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転
換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラ
スト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレ
ングリコール法あるいはパーティクルガン法などを挙げ
ることができる。さらに、遺伝子を導入した細胞から再
生された形質転換植物体である。再生方法としては、カ
ルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた
培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体
を得る方法がある。使用する培地としては、ワタではＭ
ＳＩＣ培地（MS塩、0.75% MgCl2, 1.9g/l KNO3, 30g/l
グルコース、2.0g/l ジェランガム、 pH5.8） 、ニン
ジンでは Kamada & Harada培地などが例示される。
ターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物である。宿
主植物細胞としては、シロイヌナズナWassilewskija
株、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウ
モロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられ
る。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転
換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラ
スト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレ
ングリコール法あるいはパーティクルガン法などを挙げ
ることができる。さらに、遺伝子を導入した細胞から再
生された形質転換植物体である。再生方法としては、カ
ルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた
培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体
を得る方法がある。使用する培地としては、ワタではＭ
ＳＩＣ培地（MS塩、0.75% MgCl2, 1.9g/l KNO3, 30g/l
グルコース、2.0g/l ジェランガム、 pH5.8） 、ニン
ジンでは Kamada & Harada培地などが例示される。
【００１６】本発明の具体的な工程例としては、下記工
程が例示される。 (1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（SAMD
C）、スペルミジン合成酵素遺伝子（SPDS）あるいはア
ルギニン脱炭酸酵素遺伝子（ＡＤＣ）の上流領域のクロ
ーニング (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 (4) 無菌タバコの栽培 (5) アグロバクテリウムの感染 (6) 除菌 (7) 形質転換植物の選択 (8) 形質転換植物の再生 (9) 形質転換体の確認 (10) GUS活性の測定 〈１〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およびＡＤＣ遺伝子の
プロモーター領域の単離 クロダネカボチャから得られた遺伝子、Ｓ−アデノシル
メチオニン脱炭酸酵素遺伝子SAMDC（特開2001-4607
9）、 スペルミジン合成酵素遺伝子SAMDC（特開2001-46
079）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子ADC（特開2001-460
79）の塩基配列より、合成オリゴヌクレオチドを作製
し、インバースＰＣＲ法を行う。クロダネカボチャより
ゲノムＤＮＡを抽出した後、EcoRIなど数種の制限酵素
で切断し、セルフライゲーションさせた後、ＰＣＲの鋳
型として使用する。第１プライマー群を用いて、ＰＣＲ
を行った後、反応産物をさらに第２プライマー群を用い
てＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。アガロ
ースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、Ｔ
Ａクローニングベクターにサブクローニングして、オー
トシークエンサーを用いて配列決定を行う。得られたＰ
ＣＲ断片の配列の一部がSAMDC、SPDS、ADCの配列と完全
に一致したことから、各々SAMDC、SPDS、ADCの上流（植
物プロモーター）と判断する。 〈２〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子、ADC遺伝子のプロモー
ター領域の利用 上記方法により得た植物プロモーターを、モデル植物の
タバコにおいて、キメラ遺伝子コンストラクトをつく
り、タンパク質の発現制御に利用することができる。さ
らに、本プロモーターは温度により制御可能であること
から、低温などのストレス耐性遺伝子と接続すると、低
温耐性をはじめとしたストレス耐性等を付与した新規植
物の育種にも応用できる。 〈３〉植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物
細胞の形質転換 植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電
気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレ
クトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等
とプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクショ
ン法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティ
クルガン法等の方法を挙げることができる。また、植物
ウイルスをベクターとして利用することによって、該目
的遺伝子を植物体に導入することができる。利用する植
物ウイルスとしては、例えばカリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）を用いることができる。すなわち、ま
ず、ウイルスゲノムを一旦、大腸菌由来のベクターなど
に挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中
にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾
されたウイルスゲノムを制限酵素により該組換え体から
切り出し、植物体に接種することによって、これらの目
的遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Ho
hn）ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント
・チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumor
s）、アカデミック・プレス、ニューヨーク（Academic
Press、New York）、第549〜560頁(1982)、米国特許第
4,407,956号〕。
程が例示される。 (1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（SAMD
C）、スペルミジン合成酵素遺伝子（SPDS）あるいはア
ルギニン脱炭酸酵素遺伝子（ＡＤＣ）の上流領域のクロ
ーニング (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 (4) 無菌タバコの栽培 (5) アグロバクテリウムの感染 (6) 除菌 (7) 形質転換植物の選択 (8) 形質転換植物の再生 (9) 形質転換体の確認 (10) GUS活性の測定 〈１〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およびＡＤＣ遺伝子の
プロモーター領域の単離 クロダネカボチャから得られた遺伝子、Ｓ−アデノシル
メチオニン脱炭酸酵素遺伝子SAMDC（特開2001-4607
9）、 スペルミジン合成酵素遺伝子SAMDC（特開2001-46
079）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子ADC（特開2001-460
79）の塩基配列より、合成オリゴヌクレオチドを作製
し、インバースＰＣＲ法を行う。クロダネカボチャより
ゲノムＤＮＡを抽出した後、EcoRIなど数種の制限酵素
で切断し、セルフライゲーションさせた後、ＰＣＲの鋳
型として使用する。第１プライマー群を用いて、ＰＣＲ
を行った後、反応産物をさらに第２プライマー群を用い
てＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。アガロ
ースゲル電気泳動で目的の長さのクローンを得た後、Ｔ
Ａクローニングベクターにサブクローニングして、オー
トシークエンサーを用いて配列決定を行う。得られたＰ
ＣＲ断片の配列の一部がSAMDC、SPDS、ADCの配列と完全
に一致したことから、各々SAMDC、SPDS、ADCの上流（植
物プロモーター）と判断する。 〈２〉SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子、ADC遺伝子のプロモー
ター領域の利用 上記方法により得た植物プロモーターを、モデル植物の
タバコにおいて、キメラ遺伝子コンストラクトをつく
り、タンパク質の発現制御に利用することができる。さ
らに、本プロモーターは温度により制御可能であること
から、低温などのストレス耐性遺伝子と接続すると、低
温耐性をはじめとしたストレス耐性等を付与した新規植
物の育種にも応用できる。 〈３〉植物プロモーターのベクターへの導入と宿主植物
細胞の形質転換 植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電
気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレ
クトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等
とプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクショ
ン法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティ
クルガン法等の方法を挙げることができる。また、植物
ウイルスをベクターとして利用することによって、該目
的遺伝子を植物体に導入することができる。利用する植
物ウイルスとしては、例えばカリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）を用いることができる。すなわち、ま
ず、ウイルスゲノムを一旦、大腸菌由来のベクターなど
に挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中
にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾
されたウイルスゲノムを制限酵素により該組換え体から
切り出し、植物体に接種することによって、これらの目
的遺伝子を植物体に挿入することができる〔ホーン（Ho
hn）ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント
・チューモアーズ（Molecular Biology of Plant Tumor
s）、アカデミック・プレス、ニューヨーク（Academic
Press、New York）、第549〜560頁(1982)、米国特許第
4,407,956号〕。
【００１７】さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラス
ミドを利用する方法がある、アグロバクテリウム属に属
する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラス
ミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性
質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導入する
こともできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のう
ち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens) は植物に感染してクラウンゴールと
呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引
き起こすが、これらは感染の際にＴｉプラスミドまたは
Ｒｉプラスミドと呼ばれる、それぞれの細菌中に存在す
るプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA)と
呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み
込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプラ
スミド上にはＴ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物の
ゲノム中に組み込まれるために必須であるｖｉｒ領域と
言われる領域がある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行
されることはなく、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領
域が存在するのと異なったプラスミド上にあっても機能
しうる〔Nature,303,179,(1983)〕。
ミドを利用する方法がある、アグロバクテリウム属に属
する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラス
ミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性
質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導入する
こともできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のう
ち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens) は植物に感染してクラウンゴールと
呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes) は植物に感染して毛状根を引
き起こすが、これらは感染の際にＴｉプラスミドまたは
Ｒｉプラスミドと呼ばれる、それぞれの細菌中に存在す
るプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA)と
呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み
込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプラ
スミド上にはＴ−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物の
ゲノム中に組み込まれるために必須であるｖｉｒ領域と
言われる領域がある。ｖｉｒ領域自身は、植物中に移行
されることはなく、またこのｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ領
域が存在するのと異なったプラスミド上にあっても機能
しうる〔Nature,303,179,(1983)〕。
【００１８】ＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ
領域中に、植物ゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入して
おけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染す
る際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことが
できる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮ
Ａ中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分
を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得
られたものをベクターとして使用することもできる。本
発明においてはこのような種々のベクターを用いること
ができる。例えば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢ
Ｉ１０１（クロンテック社）等のベクターに、本発明の
プロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子を
センスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入し
て、これらを植物細胞に導入することができる。なお、
これらのベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、
該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細
菌は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有し
ている必要がある。
領域中に、植物ゲノム中に組込みたいＤＮＡを挿入して
おけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染す
る際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むことが
できる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮ
Ａ中のクラウンゴール、又は毛状根を引き起こす部分
を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得
られたものをベクターとして使用することもできる。本
発明においてはこのような種々のベクターを用いること
ができる。例えば、バイナリーベクターと呼ばれるｐＢ
Ｉ１０１（クロンテック社）等のベクターに、本発明の
プロモーターに繊維形成および伸長に関与する遺伝子を
センスまたはアンチセンス方向で接続したものを挿入し
て、これらを植物細胞に導入することができる。なお、
これらのベクターは前出のｖｉｒ領域を有しておらず、
該ベクターを導入して用いるアグロバクテリウム属の細
菌は、ｖｉｒ領域を有している他のプラスミドを含有し
ている必要がある。
【００１９】また、これらのベクターはアグロバクテリ
ウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅すること
ができるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプ
ラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことがで
きる。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子
を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌ま
たは植物細胞等を形質転換する際に、形質転換体を容易
に選別することができる。また、これらのベクターには
カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶの３５Ｓプロ
モーターが存在しており、これらのベクターに挿入され
た遺伝子を植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発
現させることが可能となる。 〈４〉形質転換植物細胞から植物体の再生 以下に、タバコにおける、アグロバクテリウムによる目
的遺伝子の導入および形質転換細胞の植物体への再生法
を詳述する。タバコの種子を常法に従って、ＭＳプレー
トに播種し、無菌的に栽培する。本発明の植物プロモー
ターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及びハイグロ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換
したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチュ
ーブに分注し、１cm角に切断したタバコの葉を浸し、数
日間、液体MS培地中で共存培養する。アグロバクテリウ
ムが肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作
を行ない、MSプレート上で数日間、培養を行う。これら
の葉片を最終的に発芽に必要なホルモンを含むMSプレー
ト上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰
り返す。形質転換した葉片は増殖を続け、シュートが現
れてくる。完全なシュートの形状を示すようになった
ら、シュートの根元のカルス部分を含まないようにメス
で切り取り、発根に必要なホルモンを含むMSプレートに
移植し、発根が確認されるまで無菌培養を行い、形質転
換体を得る。この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡ
を抽出し、プロモーター部分およびGUS遺伝子部分にプ
ライマーを設計し、PCRを行い、形質転換の有無を確認
することができる。
ウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅すること
ができるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプ
ラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことがで
きる。更に、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝子
を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌ま
たは植物細胞等を形質転換する際に、形質転換体を容易
に選別することができる。また、これらのベクターには
カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶの３５Ｓプロ
モーターが存在しており、これらのベクターに挿入され
た遺伝子を植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発
現させることが可能となる。 〈４〉形質転換植物細胞から植物体の再生 以下に、タバコにおける、アグロバクテリウムによる目
的遺伝子の導入および形質転換細胞の植物体への再生法
を詳述する。タバコの種子を常法に従って、ＭＳプレー
トに播種し、無菌的に栽培する。本発明の植物プロモー
ターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン及びハイグロ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換
したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチュ
ーブに分注し、１cm角に切断したタバコの葉を浸し、数
日間、液体MS培地中で共存培養する。アグロバクテリウ
ムが肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作
を行ない、MSプレート上で数日間、培養を行う。これら
の葉片を最終的に発芽に必要なホルモンを含むMSプレー
ト上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰
り返す。形質転換した葉片は増殖を続け、シュートが現
れてくる。完全なシュートの形状を示すようになった
ら、シュートの根元のカルス部分を含まないようにメス
で切り取り、発根に必要なホルモンを含むMSプレートに
移植し、発根が確認されるまで無菌培養を行い、形質転
換体を得る。この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡ
を抽出し、プロモーター部分およびGUS遺伝子部分にプ
ライマーを設計し、PCRを行い、形質転換の有無を確認
することができる。
【００２０】また、形質転換体や非形質転換体より、常
法に従ってＲＮＡを抽出し、キメラ遺伝子のセンスまた
はアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これら
のプローブを用いてノザンハイブリザイゼーションを行
ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。エレメント決定方法 本発明のプロモーター上にあるエレメント部位を決定す
る方法としては、例えばJoseph Sambrook,David W. Rus
sell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれ
ているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプ
ロモーターを作製し、植物細胞等に形質転換後、目的の
条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて
調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決
定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell Mo
lecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているよ
うにプロモーター上にDNA変異を導入して、またはPCR法
を利用した変異の変異の導入により、上記と同様に、植
物細胞等に形質転換後、プロモーター活性を調査し、も
っとも重要なエレメント配列を決定する方法がある。具
体例としては、アラビドプシスDREエレメントの決定（T
he Plant Cell 6:251-264(1994) ）などが参考になる。
法に従ってＲＮＡを抽出し、キメラ遺伝子のセンスまた
はアンチセンス配列を有するプローブを作成し、これら
のプローブを用いてノザンハイブリザイゼーションを行
ない、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。エレメント決定方法 本発明のプロモーター上にあるエレメント部位を決定す
る方法としては、例えばJoseph Sambrook,David W. Rus
sell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれ
ているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプ
ロモーターを作製し、植物細胞等に形質転換後、目的の
条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて
調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決
定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell Mo
lecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているよ
うにプロモーター上にDNA変異を導入して、またはPCR法
を利用した変異の変異の導入により、上記と同様に、植
物細胞等に形質転換後、プロモーター活性を調査し、も
っとも重要なエレメント配列を決定する方法がある。具
体例としては、アラビドプシスDREエレメントの決定（T
he Plant Cell 6:251-264(1994) ）などが参考になる。
【００２１】The plant journal (1996) 9(2) 14-158
は、公知の35SプロモーターにSAMDC遺伝子を接続したも
のでは、形質転換体ができず、誘導性のプロモーターに
変更することで形質転換体が可能になったことを報告し
ており、本発明のプロモーターは、35Sプロモーターよ
りも形質転換体を得るのに有利である。た。
は、公知の35SプロモーターにSAMDC遺伝子を接続したも
のでは、形質転換体ができず、誘導性のプロモーターに
変更することで形質転換体が可能になったことを報告し
ており、本発明のプロモーターは、35Sプロモーターよ
りも形質転換体を得るのに有利である。た。
【００２２】本発明のプロモーターの改変は、プロモー
ターのエレメントをタンデムに接続したり、タバコモザ
イクウイルスのΩ配列を接続するなどの種々の方法によ
り活性が変化したプロモーターを得ることができる（Pl
ant cell physiol 37(1):49-59(1996)、Efficient Pro
moter Cassettes for Enhanced Expression of Foreign
Genes in Dicotyledonous and Monocotyledonous Plan
t、特開 2000-166577）。
ターのエレメントをタンデムに接続したり、タバコモザ
イクウイルスのΩ配列を接続するなどの種々の方法によ
り活性が変化したプロモーターを得ることができる（Pl
ant cell physiol 37(1):49-59(1996)、Efficient Pro
moter Cassettes for Enhanced Expression of Foreign
Genes in Dicotyledonous and Monocotyledonous Plan
t、特開 2000-166577）。
【００２３】本発明のプロモ−ターに接続することが好
ましい遺伝子として、下記のものが例示される。 (i)Genes encoding enzymes that synthesize osmoprot
ectants
ましい遺伝子として、下記のものが例示される。 (i)Genes encoding enzymes that synthesize osmoprot
ectants
【００２４】
【表１】
【００２５】(ii)Late embryogenesis abundant (LEA)-
related genes
related genes
【００２６】
【表２】
【００２７】(iii)Regulatory genes
【００２８】
【表３】
【００２９】(iv)Oxidative stress related genes
【００３０】
【表４】
【００３１】(v) Genes encoding for molecular chape
rones
rones
【００３２】
【表５】
【００３３】参考文献
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ation with a gene forcholine oxidase enhances the
cold tolerance of Arabidopsis during germination a
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impairs calcium utilization and sensitivity to io
nic stress in transgenic plants. Plant Cell Physio
l 42: 74-84 ・Lee JH, and Schoffl F (1996) An Hsp70 antisense
gene affects the expression of HSP70/HSc70, the re
gulation of HSF, and the acquisition of thermotole
rance in transgenic Arabidopsis thaliana. Mol Gen
Genet 252: 11-19 ・Lee JH, Hubel A, and Schoffl F (1995) Depression
of the activity of genetically engineered heat sh
ock factor causes constitutive synthesis ofheat sh
ock proteins and increased thermotolerance in tran
sgenic Arabidopsis. Plant J 8: 603-612 ・Lilius G, holmberg N, and Bulow L (1996) Enhance
d NaCL stress tolerance in transgenic tobacco expr
essing bacterial choline dehydrogenase. Bio/techno
logy 14:177-180 ・Malik MK, Slovin Jp, Hwang CH, and Zimmerman JL
(1999) Modified expression of a carrot small heat
shock protein gene, Hsp17.7, results in increased
or decreased thermotolerance. Plant J 20: 89-99 ・McKaersie BD (2001) Stress tolerance of transgen
ic plants overexpressing superoxide dismutase ( Ab
stract Socity for Experimental Biology Annual Mee
ting). J Exptl Bot 52 (supplement): p8 ・McKaersie BD, Bowley SR, and Jones KS (1999) Win
ter survival of transgenic alfalfa overexpressing
superoxide dismutase. Plant Physiol 199: 839-847 ・McKaersie BD, Bowley SR, Harjanto SR, and Leprin
ce O (1996) Water deficit tolerance and field perf
ormance of transgenic alfalfa overexpressingsupero
xide dismutase. Plant Physiol 111: 1177-1181 ・McKaersie BD, Chen Y, Debens M, Bowley SR, Bowle
r C, Inze D, D'HalluinK, and Botterman J (1993) Su
peroxide dismutase enhance tolerance of freezing s
tress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.).
Plant Physiol 103: 1155-1163 ・Medina J, Catala R, and Salinas J (2001) Develop
mental and stress regulation of RC12A and RC12B, t
wo cold-inducible genes of Arabidopsis encoding hi
ghly conserved hydrophobic proteins. Plant Physiol
125: 1655-1666 ・Moghaieb REA, Tanaka N, Saneoka H, Hussein HA, Y
ousef SS, Ewada MAF, Aly MAM, and Fujita K (2000)
Expression of betaine aldehyde dehydrogenasegene i
n transgenic tomato hairy roots leads to the accum
ulation of glycine betaine and contributes to the
maintenance of the osmotic potentialunder salt str
ess. Soil Sci Plant Nutr 46: 873-883 ・MsPRP2 gene in alfalfa and improve salinity tole
rance of the plants. Plant Physiol 120: 473-480 ・Park JM, Park c-J, Lee S-B, Ham B-K, Shin R, and
Paek K-H (2001) Overexpression of the tobacco Tsi
1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription fa
ctor enhances resistance against pathogen attack a
nd osmotic stress in tobacco. Plant Cell 13: 1035-
1046 ・Pilon-Smits EAH, Ebskamp MJM, Paul MJ, Jeuken MJ
W, Weisbeek PJ, and Smeekens SCM (1995) Improved p
erformance of transgenic fructan-accumulating toba
cco under drought stress. Plant physiol 107: 125-1
30 ・Queitsch C, Hong S-W, Vierling E, and Lindquist
S (2000) Heat shock protein 101 plays a crucial th
ermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell 12:479-49
2 ・Quimio CA, Torrizo LB, Setter TL, Ellis M, Grove
r A, Abrigo EM, OlivaNP, Ella ES, Carpena AL, Ito
O, Peacock WJ, Dennis E, Datta SK (2000) Enhanceme
nt of submergence tolerance in transgenic rice ove
rproducing pyruvate decarboxylase. J Plant Physiol
156: 516-521 ・Roxas VP, Lodhi SA, Garrett DK, Mahan JR, and Al
len RD (2000) Stress tolerance in transgenic tobac
co seedlings that overexpress glutathione S-transf
erase/glutathione peroxidase. Plant Cell Physiol 4
1: 1229-1234 ・Roxas VP, Smith RK Jr, Allen ER, and Allen RD (1
997) Overexpression ofglutathione-S-transferase/gl
utathione peroxidase enhances the growth oftransge
nic tobacco seedlings during stress. Nature Biotec
hnol 15: 988-991 ・Saijo Y, Hata S, Kyozuka j, Shimamoto K, and Izu
i K (2000) Over-expression of a single Ca2+ depend
ent protein kinase confers both cold and salt/drou
ght tolerance on rice plants. Plant J 23: 319-327 ・Sakamoto A, Alia HH, and Murata N (1998) Metabol
ic engineering of riceleading to biosynthesis of g
lycine betaine and tolerance to salt and cold. Pla
nt Mol. Biol. 38: 1011-1019 ・Sheveleva E, Chmara W, Bohert HJ, and Jensen RG
(1997) Increased saltand drought tolerance by D-on
onitol production in transgenic Nicotiana tabacum
L. Plant Physiol. 115: 1211-1219 ・Sivamani E, bahieldin A, Wraith JM, Al-Niemi T,
Dyer WE, Ho THD, and QU RD (2000) Improved biomass
productivity and water use efficiency underwater
deficit conditions in transgenic wheat constitutiv
ely expressingthe barley HVA1 gene. Plant Sci 155:
1-9 ・Soderman E, Hjellstrom M, Fahleson J, and Engstr
om P (1999) The HD-Zipgene ATHB6 in Arabisopsis is
expressed in developing leaves, roots andcarpels
and up-regulated by water deficit conditions. Plan
t Mol Biol 40:1073-1083 ・Steponkus Pl, Uemura M, Joseph RA, Gilmour S, an
d Thomashow MF (1998)Mode of action of the COR15a
gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thal
iana. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14570-14575 ・Tamminen I, Makela P, Heino P, and Palva ET (200
1) Ectopic expressionof AB13 gene enhances freezin
g tolerance in response to abscisic acid and low t
emperature in Arabidopsis thaliana. The Plant J 2
5: 1-8 ・Tarczynski MC, Jensen RG, and Bohert HJ (1993) S
tress protection of transgenic tobacco by producti
on of the osmolyte mannitol. Science 259: 508-510 ・Tepperman JM, and Dunsmuir P (1990) Transformed
plants with elevated levels of chloroplasts SOD ar
e not more resistant to superoxide toxicity.Plant
Mol Biol 14: 501-511 ・Thomas JC, Sepahi M, Arendall B, and Bohert HJ
(1995) Enhancement of seed germination in high sal
inity by engineering mannitol expression in Arabid
opsis thaliana. Plant Cell Envir 18: 801-806 ・Van Camp W, Capiau K, Van Montagu M, Inze D, and
Slooten L (1996) Enhancement of oxidative stress
tolerance in transgenic tobacco plants overproduci
ng Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant
Physiol 112: 1703-1714 ・Wang J, Zhang H, and Allen RD (1999) Overexpress
ion of an Arabidopsisperoxisomal ascorbate peroxid
ase gene in tobacco increases protection against o
xidative stress. Plant Cell Physiol 40: 725-732 ・Winicov I, and Bastola DR (1999) Transgenic over
expression of the transcription factor Alfin1enhan
ces expression of the endogenous ・Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho TD, and Wu R (1
996) Expression of a late embryogensis abundant pr
otein gene, HVA1, from barley confers tolerance to
water deficit and salt stress in transgenic rice.
Plant Physiol 110: 249-257 ・Yu Q, Osborne LD, and Rengel Z (1999) Increased
tolerance to Mn deficiency in transgenic tobacco o
verproducing superoxide dismutase. Annals Bot 84:
543-547 ・Zhu B, Su J, Chang MC, Verma DPS, Fan YL, and Wu
Ray (1998) Overexpression of a pyrroline-5-carbox
ylate synthetase gene and analysis of tolerance to
water and salt stress in transgenic rice. Plant S
ci 139: 41-48
ation with a gene forcholine oxidase enhances the
cold tolerance of Arabidopsis during germination a
nd early growth. Plant Cell Envir 21: 232-239. ・Bowler C, Slooten L, Vandenbranden S, Rycke RD,
Botterman J, Sybesma C, Van MM, and Inze D (1991)
Manganese superoxide dismutase can reduce cellular
damage mediated by oxygen radicals in transgenic
plants. EMBO J 10: 1723-1732 ・Capell T, Escobar C, Liu H, Burtin D, Lepri O, a
nd Christou P (1998) Overexpression of the oat arg
inine decarboxylase cDNA in transgenic rice(Oryza
sativa L.) affects normal development patterns in
vitro and results in putrescine accumulation in tr
ansgenic plants. Theor Appl Genet 97:246-254 ・De Ronde JA, Spreeth MH, and Cress WA (2000) Eff
ect of antisense L-Delta(1)-pyrroline-5-carboxylat
e redutase transgenic soybean plants subjected to
osmotic and drought stress. Plant Growth Regul 32:
13-26 ・Deak M, Horvath GV, Davletova S, Torok K, Sass
L, Vass I, Barna B, Kiraly Z, and Dudits D (1999)
Plants ectopically expressing the iron-binding pro
tein ferritin, are tolerant to oxidative damages a
nd pathogens. Nature Biotechnol 17: 192-196 ・Espinosa-Ruiz A, Belles JM, Serrano R, and Culia
nez-Macia FA (1999) Arabidopsis thaliana AtHAL3: a
flavoprotein related to salt and osmotic toleranc
e and plant growth. Plant J 20: 529-539 ・Ezaki B, Gardner RC, Ezaki Y, and Matsumoto H (2
000) Expression of aluminum-induced genes in trans
genic arabidopsis plants can ameliorate aluminum s
tress and/or oxidative stress. Plant Physiol 122:
657-665 ・Grichko VP, and Glick BR (2001) Flooding toleran
ce of transgenic tomato plants expressing the bact
erial enzyme ACC deaminase controlled by the35S, r
o1D or PRB-1b promoter. Plant Cell Physiol 42: 245
-249 ・Gupta AS, Heinen JL, Holaday AS, Burke JJ, and A
llen RD (1993) Increased resistance to oxidative s
tress in transgenic plants that overexpresschlorop
lastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad
Sci USA 90: 1629-1633 ・Hayashi HA, Mustardy L, Deshnium P, Ida M, and M
urata N (1997) Transformation of Arabidopsis thali
ana with the codA gene for choline oxidase:accumul
ation of glycine betaine and enhanced tolerance to
salt and coldstress. Plant J 12: 133-142 ・Hirano HY, and Sano Y (1998) Enhancement of Wx g
ene expression and theaccumulation of amylose in r
esponse to cool temperatures during seed developme
nt in rice. Plant Cell Physiol 39(8): 807-812 ・Hong Suk-Whan and Vierling E. (2000) Mutants of
Arabidopsis thaliana defective in the acquisition
of tolerance to high temperature stress. Proc.Nat
l.Acad.Sci.97:4392-4397. ・Hoshida H, Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, Tanaka
A, and Takabe T (2000) Enhanced tolerance to salt
stress in transgenic rice that overexpresses chlo
roplast glutamine synthetase. Plant Mol Biol 43: 1
03-111 ・Huang J, Hirji R, Adam L, Rozwadowski KL, Hammer
lindi JK, Keller WA, and Selvaraj G (2000) Genetic
engineering of glycine betaine production toward
enhancing stress tolerance in plants: metabolic li
mitations. PlantPhysiol 122: 747-756 ・Jaglo-Ottosen KR, Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenb
erger O, and ThomashowMF (1998) Arabidopsis CBF1 o
verexpression induces COR genes and enhances freez
ing tolerance. Science 280: 104-106 ・Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K,
and Shinozaki K (1999) Improving plant drought, s
alt and freezing tolerance by gene transferof a si
ngle stress-inducible transcription factor. Nature
Biotechnol 17:287-291. ・Karakas B., Oziasakins P., Stushnoff C., Sueffer
held M. and Rieger M.(1997). Salinity and drought
tolerance of mannitol-accumulating transgenic toba
cco. Plant Cell Environ. 20:609-616. ・Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G-H, Hu C-AA, and V
erma DPS (1995) Overexpression of pyrroline-5-carb
oxylate synthetase increases proline production an
d confers osmotolerance in transgenic plants. Plan
t Physiol 108: 1387-1394 ・Kim JC, Lee SH, Cheng YH, Yoo CM, Lee SI, Chun H
J, Yun DJ, Hong JC, Lee SY, Lim CO, and Cho MJ (20
01) A novel cold-inducible zinc finger protein fro
m soybean, SCOF-1, enhances cold tolerance in tran
sgenic plants. Plant J 25: 247-259 ・Kim SA, Kwak JM, Jae SK, Wang MH, and Nam HG (20
01) Overexpression ofthe AtGluR2 gene encoding an
aradopsis homolog of mammalian glutamate receptors
impairs calcium utilization and sensitivity to io
nic stress in transgenic plants. Plant Cell Physio
l 42: 74-84 ・Lee JH, and Schoffl F (1996) An Hsp70 antisense
gene affects the expression of HSP70/HSc70, the re
gulation of HSF, and the acquisition of thermotole
rance in transgenic Arabidopsis thaliana. Mol Gen
Genet 252: 11-19 ・Lee JH, Hubel A, and Schoffl F (1995) Depression
of the activity of genetically engineered heat sh
ock factor causes constitutive synthesis ofheat sh
ock proteins and increased thermotolerance in tran
sgenic Arabidopsis. Plant J 8: 603-612 ・Lilius G, holmberg N, and Bulow L (1996) Enhance
d NaCL stress tolerance in transgenic tobacco expr
essing bacterial choline dehydrogenase. Bio/techno
logy 14:177-180 ・Malik MK, Slovin Jp, Hwang CH, and Zimmerman JL
(1999) Modified expression of a carrot small heat
shock protein gene, Hsp17.7, results in increased
or decreased thermotolerance. Plant J 20: 89-99 ・McKaersie BD (2001) Stress tolerance of transgen
ic plants overexpressing superoxide dismutase ( Ab
stract Socity for Experimental Biology Annual Mee
ting). J Exptl Bot 52 (supplement): p8 ・McKaersie BD, Bowley SR, and Jones KS (1999) Win
ter survival of transgenic alfalfa overexpressing
superoxide dismutase. Plant Physiol 199: 839-847 ・McKaersie BD, Bowley SR, Harjanto SR, and Leprin
ce O (1996) Water deficit tolerance and field perf
ormance of transgenic alfalfa overexpressingsupero
xide dismutase. Plant Physiol 111: 1177-1181 ・McKaersie BD, Chen Y, Debens M, Bowley SR, Bowle
r C, Inze D, D'HalluinK, and Botterman J (1993) Su
peroxide dismutase enhance tolerance of freezing s
tress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.).
Plant Physiol 103: 1155-1163 ・Medina J, Catala R, and Salinas J (2001) Develop
mental and stress regulation of RC12A and RC12B, t
wo cold-inducible genes of Arabidopsis encoding hi
ghly conserved hydrophobic proteins. Plant Physiol
125: 1655-1666 ・Moghaieb REA, Tanaka N, Saneoka H, Hussein HA, Y
ousef SS, Ewada MAF, Aly MAM, and Fujita K (2000)
Expression of betaine aldehyde dehydrogenasegene i
n transgenic tomato hairy roots leads to the accum
ulation of glycine betaine and contributes to the
maintenance of the osmotic potentialunder salt str
ess. Soil Sci Plant Nutr 46: 873-883 ・MsPRP2 gene in alfalfa and improve salinity tole
rance of the plants. Plant Physiol 120: 473-480 ・Park JM, Park c-J, Lee S-B, Ham B-K, Shin R, and
Paek K-H (2001) Overexpression of the tobacco Tsi
1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription fa
ctor enhances resistance against pathogen attack a
nd osmotic stress in tobacco. Plant Cell 13: 1035-
1046 ・Pilon-Smits EAH, Ebskamp MJM, Paul MJ, Jeuken MJ
W, Weisbeek PJ, and Smeekens SCM (1995) Improved p
erformance of transgenic fructan-accumulating toba
cco under drought stress. Plant physiol 107: 125-1
30 ・Queitsch C, Hong S-W, Vierling E, and Lindquist
S (2000) Heat shock protein 101 plays a crucial th
ermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell 12:479-49
2 ・Quimio CA, Torrizo LB, Setter TL, Ellis M, Grove
r A, Abrigo EM, OlivaNP, Ella ES, Carpena AL, Ito
O, Peacock WJ, Dennis E, Datta SK (2000) Enhanceme
nt of submergence tolerance in transgenic rice ove
rproducing pyruvate decarboxylase. J Plant Physiol
156: 516-521 ・Roxas VP, Lodhi SA, Garrett DK, Mahan JR, and Al
len RD (2000) Stress tolerance in transgenic tobac
co seedlings that overexpress glutathione S-transf
erase/glutathione peroxidase. Plant Cell Physiol 4
1: 1229-1234 ・Roxas VP, Smith RK Jr, Allen ER, and Allen RD (1
997) Overexpression ofglutathione-S-transferase/gl
utathione peroxidase enhances the growth oftransge
nic tobacco seedlings during stress. Nature Biotec
hnol 15: 988-991 ・Saijo Y, Hata S, Kyozuka j, Shimamoto K, and Izu
i K (2000) Over-expression of a single Ca2+ depend
ent protein kinase confers both cold and salt/drou
ght tolerance on rice plants. Plant J 23: 319-327 ・Sakamoto A, Alia HH, and Murata N (1998) Metabol
ic engineering of riceleading to biosynthesis of g
lycine betaine and tolerance to salt and cold. Pla
nt Mol. Biol. 38: 1011-1019 ・Sheveleva E, Chmara W, Bohert HJ, and Jensen RG
(1997) Increased saltand drought tolerance by D-on
onitol production in transgenic Nicotiana tabacum
L. Plant Physiol. 115: 1211-1219 ・Sivamani E, bahieldin A, Wraith JM, Al-Niemi T,
Dyer WE, Ho THD, and QU RD (2000) Improved biomass
productivity and water use efficiency underwater
deficit conditions in transgenic wheat constitutiv
ely expressingthe barley HVA1 gene. Plant Sci 155:
1-9 ・Soderman E, Hjellstrom M, Fahleson J, and Engstr
om P (1999) The HD-Zipgene ATHB6 in Arabisopsis is
expressed in developing leaves, roots andcarpels
and up-regulated by water deficit conditions. Plan
t Mol Biol 40:1073-1083 ・Steponkus Pl, Uemura M, Joseph RA, Gilmour S, an
d Thomashow MF (1998)Mode of action of the COR15a
gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thal
iana. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14570-14575 ・Tamminen I, Makela P, Heino P, and Palva ET (200
1) Ectopic expressionof AB13 gene enhances freezin
g tolerance in response to abscisic acid and low t
emperature in Arabidopsis thaliana. The Plant J 2
5: 1-8 ・Tarczynski MC, Jensen RG, and Bohert HJ (1993) S
tress protection of transgenic tobacco by producti
on of the osmolyte mannitol. Science 259: 508-510 ・Tepperman JM, and Dunsmuir P (1990) Transformed
plants with elevated levels of chloroplasts SOD ar
e not more resistant to superoxide toxicity.Plant
Mol Biol 14: 501-511 ・Thomas JC, Sepahi M, Arendall B, and Bohert HJ
(1995) Enhancement of seed germination in high sal
inity by engineering mannitol expression in Arabid
opsis thaliana. Plant Cell Envir 18: 801-806 ・Van Camp W, Capiau K, Van Montagu M, Inze D, and
Slooten L (1996) Enhancement of oxidative stress
tolerance in transgenic tobacco plants overproduci
ng Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant
Physiol 112: 1703-1714 ・Wang J, Zhang H, and Allen RD (1999) Overexpress
ion of an Arabidopsisperoxisomal ascorbate peroxid
ase gene in tobacco increases protection against o
xidative stress. Plant Cell Physiol 40: 725-732 ・Winicov I, and Bastola DR (1999) Transgenic over
expression of the transcription factor Alfin1enhan
ces expression of the endogenous ・Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho TD, and Wu R (1
996) Expression of a late embryogensis abundant pr
otein gene, HVA1, from barley confers tolerance to
water deficit and salt stress in transgenic rice.
Plant Physiol 110: 249-257 ・Yu Q, Osborne LD, and Rengel Z (1999) Increased
tolerance to Mn deficiency in transgenic tobacco o
verproducing superoxide dismutase. Annals Bot 84:
543-547 ・Zhu B, Su J, Chang MC, Verma DPS, Fan YL, and Wu
Ray (1998) Overexpression of a pyrroline-5-carbox
ylate synthetase gene and analysis of tolerance to
water and salt stress in transgenic rice. Plant S
ci 139: 41-48
【００３４】
【発明の効果】本発明では、レポーター遺伝子として広
く植物で使われているＧＵＳ遺伝子を本発明のプロモー
ターの３’末端に連結して使用すると、ＧＵＳ活性を調
べることで、簡単にプロモーターの強さを評価できる。
レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子に限らず、ル
シフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインも
使用することができる。SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およ
びADC遺伝子は、ポリアミン合成遺伝子酵素群の一つの
遺伝子であり、まだ、未知の機能を持っているポリアミ
ンの発現の時期、発現の組織などを本発明のプロモータ
ーを利用して同定し、ポリアミンの機能を明らかにする
ためにも有用である。
く植物で使われているＧＵＳ遺伝子を本発明のプロモー
ターの３’末端に連結して使用すると、ＧＵＳ活性を調
べることで、簡単にプロモーターの強さを評価できる。
レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子に限らず、ル
シフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインも
使用することができる。SAMDC遺伝子、SPDS遺伝子およ
びADC遺伝子は、ポリアミン合成遺伝子酵素群の一つの
遺伝子であり、まだ、未知の機能を持っているポリアミ
ンの発現の時期、発現の組織などを本発明のプロモータ
ーを利用して同定し、ポリアミンの機能を明らかにする
ためにも有用である。
【００３５】本発明のプロモーターは、SAMDC遺伝子、S
PDS遺伝子およびADC遺伝子、すなわちポリアミン合成酵
素群に関与するプロモーターであり、植物のポリアミン
合成シグナル経路を解明するためのシス因子やトランス
因子の単離に利用することができ、かつ、温度による遺
伝子制御が可能であることから、既知の温度による遺伝
子制御可能なプロモーターと比較研究し、植物のストレ
ス応答システムを研究する技術分野においてもきわめて
有用である。
PDS遺伝子およびADC遺伝子、すなわちポリアミン合成酵
素群に関与するプロモーターであり、植物のポリアミン
合成シグナル経路を解明するためのシス因子やトランス
因子の単離に利用することができ、かつ、温度による遺
伝子制御が可能であることから、既知の温度による遺伝
子制御可能なプロモーターと比較研究し、植物のストレ
ス応答システムを研究する技術分野においてもきわめて
有用である。
【００３６】さらに、低温などのストレス耐性に関与す
るタンパクをコードしている塩基配列と、本発明の植物
プロモーターを結合したキメラ遺伝子を作製して、特定
の環境条件の時のみに目的の遺伝子の発現を行うことが
でき、植物に負担が少ないストレス耐性形質転換植物を
作製することが出来る。また、一般にカリフラワーモザ
イクウイルスの３５Ｓプロモーターを用いることによっ
て、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化
をもたらすことができるが、本発明プロモーターを用い
れば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体
を作製することができる。
るタンパクをコードしている塩基配列と、本発明の植物
プロモーターを結合したキメラ遺伝子を作製して、特定
の環境条件の時のみに目的の遺伝子の発現を行うことが
でき、植物に負担が少ないストレス耐性形質転換植物を
作製することが出来る。また、一般にカリフラワーモザ
イクウイルスの３５Ｓプロモーターを用いることによっ
て、植物の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化
をもたらすことができるが、本発明プロモーターを用い
れば、生育環境に応じて、その形態が変化しうる植物体
を作製することができる。
【００３７】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。 実施例１ SAMDCの上流領域を持つ形質転換タバコの作
製 (1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、SAMD
Cの上流領域 (SAMDCpro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、インバー
ス(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを
行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、Dra
I、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Liga
tion high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせ
た。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣ
Ｒ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SAMDC
の５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号２およ
び３に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用
い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サ
イクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列
番号４および５に示した塩基配列を有する第２プライマ
ー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣ
Ｒ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤ
ＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech社）を
用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換して、クローニングした。その後、ABI PRIS
M 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SAMDCの５
‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマー
の配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応する
ゲノム領域であることが確認できた。さらに、転写阿開
始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素サイト
（XbaI、BamHI）を付加した配列番号６および７のプラ
イマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入し、pSAMDC10
00proと名付けた。この塩基配列を配列番号１に示す。
さらに同様に転写阿開始点から500bpになるものも配列
番号８および９により作製し、pSAMDC500proと名付け
た。この塩基配列を配列番号10に示す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEco
RIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該
プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ
遺伝子をプラスミド、上記のベクターpSAMDC1000proとp
SAMDC500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよびE
coRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSAMDCpro1000:
ＧＵＳとｐSAMDCpro500:ＧＵＳを得た。
する。 実施例１ SAMDCの上流領域を持つ形質転換タバコの作
製 (1) Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子、SAMD
Cの上流領域 (SAMDCpro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、インバー
ス(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニングを
行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、Dra
I、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Liga
tion high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせ
た。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣ
Ｒ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SAMDC
の５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号２およ
び３に示した核酸配列を有する第１プライマー群を用
い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８サ
イクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列
番号４および５に示した塩基配列を有する第２プライマ
ー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣ
Ｒ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得られたＤ
ＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech社）を
用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換して、クローニングした。その後、ABI PRIS
M 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SAMDCの５
‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプライマー
の配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応する
ゲノム領域であることが確認できた。さらに、転写阿開
始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素サイト
（XbaI、BamHI）を付加した配列番号６および７のプラ
イマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入し、pSAMDC10
00proと名付けた。この塩基配列を配列番号１に示す。
さらに同様に転写阿開始点から500bpになるものも配列
番号８および９により作製し、pSAMDC500proと名付け
た。この塩基配列を配列番号10に示す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEco
RIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該
プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ
遺伝子をプラスミド、上記のベクターpSAMDC1000proとp
SAMDC500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよびE
coRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSAMDCpro1000:
ＧＵＳとｐSAMDCpro500:ＧＵＳを得た。
【００３８】また、pSAMDC1000proとpSAMDC500proを制
限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI
-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良
先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIお
よびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢ
Ｉ101-SAMDCpro1000：ＧＵＳとpBI101-SAMDCpro500:GUS
を得た。次いで、該プラスミド、pBI101-1000：ＧＵＳ
とpBI101-500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、
Escherichia coli JM109/pBI101-SAMpro1000:GUSおよび
Escherichia coli JM109/pBI101-SAMpro500:GUSを得
た。この工程を図１に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-SAMDCpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pB
I101-SAMDCpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナ
マイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、そ
れぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプ
ラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404ce
ll（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレ
クトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuv
ett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5K
V/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレク
トロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時
間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP
培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コ
ロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI1
01-SAMDCpro1000:GUS、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GU
Sと命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-SAMDCpr
o1000:GUSとLBA4404/ pBI101-SAMDCpro500:GUSを28℃、
２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシ
ャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例２：CaMV35Sプロモーターを持つ形質転換タバコ
の作製 (１) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）と
の融合 CaMV35Sプロモーター（35Ｓ）を含むプラスミド、pBI22
1（Clontech社）を制限酵素、XbaIおよびHindIIIで切断
した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミ
ド中の35Sプロモーターを取り出した。この35Sプロモー
ターをプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大
学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびHi
ndIIIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ35
S：ＧＵＳを得た。次いで、該プラスミド、ｐＢＩ35S：
ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichi
a coli JM109/pBI101-35S:GUSを得た。この工程を図１
に示す。 (２) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （１）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI
101-35S:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを
含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大
腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2
μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO
BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポ
レーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap
0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Ca
pacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレ
ーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で
培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗
布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選
択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-35S:GUS
と命名した。 (３) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (４) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/pBI35S:GUSを28
℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別
のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行っ
た。 (５) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (６) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (７) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (８) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例３：GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例１（２）で得られたpSAMDCpro1000:ＧＵＳと
pBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2
、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテ
ックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10
000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さ
ないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテック
スでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳ
とPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを
１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、
そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５
マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パー
ティクルガンの準備を行った。
限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI
-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良
先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIお
よびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢ
Ｉ101-SAMDCpro1000：ＧＵＳとpBI101-SAMDCpro500:GUS
を得た。次いで、該プラスミド、pBI101-1000：ＧＵＳ
とpBI101-500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、
Escherichia coli JM109/pBI101-SAMpro1000:GUSおよび
Escherichia coli JM109/pBI101-SAMpro500:GUSを得
た。この工程を図１に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-SAMDCpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pB
I101-SAMDCpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナ
マイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、そ
れぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプ
ラスミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404ce
ll（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレ
クトロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuv
ett Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5K
V/cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレク
トロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時
間、28℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP
培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コ
ロニーを選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI1
01-SAMDCpro1000:GUS、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GU
Sと命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-SAMDCpr
o1000:GUSとLBA4404/ pBI101-SAMDCpro500:GUSを28℃、
２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別のシ
ャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行った。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例２：CaMV35Sプロモーターを持つ形質転換タバコ
の作製 (１) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）と
の融合 CaMV35Sプロモーター（35Ｓ）を含むプラスミド、pBI22
1（Clontech社）を制限酵素、XbaIおよびHindIIIで切断
した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミ
ド中の35Sプロモーターを取り出した。この35Sプロモー
ターをプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大
学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIおよびHi
ndIIIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢＩ35
S：ＧＵＳを得た。次いで、該プラスミド、ｐＢＩ35S：
ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichi
a coli JM109/pBI101-35S:GUSを得た。この工程を図１
に示す。 (２) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （１）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI
101-35S:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイシンを
含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞれの大
腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミド2
μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell（GIBCO
BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレクトロポ
レーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvett Gap
0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/cm、Ca
pacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクトロポレ
ーションを行った。その後、SOC培地で２時間、28℃で
培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上に塗
布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選
択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-35S:GUS
と命名した。 (３) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (４) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/pBI35S:GUSを28
℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別
のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行っ
た。 (５) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (６) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (７) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (８) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号11および12のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例３：GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例１（２）で得られたpSAMDCpro1000:ＧＵＳと
pBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2
、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテ
ックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10
000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さ
ないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテック
スでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳ
とPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを
１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、
そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５
マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パー
ティクルガンの準備を行った。
【００３９】パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μ
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。（図２，
３） （２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の
確認 前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMD
Cpro500:GUSとLBA4404/pBI101-35S:GUSによる形質転換
タバコを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25
℃、暗黒化、１日間の処理を行ったあと、ＧＵＳ染色液
(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウ
ム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸
し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込
ませ、３７℃で一晩インキュベートして、クロロフィル
を除くため、５０％エタノールに１０分間、１００％エ
タノールに１０時間浸した。特にLBA4404/pBISAMpro100
0:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSにおいて、GUSよる染色が見
られた (図４，６)。また、LBA4404/pBISAMpro500:GUS
では、GUSによる染色が見られなかった。（図５）。 （３）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定 前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMD
Cpro500:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSによる形質転換タバ
コを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25℃、
暗黒化、１日間の処理を行ったものと、25℃、暗黒化、
同期間の処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４
−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を
分解して、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成
する反応を指標として測定した。処理を行った葉、約１
００ｍｇを500μｌの緩衝液（50mM リン酸ナトリウム
(pH7.0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% サル
コシル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠
心分離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍ
Ｍの４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MU
G ）を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μ
ｌの０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。そ
の反応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-M
U）の蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、G
US-活性を算出した。また、得られた抽出液のタンパク
質濃度の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD
社）を用いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコ
について、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。
数字は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に
生成する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI1
01-35Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロ
モーター活性が見られた。LBA4404/pBI101-SAMDC1000:G
USでは、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター
活性が見られた。また、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:G
USでは、プロモーター活性がほとんど見られなかった。
（図７、８） これらの結果より、本発明のＤＮＡは、温度により、キ
メラ遺伝子を約５〜10倍多く発現させるように制御でき
ることが分かった。実施例４ SPDSの上流領域を持つ形
質転換タバコの作製 (1) スペルミジン合成酵素遺伝子、SPDSの上流領域 (SP
DS pro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバ
ース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニング
を行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、Dra
I、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Liga
tion high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせ
た。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣ
Ｒ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SPDS
の５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号１４お
よび１５に示した核酸配列を有する第１プライマー群を
用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８
サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配
列番号１６および１７に示した塩基配列を有する第２プ
ライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。こ
のＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得ら
れたＤＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech
社）を用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ
１０９を形質転換して、クローニングした。その後、AB
I PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SPD
Sの５‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプラ
イマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対
応するゲノム領域であることが確認できた。さらに、転
写阿開始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素
サイト（XbaI、BamHI）を付加した配列番号１８および
１９のプライマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入
し、p SPDS 1000proと名付けた。この塩基配列を配列番
号１３に示す。さらに同様に転写阿開始点から500bpに
なるものも配列番号２０および２１により作製し、pSPD
S500proと名付けた。この塩基配列を配列番号２２に示
す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEco
RIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該
プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ
遺伝子をプラスミド、上記のベクターp SPDS 1000proと
p SPDS 500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよ
びEcoRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSPDSpro100
0:ＧＵＳとｐSPDSCpro500:ＧＵＳを得た。この工程を図
９に示す。また、p SPDS 1000proとp SPDS 500proを制
限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI
-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良
先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIお
よびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢ
Ｉ101- SPDS pro1000：ＧＵＳとpBI101- SPDS pro500:G
USを得た。次いで、該プラスミド、pBI101-SPDS1000：
ＧＵＳとpBI101-SPDS500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-SPpro1000:
GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SPpro500:GU
Sを得た。この工程を図14に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-SPDSpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI
101-SPDSpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマ
イシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それ
ぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラ
スミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciensLBA4404cell
（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレク
トロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvet
t Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/
cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクト
ロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、2
8℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101- SP
DS pro1000:GUS、LBA4404/pBI101- SPDS pro500:GUSと
命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101- SPDS p
ro1000:GUSとLBA4404/ pBI101- SPDS pro500:GUSを28
℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別
のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行っ
た。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号２３および２４のプライマーを用
いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれるこ
とを確認した。 実施例５：GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例４（２）で得られたpSPDS pro1000:ＧＵＳと
pBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2
、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテ
ックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10
000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さ
ないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテック
スでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSPDSpro1000:ＧＵＳと
PBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを１
枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、そ
のキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５マ
イクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パーテ
ィクルガンの準備を行った。
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。（図２，
３） （２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の
確認 前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMD
Cpro500:GUSとLBA4404/pBI101-35S:GUSによる形質転換
タバコを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25
℃、暗黒化、１日間の処理を行ったあと、ＧＵＳ染色液
(50mM リン酸バッファー、0.5Mフェリシアン化カリウ
ム、0.5Mフェロシアン化カリウム、1mM X-Gluc)に浸
し、真空装置で吸引して溶液を試料内部までよく染み込
ませ、３７℃で一晩インキュベートして、クロロフィル
を除くため、５０％エタノールに１０分間、１００％エ
タノールに１０時間浸した。特にLBA4404/pBISAMpro100
0:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSにおいて、GUSよる染色が見
られた (図４，６)。また、LBA4404/pBISAMpro500:GUS
では、GUSによる染色が見られなかった。（図５）。 （３）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定 前記実施例１（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとLBA4404/pBI101-SAMD
Cpro500:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSによる形質転換タバ
コを、４℃、暗黒化、４日間の低温処理に続き、25℃、
暗黒化、１日間の処理を行ったものと、25℃、暗黒化、
同期間の処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４
−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を
分解して、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成
する反応を指標として測定した。処理を行った葉、約１
００ｍｇを500μｌの緩衝液（50mM リン酸ナトリウム
(pH7.0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% サル
コシル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠
心分離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍ
Ｍの４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MU
G ）を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μ
ｌの０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。そ
の反応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-M
U）の蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、G
US-活性を算出した。また、得られた抽出液のタンパク
質濃度の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD
社）を用いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコ
について、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。
数字は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に
生成する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI1
01-35Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロ
モーター活性が見られた。LBA4404/pBI101-SAMDC1000:G
USでは、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター
活性が見られた。また、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:G
USでは、プロモーター活性がほとんど見られなかった。
（図７、８） これらの結果より、本発明のＤＮＡは、温度により、キ
メラ遺伝子を約５〜10倍多く発現させるように制御でき
ることが分かった。実施例４ SPDSの上流領域を持つ形
質転換タバコの作製 (1) スペルミジン合成酵素遺伝子、SPDSの上流領域 (SP
DS pro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバ
ース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニング
を行った。すなわち、制限酵素NcoI、BamHI、SphI、Dra
I、AIW44I で１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Liga
tion high（東洋紡社）でセルフライゲーションさせ
た。ライゲーションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣ
Ｒ試薬キット(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、SPDS
の５‘上流域を増幅させた。該反応は、配列番号１４お
よび１５に示した核酸配列を有する第１プライマー群を
用い、９４℃、１５秒間および６５℃、１２分間を２８
サイクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配
列番号１６および１７に示した塩基配列を有する第２プ
ライマー群を用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。こ
のＰＣＲ産物を電気泳動で量および長さを確認し、得ら
れたＤＮA断片をAdvanTAge PCR Cloning Kit（Clontech
社）を用いて、ベクターｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ
１０９を形質転換して、クローニングした。その後、AB
I PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社）を用いて、SPD
Sの５‘上流域塩基配列を決定した。該塩基配列はプラ
イマーの配列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対
応するゲノム領域であることが確認できた。さらに、転
写阿開始点から約1000bpになるように、両端に制限酵素
サイト（XbaI、BamHI）を付加した配列番号１８および
１９のプライマーを設計し、pBluescriptのMCSへ挿入
し、p SPDS 1000proと名付けた。この塩基配列を配列番
号１３に示す。さらに同様に転写阿開始点から500bpに
なるものも配列番号２０および２１により作製し、pSPD
S500proと名付けた。この塩基配列を配列番号２２に示
す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、BamHIおよびEco
RIで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って、該
プラスミド中のＧＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ
遺伝子をプラスミド、上記のベクターp SPDS 1000proと
p SPDS 500proのpBluescript上の制限酵素、BamHIおよ
びEcoRIサイトに挿入して、プラスミド、ｐSPDSpro100
0:ＧＵＳとｐSPDSCpro500:ＧＵＳを得た。この工程を図
９に示す。また、p SPDS 1000proとp SPDS 500proを制
限酵素、XbaI およびBamHIで切断し、電気泳動後、XbaI
-BamHI断片をプラスミド、ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良
先端大学、新名淳彦教授から入手）の制限酵素、XbaIお
よびBamHIサイトに挿入して、新規なプラスミド、ｐＢ
Ｉ101- SPDS pro1000：ＧＵＳとpBI101- SPDS pro500:G
USを得た。次いで、該プラスミド、pBI101-SPDS1000：
ＧＵＳとpBI101-SPDS500:GUSで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換して、Escherichia coli JM109/pBI101-SPpro1000:
GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI101-SPpro500:GU
Sを得た。この工程を図14に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-SPDSpro1000:GUSおよびEscherichia coli JM109/pBI
101-SPDSpro500:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマ
イシンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それ
ぞれの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラ
スミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciensLBA4404cell
（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレク
トロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvet
t Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/
cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクト
ロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、2
8℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101- SP
DS pro1000:GUS、LBA4404/pBI101- SPDS pro500:GUSと
命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101- SPDS p
ro1000:GUSとLBA4404/ pBI101- SPDS pro500:GUSを28
℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、それぞれ別
のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存培養を行っ
た。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号２３および２４のプライマーを用
いてPCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれるこ
とを確認した。 実施例５：GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例４（２）で得られたpSPDS pro1000:ＧＵＳと
pBI221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2
、20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテ
ックスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。10
000rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さ
ないように250μlの100%エタノールを加え、ボルテック
スでしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSPDSpro1000:ＧＵＳと
PBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを１
枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、そ
のキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５マ
イクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パーテ
ィクルガンの準備を行った。
【００４０】パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μ
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。（図１
０，１１） （２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の
確認 前記実施例４（９）で得られたLBA4404/pBI101-SPDSpro
1000:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒化、４日
間の低温処理に続き、25℃、暗黒化、１日間の処理を行
ったあと、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5M
フェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウ
ム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試
料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベー
トして、クロロフィルを除くため、５０％エタノールに
１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。LBA4
404/pBISPDSpro1000:GUSにおいて、GUSよる染色が見ら
れた(図１２)。 実施例６ アルギニン脱炭酸酵素の上流領域を持つ形質
転換タバコの作製 (1) アルギニン脱炭酸酵素遺伝子、ADCの上流領域 (ADC
Cpro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバ
ース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニング
を行った。すなわち、制限酵素EcoRV、SacI、SphI、で
１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ligation high
（東洋紡社）でセルフライゲーションさせた。ライゲー
ションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット
(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、ADCの５‘上流域を
増幅させた。該反応は、配列番号27および28に示した核
酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５
秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。
次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号26および29に
示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同
様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動
で量および長さを確認し、得られたＤＮA断片をAdvanTA
ge PCR Cloning Kit（Clontech社）を用いて、ベクター
ｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、
クローニングした。その後、ABI PRISM 310 Genetic An
alyzer（ABI社）を用いて、ADCの５‘上流域塩基配列を
決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡ
と全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であるこ
とが確認できた。さらに、転写阿開始点から約1000bpに
なるように、両端に制限酵素サイト（XbaI、BamHI）を
付加した配列番号30および31のプライマーを設計し、PC
Rにより増幅し、TAKARA BKL Kitを用いてPUC118のMCSへ
挿入し、pADC1000proと名付けた。この塩基配列を配列
番号25に示す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、で切断した後、
アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧ
ＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミ
ド、上記のベクターpADC1000proのpBluescript上の制限
酵素、BamHIおよびEcoRIサイトに挿入して、プラスミ
ド、ｐADCpro1000:ＧＵＳを得た。この工程を図13に示
す。また、pADC1000proを制限酵素、XbaI およびBamHI
で切断し、電気泳動後、XbaI-BamHI断片をプラスミド、
ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授か
ら入手）の制限酵素、XbaIおよびBamHIサイトに挿入し
て、新規なプラスミド、ｐＢＩ101-ADCpro1000：ＧＵＳ
を得た。次いで、該プラスミド、pBI101-ADC1000：ＧＵ
Ｓで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia co
li JM109/pBI101-ADCpro1000:GUSを得た。この工程を図
14に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-ADCpro1000:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイ
シンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞ
れの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラス
ミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell
（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレク
トロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvet
t Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/
cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクト
ロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、2
8℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-ADC
pro1000:GUSと命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-ADCpro1
000:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、
それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存
培養を行った。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号23および24のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例７ GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例６（２）で得られたpADCpro1000:ＧＵＳとpB
I221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2、
20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテッ
クスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。1000
0rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さな
いように250μlの100%エタノールを加え、ボルテックス
でしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳ
とPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを
１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、
そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５
マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パー
ティクルガンの準備を行った。
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。（図１
０，１１） （２）形質転換タバコの染色によるプロモーター活性の
確認 前記実施例４（９）で得られたLBA4404/pBI101-SPDSpro
1000:GUSによる形質転換タバコを、４℃、暗黒化、４日
間の低温処理に続き、25℃、暗黒化、１日間の処理を行
ったあと、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッファー、0.5M
フェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン化カリウ
ム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試
料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベー
トして、クロロフィルを除くため、５０％エタノールに
１０分間、１００％エタノールに１０時間浸した。LBA4
404/pBISPDSpro1000:GUSにおいて、GUSよる染色が見ら
れた(図１２)。 実施例６ アルギニン脱炭酸酵素の上流領域を持つ形質
転換タバコの作製 (1) アルギニン脱炭酸酵素遺伝子、ADCの上流領域 (ADC
Cpro)のクローニング クロダネカボチャ(Cucurbita ficifolia Bouche)の播種
後、1ヶ月育成した幼植物体を用いて、Plant DNAZOL(G
IBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮＡを抽出し、インバ
ース(inverse) ＰＣＲ法でゲノムＤＮＡのクローニング
を行った。すなわち、制限酵素EcoRV、SacI、SphI、で
１μｇのゲノムＤＮＡを切断した後、Ligation high
（東洋紡社）でセルフライゲーションさせた。ライゲー
ションしたＤＮＡ 300ngを鋳型にしてＰＣＲ試薬キット
(LA-PCR キット、宝酒造)を用いて、ADCの５‘上流域を
増幅させた。該反応は、配列番号27および28に示した核
酸配列を有する第１プライマー群を用い、９４℃、１５
秒間および６５℃、１２分間を２８サイクル実施した。
次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列番号26および29に
示した塩基配列を有する第２プライマー群を用いて、同
様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を電気泳動
で量および長さを確認し、得られたＤＮA断片をAdvanTA
ge PCR Cloning Kit（Clontech社）を用いて、ベクター
ｐＴAdvに導入し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、
クローニングした。その後、ABI PRISM 310 Genetic An
alyzer（ABI社）を用いて、ADCの５‘上流域塩基配列を
決定した。該塩基配列はプライマーの配列よりｃＤＮＡ
と全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノム領域であるこ
とが確認できた。さらに、転写阿開始点から約1000bpに
なるように、両端に制限酵素サイト（XbaI、BamHI）を
付加した配列番号30および31のプライマーを設計し、PC
Rにより増幅し、TAKARA BKL Kitを用いてPUC118のMCSへ
挿入し、pADC1000proと名付けた。この塩基配列を配列
番号25に示す。 (2) β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）との
融合 β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を含むプラスミ
ド、pBI221（Clontech社）を制限酵素、で切断した後、
アガロースゲル電気泳動を行って、該プラスミド中のＧ
ＵＳ遺伝子を取り出した。このＧＵＳ遺伝子をプラスミ
ド、上記のベクターpADC1000proのpBluescript上の制限
酵素、BamHIおよびEcoRIサイトに挿入して、プラスミ
ド、ｐADCpro1000:ＧＵＳを得た。この工程を図13に示
す。また、pADC1000proを制限酵素、XbaI およびBamHI
で切断し、電気泳動後、XbaI-BamHI断片をプラスミド、
ｐＢＩ１０１−ＨｍB（奈良先端大学、新名淳彦教授か
ら入手）の制限酵素、XbaIおよびBamHIサイトに挿入し
て、新規なプラスミド、ｐＢＩ101-ADCpro1000：ＧＵＳ
を得た。次いで、該プラスミド、pBI101-ADC1000：ＧＵ
Ｓで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Escherichia co
li JM109/pBI101-ADCpro1000:GUSを得た。この工程を図
14に示す。 (3) プラスミドのアグロバクテリウムへの導入 （2）で得られた大腸菌、Escherichia coli JM109/pBI1
01-ADCpro1000:GUSを、それぞれ５９ｍｇ／Lのカナマイ
シンを含むＬＢ培地で、３７℃で一晩、培養し、それぞ
れの大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラス
ミド2μｌとELECTOROMAX A.tumefaciens LBA4404cell
（GIBCO BRL社）50μlを混ぜ、ジーンパルサーIIエレク
トロポレーションシステム（BIO-RAD社）により、Cuvet
t Gap 0.2cm、Voltage 2.5KV、Field strength 12.5KV/
cm、Capacity 25μF、Resistor200Ωの条件でエレクト
ロポレーションを行った。その後、SOC培地で２時間、2
8℃で培養を行い、５０ｍｇ／ｌカナマイシンYEP培地上
に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニー
を選択した。得られた形質転換体をLBA4404/pBI101-ADC
pro1000:GUSと命名した。 (4) 無菌タバコの栽培 タバコの種子（奈良先端大学、新名惇彦教授から入手）
数１０粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノー
ル１ｍｌを加え、３分間放置した。続いて、滅菌液(5％
次亜塩素酸ナトリウム、0.02％TritonX-100)に３分間浸
し、滅菌水で５回洗浄した後に、MSプレート(1リットル
あたりでムラシゲ−スクーグ無機塩類4.3g、ショ糖30g
、ミオイノシトール0.1g、ジェランガム2.5g、pH5.7)
に置床した。このプレートを25℃の植物インキュベータ
ー（サンヨー製、MLR-350HT）中で、約２週間培養し
た。発芽後、上記と同様のMS培地を含む植物培養用ポッ
トに移植し、約１ヶ月育成した。 (5) アグロバクテリウムの感染 前記(4) で１ヶ月培養したタバコの葉を、メスで約１．
０ｃｍ程度に切りそろえ、液体ＭＳ培地上に浮遊させ、
上記(3)にて得た形質転換体、LBA4404/ pBI101-ADCpro1
000:GUSを28℃、２日間培養した培養液50μLを添加し、
それぞれ別のシャーレ中で2日間、２5℃、暗黒化で共存
培養を行った。 (6) 除菌 共存培養後の葉片を、滅菌水で数回洗浄した。 (7) 形質転換植物の選択 除菌済みのタバコ葉片をカナマイシン（100mg/L）、ハ
イグロマイシン（20mg/L）、カルベニシリン（250mg/
L）、ナフタレン酢酸（0.02mg/L）、ベンジルアミノプ
リン（1mg/L）を含むMS培地に静置し、光強度４０００
ルクスで培養した。以後、１週間毎に新しいＭＳプレー
トに移植した。形質転換した葉片は増殖を続け、ドーム
状に盛り上がったカルス状のものから、約１カ月後、シ
ュートが形成された。 (8) 形質転換植物の再生 シュートとなった植物体の根元を、カルス部分を含まな
いように剃刃もしくはメスで切り取り、MS培地を含む植
物培養用ポットに軽く乗せるように挿して、25℃、16時
間の光照射、8時間の暗黒化の条件で育成した。 (9) 形質転換体の確認 前記（８）で育成した植物体から、１枚の葉を切り出
し、Plant DNAZOL(GIBCO BRL社)を用いてでゲノムＤＮ
Ａを抽出し、配列番号23および24のプライマーを用いて
PCRを行うことにより、目的のDNA断片が含まれることを
確認した。 実施例７ GUS活性の測定 （１）パーティクルガンによるプロモーター活性の評価 前記実施例６（２）で得られたpADCpro1000:ＧＵＳとpB
I221を野生型タバコの葉を用いて、パーティクルガン
（Bio-Rad社）による一過性発現での、GUS活性を観察し
た。植物サンプルの準備として、タバコの葉を、0.25%
のゲランガムを含む培地状に並べた。撃ち込む粒子は、
金粒子60mgを計量し、1mlの70%エタノールを加え、ボル
テックスで５分間撹拌した。15分静置後、10000rpm５秒
間遠心し、上清を除去後、以下の作業を３回繰り返す。
1mlの滅菌水を加え、１分間ボルテックス、１分間静
置、10000rpm２秒間遠心、上清除去。繰り返した後、1m
lの滅菌水を加え、50μlづつ分注し、−20℃で保存し、
金粒子を５分間ボルテックスを行った。ボルテックスを
しながら、５μl DNA (1mg/1ml )、50μl 2.5M CaCl2、
20μl 0.1M spermidineを加え、さらに３分間ボルテッ
クスを行い、１分間静置し、微粒子を沈殿させた。1000
0rpm,10秒間遠心し、上清を除去し、ペレットを乱さな
いように250μlの100%エタノールを加え、ボルテックス
でしっかりと撹拌させた後、遠心を行い上清を除去し
た。30μl 100%エタノールを添加し、ボルテックスで
しっかりと撹拌して、金粒子へｐSAMDCpro1000:ＧＵＳ
とPBI221を吸着させた。その後、キャリアーディスクを
１枚づつ70%エタノール中で洗浄し、十分に乾燥させ、
そのキャリアーの中心部分に上記で準備した金粒子を５
マイクロμlづつ添加し、乾燥させることにより、パー
ティクルガンの準備を行った。
【００４１】パーティクルガンの条件は、金粒子0.1μ
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。 （２）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定 前記実施例６（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSに
よる形質転換タバコを、４℃、暗黒下、5日間の低温処
理に続き、25℃、暗黒下、１日間の処理を行ったもの
と、25℃、暗黒下、同期間の処理を行ったものと、４
℃、光あり、5日間の低温処理に続き、25℃、光あり、
１日間の処理を行ったものと、25℃、光有り、同期間の
処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４−メチル
ウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を分解し
て、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成する反
応を指標として測定した。処理を行った葉、約１００ｍ
ｇを500μｌの緩衝液（50mM リン酸ナトリウム(pH7.
0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% サルコシ
ル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分
離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍＭの
４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）
を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μｌの
０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。その反
応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-MU）の
蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、GUS-活
性を算出した。また、得られた抽出液のタンパク質濃度
の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD社）を用
いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコについ
て、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。数字
は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に生成
する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI101-3
5Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロモー
ター活性が見られた。LBA4404/pBI101-ADC1000:GUSで
は、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター活性
が見られた。（図１５,１６） これらの結果より、本発明のＤＮＡは、光にほとんど左
右されることなく、温度により、キメラ遺伝子を約2〜
４倍多く発現させるように制御できることが分かった。
ｍ圧力1350psi、発射口から距離3段でそれぞれ２回ずつ
撃ち込んだ。染色は、ＧＵＳ染色液(50mM リン酸バッフ
ァー、0.5Mフェリシアン化カリウム、0.5Mフェロシアン
化カリウム、1mM X-Gluc)に浸し、真空装置で吸引して
溶液を試料内部までよく染み込ませ、３７℃で一晩イン
キュベートして、GUSのスポットを確認した。 （２）形質転換タバコの定量的GUS活性の測定 前記実施例６（９）および実施例２（８）で得られたLB
A4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとLBA4404/pBI35S:GUSに
よる形質転換タバコを、４℃、暗黒下、5日間の低温処
理に続き、25℃、暗黒下、１日間の処理を行ったもの
と、25℃、暗黒下、同期間の処理を行ったものと、４
℃、光あり、5日間の低温処理に続き、25℃、光あり、
１日間の処理を行ったものと、25℃、光有り、同期間の
処理を行ったものを準備した。GUS 活性は、４−メチル
ウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）を分解し
て、４ーメチルウンベリフェロン（4-MU）を生成する反
応を指標として測定した。処理を行った葉、約１００ｍ
ｇを500μｌの緩衝液（50mM リン酸ナトリウム(pH7.
0), 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% サルコシ
ル）中で、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分
離し、上清を得た。このうち10μｌに90μｌの1ｍＭの
４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド（4-MUG ）
を加え、３７℃で反応を行い、１時間後に、900μｌの
０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加え反応を停止した。その反
応液中に生じた４−メチルアンベリフェロン（4-MU）の
蛍光（３６５nm励起、４５５nm発光）を測定し、GUS-活
性を算出した。また、得られた抽出液のタンパク質濃度
の定量は、Protein assay reagent （BIO-RAD社）を用
いた方法で行った。それぞれの形質転換タバコについ
て、GUS 活性を測定した結果を下記表１に示す。数字
は、1mgの抽出液のタンパク質量あたり、１分間に生成
する4-MUの量として示してある。特にLBA4404/pBI101-3
5Ｓ:GUSでは、温度処理に関係なく、常に強いプロモー
ター活性が見られた。LBA4404/pBI101-ADC1000:GUSで
は、低温処理を与えたものに特に強いプロモーター活性
が見られた。（図１５,１６） これらの結果より、本発明のＤＮＡは、光にほとんど左
右されることなく、温度により、キメラ遺伝子を約2〜
４倍多く発現させるように制御できることが分かった。
【００４２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> TOYOBO RESEARCH CENTER CO., LTD
<120> A PROMOTER DERIVED FROM PLANT
<130> 16802JP
<140>
<141>
<160> 31
<170> PatentIn Ver. 2.1
配列番号１
配列の長さ：1212
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：Genomic DNA
配列
ggtccggtac ttggtctctc caatctattt gccatgtgta aagtcgaaaa taaccctatt 60
aggcagcggt gcgtgttgag tcgcacgtga gaaactaaat taaaaaaatg caacgctgat 120
agagttggaa tcacgtgata agaatttctt ccggctttga cactaagcca cctacgttta 180
taaagaataa aaattacttt ttatgtctaa taaatattta aaatttaaaa tattaaatta 240
cggatattta taatgggatg attttggaat agtttaaaaa tgttttttta aaaaagattt 300
tcaataattt ttttatataa tttaccattt atttaaaaat actctaaata acattttttt 360
tccctttatc ttcaaaagat attttattaa ttaagcggct caaatttatt ggttttttca 420
agacaatact cttgatttgc aacttcccat aaaattatta tttattatta ttattattaa 490
ttaagtataa atctttttcc ctatccctct cattattttc tgtttttttc ccttaaaaat 540
cccttcttct tagtttaatt ttgaaactcg ttttttatgg acccaattgg ataaaaaagt 600
taaatatact taattaataa ataataaaaa tatattggtt tggatttgat aacaattcta 660
tgataattaa aagaaaaaac ttttacccat atttttatgt ttaatttttc aagttaaaaa 720
atggttataa tctctctaag acagattatc tctataatat ttatttaata aattattttt 780
taaaaagtgt agaaacaaaa aagagatata tttttaaagc ttcgagaata aaattaaaat 840
ttaaaataat aatatttttt taaatccgga gaaaaggaat ggcagttatt ttattatgta 900
ataatttggc accccgcgta gggaaagccg ataagggcta cgctgtcatt tcacatagct 960
aagttacgga atttagggat gagagaaaat agggcaaaac cgtaattaaa cccaaaccgc 1020
gtggtttttt cgctatataa gttcctcttc gctattgaag acctcacaga aacgcaaacc 1080
gtctgcggcc tcttgaattc tcatcgtttc tctctctttc gaattttgtt ttctttcgct 1140
ctcagccctt tcttgcaagt tttattttag gcattctccg ggtttccttc tcctccgcta 1200
attcttttca tc1212
配列番号２
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
tacgaacgca gttggagtag gcagcagatc 30
配列番号３
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
atgcggagtc taccatccat gtcactccag 30
配列番号４
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ccaccgtgtg gtctaacgtc ttcaatgctg 30
配列番号５
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
gaattggacg acctggacct gtgtaaggtg 30
配列番号６
配列の長さ：33
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
aatctagagg tccggtactt ggtctctcca atc 33
配列番号７
配列の長さ：35
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ccggatccga tgaaaagaat tagcggagga gaagg 35
配列番号８
配列の長さ：36
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cctctagaga aactcgtttt ttatggaccc aattgg 36
配列番号9
配列の長さ：35
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ccggatccga tgaaaagaat tagcggagga gaagg 35
配列番号10
配列の長さ：650
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：genomic DNA
配列
gaaactcgtt ttttatggac ccaattggat aaaaaagtta aatatactta attaataaat 60
aataaaaata tattggtttg gatttgataa caattctatg ataattaaaa gaaaaaactt 120
ttacccatat ttttatgttt aatttttcaa gttaaaaaat ggttataatc tctctaagac 180
agattatctc tataatattt atttaataaa ttatttttta aaaagtgtag aaacaaaaaa 240
gagatatatt tttaaagctt cgagaataaa attaaaattt aaaataataa tattttttta 300
aatccggaga aaaggaatgg cagttatttt attatgtaat aatttggcac cccgcgtagg 360
gaaagccgat aagggctacg ctgtcatttc acatagctaa gttacggaat ttagggatga 420
gagaaaatag ggcaaaaccg taattaaacc caaaccgcgt ggttttttcg ctatataagt 480
tcctcttcgc tattgaagac ctcacagaaa cgcaaaccgt ctgcggcctc ttgaattctc 540
catcgtttct tctctttcga attttgtttt ctttcgctct cagccctttc ttgcaagttt 600
tattttaggc attctccggg tttccttctc ctccgctaat tcttttcatc 650
配列番号11
配列の長さ：20
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ttgtgtggaa ttgtgagcgg 20
配列番号12
配列の長さ：19
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cgcgatccag actgaatgc 19
配列番号１３
配列の長さ：1212
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：genomic DNA
配列
aaacctaaat gggaacgcat atgttttaaa attttaattt ctaaatagtt aaaagttatt 60
ttcgagagaa taaataataa ctaaataatt atactataaa caaaatataa attcaaatat 120
atatctgtta agtaaatcaa gcatcaccta atttggatta taaattcaaa tcgtcattat 180
catccatcat aatatactct ctaccaaatt taaggcaaaa aaaatttgtt taattacatt 240
actttttgag tcaatttcat gtcaagatta gtctcgtagc cctacgtctt ttagtctaaa 300
ttctctctgt tcacgtcata aattttgttt catataacta tctaacgtta ttgcactttg 360
caccgttttt attgatatct tcaactgtac gaggtgaaga aaagccacga aaaaccctat 420
ttagtacacg tgttggtgcc tctgtgctta atgcattaat catacgaccc tttaaggcaa 480
aaattcgaac atttgtcatt ttagttgaac atataatata taatcatgta ttgttaagat 640
tctaaccgta acgtttcatg gccccgatat actcttgcga tatggtcatg ttatttcgac 600
agaggtccgt ttaacatatt ttgtcctctt tcacatgcct ctcaatttta gatattatag 660
atttatttat gtatttctgg cgaaaaataa aattatattt taataaaata ttatattaca 720
ctaaaaaaaa tatacctttc atggtcaaaa ctacactata gtatttggaa gtttatggaa 780
aaatcgaacc tatacaaaaa catgaaagaa cgagatgaaa aaaaaaacat aaatcgaggg 840
cagtaagaaa aagaaaaaag atcgaggaaa ccgtaatttg attccttcaa aagcgaagcc 900
tttcacggac cctttgcgat tatataaatg gaggaagaac tgggtcagtt tgctcagtgc 960
tcatatccaa cgggtcatac agaagcactc cccactgtat tgggatttgg gattttagcg 1020
agtcgatagt agaggga 1037
配列番号１４
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
acagaggaaa tagaatcggg ctgtgaggcg 30
配列番号１５
配列の長さ：26
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ggttctcgtt atcggtggag gagacg 26
配列番号１６
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
attctcaatc tcaggtttct tcgccgccgc 30
配列番号１７
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
gaggtggctc gccattcatc tgttgagcag 30
配列番号１８
配列の長さ：30
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cctctagaaa cctaaatggg aacgcatatg 30
配列番号１９
配列の長さ：28
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ccggatcctc cctctactat cgactcgc 28
配列番号２０
配列の長さ：29
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cctctagaca cgtgttggtg cctctgtgc 29
配列番号２１
配列の長さ：28
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ccggatcctc cctctactat cgactcgc 28
配列番号２２
配列の長さ：618
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：genomic DNA
配列
acacgtgttg gtgcctctgt ggctaatgca ttaatcaata cgacctttaa ggcaaaaatt 60
cgaacatttg tcatttttag ttgaacatat aatatataat catgtattgt taagattcta 120
accgtaacgt ttcatggccc cgatatactc ttgcgatatg gtcatgttat ttcgacagag 180
gtccgtttaa catattttgt cctctttcac atgcctctca attttagata ttatagattt 240
atttatgtat ttctggcgaa aataaaatta tattttaata aaatattata ttacactaaa 300
aaaaatatac ctttcatggt caaaactaca ctatagtatt tggaagttta tggaaaaatc 360
gaacctatac aaaaacatga aagaacgaga tgaaaaaaaa aacataaatc gagggcagta 420
agaaaaagaa aaaagatcga ggaaaccgta atttgattcc ttcaaaagcg aagccttttc 480
acggaccctt tgcgattata taaatggagg aagaactggg tcagtttgct caagtgctca 540
tatccaacgg gtcatacaga agcactcccc actgtattgg ggattttggg attttaagcg 600
agtcgatagt agaaggga 618
配列番号２３
配列の長さ：20
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
ttgtgtggaa ttgtgagcgg 20
配列番号２４
配列の長さ：19
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cgcgatccag actgaatgc 19
配列番号２５
配列の長さ：919
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：genomic DNA
配列
aataagatta ttttttaaaa ttctaaattt tcatctttac tgtactaaaa tattaaaata 60
tctcagaatt atctggctcg acaattgaga tattaatgag tttacatata ttcaatttgt 120
taaaacataa tcttttttac taaaaattag tcgtttaaat ttctatattt acatattgta 180
aaaaatttag gtatttatga tggtgacacg cccaatacta gggctggatg agtgtcactc 240
gagagtagcc gatttgcgag tcacaaccta ctcattagtt acgatatttg catatctcac 300
cgtctttcat attttcattt cgacttgctg aagaatcttt ctcgagcttg tttcttaatg 360
gagagttcga agacaattca cgagtcgaca atgctgataa aaaaaagata catgaatgaa 420
ttgagatcat atttattctc acaaatttta agtcggagag agattcaaat gagggggcaa 480
gatccagatg gtccacctca gcaacatctt aacaccacga aacttcccgt taccttcgtc 540
ttcttgctaa taatatcgta tttcattata ccgcgatatt tttattttta aaaatcgcca 600
cgtaagcaaa gttaacctga aatcaaagcc tcgggagacg taattgccaa tggagggtcc 660
cgcatggaag tcggccacgc ggcaacccga cgctgattag tccacgatag aatctcagtt 720
ttttttaaaa aaattattat tattaattac gacaaaaata attaatcgtc cttttttaaa 780
aaccgcgata aaattaaatc gggtcatcat aataaactac cgggttgatg gagggctgtt 840
aagtccgacc cgacccgaga catattctcc tataaaatgg cacttggttg ttcatgcaaa 900
tctcgctcat tctaacctc 919
配列番号２６
配列の長さ：31
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
aatctagacg ctcttcacca tgcagatctg g 31
配列番号２７
配列の長さ：19
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
tgtccgacga cggatcaag 19
配列番号２８
配列の長さ：20
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
cctcttggtc tccttctctg 20
配列番号２９
配列の長さ：31
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
aaggatcccg tttggagtct ctccaatcgg c 31
配列番号３０
配列の長さ：28
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
aatctagacg gaacaaagcg gtatatcc 28
配列番号３１
配列の長さ：28
配列の種類：核酸
配列の型：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：他の核酸（合成DNA）
配列
aaggatccat tggagagccc tcggagac 28
【図１】本発明プロモーターを含有するpSAMDCpro1000:
GUS、pSAMDCpro500:GUSおよびpBI101-SAMDCpro1000:GU
S、 pBI101-SAMDCpro1000:GUS 、pBI101-35S:GUSの構築
工程を表す図である。
GUS、pSAMDCpro500:GUSおよびpBI101-SAMDCpro1000:GU
S、 pBI101-SAMDCpro1000:GUS 、pBI101-35S:GUSの構築
工程を表す図である。
【図２】pSAMDCpro1000:ＧＵＳを用いて、タバコの葉で
一過性発現を確認した図である。
一過性発現を確認した図である。
【図３】pBI221を用いて、タバコの葉で一過性発現を確
認した図である。
認した図である。
【図４】LBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSによる形質
転換タバコをGUS染色した図である。
転換タバコをGUS染色した図である。
【図５】LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSによる形質転
換タバコをGUS染色した図である。
換タバコをGUS染色した図である。
【図６】LBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSによる形質
転換タバコをGUS染色した図である。
転換タバコをGUS染色した図である。
【図７】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコ
のGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を1.0
とした場合の４℃の活性を相対的に表した図である。前
記実施例に記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとS
AMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GU
SとSAMDCpro500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35
Sが対応する。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で
行い、その平均値を表している。
のGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を1.0
とした場合の４℃の活性を相対的に表した図である。前
記実施例に記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとS
AMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GU
SとSAMDCpro500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35
Sが対応する。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で
行い、その平均値を表している。
【図８】本発明プロモーターを含有する形質転換タバコ
のGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例に
記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとSAMDCpro100
0が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとSAMDCpr
o500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応す
る。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その
平均値を表している。
のGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例に
記載のLBA4404/pBI101-SAMDCpro1000:GUSとSAMDCpro100
0が対応し、LBA4404/pBI101-SAMDCpro500:GUSとSAMDCpr
o500が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応す
る。それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その
平均値を表している。
【図９】本発明プロモーターを含有するpSPDSpro1000:G
US、pSPDSpro500:GUSの構築工程を表す図である。
US、pSPDSpro500:GUSの構築工程を表す図である。
【図１０】pSPDS pro1000:ＧＵＳを用いて、タバコの葉
で一過性発現を確認した図である。
で一過性発現を確認した図である。
【図１１】pBI221を用いて、タバコの葉で一過性発現を
確認した図である。
確認した図である。
【図１２】LBA4404/pBI101-SPDSpro1000:GUSによる形質
転換タバコをGUS染色した図である。
転換タバコをGUS染色した図である。
【図１３】pBI101-SPDSpro1000:GUSと pBI101-ADCpro10
00:GUSの構築工程を表す図である。
00:GUSの構築工程を表す図である。
【図１４】pBI101-SPDSpro1000:GUS、pBI101-SPDSpro50
0と pBI101-ADCpro1000:GUSの構築工程を表す図であ
る。
0と pBI101-ADCpro1000:GUSの構築工程を表す図であ
る。
【図１５】本発明プロモーターを含有する形質転換タバ
コのGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を
1.0とした場合の４℃の活性を相対的に表した図であ
る。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GU
SとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと3
5Sが対応する。darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、
lightは光がある条件で処理を行ったサンプルである。
それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均
値を表している。
コのGUS酵素の発現量を定量的に測定し、25℃の活性を
1.0とした場合の４℃の活性を相対的に表した図であ
る。前記実施例に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GU
SとSAMDCpro1000が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと3
5Sが対応する。darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、
lightは光がある条件で処理を行ったサンプルである。
それぞれ独立の２ラインを反復数２回で行い、その平均
値を表している。
【図１６】本発明プロモーターを含有する形質転換タバ
コのGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例
に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとSAMDCpro100
0が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。
darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、lightは光があ
る条件で処理を行ったサンプルである。それぞれ独立の
２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表してい
る。
コのGUS酵素の発現量を定量的に測定した。前記実施例
に記載のLBA4404/pBI101-ADCpro1000:GUSとSAMDCpro100
0が対応し、LBA4404/pBI101-35S:GUSと35Sが対応する。
darkは暗黒下で処理を行ったサンプル、lightは光があ
る条件で処理を行ったサンプルである。それぞれ独立の
２ラインを反復数２回で行い、その平均値を表してい
る。
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フロントページの続き
(72)発明者 猪原 泉
滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 株式会
社東洋紡総合研究所内
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA16 CA17
CA19 CB02 CD03 CD07 CD09
CD10 CD13 CD17
4B024 AA08 CA01 DA01 DA06 EA04
FA02 GA11 GA17 GA19 HA14
4B065 AA88Y AA89X AB01 CA53
Claims (26)
- 【請求項１】植物由来Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸
酵素遺伝子のプロモーター領域を含むDNA断片。 - 【請求項２】以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA断
片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA - 【請求項３】以下の（a）または（b）のDNAを含む請求
項１記載のDNA断片。 （a）配列番号１の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA - 【請求項４】請求項２または３の塩基配列からなるDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA断
片。 - 【請求項５】温度により制御可能な請求項１から４のい
ずれか１項に記載のDNA断片。 - 【請求項６】請求項１から５のいずれか１項に記載のDN
A断片を含むベクター。 - 【請求項７】異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下にあ
る請求項６記載のベクター。 - 【請求項８】請求項６または７記載のベクターを宿主植
物細胞に導入した形質転換植物。 - 【請求項９】請求項８記載の形質転換植物から得られた
種子及びその子孫。 - 【請求項１０】植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子
のプロモーター活性を有するDNA断片。 - 【請求項１１】以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA
断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA - 【請求項１２】以下の（a）または（b）のDNAを含む請
求項１０に記載のDNA断片。 （a）配列番号１３の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA - 【請求項１３】請求項１１または１２の塩基配列からな
るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有する
DNA断片。 - 【請求項１４】請求項１０から１３のいずれか１項に記
載のDNA断片を含むベクター。 - 【請求項１５】異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下に
ある請求項１４記載のベクター。 - 【請求項１６】請求項１４または１５に記載のベクター
を宿主植物細胞に導入した形質転換植物。 - 【請求項１７】請求項１６記載の形質転換植物から得ら
れた種子及びその子孫。 - 【請求項１８】植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子
のプロモーター活性を有するDNA断片。 - 【請求項１９】以下の（a）または（b）のDNAを含むDNA
断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA - 【請求項２０】以下の（a）または（b）のDNAを含む請
求項１８に記載のDNA断片。 （a）配列番号２５の塩基配列からなるDNA （b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配
列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、
かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するDNA
断片。 - 【請求項２１】請求項１９または２０に記載の塩基配列
からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有
するDNA。 - 【請求項２２】温度により制御可能な請求項18から21の
いずれか１項に記載のDNA断片。 - 【請求項２３】請求項１８から２２のいずれか１項に記
載のDNA断片を含むベクター。 - 【請求項２４】異種遺伝子が該DNA断片の転写制御下に
ある請求項２３記載のベクター。 - 【請求項２５】請求項２３または２４に記載のベクター
を宿主植物細胞に導入した形質転換植物。 - 【請求項２６】請求項２５記載の形質転換植物から得ら
れた種子及びその子孫。
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| JP2002063742A JP3772974B2 (ja) | 2001-10-23 | 2002-03-08 | 植物由来のプロモーター |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| WO2011013764A1 (ja) * | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 日本たばこ産業株式会社 | アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法 |
-
2002
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